DE1598621A1 - Verfahren zur schnellen sukzessiven Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Zellen,insbesondere zur maschinellen Schnelldiagnose fuer Krebs,und Vorrichtung zur Durchfuehrung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur schnellen sukzessiven Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Zellen,insbesondere zur maschinellen Schnelldiagnose fuer Krebs,und Vorrichtung zur Durchfuehrung des Verfahrens

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DE1598621A1 DE1966J0030681 DEJ0030681A DE1598621A1 DE 1598621 A1 DE1598621 A1 DE 1598621A1 DE 1966J0030681 DE1966J0030681 DE 1966J0030681 DE J0030681 A DEJ0030681 A DE J0030681A DE 1598621 A1 DE1598621 A1 DE 1598621A1
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Description

■ PATENTANWALT DIPL.-ING. H.E. BÖHMER - BÖBLINGEN /WÜRTT.
Sindelfinger Straße 49 Tel. (07031) 661 30 40
• Böbllngen, 26. April I966 si-OG
Anmelderin: International Business Machines.
Corporation, Armonk, N.Y. 10
Amtliches Aktenzeichen: Neuanmeldung Aktenzeichen der Anmelderin: Docket 10 842
Verfahren zur schnellen sukzessiven Untersuchung einer Vielzahl von biologische Zellen« insbesondere zur maschinellen Schnelldiagnose fUr Krebs und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur «ohneIlen sukzessiven Untersuchung einer Vielzahl von biologiechen Zellen,iinsbesondere zur maschinellen Schnelldiagnose von Krebs sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Gegenstand der Messung 1st der Anteil der Nukleinsäure pro Volumeinheit für jede individuelle Zelle innerhalb einer Probe einer Körperflüssigkeit, welche auf das Vorhandensein von abnormalen Zellen geprüft werden soll.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt« d«d die Gegenwart von Krebs festgestellt Herden kann duroh Messung dir ohestisohtn Veränderung
8AD ORiGiNAi,
innerhalb gewisser spezifischer Körperzellen* welche entweder ', durch Biopsie, durch Irregation von Körperorganen, beispielsweise des Uterus oder durch Ausschabung solcher Organe, z.B. der Zervix gewonnen werden. Die obengenannten Untersuchungen zeigten, daß ein Anwachsen des Anteiles der Nukleinsäuren (Deoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäure, im folgenden mit DNS und RNS bezeichnet) innerhalb einer Probe auf einen Pegel oberhalb eines normalen Anteils bei bestimmten Zellen ein Zeichen für die Anwesenheit von Krebs innerhalb der Zellen des untersuchten Organs bzw. des die Körperflüssigkeit liefernden Organes ist. Es wurden bereits Vorrichtungen zur maschinellen Krebsdiagnose vorgeschalgen, die von der Tatsache Gebrauch machen, daß die Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum in der Nähe der
Wellenlänge von 2537 A besitzen« Gewöhnlich werden dem zu untersuchenden Organ entstammende Zellen auf einen Objektträger gebracht» In bekannter Welse gefärbt und mittels einer Abtastmethode untersucht, wobei Jede einzelne auf dem Bildträger befindliche Zelle durchstrahlt wird. Mittels einer derartigen Absorptionsmessung läßt sich feststellen, ob Nukleinsäuren in normalen oder abnormalen Anteilen in den untersuchten Zellen vorhanden sind. Die genannten Vorrichtungen machten teils von Absorptionsmessungen in Form eines Strahlungsprofils über der zu untersuchenden Zelle, tails von einer Messung der Öesamtabsorptlcn der Zeil© Qebrauch < und waren verhältnismäßig erfolg*4 reloh« jedoch 1st derea Benutzung nur äaaa ssga^raeht, wenn eine
verhältnismäßig begrenzte Anzahl von Zellproben untersucht werden sollen. Ist es jedoch erwünscht z. B. im Rahmen einer Massenuntersuchung Proben mit 100 000 und mehr Zellen zu untersuchen» so sind die erwähnten Vorrichtungen zu zeitraubend und teuer. Diese Ökonomischen Gründe, welche gegen die Verwendung der obengenannten Vorrichtung bei Massenuntersuchungen sprechen, resultieren aus der Tatsache, daß die Vorrichtungen zwar eine schnellere Untersuchung gestatten, als dies bei einem manuellen Verfahren der Fall ist, daß jedoch die Verminderung der Untersuchungszeit nicht groß genug ist, um sie für Massenuntersuchungen geeignet zu machen. Ein zusätzlicher Paktor, der gegen die Verwendung der obengenannten Vorrichtungen spricht, besteht in der Tatsache, daß sogar in einer abnormalen Probe Krebszellen nur verhältnismäßig selten zu finden sind, wodurch es erforderlich wird, jede einzelne Zelle zu untersuchen. Aus den genannten Gründen ist es wünschenswert, über ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zu verfügen, welches jede einzelne Zelle mit hoher Geschwindigkeit sowie mit großer Genauigkeit zu untersuchen gestattet. Dies stellt die einzige Möglichkeit dar, die genannten zeltlichen, personellen und ökonomischen Schwierigkelten zu überwinden.
Einer der Hauptgründe dafür, daß die Sterblichkeit infolge von Krebs in den letzten Jahren abgenommen hat, 1st der Tatsache zuzuschreiben, daß die Medizin ihr Hauptaugenmerk auf eine möglichst
BAD ORIGINAL '
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frühe Erkennung dieser Krankheit richtete. Aus einem neueren Report des Präsidenten der Kommission für Herzkrankheiten, Krebs und Kreislaufkrankheiten geht hervor, daß bezüglich des Zervikalkrebses fast eine 100#-ige Uberlebungswahrscheinllchkeit für die Patienten bestellt, welche in den Genuß einer Frühdiagnose mit anschließender Behandlung kommen. Frühe Diagnose und Behandlung des Zervikalkrebses wurde grundsätzlich ermöglicht durch die Benutzung des wohlbekannten Bipanikolaou-Verfahrens. Diese Methode besitzt den Vorteil, daß Untersuchungsproben leicht durch einen Arzt oder durch den Patienten selbst beschafft werden können und daß jährliche Untersuchungen des Zervikalkrebses in manchen Gegenden eine feststehende Einrichtung wurden. Es besteht somit Grund zur Annahme, daß infolgedessen in manchen Ländern der Zervikalkrebs aufgehört hat Todesfälle zu verursachen und daß sich dieses Ergebnis auf einer weltweiten Basis reprodzieren ließe, wenn die Möglichkeit bestünde, Proben der gesamten weib* _ liehen Bevölkerung jährlich einer Untersuchung zu unterziehen. Wie bereits erwähnt wurde, sind die zur Zeit benutzten manuellen und maschinellen Zellenuntersuchungsverfahren verhältnismäßig zeitraubend und zu teuer. Fernerhin leiden die zur Zeit verfügbaren Untersuchungsmethoden unter einer gewissen Ungenauigkeit im Falle der Benutzung von Messungen der Absorptionsmaxima der Nukleinsäure, bei denen die Objektträger durch einen Lichtstrahl abgetastet werden, da große Zellen oder Zellanhäufungen die Anzeige einer abnormalen Zelle vortäuschen können obwohl in
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lti die JUtüftiSä H®i> Hukloiftoliu^uii iisrffltil lab« Ana ύ&η Gesagten-geht hervor, daß ein starkes Bedürfnis nach einen Diagnostizierverfahren für Krebs vorliegt, welches geeignet ist für eine schnell durchzuführende Massenuntsrsuchung von Proben mit einer hohen Anzahl von Einseizeilen® Diese Untersuchung hat schnell und genau su erfolgen und es sollen auch die ZellgröJie und der Anteil der Nukleinsäure der jeweils ge-, messenen Zelle in Betracht gezogen werden können.
Die genannten Aufgaben werden unter Vermeidung der den bisher bekannten Diagnostiziervorrichtungen anhaftenden Nachteile von dem Verfahren nach der Erfindung dadurch gelöst, daß die in einer Suspensionslösung suspendierten zu untersuchenden Zellen durch eine enge Kanüle innerhalb eines Objektglases aus Quarz getrieben werden, daß das von einer Lichtquelle über eine Kondensorlinse gelieferte UV-Licht diese Kanüle sowie die Objektivlinse und eine weitere Linse durchsetzend von dem Diohroidspiegel in zwei StrahlengMnge- aufgespalten und der bei 2557 8 liegende, der Zellabsorption proportionale Spektralanteil einem ersten Elektronenvervielfacher, der restliche, dem gestreuten Lichtanteil und damit dem Zellenvolum proportionale Spektralanteil einem aweiten Elektronenvervielfacher zugeleitet wird, daß das von einem Verstärker welter verstärkte, der Zellabsorption propor tionale Signal an die Vertikalablenkplatten, das von einem Ver- otärker weiter verstärkte dir Streuung bzw« öera Zellenvolum
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Blgnal &n öle HurlsonEalaolenlspXafcfceia- eines Os^illoskopes angelegt und gleichzeitig eine He11tastung des Kathodenstrahles mittels eines aus dem Signal des der Absorptionsmessung zugeordneten Elektronenvervlelfaehers durch einmalige seitlich© Differentiation gewonnenen Hilfssignales durchgeführt i'jlrdo ueT&fpß daß di© Enöpunkt der aufgegeiohaeten BiIdkuryen innerhalb keulenförmiger Bereiche liegen, deren Symmetrie« geraden Steigungswinkel besitzen, .' - die gegeben sind durch das Verhältnis der Zellabsorption/Zellvoluraen.
Die Erfindung wird an Hand der Zeichnungen beispielshalber erläutert* Darin zeigen:
Pigο 1 eine teils scheraatisch, teils als Blockdiagramm
Vorrichtung zur ihjrohführung des Ver-
Fig. Z eine vergrößerte Ansicht des zur Durchleuchtung bzw. zur Streuungsmessung der einzelnen Zellen der biologischen Probe mit einer engen Kanüle versehenen
FIg β 3 ' ®i^ To^ ^®*5 Vö^r'iehtung naeh d@r Erfindung auf ä®m
der iCafchoaenstfahlröhi5© gur Anzeige
-τ- 1698621.
purtktiö liefen in keulenartigen Fläenenbereichen, wobei der Steigungswinkel der Symmetriegeraden der einzelnen Bereiche für die jeweilige Zellenart charakteristisch ist. Die größten Steigungswinkel sind den abnormalen Zellen, nämlich krebsbefallenen und Strahlungsgeschädigten Zellen zugeordnet.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren sowie eine Vorrichtung entwickelt, die zur Untersuchung von großen Mengen von Zellen in der Größenordnung von 100 000 Zellen innerhalb von zwei oder drei Minuten geeignet ist. Man geht dabei aus " von einer Zellenanhäufung innerhalb eines 4 : 1-Gemenges einer isotonischen physiologischen Kochsalzlösung mit Äthanol. Es können auch andere sowohl fixative als nichtfixative Salzlösungen benutzt werden, jedoch ergab das erwähnte 4 : 1-Gemenge von physiologischer Kochsalzlösung und Äthanol die besten Resultate. Die Proben können durch einen Arzt oder durch die Patienten selbst beschafft werden. Im Falle der Untersuchung auf Zervikalkrebs kann ein geeignetes Instrumentarium hierzu entweder von den Krankenhäusern oder im Handel erhalten werden. Zur Vorbereitung der Probe für die Untersuchung zur Verhinderung des Auslaugens der Konstituenten der Zelle sowie zur Standardisierung des Anteils des ohne Zerstörung der ultravioletten Absorptionscharakteristik für die Nukleinsäuren zulässige Denaturalisierung des Proteins werden die Proben für eine Zeitdauer von zwei
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n η&βη der· ßntnahraa in einer gO^-igen Äfehanoliöaung und einer 2^-igen Essigsäurelösung suspendiert. Es hat sieh herausgestellt, daß bei Benutzung von Flxativen die Proben für «ine Zeit bis zu drei Monaten aufbewahrt werden können mit nur geringen Abweichungen zwischen den Untersuchungsresultaten im Vergleich zu den nicht gealterten Proben« Bei der Vorbereitung der Proben für die Untersuchung wurde ebenfalls gefunden, daß die fe Differenz bezüglich der Absorption zwischen Zellen mit großem und solchen mit geringem Anteil von Nukleinsäuren vergrößert wird, wenn die Zellen nochmals suspendiert werden mit einer wässrigen Lösung von Natriumazetat und Essigsäure, welche einen pH-Wert in der Nähe von 2, insbesondere einem solchen von 2,1 besitzt, bei einer Molarität des Natriums von etwa 0,15. Für pH-Werte von Molaritäten, die von den genannten Werten abweichen» wurde keine Konsistenz der Resultate erhalten. Die Xnkonsistenz kann zum Teil auf das Anwachsen der Absorption der Nukleinsäure mit gleichzeitiger Denaturalisierung bei geringen pH-Werten
zurückgeführt werden. Es wurde welter gefunden, daß eine Probe, welche krebsbefallene Zellen enthält, bei einem von 2,1 abweichenden pH-Wert als normal erscheinen kann. In einem Experiment konnte eine Krebszellen enthaltende Probe in Natriumazetat und EssigsSurelösung mit einem pH-Wert von 3,8 nicht mehr unter-
einer ^ ,
schieden werden von/Probe mit normalen Zellen innerhalb einer Lösung mit einem pH-Wert von 2,1. Andere Untersuchungen, welche verschiedene Krebszellen und Lösungen mit einem verschiedenen
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pH-Wert benutzten, zeigten eine ähnliche Tendenz» Absorption durch DNS und RNS wird fast um den Paktor 2 gesteigert durch . die Benutzung von Lösungen mit einem pH-Wert in eier HMhe von 2. Man glaubt, daß Lösungen mit einem derartigen pH-Wert eine Aufwicklung der Molekularstruktur der Mukleinsäur-e bewirkt und hierdurch das Absorptionsvermögen einer jeden Zelle erhöht» öas genannte Phänomen der Äufspulung des Moleküls der Nukieinsäure wurde zwar bereits anderweitig demonstriert, es ist aber anzunehmen, daß das vorliegende Verfahren und die Vorrichtung die erste Anwendung dieses Phänomens zur Verbesserung des Absorptionsvermögens einzelner Zellen darstellen, wobei die Messung der Dichte der Nukieinsäure zur Entscheidung der Frage herangezogen werden, ob in der Probe krebsbefallene Zellen anwesend sind oder nicht.
Die zu untersuchenden, geilen werden zunächst in. einem Fil.tgr * nach Buckbee Mears mit 250 Maschen pro Zoll, welches in ein Swinnyfilter eingesetzt ist, gefiltert und die Zellen in zwei ml einer wässrigen Lösung von Natriumazetat und Essigsäure mit einem pH-Werfc in der Nähe von 2 suspendiert. Mach der Filterung und Suspension in der Lösung wird dia Probe in das Gerät der-Pig. 1 eingegeben,
Haeh erfolgter Untersuchung wird die Probe in dem oder einem anderen Behälter 1 gesammelt, die ihrerc-tjlts durch
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das Bohr 2 mit der einen Seite der Kanüle 3 im Objektglas ver bunden sind ο Di© andere Seit©- dieser Kanüle 3 ist ml% der Speicherspul© 4 aus Teflon verbunden0 Eine. Injektionsspritze 5 isfe &n öl© Sp@i@h@rs.pule 4 angeschlossen^ wodur-öia ü-jp Tranp eteeh öle Röhr© sowie durch die Kanüle des Speiehsrgiascs bewerfe" stelligfc WlX5Oo BIe Spul® aus Teflonrohr 4 kann susäfeslleh auf ' ©inern Sohüfefc©lg©räfe montiert werden^ um di@ Zellen Ie uqt Susp©»= sion zu halten ο Di© zn~ untersuchend© Probe viird v©!5 Beginn äe%>
in di@ Vorratsspule 4 eingebracht und verbleibt dort bis zur Inbetriebsetzung der Vorrichtung. Di© au untersuchend® Flüssigkeit wird mit einer festen Rate in die Kanüle 3 injiziert, was beispielsweise mit einer Infusionsspritze geschehen kann. Ein® geeignet® Infusionsrat®. wurde &wa bei 0,5 ml/Min» festgestellt. Eine Anzeigevorrichtung für Lutblasen, bestehend aus der Photocell® 6 sfeiSllt dl© Anwesenheit von Luftblasen zu Beginn und aia Bnü<B 4©f UnttwauQhung fest imd.li©fOTfc Signale, weleho den Start e di© Auß©rgangsetzung der Apparatur bewirken» Die zu unter-
Flüssigkeit durchfließt die eng® Kanüle innerhalb des Objektträgers mit den Abmessungen von 100 yu χ 100 μ und fließt
- ff ί
vjQifeerhin ia ö@a SaRimelbehältes3 I0 Pig& 2 ■ zeigt detailliert di@ Kanül© 3s dusOh welehs di© Unt©rsuchungsflüssigk©ife hindtiröhg©° ρηπφ'ύ liiirde BIe Kanüle besitzt eine prisiaatische Oastälfc^ und -. ist säitfesls ©in©S""lJ3Ltrasehallsohn©id@g©rUt©s in -elmsn aus Quars eing©aohoifcfe@iia Mach dem E
Wandungen poliert ο Iu ύ®^ iiffe© dar EMan das Kahalos
wurden dann die Bohrungen θ eingebracht. Die Quarzabdeckung 9 wurde dann oberhalb des Kanals 3 aufgesetzt und mit diesem verklebt. RohrZuleitungen aus Polyäthylen 2 dienen der Ableitung und das Rohr 10 der Zuführung der zu untersuchenden Flüssigkeit. Das Polyäthylenrohr 10 ist mit der Vorratsspule 4 mittels eines niohtgezeigten Touhy-Borst-Adapters verbunden.
Der aus Quarz bestehende Objektträger 7 mit Abdeckung 9 mit der Durchflußkanüle JJ und den zugehörigen Polyäthylenrohren 2 und 10 wird dann auf dem Tischchen eines Mikroskops montiert. Dieses besitzt eine Zeiss-Ultrafluorobjektlvlinse 100/1,25 mit Glyzerin-* immersion, welche den mittleren Teil des Flußkanals auf eine Appertur abbildet. Eine Lichtquelle IJ, bestehend aus einer . Hanovia-Niederdruckquecksilberdampflampe mit Wasserkühlung wird mittels eines Zeiss 0,85 NA-Immersionskondensors 14 auf den Kanal 3 abgebildet. Die Lichtquelle IJ liefert ultraviolettes Licht. Der größte fell ihrer Energie wird bei 2 537 8 ausgestrahlt, was in der Nähe des Absorptionsmaximums der Nukleinsäuren (DNA und RNA) liegt. Eine Quarzlinse 15 sowie ein Dichroid-Spiegel 16 bilden das die Objektivlinse 12 durchsetzende Licht mit einer Wellenlänge größer als 4 000 8 auf der Vorderseite einer Photovervielfachungsröhre 17 (EMR 541 A) ab und reflektieren kürzere Wellenlängen mit einem Ablenkungswinkel von 90° in der Weise, daß der reflektierte Strahl auf einen zweiten Photovervielfacher 18 (EMH 541 F) auftrifft, nachdem er zusätzlich ein J mm Flüseig-
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einem
mit 1-4 diphenylbutadien-Lösung in Äthanol enthält. Das Filter. 19 sowie die Photovervielfacherröhre 18 isolieren in wirksamer . Weise den Spektralanteil bei 2 537 8* .
Die Zellen mit einer Flußrate von oberhalb 500 Zellen/Sekunde rufen Impulse'von etwa 200 Ai see Dauer an den Ausgangsklemmen der Photovervielfacherröhre 17 und 18 hervor. Der Elektronenvervielfacher 17 mißt den durch die Zellen aus dem Lichtkegel 1 des Objektivs mit hoher Appertur gestreuten Lichtanteil, wobei das Licht dem Kondensor mit einer niedrigeren numerischen Appertur entstammt. Der Photovervielfacher 18 mißt die Absorption des Lichtes bei 2 537 S einer jeden Zelle bei ihrem Passieren der Kanüle 3« Die einzelnen von dem Photovervlelfächer 17 gelieferten Impulse, welche ein Maß sind für den Lichtverlust infolge der Streuung durch die Zellen ist dreißigmal geringer als der CurQf- Absorption tovorgerufene Impuls b§£ gleiöher einfallender Lichtenergie bei beiden Photovervielfachern. Der allgemeine Eiiergiepegel liegt aber genügend hoch« um ein gutes Verhältnis zwischen Signal und Rauschen an beiden Photovervielfachern zu gewährleisten« Die von der Streuung erzeugten Signale dieser Größenordnung ergaban aufgrund von Experimenten die beste Abschätzung der Z©llgrÖße» wobei als Vergleich verschiedene andere Methoden in Betraeht gezogen wurden* beispielsweise Messungen in den Z&ll&n enthaltenden Proteins» welches eine Absorption-
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Del 2 yöö S oder 3 1J5O 8 aufweist sowie Änderungen der elektrischen Leitfähigkeit über die Kanüle 3, welche durch den Durchgang der Zellen verursacht wird.
Die Ausgangssignale der Photovervielfacher 17 und 18 werden mittels eines Bandpasses zwischen 200 Hz und 5 kHz gefiltert ; es erfolgt weiterhin eine Verstärkung in den Verstärkern 170 und I8o, welche auch als Bestandteil des Oszilloskops sein können und die auch auf 0 geklemmt werden können. Das verstärkte Ausgangssignal des Photovervielfachers 18, welches dem Absorptionssignal entspricht,wird zu den vertikalen Ablenkungsplatten 21 des Öszillokops 22 geführt, welches z.B. ein Tektronix-536-Qszilloskop sein kann. Das vom Photovervielfacher 17 gelieferte Ausgangssignal, welches der Lichtintensitätsminderung infolge Streuung an der jeweils untersuchten Zelle:, entspricht, wird an die Horizontalablenkplatten 22 der Qszilloskops 22 geführt« Jede Zelle ruft bei ihrem Passieren durch die Kanüle 3 als Resultierende eine Gerade auf dem Bildschirm des Oszilloskops 22 hervor, wobei die durch Strahlaufhellung allein sichfcar gemachten Endpunkte dieser Geraden Koordinaten besitzen, welche durch das Größenverhältnis der beiden Signale gegeben sind. Zur Realisierung der erwähnten Strahlaufhellung wird der Ausgang des Photovervlelfachers l8 gleichfalls einem Differenzierglied 24, bei dem es eich um eine in der Elektronik bekannte Schaltung handelt, züge« führt. Das dem Absorptionsvermögen entsprechende Signal wird
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differenziert und beim Überstreichen des Nullpunktes dieses Signales wird von einem Impulsgeber 25 ein Impuls von einer ,Mikrosekunde Dauer geliefert, welcher weiterhin der Z-Achse bzw. der Strahlintensitätsmodulationsklemme. 26 zugeleitet wird* Hierdurch wird erreicht, daß lediglich das Ende der auf dem Bildschirm erscheinenden Spur eine genügende Intensität besitzt, um dort sichtbar zu werden. Indem man die Strahlintensität des " Oszllloskops so einstellt, daß lediglich ein einzelner Punkt für Jede Zelle auf dem Schirm erscheint, und zwar an.denjenigen Stellen, deren Koordinaten bestimmt sind durch die Volum- bzw. die Absorptionseingeschaften der Zellen, ist es möglich, aus der Anzeige für Jede Zelle den Gehalt an Nukleinsäure pro Volumeinheit zu erhalten. Durch Kombination einer Kamera mit dem Osziloskop 1st eine laufende Aufzeichnung der Verteilung dieser Eigenschaften innerhalb einer speziellen Probe möglich. Aus dem Vorstehenden ist ersi(?h.tl3.oh, daß bei 4en. genannten Messungen der Absorption/Volumelnheit dl© Leuehtspur einer Zelle mit einem
hohen Gehalt an Nukleinsäure auf der linken Seite des Oszilloskopschirmes innerhalb eines keulenförmigen Flächenbereiches mit einem größeren Steigungswinkel der Symmetriegeraden dieses Bereiches erscheinen wird«. Man kann daher nach elaör geeigneten Maskierung des Bildschirm©® mittels oinep Kamera eine Aufzeichnung dar jenigen Zellen ■ erhalten, 'für die .e.ina hohe-Wahrscheinlichkeit besteht, Von Krebs befahlen su sein« Weiterhin kann nach einer de& OasilloskopblldsQhlrmea, al® @tn® abnormale bzw*
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oino kreboboftillön«* Zelle anaeitfurtde Leuehtapur auf einer Photozelle ausgenutzt werden. Die Photozelle kann ihrerseits ein Alarmsignal auslösen, so daß eine personelle Beaufslchtung der Meflvorrichtung erst vom Zeitpunkt des ausgelösten Alarms an erforderlich ist« Der Ausgang der Gesamtvorrichtung braucht nicht notwendigerweise in einem sichtbaren Signal zu bestehen, sondern kann auch ein analoges oder digitales Signal sein, welches in Verbindung mit zusätzlich zu benutzenden Daten-Verarbeitungseinrichtungen angewendet wird. Es sei darauf hingewiesen, daß auch andere Parameter, welche abnorme Eigenschaften von biologischen Zellen charakterisieren gleichzeitig mit den' obengenannten Messungen sichtbar gemacht oder angezeigt werden können. Z.B. können Messungen mit Hilfe anderer Wellenlängen durchgeführt werden, welche die Absorption des ultravioletten Lichtes durch das Protein oder das Zytoplasma einer Zelle betreffen. So können,Zellen mit einer durch Protein hervorgerufene hohen Absorption begüglloh einer anderen Wellenlänge zusätzliche Daten ergeben, welche in Verbindung mit den oben beschriebenen Messungen angezeigt werden oder einem Computer zugeführt werden, um nach Weiterverarbeitung noch genauere Information über eine individuelle Zelle zu erhalten.
Fig. > zeigt ein Diagramm der Absorption von Nukleinsäuren, aufgetragen gegen das Volumen für verschiedene Zeiltypen. Charakteristisch ist bei dem Diagramm, daß normale Zellen einer vorgegebenen
BAD
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Art eine apessiftsohe Lage
während alle krebsbefallenen Zellen eine Lage einnehmen, welche im wesentlichen die gleiche ist, ohne Rücksicht auf die jeweilige Zellenart. Es sei darauf hingewiesen, daß die verschiedenen in Fig. 3 aufgezeichneten keulenförmigen Fläehenbereiche in Wirklichkeit Bereiche sind, welche durch eine große Anzahl von Einzelzellen festgelegt werden-, die normalerweise auf dem Schirm des Oszilloskops als eine Vielzahl von Einzelpunkten erscheinen. Die Umrandungen, welche mit den Buchstaben A bis D bezeichnet sind, entsprechen Gebieten innerhalb derer die von den verschiedenen Arten normaler Zellen hervorgerufene Leuchtspuren fallen, während die Umrandung D und F Gebieten entsprechen .in welche die von Krebszellen und Strahlungsgeschädigten Zellen hervorgerufene Leuchtspuren fallen. Das Gebiet A zeigt den Bereich, in den die von normalen Erythrozyten hervorgerufene Leuchtpunkte fallen. Von den verschiedenen getesteten Zellkörpern wiesen diese die geringste Absorption des ultravioletten Lichtes pro Volumeinheit bei einer Wellenlänge von 2 537 S auf. Die Leuchtspuren von Leukozyten und Epidermoidalzellen fallen in die Gebiete B und C \ΐι~Δ besitzen ein etwas größeres Absorptionsvermögen als dies für die Erythrozyten der Fall ist. Unter den normalen Zellen besitzen die Lymphossyten in dem Bereich D das höchste Absorptionsvermögen pro Volumeinhwij wegen des großen Anteiles von DNA in den Kernen dieser Zellen. Untersuchungen dieser normalen Zellkörper lassen die erwähnten Gebiete so weit abgrenzen, daß es möglich ist, für
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eine vorgegebene Einstellung der Verstärkungsgrade der Verstärker der Vorrichtung nach Fig. 1 die verschiedenen Zelltypen zu identifizieren, wenn sie gleichzeitig in einer gegebenen Probe vorliegen. .
Der Bereich E entspricht demjenigen Gebiet, in den die Leuchtspuren der meisten abnormalen O^u, krebsbefailenen Zellen fallen. Allgemein kann festgestellt werden, daß die abnormalen Zellen das höchste Absorptionsvermögen pro Volumeinheit aufweisen, mit Ausnahme derjenigen Zellen, welche z.B. durch Radioaktivität strahlungsgeschadigt sind. Im Laufe der verschiedenen mit der Vorrichtung nach der Erfindung durchgeführten Experimente trat lediglich ein einziger Krebstyp auf, welcher eine normale Verteilung der Leuchtspuren auf dem Anzeigeschirm aufwies, wobei es sich um ein stromatisches Sarkom des Endometrlums handelte; andererseits gab es Fälle, in denen normale Zellen das hohe Absorptionsvermögen zeigten, welches für Krebs charakteristisch ist. Derartige Verteilungen bilden aber die Ausnahme und die Abweichung von dem normalen Verhalten kann duroh in jedem der genannten Fälle auftretende ungewöhnliche Umstände erklärt werden. So wurden z.B. derartige Ausnahmeverhalten von Zellen gefunden bei der Untersuchung von Proben, die von Frauen im pöstmenopausalen Zustand oder nach einer Krebsbehandlung stammten. Diese Ausnahmen gehören zu klinisch wohl definierten Zuständen, so daß ein Patient, diessen Krankheitsgesohichte diese speziellen
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Krankheitstypen aufweist, einer gesonderten Spezialuntersuohung bzw. Behandlung zugeführt werden kann, durch welche genauere Aufschlüsse zu erhalten sind.
Zusätzlich zu dem durch Vaginalirrigation erhaltenen uterinen Material wurden auch Suspensionen von Zellproben aus einer Vielfalt von chirurgisch entfernten Tumoren untersucht und es wurden Vergleiohsuntersuchungen gemacht, wobei nach Möglichkeit die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung mit Zellsuspensionen von vergleichbarem gutartigem Gewebe benutzt wurde. Es wurden folgende Tumore auf die genannte Art untersuchtι Epidermoidale Carcinome der Zervix, der Lunge, verhornte schuppenförmige Carcinome von Mund und Fharync, Adenocarcinome des Endometriums, des Dickdarms, der Brust, des Ovariüms sowie gewisse Lymphome. Gutartiges Epithe der uterinen Cervix und orale sowie dem Colon entstammende Schleimhaut wurde mit den in Suspensionen aufbereiteten Tumoren verglichen, wobei die letzteren durchweg ein Diagramm ergaben, welches ein höheres Absorptionsvermögen pro Volumeinheit bei 2 537 8 aufwiesen als dieses der Fall war fUr die von den gutartigen Geweben aufbereiteten Suspensionen. In gleicher Art wurde die Absorption pro Volumeinheit bei Vergleich mit gutartigen Lymphknoten höher befunden für rektikuläre Zellsarkorae, Lymphosarkome und Hodgkin's-Lymphon. In allen Fällen wurdmauf dem Bildschirm erhaltene Diagramme &ls konsistent und reproduzierbar gefunden, mit geringen
Abweichungen öogar nach wiederholtem Gebrauch der Proben. In allen Fällen* in denen die Zeilsuspensionen die Anwesenheit von Krebs aufwiesen, wurden zur· Prüfung dieses Tatbestandes Untersuchungen zytologischer Abstriche 3urch Pathalogen herangezogen·. In umgekehrter Weise wurden Suspensionen von krebsbefallenem Gewebe angefertigt, und ohne vorherige Kenntnis der Existenz des Krebses seitens des Experimentators der Untersuchung zugeführt. In allen Fällen abgesehen von wenigen, oben bereite erwähnten Ausnahmen, lieferte die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung eine positive Diagnose der krebsbefallenen Zellen. , .
Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens bzw. der Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens gegenüber dem bisher bekannten Stand der Technik iet beträchtlich. Die Untersuchungsdauer beträgt zwei bis drei Minuten pro Probe, wobei eine dauernde Aufzeichnung der erhaltenen Resultate möglich 1st und durch eine am Oeüillüskop befestigte Filmkamera oder durch ein bekanntes I von der Datenverarbeitung her bekanntes Speicherungsverfahren realisiert werden kann. Infolge der genannten Eigenschaften ist die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung hervorragend geeignet zur.,. Erfassung dringend krebsverdächtiger Patienten im Rahmen einer Massenuntersuchung· Eine etwa erfolgende positive Anzeige bei Jeder Probe ist geeignet, diejenigen krebsverdächtigen Patienten auszusondern, die dann später einer Untersuchung von Zytologen oder Pathalogen zugeführt werden können, wobei die Wahrsehein-
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lichkeit der Wirksamkeit einer Krebsbehandlung durch die nunmehr* mügliehe masohinelle Frühdiagnose wesentlioh höher als früher anzusetzen ist.
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Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zur schnellen sukzessiven Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Zellen, Insbesondere zur maschinellen Schnelldiagnose von Krebs, dadurch gekennzeichnet, daß die in einer Suspensionslösung suspendierten zu untersuchenden Zellen durch eine enge Kanüle (>) innerhalb eines Objektglases (9) aus Quarz getrieben werden, daß das von einer Lichtquelle (IjJ) über eine Kondensor linse (14) gelieferte UV-Licht diese Kanüle sowie die Objektivlinse (12) und eine weitere Linse (I5) durchsetzend von dem Diehroitspiegel (16) in zwei Strahlengänge aufgespalten und der bei einer durch den Gehalt an Nucleinsäuren bedingten maximalen Zellabsorption liegenden Spektralanteil einem ersten Elektronen-vervielfacher (20), der restliche, dem gestreuten Lichtanteil und damit dem Zellenvolum proportionale Spektralanteil einem zweiten Elektronenvervielfacher (17) zugeleitet < wird, daß das von einem Verstärker (I80) weiter verstärkte der Zffllabflorptlon proportionalt Signal an dl· Vertikalablenkplatten, das von einem Verstärker (170) weiter verstärkte der Streuung bzw. dem Zellenvolum proportionale Signal an die Horizontalablenkplatten eines Oszilloskopes (22) angelegt und gleichzeitig eine Helltastung des Kathodenetrahlee mittel« eines aus dem Signale des Elektronenvervielfacher» (18) durch einmalige zeitliche Differentiation
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    gewonnenen Hilfssignales durchgeführt wird, derart, daß die Endpunkte der aufgezeichneten Bildkurven innerhalb keulenförmiger Bereiche liegen, deren Symmetriegeraden Steigungswinkel besitzen, die gegeben sind durch das Verhältnis der Zellabsorption zum Zellvolumen.
    2i Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das der Absorption entsprechende Signal durch Ausleuchtung der zu untersuchenden Zellen mit UV-Licht bei 2537 A, .das der Streuung bzw. dem Zellvolum entsprechende Signal durch Ausleuchtung der Zellen mit einer Wellenlänge über 4000 8 gewonnen wird.
    JJ. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als zwei verschiedenen Spektralbereichen zugeordnete Zelleigenschaften zur Entscheidung des diagnostischen Befundes herangezogen werden.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Zellen in einer isotonischen wässrigen Lösung von Natriumacetat und Essigsäure mit einem pH-Wert in der Nähe von 2 suspendiert werden.
    Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine laufende . Aufzeichnung der gelieferten diagnostischen
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    Ergebnisse mit photographischen Mitteln oder mittels von datenverarbeitenden Maschinen her bekannten Speichervorrichtungen. -
    6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 5·
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