DE2134937C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Erfassen von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen - Google Patents

Description

Es besteht ein großer Bedarf nach einer genauen Analysenmethode für Proben mit kleinen Teilchen, wie sich besonders bei Untersuchungen über die Luftverunreinigung und Wasserverschmutzung, sowie in der medizinischen Forschung und Diagnostik gezeigt hat. Für medizinische Zwecke müssen Blutzellen und anderes biologisches Zellmaterial gezählt und Proben, die derartige Zellen enthalten, analysiert werden, um beispielsweise festzustellen, ob eine bestimmte Zellart in unausgewogenem Verhältnis vorliegt.

Aus der US-PS 34 97 690 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Klassifizieren biologischer Zellen durch Messen ihrer Größe und Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen auf elektrooptischen! Wege bekannt. Bei diesem Verfahren läßt man die einzelnen Zellen nacheinander durch einen quer zum Strom verlaufenden Beleuchtungsstrahl treten und erzeugt dabei für jede optische Reaktion auf jedes Teilchen einen diskreten elektrischen Impuls. Die Impulse werden daraufhin untersucht, ob sie bestimmte Schwellwerte überschreiten, und ihre Amplituden werden miteinander in Beziehung gesetzt. Nachteilig ist daran, daß die kleinen Zellen nur verhältnismäßig schwache Impulse liefern, so daß sie sich nicht oder nur schlecht von Rauschimpulsen unterscheiden lassen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung, mit denen man die Amplituden der von den zu erfassenden kleinen Teilchen ausgehenden erwünschten Impulse derart verstärken kann, daß sie sich von den störenden Rauschsignalen besser unterscheiden lassen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Erfassen von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen, bei dem man die Suspension unter Vereinzelung der Teilchen durch einen querverlaufenden Lichtstrahl treten läßt, mindestens zwei verschiedene optische Reaktionen des Strahls auf jedes Teilchen gleichzeitig mißt und dadurch für jede optische Reaktion auf jedes Teilchen einen diskreten elektrischen Impuls erzeugt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Amplituden der gleichzeitig auftretenden Impulse summiert.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens aus einem Gehäuse mit lichtdurchlässigen Wänden, die eine optische Kammer umschließen, einem Behälter- und Leitungssystem zum Hindurchleiten von Flüssigkeit mit darin suspendierten Teilchen durch die Kammer in einen Strom, in dem die Teilchen einzeln hintereinander befördert werden, einer Lichtquelle zum Richten von Licht durch das Gehäuse und quer durch den Teilchenstrom hindurch, mindestens zwei lichtempfindlichen Abtastelementen, die außerhalb des Gehäuses angeordnet sind und gleichzeitig verschiedene optische

]0 Reaktionen jedes Teilchens auf den Lichtstrahl erfassen und elektrische Impulse in Abhängigkeit von den optischen Reaktionen erzeugen, sowie einer Auswertungsschaltung, wobei die Vorrichtung gekennzeichnet ist durch einen Summenverstärker als Teil der Auswertungsschaltung, der die Impulse addiert um die Anwesenheit jedes Teilchens durch das gleichzeitige Auftreten beider elektrischer Impulse als Summenimpuls anzuzeigen.

Mit dem Verfahren nach der Erfindung werden die echten, von Teilchen herrührenden Reaktionssignale von störenden Rauschsignalen unterschieden.

Die Erfindung soll im folgenden an Hand von Zeichnungen naher erläutert werden, worin
Fig. 1 eine sciiematische Darstellung eines beispielhaften Meßsystems zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

F i g. 2 einen schematischen Schaltplan, der Einzelheiten des Schaltkreises 34 aus F i g. 1 zusammen mit den damit verbundenen Teilen des Systems zeigt, und

Fig. 3 ein Beispiel von Bildmustern, die ausgewählt und auf dem Bildschirm des Kathodenstrahloszilloskops 40 gemäß F i g. 1 dargestellt werden können,
darstellen.

Fig. 1 erläutert, ein beispielhaftes System zur Photoanalyse kleiner Teilchen gemäß der Erfindung. Das System besieht aus einer optischen Kammer 10, durch die ein Teilchenstrom 12 in einer Flüssigkeit aus einem Reservoir 15 über eine Leitung 14 hindurchgeleitet werden kann. Der Teilchenstrom 12 ist vorzugsweise von einer Wasserhülle umgeben, die durch ein Einlaßrohr 16 zugeführt wird, und der kombinierte Strom wird durch ein Abflußrohr 18 aus dem System herausgeführt. Beim Passieren der Kammer wird der Teilchenstrom 12 durch einen schmalen Lichtstrahl 20 aus einer Lichtquelle 22 hindurchgefiihrt. Die Lichtquelle 22 ist vorzugsweise ein Laser und kann Linsen zum Formen und Richten des Lichtstrahles enthalten. Verschiedene optische Reaktionen der einzelnen Teilchen auf den Lichtstrahl 20 werden von den photoelektrischen Abtastelementen 24, 26 und 28 registriert. Das photoelektrische Abtastelement 24, das direkt mit dem Lichtstrahl 20 in einer Richtung liegt, ermittelt den Betrag der Lichtabsorption jedes einzelnen Teilchens. Die photoelektrischen Detektoren 26 und 28 ermitteln die Streuung des Lichtstrahls 20 durch jedes Teilchen in einem engen Winkel. Wenn bei einem typischen Meßvorgang ein Teil der Teilchen gefärbt und andere ungefärbt sind, erhöht sich das optische Absorptionssignal, das von dem photoempfindlichen Element gemessen wird, für die gefärbten Teilchen im Vergleich zu den ungefärbten. Andererseits verändert sich aber die optische Strahlung, die den Engwinkel-Streuungsabtastern 26 und 28 durch Streuung zugeführt wird, nicht wesentlich, oder fällt für die gefärbten Teilchen sogar ab. Auf diese Weise liefern die verschiedenen Signale eine Grundlage zur Unterscheidung der Kennwerte von einzelnen Teilchen sowie für die Auszählung der Gesamtanzahl von Teilchen. Die

Signale, die von den lichtempfindlichen Abtastelementen 24, 26 und 28 gemessen werden, werden durch diese Elemente in elektrische Signalimpulse umgewandelt, die über Verbindungsleitungen 30 und 32 einer Auswertungsschaltung 34 zugeführt werden.

Die Analyse der optischen Reaktionssignale in der Auswertungsschaltung 34 verursacht, daß die Auswertungsschaltung zwei Zählwerke 36 und 38 erregt. Zählwerk 36 liefert eine Auszählung der Gesamtzahl der Teilchen innerhalb einer vorbestimmten Probe, und Zählwerk 38 liefert die Anzahl von Teilchen innerhalb der Probe, die eine bestimmte Kenneigenschaft haben, die unterschieden werden soll, wie beispielsweise eine hohe optische Absorption. Die Auswertungsschaltung 34 ist außerdem vorzugsweise mit einem Kathodenstrahloszilloskop 40 verbunden, um entsprechende Signale dorthin zu liefern.

Die flüssige Probe, die die zu analysierenden Teilchen enthält, kann dem Rohr 14 von einer Quelle, wie beispielsweise dem Reservoir 15, zugeführt werden. Um eine genaue Volumenmessung für eine bestimmte zu analysierende flüssige Probe zu gewährleisten, sind Photozellen 46 und 48 an voneinander beabstandeten Stellen längs des Rohres 14 vorgesehen, das vorzugsweise aus Glas besteht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Flüssigkeit an den entsprechenden Stellen gegenüber den Photozellen zu ermitteln. In der Höhe der entsprechenden Photozellen sind davon getrennte Lichtquellen 50 und 52 vorgesehen. Wenn Flüssigkeit in dem Abschnitt des Rohres 14 unmittelbar zwischen den Lichtquellen 50 und der Photozelle 46 vorhanden ist, so fokussiert die Flüssigkeit das Licht von der Quelle 50 auf die Photozelle 46 und ruft dort ein Signal von einem höheren Intensitätsgrad hervor. Wenn dieser Abschnitt des Rohres 14 leer, d. h. lediglich mit Luft gefüllt ist, wird die Bestrahlung defokussiert und das optische Signal, das in die Photozelle 46 gelangt, entsprechend verringert. Dieser Wechsel in der Signalintensität bei Photozelle 46 wird im Kreis 34 registriert. Photozelle 48 reagiert in analoger Weise auf die Beleuchtung durch Lichtquelle 52. Der Abschnitt des Rohres 14 zwischen den Photozellen 46 und 48 kann als länglicher Behälter mit einem Einlaß bei der Photozelle 46 und einem Auslaß bei Photozelle 48 angesehen werden.

In einer zweckmäßigen Durchführungsform verursacht die Auswertungsschaltung 34, daß die Zählwerke 36 und 38 in ihre Nullstellung zurückkehren, wenn beide Photozellen 46 und 48 die Anwesenheit von Flüssigkeit im Rohr 14 anzeigen. Wenn das Schwanzende der Teilchenprobe die obere Photozelle 46 passiert, so daß die Anwesenheit von Luft statt Flüssigkeit ermittelt wird, wird die Zählung der Teilchen begonnen. Wenn das Schwanzende der Flüssigkeitsprobe die untere Zelle 48 passiert, wird die Übertragung weiterer Zählimpulse an die Zählwerke 36 und 38 unterbrochen. Auf diese Weise werden die in den Zählwerken 36 und 38 gespeicherten Zählwerte auf ein Volumen an Teilchen führende Flüssigkeit bezogen, das genau demjenigen Flüssigkeitsvolumen entspricht, das in der Röhre 14 zwischen den Photozellen 46 und 48 vorhanden ist

F i g. 2 stellt ein Schaltbild der Auswertungsschaltung 34 gemäß F i g. 1 zusammen mit unmittelbar an diesen Kreis angeschlossenen Komponenten dar. In diesem Kreis werden die Absorptionssignale, die durch die Verbindung 30 übermittelt werden, von einem Verstärker 54 verstärkt und über eine Verbindung 56 einem Proben- und Speicherkreis 58 zugeführt. Vom Kreis 58 wird das Signal über eine Verbindungsleitung 60 und einen Gruppenschalter 62 dem X-Achsen-Eingang des Oszilloskops 40 zugeführt. Analog wird das durch die Verbindungsleitung 32 übermittelte Engwinkel-Streusignal in einem Verstärker 64 verstärkt und über eine Verbindungsleitung 66 einem Proben- und Speicherkreis 68 zugeführt. Die Ausgabe von dem Proben- und Speicherkreis 68 wird durch Verbindungsleitungen 70 und Gruppenschalter 62 dem V-Achsen-Eingang des

ίο Oszilloskops zugeleitet. Auf diese Weise kann das Oszilloskop 40 die Funktion der Absorption gegen die Streuung für jedes Teilchen auftragen. Die Proben- und Speicherkreise 58 und 68 sind impulsbildende Kreise oder monostabile Vibratoren, die die Spitzenwerte der entsprechenden Absorptions- und Streusignale über eine bestimmte Zeit langer speichern als der tatsächlichen Dauer der Eingabesignale von den photoempfindlichen Abtastgeräten 24 bis 28 entspricht. In einer zweckmäßigen Durchführungsform entspricht die Speicherzeit etwa 40 Mikrosekunden. Die Speicherung dieser Maximalwerte durch die Proben- und Speicherkreise 58 und 68 ermöglicht eine Darstellung, die die Kombination der Maximalwerte für jedes Teilchen als im wesentlichen einen einzigen Punkt auf dem Bildschirm des Oszilloskops 40 repräsentiert. Ein anderes wesentliches Element für diese Darstellung ist ein Aufhellungssignal, das dem Oszilloskop auf dem dritten Eingang Z zugeführt wird, wie weiter unten ausführlicher beschrieben.

Das verstärkte Absorptionssignal von dem Verstär- ker 54 auf der Ausgabeverbindung 56 wird auch über einen Regelwiderstand 72 einem Verstärker 74 zugeführt. Analog wird das verstärkte Streusignal vom Verstärker 64 über eine Verbindungsleitung 66 und einen Regelwiderstand 76 zusammen mit der Eingabe über Widerstand 72 der Eingabe zum Verstärker 74 zugeführt. Somit empfängt und verstärkt der Verstärker 74 die Summe der Fraktionen der verstärkten Absorptions- und Streusignale, die über die Regelwiderstände 72 und 76 zugeführt werden. Die entsprechenden Fraktionen von Signalen werden durch Einstellung der Regelwiderstände bestimmt Die verstärkte summierte Ausgabe vom Verstärker 74 wird über eine Schwellwertschaltung 78 und einen logischen Und-Schaltungskreis 80 dem Zählwerk 36 zugeführt. Die Schwellwertschaltung 78 arbeitet so, daß sie das verstärkte Summemignal vom Verstärker 74 durchläßt, wenn dieses Signal eine einstellbare bestimmte Schwellenspannung T2 überschreitet Der Schwellenwert TI wird vorzugsweise so hoch gewählt daß Rauschsignale von dem System ausgeschlossen und sämtliche erwünschten Teilchenbestimmungssignale durchgelassen werden. Entsprechend wird der Summenkreis einschließlich Verstärker 74 dazu verwendet um die Anwesenheit von auszuzählenden Teilchen zu bestimmen, und die erhaltenen Impulssignale werden dem Zählwerk 36 zur individuellen Registrierung und Speicherung zugeleitet

Das Summensignal vom Verstärker 74 wird außerdem über eine Verbindungsleitung 98 und eine Schwellwertschaltung 81 beiden Proben- und Speicherkreisen 58 und 68 zugeleitet Das Signal das über die Schwellwertschaltung 81 geleitet wird, ist ein Steueroder Einschaltsignal, das die Probe- und Speicherkreise 58 bzw. 68 veranlaßt auf die Eingabesignale von dem .Absorptionsverstärker 54 und dem Streuverstärker 64 anzusprechen. Auf diese Weise werden durch geeignete Einstellung der Schwelle Tl für die Schwellwertschal-

tung 81 die Proben- und Speicherkreise veranlaßt, lediglich auf die Anwesenheit von erwünschten Teilchensignalen anzusprechen. Die Schwelle Ti wird vorzugsweise leicht unterhalb der Schwelle T2 angesetzt, so daß die Proben- und Speicherkreise 58 und 68 stets gesteuert werden, wenn ein Impuls durch die Schwellwertschaltung 78 hindurchgeht, um im Zählwerk 36 ausgezählt zu werden.

Die Verwendung des Summenverstärkers 74, wie oben beschrieben, zusammen mit den Schaltungen 78 und 81 verursacht eine beträchtliche Erhöhung der Empfindlichkeit der Vorrichtung Signalen gegenüber, die sonst zu schwach sein könnten, als daß man sie als erwünschte Signale erkennen könnte. So können unerwünschte Rauschsignale in den Ausgaben von Streuverstärker 64 oder Absorptionsverstärker 54 auftreten. Derartige Rauschsignale treten jedoch gewöhnlich nicht zusammen auf. Demgemäß dient der summierende Verstärker 74 dazu, um zwischen erwünschten Absorptions- und Streusignalen, die zusammen d. h. gleichzeitig, auftreten, und störenden Signalen, die eine beträchtliche Amplitude besitzen können, zu unterscheiden.

Die verstärkten Absorptions- und Streusignale auf den Verbindungen 56 und 66 werden auch durch Regelwiderstände 82 und 84 einem Differenzmeßverstärker 86 zugeführt. Die Ausgabe vom Verstärker 86 stellt eine algebraische Differenz zwischen einer Fraktion des verstärkten Absorptionssignals, wie es durch die Einstellung des Widerstandes 82 bestimmt wurde, und einer Fraktion des verstärkten Streusignals, wie es durch die Einstellung des Widerstandes 84 bestimmt wurde, dar. Dieses Differenzsignal wird zwei Schwellwertschaltungen 88 und 90 zugeführt, die als unterer bzw. oberer Begrenzungskreis dienen, indem sie Differenzsignale oberhalb einer einstellbaren Schwelle T5 bzw. unterhalb einer einstellbaren Schwelle 7~6 weiterleiten. Ein Wechselrichter 92 an der Ausgabe der Schwellwertschaltung 90 wandelt die Wirkungsweise der Schwellwertschaltung 90 von der einer Untergrenzenschaltung in die einer Obergrenzenschaltung um. Das Ausgangssignal von der Schwellwertschaltung 88 und das Ausgangssignal der Schaltung 90, die durch den Wechselrichter 92 umgekehrt wurde, werden einem logischen Und-Gatter 94 zugeführt und auf diese Weise über ein weiteres Und-Gatter % dem Zählwerk 38. Das Und-Gatter 94 ist ein Und-Gatter mit vier Eingängen, das lediglich auf die Anwesenheit von Eingabesignalen an allen vieren seiner Eingänge anspricht Die anderen beiden Eingaben werden von dem Summenverstärker 74 über eine Verbindungsleitung 98 und Schwellwertschaltungen 100 und 102 übermittelt wobei die Ausgabe von Schaltung 102 von einem Wechselrichter umgekehrt wird.

Auf diese Weise muß ein einzelnes Teilchen, damit man eine Ausgabe vom Und-Gatter 94 erhält, ein Summensignal über den Verstärker 74 erzeugen, das zwischen einer unteren Schwelle Γ3, bestimmt durch Schwellwertschaltung 100, und einer oberen Schwelle 7"4, bestimmt durch Schaltung 102, liegt, sowie ein Differenzsignal, das zwischen den Schwellen T5 und Γ6 liegt Daher wird das Teilchen, wenn seine Signale in dem Bereich sämtlicher dieser Meßschwellen fallen, gezählt und die Zählung in dem Zählwerk 38 registriert Auf diese Weise wird ein sehr genaues Mittel zur Aushl und Auszählung von Teilchen mit besonderen Eigenschaften erhalten, wie im einzelnen in Verbindung mit F i g. 3 beschrieben wird.

Um sicherzugehen, daß die Teilchen in der ausgewählten Klasse, die im Zählwerk 38 gezählt werden, auch Teilchen sind, die von dem Gesamtteilchenzähler im Zählwerk 36 erfaßt werden, muß das Und-Gatter 96 von dem Ausgabesignal auf der Verbindungsleitung 110 von dem Und-Gatter 80 für die Gesamtteilchenzählung geöffnet werden. Auf diese Weise wird kein Teilchen im Zähler 38 gezählt, wenn es nicht auch im Zähler 36 gezählt wird.

ίο Mittels einer Verbindungsleitung 106 und eines Schalters 108 werden die Teilchenimpulse, die vom Zählwerk 38 empfangen werden, auch dazu verwendet, um den Aufhellungskreis Z des Kathodenstrahloszilloskops 40 zu steuern. Auf diese Weise wird, während Schalter 108 in der gezeigten Stellung ist, lediglich die Angabe für die Teilchen, die tatsächlich vom Zählwerk 38 ausgezählt werden, abgebildet, da der Kathodenstrahlenoszilloskopstrahl so aufgehellt wird, daß er nur für diese bestimmten Teilchensignale sichtbar ist.

Gewünschtenfalls kann Schalter 108 in die andere Stellung umgelegt werden, um eine Verbindung zu einer Leitung 110 herzustellen, die die Signale zum Eingang des Zählwerks 36 befördert. Auf diese Weise werden die Signale für alle Teilchen, die ausgezählt werden, vom Oszilloskop 40 dargestellt.

Derjenige Teil des Kreises, gemäß F i g. 2, der zu den Photozellen 46 und 48 zum automatischen Messen eines vorherbestimmten Flüssigkeitsvolumens, das Teilchen enthält, gehört, ist wie folgt aufgebaut: Die Photozelle 46 ist über einen Widerstand 111 mit einem Verstärker 112 verbunden, so daß sie am Anschluß 113 eine Ausgabe in Abhängigkeit von der Ermittlung von Flüssigkeit in dem Rohr 14, die das Licht auf die Photozelle 46 bündelt, liefert. Analog führt die Anwesenheit von Flüssigkeit gegenüber Photozelle 48 zu einem Signal über Widerstand 114 zum Verstärker 115. Wenn beide dieser Einstellungseingaben vorhanden sind, wird der Flipflop 117 in den Einstellungszustand verschoben, wodurch an dem Rückstellungsausgabenanschluß 118 eine logische Nullausgabe erzeugt wird. Diese Rückstellungsausgabe wird in einem Wechselrichter ί 19 umgekehrt und über einen Anschluß 120 und eine Wechselstromkupplung, die von einem Kondensator 121 dargestellt wird, geleitet um beide Zählwerke 36 und 38 rückzustellen. Dieses Signa! stellt auch einen Flipflop 138, dessen Wirkungsweise weiter unten beschrieben wird, zurück. Eine andere Ursache für ein Rückstellungssignal ist durch einen von Hand zu bedienenden Rückstellungsdruckknopf 122 vorgesehen, der dann benutzt wird, wenn die automatische Volumenanzeige angewandt wird.

Um eine falsche Arbeitsweise der Volumenmeßvorrichtung zu verhindern, wenn etwa nur ein reiner Wassertropfen durch das Rohr 14 hindurchgeht werden die Verstärker 112 und 115 durch die Kondensatoren 112-4 und USA geshuntet Diese Kondensatoren versorgen in Verbindung mit den Eingabewiderständen 111 und 114 jeden der Verstärker 112 und 115 mit einer Zeitverzögerungsansprechcharakteristik, so daß eine Zeitverzögerung von mehreren Sekunden erforderlich ist während der die Photozelle kontinuierlich Flüssigkeit »sehen« muß, ein wirksames Ausgabesignal zur Veränderung des Zustandes des Flip-Flops 117 oder zur Durchführung einer der anderen Schaltfunktionen, wie sie weiter unten beschrieben sind, gegeben wird. Diese Zeitverzögerung kann vorzugsweise m der Größenordnung von 5 Sekunden liegen. ledoch in dem Augenblick, in dem eine Photozelle Luft anstatt Flüssigkeit »sieht«.

ist der daraus resultierende Abfall in dem Signal wegen der Anwesenheit der Dioden 111/4 und 114/4, die die Widerstände 111 bzw. 114 shunten, ein plötzlicher Abfall. Auf diese Weise wird der Kreis, wenn nur ein reiner Wassertropfen ermittelt wird, schnell wieder rückgestellt, um den Zeitverzögerungszyklus wieder zu beginnen. Sobald der Flip-Flop 117 in den eingestellten Zustand versetzt ist, wird ein Einstellungsausgabesignal über einen Schalterkontakt 123 und einen Anschluß 124 dem Und-Gatter 80 zugeführt, um eine der Einschalteingaben für dieses Und-Gatter zu liefern. Wenn danach das Schwanzende der Flüssigkeitsprobe die Photozelle 46 passiert, wird der dadurch hervorgerufene Wechsel in der Photozellenausgabe von Anschluß 113 über einen Wechselrichter 125, einen Hebelschalter 126 und einen Anschluß 127 durch das Und-Gatter 80 nachgewiesen. Dadurch erhält man das Endeinschaltsigna!, um Gatter 80 zu öffnen und die Übermittlung der Teilchenzählsignale über Verstärker 78 zu beginnen. Die Hebelschalter 123 und 126 sind zusammen gekuppelt und können von der dargestellten automatischen Stellung auf eine manuelle Stellung umgelegt werden, in der derartige Spannungsbedingungen erzielt werden, daß das Gatter 80 kontinuierlich eingeschaltet ist.

Die Ausgabe aus dem Wechselrichter 125 wird außerdem als eine der Rückstellungseingaben dem Flip-Flop 117 zugeführt. Wenn die zweite Photozelle 48 den Durchtritt des Schwanzendes der Flüssigkeitsprobe erfaßt, wird die dadurch hervorgerufene Signaländerung bei Anschluß 116 durch den Wechselrichter 128 erfaßt, um die zweite Rückstellungseingabe dem Flip-Flop 117 zuzuführen, wodurch der Flip-Flop rückgestellt wird. Dadurch wird die Einstellausgabe entfernt, die über Schalter 123 und Anschluß 124 dem Gatter 80 zugeführt wird und dadurch Gatter 80 abgeschaltet, und die Zählwerke 36 und 38 werden angehalten. Auf diese Weise sind die Zählwerte, die in den Zählwerken 36 und 38 gespeichert sind, Zählungen, die genau auf einer Teilchenprobe beruhen, die aus einem Volumen von teilchenhaltiger Flüssigkeit stammen, das durch das Volumen zwischen den Photozellen 46 und 48 gemessen ist, und lediglich die Teilchen innerhalb des abgemessenen Volumens sind aufgrund des Aufhellungssignals, das aus dem Oszilloskop 40 über den Schalter 108 zugeführt wird, sichtbar.

Eine dritte Eingabe wird normalerweise auf kontinuierlicher Grundlage dem Und-Gatter 96 von der Nullstellungsausgabe eines Flip-Flop 138 zugeführt Jedoch wird dieses Signal unterbrochen, wenn der Flip-Flop 138 durch ein Signal auf die Einstelleingabe dieses Flip-Flop eingestellt wird, das über einen Schalter 140 vom Zählwerk 36 geliefert wird Schalter 140 ist ein Wählschalter, der dazu verwendet werden kann, um ein gewünschtes Ausg-ibesignal vom Zählwerk 36 entsprechend der Erreichung eines bestimmten Zählwertes im Zählwerk 36 auszuwählen. Ganz allgemein zählt das Zählwerk 36 sämtliche Teilchen innerhalb einer ausgewählten Probe und der Zähler 38 nur diejenigen Teilchen, die bestimmte Ansprüche erfüllen. Durch Einstellen des Wählschalters 140 kann das Zählwerk 38 veranlaßt werden, an einem bestimmten ausgewählten Gesamtzählwert der im Zählwerk 36 gespeichert ist aufzuhören. Dann stellt die im Zählwerk 36 gespeicherte Zählung unmittelbar das Verhältnis zwischen dem Zählwert der im Zählwerk 38 aufgezeichnet ist und der ausgewählten Gesamtzählung der Teilchen, die durch die Einstelhmg des Schalters 140 bestimmt ist dar. Vorzugsweise können die Einstellungen des Schalters 140 Vielfache von 10 in der Gesamtzahl darstellen, die durch das Zählwerk 36 erreicht wird. Der Zählwert, der im Zählwerk 38 gespeichert ist, nachdem dieses Zählwerk gestoppt wurde, liefert danach eine unmittelbare Angabe des prozentualen Anteils der gesamten Teilchen, der die besonderen Eigenschaften besitzt, die durch die das UND-Gatter 94 speisenden Kreise ermittelt werden sollen. Dies ist ein besonders wertvolles Kennzeichen, da es eine automatische Registrierung eines prozentualen Anteiles gestattet, ohne daß eine getrennte Rechnung vorgenommen werden muß. Außerdem stört der Betrieb des Kreises, der mit dem Flip-Flop 138 verbunden ist, nicht den übrigen Betrieb des Gesamtteilchenzählwerkes 36. Auf diese Weise kann das Zählwerk 36 die Gesamtzahl von Teilchen innerhalb einer abgemessenen Probe weiterzählen und registrieren.

In einer zweckmäßigen Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt der Wählschalter 140 nicht nur Vielfache von 10 in der Gesamtzählung, sondern es ist außerdem ein Gruppenschalter, der noch einen — nicht gezeigten — Drehschalterkontakt besitzt, der eine Einschalt- oder Steuerspannung mit ausgewählten Dezimalkommastellen im Zählwerk 38 verbindet, um so geeignete genaue Angaben der prozentualen Zählung, die schließlich im Zählwerk 38 gespeichert ist, zu liefern. Die Genauigkeit dieser prozentualen Zählung wird durch die Steuerung des Und-Gatters 96 über den Anschluß 110 durch das Gesamtteilchenzählsignal von Gatter 80 noch vergrößert. Diese Eingabe zum Und-Gatter % stellt sicher, daß kein Teilchen vom Zählwerk 38 als Mitglied der speziell ausgewählten Teilchenklasse gezählt wird, wenn es nicht außerdem als Teilchen in dem Gesamtteilchenzählregister 36 erfaßt wird.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung kann dazu verwendet werden, um eine Dauerregistrierung von Versuchsergebnissen durchzuführen. Die Zählungen, die von den Zählwerken 36 und 38 gespeichert werden, können auf einem — nicht dargestellten — Datenregistriermittel gespeichert werden. Außerdem ist eine grafische Registrierung des Versuchs leicht dadurch möglich, daß man einen photographischen Film gegenüber den optischen Signalen, die auf dem Schirm des Kathodenstrahlenoszilloskops 40 hervorgebracht werden, exponiert. Jedes Teilchen, das in den Bereich der ausgewählten Teilchengruppe fällt wird danach durch eine Schwärzung auf dem Film, die von dem Lichtpunkt herrührt der durch die Anwesenheit des betreffenden Teilchens hervorgerufen wird, registriert Das Oszilloskop 40 kann auch so geschaltet werden,

daß es eine Angabe der Summen- und Differenzsignale statt der Absorptions- und Streusignaie registriert Dies wird dadurch bewerkstelligt daß man den Gruppenschalter 62 auf die unterste Stellung einstellt um die Ausgabe des Differenzverstärkers 86 über den Anschluß 142 zur y-Achsen-Eingabe des Oszilloskops 40 und die Summen-Signalausgabe von Verstärker 74 über den Anschluß 98 zur X-Achsen-Eingabe des Oszilloskops schaltet Die Widerstände 82 und 84 an den Eingaben des Differenzverstärkers 86 werden dann leicht so eingestellt daß das Differenzsignal für Teilchen mit einer Mindestabsorptionscharakteristik praktisch gleich Null ist (keine F-Achsen-Ablenkung). Beispielsweise

es können diese Teilchen ungefärbte Blutzellen sein. Dadurch, daß man diese besondere Einstelhmg vorsieht, in der das Mindestabsorptionssignal durch Subtraktion vgn dem Streusignal gestrichen wird, wird eine gefärbte

Zelle mit beträchtlicher Absorption sehr leicht unterschieden, da die Vorrichtung lediglich die Zunahme in dem Absorptionssignal, die durch die Anwesenheit der Farbe verursacht wird, ermittelt, während das Streusignal praktisch konstant bleibt oder für gefärbte Zellen sogar abnimmt.

Um die Absorptions- und Streuverstärker 54 und 64 lediglich auf Veränderungen in den optischen Abtastsignalen von den optischen Abtastern 24—26, die durch den Durchtritt von zu messenden Teilchen hervorgerufen werden, abhängig zu machen, sind Schwellwerlbeg-enzer und Integratorverstärker vorgesehen, um Rückführungssignale zu erzeugen. Auf diese Weise ist an der Ausgabe des Absorptionsverstärkers 54 ein Begrenzer- oder Clipperverstärker 148 vorgesehen, der einen Integratorverstärker 150 speist, wodurch ein Rückführungssignai durch RückführungsanschiuB 152 zu dem Absorptionssignalverstärker 54 geliefert wird. Der Clipperverstärker 148 liefert ein abgeschnittenes Ausgangssignal, das nicht auf die Peak-Signale, die :o durch den Durchtritt von Teilchen mit hoher Absorption hervorgerufen werden, anspricht. Der Integratorverstärker 150 speichert und verstärkt einen integrierten Wert des abgeschnittenen Ausgangssignals und liefert dieses integrierte Ausgangssignal als Gegenkopplung an den Verstärker 54, wodurch der Verstärker 54 praktisch unempfindlich gegenüber Fließgleichgewichts- und Niedrigfrequenzeneingaben von dem lichtempfindlichen Abtastelement 44 gemacht wird. In einer bevorzugten Durchführungsform erstreckt sich Jo diese Unempfindlichkeit auf Rauschen bis etwa 2000 Hertz. Die tatsächlichen Teilchensignale besitzen eine Anstiegsrate, die einer Frequenz oberhalb 2000 Hz entspricht.

Ein Clipperverstärker 154 und ein Integratorverstärker 156 werden in analoger Weise mit der Ausgabe des Streuverstärkers 64 verbunden und sind in einem Gegenkopplungsweg 158 verbunden, um für den Verstärker 64 eine ähnliche Fließgleichgewichts- und Niedrigfrequenzeleminierungsfunktion zu gewährleisten. F i g. 3 erläutert, wie die Schwellen Γ3, Γ4, Γ5 und Γ6 des Kreises gemäß Fig.2 eingestellt werden können, um lediglich Teilchensignale, die in dem Bereich eines gewünschten Gebietes auf dem Schirm des Oszüloskopes 40 fallen, auszuwählen. Die gewünschte Fläche kann als Fenster bezeichnet werden, weil diese Schwellen die Grenzen eines Gebietes definieren, durch das der Beobachter eine Darstellung der Charakteristika von lediglich derjenigen Teilchengruppe sehen kann, die ausgewählt worden ist. Das Gebiet kann auch als so elektronisch bestimmte öffnung angesehen werden. Auf diese Weise stellt F i g. 3 Muster dar, die für das Fenster oder die öffnung auf de—. Schirm des Kaihodenstrahloszilloskops 40 dargestellt werden können.

Gemäß einer Durchführungsform der Erfindung werden Absorptionssignale auf die .Y-Achse des Oszilloskops und Streusignale auf die V-Achse gegeben. Wenn die Regelwiderstände 72 und 76, die den Summenverstärker 74 gemäß Fig.2 speisen, so eingestellt sind, daß die Absorptions- und Streusignale praktisch die gleiche Wirkung bei der Bestimmung der Ausgabe des Summenverstärkers 74 haben, dann definiert die Untergrenzenschwellwertschaltung 100 eine Untergrenzenschwellwertkennlinie, die praktisch eine um 45" geneigte linie ist, wie bei Γ3-1 in Fig.3 dargestellt Analog definiert die Obergrenzenschwellwertschaltung 102 ebenfalls einen Grenzwert, der durch eine um 45° geneigte Linie, dargestellt bei Γ4-1, dargestellt wird. Die Verschiebung beider dieser Kurven von der unteren linken Ecke des Schirms aus kann durch Änderung des Wertes der entsprechenden Schwellen Γ3 und Γ4 erfolgen.

Das Differenzsignal von dem Differenzverstärker 86 stellt mathematisch eine Funktion des Absorptionssignals minus einer Funktion des Streusignals dar. Wenn die Regelwiderstände 82 una 84 so eingestellt werden, daß die Absorptions- bzw. Streueingaben praktisch die gleiche Wirkung auf J^:~. Ausgabe des Verstärkers 86 haben, dann sind Form uuJ igung der Grenzen des Fensters oder der öffnung, die durch die Schwellwertschaltungen 88 und 90 bestimmt werden, jeweils praktisch um 45° geneigte Linien, die sich nach rechts oben erstrecken, wie in F i g. 3 durch die Linien Γ5-1 und Γ6-1 dargestellt. Die vertikalen Stellungen dieser Schweücniinicn können durch Einstellen der damit verbundenen Schwellwerte Γ5 und Γ6 einreguliert werden. Auf diese Weise wird durch Verringerung des Wertes jeder Schwelle die entsprechende Schwellenlinie nach oben verschoben. Umgekehrt wird durch Erhöhung des Schwellwertes die Schwellenlinie nach unten verschoben. Somit können durch Auswahl der Schwellwerte und Steilheit der Kennlinien, wie beschrieben, Fenster oder öffnung, wie sie durch die Linien Γ3-1, Γ4-1, Γ5-1 und Γ6-1 definiert sind, so gewählt werden, daß sie ein Fenster bilden, das TeilchencharakteristiKa innerhalb eines vorherbestimmten Gebietes, wie des mit der Bezugszahl 160 versehenen, auswählt.

Wenn ein anderes Gebiet, wie beispielsweise das mit der Bezugszahl 162 bezeichnete, ausgewählt werden soll, können die entsprechenden Einstellungen des Summen- und Differenzverstärkerverhältnisses und der Schwellen vorgenommen werden, um dieses Gebiet statt des Gebietes 160 auszuwählen. Diese modifizierten Schwellen sind durch die Linien Γ3-2, 74-2, Γ5-2 und Γ6-2 dargestellt. Obwohl dieses zweite Fenster in Fig. 3 so dargestellt ist. als wenn es zugleich mit dem ersten Fenster Γ3-1 bis Γ6-1 erscheinen würde, so versteht es sich, daß diese beiden Fenster nicht zur gleichen Zeit vorhanden sind, da sie verschiedene Arbeitsweisen desselben Komponenten darstellen.

Um die Summenschwelienkurven T3-2 und Γ4-2 zu erhalten, werden die Regelwiderstände 72 und 76 so eingestellt, daß die Wirkung des Absorptionssignals, das durch den Regelwiderstand 72 geliefert wird, vermindert und die Wirkung des Streusignals, das durch den Regelwiderstand 76 dem Summenverstärker 74 zugeführt wird, erhöht werden. Somit üben Änderungen im Streusignal eine große, im Absorptionssignal dagegen eine sehr geringe Wirkung auf diese Kennlinien aus.

Urr. die Schweüer.kennünier. Γ5-2 und Γ6 2 mit geringer Steilheit zu erzielen, wird das Verhältnis der Eingaben in den Differenzverstärker 86 verändert so daß die Wirkung des Streusignals, das durch den Regelwiderstand 84 geliefert wird, vermindert und die Wirkung des Absorptionssignals, das durch den Regelwiderstand 82 geliefert wird, erhöht wird. Dies führt zu einer relativen Unabhängigkeit dieser Kennlinien von dem Streusignal und macht sie in der Hauptsache von dem Absorptionssignal auf der horizontalen Achse abhängig.

Während die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die Ermittlung von Absorptions- und Streusignalen beschrieben wurde, so ist selbstverständlich die Erfindung ebenso auf andere optische, von Teilchen ausgehende Reaktionssignale anwendbar.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (14)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Erfassen von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen, bei dem man die Suspension unter Vereinzelung der Teilchen durch einen querverlaufenden Lichtstrahl treten läßt, mindestens zwei verschiedene optische Reaktionen des Strahls auf jedes Teilchen gleichzeitig mißt und dadurch für jede optische Reaktion auf jedes Teilchen einen diskreten elektrischen Impuls erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amplituden der gleichzeitig auftretenden Impulse summiert

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Ermittlung der Gesamtzahl der Teilchen innerhalb einer Teilchenprobe die Summenimpulse zählt

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Teilchen mit bestimmten Eigenschaften optisch von anderen unterscheidet, indem man für jedes Teilchen zusätzlich das Verhältnis der Amplituden der gleichzeitig auftretenden diskreten Impulse von den verschiedenen optischen Reaktionen bildet und außer der Gesamtzahl der Teilchen noch die Zahl derjenigen Teilchen bestimmt, für die dieses Verhältnis einen der bestimmten Eigenschaft entsprechenden Wert besitzt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis der Amplituden der gleichzeitig auftretenden diskreten elektrischen Impulse von verschiedenen optischen Reaktionen durch Subtrahieren der Amplitude des Impulses einer optischen Reaktion von der Amplitude des Impulses einer anderen optischen Reaktion unter Gewinnung eines Differenzsignals mißt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zahl derjenigen Teilchen innerhalb der gesamten Teilchenprobe bestimmt, die bestimmte Eigenschaften besitzen, indem man die Kombination der gleichzeitig auftretenden diskreten elektrischen Impulse lediglich von denjenigen Teilchen zählt, die einen Summenimpuls zwischen vorherbestimmten Impulsintensitäten und einen Differenzimpuls zwischen vorherbestimmten Impulsintensitäten liefern.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amplituden der elektrooptisch erhaltenen diskreten elektrischen Impulse getrennt verändert, um ausgewählte Funktionen der einzelnen optischen Reaktionen vor der Bildung der Summe der Impulse zu erhalten und dadurch eine gewichtete Summe zur besseren Unterscheidung zwischen erwünschten Teilchenreaktionssignalen und unerwünschten Rauschsignalen zu erzeugen.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche aus einem Gehäuse mit lichtdurchlässigen Wänden, die eine optische Kammer umschließen, einem Behälterund Leitungssystem zum Hindurchleiten von Flüssigkeit mit darin suspendierten Teilchen durch die Kammer in einen Strom, in dem die Teilchen einzeln hintereinander befördert werden, einer Lichtquelle zum Richten von Licht durch das Gehäuse und quer durch den Teilchenstrom hindurch, mindestens zwei lichtempfindlichen Abtastelementen, die außerhalb des Gehäuses angeordnet sind und gleichzeitig verschiedene optische Reaktionen jedes Teilchens auf den Lichtstrahl erfassen und elektrische Impulse in Abhängigkeit von den optischen Reaktionen erzeugen, sowie einer Auswertungsschaltung, gekennzeichnet durch einen Summenverstärker (74) als Teil der Auswertungsschaltung, der die Impulse addiert, um die Anwesenheit jedes Teilchens durch das gleichzeitige Auftreten beider elektrischer Impulse als Summenimpuls anzuzeigen.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, gekennzeichnet durch Verstärker (54, 64), die jedem der lichtempfindlichen Abtastelemente (24, 26) zum getrennten Verstärken der Impulse nachgeschaltet sind, sowie Regelwiderstände (72, 76) zum getrennten Verändern der verstärkten Impulse, bevor sie dem Summenverstärker (74) zugeführt werden, um einen gewichteten Summenimpuls zu erzeugen.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der getrennten Verstärker (54, 64) einen Hauptverstärker (54, 64) und einen Begrenzerverstärker (148,154) sowie einen Integratorverstärker (150, 156), die in Kaskadenschaltung miteinander verbunden sind, aufweist, wobei der Begrenzerverstärker und der Integratorverstärker ein Gegenkopplungssignal (152 bis 158) an den Hauptverstärker liefern, das einen integrierten Wert der. abgeschnittenen Ausgangssignals des Begrenzerverstärkers darstellt, um dadurch den Hauptverstärker praktisch unempfindlich gegenüber eingesch'vungenen oder niederfrequenten Eingangssignalen der zugehörigen lichtempfindlichen Abtastelemente zu machen.

10. Vorrichtung gemäß Ansprüche oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertungsschaltung zusätzlich einen Differenzverstärker (86) zur Erzeugung eines Differenzimpulses aus den eingegebenen elektrischen Impulsen enthält, sowie Regelwiderstände (82, 84) zum getrennten Verändern der dem Differenzverstärker zugeführten Impulse, um dadurch einerseits einen Differenzimpuls vom Betrag Null zu erzeugen, wenn Teilcheneigenschaften, von denen die optischen Reaktionsimpulse hervorgerufen werden, nicht bestimmt werden sollen, andererseits aber einen meßbaren Differenzimpnls zu erzeugen, wenn die optischen Reaktionsimpulse bestimmt werden sollen.

11. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Schwellwertschaltung (78) angeschlossen ist, die derart betreibbar ist, daß sie lediglich diejenigen Summenimpulse durchläßt, die einen bestimmten Schwellwert überschreiten.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zählwert (36) an die Schwellwertschaltung (78) angeschlossen ist und auf die Surnmenimpulse anspricht, die durch die Schwellwertschaltung zum Zählen und Registrieren jedes der Impulse hindurchgelassen werden.

13. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum optischen Unterscheiden von Teilchen, die bestimmte Eigenschaften haben, innerhalb einer Teilchengruppe, die auch solche Teilchen umfaßt, die diese Eigenschaften nicht besitzen, und zum automatischen Errechnen des Anteils der Gesamtzahl von Teilchen innerhalb einer Teilchengruppe, die die bestimmten Eigenschaften besitzen, ein erstes Zählwerk (36) zum Zählen der Impulse von dem Summenkreis enthält, um dadurch sämtliche zu untersuchenden Teilchen zu zählen, sowie ein

zweites Zählwerk (38) zum Zählen der Impulse von dem Differenzkreis, um dadurch die Teilchen mit den bestimmten Eigenschaften zu zählen, wobei das erste Zählwerk so betreibbar ist, daß es nach Erreichen eines vorherbestimmten Zahlwertes ein Ausgabesignal (bei 140,138) liefert und dem zweiten Zählwerk (bei 96) zuführt, und das. zweite Zählwerk (38) auf den Empfang des zuletzt erwähnten Signals hin abschaltbar ist, um dadurch automatisch das Verhältnis zwischen dem vom zweiten Zählwerk registrierten Wert und dem vorherbestimmten Zählwert des ersten Zählwerkes anzuzeigen.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der vorherbestimmte Zählwert, bei dem das -erste Zählwerk (36) das Signal zum Anhalten des zweiten Zählwerks (38) erzeugt, gleich einer Zahl ist, die eine Potenz von 10 ist, so daß das Verhältnis zwischen der im zweiten Zählwerk gespeicherten Zählung, nachdem es angehalten wurde, und dem vorbestimmten Zählwert des ersten Zählwerks ein Prozentverhältnis darstellt.