DE2134937A1

DE2134937A1 - Verfahren und vorrichtung zur analytischen bestimmung kleiner teilchen

Info

Publication number: DE2134937A1
Application number: DE19712134937
Authority: DE
Inventors: Louis A Kamentsky; Isaac Klinger
Original assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Current assignee: BIO PHYSICS SYSTEMS Inc
Priority date: 1971-07-13
Filing date: 1971-07-13
Publication date: 1973-02-01
Also published as: DE2134937C2

Description

Verfahren und Vorrichtung zur analytischen Bestimmung kleiner Teilchen Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von Materialproben, die sehr kleine Teilchen, wie beispielsweise Blutzellen, enthalten.
Es besteht großer Bedarf nach einer genauen Analysemethode für Proben mit kleinen Teilchen. Dieser Bedarf macht sich besonders bei Untersuchungen über die Bedingungen für Luftverunreinigung und Wasserverschmutzung bemerkbar. Auch in der medizinischen Forschung und Diagnostik ist er von großer Bedeutung. Für medizinische Zwecke müssen Blutzellen und anderes biologisches Zellmaterial gezählt werden und Proben, die derartige Zellen enthalten, müssen analysiert werden, um beispielsweise festzustellen, ob eine bestimmte Zellenart in unausgewogenem Verhältnis vorliegt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum schnellen Messen und Bestimmen kleiner Teilchen in einer Probe aus zu analysierenden Teilchen, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Teilchen nacheinander in einem Strom durch einen querverlaufenden Beleuchtungsstrahl treten läßt, mindestens zwei verschiedene optische Reaktionen auf den Strahl durch jedes Teilchen auf elektro-optischem Wege mißt und dadurch für jede optische Reaktion auf jedes Teilchen einen diskreten elektrischen Signalimpuls erzeugt, die Amplituden der elektrischen Signalimpulse von den verschiedenen optischen Reaktionen summiert und den erhaltenen Summensignalimpuls zur Bestimmung, ob die Amplitude einen vorherbestimmten Schwellenwert überschreitet, untersucht.
Auf diese Weise werden die echten, von Teilchen herrührenden Reaktionssignale von störenden Rauschsignalen unterschieden, d.h., es wird eine hinreichende Empfindlichkeit für den Signalnachweis erzielt. Die unterschiedlichen optischen Reaktionen, die durch die verschiedenen elektro-optischen Einrichtungen erfaßt werden, erzeugen elektrische Signale, die zur Bestimmung der Unterschiede in den verschiedenen Teilchen während des Abtastens verwendet werden können. Vorzugsweise werden die Teilchen sehr schnell durch die optische Abtaststation geführt, und der optische Beleuchtungsstrahl ist vorzugsweise sehr eng begrenzt, so daß die elektrischen Signale, die durch die Teilchen erzeugt werden, in kurzen Impulsen auftreten.
Die Erfindung soll im folgenden anhand von ZeicEnungen erläutert werden, worin Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Meßsystems zur Durchführung de-s erfindungsgemäßen Verfahrens, Fig. 2 ein schematischer Schaltplan, der Einzelheiten des Schaltkreises 34 aus Figur 1 zusammen mit den damit verbundenen Teilen des Systems zeigt und Fig. 3 ein Beispiel von Bildmustern, die ausgewählt und auf dem Bildschirm des Kathodenstrahloszilloskops 40 gemäß Figur 1 dargestellt werden können, darstellen.
Figur 1 erläutert ein System zur Photoanalyse kleiner Teilchen gemäß der Erfindung. Das System besteht aus einer optischen Kammer 10, durch die ein Teilchenstrom 12 in einer Plüssigkeit aus einem Reservoir 15 über eine Leitung 14 hindurchgeleitet werden kann. Der Teilchenstrom 12 ist vorzugsweise von einer Wasserhülle umgeben, die durch ein Einlaßrohr 16 zugeführt wird, und der kombinierte Strom wird durch ein Abflußrohr 18 aus dem System herausgeführt. Beim Passieren der Kammer wird der Teilchenstrom 12 einen schmalen Lichtstrahl 20 aus einer Lichtquelle 22. Die Lichtquelle 22 ist vorzugsweise ein Laser und kann Linsen zum Formen und Richten des Lichtstrahles enthalten. Verschiederle optische Reaktionen der einzelnen Teilchen auf den Lichtstrahl 20 werden von den photoelektrischen Abtastelementen 24, 26 und 28 registriert. Das photoelektrische Abtastelement 24, das direkt mit dem Lichtstrahl 20 in einer Richtung liegt, ermittelt den Betrag der Lichtabsorption jedes einzelnen Teilchens. Die photoelektrischen Detektoren 26 und 28 ermitteln die Streuung des Lichtstrahls 20 durch jedes Teilchen in einem engen Winkel. Wenn bei einem typischen Meßvorgang ein Teil der Teilchen gefärbt und andere ungefärbt sind, erhöht sich das optische Absorptionssignal, das von dem photoempfindlichen Element gemessen wird, für die gefärbten Teilchen im Vergleich zu den ungefärbten. Andererseits verändert sich aber die optische Strahlung, die den Engwinkel-Streuungsabtastern 26 und 28 durch Streuung zugeführt wird, nicht wesentlich, oder fällt für die gefärbten Teilchen sogar ab. Auf diese Weise liefern die verschiedenen Signale eine Grundlage zur Unterscheidung der Kennwerte von einzelnen Teilchen sowie für die Aus zählung der Gesamtanzahl von Teilchen.
Die Signale, die von den lichtempfindlichen Abtastelementen 24, 26 und 28 gemessen werden, werden durch diese Elemente in elektrische Signalimpulse umgewandelt, die über Verbindungsleitungen 30 und 32 einem Auswertungskreis 34 zugeführt werden.
Die Analyse der optischen Reaktionssignale im Kreis 34 verursacht, daß der Kreis zwei Zählwerke 36 und 38 erregt. Zählwerk 36 liefert eine Aus zählung der Gesamtzahl der Teilchen innerhalb einer vorbestimmten Probe, und Zählwerk 38 liefert die Anzahl von Teilchen innerhalb der Probe, die eine bestimmte Kenneigenschaft haben, die unterschieden werden soll, wie beispielsweise eine hohe optische Absorption. Der Kreis 34 ist außerdem vorzugsweise mit einem Kathodenstrahloszilloskop 40 verbunden, um entsprechende Signale dorthin zu liefern.
Die flüssige Probe, die die zu analysierenden Teilchen enthält, kann dem Rohr 14 von einer Quelle, wie beispielsweise dem Reservoir 15, zugeführt werden. Um eine genaue Volumenmessung für eine bestimmte zu analysierende flüssige Probe zu gewShrleisten, sind Photozellen 46 und 48 an voneinander beabstandeten Stellen längs des Rohres 14 vorgesehen, das vorzugswei se aus Glas besteht, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Blüssigkeit an den entsprechenden Stellen gegenüber den Photozellen zu ermitteln. In der Höhe der entsprechenden Photozellen sind davon getrennte Lichtquellen 50 und 52 vorgesehen.
Wenn Flüssigkeit in dem Abschnitt des Rohres 14 unmittelbar zwischen den Lichtquellen 50 und der Photozelle 46 vorhanden ist, so fokussiert die Flüssigkeit das Licht von der Quelle 50 auf die Photozelle 46 und ruft dort ein Signal von einem höheren Intensitätsgrad hervor. Wenn dieser Abschnitt des Rohres 14 leer, d.h. lediglich mit Luft gefüllt ist, wird die Bestrahlung defokussiert und das optische Signal, das in die Photozelle 46 gelangt, entsprechend verringert. Dieser Wechsel in der Signalintensität bei Photozelle 46 wird im Kreis 34 registriert. Photozelle 48 reagiert in analoger Weise auf die Beleuchtung durch Lichtquelle 52. Der Abschnitt des Rohres 14 zwischen den Photozellen 46 und 48 kann als länglicher Behälter mit einem Einlaß bei der Photozelle 46 und einem Auslaß bei Photozelle 48 angesehen werden.
In einer bevorzugten Durchführungsform verursacht der Kreis 34, daß die Zählwerke 36 und 38 in ihre Nullstellung zurückkehren, wenn beide Photozellen 46 und 48 die Anwesenheit von Flüssigkeit im Rohr 14 anzeigen. Wenn das Schwanzende der Teilchenprobe die obere Photozelle 46 passiert, so daß die Anwesenheit von Luft statt Flüssigkeit ermittelt wird, wird die Zählung der Teilchen begonnen.Wenn das Schwanzende der Flüssigkeitsprobe die untere Zelle 48 passiert,wird die Ubertragung weiterer Zählimpulse an die Zählwerke 36 und 38 unterbrochen. Auf diese Weise werden die in den Zählwerken 36 und 38 gespeicherten Zählwert auf ein Volumen an Teilchen führende Flüssigkeit bezogen, das genau demjenigen Flüssigkeitsvolumen entspricht, das in der Röhre 14 zwischen den Photozellen 46 und 48 vorhanden ist.
Figur 2 stellt ein Schaltbild des Kreises 34 gemäß Figur 1 zusammen mit unmittelbar an diesen Kreis angeschlossenen Komponenten dar. In diesem Kreis werden die Absorptionssignale, die durch die Verbindung 30 übermittelt werden, von einem Verstärker 54 verstärkt und über eine Verbindung 56 einem Proben- und Speicherkreis 58 zugeführt. Vom Kreis 58 wird das Signal über eine Verbindungsleitung 60 und einen Gruppenschalter 62 dem X4^h X-Eingang des Oszilloskops 40 zugeführt.
Analog wird das durch die Verbindungsleitung 32 übermittelte Engwinkel-Streusignal in einem Verstärker 64 verstärkt und über eine Verbindungsleitung 66 einem Proben- und Speicherkreis 68 zugeführt. Die Ausgabe von dem Proben- und Speicherkreis 68 wird durch Verbindungsleitungen 70 und Gruppenschalter 62 dem Y4dwea-Eingang des Oszilloskops zugeleitet. Auf diese Weise kann das Oszilloskop 40 die Funktion der Absorption gegen die Streuung für jedes Teilchen auftragen. Die Probe- und Speicherkreise 58 und 68 sind impulsbildende Kreise oder monostabile Vibratoren, die die Spitzenwerte der entsprechenden Absorptions- und Streusignale über eine bestimmte Zeit länger speichern als der tatsächlichen Dauer der Eingabesignale von den photoempfindlichen Abta stgeräten 24 bis 28 entspricht.
in einer bevorzugten Durchführungsform entspricht die Speicherzeit etwa 40 Mikrosekunden. Die Speicherung dieser Maximalwerte durch die Proben- und Speicherkreise 58 und 68 ermöglicht eine Darstellung, die die Kombination der Maximalwerte für jedes Teilchen als im wesentlichen einen einzigen Punkt auf dem Bildschirm des Oszilloskops 40 repräsentiert. Ein anderes wesentliches Element für diese Darstellung ist ein Aufhellungssignal, das dem Oszilloskop auf dem dritten Eingang Z zugeführt wird, wie weiter unten ausführlicher beschrieben.
Das verstärkte Absorptionssignal von dem Verstärker 54 auf der Ausgabeverbindung 56 wird auch über einen Regelwiderstand 72 einem Verstärker 74 zugeführt. Analog wird das verstärkte btreusignal vom Verstärker 64 über eine Verbindungsleitung 66 und einen Regelwidersta- 76 zusammen mit der Eingabe über widerstand 72 der Eingabe zum Verstärker 74 zugeführt. Somit empfängt und verstärkt der Verstärker 74 die Summe der Braktionen der verstärkten Absorptions- und Streusignale, die über die Regelwiderstände 72 und 76 zugeführt werden. Die entsprechenden Fraktionen von Signalen werden durch Einstellung der Regelwiderstände bestimmt. Die verstärkte summierte Ausgabe vom Verstärker 74 wird über einen Schwellenkreis 78 und einen logischen Und-Schaltungskreis 80 dem Zählwerk 36 zugeführt. Der Schwellenverstärkerkreis 78 arbeitet so, daß er das verstärkte Summensignal vom Verstärker 74 durchläßt, wenn dieses Signal eine einstellbare bestimmte Schwellenspannung T 2 überschreitet. Der Schwellenwert T2 wird vorzugsweise so hoch gewählt, daß Rauschsignale von dem System ausgeschlossen und sämtliche erwünschten Teilchenbestimmungssignale durchgelassen werden. Entsprechend wird der Summenkreis einschließlich Verstärker 74 dazu verwendet, um die Anwesenheit von auszuzählenden Teilchen zu bestimmen, und die erhaltenen Impulssignale werden dem Zählwerk 36 zur individuellen Registrierung und Speicherung zugeleitet.
Das Summensignal vom Verstärker 74 wird außerdem über eine Verbindungsleitung 98 und einen Schwellenkreis 81 beiden Proben- und Speicherkreisen 58 und 68 zugeleitet. Das Signal, das über den Schwellenkreis 81 geleitet wird, ist ein Steuer- oder Einschaltsignal (enabling signal) das die Probe- und Speicherkreise 58 bzw. 68 veranlaßt, auf die Eingabesignale von dem Absorptionsverstärker 54 und dem Streuverstärker 64 anzusprechen. Auf diese Weise werden durch geeignete Einstellung der Schwelle 21 für den Schwellenkreis 81 die Proben- und Speicherkreise veranlaßt, lediglich auf die Anwesenheit von erwunschten Teilchensignalen anzusprechen. Die Schwelle Ti wird vorzugsweise leicht unterhalb der Schwelle T2 angesetzt, so daß die Probe- und Speicherkreise 58 und 68 stets gesteuert werden, wenn ein Impuls durch den Schwellenkreis 78 hindurchgeht, um im Zählwerk 36 ausgewählt zu werden.
Die Verwendung des Summekreises 74, wie oben beschrieben, zusammen mit den Schwellenkreisen 78 und 81 verursacht eine beträchtliche Erhöhung der Empfindlichkeit der Vorrichtung Signalen gegenüber, die sonst zu schwach sein könnten, als daß man sie als erwünschte Signale erkennen könnte. Auf diese Weise können unerwünschte Rauschsignale in den Ausgaben von Streuverstärker 64 oder Absorptionsverstärker 54 auftreten. Derartige Rauschsignale treten jedoch gewöhnlich zusammen auf. Demgemiiß dient der summierende Verstärker 74 dazu, um zwischen erwünschten Absorptions- und Streusignalen, die zusammen auftreten, (occur concurrently) und störenden Signalen, die eine beträchtliche Amplitude besitzen können, zu unterscheiden.
Die verstärkten Absorptions- und Streusignale auf den Verbindungen 56 und 66 werden auch durch Regelwiderstände 82 und 84 einem Differenzmeßverstärker 86 zugeführt. Die Ausgabe vom Verstärker 86 stellt eine algebraische Differenz zwischen einer Fraktion des verstärkten Absorptionssignals, wie es durch die Einstellung des Widerstandes 82 bestimmt wurde, und einer Fraktion des verstärkten Streusignals, wie es durch die Einstellung des Widerstandes 84 bestimmt wurde, dar. Dieses Differenzsignal wird zwei Schwellenkreisen 88 und 90 zugeführt, die als unterer bzw. oberer Begrenzungskreis dienen, indem sie Differenzsignale oberhalb einer einstellbaren Schwelle T5 bzw. unterhalb einer einstellbaren Schwelle T6 weiterleiten. Ein Wechselrichter (inverter) 92 an der Ausgabe des Schwellenkreises 90 wandelt die Wirkungsweise des Schwellenkreises 90, von der eines Untergrenzenkreises in die eines Obergrenzenkreises um. Das Ausgabe signal von dem Schwellenverstärker 88 und die Ausgabe des Schwellenkreises 90, die durch den Wechselrichter 92 umgekehrt wurde, werden einem logischen Und-Gatter 94 zugeführt und auf diese Weise über ein weiteres Und-Gatter 96 dem Zählwerk 38. Das Und-Gatter 94 ist ein Und-Gatter mit vier Eingängen, das lediglich auf die Anwesenheit von Eingabesignalen an allen vieren seiner Eingänge anspricht. Die anderen beiden Eingaben werden von dem Summenverstärker 74 über eine Verbindungsleitung 98 und Schwellenkreise 100 und 1o2 übermittelt, wobei die Ausgabe von Kreis 102 von einem Wechselrichter umgekehrt wird.
Auf diese Weise muß ein einzelnes Teilchen, damit man eine Ausgabe vom Und-Gatter 94 erhält, ein Summensignal über den Verstärker 74 erzeugen, so daß zwischen einer unteren Schwelle 23 bestimmt am Schwellenkreis 100, und einer oberen Schwelle T4 bestimmt bei Kreis 102, liegt, sowie ein Differenzsignal, das zwischen den Schwellen T5 und T6 liegt. Daher wird das Teilchen, wenn seine Signale in dem Bereich sämtlicher dieser Meßschwellen fallen, gezählt, und die Zählung in dem Zählwerk 38 registriert. Auf diese Weise wird ein sehr genaues Mittel zur Auswahl und Auszählung von Teilchen mit besonderen Eigenschaften erhalten, wie im einzelnen in Verbindung mit Figur 3 beschrieben wird.
Um sicher zu gehen, daß die Teilchen in der ausgewählten Klasse, die im Zählwerk 38 gezählt werden, auch Teilchen sind, die von dem Gesamtteilchenähler im Zählwerk 36 erfaßt werden, muß das Und-Gatter 96 von dem Ausgabesignal auf der Verbindungsseite 110 von dem Und-Gatter 80 für die Gesamtteilchenzählung geöffnet werden (must be gated open). Auf diese Weise wird kein Teilchen im Zähler 38 gezählt, wenn es nicht auch'im Zähler 36 gezählt wird.
Mittels einer Verbindungsleitung 106 und eines Schalters 108 werden die Teilchenimpulse, die vom Zählwerk 38 empfangen werden, auch dazu verwendet, um den Aufhellungskreis Z des Kathodenstrahloszilloskops 40 zu steuern. Auf diese Weise wird, während Schalter 108 in der gezeigten Stellung ist, lediglich die Angabe für die Teilchen, die tatsächlich vom Zählwerk 38 ausgewählt werden, abgebildet, da der Kathodenstrahlenoszilloskopstrahl so aufgehellt wird, daß er nur für diese bestimmten Teilchensignale sichtbar ist. Gewünschtenfalls kann Schalter 108 in die andere Stellung umgelegt werden, um eine Verbindung zu einem Schalter 110 herzustellen, der die Signale zum Eingang des Zählwerks 36 befördert. Auf diese Weise werden die Signale für alle Teilchen, die ausgezählt werden, vom Oszilloskop 40 dargestellt.
Derjenige Teil des Kreises,gemäß Figur 2, der mit den Photozellen 46 und 48 zum automatischen essen eines vorherbestimmten Flüssigkeitsvolumens, das Teilchen enthält, ist wie folgt aufgebaut: Die Photozelle 46 ist über einen Widerstand 111 mit einem Verstärker 112 verbunden, so daß sie am Anschluß 113 eine Ausgabe in Abhängigkeit von der Ermittlung von Flüssigkeit in dem Rohr 14, die das Licht auf die Photozelle 46 bündelt, liefert. Analog führt die Anwesenheit von Flüssigkeit gegenüber Photozelle 48 zu einem Signal über Widerstand 114 zum Verstärker 115. Wenn beide dieser Einstellungseingaben vorhanden sind, wird der Plip-Flop 117 in den Einstellungszustand ((-set state) verschoben, wodurch an dem Rückstellungsausgabenanschluß 118 (reset output connection) eine logische Nullausgabe erzeugt wird. Diese Rückstellungsausgabe wird in einem Wechselrichter 119 umgekehrt und über einen Anschluß 120 und eine Wechselstromkupplung (AC coupling), die von einem Kondensator 121 dargestellt wird, geleitet, um beide Zählwerke 36 und 38 rückzustellen. Dieses Signal stellt auch einen Flip-Flop 138, dessen Wirkungsweise weiter unten beschrieben wird, zurück. Eine andere Ursache für ein Rückstellungssignal ist durch einen von Hand zu bedienenden Rückstellungsdruckknopf 122 vorgesehen, der dann benutzt wird, wenn die automatische Volumenanzeige angewandt wird.
Um eine falsche Arbeitsweise der Volumenmeßvorrichtung zu verhindern, wenn etwa nur ein reiner Wassertropfen durch das Rohr 14 hindurchgeht, werden die Verstärker 112 und 115 durch die Kondensatoren 112A und 115A geshunted. Diese Kondensatoren versorgen in Verbindung mit den Eingabewiderständen 111 und 114 jeden der Verstärker 112 und 115 mit einer Zeitverzögerungsansprechcharakteristik, so daß eine Zeitverzögerung von mehreren Sekunden erforderlich ist, während der die Photozelle kontinuierlich Flüssigkeit "sehen" muß, ein wirksames Ausgabesignal zur Veränderung des Zustandes des Flip-Flops 117 oder zur Durchführung einer der anderen Schaltfunktionen, wie sie weiter unten beschrieben sind, gegeben wird. Diese Zeitverzögerung kann vorzugsweise in der Größenordnung von 5 Sekunden liegen. Jedoch in dem Augenblick, in dem eine Photozelle Luft anstatt Flüssigkeit sieht", ist der daraus resultierende Abfall in dem Signal wegen der Anwesenheit der Dioden 111A und 114A, die die Widerstände 111 bzw. 114 shunten, ein plötzlicher Abfall. Auf diese Weise wird der Kreis, wenn nur ein reiner Wassertropfen ermittelt wird, schnell wieder rückgestellt, um den Zeitverzögerungszyklus wieder zu beginnen.
Sobald der Flip-Flop 117 in den eingestellten Zustand versetzt ist, wird ein Einstellungsausgabesignal über einen Schalterkontakt 123 und einen Anschluß 124 dem Und-Gatter 80 zugeführt, um eine der Einschalteingaben für-dieses Und-Gatter zu liefern. Wenn danach das Schwanzende der Plüssigkeitsprobe die Photozelle 46 passiert, wird der dadurch hervorgerufene Wechsel in der Photozellenausgabe von Anschluß 113 über einen Wechselrichter 125, einen Hebelschalter 126 und einen Anschluß 127 durch das Und-Gatter 80 nachgewiesen. Dadurch erhält man das Endeinschaltsignal, um Gatter 80 zu öffnen und die Übermittlung der Teilchenzählsignale über Verstärker 78 zu beginnen. Die Hebelschalter 123 und 126 sind zusammen gekuppelt und können von der dargestellten automatischen Stellung auf eine manuelle Stellung umgelegt werden, in der derartige Spannungsbedingungen erzielt werden, daß das Gatter 80 kontinuierlich eingeschaltet (enabled) ist.
Die Ausgabe aus dem Wechselrichter 125 wird außerdem als eine der Rückstellungseingaben dem Flip-Flop 117 zugeführt. Wenn die zweite Photozelle 48 den Durchtritt des Schwanzendes der Flüssigkeitsprobe erfaßt, wird die dadurch hervorgerufene Signaländerung bei Anschluß 116 durch den Wechselrichter 128 erfaßt, um die zweite Rückstellungseingabe dem Flip-Flop 117 zuzuführen, wodurch der Flip-Flop rückgestellt wird. Dadurch wird die Einstellausgabe (set output) entfernt, die über Schalter 123 und Anschluß 124 dem Gatter 80 zugeführt wird und dadurch Gatter 80 abgeschaltet, und die Zählwerke 36 und 38 werden angehalten. Auf diese Weise sind die Zählwerte, die in den Zählwerken 36 und 38 gespeichert sind, Zählungen, die genau auf einer Teilchenprobe beruhen, die aus einem Volumen von teilchenhaltiger Flüssigkeit stammen, das durch das Volumen zwischen den Photozellen 46 und 48 gemessen ist, und lediglich die Teilchen innerhalb des abgemessenen Volumens sind aufgrund des Aufhellungssignals, das aus dem Oszilloskop 40 über den Schalter 108 zugeführt wird, sichtbar.
Eine dritte Abgabe wird normalerweise auf kontinuierlicher Grundlage dem Und-Gatter 96 von der Nullstellungsausgabe eines Flip-Flop 138 zugeführt. Jedoch wird dieses Signal unterbrochen, wenn der Flip-Flop 138 durch ein Signal auf die Einstelleingabe (set input) dieses Flip-Plop eingestellt wird, das über einen Schalter 140 vom Zählwerk 36 geliefert wird.
Schalter 140 ist ein Wählschalter, der dazu verwendet werden kann, um ein gewünschtes Ausgabe signal vom Zählwerk 36 entsprechend der Erreichung eines bestimmten Zählwertes im Zählwerk 36 auszuwählen. Ganz allgemein zählt das Zählwerk 36 samtliche Teilchen innerhalb einer ausgewählten Probe und Schalter 38 zählt nur diejenigen Teilchen, die bestimmte Ansprüche erfüllen. Durch Einstellen des Wählschalters 140 kann das Zählwerk 38 veranlaßt werden, an einem bestimmten ausgewählten Gesamtzählwert, der im Zählwerk 36 gespeichert ist, aufzuhören. Dann stellt die im Zählwerk 38 gespeicherte Zählung unmittelbar das Verhältnis zwischen dem Zählwert, der im Zählwerk 38 aufgezeichnet ist, und der ausgewählten Gesamt zählung der Teilchen, die durch die Einstellung des Schalters 140 bestimmt ist, dar. Vorzugsweise können die Einstellungen des Schalters 140 Vielfache von 10 in der Gesamtzahl darstellen, die durch das Zählwerk 36 erreicht wird. Der Zählwert, der im Zählwerk 38 gespeichert ist, nachdem dieses Zählwerk gestoppt wurde, liefert danach eine unmittelbare Angabe des prozentualen Anteils der gesamten Teilchen, der die besonderen Eigenschaften besitzt, durch die das Und-Gatter 94 speisenden Kreise ermittelt werden sollen. Dies ist ein besonders wertvolles Kennzeichen, da es eine automatische Registrierung eines prozentualen Anteiles gestattet, ohne daß eine getrennte Rechnung vorgenommen werden muß. Außerdem stört der Betrieb des Kreises, der mit dem Flip-Flop 138 verbunden ist, nicht den übrigen Betrieb des Gesamtteilchenzählwerkes 36. Auf diese Weise kann das Zählwerk 36 die Gesamtzahl von Teilchen innerhalb einer abgemessenen Probe weiterzählen und registrieren.
In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt der Wählschalter 140 nicht nur Vielfache von 10 in der Gesamtzählung, sondern es ist außerdem ein Gruppenschalter, der noch einen - nicht gezeigten - Drehschaltern kontakt besitzt, der eine Einschalt- oder Steuerspannung (enabling voltage) mit ausgewählten Dezimalkommastellen im Zählwerk 38 verbindet, um so geeignete genaue Angaben der prozentualen Zählung, die schließlich im Zählwerk 38 gespeichert ist, zu liefern Die Genauigkeit dieser prozentualen Zählung wird durch die Steuerung des Und-Gatters 96 über den Anschluß 110 durch das Gesamtteilchenzählsignal von Gatter 80 noch vergrößert. Diese Eingabe zum Und-Gatter 96 stellt sicher, daß kein Teilchen vom Zählwerk 38 als Mitglied der speziell ausgewählten Teilchenklasse gezahlt wird, wenn es nicht außerdem als Teilchen in dem Gesamtteilchenzählregister 36 erfaßt wird.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung kann dazu verwendet werden, um eine Dauerregistrierung von Versuchsergebnissen durchzuführen. Die Zählungen, die von den Zählwerken 36 und 38 gespeichert werden, können auf einem - nicht dargestellten - Datenregistriermittel gespeichert werden. Außerdem ist eine grafische Registrierung des Versuchs leicht dadurch möglich, daß man einen photographischen Film gegenüber den optischen Signalen, die auf dem Schirm des Kathodenstrahlenoszilloskops 40 hervorgebracht werden, exponiert. . Jedes Teilchen, das in dem Bereich der ausgewählten Teilchengruppe fällt, wird danach durch eine Schwärzung auf dem Pilm, die von dem Lichtpunkt herrührt, der durch die Anwesenheit des betreffenden Teilchens hervorgerufen wird, registriert.
Das Oszilloskop 40 kann auch so geschaltet werden, daß es eine Angabe der Summen- und Differenzsignale statt der Absorptions-und Streusignale registriert. Dies wird dadurch bewerkstelligt, daß man den Gruppenschalter 62 auf die unterste Stellung einstellt, um die Ausgabe des Differenzverstärkers 86 über den Anschluß 142 zur Y-Acbsen-Eingabe des Oszilloskops 40 und die Summen-Signalausgabe von Verstärker 74 über den Anschluß 98 zur X-Achsen-Eingabe des Oszilloskops schaltet. Die Widerstände und 84 an den Eingaben de 8 des Differenzverstärkers 86 werden dann leicht so eingestellt, daß dasDifferenzsignal für Teilchen mit einer Mindestabsorptionscharakteristik praktisch gleich Null ist (keine Y-Achsen-Ablenkung). Beispielsweise können diese Teilchen ungefarbte Blutzellen sein. Dadurch, daß man diese besondere Einstellung vorsieht, in der das Mindestabsorptionssignal durch Subtraktion von dem Streusignal gestrichen wird, wird eine gefärbte Zelle mit beträchtlicher Absorption sehr leicht unterschieden, da die Vorrichtung lediglich die Zunahme in dem Absorptionssignal, die durch die Anwesenheit der Farbe verursacht wird, ermittelt, während das Streusignal praktisch konstant bleibt oder für gefärbte Zellen sogar abnimmt.
Um die Absorptions- und Streuverstärker 54 und 64 lediglich auf Veränderungen in den optischen Abtastsignalen von den optischen Abtastern 24 - 26, die durch den Durchtritt von zu messenden Teilchen hervorgerufen werden, abhängig zu machen, sind Schwellenwertbegrenzer (Olipper) und Integratorverstärker vorgesehen, um Rückführungssignale zu erzeugen. Auf diese Weise ist an der Ausgabe des Absorptionsverstärkers 54 ein Clipperverstärker 148 vorgesehen, der einen Integratorverstärker 154 speist, wodurch einRückführungssignal durch Rückführungsanschluß 152 zu dem Absorptionssignalverstärker 54 geliefert wird. Der Clipperverstärker 148 liefert eine abgeschnittene Ausgabe, die nicht auf die Peak-Signale, die durch den Durchtritt von Teilchen mit hoher Absorption hervorgerufen werden, anspricht. Der Integratorverstärker 150 speichert und verstärkt einen integrierten Wert der abgeschnittenen -Ausgabe und liefert diese integrierte Ausgabe als Gegenkopplung (negative feedback) an den Verstärker 54, wodurch der Verstärker 54 praktisch unempfindlich gegenüber Fließgleichgewichts-(steady state) und Niedrigfrequenzeneingaben von dem lichtempfindlichen Abtaßelement 44 gemacht wird. In einer bevorzugten Durchführungsform erstreckt sich diese Unempfindlichkeit auf Rauschen bis etwa 2 000 Hertz. Die tatsächlichen Teilchensignale besitzen eine Anstiegsrate (rate of rise), die einer Frequenz oberhalb 2 000 Hertz entspricht.
Ein Clipperverstärker 154 und ein Integratorverstärker 156 werden in analoger Weise mit der Ausgabe des Streuverstärkers 64 verbunden und sind in einem Gegenkopplungsweg 158 verbunden, um für den Verstärker 64 eine ähnliche Fließgleichgewichts-und Niedrigfrequenzeleminierungsfunktion zu gewährleisten. Figur 3 erläutert, wie die Schwellen T3, T4, T5 und T6 des Kreises gemäß Figur 2 eingestellt werden können, um lediglich Teilchensignale, die in dem Bereich eines gewünschten Gebietes auf dem Schirm des Oszilloskopes 40 fallen, auszuwählen. Die gewünschte Fläche kann als Fenster bezeichnet werden, weil diese Schwellen die Grenzen eines Gebietes definieren, durch das der Beobachter eine Darstellung der Charakteristika von lediglich derjenigen Teilchengruppe sehen kann, die ausgewählt worden ist. Das Gebiet kann auch als elektronisch bestimmte Öffnung angesehen werden. Auf diese Weise stellt Figur 3 Muster dar, die für das Fenster oder die Öffnung auf dem Schirm des Kathodenstrahloszilloskops 40 dargestellt werden können.
In der bevorzugten Durchführungsform der Erfindung werden Absorptionssignale auf die X-Achse des Oszilloskops und Streusignale auf die Y-Achse gegeben. Wenn die Regelwiderstände 72 und 76, die den Summenverstärker 74 gemäß Figur 2 speisen, so eingestellt sind, daß die Absorptions- und Streusignale praktisch die gleiche Wirkung bei der Bestimmung der Ausgabe des Summenverstärkers 74 haben, dann definiert der untere Grenzenschwellenkreis 100 eine Untergrenzenschwellenkennlinie, die 0 praktisch eine um 45 geneigte Linie ist, wie bei T3-1 in Figur 3 dargestellt. Analog definiert der obere Grenzenschwellenkreis 102 ebenfalls einen Grenzwert, der durch eine um 45 0geneigte Linie, dargestellt bei T4-1, dargestellt wird. Die Verschiebung beider dieser Kurven von der unteren linken Ecke des Schirms aus kann durch Änderung des Wertes der entsprechenden Schwellen T3 und T4 erfolgen.
Das Differenzsignal von dem Differenzverstärker 86 stellt mathematisch eine Funktion des Absorptionssignales einer Funktion des Streusignals dar. Wenn die Regelwiderstände 82 und 84 so eingestellt werden, daß die Absorptions- bzw. Streueingaben praktisch die gleiche Wirkung auf die Ausgabe des Verstärkers 86 haben, dann sind Form und Neigung der Grenzen des Fensters oder der Öffnung, die durch die Schwellenkreise 88 und 90 bestimmt werden, jeweils praktisch um 450 geneiete Linien, die sich nach rechts oben erstrecken, wie in Figur 3 durch die Linien T5-1 und T6-1 dargestellt. Die vertikalen Stellungen dieser Schwellenlinien können durch Einstellen der damit verbundenen Schwellenwerte T5 und T6 einreguliert werden. Auf diese Weise wird durch Verringerung des Wertes jeder Schwelle die entsprechende Schwellenlinie nach oben verschoben. Umgekehrt wird durch Erhöhung des Schwellenwertes die Schwellenlinie nach unten verschoben. Somit können durch Auswahl der Schwellenwerte und Steilheit der Kennlinien wie beschrieben, Fenster oder Öffnung, wie sie durch die Linien T3-1, 24- T5-1 und T6-1 definiert sind, so gewählt werden, daß sie ein Fenster bilden, das Teilchencharakteristika innerhalb eines vorherbestimmten Gebietes, wie des mit der Bezugszahl 160 versehenen, auswählt.
Wenn ain anderes Gebiet,wie beispielsweise das mit der Bezugszahl 162 bezeichnete, ausgewählt werden soll, können die entsprechenden Einstellungen des Summen- und Differenzverstärkerverhältnisses und der Schwellen vorgenommen werden, um dieses Gebiet statt des Gebietes 160 auszuwählen.Diese modifizierten Schwellen sind durch die Linien TS-2, T4-2, T5-2 und T6-2 dargestellt. Obwohl dieses zweite Fenster in Figur 3 so dargestellt ist, als wenn es zugleich mit dem ersten Fenster T3-1 bis T6-1 erscheinen würde, so versteht es sich, daß diese beiden Fenster nicht zur gleichen Zeit vorhanden sind, disie verschiedene Arbeitsweisen desselben Komponenten darstellen.
Um die Summenschwelienkurven T3-2 und T4-2 zu erhalten, werden die Regelwiderstände 72 und 76 so eingestellt, daß die Wirkung des Absorptionssignals, das durch den Regelwiderstand 72 geliefert wird, vermindert und die Wirkung des Streusignals, das durch den Regelwiderstand 76 dem Summenverstärker 76 zugeführt wird, erhöht werden. Somit üben Änderungen im Streusignal eine große, im Absorptionssignal dagegen eine sehr geringe Wirkung auf diese Kennlinien aus.
Um die Schwellenkennlinien T5-2'und T6-2 mit der geringen Steilheit zu erzielen, wird das Verhältnis der Eingaben in den Differenzverstärker 86 verändert, so daß die Wirkung des Streusignals, das durch den Regelwiderstand 84 geliefert wird, vermindert und die Wirkung des Absorptionssignals, das durch den Regelwiderstand 82 geliefert wird, erhöht wird. Dies führt zu einer relativen Unabhängigkeit dieser Kennlinien von dem Streusignal und macht sie in der Hauptsache von dem Absorptionssignal auf der horizontalen Achse abhängig.
Während die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die Ermittlung von Absorptions- und Streusignalen beschrieben wurde, so ist selbstverständlich die Erfindung ebenso auf andere optische, von Teilchen ausgehende Reaktionssignale anwendbar.

Claims

Patentansprüche

@ Verfahren zum schnellen Messen und Bestimmen kleiner Teilchen in einer Probe aus zu analysierenden Teilchen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Teilchen nacheinander in einem Strom durch einen querverlaufenden Beleuchtungsstrahl treten läßt, mindestens zwei verschiedene optische Reaktionen auf den Strahl durch jedes Teilchen auf elektro-optischem Wege mißt und dadurch für jede optische Reaktion auf jedes Teilchen einen diskreten elektrischen Signalimpuls erzeugt, die Amplituden der elektrischen Signalimpulse von den verschiedenen optischen Reaktionen summiert und den erhaltenen Summensignalimpuls zur Bestimmung, ob die Amplitude einen vorherbestimmten Schwellenwert überschreitet, untersucht.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man außerdem zur Erzielung einer Aus zählung der Gesamtzahl der Teilchen innerhalb einer Teilchenprobe die Summensignalimpulse zählt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Teilchen mit bestimmten Eigenschaften optisch voneinander unterscheidet, indem Zahlen der getrennten elektrischen Signalimpulse von den verschiedenen optischen Reaktionen mißt und Veränderungen in diesem Verhältnis als Grundlage zur Unterscheidung der zu bestimmenden Teilchen mit besonderen Eigenschaften bestimmt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man das Verhältnis zwischen den getrennten elektrischen Signalimpulsen durch Subtrahieren einer vorherbestimmten Funktion eines der Signalimpulse von einer vorherbestimmten Funktion eines anderen der Signalimpulse unter Gewinnung eines Differenzsi-Signals mißt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, d a-d u r c h g e k e n n z e i c h n e t daß man sämtliche Teilchen innerhalb der gesamten Teilchenprobe auswählt , die die zu bestimmenden Unterteilungsmerkmale besitzen, indem man die Kombination der zwei verschiedenen elektrischen Signale lediglich von denjenigen Teilchen zählt, die einen Summensignalimpuls zwischen vorher bestimmten Signalintensitäten und einen Differenzsignalimpuls zwischen vorher bestimmten Signalintensitäten liefern.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektrooptisch erhaltenen elektrischen Signale einstellt, um ausgewählte Funktionen der optischen Reaktionen vor der Erzeugung der Summe der elektrischen Signale zu erhalten und dadurch eine abgeschätzte Summe zur Förderung der Unterscheidung von echten Teilchenreaktionssignalen von falschen Rauschsignalen zu erzeugen.
7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Gehäuse (10) mit lichtdurchlässigen Wänden, die eine optische Kammer umschließen, Mitteln (14 bis 18) zum Bewegen von Flüssigkeit (12) mit darin suspendierten Teilchen durch die am mer in einen Strom, der die Teilen einzeln hintereinander be-.
fördert, eine Lichtquelle (22) zum Richten von Licht (20) durch das Gehäuse und quer durch den Teilchenstrom hindurch, mindestens zwei lichtempfindliche Abtastelemente (24,26), die außerhalb des Gehäuses angeordnet sind und gleichzeitig verschiedene optische Reaktionen jedes Teilchens gegenüber der Beleuchtung durch den Strahl ermitteln und elektrische Signalimpulse (bei 30,32) in Abhängigkeit von den optischen Reaktionen auf die Teilchen erzeugen, sowie Mittel (34), die angeschlossen sind, um die Signalimpulse zu empfangen und zu addieren und somit einen Summensignalimpuls zu erzeugen, um die Anwesenheit jedes Teilchens durch die gleichzeitige Anwesenheit beider elektrischer Signalimpulse anzuzeie. 1 a 8. Vorrichtung gemäß Anspruch 7, g e k e n n z e i c h n e t durch eine getrennte Verstärkereinrichtung (54,64), die mit jedem der fotoempfindlichen Abtastelemente (24,26) zum Empfang der elektrischen Signalimpulse und zum getrennten Verstärken der Signalimpulse, bevor sie dem Signalmittel (74) zugeführt werden, verbunden ist, sowie Mittel (72,76) zum getrennten Einstellen der verstärkten Signalimpulse, die dem Summensignalmittel zugeführt werden, um einen Summensignalimpuls mit einem bestimmten Gewicht zu erzielen und dadurch die Unterscheidung der Signale aufgrund der echten Teilchenreaktion von den falschen Rauschsignalen zu verbessern.
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der getrennten Verstärker (54,64) einen Hauptverstärker (54, 64) und einen Klipperverstärker (148,154) sowie einen Integratorverstärker (150,156), die in Kaskadenschaltung miteinander verbunden sind, umfaßt, wobei der Klipperverstärker und der Integratorverstärker einsetzbar sind, um ein Gegenkopplungssignal (negative feed~back signal) (152 bis 158) an den Hauptverstärker zu liefern, das einen integrierten Wert der abgeschnittenen Ausgabe des Klipperverstärkers darstellt, um dadurch den Hauptverstärker praktisch unempfindlich gegenüber Fließgleichgewichts (steady state )- und Niedrigfrequenzeingaben von den angeschlossenen lichtempfindlichen Abtastelementen zu machen.
10. Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kreis ein Mittel (86) zum Empfang der entsprechenden.

elektrischen Signalimpulse enthält, das zur Erzeugung eines Differenzsignalimpulses betreibbar ist sowie Mittel (82,84) zum getrennten Einstellen der Verstärkungssteigerung (amplification gain ) im Hinblick auf die Signalimpulse, um dadurch das Verhältnis der verstärkten Signalimpulse bei der Eingabe zu dem Differenzsignal einzustellen, um dadurch einen Nulldifferenzausgabesignalimpuls für die Bedingung; hervorzurufen, bei der die Teilchencharakteristika, die die optischen Reaktionssignale verursachen, nicht bestimmt werden sollen, wobei der Differenzkreis derart wirkt, daß ein wesentliches Differenzausgabesignal erzeugt wird, wenn die optischen Reaktionssignale ermittelt werden sollen.
11. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Schwellenkreis (78) angeschlossen ist, um die Summensignalimpulse von dem Summensignalmittel zu empfangen, und der betreibbar ist, um lediglich diejenigen Summensignalimpulse durchzulassen, die einen bestimmten Schwellenwert überschreiten.
12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zählwerk (36) an den Schwellenkreis (68) angeschlossen ist und auf die Summensignalimpulse anspricht, die durch den Schwellenkreis zum Zählen und Registrieren jedes der Impulse hindurchgelassen werden.
13. Vorrichtung gemäß Anspruch 12, gekennzeichnet durch einen länglichen Behälter (14), der mit den Mitteln zum Bewe- -gen der Teilchen enthaltenden Flüssigkeit verbunden ist, durch den die Flüssigkeit in die Kammer geführt wird, einen ersten Detektor (46,50), der am Eingang des Behälters zum Registrieren der Anwesenheit von Flüssigkeit in ihm und zur Erzeugung eines elektrischen Signales in Abhängigkeit davon angeordnet ist, einen zweiten Detektor (48,52) am Ausgangsende des Behälters zum Registrieren der Anwesenheit von Flüssigkeit darin und zur Erzeugung eines elektrischen Signals in Abhängigkeit davon, einen logischen Kreis (117), der zwischen dem Zählwerk (36) und dem ersten und zweiten Detektor (46,48) angeordnet ist, wobei der logische Kreis derart betreibbar ist, daß er das Zählwerk in Abhängigkeit von den Flüssigkeitsregistriersignalen von beiden Detektoren zurückstellt und die Zähloperation des Zählwerks auf Unterbrechung des Flüssigkeitsregistriersignals vom ersten Detektor hin beginnt und die Zähloperation des Zählwerks auf die darauffolgende Unterbrechung des Flüssigkeitsregistriersignals vom zweiten Detektor hin beendet und dadurch eine Auszählung der Teilchenzahl innerhalb einer Probe mit einem Volumen entsprechend dem Volumen des Behälters liefert.
14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Detektoren aus einer Fotozelle (46,48) und einer Lichtquelle (50,52) zur Beleuchtung dieser Fotozelle durch den Behälter (14) hindurch besteht und daß der Behälter aus einem optischen, lichtdurchlässigen Material besteht.
15. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum optischen Unterscheiden von Teilchen, die bestimmte Eigenschaften-haben, innerhalb einer Teilchengruppe, die auch solche Teilchen umfaßt, die diese Eigenschaften nicht besitzen, und zum automatischen Errechnen des Anteils der Gesamtzahl von Teilchen innerhalb einer Teilchenprobe, die die besonderen Eigenschaften besitzen, ein erstes Zählwerk.(36) zum Zählen der Signalimpulse von dem Summensignal, um dadurch sämtliche zu untersuchende Teilchen zu zählen sowie ein zweites Zählwerk (38) zum Zählen der Signalimpulse von dem Differenzkreis enthält, um dadurch die Teilchen mit dem besonderen, zu ermittelnden Merkmal zu zählen wobei das erste Zählwerk so betreibbar ist, daß es nach Erreichen eines vorherbestimmten Zählwertes ein Ausgabesignal wobei 140,138) liefert, das erste Zählwerk angeschlossen ist, um das Ausgabesignal dem zweiten Zählwerk (bei 96) zuzuführen, und das zweite Zählwerk (38) auf den Empfang des zuletzt erwähnten Signals hin betreibbar ist, um den Zählvorgang zu unterbrechen und dadurch automatisch das Verhältnis zwischen den vom zweiten Zählwerk registrierten Wert und dem vorherbestimmten Zählwert anzuzeigen.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der vorherbestimmte Zählwert, bei dem das erste Zählwerk (36) das Signal zum Anhalten des zweiten Zählwerks (38) erzeugt, gleich einer Zahl ist, die eine Potenz von 10 ist, so daß das Verhältnis zwischen der im zweiten Zählwerk gespeicherten Zählung, nachdem es angehalten wurde, und der vorherbe stimmten Zählung des ersten Zählwerks ein Prozentverhältnis darstellt.