DE3531969A1

DE3531969A1 - Geraet und verfahren zur erfassung und klassifizierung von teilchen mit hilfe von techniken der durchfluss-cytometrie

Info

Publication number: DE3531969A1
Application number: DE19853531969
Authority: DE
Inventors: Robert F. Cary N.C. Adrion; Burton H. Chapel Hill N.C. Sage jun.; Hai-ping WU
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1984-09-11
Filing date: 1985-09-07
Publication date: 1986-03-20
Also published as: US4661913A; JPS6171337A; FR2570192A1

Description

Gerät und Verfahren zur Erfassung und Klassifizierung von Teilchen mit Hilfe von Techniken der Durchfluß-Cytometrie

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gerät und ein Verfahren zur Erfassung von Teilchen in einer Probe und insbesondere Durchfluß-Cytometrie-Gerät sowie ein Verfahren zur Erfassung und Klassifizierung interessierender biologischer Teilchen aus einer heterogenen Population biologischer Teilchen.

Durchfluß-Cytometrie-Geräte arbeiten auf der Grundlage des Durchflusses von Zellen oder anderer Teilchen in einem Flüssigkeitsstrom, um eine oder mehrere kennzeichnende Eigenschaften der der Untersuchung unterzogenen Zellen zu bestimmen. Weiterhin ist ein Durchfluß-Cytometrie-Gerät einsetzbar zum Nachweis der Anwesenheit bestimmter interessierender Teilchen oder Zellen, zum Zählen solcher Zellen oder Teilchen sowie in einigen Fällen zum Bereitstellen einer Sortier-Kapazität, mit deren Hilfe es möglich ist, derartige interessierende Zellen oder Teilchen zu sammeln. In einem typischen Durchfluß-Cytometrie-Gerät wird eine Zellen enthaltende Flüssigkeitsprobe in einem sich rasch bewegenden Flüssigkeitsstrom so durch das Durchfluß-Cytometrie-Gerät hindurchgeführt, daß jede Zelle der Reihe nach und im wesentlichen eine nach der anderen ein Meßgebiet passiert. Das Zellvolumen kann aufgrund von Änderungen der elektrischen Impedanz bestimmt werden, wenn eine jede Zelle das Meßgebiet durchläuft. In ähnlicher Weise streuen die hindurchströmenden Zellen, wenn ein einfallender Lichtstrahl auf das Meßgebiet gerichtet ist, dieses Licht, wenn

sie durch das Meßgebiet hindurchfließen. Dieses Streulicht dient als Funktion der Zellform und -größe, des Brechungsindex, der Lichtundurchlässigkeit, Rauhigkeit und dergleichen. Weiterhin ist die von markierten ZeI-len oder selbstfluoreszierenden Zellen, die beim Durchgang durch die Anregungsenergie des einfallenden Lichtstrahls angeregt worden sind, emittierte Fluoreszenz zur Identifizierung der Zellen mit Fluoreszenz-Eigenschaften meßbar. Nach der Durchführung einer Zellanalyse mit Hilfe des Durchfluß-Cytometrie-Geräts können die als Zellen mit den gewünschten Eigenschaften identifizierten Zellen sortiert werden, sofern das Gerät so konstruiert ist, daß es diese Fähigkeit besitzt.

Repräsentative Durchfluß-Cytometrie-Geräte sind in den US-PSen 3 826 364 und 4 284 412 sowie in der Veröffentlichung von Herzenberg et al., "Fluorescence-activated Cell Sorting", Sei.Am. 234 (3), 108 (1976) beschrieben.

Die rasche quantitative Analyse biologischer Zellen erweist sich immer mehr als außerordentlich nützlich in der biomedizinischen Forschung und in der klinischen Medizin. Neue Durchfluß-Cytometrie-Geräte erlauben eine quantitative Multi-Parameter-Analyse von Zelleigenschäften mit Geschwindigkeiten von mehreren Tausend Zellen pro Sekunde. Diese Instrumente liefern die Möglichkeit, Zelltypen durch Messung der zwischen ihnen bestehenden Unterschiede zu differenzieren. Diese Differenzierung basiert auf den Fluoreszenz-Charakteristiken, die zur Erfassung der funktionalen Unterschiede der Zellen verwendet werden können, sowie auf der Lichtstreuung, einer Funktion der Zellmorphologie.

Obwohl die Fortschritte in den Techniken der Durchfluß-Cytometrie die Zellanalyse verbessert haben, fehlt es den zur Zeit verfügbaren Apparaturen noch in mancher Hinsicht an Leistungsfähigkeit. Beispielsweise lassen sich Techniken der Durchfluß-Cytometrie einsetzen zum Nachweis der Anwesenheit von Bakterien im Blut, einem Zustand, der als Bakteriämie bekannt ist. Die gegenwärtig eingeführten, zum Nachweis der Bakteriämie einsetzbaren diagnostischen Methoden beruhen auf dem visueilen Nachweis des Bakterienwachstums in flüssigen, mit Blutproben beimpften Medien. Der Nachweis der Bakteriämie mit Hilfe der Wachstumsmethoden ist langsam und dauert gewöhnlich zwei bis vierzehn Tage. Die Techniken der Durchfluß-Cytometrie unter Verwendung spezieller Markierung der Bakterien mit Fluoreszenzfarbstoffen und Arbeitsweisen der Probenpräparation, die die Unterscheidung der restlichen Blutzellen ermöglichen, sind Gegenstand von Untersuchungen. Sobald eine positive Blutkultur identifiziert worden ist, wenden gegenwärtig die klinischen Laboratorien zusätzlich Material, Arbeit und Zeit auf, um eine Bakterien-Klassifizierung/Antibiotikum-Empfindlichkeit-Information zu gewinnen. Diese Arbeitsgänge, wenngleich sie wirksam sind, sind kostspielig und hängen praktisch sämtlich von dem Bakterienwachstum ab. Die Ergebnisse sind frühestens nach Stunden verfügbar, und in den meisten Fällen ist eine Inkubation über Nacht oder mehrere Tage lang erforderlich. Demgemäß besteht ein klar erkennbares Bedürfnis, die Geschwindigkeit dieser nachfolgenden Test-Operationen zu erhöhen. Eine solche Erhöhung der Geschwindigkeit ließe sich dadurch erreichen, daß die Durchfluß-Cytometrie für die nicht vom Wachstum abhängige Klassifizierung von Bakterien eingesetzt wird.

Der Fortschritt im Einsatz von Durchfluß-Cytometrie-Techniken unterliegt bisher auch Grenzen, die durch den Mangel an verfeinerten Analysenverfahren zur Handhabung von Daten gezogen sind, die sich auf mehrere Merkmale zur Gewinnung zuverlässiger Ergebnisse beziehen. Die Daten, die mittels Durchfluß-Cytometrie-Geräten gewonnen werden, werden fast immer in Form eindimensionaler (Histogramm) oder zweidimensionaler (Konturen-Darstellung, Streuungs-Darstellung) Frequenz-Verteilungen gemessener Variabler dargestellt. Die Aufteilung der Aufzeichnungen von Mehrparameter-Daten bedingt den nacheinander ablaufenden Einsatz der miteinander in Wechselwirkung stehenden ein- oder zweidimensionalen Graphik-Programme. Diese Arbeitsweise ist nicht nur schwerfällig, sondern gibt auch die Vorteile der Verarbeitung von Daten im mehrdimensionalen Raum preis und kann zudem eine signifikante Subpopulation von Zellen verdecken.

Beispielsweise verfügen die gegenwärtig einsetzbaren Durchfluß-Cytometrie-Geräte über die Fähigkeit, vier Merkmale für jeweils Tausende von Zellen pro Sekunde zu messen. Die Datenverarbeitung zur Klassifizierung der Zellen muß derartige Sätze von Multiparameter-Eingangsdaten in sinnvolle experimentelle Maße umformen, und dies ist eine außerordentlich komplexe Aufgabe. Die bei weitem am meisten verbreitete Methode der Datenverarbeitung umfaßt den aufeinander folgenden Einsatz rechteckiger Fenster in zwei Dimensionen, um eine mehrdimensionale Analyse zu erstellen.

Die quantitative Analyse von Multiparameter-Daten der Durchfluß-Cytometrie zu einer raschen Erfassung von Zellen besteht aus zwei Stufen, nämlich der Charakterisierung der Zellklassen und der Probenverarbeitung. Im

_ ₂₆ „ 3531959

allgemeinen unterteilt der Vorgang der Charakterisierung der Zellklassen den Zellmerkmals-Raum in zwei nicht-zusammenhängende Bereiche der interessierenden Zellen und der nicht interessierenden Zellen. Dann wird in der Probenverarbeitung jede Zelle, entsprechend dem Bereich, in den sie fällt, als zu einer der beiden Kategorien gehörig klassifiziert. Die sorgfältige Analyse der in Untersuchung befindlichen Zellklassen ist sehr wichtig, da eine gute Erfassungsleistung nur dann erwartet werden darf, wenn ein angemessener Bereich für die Darstellung der interessierenden Zellen erhalten wird. Dementsprechend ist die Auswahl eines spezifischen Bereichs für eine Zellpopulation die Fundamentaloperation einer Datenanalyse zur Erfassung von Zellen. Für Multiparameter-Daten ist jedoch das Problem der Isolierung des interessierenden Bereichs im vierdimensionalen Raum eine Aufgabe, die sich in der Praxis nicht visuell durchführen läßt. Eine mögliche Lösung dieser Aufgabe ist die Wahl zweier zweidimensionaler Fenster zur gleichen Zeit.

Unabhängig davon, ob eine Rechteckfenster-Auswertung von vier oder fünf Parametern erfolgt, zeigen die meisten Zell-Clusters elliptische oder eiförmige Gestalt in dem durch die Erfassung der Zwei-Farben-Fluoreszenz dargestellten Koordinatenraum. Die Hauptachsen dieser Clusters sind häufig nicht parallel zu den Koordinatenachsen. Die ideale Grenze für die Festlegung eines solchen Bereichs ist aus diesem Grunde ein ellipsoides oder ovoides Gebilde im mehrdimensionalen Raum. Die Rechteckfenster zur Isolierung solcher Clusters schließen gewöhnlich einen großen Teil des offenen Raumes ein, wodurch ungesuchte Hintergrund-Teilchen als interessierende Zellen eingestuft werden und demzufolge Klassifizierungsfehler eingeführt werden.

Es scheint Bedarf an verfeinerten Algorithmen zu bestehen, um die analytische Leistungsfähigkeit der Durchfluß-Cytometrie-Geräte zu verbessern. Es ist keine Arbeit bekannt, die den Versuch unternimmt, mit Hilfe Durchfluß-Cytometrie-Geräten gemessene "Ereignisse" unter Einsatz der Techniken der Erkennung von Mustern zu klassifizieren.

Die Muster-Erkennung ist ein Gebiet, das sich mit der maschinellen Erkennung sinnvoller Regelmäßigkeiten in Störeinflüssen ausgesetzten oder komplexen Umgebungen befaßt. Sie umfaßt den Nachweis und die Erkennung invarianter Eigenschaften in Sätzen von Meßwerten, die Objekte oder Ereignisse beschreiben. Im allgemeinen ist der Zweck der Muster-Erkennung die Kategorisierung einer Probe von Beobachtungsdaten als Glied einer Klasse. Zuerst muß ein Satz kennzeichnender Meßwerte und Beziehungen für die Darstellung der Klasse extrahiert werden, und danach kann die Klassifizierung der Daten auf der Grundlage der Darstellung erfolgen. Dieser Lösungsweg ist bei Problemen aus vielen unterschiedlichen Gebieten beschritten worden, darunter auch einigen Untersuchungen auf dem Gebiet der Cytologie.

Ein Forscher wandte Methoden der Muster-Erkennung auf Bilder von Leukocyten an, die durch mikroskopische Untersuchung speziell angefärbter Blut-Ausstriche erhalten worden waren (J.M.S. Prewitt, "Parametricand Nonparametric Recognition by Computer: An Application to Leukocyte Image Processing", Adv. Computers 12, 25-414, 1972). In der Veröffentlichung von Prewitt wurden fünf Typen weißer Blutkörperchen, die im normalen menschlichen peripheren Blut gefunden werden, auf

der Grundlage der Verarbeitung digitalisierter Mikrobilder mittels eines Computers voneinander unterschieden. Eine ähnliche Untersuchung von Bartels beschreibt Versuche, cytologische "Profile" für normale und abnorme Zellpopulationen statistisch zu beschreiben. Mehrere mehrdimensionale Analysenmethoden wurden zur Bestimmung der statistisch signifikanten Differenzen zwischen den verschiedenen Profilen angewandt. Danach konnten die Zellen mit einem hohen Genauigkeitsgrad in diese beiden Kategorien eingeordnet werden (T.H. Bartels, "Numerical Evaluation of Cytological 'Data", I-VIII, Anal. Quant. Cytol. 1, 2, 3 (1979, 1980, 1981)).

In Richtung auf die Verarbeitung von Daten, die mittels Durchfluß-Cytometrie gewonnen wurden, sind bisher nur wenige Arbeiten mit Hilfe der Anwendung der Muster-Erkennung durchgeführt worden. In einem Versuch, die Fenster-Formen den Cluster-Umrissen im zweidimensionalen Raum anzupassen, hat ein Forscher versucht, eine quadratische oder stückweise quadratische Gleichung für die Bildung eines elliptischen Fensters zu verwenden (T. Sharpless, "Cytometric Data Processing", in: Flow Cytometry and Sorting, herausgegeben von M.R. Melamed, P.F. Mullaney und M.L. Mendelsohn, John Wiley and Sons, New York 1979, Seite 359-379). Das Fenster kann dem Zell-Cluster angepaßt werden. Da das Unterscheidungsvermögen erhöht wird, wenn Daten in einem hochdimensionalen Raum analysiert werden, haben andere Forscher Hardware und Software für eine dreidimensionale graphisehe Analyse beschrieben, in der ellipsoide Cluster mittels Ebenen getrennt werden (M. Stohr und G. Futterman, "Visualization of Multidimensional Spectra in Flow Cytometry", J. Histochem. Cytochem. 2Ί_, 560 (1978)). Es

ist jedoch sehr viel schwieriger, einen Malysenraum von mehr als drei Dimensionen sichtbar darzustellen, während typischerweise die Daten der Durchfluß-Cytometrie vier Parameter für jede Zelle enthalten. 5

Bei der Analyse biologischer Teilchen ist der Nachweis der Teilchen allein in der Regel nicht hinreichend. Damit die Analyse klinisch verwertet werden kann, müssen auch Angaben darüber gewonnen werden, was für Teilchen, etwa Bakterien, vorliegen, so daß der Kliniker Entscheidungen hinsichtlich des wahrscheinlichen Ortes der Infektion und der geeigneten antimikrobiellen Therapie treffen kann. Gegenwärtig wird in klinischen Laboratorien die Klassifizierung der Bakterien gewöhnlieh in der Weise durchgeführt, daß die Ergebnisse biochemischer Reaktionen zwischen spezifischen Reagentien und Bakterien und/oder deren StoffWechselprodukten beobachtet oder gemessen werden. Dieses Verfahren erfordert ein reines Bakterien-Isolat, kann vier bis sechs oder mehr Stunden dauern und benötigt Inocula von mehr

7
als 10 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (cfu/ml). Nach gegenwärtiger Lage der Dinge kann die Information über die Klassifizierung erst dann gewonnen werden, wenn die Organismen auf eine ausreichende Zahl angewachsen sind, um die Inocula für die übliche Arbeitsweise zu liefern. Aus diesem Grunde sind Entscheidungen auf der Grundlage von Mikroorganismen, die tatsächlich von dem Patienten gewonnen worden sind, erst innerhalb eines Zeitrahmens von zwei bis vierzehn Tagen möglich. Das Warten auf diese Ergebnisse kann für den Patienten ein hohes Risiko in bezug auf Morbidität oder gar Mortalität bedeuten. In der neueren Praxis werden die frühzeitigen Entscheidungen gewöhnlich

empirisch auf der Basis der Symptome des Patienten getroffen. Somit besteht das Bedürfnis nach früheren, auf Informationen beruhenden Entscheidungen hinsichtlich der antimikrobiellen Therapie nach wie vor. Zur Ermöglichung früherer, auf Informationen beruhender Entscheidungen werden Verfahren benötigt, die eine Klassifizierung biologischer Teilchen in niedrigeren Konzentrationen erlauben und aus diesem Grunde rascher durchgeführt werden können.
10

Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung auf Techniken der Muster-Erkennung zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit des Nachweises und der Klassifizierung von Teilchen mit Hilfe durchfluß-cytometrischer Multiparameter-Daten gerichtet.

Das Gerät gemäß der vorliegenden Erfindung zum Erfassen der Teilchen in einer Probe umfaßt eine Strömungseinrichtung zum, im wesentlichen vereinzelten, Bewegen der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums. Ein einfallender Lichtstrahl ist vorzugsweise auf die Teilchen in dem Strom gerichtet. Weiterhin enthält das Gerät eine Licht-Meßeinrichtung zum Erfassen lichtbezogener Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt,
eine Einrichtung zum Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen entsprechend einem Muster aus den von einer solchen Klasse gemessenen lichtbezogenen Daten sowie eine Einrichtung, die aufgrund der Erkennung des Musters der von den Probe-Teilchen erfaßten lichtbezogenen Daten eine Entscheidung darüber trifft, daß Teilchen aus einer unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören. Daten, die

mittels elektrischer oder akustischer Meßeinrichtungen aufgenommen worden sind, können ebenfalls für die Techniken der Muster-Erkennung eingesetzt werden, die hier beschrieben werden.
5

In einer anderen Ausführungsform dieses Gedankens der vorliegenden Erfindung erfaßt und klassifiziert ein Durchfluß-Cytometrie-Gerät interessierende biologische Teilchen aus einer heterogenen Population biologischer Teilchen. Zusätzlich zu den Elementen des oben beschriebenen Geräts enthält diese Ausführungsform noch eine Einrichtung zur Auftrennung der aufgestellten Klasse in eine Mehrzahl von Unterklassen, wobei die lichtbezogenen Daten jeder dieser Unterklassen getrennt gespeichert werden. Eine Einrichtung zum Vergleichen vergleicht solche gespeicherte Daten mit Licht-Daten, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen. Dann entscheidet die Einrichtung aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören und identifiziert die Unterklassen, zu denen die unbekannten Teilchen gehören.

Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Teilchen in einer Probe. Das Verfahren umfaßt das Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit bekannten, gemeinsamen Kennzeichen entsprechend einem von einer solchen Klasse bekannter Teilchen erfaßten Datenmuster. Die die Teilchen betreffenden Daten können mit Hilfe verschiedener Techniken erfaßt werden, darunter elektrische und akustische Messungen sowie optische Charakteristiken.

Danach bestimmt das Verfahren aufgrund der Erkennung des Musters der Daten der Probe-Teilchen, daß Probe-Teilchen aus einer unbekannten Klasse zu der aufgestellten etablierten Klasse gehören.
5

In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung erfaßt und klassifiziert das Verfahren interessierende biologische Teilchen aus einer heterogenen Population biologischer Teilchen. Das Verfahren umfaßt das, im wesentlichen vereinzelte, Bewegen (Befördern) der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums (Fluids). Vorzugsweise wird ein Strahl einfallenden Lichts erzeugt und auf die Teilchen in dem Strom gerichtet. Lichtbezogene Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt, werden erfaßt. Eine Klasse von Teilchen wird aufgestellt, wobei diese Teilchen gemeinsame Kennzeichen auf der Grundlage der von einer solchen Klasse erfaßten Licht-Daten aufweisen. Diese lichtbezogenen Daten werden dann gespeichert. Das Verfahren umfaßt weiterhin die Auftrennung der Klasse in eine Mehrzahl von Unterklassen, wobei von jeder dieser Unterklassen die lichtbezogenen Daten getrennt gespeichert werden. Diese gespeicherten Daten werden mit Licht-Daten verglichen, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen. Schließlich stellt das Verfahren aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten fest, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören, und identifiziert die Unterklassen, zu denen die unbekannten Teilchen gehören.

Gemäß dem Prinzip der vorliegenden Erfindung werden Techniken der Muster-Erkennung zugrunde gelegt, um die

Leistung der Klassifizierung von Teilchen unter Benutzung von durchfluß-cytometrischer Multiparameter-Daten zu verbessern. Die hier beschriebenen Techniken führen "intelligente Hilfen" in das System zur automatischen Erfassung und Klassifizierung biologischer Teilchen ein. Der Lösungsweg der Muster-Erkennung liefert eine effektive und effiziente Beschreibung der Teilchen, bestimmt die Unterscheidung von Merkmalen bei verschiedenartigen Zelltypen und klassifiziert die unbekannten Zellen auf der Basis der extrahierten Merkmale. Dementsprechend liegt ein signifikanter Nutzen in Algorithmen der Muster-Erkennung, die Information rascher und genauer als andere Methoden zu verarbeiten vermögen. Diese günstigen Merkmale erleichtern die Entwicklung rascher, nicht auf dem natürlichen Wachstum beruhender Methodologien zur Erfassung und Klassifizierung biologischer Teilchen.

Ein deterministischer Lösungsweg der Muster-Erkennung zur Erfassung biologischer Teilchen mit Hilfe von Techniken der Durchfluß-Cytometrie ist eine prinzipielle Untermauerung der vorliegenden Erfindung. Ein neuer Algorithmus wurde entwickelt, der Erfassungsbereiche in einem mehrdimensionalen Raum mit Hilfe von Merkmalen definiert, die gewöhnlich mit Durchfluß-Cytometrie-Geräten gemessen werden. Zum Nachweis eines bestimmten Teilchen-Typs, etwa von Bakterien, werden Daten einer reinen Probe als Übungssatz gesammelt. Eine Hauptkomponenten-Transformation des Satzes der Übungsdaten wird vorgenommen, um die neuen unkorrelierten Merkmale zu gewinnen. Dann wird eine Transformation zum Sammeln (eine cluster-bildende Transformation) angewandt, um die Daten zu einer stärker verdichteten Form zu komprimieren. Zuletzt wird ein Nachweis-Bereich definiert,

vorzugsweise in Form einer Hyperkugel mit einem Radius der doppelten Standardabweichung, der das verdichtete Cluster einschließt. Dieser Bereich kann dann dazu benutzt werden, interessierende Teilchen von Hintergrund-Teilchen in unbekannten Proben zu differenzieren. Vom Standpunkt des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses betrachtet zeigt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine signifikante Verbesserung gegenüber demjenigen, das mit der herkömmlichen Methode der Rechteck-Auswertung erzielt wird.

Die Methode der Hauptkomponenten-Transformation wird auch in der Untersuchung der Klassifizierung biologischer Teilchen angewandt. Neben der Hauptkomponenten-Technik fallen auch andere Techniken der Teilchen-Klassifizierung in den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Zur Verbesserung der Geschwindigkeit wurde eine auf der Bayes-Regel beruhende Technik entwickelt. Zur Behandlung von Ereignissen mit gemeinsamer Beteiligung mehrerer Elemente wurde eine Technik auf der Grundlage der Cluster-Charakteristik entwickelt. Für eine nichtparametrische Annäherung wurde eine Technik auf der Grundlage der Regel der k nächsten Nachbarn entwickelt. Jede dieser Techniken der rechnerunterstützten Klassifizierung biologischer Teilchen hat ihre Vorteile und individuell hervorstechenden Merkmale. Es ist zu erwarten, daß die Anwendung von Algorithmen der Muster-Erkennung zum Nachweis, zur Analyse und zur Klassifizierung durchfluß-cytrometrischer Daten biologischer Teilchen in intelligenter Weise die Analyse biologischer Daten vereinfacht und beschleunigt.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung typischer optischer Elemente und Strahlengänge eines bevorzugten Durchfluß-Cytometrie-Geräts zur Erfassung und Klassifizierung interessierender biologischer Teilchen entsprechend den Prinzipien der vorliegenden Erfindung.

Fig. 2 zeigt eine Diagramm-Darstellung zweier Parameter (des Logarithmus der roten Fluoreszenz und des Logarithmus der grünen Fluoreszenz) einer Datengruppe zu Kalibrierzwecken von E. coli und P. mirabilis, in der das Fenster den durch die Methode der Rechteck-Auswertung festgelegten Erfassungsbereich bezeichnet.

Fig. 3 zeigt eine Diagramm-Darstellung zweier Parameter (des Logarithmus der roten Fluoreszenz und des Logarithmus der grünen Fluoreszenz) einer Datengruppe zu Kalibrierzwecken von E. coli und P. mirabilis, in der die eiförmige Grenzlinie den durch die Methode der Hauptkomponente festgelegten Erfassungsbereich bezeichnet.

Fig. 4 A und Fig. 4 B zeigen vergleichende Darstellungen der linearen bzw. der logarithmischen Methode der Hauptkomponente (PCM) und der Methode der Rechteck-Auswertung beim Nachweis von S. aureus in Blut, wobei der eiförmige und der unregelmäßig geformte Bereich aufgrund einer PCM-Analyse unter Zugrundelegung der Vorwärts-Streuung und der grünen Fluoreszenz gebildet wurden und das Rechteck aus dem Verfahren der Fenster-Auswertung resultiert.

Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Fließdiagramms zur Klassifizierung von Zellen und Proben.

Fig. 6 zeigt ein Streuungs-Diagramm von fünf Typen von Bakterien im Raum der zwei dominanten Eigenvektoren der Karhunen-Loeve-Ausdehnung.

Fig. 7 zeigt eine graphische Darstellung von nach der Methode der Hauptkomponente (PCM) bestimmten Cluster-Grenzen der fünf Typen von Bakterien im Raum der zwei dominanten Eigenvektoren der Karhunen-Loeve-Ausdehnung.

Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung der Grenzen der Klassifizierung von sieben Typen von Bakterien im Raum der zwei dominanten Eigenvektoren der Karhunen-Loeve-Ausdehnung, worin die Grenzen nach der Methode der Hauptkomponente (PCM) unter Verwendung von Daten bestimmt wurden, die aus dem vierdimensionalen Merkmalsraum auf diesen zweidimensionalen Eigenraum projiziert wurden.

Fig. 9 zeigt eine graphische Darstellung dreier Klassen von Teilchen und der ihnen entsprechenden Grenzen der Klassifizierung, die durch die Bayes¹sehen Entscheidungsgrenzen bestimmt wurden.

Fig. 10 A und Fig. 10 B zeigen graphische Darstellungen der Bestimmung von Clustern über Schwellenwerte, wobei der das Cluster suchende Algorithmus zur Extraktion des Hauptteils eines Clusters aus Daten, die durch nicht von dem Cluster herrührende (Hintergrund-) Daten verunreinigt waren, eingesetzt wurde.
30

Fig. 10 A zeigt die Konturen-Darstellung der Original-Daten, während Fig. 10 B das resultierende Cluster nach der Anwendung des das Cluster suchenden Algorithmus zeigt.

— οι —

Wenngleich die vorliegende Erfindung durch Ausführungsformen in vielen unterschiedlichen Formen erfüllt wird, ist in den Zeichnungen eine bevorzugte Ausführungsform dargestellt, die im Folgenden näher beschrieben wird. Es ist jedoch ausdrücklich festzustellen, daß die hier gegebene Offenbarung als beispielhaft für die Prinzipien der vorliegenden Erfindung zu betrachten ist, jedoch nicht als eine Beschränkung der Erfindung auf die dargestellte Ausführungsform gedacht ist.

In Fig. 1 sind im einzelnen die optischen Elemente und die Elemente für den Teilchen-Durchfluß eines Durchfluß-Cytometrie-Geräts 11 dargestellt. Die optischen bzw. Durchfluß-Elemente gemäß Fig. 1 stellen die Hauptkomponenten eines bevorzugten Durchfluß-Cytometrie-Geräts für den Transport von Teilchen wie Zellen oder dergleichen, im wesentlichen nacheinander, in einem Flüssigkeitsstrom dar, um derartige Partikel in bezug auf ihre spezifischen Eigenschaften zu untersuchen.

Beispielsweise können die Elemente der in Fig. 1 ge-

(R)

zeigten Vorrichtung in einem FACS -Zellensortierer zum Sortieren von durch Fluoreszenz aktivierten Zellen eingebaut sein, der von der FACS Systems Division of Becton, Dickinson and Company, Sunnyvale, California, hergestellt und vertrieben wird. Der FACS-Zellensortierer (Cell Sorter) analysiert und sortiert Zellenpopulationen auf der Basis von Streulicht und Fluoreszenz in einer großen Mannigfaltigkeit unterschiedlicher Anwendungen für Forschungslaboratorien. Zusätzlieh zu den optischen Elementen und den Durchfluß-Elementen, die nachfolgend im einzelnen beschrieben werden und die in einem Gerät wie dem FACS Cell Sorter eingebaut sein können, sind andere Einzelheiten eines

jo —

Zellensortiergerätes, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung von Wert sind, in der US-PS 3 826 364 sowie in der im Vorstehenden angeführten Veröffentlichung in "Scientific American" beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist in vielen unterschiedlichen Arten von Durchfluß-Cytometrie- oder Durchfluß-Fluorometrie-Geräten mit Vorteil anwendbar, sei es, daß das Streulicht, das Teilchen-Volumen, die Fluoreszenz, Kombinationen der vorgenannten Größen oder andere optisehe, elektrische oder akustische Parameter zur Identifizierung, Klassifizierung oder Quantifizierung von Zellen oder dergleichen in einer Probe eines flüssigen Mediums gemessen werden.

Wie in Fig. 1 dargestellt ist, wird die Lichtenergie für das Durchfluß-Cytometrie-Gerät von einer Lichtquelle 12 erzeugt, etwa einem Laser, der einen gerichteten Lichtstrahl einer einzigen Wellenlänge liefert, oder einer Bogenlampe wie einer Quecksilber- oder Xenon-Bogenlampe, die einen inkohärenten oder ungerichteten, ein breites Wellenlängen-Spektrum umfassenden Lichtstrahl liefert.

In dem Durchfluß-Cytometrie-Gerät 11 wird die Anregungsenergie durch einen von der Lichtquelle 12 erzeugten Lichtstrahl 14 geliefert. Typischerweise durchläuft der Lichtstrahl eine Sammellinse 15, die den Lichtstrahl auf den Flüssigkeitsstrom 16 fokussiert, der die zu untersuchenden Teilchen oder Zellen 17 enthält.

Eine in dem Durchfluß-Cytometrie-Gerät gemäß der vorliegenden Erfindung eingebaute Düse 18 erleichtert das Fließen der Teilchen oder Zellen 17 in dem Flüssigkeitsstrom 16. Die Benutzung einer Düse dieses Typs ist

wohlbekannt und beispielsweise in der OS-PS 3 826 364 beschrieben. Normalerweise wird eine Mantelflüssigkeit 19 zum Einhüllen des Teilchenstroms 16 eingesetzt, wodurch ein hydrodynamisch fokussiertes Strömungssystem der Flüssigkeit erzeugt wird. Beim Durchgang jeder Zelle oder jedes Teilchens durch den Bereich des fokussierten Lichts 20, in dem der Lichtstrahl 14 den Flüssigkeitsstrom 16 schneidet, läßt sich von diesem gestreutes Licht mittels eines geeigneten Photodetektors 21 erfassen. In der hier beschriebenen Ausführungsform erfaßt der Photodetektor 21 Licht, das in Vorwärtsrichtung gestreut wird, typischerweise unter einem Winkel von 0,5° bis 10° zur Achse des Lichtstrahls. Gleichzeitig wird Licht, das in senkrechter Richtung von den durch den Lichtstrahl hindurchgehenden Zellen 17 gestreut worden ist, mit Hilfe eines geeigneten Photodetektors 22 erfaßt.

In ähnlicher Weise läßt sich auch Fluoreszenz erfassen, wenn sie von Teilchen emittiert wird, die aufgrund der Bestrahlung durch die Lichtquelle energetisch angeregt werden. Fluoreszenz, die durch selbstfluoreszierende Teilchen oder fluoreszenzmarkierte Teilchen in dem Fluid-Strom 16 emittiert wird, wird längs der Fluoreszenzachse 23 erfaßt, die typischerweise im rechten Winkel zur Achse des Lichtstrahls 14 verläuft. Die von den fließenden Teilchen emittierte Fluoreszenz kann durch ein geeignetes Filter 24 geschickt werden, bevor sie auf einen dichroitischen Spiegel 25 trifft. Dieser dichroitische Spiegel, Fachleuten wohlbekannt, erlaubt den Durchgang bestimmter Wellenlängen des Lichts, während andere Wellenlängen reflektiert werden. In dieser Hinsicht kann von den Teilchen emittierte Fluoreszenz-Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen in Fluoreszenz-Detektoren 26 und 27 erfaßt werden.

Die Photodetektoren 21 und 22 und Fluoreszenz-Detektoren 26 und 27 können wohlbekannte Photovervielfacher-Röhren oder ähnliche Vorrichtungen sein, die Lichtsignale in elektrische Impulse umwandeln, so daß das dadurch erfaßte Licht den durch das Gerät fließenden fluoreszenzmarkierten Zellen und Zellen spezieller Größe zugeordnet werden kann. Die von den Photodetektoren und Fluoreszenz-Detektoren abgegebenen elektrischen Signale werden typischerweise in die Elektronik 28 des Geräts zu Zwecken der Anzeige, der Speicherung oder der weiteren Verarbeitung eingegeben, so daß eine oder mehrere kennzeichnende Eigenschaft(en) der zu analysierenden Zellen bestimmt werden können.

in der hier beschriebenen Anordnung können Streulicht und Fluoreszenzstrahlung für jedes durch den Bereich des fokussierten Lichts 20 hindurchgehende Teilchen gleichzeitig erfaßt werden. Die Teilchen 17 in dem Flüssigkeitsstrom können in einem geeigneten Behälter 29 gesammelt oder möglicherweise sortiert und in verschiedenen Behältern gesammelt werden, sofern das Durchfluß-Cytometrie-Gerät mit einer Sortiervorrichtung ausgerüstet ist.

Nachdem nunmehr die Hauptelemente eines Durchfluß-Cytometrie-Geräts beschrieben sind, wird auf die Techniken der Muster-Erkennung gemäß der vorliegenden Erfindung näher eingegangen. Es ist davon auszugehen, daß die Algorithmen der vorliegenden Erfindung, die die Techniken der Muster-Erkennung zum Zweck der Klassifizierung der biologischen Teilchen ausführen und anwenden, in der Elektronik des vorliegenden Geräts enthalten sind. Für die Zwecke der nachfolgenden Erörterungen sollen die Techniken der Muster-Erkennung beispielhaft an der Erfassung und Klassifizierung von

Bakterien dargestellt werden. Beispielsweise wurden die Nachweis-Merkmale der vorliegenden Erfindung in bezug auf Bakterien in peripherem menschlichen Blut getestet. Andererseits wurde auch die Klassifizierung von Bakterien in menschlichem Urin-Proben im Hinblick auf die vorliegende Erfindung getestet. Jedoch haben die Prinzipien der vorliegenden Erfindung eine breite Anwendbarkeit auf den Nachweis und die Klassifizierung biologischer Teilchen, unabhängig davon, ob solche Teilchen Mikroorganismen in verschiedenartigen biologischen Flüssigkeiten sind, oder ob es sich um die Zeil-Analyse, etwa die Identifizierung und Zählung verschiedener Unterklassen (Subklassen) von Leukocyten, handelt.

Die Datenanalyse für die Erfassung von Bakterien umfaßt die Kategorisierung von Teilchen als Angehörige einer bestimmten, spezifizierten Bakterien-Species, zu der sie gehören. Die Methoden der Erkennung von Mustern eignen sich in einzigartiger Weise für eine Untersuchung dieser Art. Bei der Problemlösung auf dem Wege der Muster-Erkennung muß der Zell-Klassifizierer, nachdem eine spezifische Methode des Designs gewählt wurde, darauf trainiert werden, Teilchen der in Betrachtung befindlichen Klasse zu erkennen. Dies ist der sogenannte Versuch des Lernens unter Aufsicht ("supervised learning approach"). Dem Klassifizierer wird durch die Arbeitsweise des Lernens der gemeinsamen Kennzeichen aus einem Satz repräsentativer Teilchen aus dieser Klasse "gelehrt", Zellen zu erfassen. Dieser Satz von Ubungsmustern einer bekannten Klassifizierung ist ein bedeutsames Element für diese Methode. Der Übungs-Satz für die Analyse wird typischerweise gewonnen durch Herstellung von Proben mit hoher Konzentration (gewöhnlich 10 oder 10 Teilchen pro 1 ml) eines Bakterien-Typs. Datensätze, die in dem Durchfluß-

Cytometrie-Gerät von diesen Proben gesammelt worden sind, werden als Datensätze zur Kalibrierung ("calibration files") bezeichnet. In dem Lernprozeß extrahierten Zell-Klassifizierer einen Satz beschreibender Merkmale ("descriptors") für jeden Bakterien-Typ aus dem Datensatz zur Kalibrierung und brachten ihn zum Bakterien-Nachweis auf die unbekannten Proben zur Anwendung .

Da Teilchen sich durch die zahlenmäßige Kennzeichnung ihrer Eigenschaften beschreiben lassen, werden für die vorliegende Erfindung die vektorielle Darstellung und der Ansatz der Entscheidungstheorie zur Logik der Klassifizierung eingesetzt. Ein Teilchen mit den Meßwerten x-, x₂ ... χ für η Merkmale wird dargestellt durch den Vektor χ = (χ,, X₂ ... χ ) im n-dimensionalen Raum, in dem jede Koordinatenachse einem speziellen Merkmal zugeordnet ist. Da die Koordinatenwerte Meßwerte sind, ist χ ein Zufallsvektor der Beobachtungen. Der durch sämtliche möglichen Zufallsvektoren gespannte Vektorraum bildet den Merkmalsraum oder Parameterraum für das Problem der Klassifizierung. Weiterhin wird für jede der Klassen von Teilchen in diesem Raum ein zugehöriger Bereich gebildet. Es wird vorausgesetzt, daß diese Klassen in ihrer Gesamtheit sämtlichen Möglichkeiten der Klassifizierung Rechnung tragen und den Bereich für Hintergrund-Teilchen, die nicht diesen Klassen angehören, ausschließen.

Ein Angelpunkt bei der Klassifizierung von Teilchen ist die Entwicklung von Entscheidungsfunktionen zur Unterteilung des Parameterräumes in Bereiche, die die Probenpunkte der jeweiligen Klassen enthalten. Zu diesem Zweck wurde ein Algorithmus entwickelt, der hier

als Methode der Hauptkomponente (principal component method, PCM) bezeichnet wird. Die PCM bedingt eine sammelnde (cluster-bildende) Transformation, die an dem Meßraum durchgeführt wird, um die die Elemente der Klasse darstellenden Punkte zu einer Schar (einem Cluster) zu verdichten. Eine solche Transformation minimiert den Intraset-Abstand zwischen den Muster-Punkten der gleichen Klasse. Ein anderer wesentlicher Schritt in der Entwicklung der Entscheidungsfunktionen ist die Extraktion von Merkmalen, die der Arbeitsgang der Auswahl der für Unterschexdungszwecke wirksamsten Merkmale ist. Gute Merkmale vergrößern die Muster-Ähnlichkeit innerhalb einer Klasse und die Muster-Unähnlichkeit zwischen den Klassen. Die Merkmals-Extraktion besteht aus der Extraktion einer Anzahl von Merkmalen, von denen jedes eine lineare Kombination sämtlicher ursprünglicher Meßwerte ist. Dieser Ansatz läßt sich so betrachten, daß der ursprüngliche Meßraum in einen anderen Darstellungsraum transformiert wird und derjenige Teilraum für die Klasse gefunden wird, der die in dem ursprünglichen Raum verfügbare Information am besten bewahrt.

Die cluster-bildende Transformation wird benutzt, um die Ähnlichkeit der Muster in der gleichen Klasse vermittels einer Minimierung eines Maßes zwischen den die Klasse definierenden Punkten zu erhöhen. Das Maß zwischen zwei Punkten wird durch den euklidischen Abstand gemessen. Je weiter die Muster verschiedener Klassen voneinander entfernt sind, desto größer ist die Chance, daß die Zugehörigkeit zu einer Klasse korrekt erkannt wird. Die physikalische Nähe wird beurteilt aufgrund des Abstandes zwischen zwei Muster-Punkten.

Somit sind Abstandsmaße das fundamentale Konzept bei der Verarbeitung der Muster-Information.

Das durch D bezeichnete Quadrat des mittleren Intraset-Abstandes kann dann durch die den Komponenten der Muster-Vektoren in dem Satz zuzuordnenden Varianzen ausgedrückt werden. Dieses Abstandsmaß wird bei der Untersuchung der cluster-bildenden Transformation verwendet und durch die nachstehende Gleichung ausgedrückt

D= = 2 £ 4 2
k=l *

in der

o, die unverfälschte Varianz der Komponenten entlang der x,-Richtung der Probe ist.

Die Messungen eines Musters werden dargestellt durch verschiedene Koordinatenachsen x, in dem n-dimensionalen Raum. Diese Parameter sind nicht alle gleich wichtig für die Definition des Raumes, in den die gleichen Muster gehören. Zum Vergleich zweier Muster Merkmal für Merkmal sollten Messungen mit der geringsten Signifikanz die geringsten Gewichtungen zuerkannt werden. Messungen, die für die Unterscheidung eine zuverlässige Information übermitteln, sollten schwer gewichtet werden. Dieses Verfahren der Gewichtung von Merkmalen kann mittels einer linearen Transformation verwirklicht werden, die die Muster-Punkte in dem neuen Raum zu einem Cluster vereinigt. Sie minimiert den Intraset-Abstand für eine besondere Klasse in der Hoffnung, daß diese Klasse vedichtet wird und dadurch die Aufgabe der Klassifizierung leichter gemacht wird.

Man betrachte zwei Vektoren a¹ und b' in dem Raum S¹, die aus den Vektoren a und B in dem Raum S mittels einer Transformationsmatrix W transformiert wurden. Sie lassen sich a¹ = W a und b¹ = W b schreiben, wobei

W =

^W11 ^W12 ^W21 ^W22

1n 2n

^wnl ^wn2

w.

nn

worin w. . die gewichtenden Koeffizienten sind. W ist die Matrix, die eine allgemeine lineare Transformation repräsentiert. Das Gewichtungsverfahren, das von Interesse ist, betrifft nur die Parameter der Hauptachsen. Wenn die Lineartransformation nur mit Änderungen der Skalen-Faktoren der Koordinaten durchgeführt wird, kann W eine Diagonalmatrix sein, in der nur die Elemente auf der Hauptdiagonale von Null verschieden sind. Da jedes Element des transformierten Vektors eine lineare Kombination der Elemente des Originalvektors ist, lassen sich die neuen Komponenten schreiben als

und

^{= w}kk ^ak
= ^Wkk ^bk

Infolgedessen wird der euklidische Abstand zwischen a und b in dem neuen Raum repräsentiert durch den Intraset-Abstand für Musterpunkte gemäß der folgenden Beziehung:

^D2 ~ ²J₁ ^(wkk<fk⁾²

In dieser Gleichung ist w,, die einzige Unbekannte, und zur Vermeidung von trivialen Lösungen muß für die W-Matrix eine weitere Randbedingung festgelegt werden. Die betrachtete Randbedingung ist

^T ^wkk ⁼ ^λ
k=l ^kk

Die vorstehende Beziehung bedeutet eine konstante VoIumen-Gewichtung und bezieht sich auf die Norm des Parameter-Raumes. Mit Hilfe des Lagrange-Verfahrens liefert die Minimierung von D², der vorstehenden Randbedingung unterworfen, die nachstehende Beziehung:

k ^{3 λ}

die der Standardabweichung der Messungen umgekehrt proportional ist. Diejenigen Koordinaten, die größere Varianzen haben, tragen wenig Gemeinsames zu dem Muster der Klasse bei; entsprechend sind die Gewichtsfaktoren klein. Wenn umgekehrt die Varianzen klein sind, sind die Beiträge zu der Cluster-Bildung groß, und die Gewichtung ist schwer.

Da die merkmalsgewichtenden Koeffizienten w die Transformationsmatrix W unter der oben spezifizierten Randbedingung bestimmen und wenn die Muster-Vekoren aus dem Raum S in den Raum S¹ mit Hilfe der Transformation

x¹ = W χ
30

transformiert werden, wird der Intraset-Abstand zwischen den Punkten im Raum S¹ minimiert. Dies ist die sogenannte sammelnde Transformation (clusterbildende Transformation) für die Datenpunkte einer Klasse.

Die Extraktion von Merkmalen aus den Übungsmustern ist eine Funktion der Festlegung bestimmter, relativ invarianter Attribute der Muster-Klasse. Vor der Festlegung, welche Komponenten in den Daten kleine oder große Varianzen aufweisen, werden die Daten insoweit vor-verarbeitet, daß neue Merkmale konstruiert werden, die nicht korreliert sind, da einige der gewählten Merkmale korreliert sein können (d.h. ein gemessener Parameter von einigen oder allen der anderen Variablen abhängen kann). Eine gewisse Technik ist zur Extraktion der unkorrelierten Merkmale erforderlich, wenn die Messwerte ihrer Natur nach korreliert sind. Die mathematische Form der Funktion, die die Korrelation unter den Variablen mißt, ist die Kovarianzmatrxx und genügt der folgenden Beziehung:

C ⁼

^σ11 ^σ12 ^σ21 ^σ22

^ση1 ^ση2

2η

ηη

Für unkorrelierte Zufallsvariable ist die Kovarianzmatrxx eine diagonale Matrix, d.h. die Elemente außerhalb der Diagonale sind Null. Es ist bekannt, daß in einer Ähnlichkeits-Transformation (d.h. C¹ = ÄCÄ" ) die Matrix C durch die Matrix Ä diagonalisiert wird, wenn Ä als modale Matrix von C gewählt wird. Für eine modale

Matrix sind die Spalten von A die Eigenvektoren von C oder, mit anderen Worten, die Zeilen von Ä sind die Eigenvektoren von C . Infolgedessen transformiert eine modale Matrix Ä die Original-Meßwerte in einen Raum, in dem die Kovarianzmatrxx diagonal ist und die neuen Koordinaten unkorreliert sind.

Dem durch die clusterbildende Transformation (x¹ = W x) festgelegten Meßwert-Raum zugeordnet ist eine Kovarianzmatrix C', die aus der ursprünglichen Kovarianz-

matrix C durch die Transformation C = WCW gebildet werden kann. Der der Matrix angefügte hochgestellte Index T besagt, daß eine solche Matrix die transponierte Matrix von W ist. Dann kann die Kovarianz der Komponenten in dem Raum S¹ durch Auffinden von Ä entkoppelt werden, derjenigen Transformation, die das Minimum des Intraset-Abstandes aufrechterhält und die Kovarianzmatrix diagonalisiert. Dies resultiert in einem neuen Raum S", in dem der Beitrag der verschiedenen unkorrelierten Komponenten zu der Cluster-Bildung evident ist.

Faßt man kurz zusammen, so basiert die Methode der Hauptkomponenten auf der Gewinnung des optimalen Satzes von Merkmalen, die die Struktur des Daten-Satzes am besten beschreiben. Durch ihre Anwendung auf die repräsentative Probe (Datengruppe zu Kalibrierzwecken) können für das mehrdimensionale Bakterien-Cluster die beschreibenden Größen (Descriptoren) mit dem höchsten Informationsgehalt ausgewählt werden, und auf diese Weise kann die Aufgabe der Erfassung und Klassifizierung erleichtert werden.

Bei der Anwendung der vorgenannten Technik zum Nachweis von Bakterien werden reine Proben von Bakterien als übungssätze für die Datengruppen zu Kalibrierzwecken verwendet, wie dies im Vorstehenden beschrieben wurde. Für derartige Daten bilden der Mittelwert der Probe und die Kovarianzmatrix der Probe eine Verdichtungs-Beschreibung. Der Mittelwert der Probe legt den Schwer-

punkt des Clusters örtlich fest, und die Kovarianzmatrix der Probe gibt an, wie gut der Mittelwert der Probe die Daten in bezug auf die in verschiedenen Richtungen tatsächlich existierende Streuung wiedergibt. Eine Transformation der Merkmals-Extraktion kann durch Diagonalisierung der Kovarianzmatrix der Original-Daten erhalten werden. Die resultierenden Eigenvektoren sind die Zeilen der gewünschten Transformationsmatrix, und die entsprechenden Eigenwerte sind die Varianzen der neuen Merkmale, die Linearkombinationen der ursprünglichen Komponenten sind.

Wie im Vorstehenden beschrieben, ist zu erwarten, daß die Merkmale mit kleineren Varianzen bei der Unter-Scheidung der Bakterien von Nicht-Bakterien wichtiger sind, und deshalb müssen diese Merkmale bei den Entscheidungen über Nachweis und Klassifizierung schwerer gewichtet werden. Dieses Verfahren der Gewichtung der Merkmale erfolgt mittels der clusterbildenden Transformation, die den Daten-Intraset-Abstand, d.h. die mittleren Abstandsquadrate zwischen den Datenpunkten, ein Minimum annehmen läßt. Mit dieser Transformation werden die Daten in eine stärker verdichtete Form komprimiert. Unter der Annahme, daß die Punkte in dem Ubungssatz (Datengruppe zur Kalibrierung) einer einzigen mehrdimensionalen Normalverteilung entstammen, kann der Klassifizierungsbereich dadurch erhalten werden, daß eine Hyperkugel (d.h. eine "Kugel" in vier oder mehr Dimensionen) mit einem Radius von zwei Standardabweichungen definiert werden, die dieses verdichtete Cluster umschließt. Dann kann in dem neuen Raum ein unbekanntes Teilchen als Bakterium erkannt werden, wenn sein Abstand vom Mittelpunkt des Clusters kleiner ist

als der Radius der Hyperkugel. Andererseits wird ein unbekanntes Teilchen als Nicht-Bakterium erkannt, wenn sein Abstand vom Mittelpunkt des Clusters größer ist als der Radius der Hyperkugel.
5

Die Anwendung der Methode der Hauptkomponenten zum Nachweis und zur Erfassung biologischer Teilchen wird im Folgenden erläutert. Die Erfassung oder Klassifizierung von Teilchen in der Durchfluß-Cytometrie beruht auf der Lichtstreuung und auf Messungen von Fluoreszenz-Licht oder Verhältnissen derartiger Messungen. Diese Parameter bilden ein analytisches Werkzeug zur Identifizierung einer Zelle als Element eines speziellen Zeil-Typs. Bei der Erfassung oder Klassifizierung von Bakterien sind die Zellen typischerweise solche verschiedener Bakterien-Species. Es gibt nur zwei praktische Möglichkeiten der Aufzeichnung dieser Daten, nämlich als Liste von Zahlen oder als bildhafte Darstellung. Bei der Trennung der Bakterien von Hintergrund-Teilchen oder der Identifizierung von Bakterien-Typen kann jedoch möglicherweise eine maximale Unterscheidung nur dadurch erreicht werden, daß sämtliche Parameter in der Mehrparameter-Analyse ausgewertet werden. Die Messungen sind aufzuzeichnen und dann mit Hilfe verfeinerter Algorithmen zu verarbeiten. Die numerisch als Listen von Parametern für jedes in dem System gemessene Teilchen aufgezeichneten Daten werden als Daten in Listen-Schreibweise (list mode data) bezeichnet und dienen hauptsächlich der Verarbeitung getrennt vom System. Sobald die Daten in Listen-Schreibweise gesammelt sind, können sie in Form eindimensionaler oder zweidimensionaler Histogramm-Streupunkt-Darstellungen, Konturen-Darstellungen etc. mit voller

Auflösung zur Anzeige gebracht werden. Diese Daten können auch mit Hilfe verschiedener Algorithmen auf der Grundlage Ereignis-für-Ereignis analysiert werden.

Fig. 2 erläutert ein Beispiel für zwei Typen von interessierenden Bakterien in Urin, E. coli und P. mirabilis. Die Erfassung von Bakterien in Urin umfaßt ein komplexes Problem, in dem nur bekannt ist, daß man mit höchster Wahrscheinlichkeit nur einen von zwei oder drei Bakterien-Typen findet. Es ist wichtig zu wissen, ob, und ggf. in welcher Menge, in der Urin-Probe eines Patienten irgendeines dieser Bakterien anwesend ist. Typischerweise hat man das Problem in der Weise bearbeitet, daß man ein rechteckiges "Universal"-Fenster zur Unterscheidung der Bakterien von Hintergrund Teilchen verwendet hat. In Fig. 2 bezeichnet das Rechteck das zweidimensionale Universal-Fenster zur Festlegung des durch die herkömmliche Methode der Rechteck-Signalauswertung bestimmten Nachweis-Bereichs. Das Fenster wird typischerweise sehr groß gemacht, damit es die beiden Ubungssätze (Datensätze zur Kalibrierung) für die beiden Bakterien-Species einschließt. Es ist zu erkennen, daß die von Leerraum in dem Fenster eingenommene überschießende Fläche zu Fehlern bei der Signalerfassung beiträgt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung verfeinert die Methode der Hauptkomponenten die Unterscheidung von Teilchen. Fig. 3 veranschaulicht die Zwei-Parameter-Auftragung des Datensatzes zur Kalibrierung von E. coli und P. mirabilis und die mit Hilfe des PCM-Algorithmus berechnete zweidimensionale Grenze. Die eiförmige Grenzlinie stellt den mit Hilfe der Hauptkomponenten-Methode festgelegten Erfassungsbereich dar. Es wird deutlich, daß

der dadurch bestimmte Bereich sich den Daten besser anschmiegt als das in Fig. 2 abgebildete Universal-Fenster, wodurch wiederum der Nachweisfehler verringert wird. Die PCM-Methode kann im vierdimensionalen logarithmischen Raum durchgeführt werden, worin Streuung nach vorwärts, grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz und Streuung in 90°-Richtung die Parameter-Achsen bilden. Es wurde gefunden, daß die PCM-Technik eine dramatische Steigerung des Signal/Rausch-Verhältnisses bewirkt, was anzeigt, daß die PCM-Näherung dann am nützlichsten ist, wenn der zu erfassende Teilchen-Typ nicht von vornherein bekannt ist.

Die quantitative Analyse gemäß der Hauptkomponenten-Methode basiert auf der in dem Ubungssatz (Datensatz zur Kalibrierung) enthaltenen Information. Diese numerisch berechnete Information enthält Statistiken der Lage, Größe, Form und Verteilung der in der Probe enthaltenen Zellen. Die PCM-Parameter, die eine besser angepaßte Oberfläche für die isolierten Zell-Cluster im mehrdimensionalen Raum konstruieren, leiten sich unmittelbar von dem Mittelwert und der Kovarianz der mehrdimensionalen Probenverteilung ab. Bei diesem Ansatz bedingt die Tatsache, daß die PCM sämtliche Parameter gleichzeitig für die Gewinnung von Lösungen der komplexen Strukturprobleme benutzt, eine wirksame und rationelle Technik der Unterscheidung.

Um eine wirksamere Beschreibung der Bakterien und einen leistungsfähigeren Bereich zur Unterscheidung der Hintergrund-Teilchen zu erzielen, kann man sich einer modifizierten Hauptkomponenten-Methode bedienen. Dieser modifizierte Ansatz erfordert eine vorherige Verarbeitung der Daten zur Eliminierung der Schiefheit innerhalb der Messungen. Danach werden die Charakteristiken

und Beziehungen zwischen den Messungen für die Darstellung der interessierenden Zellen extrahiert. Die Modifizierung der PCM beruht auf einer logarithmischen Transformation, die vor der clusterbildenden Transformation und Merkmals-Extraktion durchgeführt wird, um die Daten so umzuverteilen, daß sie annähernd eine Gauß-Verteilung zeigen. In Fig. 4A ist die (eiförmige) PCM-Grenzlinie dem durch die Arbeitsweise der Fenster-Auswertung erzeugten rechteckigen Fenster überlagert dargestellt. Diese eiförmige Grenzlinie resultiert aus einer Analyse mittels der linearen PCM.

Fig. 4B veranschaulicht die logarithmisch modifizierte Hauptkomponenten-Methode im Vergleich zu der Methode unter Verwendung des rechteckigen Universal-Fensters. Die Daten-Punkte in Fig. 4B stellen die Erfassung von S. aureus in Blut dar. Der unregelmäßig geformte Bereich wurde aufgrund einer PCM-Analyse der Streuung nach vorwärts und der grünen Fluoreszenz mit Hilfe einer logarithmischen Transformation erzeugt. Das Rechteck resultierte aus dem Verfahren der Auswertung mittels des Universal-Fensters. Es ist zu ersehen, daß der Bereich der modifizierten PCM der Mehrzahl der Ereignisse in der positiven Probe besser angepaßt ist als das rechteckige Fenster und der aus Fig. 4A zu entnehmende Bereich der linearen PCM.

Sobald interessierende Teilchen erfaßt worden sind, ist die Klassifizierung biologischer Teilchen ein weiter verfeinerter Arbeitsgang. Die bisherige Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezog sich allgemein allein auf die Erfassung der Teilchen. Fig. 5 veranschaulicht ein Kaskadenmodell der Zeil- und Proben-Klassifizierung. In der Stufe der Zeil-Klassifizierung ist K die

Anzahl der als Bakterien klassifizierten Zellen. In der Praxis wird jedoch der Wert von K durch eine bestimmte Anzahl von Hintergrund-Teilchen (Rauschen) verfälscht, die ebenfalls die vorgewählten Kriterien für Bakterien erfüllen. Der Grad der Verfälschung hängt davon ab, wie gut das Gerät zur Zeil-Klassifizierung (Cell Classifier) arbeitet. Falls der Cell Classifier in bezug auf die Eliminierung von Verunreinigungen perfekt wäre, würde jeder von Null verschiedene K-Wert in hinreichender Weise die Anwesenheit von Bakterien anzeigen. Aus diesem Grunde ist es notwendig, in dem Proben-Klassifiziergerät einen Schwellenwert für den Detektor der von Null verschiedenen Werte zu wählen, um die Hypothese zu testen, daß die Probe bakterienpositiv ist. Eine Probe wird dann positiv genannt, wenn in ihr mehr Bakterien, als dem Schwellenwert entsprechen, nachgewiesen werden, und sie wird als negativ bezeichnet, wenn in der Probe Bakterien-Zahlen unterhalb des Schwellenwertes erfaßt werden. Die Einstellung des Schwellenwertes ermöglicht eine willkürliche Vermittlung zwischen Fehlerraten in positiver Richtung und Fehlerraten in negativer Richtung. Die genannten Fehlerraten hängen jedoch wiederum von der Genauigkeit der K-Werte ab. Die Verringerung des Nachweisfehlers in dem Cell Classifier verbessert die Genauigkeit des K-Wertes und reduziert damit beide Fehlerraten des Proben-Klassifiziergeräts. Mit einem zuverlässigen Schätzwert von K und einem Schwellenwert, der so eingestellt ist, daß positive Fehlerraten durch negative Fehlerraten ausgeglichen werden, läßt sich eine optimale Klassifizierungsleistung erzielen.

Die Techniken der Muster-Erkennung für die Klassifizierung biologischer Teilchen wurden gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt. Geschaffen wurden Algorithmen

für die richtige Klassifizierung biologischer Teilchen. Unter richtiger Klassifizierung ist zu verstehen, daß die Algorithmen dazu befähigt sind, die Übereinstimmung zwischen der Computer-Analyse und den Standard-Prüfverfahren der Mikrobiologie sicherzustellen, aufgrund derer für die spezifischen Teilchen die Datengruppen für die Klassifizierung gewonnen wurde. Insbesondere wurden Algorithmen zur Klassifizierung von sieben Typen von Bakterien entwickelt, denen man allgemein in der Praxis begegnet:

Proteus mirabilis,

Streptococcus faecalis,

Staphylococcus saprophyticus,

Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa und

Lactobacillus.

Es sei jedoch angemerkt, daß ebenfalls Algorithmen für die Erfassung und Klassifzierung anderer biologischer Teilchen wie etwa Unterklassen (Subklassen) von Lymphocyten geschaffen werden können und in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen.

Die Klassifizierung biologischer Teilchen kann mit Hilfe einer Anzahl unterschiedlicher Techniken der Muster-Erkennung erfolgen, darunter

(1) die Methode der Hauptkomponenten,

(2) die Bayes'sche Regel,

(3) die Cluster-Statistik und

(4) die Regel der k nächsten Nachbarn,
ist aber nicht darauf beschränkt.

Wie bereits im Vorstehenden angedeutet wurde, erfaßt die Vektor-Darstellung der biologischen Teilchen in

Form einer Karte die Teilchen als Punkte und die Klassen als Sätze (Sets) in einem Raum begrenzter Dimensionalität. Für jede Teilchen-Klasse wird ein entsprechender Teilchen-Bereich in dem Vektorraum gebildet. Es wird angenommen, daß die Teilchen-Bereiche und die Bereiche für die Hintergrund-Teilchen erschöpfend und sich gegenseitig ausschließend sind. Durch quantitative Charakterisierung der Clusters von Teilchen-Daten wird ein Maß zur Trennung der Clusters definiert, so daß Bereiche für die Klassifizierung aufgestellt werden können. Die Basis-Meßwerte, auf denen die Quantifizierung beruht, sind Ort, Größe und Separierung von Daten-Clustern. Diese Eigenschaften helfen, die Analysen-Merkmale auszuwählen, die unterschiedliche Typen biologischer Teilchen verschieden aussehen lassen, und vermögen zu identifizieren, welche Methode der Präparation bei der Unterscheidung die wirkungsvollste ist.

Bei der Vektor-Kartographie von Teilchen wurde eine Arbeitsweise entwickelt, in der vierdimensionale Daten in zwei Dimensionen dargestellt werden können, wofür ein neuer zweidimensionaler Merkmals-Raum benutzt wird. Die zwei neuen Komponenten des Merkmals-Raumes leiten sich von den gemessenen Parameter ab und tragen für alle betrachteten Daten dem größten Teil der Variation in den Original-Daten Rechnung, so daß die effektive Dimensionalität der Daten sich auf zwei reduzieren läßt.

Die vorliegende Erfindung baut auf der Theorie der Karhunen-Loeve-Ausdehnung (K-L-Ausdehnung) auf, die die Technik zur Merkmalsauswahl erleichtert. Der Arbeitsgang der Auswahl der Merkmale steht in Beziehung zum Leistungsvermögen der Systeme zur Muster-Erkennung.

Seine Funktion besteht darin, aus den verfügbaren Daten diejenigen Merkmale zu extrahieren, die für Zwecke der Klassifizierung am stärksten signifikant zu sein scheinen. Die K-L-Äusdehnung ist in der Kommunikationstheorie wohlbekannt und ist beschrieben von Fukunaga in "Introduction to Statistical Pattern Recognition", Academic Press, New York 1972. Diese K-L-Ausdehnung beruht auf einer Eigenvektor-Analyse der Kovarianzmatrix der Probe in Verbindung mit den Eingangs-Daten.

Die Ergebnisse dieser Analyse werden dazu verwendet, die Darstellungs-Vektoren für die Punkte in allen Clusters in ein neues Koordinatensystem linear zu transformieren, in dem die Koordinaten-Variablen untereinander nicht korreliert sind und worin die Information aus der Verteilung der Original-Daten in den ersten wenigen Achsen des neuen Koordinatensystems konzentriert sind. Auf diese Weise ist es möglich, sich dem Darstellungsvektor mit dem kleinsten quadratischen Fehler mit Hilfe eines neuen Merkmals-Vektors reduzierter Dimension anzunähern. Es ist diese Kombination aus Merkmals-Auswahl und Reduktion, die die K-L-Ausdehnung zu einem leistungsfähigen allgemeinen Lösungsansatz bei Problemen der Muster-Erkennung machen.

Eine Arbeitstechnik zur anschaulichen Darstellung vierdimensionaler Daten im zweidimensionalen Raum entsprechend dem Algorithmus der K-L-Ausdehnung wird folgendermaßen durchgeführt:

1) Man verknüpft die Datengruppen der Ubungssätze für sämtliche interessierenden Bakterien-Klassen zu einem Datensatz für die Kalibrierung.

2) Man berechnet das Mittel und die Kovarianzmatrix dieses Datensatzes für die Kalibrierung nach den oben beschriebenen Arbeitsweisen.

3) Man berechnet die Eigenvektoren und die Eigenwerte für die Kovarianzmatrix.

4) Man wählt die zwei Eigenvektoren, die den beiden größten Eigenwerten der Kovarianzmatrix entsprechen, die die Basis für den neuen Raum bilden.

5) Man bildet eine (2 χ 4)-Transformationsmatrix W mit Hilfe der in Schritt 4 gewählten Eigenvektoren als Zeilen der Matrix W. Und

6) man errechnet den neuen Daten-Vektor x¹ aus der Beziehung x¹ = W χ und zeigt die neuen Ereignisse in dem neuen Raum an.

Die Vektoren x¹ sind nun die zweidimensionale Darstellung, die den Fehler der Annäherung minimiert. Aus diesem Grunde ist die Anzahl der Merkmale, die zur Beschreibung der Daten nötig ist, wirksam vermindert. Wenn in Wirklichkeit alle vier neuen Merkmale ausgewählt würden, ergäbe sich keine Netto-Verringerung der Merkmale, und die neuen Daten-Punkte würden die alten Punkte nach einer Drehung der Koordinaten darstellen.

Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung ist anzumerken, daß die vierdimensionalen Daten für jedes interessierende Teilchen die Streuung nach vorwärts, Streuung in 90°-Richtung, grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz betreffen, wie sie mit Hilfe eines Durchfluß-Cytometrie-Geräts erfaßt werden.

Fig. 6 veranschaulicht die Ergebnisse der Analyse von 5 Bakterien-Typen in Urin: S. faecalis, P. mirabilis, S. saprophyticus, P. aeruginosa und K. pneumoniae. Die Eigenvektoren wurden aus dem Datensatz extrahiert, der alle fünf Bakterien-Typen enthielt, und wurden geordnet

in der Reihenfolge von ihrem höchsten zu ihrem niedrigsten Eigenwert. Der Prozentsatz der Varianz, der in den ersten beiden Komponenten erhalten geblieben war, betrug 93,5 %. Da diese Linearkombinationen der Original-Variablen sind, ist zu erwarten, daß diese Auftragung mehr Information über die Datenstruktur enthält als irgendeine Auftragung zweier Variabler, obgleich es schwierig sein mag, den Linearkombinationen irgendeine wissenschaftliche Bedeutung zuzuordnen. Obwohl in Fig. 6 die Elemente verschiedener Klassen durch unterschiedliche Markierungen dargestellt sind, ist es sehr schwierig, sich den tatsächlichen Raum für jede einzelne Klasse und die Größe des zwischen den Klassen gemeinsam anteiligen Raumes visuell vorzustellen. Die Auftragung lediglich der Grenzlinien der Klassen (oder der Bereiche der Klassifizierung) wäre ausreichend, um aufzuzeigen, wo sich die Klassen befinden und wieviel Raum jede von ihnen einnimmt. Von den im Vorstehenden angegebenen vier verschiedenen Strategien zur Klassifizierung ist die Methode der Hauptkomponenten diejenige, die für die Festlegung der Grenzen der einzelnen Klassen am besten geeignet ist.

Bei der Anwendung auf das Problem der Erfassung von Bakterien unterscheidet die Methode der Hauptkomponenten mit Erfolg Bakterien von Hintergrund-Teilchen. PCM benutzt explizit die Struktur der Teilchen zur Festlegung einer Grenze zwischen Signal und Rauschen, wie im Vorstehenden beschrieben. Ein experimentell bestimmtes Cluster kann mittels eines Satzes von Zahlen codiert werden, die zwei Transformationen, nämlich Merkmal-Extraktion und Cluster-Bildung, sowie einen Mittelpunkt und einen Radius in dem transformierten

Raum umfassen. Diese Zahlen können als Elemente eines speziellen Merkmals-Satzes des Clusters betrachtet werden. Wenn eine numerische Form zur Kennzeichnung einer Klasse Bakterien dienen soll, sollten c Sätze von Zahlen ausreichen, um die betrachteten c Klassen zu definieren. Diese Sätze von Merkmalen begrenzen im wesentlichen die c Klassifizierungs-Bereiche in dem Meßwert-Raum. In diesem Falle existiert jedoch der unbesetzte Raum außerhalb der Gesamtheit der c Klassifizierungsbereiche, der sinnvollerweise den Hintergrund-Teilchen vorbehalten wird.

Die PCM-Methode erfordert unterschiedliche Übungssätze (Datensätze für die Kalibrierung) für die unterschiedliehen Bakterien-Gruppen, die zu klassifizieren sind. Wenn alle Übungssätze zur Gewinnung des Merkmals-Satzes verarbeitet werden, wird der mehrdimensionale Parameter-Raum in Gebiete unterteilt, die den verschiedenen Bakterien-Klassen entsprechen. Diese Bereiche in ihrer Gesamtheit berücksichtigen die in Betrachtung befindlichen Bakterien und schließen Hintergrund-Teilchen aus. Die Klassifizierung kann dadurch erfolgen, daß geprüft wird, ob ein Eingangs-Teilchen in irgendeinen der c Klassifizierungs-Bereiche fällt, oder es als Hintergrund-Teilchen zugeordnet wird, sofern es nicht einer der c Klassen angehört.

Auf der Basis dieser Näherung ist es wünschenswert, daß die Bereiche der Bakterien-Klassen dichten und wohlgetrennten Clustern entsprechen. In der Praxis überlappen sich jedoch die von verschiedenen Bakterien-Typen gebildeten Bereiche bis zu bestimmten, unterschiedlichen Graden. Damit bleibt noch das Problem zu lösen,

— 01 —

wie Ereignisse zu klassifizieren sind, die in die Oberlappungsbereiche fallen. Zur Behandlung solcher Situationen müssen in das Gerät zur Klassifizierung weitere Prozesse der Entscheidungsfindung implementiert werden.

Eine intuitive Lösung besteht darin, den Gedanken der Regel der nächsten Nachbarn bei der Muster-Erkennung anzuwenden, der ein Muster einer unbekannten Klassifizierung der Klasse ihres nächsten Nachbarn zuordnet. Das Ereignis sollte der Klasse zugeordnet werden, deren Mittelpunkt am nächsten bzw. dichtesten bei dem Ereignis liegt. Zur Definition der Vorstellung von "Nähe" (oder "Dichtheit") ist es erforderlich, zuerst ein fihnlichkeitsmaß zu definieren, das eine Regel für die Zuordnung von Mustern zu den Bezirken eines speziellen Cluster-Mittelpunkts aufstellt. Bei der Näherung mittels der nächsten Nachbarn spielt allgemein der euklidische Abstand eine Rolle. Wenn man jedoch zu bewerten wünscht, wieweit entfernt ein einzelnes Teilchen von dem Mittelwert-Vektor ist, sollte man nicht nur einfach den euklidischen Abstand errechnen. Der Grund hierfür ist der, daß die Werte für verschiedene Komponenten möglicherweise nicht unabhängig voneinander sind, sondern Kovarianz zeigen können. Die gegenseitige Korrelation zwischen den das Cluster bildenden Variablen sollte berücksichtigt werden. Dies bewerkstelligt eine Maßzahl, die als Mahalanobis-Abstand bekannt ist.

Der Mahalanobis-Abstand ist ein Wahrscheinlichkeitsmaß, das die effektive Trennung zwischen zwei Punkten nach der Einstellung für die innere Kovarianz der Parameter darstellt, und ist definiert als

— Ό/. —

_φ 1 _

-T

Hierin ist U ein Zeilen-Vektor von Differenzen zwischen dem Mittelpunkt eines Clusters und einem einzelnen Teilchen; Γ ist der zugehörige Spalten-Vektor. C~ ist der Kehrwert der Varianz-Kovarianz-Matrix. Der Konzeption nach bestimmt dies das Herausfinden, welcher Zeil-Typ dem Merkmal-Satz des Ereignisses am meisten ähnelt. Je kürzer der Abstand zwischen dem Ereignis und dem Mittelpunkt des Clusters ist, desto wahrscheinlicher ist es, daß die unbekannte Zelle zu der betreffenden Klasse gehört. Je langer der Abstand ist, desto weniger wahrscheinlich ist es, daß die unbekannte Zelle zu derjenigen Klasse gehört.

Die Anwendung der PCM-Technik der Klassifizierung ist in Fig. 7 anschaulich dargestellt. Cluster-Grenzen, die mittels der PCM bestimmt wurden, sind aufgezeichnet und beziehen sich auf die fünf-Bakterien-Typen in dem Raum der zwei dominierenden Eigenvektoren der K-L-Ausdehnung.

Die Bakterien P. aeruginosa, S. faecalis und S. saprophyticus, die in Fig. 6 nahezu ununterscheidbar sind, sind in Fig. 7 deutlich dargestellt. Wenngleich noch immer eine Überlappung zwischen S. faecalis und S. saprophyticus zu beobachten ist, ist die Trennung zwischen P. mirabilis und K. pneumoniae signifikant gesteigert. In ähnlicher Weise veranschaulicht Fig. 8 die errechneten zweidimensionalen Klassifizierungsbereiche für sieben Bakterientypen: P. mirabilis, S. faecalis, S. saprophyticus, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa und Lactobacillus. Die Darstellung in Fig. 8 zeigt den Raum der zwei dominierenden Eigenvektoren der Karhunen-Loeve-Ausdehnung. Die Grenzen sind nach der

Hauptkomponenten-Methode bestimmt, wobei aus dem vierdimensionalen Merkmals-Raum auf diesen zweidimensionalen Eigenraum projizierte Daten eingesetzt wurden. Es wird deutlich, daß Klasse 1 (P. mirabilis) und Klasse 5 (E. coli) einen großen Betrag der Überlappung aufweisen. Es gibt eine gewisse Überlappung zwischen S. faecalis und Lactobacillus sowie eine Wechselwirkung mit S. saprophyticus. Obwohl das Ausmaß der Überlappung im vxerdimensxonalen Raum reduziert wurde, ist es nicht verwunderlich zu erkennen, daß einige der Teilchen in der Probe von P. mirabilis von dem PCM-Klassifiziergerät in die Klasse von E. coil eingeordnet wurden, wie dies in der folgenden Tabelle dargestellt ist:

Klassen-Nr. Klassen-Name Zahl (Count) Vertrauens-

der Ereignisse wert (%)

1	P. mirabilis	822	85,71
2	S. faecalis	23	2,40
3	S. saprophyticus	0	0,00
4	K. pneumoniae	14	1,46
5	E. coli	100	10,43
6	P. aeruginosa	0	0,00
7	Lactobacillus	0	0,00
	Hintergrund	41/1000

Die Probe wurde jedoch korrekt klassifiziert, da sie signifikant mehr als P. mirabilis markierte Zellen enthielt.
30

Unter der Annahme normaler Daten-Statistik kann die Klassifizierung biologischer Teilchen, z.B. Bakterien, aufgrund der Anwendung der Bayes-Regel vorgenommen werden. Nach dem Ansatz der Bayes-Regel legt man die statistische Entscheidungstheorie der Durchführung der

Klassifizierung zugrunde. Sie unterteilt den Merkmalsraum in c sich gegenseitig ausschließende und erschöpfende Bereiche (R,, R₂, ... R), die c Bakterien-Typen entsprechen. Dann besteht die Klassifizierung darin, eine Zelle der i-ten Klasse zuzuordnen, wenn ihre Parameter die größte Wahrscheinlichkeit in dem zugehörigen Bereich R. ergeben. Die Anwendung wahrscheinlichkeitstheoretischer Überlegungen gründet sich auf mehrere Betrachtungen. Erstens liefern sie ein Werkzeug, das die Konsequenzen der Meßwert-Variabilität auszudrücken vermag, was bei der Datensammlung unvermeidbar ist. Zweitens ermöglichen sie quantitative Maßzahlen für Korrelationen zwischen Merkmalen. Schließlich erkennt der statistische Gesichtspunkt an, daß eine naturbedingte Unscharfe existiert (d.h. gemeinsame Angehörigkeiten zu mehreren Klassen), die dem Unterscheidungsverfahren anhaftet, was eine von Fehlern freie Kategorisierung unerreichbar werden läßt. Die Bayes'sche Entscheidungsstrategie, wie sie hier zugrunde gelegt wird, ist ein geeignetes statistisches Lösungsverfahren, da es aufgrund seiner Konstruktion die Strafen für das Verursachen von Fehlern minimiert.

Das Bayes-Klassifiziergerät begünstigt die Zuordnung eines Ereignisses χ zu der wahrscheinlichsten Quelle und maximiert die mittlere Erfolgsquote über die c Klassen. Seine Strategie ist äquivalent der Folge von c (c - 1) /2 paarweisen Vergleichen, die jeweils die Eliminierung der der kleineren Wahrscheinlichkeit entsprechenden Klasse nach sich ziehen. Bei jedem Schritt wird der Merkmalsraum in zwei Bereiche, entsprechend dem Vorzeichen von d.j. = D₁(X) - D. (χ), unterteilt, worin i,j = 1,2 ... c und O^ und D. die Entscheidungsfunktionen der Klassen i bzw. j sind. Der Bereich des

positiven Vorzeichens ist der Klasse i zugeordnet, und der Bereich des negativen Vorzeichens ist der Klasse j zugeordnet. Sie sind durch eine Entscheidungsgrenze getrennt, auf der d. . verschwindet. Die Klassifizierung der Klasse i ist einfach der gemeinsame Anteil sämtlicher der Klasse i zugeordneter positiver Bereiche. Seine Grenzen bestehen aus sämtlichen Punkten innerhalb der Grenzen der paarweisen Entscheidungen, die nicht einem negativen Bereich angehören.

Die Implementierung eines Bayes-Klassfiziergeräts für biologische Teilchen auf der Basis von statistischen Entscheidungsfunktionen besteht aus
erstens dem Auswerten der Werte der c-Funktion für einen Eingabe-Vektor x,

zweitens dem Auswählen des größten und

schließlich dem Zuordnen des unbekannten Eingangs-Teilchens zu der entsprechenden Klasse.
Eine anschauliche Darstellung des Ansatzes der Bayes-Regel ist in Fig. 9 gegeben. Drei Zeil-Klassen sind in dem Zwei-Parameter-Raum der Fig. 9 getrennt. Der der Klasse I entsprechende Raum besteht aus der durch die negative Seite der Kurve d^.» = 0 und die positive Seite der Kurve d₃₁ = 0 bestimmten Fläche. Diese Fläche ist durch "Klassifizierungsbereich I" in der Figur bezeichnet. Es ist ersichtlich, daß, obwohl die Klasse I eine relativ kleine Fläche besetzt, der tatsächliche Klassifizierungsbereich, in dem ein Teilchen dieser Klasse zugeordnet werden würde, eine sehr große Ausdehnung besitzt. Ähnliche Erläuterungen gelten für die anderen beiden Klassen. Die durch A, B und C bezeichneten drei Punkte, die in der Figur deutlich als Hintergrund-Teilchen dargestellt sind, werden mittels des Bayes-Klassifiziergeräts irrtümlich als Teilchen der Klasse I

klassifiziert. Dies ist ein Nachteil des Bayes-Klassifiziergeräts, da ihm die Fähigkeit fehlt, mit unklaren Situationen in dem Prozeß der Entscheidungsfindung fertig zu werden (z.B. solchen, in denen die Wahrscheinlichkeit dafür, daß ein Ereignis in irgendeine der Klassen fällt, außerordentlich klein ist). Eine Maßnahme, diesem Problem abzuhelfen, besteht in der Vor-Verarbeitung der Merkmale eines Ereignisses, um offensichtliche Ausreißer zu eliminieren.

Ein anderer Lösungsweg für die Klassifizierung biologischer Teilchen mit Hilfe von Techniken der Muster-Erkennung ist die Technik der Cluster-Merkmale. Die bisher beschriebenen Techniken der Klassifizierung konzentrierten sich auf eine Ereignis-für-Ereignis-Analyse. Es kann jedoch genügend Information in Form numerischer Daten in Meßwerten der Gruppe von Ereignissen als Ganzes vorliegen, um zu bestimmen, ob das biologische Teilchen vorliegt. Wenn eine Verifizierung von Differenzen zwischen zwei Zellpopulationen den diagnostischen Schlüssel liefert, ist es für gewöhnlich nicht notwendig, daß jede einzelne Zelle richtig klassifiziert wird; es ist lediglich notwendig, die Signifikanz einer Differenz zwischen den Klassen zu beweisen. Wenn die Unterscheidung gut genug ist, um die Clusters fehlerfrei zu klassifizieren, kann die Schwierigkeit sich überlappender Bereiche ausgeschaltet werden und das Problem von Teilchen, die mehreren Klassen angehören, vernachlässigt werden.

Der grundlegende Gesichtspunkt der Cluster-Klassifizierung ist die Annahme, daß eine als Cluster bezeichnete Gruppe von Teilchen einer einzigen Bakterien-Population

zu entnehmen ist. Dies bedeutet, daß erwarte*; wird, daß die Daten gerade für eine Klasse von Bakterien repräsentativ sind. Aus diesem Grunde besteht der Anfangsschritt bei der Cluster-Analyse - der allen Verarbeitungstechniken der Daten von Bakterien gemeinsam ist darin, einen klaren Datensatz für die Klassifizierung zu gewinnen. Methoden der Rechteck-Auswertung sind hierfür nicht gut genug, da die Struktur-Merkmale sehr anfällig gegenüber Teilchen außerhalb des Clusters sind. Dementsprechend wurde gemäß der vorliegenden Erfindung ein Algorithmus zum Suchen von Clustern mit dem Ziel entwickelt, die "natürliche" Gruppierung der Daten zu erhalten und jene Ausreißer-Ereignisse wirksam zu eliminieren.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein zeiteffizientes Schema auf der Grundlage der Tatsache entwickelt, daß in durchfluß-cytometrischen Daten für biologische Teilchen ein Cluster immer existiert. Diese Beobachtung wird durch die Tatsache veranlaßt, daß Bakterien-Daten gewöhnlich eine eingipflige Struktur zeigen. Ungeachtet dessen, daß die Bakterien in dem Cluster pathogen oder nicht pathogen sein können, bilden sie jeweils ein Cluster in dem Parameter-Raum.

Wenn in dem Cluster nicht genügend Ereignisse enthalten sind, wird die Flüssigkeitsprobe nicht als klinisch bedeutsam angesehen. Auf der Grundlage dieser Annahmen wird die Benutzung eines Histogramms zur Darstellung der Daten sinnvoll. Das Histogramm kartographiert die Punkte in dem Cluster in neuer Form, die durch große Zahlen auf der Frequenz-Achse gekennzeichnet ist, sowie die verbleibenden Punkte in die Umgebung mit kleinen Werten für die Frequenz-Counts. Wegen dieser deutlichen

Differenzen der Werte in dem neuen Format kann das Cluster leichter identifiziert werden. Hier ist der Hauptgedanke, in dem neuen (d + l)-dimensionalen Raum nach einem zentralen Gipfel Ausschau zu halten, der von einem Tal umgeben ist. Die den Gipfel bildenden Ereignisse sind Bestandteile des Clusters in dem ursprünglichen Raum, und andere Ereignisse werden als Rauschen betrachtet.

Das Verfahren zur Extraktion eines Clusters umfaßt das Anlegen eines Schwellenwertes an das Histogramm der Daten. Dieser Vorgang bedingt das Auswählen eines Wertes T derart, daß alle Frequenz-Counts größer als T in das Cluster kartographiert werden, während alle anderen Frequenz-Counts dem Hintergrund zugeteilt werden. Da die Erzeugung eines mehrdimensionalen Histogramms unpraktisch ist, ist der am stärksten informative und effizienteste Weg die Bildung eines Zwei-Parameter-Histogramms. Dieses ähnelt einem zweidimensionalen Bild, und die Werte der Frequenz-Counts sind den Grau-Werten äquivalent. Der hierunter entwickelte Algorithmus errechnet das Histogramm für zwei ausgewählte Parameter, erfaßt einen Gipfel, berechnet einen Schwellenwert, identifiziert den Teil des Histogramms, in dem ein Cluster lokalisiert ist, und extrahiert die das Cluster bildenden Ereignisse aus den Original-Daten.

Der bevorzugte Algorithmus beinhaltet das Konstruieren eines zweidimensionalen Histogramms aus zwei der vier Meßwert-Parameter, das von geringerer Auflösung als die in den Original-Messungen existierende maximal mögliche Auflösung ist. Die Wahl einer niedrigeren

Auflösung erhält die wichtigen Merkmale des Original-Clusters, verringert jedoch den rechnerischen Aufwand und Speicherbedarf für die nachfolgenden Schritte. Bei geringerer Auflösung besteht die Möglichkeit, daß kleine Clusters, die sich in der Nähe eines großen befinden, nicht nachweisbar sind. Durch Einsatz eines Gipfel-Detektors über dem zweidimensionalen Histogramm ist es möglich, den interessierenden Bereich nachzuweisen, und es ist dann erforderlich, nur diesen Bereich für die weitere Analyse zurückzubehalten. Hier ist die Hauptaufgabe, denjenigen Teil des "Bildes" zu finden, der sich signifikant von dem Hintergrund unterscheidet. Mit anderen Worten, die Grenze um den Gipfel, die das Cluster umschließt, bedarf der Festlegung.

Sobald der Schwellenwert festgelegt ist, kann der Umriß eines Clusters durch Kennzeichnung der Schwellenwertübergänge enthaltenden Bereiche erzeugt werden. Der Schritt des Auffindens des Umrisses des Bereichs ist wichtig für Zwecke der Identifizierung von Teilchen in dem Cluster aus dem Original-Datensatz. Mittels der Fähigkeit, aus den Original-Daten diejenigen Ereignisse, die das Cluster bilden, wieder abzurufen, vermag der Algorithmus durch Nutzung der verbleibenden zwei Parameter eine maximale Empfindlichkeit in der Cluster-Charakterisierung zu erzielen.

Fig. 1OB zeigt die verbleibenden Cluster nach der Anwendung des Algorithmus zum Cluster-Suchen auf die Sätze der Original-Daten, die in Fig. 1OA dargestellt sind. Es ist deutlich erkennbar, daß mehrere nicht signifikante Hintergrund-Cluster eliminiert werden und nur die dominierenden Cluster erhalten bleiben.

In der Cluster-Analyse zur Klassifizierung von Bakterien ist es wünschenswert, die Signifikanz einer Differenz zwischen zwei Klassen zu beweisen. Dies erfolgt auf der Grundlage statistischer Tests, die hochempfindlieh sind in bezug auf die Bewertung der Signifikanz der beobachteten Differenzen. Zur Bewertung der Signifikanz solcher Differenzen sind verschiedene Test-Statistiken einsetzbar, die gewöhnlich in der mehrdimensionalen Analyse angewandt werden. Beispielsweise kann die mehrdimensionale Analyse zur Bestimmung der Signifikanz der Differenz zwischen den Mittelwert-Vektoren zweier mehrdimensionaler Verteilungen angewandt werden. Weiterhin kann ein anderer Test zum Nachweis kleiner Differenzen zwischen den Varianz-Kovarianz-Strukturen zweier Proben eingesetzt werden.

In den vorhergehenden Abschnitten wurde das überwachte Lernen ("supervised learning") unter der Annahme abgehandelt, daß die zugrundeliegenden Dichte-Funktionen annähernd normal waren. Obwohl diese Annahme aufgrund der intensiven eingipfligen Häufung der Bakterien-Daten und auch der zufriedenstellenden Ergebnisse vernünftig erscheint, entsprechen die üblichen Parameter-Formen nur selten exakt den Dichten. Dem Rechnung tragend liegen auch nicht-parametrische Methoden der Muster-Erkennung innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung. Eine derartige nicht-parametrische Technik der Muster-Erkennung ist die Regel vom nächsten Nachbarn, die Wahrscheinlichkeitsschätzungen umgeht und direkt auf die Entscheidungsfunktionen zugeht.

Vereinfacht ausgedrückt ersetzen Regeln über nächste Nachbarn das Erfordernis, die zugrundeliegenden Verteilungen zu kennen, durch das Erfordernis, eine große

Zahl von Mustern zu kennen. Die Grundgedanken dieses Ansatzes sind die, daß wahrscheinlich Punkte, die im Merkmals-Raum dicht nebeneinander liegen, entweder zu derselben Klasse gehören oder etwa die gleichen Wahrscheinlichkeiten dafür aufweisen, daß sie sich in ihren betreffenden Klassen befinden. Der erste dieser Gedanken führt zu der Formulierung der Regel vom einzelnen nächsten Nachbarn (1-NNR), während aus dem zweiten Gedanken die Formulierung der Regel über die k nächsten Nachbarn (k-NNR) resultiert.

Die Einbeziehung der k-NN-Regel in ein Klassifiziergerät ist nicht so kompliziert wie die zuvor beschriebenen Techniken. Für jedes unbekannte Ereignis berechnet die Regel über die nächsten Nachbarn die Abstände zwischen sämtlichen Punkt-Paaren und ordnet die Werte in steigender Reihenfolge. Dann werden die k nächsten Punkte und ihre Zugehörigkeiten bestimmt. Aus diesen k Punkten wird die Klasse, die die Mehrheit der Ereignisse enthält, für das unbekannte Teilchen gewählt. Wenn jedoch die Gesamtzahl der Ereignisse in der ausgewählten Klasse einen Schwellenwert L nicht überschreitet, werden die unbekannten Teilchen als Hintergrund-Teilchen klassifiziert. Der Schwellenwert schützt das Klassifiziergerät durch Offenhalten einer solchen Ablehnungsmöglichkeit vor übermäßigen Klassifizierungsfehlern.

Als nicht-parametrischer Klassifizierungs-Algorithmus beruht die k-NN-Regel eher auf der Ähnlichkeit oder Nachbarschaft im Merkmalsraum als auf der maximalen Wahrscheinlichkeit als Grundlage für eine Klassenzugehörigkeit. Sie ordnet das unbekannte Teilchen dadurch

INSPSCTfD

der Klasse zu, daß ein für alle Paare von Objekten in sämtlichen Klassen definiertes Ähnlichkeitsmaß geprüft wird. Das vorzugsweise verwendet fihnlichkeitsmaß ist der euklidische Abstand.
5

Die die Arbeitsweise nach der k-NN-Regel stützende theoretische Begründung liegt in der unendlichen Probengröße, einer Bedingung, die in der Praxis nur selten vorkommt. Dementsprechend sollte die k-NN-Regel nur dann angewandt werden, wenn ein sehr umfangreicher Übungssatz (Datensatz für die Kalibrierung) zur Verfügung steht.

Somit macht die vorliegende Erfindung ein Durchfluß-Cytometrie-Gerät und ein Verfahren zur Erfassung und Klassifizierung biologischer Teilchen verfügbar. Gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung wurden Techniken der Muster-Erkennung entwickelt, die die Leistungsfähigkeit der Erfassung und Klassifizierung biologischer Teilchen in signifikantem Maße verbessern. Es wurde hier aufgezeigt, daß die durchfluß-cytometrische Klassifizierung von Teilchen qualitativ verstärkt wird ausgrund einer Analyse, die gleichzeitig sämtliche gemessenen Merkmale der der Untersuchung unterzogenen Teilchen benutzt.

1*'

Leerseite -

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD ElSHOlD" FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

PATENTANWÄLTE

. , . , „ Dr.-Ing. von Kreisler 11973

Becton Dickinson and Company Dr.-Ing. K. W. Eishold 11981

Paramus, N.J. 07652, U.S.A. Dr.-Ing. K. Schönwald

Dr. J. F. Fues

Dipl.-Chem. Alek von Kreisler
Dipl.-Chem. Carola Keller
Dipl.-Ing. G. Selting
Dr. H.-K. Werner

DEIGHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

D-5000 KÖLN 1

6. September 1985

AvK/GF 546

Patentansprüche

1. Durchfluß-Cytometrie-Gerät zum Nachweis interessierender biologischer Teilchen in einer Probe unbekannter *" biologischer Teilchen mit einer Strömungseinrichtung zum im wesentlichen ver- ·* einzelten Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums,

einer Lichtquelle mit einem auf die Teilchen in dem Strom gerichteten Strahl einfallenden Lichts,

- einer Meßeinrichtung zum Erfassen lichtbezogener Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt,
einer Einrichtung zum Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen auf der Grundlage der von einer solchen Klasse erfaßten Licht-Daten sowie zum Speichern solcher lichtbezogener Daten,

- einer Einrichtung zum Vergleichen solcher gespeicherter Daten mit Licht-Daten, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen

Telefon: (0221] 131041 ■ Telex: 8882307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln

_₂_ 3531369

und

einer Einrichtung, die aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten eine Entscheidung darüber trifft, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen lichtbezogener Daten eine Vorrichtung zum Erfassen einer Mehrzahl verschiedener Lichtsignale umfaßt.

3. Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Erfassen Mittel zum Erfassen des durch die Teilchen, die durch den Lichtstrahl hindurchtreten, gestreuten Lichts und der von ihnen emittierten Fluoreszenz enthält.

4. Gerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Erfassen die Streulicht- und Fluoreszenz-Signale gleichzeitig aufnimmt.

5. Gerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Erfassen Mittel zum Erfassen des in wenigstens zwei verschiedenenen Richtungen gestreuten Lichts und zum Erfassen der von den Teilchen bei wenigstens zwei verschiedenen Wellenlängen emittierten Fluoreszenz enthält.

6. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Aufstellen und zum Speichern einer Klasse von Teilchen eine elektrische Schaltung mit Speichervorrichtung ist, wobei die Schaltung Mittel zur Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale enthält.

.3- 3131969

7. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Vergleich der Daten eine Vorrichtung mit Entscheidungsfunktion enthält, die den Raum zur Messung der Licht-Daten in einen Bereich zu unterteilen vermag, der die Datenpunkte von Probe-Teilchen enthält, die zu der aufgestellten Klasse gehören.

8. Gerät nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mit Entscheidungsfunktion Mittel zur Transformation der Daten des Meßraums enthält, um die die Elemente der genannten Klasse repräsentierenden Datenpunkte zu sammeln.

9. Gerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur sammelnden Transformation dazu befähigt ist, die die Daten des Musters des Meßraums betreffenden Vektoren gemäß der nachstehenden Beziehung in einen neuen Raum zu transformieren

x¹ = Wx ,

in der

χ der ursprüngliche Vektor des Meßraums ist,
x¹ der transformierte Vektor ist und

W die aus variablen gewichteten Koeffizienten w. . bestehende Transformationsmatrix ist.

10. Gerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur sammelnden Transformation dazu befähigt ist, den Intraset-Abstand zwischen den Datenpunkten der aufgestellten Klasse zu minimieren.

11. Gerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Transformation dazu befähigt ist, bei der Minimierung des Intraset-Abstandes für Datenpunkte in dem transformierten Raum auf der Grundlage der nachstehenden Beziehung zu arbeiten

η
D² = 2 y (W₁ . <5, ) ² ,

k=l ^{kk k}

in der

D² das Quadrat des mittleren Intraset-Abstandes zwischen zwei Punkten eines mehrdimensionalen Raums ist,

<>, die unverfälschte Varianz der Komponenten in x-Richtung der Probe ist,

w_ui der variable gewichtende Faktor ist und

zur Minimierung von D²

12. Gerät nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mit Entscheidungsfunktion weiterhin Mittel zum Extrahieren von Merkmalen aus den gespeicherten Daten zur Unterscheidung von die unbekannten Teilchen betreffenden Daten enthält.

13. Gerät nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Extrahieren dazu befähigt ist, eine Mehrzahl von Merkmalen aus den gespeicherten Daten zu extrahieren, wobei jedes Merkmal eine Linearkombination sämtlicher gespeicherter Original-Meßdaten ist.

14. Gerät nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Extrahieren dazu befähigt ist, unkorrelierte Merkmale aus den gespeicherten Daten zu extrahieren, wenn die Messungen der Merkmale, in Wirklichkeit korreliert sind, wodurch die mathematische Form der Funktion, die die Korrelation zwischen den Merkmalen mißt, eine Kovarianzmatrix ist.

3531369

15. Gerät nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Extrahieren dazu befähigt ist, die gespeicherten Daten des ursprünglichen Meßraums in einen anderen Darstellungsraum zu transformieren und den Unterraum für die Klasse, der im wesentlichen die in dem ursprünglichen Meßraum verfügbaren Daten konserviert, aufgrund der folgenden mathematischen Beziehung zu bestimmen:

C' = WCW^T ,

in der

C¹ die transformierte Kovarianzmatrix ist, C die ursprüngliche Kovarianzmatrix ist, W die aus variablen gewichteten Koeffizienten w. . bestehende Transformationsmatrix ist und

die
ist.

-T -

W die transponierte Form der Transformationsmatrix W

16. Gerät nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Extrahieren dazu befähigt ist, die Kovarianz der Komponenten-Merkmale auf der Grundlage einer modalen Matrix zu entkoppeln, die den Original-Meßraum in einen neuen Raum transformiert, in dem die Kovarianzmatrix diagonal ist und die Koordinaten des neuen Raums unkorreliert sind.

17. Gerät nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Treffen der Entscheidung ein Mittel zum Definieren eines Gebiets für die aufgestellte Klasse als Hyperkugel mit spezifiziertem Radius in dem neuen Raum enthält und die Einrichtung zum Treffen der Entscheidung weiterhin dazu befähigt ist zu bezeichnen, daß ein unbekanntes Teilchen zu der aufgestellten Klasse gehört, wenn sein Abstand vom Zentrum der Ansammlung (des Clusters) kleiner als der Radius der genannten Hyperkugel ist.

3531959

18. Gerät zum Nachweis von Teilchen in einer Probe mit

- einem Meßgebiet zum Messen kennzeichnender Merkmale der Teilchen,

einer Strömungseinrichtung zum im wesentlichen vereinzelten Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums durch das Meßgebiet hindurch,

einer Meßeinrichtung zum Erfassen von mit den kennzeichnenden Merkmalen in Verbindung stehenden Daten für jedes strömende Teilchen, wenn dieses durch das Meßgebiet hindurchtritt,

einer Einrichtung zum Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen gemäß eines von einer solchen Klasse von Teilchen erfaßten Daten-Musters und

einer Einrichtung, die aufgrund der Erkennung des von den Teilchen der Probe erfaßten Daten-Musters eine Entscheidung darüber trifft, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

19. Durchfluß-Cytometrie-Gerät zum Nachweis interessierender biologischer Teilchen in einer Probe unbekannter biologischer Teilchen mit

einer Strömungseinrichtung zum im wesentlichen vereinzelten Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums,

einer Lichtquelle mit einem auf die Teilchen in dem Strom gerichteten Strahl einfallenden Lichts,

- einer Meßeinrichtung zum gleichzeitigen Empfang von durch jedes strömende Teilchen gestreutem Licht und von jedem strömenden Teilchen emittierter Fluoreszenz, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt,

3131969

einer Einrichtung zum Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen auf der Grundlage der Streulicht- und Fluoreszenz-Daten sowie zum Speichern solcher Daten,

einer Einrichtung zum Transformieren der von Probe-Teilchen einer unbekannten Klasse erfaßten Licht-Daten, um die auf diese Weise transformierten Daten-Punkte (in Form eines Clusters) zu sammeln, einer Einrichtung zum Extrahieren von Merkmalen aus den gespeicherten Daten zur Unterscheidung von Daten, die die unbekannten Teilchen betreffen, und einer mit der Einrichtung zum Transformieren und der Einrichtung zum Extrahieren verbundenen Einrichtung, die aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten eine Entscheidung darüber trifft, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

20. Durchfluß-Cytometrie-Gerät zum Nachweis und zur Klassifizierung interessierender biologischer Teilchen in einer Probe unbekannter biologischer Teilchen mit einer Strömungseinrichtung zum im wesentlichen vereinzelten Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums,

einer Lichtquelle mit einem auf die Teilchen in dem Strom gerichteten Strahl einfallenden Lichts, - einer Meßeinrichtung zum Erfassen lichtbezogener Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt, einer Einrichtung zum Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen auf der Grundlage der von einer solchen Klasse erfaßten Licht-Daten sowie zum Speichern solcher lichtbezogener Daten,

einer Einrichtung zum Einteilen der Klasse in eine Mehrzahl von Unterklassen derselben, wobei die lichtbezogenen Daten jeder Unterklasse getrennt gespeichert werden,

einer Einrichtung zum Vergleichen solcher gespeicherter Daten mit Licht-Daten, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen, und

Einrichtungen, die aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten eine Entscheidung darüber treffen, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören, und die Unterklassen identifizieren, zu denen die unbekannten Teilchen gehören.

21. Gerät nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, die Unterklassen durch vektorielle Darstellung in einem Raum numerisch zu kennzeichnen.

22. Gerät nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, in einem Raum begrenzter Dimensionalität die Teilchen als Punkte und die Teilchen-Unterklassen als Punktscharen (Cluster) kartographisch darzustellen.

23. Gerät nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen die kartographische Darstellung in der Weise durchführt, daß es eine zweidimensionale Darstellung vierdimensionaler Daten liefert.

24. Gerät nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, aus den gespeicherten vierdimensionalen Daten diejenigen Merkmale zu extrahieren, die für die Zwecke der Klassifizierung am meisten signifikant sind, und die Darstellungsvektoren der ursprünglichen Clusters linear in ein neues Koordinatensystem zu transformieren, in dem die Koordinaten-Variablen nicht miteinander korreliert sind und die Daten aus den ursprünglichen Clusters in den ersten wenigen Achsen des neuen Koordinatensystems konzentriert sind.

25. Gerät nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen die Merkmale in der Weise extrahiert, daß sie eine Eigenvektor-Analyse einer Kovarianzmatrix in Verbindung mit Daten der ursprünglichen Clusters durchführt und die beiden größten Eigenwerte der Kovarianzmatrix als Basis für den neuen zweidimensionalen Raum benutzt.

26. Gerät nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, die Unterklassen durch Anwendung eines statistischen Entscheidungsmittels zu identifizieren.

27. Gerät nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das statistische Entscheidungsmittel dazu befähigt ist, den Bereich des ursprünglichen Datenspeichers in eine Mehrzahl ausschließlicher und erschöpfender, der Zahl der Unterklassen entsprechender Unterbereiche aufzuteilen und ein Teilchen einer der Unterklassen zuzuordnen, wenn dessen lichtbezogene Daten in dem entsprechenden Unterbereich die größte Wahrscheinlichkeit liefern.

28. Gerät nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, die Unterklassen durch Unterscheidung interessierender Teilchen von Hintergrund-Teilchen zu identifizieren, wobei die die Struktur der Teilchen darstellenden Daten zur Festlegung der Grenze zwischen Signal und Rauschen zugrundegelegt werden.

29. Gerät nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mittel zum Sammeln (als Cluster) von die Unterklassen darstellenden Daten durch Kodieren eines durch zwei mathematische Transformationen erzeugten Satzes von Zahlen für jede Teilchen-Unterklasse enthalten ist, wobei diese Sätze jeweils weiterhin durch einen Mittelpunkt und einen Radius in dem transformierten Raum funktionell -dargestellt werden, worin ein unbekanntes Teilchen als zu einer Unterklasse gehörig identifiziert wird, wenn sein Datenvektor in den spezifisch kodierten Satz von Zahlen fällt.

30. Gerät nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, die Unterklassen durch Unterscheidung von Clusters interessierender Teilchen von anderen Clusters oder von Hintergrund-Teilchen zu identifizieren, wobei die die Struktur der Teilchen darstellenden Daten zur Festlegung der Grenzen zwischen Clusters zugrundegelegt werden.

31. Gerät nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mittel zum Unterscheiden von Clusters durch Auswerten eines Histogramms für die Daten-Darstellung enthalten ist, wobei die Daten in dem Histogramm in neuer Form kartographisch dargestellt werden, die durch große

3131969

Zahlen der Frequenz-Achse derselben gekennzeichnet sind, wobei die verbleibenden Punkte der umgebenden Fläche mit kleinen Werten für Frequenz-Zählungen zugeordnet werden.

32. Gerät nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Histogramm derart zur Identifizierung eines interessierenden Clusters als Antwort auf das Anlegen eines Frequenz-Schwellenwertes an die Histogramm-Daten befähigt ist, daß alle gezählten Frequenz-Werte (Frequenz-Counts), die größer als der Schwellenwert sind, in das Cluster kartographisch aufgenommen werden, und sämtliche anderen Frequenz-Counts in den Hintergrund-Bereich kartographisch aufgenommen werden.

33. Gerät nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen dazu befähigt ist, die Unterklassen durch überprüfung eines für sämtliche Paare von Punkten in sämtlichen Unterklassen definierten Ähnlichkeits-Maßes zu identifizieren.

34. Gerät nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das Ähnlichkeits-Maß der euklidische Abstand zwischen sämtlichen Paaren von Punkten ist.

35. Gerät nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung zum Erfassen den Abstand zwischen sämtlichen Paaren von Daten-Punkten berechnet und die berechneten Werte in aufsteigender Ordnung sortiert, um die nächsten Nachbarn sämtlicher Punkte zu bestimmen, wobei unbekannte Teilchen derjenigen Unterklasse zugeordnet werden, in der die Mehrheit benachbarter Punkte vorkommt.

36. Gerät nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß eine Schwellenwert-Anzahl von Punkten tiberschritten werden muß, bevor die unbekannten Teilchen einer Unterklasse zugeordnet werden, und anderfalls die Teilchen als Hintergrund-Teilchen klassifiziert werden.

37. Gerät zum Nachweis und zur Klassifizierung von Teilchen in einer Probe mit

einem Meßgebiet zum Messen kennzeichnender Merkmale der Teilchen,

einer Strömungseinrichtung zum im wesentlichen vereinzelten Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums durch das Meßgebiet hindurch,

einer Meßeinrichtung zum Erfassen von mit den kennzeichnenden Merkmalen in Verbindung stehenden Daten für jedes strömende Teilchen, wenn dieses durch das Meßgebiet hindurchtritt,

einer Einrichtung zum Aufstellen einer Mehrzahl von Unterklassen von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen gemäß eines von solchen Unterklassen von Teilchen erfaßten Daten-Musters und

einer Einrichtung, die aufgrund der Erkennung der von den Teilchen der Probe erfaßten Daten-Mustern eine Entscheidung darüber trifft, daß Probe-Teilchen aus einer unbekannten Klasse zu den aufgestellten Unterklassen gehören.

38. Verfahren zum Nachweis interessierender biologischer Teilchen in einer Probe unbekannter biologischer Teilchen durch

im wesentlichen vereinzeltes Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums,

- Erzeugen eines auf die Teilchen in dem Strom gerichteten Strahls einfallenden Lichts,

Erfassen lichtbezogener Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt,

Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen auf der Grundlage der von einer solchen Klasse erfaßten Licht-Daten sowie Speichern solcher lichtbezogener Daten,

- Vergleichen solcher gespeicherter Daten mit Licht-Daten, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen und

Feststellen aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Erfassens das Erfassen einer Mehrzahl verschiedener Lichtsignale umfaßt.

40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Erfassens das gleichzeitige Erfassen von Streulicht- und Fluoreszenz-Signalen umfaßt.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Erfassens das Erfassen von in wenigstens zwei verschiedenenen Richtungen gestreutem Licht und das Erfassen der von den Teilchen bei wenigstens zwei verschiedenen Wellenlängen emittierten Fluoreszenz umfaßt.

42. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Vergleichens das Unterteilen des Raumes

zur Messung der Licht-Daten in einen Bereich umfaßt, der die Datenpunkte von Probe-Teilchen enthält, die zu der aufgestellten Klasse gehören.

43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Unterteilens weiterhin die Transformation der Daten des Meßraums enthält, um die die Elemente der genannten Klasse repräsentierenden Datenpunkte als Cluster zu sammeln.

44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Transformation die die Daten des Musters des Meßraums betreffenden Vektoren gemäß der nachstehenden Beziehung in einen neuen Raum transformiert

x¹ = Wx ,
in der

χ der ursprüngliche Vektor des Meßraums ist,
x¹ der transformierte Vektor ist und

W die aus variablen gewichteten Koeffizienten w. . bestehende Transformationsmatrix ist.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Transformation den Intraset-Abstand zwischen den Datenpunkten der aufgestellten Klasse minimiert.

46. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Unterteilens das Extrahieren von Merkmalen aus den gespeicherten Daten zur Unterscheidung von die unbekannten Teilchen betreffenden Daten umfaßt.

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Extrahierens das Extrahieren einer Mehrzahl von Merkmalen aus den gespeicherten Daten umfaßt, wobei jedes Merkmal eine Linearkombination sämtlicher gespeicherter Original-Meßdaten ist.

48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Extrahierens das Extrahieren unkorrelierter Merkmale aus den gespeicherten Daten umfaßt, wenn die Messungen der Merkmale in Wirklichkeit korreliert sind, wodurch die mathematische Form der Funktion, die die Korrelation zwischen den Merkmalen mißt, eine Kovarianzmatrix ist.

49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Extrahierens die Transformation der gespeicherten Daten des ursprünglichen Meßraums in einen anderen Darstellungsraum und die Bestimmung des Unterraums für die Klasse, der im wesentlichen die in dem ursprünglichen Meßraum verfügbaren Daten konserviert, aufgrund der folgenden mathematischen Beziehung umfaßt:

C¹ = WCW^T ,

in der

C¹ die transformierte Kovarianzmatrix ist,
C die ursprüngliche Kovarianzmatrix ist,
W die aus variablen gewichteten Koeffizienten w. . bestehende Transformationsmatrix ist und

-T -

W die transponierte Form der Transformationsmatrix W

ist.

50. Verfahren zum Nachweis von Teilchen in einer Probe durch

- im wesentlichen vereinzeltes Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums durch ein Meßgebiet hindurch,

Erfassen von mit den kennzeichnenden Merkmalen in Verbindung stehenden Daten für jedes strömende Teilchen, wenn dieses durch das Meßgebiet hindurchtritt,

- Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen gemäß eines von einer solchen Klasse von Teilchen erfaßten Daten-Musters und

Bestimmung aufgrund der Erkennung des von den Teilchen der Probe erfaßten Daten-Musters, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

51. Verfahren zum Nachweis von Teilchen in einer Probe durch

- Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen entsprechend einem aus einer solchen Klasse bekannter Teilchen erfaßten Muster von Daten und

Bestimmen aufgrund der Erkennung des Musters mittels von den Probe-Teilchen erfaßter Daten, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören.

52. Verfahren zum Nachweis und zur Klassifizierung interessierender biologischer Teilchen in einer Probe unbekannter biologischer Teilchen durch

im wesentlichen vereinzeltes Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums,
Erzeugen eines auf die Teilchen in dem Strom gerichteten Strahls einfallenden Lichts,

"™ J. / ■·

Erfassen lichtbezogener Daten in Verbindung mit jedem strömenden Teilchen, wenn dieses durch den Lichtstrahl hindurchtritt,

Aufstellen einer Klasse von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen auf der Grundlage der von einer solchen Klasse erfaßten Licht-Daten sowie Speichern solcher lichtbezogener Daten,

Einteilen der.Klasse in eine Mehrzahl von Unterklassen derselben, wobei die lichtbezogenen Daten jeder Unterklasse getrennt gespeichert werden, - Vergleichen solcher gespeicherter Daten mit Licht-Daten, die von einer Probe von Teilchen einer unbekannten Klasse stammen und

Bestimmen aufgrund des Vergleichs der betreffenden lichtbezogenen Daten, daß Teilchen aus der unbekannten Klasse zu der aufgestellten Klasse gehören, und Identifizieren der Unterklassen, zu denen die unbekannten Teilchen gehören.

53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens die numerische Kennzeichnung der Unterklassen durch vektorielle Darstellung in einem Raum umfaßt.

54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens die kartographische Darstellung der Teilchen als Punkte und der Teilchen-Unterklassen als Punktscharen in einem Raum begrenzter Dimensionalität umfaßt.

55. Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß die kartographische Darstellung in der Weise erfolgt, daß eine zweidimensionale Darstellung vierdimensionaler Daten erzeugt wird.

56. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens das Extrahieren derjenigen Merkmale aus den gespeicherten vierdimensionalen Daten, die für die Zwecke der Klassifizierung am meisten signifikant sind, und die Transformation der Darstellungsvektoren der ursprünglichen Clusters in ein neues Koordinatensystem, in dem die Koordinaten-Variablen nicht miteinander korreliert sind und die Daten aus den ursprünglichen Clusters in den ersten wenigen Achsen des neuen Koordinatensystems konzentriert sind, umfaßt.

57. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens die Unterklassen aufgrund eines Schritts einer statistischen Entscheidung identifiziert, der die Unterteilung des Bereichs des ursprünglichen Datenspeichers in eine Mehrzahl ausschließlicher und erschöpfender, der Zahl der Unterklassen entsprechender Unterbereiche und die Zuordnung eines Teilchens zu einer der Unterklassen umfaßt, wenn dessen lichtbezogene Daten in dem entsprechenden Unterbereich die größte Wahrscheinlichkeit liefern.

58. Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Unterteilens das Sammeln (als Cluster) von die Unterklassen darstellenden Daten durch Kodieren eines durch zwei mathematische Transformationen erzeugten Satzes von Zahlen für jede Teilchen-Unterklasse umfaßt, wobei diese Sätze jeweils weiterhin durch einen Mittelpunkt und einen Radius in dem transformierten Raum funktionell dargestellt werden, worin ein unbekanntes Teilchen als zu einer Unterklasse gehörig identifiziert wird, wenn sein Datenvektor in den spezifisch kodierten Satz von Zahlen fällt.

59. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens zur Identifizierung der Unterklassen die Unterscheidung von Clusters interessierender Teilchen von anderen Clusters oder von Hintergrund-Teilchen umfaßt, wobei die Struktur der Teilchen darstellende Daten zur Festlegung der Grenzen zwischen Clusters zugrundegelegt werden.

60. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Bestimmens zur Identifizierung der Unterklassen die Überprüfung eines für sämtliche Paare von Punkten in sämtlichen Unterklassen definierten Stmlichkeits—Maßes umfaßt..

61. Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Uberprüfens die Berechnung des Abstands zwischen sämtlichen Paaren von Daten-Punkten und das Sortieren der berechneten Werte in aufsteigender Ordnung umfaßt, um die nächsten Nachbarn sämtlicher Punkte zu bestimmen, wobei unbekannte Teilchen derjenigen Unterklasse zugeordnet werden, in der die Mehrheit benachbarter Punkte vorkommt.

62. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die zu erfassenden und zu klassifizierenden Teilchen Zellen sind.

63. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die zu erfassenden und zu klassifizierenden Teilchen eine Mehrzahl von Unterklassen (Subklassen) von Bakterien sind.

64. Verfahren nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß die zu erfassenden und zu klassifizierenden Bakterien einer Probe einer biologischen Flüssigkeit entstammen.

65. Verfahren nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit Urin ist.

66. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die zu erfassenden und zu klassifizierenden Teilchen unterschiedliche Subklassen von Leukocyten sind.

67. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Aufsteilens die Herstellung einer flüssigen Probe mit einer hohen Konzentration eines bekannten Teilchen-Typs mit gemeinsamen Kennzeichen und das Erfassen der Lichtdaten aus einer solchen bekannten Klasse von Teilchen umfaßt, um einen Bereich mit einem erkennbaren Muster von Daten-Punkten festzulegen.

68. Verfahren zum Nachweis und zur Klassifizierung von Teilchen in einer Probe durch

im wesentlichen vereinzeltes Befördern der Teilchen in einem Strom eines fließfähigen Mediums durch ein Meßgebiet hindurch,

Erfassen von mit den kennzeichnenden Merkmalen in Verbindung stehenden Daten für jedes strömende Teilchen, wenn dieses durch das Meßgebiet hindurchtritt, - Aufstellen einer Mehrzahl von Unterklassen von Teilchen mit gemeinsamen Kennzeichen gemäß eines von solchen Unterklassen von Teilchen erfaßten Daten-Musters und

Bestimmen aufgrund der Erkennung der von den Teilchen der Probe erfaßten Daten-Muster, daß Probe-Teilchen aus einer unbekannten Klasse zu den aufgestellten Unterklassen gehören.

_₂₁_ 3831863

69. Verfahren zum Nachweis und zur Klassifizierung von Teilchen in einer Probe durch

- Aufstellen einer Mehrzahl von Unterklassen von Teilchen mit jeweils bekannten gemeinsamen Kennzeichen, die mit solchen Unterklassen von Teilchen zusammenhängendenden Daten-Mustern entsprechen, und
Bestimmen aufgrund der Erkennung der mit den Teilchen der Probe zusammenhängenden Daten-Muster, daß Probe-Teilchen aus einer unbekannten Klasse zu den aufgestellten Unterklassen gehören.