CN105051521B - 用于设计流式细胞术中的面板的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的实施例涵盖确定用于流式细胞术的各种抗体‑染料缀合物的检出限的系统和方法。示例性的技术涉及对溢出引起的正态分布测量误差扩大运用线性叠加方法。
Description
相关申请的交叉引用
本发明要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/791,492的优先权，该专利申请在此以引用方式并入。
背景技术
本发明的实施例整体涉及用于评估生物样品的细胞的系统和方法，具体地讲，涉及用于选择抗体-染料缀合物的组合供流式细胞术使用的技术。另外的实施例整体涉及用于分析多色流式细胞术中的阳性率的自动化系统和方法。
使用荧光流式细胞术执行细胞表面免疫分型已成为用于将含有多种不同类型细胞的细胞样品中的所关注细胞区分出来并对其进行计数的较为常规的工艺。通常情况下，使用所关注细胞外表面上抗原的特异性细胞表面探针(例如荧光素标记的单克隆抗体(MAB)或其他适当标记的配体)来有选择地标记此类细胞或有选择地将此类细胞“染色”，供后续检测分析。流式细胞仪用专门适用于激发荧光素标签的辐射通过逐一照射样品中的各个细胞来检测染色细胞。荧光素标签在被照射时发出荧光，而与这些标签相关的细胞将入射辐射以由被照射细胞的物理和光学特性决定的图案散射。流式细胞仪中的适当光检测器检测这些荧光和散射的辐射，且其相应的输出信号被用来基于它们的相应光散射和荧光标记区分不同细胞类型。
用流式细胞术执行免疫分型通常涉及选择一套在生理上适用于预想的评估或监测程序的探针或试剂。与此相关地，由于某些疾病病症可由患者细胞的表面上或细胞内部的各种抗原的表达来表征，故可以选择与这些抗原情形对应的抗体探针试剂面板。例如，SolastraTM五色试剂面板(SolastraTM5-Color Reagent Panel)是流式细胞术中使用的表征血淋巴肿瘤的标记抗体混合物的面板。该面板可用于识别相关的白细胞表面分子并对其进行计数，还可用于帮助对某些血液学检测结果异常和/或者血液、骨髓和/或淋巴组织中存在芽细胞的患者进行鉴别诊断。SolastraTM五色试剂(SolastraTM 5-Color Reagents)由针对B细胞系抗原、T细胞系抗原和髓单核细胞系抗原的多种抗体构成。此类面板可用于血液病理学应用的流式细胞分析。
用流式细胞术装置测量从中流过的样品会产生散射光、荧光或这两种光的组合的特征性光子标记。分析这种标记，就可能推断颗粒的物理化学特性。通常需检测蛋白质表达情况(示例性颗粒的一种生物学特征)。来自血样的颗粒标记能够以点图的形式呈现，且可运用设门技术来说明这些标记分别是什么标记。一般来讲，运用设门技术将标记分为两类，要么是阳性，要么是阴性。举例来说，可运用设门技术确定某个颗粒是血细胞、还是一片碎屑，或确定该血细胞是否含有疾病标志物。因此，设门技术在诊断应用和临床血液学应用中是重要的。然而，例如，倘若阳性标记和阴性标记的外观相似，则可能难以确定该颗粒应归属于阳性群体还是阴性群体。现已提出多种设门技术或特异性对照技术来帮助确定某颗粒应归类为阳性还是阴性，诸如同种型对照技术、运用聚类分析算法(如主成分分析)的模型，以及荧光扣除对照(FMO)。
虽然目前已知的抗体面板选择技术为执行细胞评估和监测程序的操作员提供了许多益处，但仍需进一步改善该项技术。此外，可改进用于评估样品的设门对照技术。本发明的实施例提供的解决方案能够满足至少一些上述需求。
发明内容
本发明的实施例涵盖用于选择和模拟供流式细胞术使用的抗体-染料缀合物面板的系统和方法，和其他相关的细胞评估和监测技术。通常，可使用或设计此类面板来评估生物样品的细胞。这些细胞可从个人、细胞培养物、人类或非人类供体库等获得。根据一些实施例，本文公开的技术可用于评估包含颗粒(例如生物细胞)的任何材料。这些颗粒存在于悬浮液中，在其表面上或内部具有在被特异性生物荧光素标记的探针非共价地结合后，可由这些探针识别的结构，这些探针例如抗体、毒素、受体配体、这些物质的衍生物或类似化合物。如在本文别处所论述，可包含荧光素标记的单克隆抗体(MAB)或其他适当标记的配体的示例性探针可以是所关注细胞的外表面抗原或内部抗原的特异性探针。尽管可取决于分析的是外部抗原还是内部抗原可能使用不同的样品制备程序，但本文讨论的数据采集技术同样适用于分析任一类抗原。流式细胞仪中的适当光检测器检测荧光和散射的辐射，且它们的相应输出信号被用来基于不同类型细胞的相应光散射标记和荧光标记区分不同细胞类型(或某细胞类型的亚型，或某类细胞的不同功能状态)。这些荧光标记可用一种称为荧光补偿的程序以计算方式解析，在被解析后，能够传送与细胞/颗粒的表面或内部存在每种被检测的单抗原有关的定量信息。
使用流式细胞术执行多色免疫表型分析通常涉及使用抗体-染料缀合物的面板或混合物。这些面板可配置为使得具有相应染料的各个探针与流式细胞术装置的各个颜色检测通道对应。如本文所论述，可以自动化选择探针面板，从而使多色流式细胞术分析过程简化。在流式细胞术中使用此类探针面板可利用多个检测通道高效采集品质优良的数据。因此，可缩短停机时间并可最大化实验室生产率。相关地，本发明的实施例提供了优先抗原检测灵敏度的改善和数据分析过程的进一步简化。
示例性流式细胞术装置可包括各种激光器配置(例如，多个固态激光器)，用于产生与红色、蓝色、紫色、黄色等对应的激发光谱。可使用可互换滤光器来方便检测各种染料和波长。示例性系统可用于同时分析多种荧光标记物。例如，配有六台荧光检测器的系统可同时采集最多六个荧光信号。可向系统追加荧光检测器和/或激光器，让其能够同时读取多达十种或更多种颜色。本发明的实施例提供的图形显示技术能够向用户呈现曲线图、图表和其他视觉特征，这些视觉特征能够方便用户分析复杂的流式细胞术数据。
在一个方面，本发明的实施例涵盖确定在流式细胞术程序中用于分析生物样品的探针面板的系统和方法。示例性方法包括：输入流式细胞仪硬件配置；输入包含多个探针的名单，其中各个探针与相应的通道特异性检出限相关联；输入抗原共表达模式；以及基于流式细胞仪硬件配置、各个通道特异性检出限和抗原共表达模式确定探针面板。探针面板可包括探针名单中的一部分探针。
本发明的另外的实施例涵盖用于在多色流式细胞术中评价的阳性的系统和方法。示例性的特异性技术或设门对照技术可用于评估个别颗粒标记，例如用于确定血细胞对于某种蛋白质表达(如疾病标志物)是阳性还是阴性。在一些情况下，可使用这些对照技术，针对采集的数据在合适的位置设门或设置图形区域，以便将这些数据的来源细胞分类。可在多色程序中，于补偿后使用示例性对照技术。在一些情况下，本文所公开方法具备的标准化水平是当前所用技术没有的。此外，本文公开的对照技术时间效率高、经济合算、对异源表达模式有效，还能量化阳性信号表达。
在结合附图阅读以下具体实施方式后，本发明实施例的上述特征和多种其他特征以及伴随的优点将变得显而易见并得到更充分理解。
附图说明
用下文给出的举例说明和附图描述根据本发明多个实施例的系统和方法的某些方面。
图1描绘了根据一些实施例的流式细胞术系统和方法的某些方面。
图1A描绘了根据一些实施例的流式细胞术装置的示例性硬件图解，这些硬件包括三台激光器和十色滤光块配置。
图1B描绘了根据一些实施例的探针面板选择技术的某些方面。
图1C描绘了根据一些实施例的抗体-染料缀合物的表达的某些方面，该抗体-染料缀合物可以指包含与流式细胞术探针有关的信息的数据库中的一组抗体-染料缀合物。
图1D描绘了根据一些实施例的针对由用户选择的抗原特异性抗体执行数据库查询以便返回与对应探针相关的信息的某些方面。
图1E至图1M描绘了根据本发明的一些实施例的面板评估技术的某些方面。
图1N至图1O描绘了根据一些实施例的针对三种缀合物的关联和计算过程的实例，用于将给定的CD与给定的染料关联起来。
图1P至图1U描绘了根据本发明的一些实施例的面板评估技术的另外的方面。
图1V至图1W描绘了根据一些实施例的示例性十色探针面板的结果显示的某些方面。
图2描绘了根据一些实施例的操作者选择程序的某些方面。
图2A至图2C描绘了根据一些实施例的分别关于目标表型、表型排除与亲本/后代方案的操作选择特征。
图2D描绘了根据一些实施例的关于抗原密度参数的操作选择特征。
图3描绘了根据一些实施例的探针面板选择技术的某些方面。
图4描绘了根据一些实施例的同种型信号转导和分辨灵敏度的某些方面。
图5描绘了根据一些实施例的将表达事件的变异系数与标准偏差进行比较的操作。
图6A至图6B描绘了根据一些实施例的用于确定阴性信号事件的双峰分布的某些方面。
图7描绘了根据一些实施例的信号事件分布扩大的某些方面。
图8描绘了根据一些实施例的由使用单种抗体-染料缀合物的染色方案获得的实际数据结果的某些方面。
图9描绘了根据一些实施例的检出限的某些方面，这些检出限可能与补偿因数无关，或者可针对补偿因数调整。
图10描绘了根据一些实施例的与某些染料有关的示例性溢出模式失真矩阵的某些方面。
图11描绘了根据一些实施例的共表达矩阵的某些方面。
图12A至图12I描绘了根据一些实施例的预估染色模式的示意图。
图13描绘了根据一些实施例的探针面板评估过程的某些方面，包括对表达模式进行分类。
图14描绘了根据一些实施例的探针面板评估过程的某些方面，包括荧光团的相对贡献。
图15描绘了根据一些实施例的探针面板评估过程的某些方面，包括染料的相对表达亮度。
图16A描绘了根据一些实施例的探针面板系统的示例性方案。
图16B至图16C描绘了根据一些实施例的探针面板用户输入模块的某些方面。
图16D至图16E描绘了根据一些实施例的以表格形式呈现表达关系的模拟器图形模块的某些方面。
图16F至图16G描绘了根据一些实施例的具有预测结果廓线的模拟器图形模块的某些方面。
图16H至图16J描绘了根据一些实施例的用于计算失真的模拟器数值模块的某些方面。
图16K至图16L描绘了根据一些实施例的溢出模式模块的某些方面。
图16M至图16O描绘了根据一些实施例的抗体数据库模块的某些方面。
图17描绘了根据一些实施例的用于对溢出模式进行建模的数值方法的某些方面，包括检测用于多变量分析的雷达图像。
图18A至图18B描绘了根据一些实施例的用于对溢出模式进行建模的数值方法的另一些方面，包括检测用于多变量分析的雷达图像。
图19A至图19B描绘了根据一些实施例的用于对溢出模式进行建模的数值方法的另一些方面，包括检测用于多变量分析的雷达图像。
图20A至图20G描绘了根据一些实施例的用于设计和模拟探针面板的计算机化界面的某些方面。
图21A至图21B描绘了根据一些实施例的用于设计和模拟探针面板的计算机化界面的另一些方面。
图22A至图22B描绘了根据一些实施例的某些方面。
图23至图26描绘了根据一些实施例的用于设计和模拟探针面板的计算机化界面的某些方面。
图27描绘了根据一些实施例的用于对PMT通道内的失真进行建模的三维图形，这种失真是PMT不能检测的两种染料的信号强度造成的。
图28描绘了根据一些实施例的示例性失真表格。
图29至图29E描绘了根据一些实施例的在适用设门的情况下，流式细胞术仪器对实际数据运用设门后，绘出事件数据的某些方面。
图30至图30A描绘了根据一些实施例的在未对实际数据运用设门的情况下，流式细胞术仪器绘出事件数据的某些方面。
具体实施方式
流式细胞术往往涉及以下步骤：用荧光素标记颗粒样品，随后使用多个荧光检测器(每个检测器只允许检测指定波长)评估样品中各个颗粒的特性。用这种方法，可能获得与颗粒样品有关的定量和定性数据。举例来说，可用不同的荧光素标记血细胞上的不同细胞表面受体，另外，流式细胞仪可使用分开的荧光通道来检测获得的发射光。在示例性实施例中，多种激发光波长可结合使用多种荧光素和多个荧光检测器，以便同时获得样品的若干参数。在特定实施例中，可量化因联用多种荧光素和多个荧光检测器导致的失真度。
在此所用的术语“事件”可以指穿过光束时的颗粒，或代表该颗粒的数据或标记。可使用多个检测器评估事件。每个检测器可各自提供强度或信号参数。相关地，每个检测器可与流式细胞仪中的相应通道关联。例如，单个检测器给出的测量值可称为参数(如测得的前向散射、侧向散射或荧光)，而针对颗粒采集的每种参数的数据可称为事件。
在一些情况下，测得的参数可能达不到检测器通道的特定阈值，因此可能不被记录为事件。从这个意义上讲，光束和流经流式细胞仪的颗粒间的相互作用可能产生颗粒事件，也可能不产生颗粒事件。任选地，可使用这种阈值来减少或消除由噪声、碎片等产生的信号。
本发明实施例涵盖的系统和方法涉及确定流式细胞仪应用中采用的光电倍增管内的荧光信号检出限。在一些情况下，确定检出限可能以下述参数为基础：目标细胞的预期表达模式(该目标细胞可用抗体-荧光素缀合物标记)；用荧光标记抗原后，由表达模式决定的从各荧光标签发出的荧光信号的预期信号强度；不同光电倍增管内的荧光素的预期溢出矩阵。
根据一些实施例，可能存在包括数据扩散的额外输入。不同给定波长检测范围(由光电倍增管前方的带通滤光片决定)的这种数据扩散各异，原因是给定波长检测范围可以决定相应光电倍增管的灵敏度，因而可以决定测量误差(数据扩散)。可做实验评估溢出和最终的数据扩散之间的关系。
示例性实施例允许流式细胞术装置的用户选择需要的荧光素-抗体组合(如探针面板)，可使用该组合设计流式细胞仪实验，包括预测荧光素缀合物的检出限。该操作也可称作面板模拟。此外，流式细胞术装置用户可选择多种抗体的组合，无需将荧光标签相应分配给这些抗体中的每一种，从而获得设计探针面板的提议，包括预期在该探针面板内使用的每根探针的最低检出限。在某些情况下，面板评估或设计技术可能涉及向因数据溢出而扩大的正态分布测量误差运用线性叠加模型。
本文所公开的探针面板评估和设计技术可以使用单种染料给出的参考荧光素测量值的数据来计算溢出(溢出也可称作上溢/溢落、溢漏，或串扰)。在一些情况下，失真度可由下式表征：
换句话讲，确定了失真度，就可量化第一标签(其为探针-标签缀合物的一部分)至少进入到第二通道内的溢出效应，第一标签是被设计或构造为在第一通道(如PMT检测器)内接受测量的，而第二通道(或其他额外的通道)是被设计或配置为测量不同标签的。在一些方面，失真度可以是作为第一探针-标签组合发光强度的函数的第二通道检出限增量预估值。在其他方面，失真度可以是第一探针-标签组合的发光强度的线性函数。在另外的方面，可使用串扰指标来计算失真度。在一些方面，使用代表对应于第一探针-标签组合的抗原与对应于第二探针-标签组合的抗原的共表达模式的系数，以数学方式修改失真度，该第二探针-标签组合是被设计或配置为在第二通道内接受测量。在另外的方面，可确定第一种可行探针面板中的每个标签的失真度，由此计算第二通道检出限的总增量。
在一些情况下，探针面板评估或设计技术可能涉及使用抗原在不同目标细胞上的预期表达模式，诸如排他性共表达、亚群(例如图1D绘出的亲本-后代)共表达、非排他性共表达或预期的抗原表达特性(如离散的或调变的表达特性)。在一些情况下，探针面板评估或设计技术可能涉及任选地针对多种不同的细胞类型或抗原表达模式，预测、估计或以其他方式确定各检测通道的检出限。
如本文所用，在描述抗原时，使用亲缘系统术语“亲本”、“子代”、“姊妹”、“姑母”和“表亲”来确定和描述特定抗原的分化簇(“CD”)之间或相应抗体之间的关系。然而应当注意，在本发明的情形下，这些术语并非是指细胞发生繁殖的代，而是指当给定细胞表面上的抗原由于分化或特化而改变时，给定细胞的发育步骤。例如，如CD45的抗原可存在于某个天然T细胞上；倘若该天然T细胞特化成杀伤性T细胞，那么，其上的CD45抗原便可充当CD2(子代)抗原的前体并可变成CD2(子代)抗原，而假使该天然T细胞特化成辅助型T细胞，那么，其上的CD45抗原便可充当CD4(子代)抗原的前体并可变成CD4(子代)抗原。在这种情况下，该CD45抗原便可称为互为姊妹的CD2抗原和CD4抗原的亲本抗原。
抗原间可能有的发育关系一般叙述如下。在一些细胞中，两种不同的抗原可能存在于同一细胞表面上，每种抗原特有一种平均密度和表达范围，从而产生称为“共表达”的情形。一种抗原存在于细胞表面上后，可能会排斥另一种特异性抗原存在于同一细胞表面上，从而产生称为“排除”的情形。具有相同“亲本”的抗原称为“姊妹”。在一些细胞上，第一抗原可存在于也表达了第二抗原的细胞表面上，然而，该第二抗原也可存在于没有第一抗原的细胞表面上。遇到此类情况，将第二抗原称为“亲本”抗原，而将第一抗原称为“后代”或“子代”抗原，从而产生了称作“亲本—后代”或“亲本—子代”的情形。给定抗原的“亲本”的“姊妹”称为该抗原的“姑母”。在考虑特异性抗原时，该特异性抗原的非排他性“姊妹”、子代、子代的后代(或“孙代”)、继续向下传代的抗原、“亲本”、亲本的“父代”(或“祖代”)、所有继续向上追溯的抗原及其非排他性“姑母”，都可称作该特异性抗原的发育谱系(或发育树)。可能出现单种蛋白在属于不同发育谱系的不同类型细胞上表达的情况，该抗原在这些不同类型细胞上的平均密度、表达范围和分布特征也可能不同。该抗原表达增多的多个细胞实体可称作“复合抗原”。此外，两个共表达抗原的表达密度可能负相关，产生称作“负相关”的情形。
为任意给定抗原设计发育谱系的一套准则可包括以下数条规则：(1)必须给每种抗原指派至少一个“亲本”，假如不清楚哪些抗原是其“亲本”，则将“未知”指派为“亲本”；(2)如果存在“姊妹”，那么必须确定每种抗原与“姊妹”的关系是“排他”、“相关”还是“负相关”，在某些方面，可能按字母顺序排列姊妹抗原的名称，优先考虑排位靠前的姊妹抗原；(3)如果存在“姑母”，那么必须确定每种抗原与“姑母”的关系是“排他”、“相关”还是“负相关”，除非“姑母”受相应抗原的亲本排斥；(4)必须将“复合抗原”处理为看起来像是多个不同的抗原，以便维持各抗原谱系的一致性，该处理过程通过指派不同的“亲本”、排他或负相关的“姊妹”和“姑母”来完成；(5)相关联的抗原共有相同的排他性和负相关性，但未必有相同的复合抗原。遵循这套规则可为某些物种和身体区室设计一整套抗原发育谱系，由此建立所有抗原间的一切可能关系。
根据一些实施例，可使用检出限基于抗原表达模式(这些抗原表达模式可能涉及抗原表达密度和荧光素亮度)，任选地结合实验数据，对多种荧光素-抗体面板进行排序、比较，或以其他方式评估这些荧光素-抗体面板。在一些方面，与确定检出限相关的计算可包括输入或接收与第一探针-标签组合的最大预期信号有关的信息，该最大预期信号以第一探针和第一标签的特性为基础。在来自第一探针-标签组合的信号可能产生至少进入到第二检测通道(即，不是被配置为特异地检测第一探针-标签缀合物的通道)内的溢出的仪器或系统中，计算第二通道检出限的增量可建立在失真事实和第一探针-标签组合的最大预期信号的基础上。因此，可基于计算得到的检出限增量将探针-标签组合选择为包括探针面板。在另外的方面，至少第二通道的检出限增大可能是测量误差增大造成的，测量误差是第一探针-标签组合的发光强度的函数。
本文所公开的示例性探针面板系统和方法非常适合用于评估溢出模式极为复杂的各种缀合物组合(如荧光素标记的抗体，面板-标签组合等)。此类系统和方法可能涉及使用检测通道和表达模式特异性地确定典型信号强度，和与典型信号强度有关的检出限增量。所以，此类系统和方法可按照具体参数操作，这些参数(例如)为表达密度、荧光素强度、共表达模式和失真度。在某些情况下，评估探针面板可包括确定典型信号强度和检出限增量的最大差值。在一些情况下，评估探针面板可涉及确定一种或多种特定抗体-染料缀合物的典型信号强度与检出限的比率。示例性探针面板评估系统和方法可建立在考虑共表达模式以及模拟实验结果的基础上。选择探针-标签组合还可建立在将计算得到的检出限总增量与至少第二通道中的预期最小检出限增量进行比较的基础上。此外，可针对一种或多种可行探针面板中的每根探针计算全部通道的检出限总增量。在一些方面，用于评估各种缀合物组合的系统和方法还可包括：针对第二种可行探针面板中的每根探针计算检出限总增量，以及将针对第一种可行探针面板中的每根探针计算得到的检出限总增量与针对第二种可行探针面板中的每根探针计算得到的检出限总增量进行比较，在此基础上选择探针面板。在其他方面，此类方法或系统可包括：针对第二种可行探针面板中的每根探针计算检出限总增量，以及基于针对第一种可行探针面板和第二种可行探针面板中的优先探针计算得到的检出限总增量选择探针面板。在其他方面，第一通道和第二通道可以是相邻的通道。
此外，在一些实施例中，设计用于流式细胞仪的探针面板的方法可包括：确定第一探针和第二探针；确定第一探针的预期最小信号；基于与第二探针相关联的可行标签确定第一探针的第一检出限；基于与第二探针相关联的不同可行标签确定第一探针的第二检出限；以及基于第一探针的第一检出限、第二检出限和预期最小信号，选择与用于探针面板的第二探针相关联的标签。在某些方面，确定第一检出限可包括将失真度乘以被设计为测量与第二探针相关联的可行标签的检测通道中的最大预期信号。在其他方面，确定第一检出限可包括将失真度乘以代表抗原共表达模式的系数，其中在一些情况下，该系数是1或0。在另外的方面，最大预期信号可部分地基于下述参数中的任一种或全部：目标细胞上的预期抗原密度、与第二探针相关联的可行标签，以及抗原共表达模式。此类方法或系统的一些实施例包括被设计为在第一通道内接受检测的第一探针，并且其中确定第一探针的第一检出限包括将失真度乘以流式细胞仪中除第一通道外的每个通道的最大预期信号。在这些方面，确定第一探针的第一检出限建立在CV扩大的线性叠加模型的基础上。在一些方面，失真度可以是颜色补偿引起的CV扩大的量度。
在一些实施例中，设计用于流式细胞仪的探针面板的方法可包括：确定第一探针、第二探针和第三探针；确定多种可行探针面板，每种可行探针面板包括第一探针、第二探针或第三探针的组合，每个探针具有与其相关联的可能标签；基于第二探针及其相关联可能标签的组合的光谱溢出效应确定第一探针的检出限，由此评估第一种可行探针面板；基于第三探针及其相关联可能标签的组合的光谱溢出效应确定第二探针的检出限，由此评估第二种可行探针面板；以及基于确定的检出限，从多种可行探针面板中选出所述探针面板。在这些方面，第一探针、第二探针和第三探针中的至少一个探针可特异地结合到抗原上。在类似的方面，第一探针、第二探针和第三探针中的至少一根探针可特异地结合到被分析物上。在另外的方面，评估第一种可行探针面板包括：部分地基于与第一探针和第二探针相关联的抗原的共表达模式来确定第一探针的检出限。在一些方面，抗原的共表达模式可包括特定细胞类型的抗原之间的共表达关系方面的信息。在某些方面，如果与第一探针和第二探针相关联的抗原的共表达模式指示这两种探针互相排除，那么可确定第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应为零。在另外的方面，如果与第二探针相关联的抗原是与第一探针相关联的抗原的后代，那么可确定第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应为零。在某些方面，可将第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应量化为失真度和抗原共表达模式的函数。与这些方面结合或作为另外一种选择，可将第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应量化为目标细胞上的预期抗原密度的函数。在一些方面，此类方法或系统可包括显示所选探针面板中的一对探针的预期信号群体分布的图形表示，其中显示信号群体分布的图形表示可包括显示第一探针和第二探针的确定检出限。
本文公开的探针面板技术非常适合与各种自动化装置一起使用，包括NaviosTM和GalliosTM流式细胞术系统(美国加利福尼亚州布瑞亚市贝克曼库尔特有限公司(BeckmanCoulter,Brea,California,USA))。在一些情况下，失真计算可以成套滤光片和/或光电探测器(例如PMT)的特定性质或性能特征为基础。此外，探针面板技术可以染料的光谱特性为基础，可视需要从染料或抗体-染料缀合物的特定文库或资源库中获得这些光谱特性。
在某些情况下，评估或模拟探针面板可以某些抗原表达图谱或表达模式为基础。此类表达图谱或表达模式可能与特定细胞类型相关联，也可能不与特定细胞类型相关联。在操作时，用户可根据特定表达模式(可以是在计划开展的实验中选择的目标表达模式)选择抗体-染料缀合物。在一些情况下，像流式细胞仪之类的仪器可被构造成接收多种颜色(如十种)，且用户可能只希望选择较少数目的探针。因此，用户可明确指定第一数量的探针，同时将第二数量的探针保留为哑变量，使探针数量总和等于流式细胞仪中颜色通道的数量。在一些情况下，可用同一通道检测不同的染料(如PC5和PC5.5)，因此，可能涉及不同时施用不同的染料。
如本文别处公开的那样，一旦用户选择或输入探针面板的某些参数，系统便可运转，从抗体数据库模块检索或上传物料编号或其他识别标记。举例来说，倘若特定文库中没有需要的缀合物(即探针)，那么，系统可指定物料编号(PN)为客户设计服务(CDS)探针。在一些情况下，此类系统和方法涉及基于相应的荧光素性质和信号强度(例如假定信号强度)(可基于目标抗原的表达密度来预估)来评估探针面板，并且可从抗体数据库模块检索或读取这些参数。在一些情况下，抗体数据库模块可包括与用于评估探针面板的各种参数(包括探针信号强度)有关的数据，其中探针信号强度可以与缀合荧光素结合的用于探针特异性的抗原密度为基础。缀合物强度数据可能是估计值，也可基于实验数据。举例来说，这种实验数据可从制造质量控制程序中获得。
本发明的另外的实施例涵盖用于评估多色流式细胞术中的阳性率的系统和方法。示例性的特异性技术或设门对照技术可用于评估个别颗粒标记，例如用于确定血细胞的某种蛋白质表达(如疾病标志物)是阳性还是阴性。在一些情况下，可使用这些对照技术，针对采集的数据在合适的位置设门或设置图形区域，以便将这些数据的来源细胞分类。可在多色程序中，可于补偿后使用示例性对照技术。在一些情况下，本文所公开方法具备的标准化水平是当前所用技术没有的。此外，本文公开的对照技术时间效率高、经济合算、对异源表达模式有效，还能量化阳性信号。
在一些情况下，从不同荧光素测得的发射光谱可能重叠，这种重叠可能有助于补偿检测器获取的信号。例如，可在数据分析期间运用荧光补偿技术，以便确定荧光素A对通道B(通道B被指派为特异性地测量荧光素B)造成干扰的大小。因此，可以获得通道B的荧光总测量值，随后减去荧光素A的贡献值，从而确定荧光素B在通道B中的荧光值。根据一些实施例，可以获得通道B的荧光总测量值，随后扣除荧光素A的贡献值，从而确定荧光素B在通道B中的荧光值，举例来说，该操作可使用涉及数字补偿且基于矩阵的补偿方法来完成。
事件数据可采用多种方式直观描绘。例如，可使用直方图显示数据，在水平(X)轴上显示单一测量参数(如荧光)，在垂直(Y)轴上显示事件数量(如细胞计数)。用这种方法，可以确定样品中具有某些特征的细胞的数量。例如，直方图左侧的矮峰可代表一小群发微弱荧光的细胞(属于阴性群体的事件)，而直方图右侧的高峰可代表一大群发明亮荧光的细胞(属于阳性群体的事件)。
本文使用的术语“门”可用作将阳性群体和阴性群体区分开的边界。门可类似地用作界定事件亚群的边界。可例如采用这样的方式设门，即，在数据图(如点阵图或直方图)上的事件子集周围勾画出边界。门可以是包容性的，用于选择落在边界之内的事件，也可以是排他性的，用于选择落在边界之外的事件。因此，阳性事件(边界特定侧的事件)的数量可以指显示出所关注的物理特征或标记物的细胞的数量。根据本发明的一些实施例，可采用设门来区分对应于荧光物质的信号和对应于非荧光物质的信号。根据一些实施例，光电倍增管(PMT)检测到的任何事件都可以发出荧光信号。因此，发出的荧光可能与特定标签相关联。
在血液学领域，针对诊断用途和临床用途有特定的设门规程。例如，可对流式细胞术数据设门，以便有选择地显现某些关注的细胞(如白血细胞)，同时消除来自不需要的颗粒(如死细胞和碎片)的结果。在某些情况下，可能很难确定将门设在何处才能有效地将事件归类为阳性或阴性。此时，操作者可选用适当的对照，帮助自己把阳性群体和阴性群体区分开。本发明的实施例能够与多色细胞计数技术(一般来讲，包括但不限于血液学领域)结合使用。在一些情况下，本发明的实施例可运用于荧光扣除对照(FMO)有用或必不可少的任何测量过程。
本发明的实施例提供了采用多色流式细胞术执行自动化阳性分析的系统和方法，该分析的特征在于溢出引起的测量误差扩大。本发明的实施例还涵盖基于荧光素溢出的线性叠加模型，根据每一个别事件的表达模式计算测量误差的技术；还将此技术运用于面板设计和模拟应用，具体操作是：将检测到的颗粒上的抗原共表达模式考虑在内，采用相同或类似的确定多色流式细胞术的预测限的技术，让操作者能够利用叠加计算确定荧光素进入其他所有检测通道的溢出比率。
与此相关地，本发明的实施例涵盖用于流式细胞术的采集后校正技术，采用该技术可将与采集的样品结果相关联的补偿误差最小化。举例来说，在多色通道实验中采用固定校正值的标准补偿方法往往不是对设门边界处的实验结果补偿过度，就是对其补偿不足。本发明的实施例涵盖使用正确补偿的数据，或避免这种补偿过度或补偿不足。
在一些情况下，本文公开的自动校正技术能够改善流式细胞术装置中的补偿结果，从而提高对采集数据后获得的特异性阳性结果的辨识。在一些实施例中，本文公开的系统和方法能够基于在其他所有通道中检测到的其他所有染料的溢出叠加模型，计算两个结果区间之间的经校正检出限或经校正边界，或每条荧光信号通道(如光电倍增管)的特异性阳性和特异性阴性之间的经校正检出限。可利用特异性阳性和特异性阴性之间的这种经校正检出限来对结果集自动设门，不再需要对结果集手动设门；另外，观察到两个结果区间的边界区域处的临界结果被明白无误地划分到了恰当的区间内。
概述
现在来看附图，图1描绘了根据一些实施例的流式细胞术系统和方法的某些方面。流式细胞术装置的配置100通常包括某些荧光信号检测器组件参数110，以及激光器激发波长参数120。
可采用多种激光器激发参数的任一种或任意组合配置流式细胞术装置。例如，激光器组件可配置成产生355nm(紫外光)、405nm(紫光)、488nm(蓝光)、532nm(绿光)、561nm(黄光)、633nm(红光)、638nm(红光)等处的激发光谱。相应地，激光器组件可包括任意数量的激光器激发设备。例如，双激光器组件可包括用于递送488nm处的激发能量的第一激光器和用于递送638nm处的能量的第二激光器。
如图1所示，激光器激发能量可冲击到抗体-染料缀合物探针的染料上。通常情况是特定染料在特征波长处受到激发，继而发出特征性荧光发射光谱。可能有一个或数个荧光发射最大值。发射光谱可能覆盖一定范围的波长。举例来说，异硫氰酸荧光素(FITC)是一种能被488nm光激发，并发出最大值在520nm附近的荧光的荧光素。举例来说，PC5和PC5.5会被两种激光波长488nm和638nm激发出至少一种波长，这让溢出模式变得更复杂。
信号检测器组件110可包括滤光片和检测器的各种组合。如此处示出，检测器组件可包括结合使用的525/40带通滤光片和光电倍增管设备PMT1，其中光电倍增管设备PMT1被指定为检测FITC染料发射。可将此类配置设计成提供特定荧光素的所需检测参数。如图所示的进一步的配置可包括：结合使用的575/30带通滤光片和光电倍增管设备PMT2，其中光电倍增管设备PMT2被指定为检测PE染料发射；结合使用的620/30带通滤光片和光电倍增管设备PMT3，其中光电倍增管设备PMT3被指定为检测ECD染料发射；结合使用的675/20带通滤光片和光电倍增管设备PMT4，其中光电倍增管设备PMT4被指定为检测PC5染料发射；结合使用的695/30带通滤光片和光电倍增管设备PMT5，其中光电倍增管设备PMT5被指定为检测PE-Cy7染料发射；以及结合使用的660/20带通滤光片和光电倍增管设备PMT6，其中光电倍增管设备PMT6被指定为检测APC染料发射。各个检测器(例如PMT1、PMT2、PMT4)可被指定为检测来自相应主要染料(例如FITC、PE、PC5)的光波长(如发射光谱图130所指示)。可使用带通滤光片允许一定量发射光从中穿过，然后射向光电倍增管(PMT)。安设有相关带通滤光片的特定光电倍增管可专用于检测缀合物被特定波长的光激发出的发射光。
流式细胞术装置的示例性硬件图解描绘于图1A中，这些硬件包括三台激光器和十色滤光块配置。如此处示出，流式细胞术装置可包括多个带通(BP)滤光片，以及二向色性(DC)短通(SP)滤光片和长通(LP)滤光片。
重新参看图1，可以看到示例性技术可能涉及正在执行某些操作的用户或操作者。例如，用户操作140可包括确定或选择流式细胞术装置的配置(如步骤142所指示)，以及确定或选择所关注的抗原表达模式(如步骤144所指示)。就选择装置配置的步骤来说，可使用下拉(数据库)按钮从多种预设硬件配置(例如图1A中表现的硬件配置)选取需要的配置，由此完成这种选择。
根据一些实施例，选择各种硬件配置和选择所关注的抗原表达模式可采用基于Web的版本实现。根据一些实施例，本文公开的系统和方法可能涉及数据库工具，此数据库工具可提供这样的指示，即探针面板在除用户指派给某一表达模式的抗原之外，是否可能包含更多的其他表达模式的抗原。如果是，系统便可能指示用户，有更多个包含这些探针的抗原对检出限有影响。
根据一些实施例，硬件配置可代表多种激光器组件、成套滤光片和检测通道组合中的任一种。举例来说，具体的硬件配置可包括在各种波长处发射的一台或多台激光器。在一些情况下，硬件配置可包括六个检测通道和两种激光颜色(例如488nm和638nm)。在一些情况下，硬件配置可包括八个检测通道和两种激光颜色(例如488nm和638nm)。在一些情况下，硬件配置可包括十个检测通道和三种激光颜色(例如405nm、488nm和638nm)。在一些情况下，硬件配置可包括十个检测通道和四种激光颜色(例如405nm、488nm、561nm和638nm)。
示例性细胞监测程序涉及评估各个细胞中相对定量存在或不存在某些细胞表面抗原或细胞内部抗原。如图1所示，处于某发育阶段或呈现某疾病状态的特定细胞可表现独特的抗原表达模式150，此抗原表达模式150的特征在于，细胞表面或细胞内部存在特定抗原(例如CD28、CD26、CD3、CD15、CD59、CD71)。因此，可使用包含激发时分别产生特异性发射光谱的这些抗原的特异性探针(例如，CD28的特异性缀合物，CD26的特异性缀合物)的抗体-染料缀合物面板来分析生物样品，由此确定表达这些抗原的细胞在样品中的包含程度，和抗原表达细胞上的抗原表达相对量。采用这种方式，运用探针面板就可以评估或监测患者的生理状态。图1B至图1H提供了与处理用户输入、返回数据库条目和后续计算结果，以及解释显示内容有关的额外细节。
图1B描绘了根据一些实施例的探针面板选择技术的某些方面。如此处示出，用户可以输入与所关注的特定抗原表达模式相对应的一组抗体(例如CD57、CD45，和其他细胞标记物)。在一些情况下，可将选择的抗体指定给相应的预定染料，或可将选择的抗体与相应的预定染料相关联。根据一些实施例，用户可将每种特异性指派给预定染料。根据一些实施例，用户可只输入特异性，软件随后向其提供最佳的抗体-染料指派建议。选择的探针面板还可能包括“哑”通道，在这种情况下，系统不打算使用特定通道和相关染料，而是将哑指定和面板设计用作“沉默”通道和阴性对照。如本文所用，“沉默”通道是指不会使信号溢出进入任何其他通道的检测器通道；在将其视为失真表格的组成部分时，可称其为“干净列”。类似地，如本文所用，“未激活”通道是指不接收检测器通道未被配置为对其检测的染料发出的任何信号溢出的检测器通道；在将其视为失真表格的组成部分时，可称其为“干净行”。
如图1B所示，在检测通道FL4中使用PC5.5作为检测CD33抗原的染料将因为在检测通道FL4中使用PC5或尝试检测PC5而变得复杂。因此，在该探针面板中将PC5指派给“哑”通道。图1B还示出用户可将特异性抗原指派给特定检测通道内的所需染料。具体地，在示出的例子中，Pacific Blue染料缀合至CD57，该染料将由405nm的光激发并在PMT检测通道FL9中接受检测。由此而论，FL9是用于检测经激发的Pacific Blue染料(因而用于检测CD57)的主要通道，因此，FL1-8和FL10是可检测来自Pacific Blue染料的不需要的溢出荧光信号的次要通道。
如图1C所示，可能涉及一组抗体-染料缀合物的探针面板可与包含有关探针信息的数据库有联系。例如，这种数据库可包含与面板中每根探针的荧光强度有关的信息。在一些实施例中，术语“面板”还可指若干种缀合物组合的序列或群组。如图所示(并如下文参照图8更详细讨论)，这种数据库可提供与一组缀合物(也称作“面板”)有关的信息。系统可使用这些信息计算明亮阳性群体的典型平均荧光强度，其中明亮阳性群体由图中示出的按十进位制比10^0高的群体事件指示，被标识为图1C中的区间(A)。这种数据库还可允许系统计算微弱阳性群体的最小荧光强度。在评估离散的抗原表达特征时，如CD4-PE图中所见，阳性群体和阴性群体明显分开，另外，微弱阳性群体的最小荧光强度等于1。然而，在评估调变的抗原表达特征时，如CD184-PE对CD57-PacB图中所见，阳性群体和阴性群体没有明显分开，原因是阳性细胞的抗原密度可能不同，此时假定最小荧光强度在0个十进位(zero decade)之内(即，小于10^0)。此外，这种数据库可允许系统针对每种缀合物按十进位制计算由出现的全部溢出贡献的联合效应导致的缀合物检出限增大(和相应的灵敏度损耗)，被标识为图1C中的区间(B)。在一些方面，一种缀合物溢出到另一种缀合物上导致的失真度可表征为(B)比(A)的比率。
相关地，如图1D所示，基于用户选择的一组抗原特异性抗体(可称作输入160)，可查询数据库162与相应探针关联的信息。如在本文别处所论述，结合图1D讨论的计算164可作为(例如)图8描绘的技术的借鉴。系统在用户输入160基础上执行缀合物数据库查询162可包括(例如)：(C)每种缀合物的PE-缀合物(或其他参考染料)强度(按十进位制比10^0高)；(D)每种缀合物相对于PE的荧光素亮度，其中PE(或其他参考染料)等于1或100％；(E)每种荧光素使用的主通道中每十进位的信号强度由次要通道造成的典型检出限增大，即失真度；(F)每种抗原的典型表达特征，要么被评估为离散的，要么被评估为调变的；(G)每种单一抗原与其他所有抗原的典型抗原共表达模式，即所关注的共表达模式，其中“1”编码存在共表达的情形，“0”编码不存在共表达或排除的情形；以及(H)每种单一抗原与其他所有抗原的典型亲本-后代抗原共表达模式，其中“0”编码存在后代性质(descendentproperty)的情形，“1”编码不存在后代性质的情形。
如图1D中描述的数据库输出166取决于应用该输出的领域。具体地讲，免疫学监测和判断血细胞紊乱的假定所关注细胞类型是不同的，因此，与所关注细胞类型相关的典型共表达模式和典型表达特征根据所关注的细胞类型不同而变化。计算164建立在从数据库搜索查询检索到的数据的基础上，可提供以下输出。(I)值，即每种缀合物所对应明亮阳性群体的比10^0高的典型平均荧光强度(因而是指离散图)，可计算为：
(I)＝log(((10^(C)-10^0*(D))+10^0)
其中加上或减去10^0让绘图比例一致。(J)值，即每种缀合物所对应微弱阳性群体的基于表达特征的典型荧光强度(因而是指调变图)，其类似于上文用于计算(I)的公式，但(C)值被设置为比10^0高的0个十进位。
(K)值，即单种缀合物在主通道中溢出所导致的次要检测通道检出限(DL)增大，可确定为：
(K)＝(I)*DF*(G)*(H)
其中针对主通道中检测到的每种单一缀合物计算(K)值，(K)值例如可以是针对十(10)色面板中的次要通道计算的九(9)个(K)值。还有(L)值，即在所有缀合物的主通道中分别检测到的溢出的组合值所导致的次要检测通道检出限总增长，可由下式给出：
(L)＝log((10^(K1)-10^0)+log((10^(K2)-10^0)+log((10^(Kn)-10^0)
其中，再次地，加上或减去10^0让绘图比例一致。可计算每个次要通道的(L)值。随后可输出166此类计算164的结果，要么显示给用户，要么供系统进一步处理，或显示给用户和供系统进一步处理。
图1E描绘了根据一些实施例的面板评估技术的某些方面。此处示出的图形化显示图表可用于分析某些面板设计，或对某些面板设计进行排位。如此处示出，提供了包含缀合有PE荧光团染料的CD45抗原特异性抗体的确定探针(或染色剂)。该PE染料可用488nm激光激发，激发后可发射由FL2通道检测的光谱(例如在约575nm处)。CD45抗原通常在白细胞上强表达，而PE是明亮的荧光团。因此，在向人源实验室样品施用CD45-PE探针的情况下，可能观察到很强的信号强度。如此处示出，结果是满量程强度。虚线(最小间距，正方形数据点符号)和点线(最大间距，三角形数据点符号)重合，指示离散表达。也就是说，阳性群体和阴性群体明显分开。
图1F描绘了添加CD25-ECD探针后的情况。ECD染料也可用488nm激光激发，激发后可发射由FL3通道检测的光谱(例如在约625nm处)。如此处示出，CD25是经调变的抗原。也就是说，虚线(最小间距)和点线(最大间距)有别。取决于细胞的活化状态，其CD25表达水平可能高，也可能低至完全不表达(阴性表达)。在这里，虚线(最小间距)与第一十进位和第二十进位间的限值重合。这对应于需要的检出限，利用该检出限可检测出抗原表达极低(信号微弱)的细胞，以及抗原表达较高(信号明亮)的细胞。如此处所描绘，具有较高表达(最大间距，点线)的细胞比具有较低表达(最小间距，虚线)的细胞高约0.75个十进位。最小间距(虚线)和最大间距(点线)的差别(A)代表根据本实施例的CD25表达范围。应当注意，该数据还可能将与ECD染料本身相关的参数考虑在内。图1F中下部的面板气泡图指明来自PE染料的发射光谱正溢出到ECD检测通道中，并导致检出限出现由圆心投射到Y轴上的位置决定的预估增长(FL3)。
如在本文别处所论述，此类气泡图可包括与不同激光器配置(例如405nm、488nm和638nm)相对应的不同线条。可使用第一十进位和第二十进位间的阈值来评估特定信号数据。在一些情况下，可为具体的共表达模式或细胞类型假定一特定背景。例如，相比于B细胞，T细胞可具有特定的表达模式。因此，用户可选择他们可能希望在模拟输出中看到的表型(和相应的共表达模式)。在一些情况下，就给定的表达模式来说，一种特定细胞类型的检出限可能与另一种特定细胞类型的检出限不同，这种现象例如取决于不同细胞类型存在或不存在这种给定表达模式的量化特征。
如图1F所示，检出限可用虚线(正方形数据点符号)表示。在表达特征离散存在的情况下，可能要么有阴性群体，要么有阳性群体，但没有两者间的群体。也就是说，不存在抗原密度不同的组成该特定群体的细胞。因此，虚线和点线将重合(如使用CD45-PE，以约575nm激发的情况)。此时，最高表达密度等于最低表达密度。相比之下，对于调变表达，可能在特定类型细胞上发现抗原以极低密度表达，直到以极高密度表达。如此处示出，经调变表达可用点线表示。举例来说，特定的CD3+细胞类型上可能存在CD4(CD4+，CD8-)，也可能不存在CD4(CD4-，CD8+)。这代表强阳性，并对应于离散的表达特征。如在本文别处所论述，探针面板评估还可能以特定表型为基础(例如，通过假设默认表型，如T细胞或单核细胞)。因此，用户可根据不同的细胞类型和表达模式评估探针面板特征，随后确定表达模式可能对特定抗原的检出限造成何种程度影响。
与其中CD25探针具有ECD标签的图1F相比，图1G描绘了来自具有较强荧光素PC5.5的CD25探针的结果。图1G的预想检出限与图1F示出的检出限相同。然而，该实施例假设的点线(最大间距)和虚线(最小间距)间的信号强度动力学范围(A)比图1F中的该信号强度动力学范围(A)大得多。如此处示出，此范围为约一个十进位。图1G中下部的面板气泡图指明来自PE染料的发射光谱正溢出到PC5.5检测通道(FL4)中。
在图1H中，重新引入了CD25-ECD探针。因此，可将CD25-ECD标签的预期可能最高表达水平(信号强度)与CD25-PC5.5标签的预期可能最高表达密度比较。再次假设，以对数标度为单位，后者要大得多。
考虑背景(实线)也是有用的。例如，如图1H所示，由于淋巴细胞高水平表达CD45，所以可能存在某种程度的背景BG，其用CD45-PE标签标记。如此处示出，来自ECD通道中PE的背景BG信号高于来自ECD通道中ECD的信号。因此存在明显的信息丢失，故这种面板设计可能并不理想。
在图1I中，移除CD25-PC5.5探针，并添加CD25-PC7探针。存在PE和PC7溢出到FL3通道中的情况。在图1J中，移除CD45-PE探针，存在PC7溢出到FL3通道中的情况。如果实线(背景，即BG)与第一对数十进位和第二对数十进位间的阈值重合或逼近该阈值，结果是有利的，如图1J所示。如此处示出，没有染料溢出到ECD通道中产生的极大背景。相反，存在CD45-PC7探针发射到ECD FL3检测通道上造成的少量溢出。因此，背景(BG)和最高表达密度(最大间距；点线)存在间隙。所以，此时的检测方案只会漏检CD25表达水平极低的那些细胞。
图1K描绘了用CD25-PE探针替代图1J的CD25-ECD探针。PE荧光素比ECD荧光素更强。如图1K所示，CD45-PC7探针在PE检测通道FL2中提供了类似的背景BG。然而，图1K中的背景与最大间距间的距离比图1J中的这种距离大，原因是CD25探针上具有更强的PE荧光素。
在图1L中，CD25-ECD探针再次包含在面板中。在这里可以看出，就CD25-PE而言的背景信号(实线)和最大信号(点线)间的距离大于就CD25-ECD而言的该距离。因此，整体灵敏度增大。此结果考虑了在CD25探针上使用的荧光素的强度(例如，PE强度大于ECD强度)，还考虑了源于在所述细胞上也有表达的其他抗原(例如CD45)的溢出模式。荧光素强度和共表达溢出模式都可能影响灵敏度。
在图1M中，CD45抗体缀合有APC-AF750荧光团，看不到溢出现象。在这里，实线(BG)与第一十进位和第二十进位间的阈值重合，因此没有添加的背景。此时的灵敏度为全灵敏度，因此，即便细胞的CD25表达密度低，也可能检测到信号。如在本文别处所论述，随着更多探针被添加到面板，将观察到结果越来越复杂。这些结果可将共表达模式与溢出相关的各种情形的多种贡献(例如荧光团强度)考虑在内。
图1N和图1O提供了三种缀合物的例子，其中给定的CD可与给定染料相关联。如图1N所示，每种CD-染料缀合物的PE-缀合(PE为参考染料)MFI都具有比10^0高的十进位值；如图所示，CD-X的MFI为0.5，CD-Y的MFI为1，CD-Z的MFI为2.5。在一些实施例中，亲本-后代矩阵可能是对称的。在一些实施例中，亲本-后代矩阵可能是不对称的。如此处示出，共表达矩阵可是对称的，然而在其他方面，共表达矩阵可是不对称的。此外，如图1O所示，CD-染料缀合物中的每一染料相对于PE具有一相对强度。A-染料的相对强度为0.2，B-染料的相对强度为0.45，C-染料的相对强度为0.85。使用给定CD-染料缀合物的这些值能够可计算出如图1O所示的失真度表格，其中在某种程度上，B-染料影响旨在检测A-染料的PMT FL1的失真值为0.25，影响旨在检测C-染料的PMT FL3的失真值为0.75。相比之下，C-染料没有对PMT FL1造成失真影响，类似地，A-染料没有对旨在检测C-染料的PMT FL3造成失真影响。进一步相比之下，A-染料影响旨在检测B-染料的PMT FL2的失真值为0.65，C-染料影响旨在检测B-染料的PMT FL2的失真值为0.1。图1O示出的计算是使用图1N和图1O提供的相关值，对图1D给出的公式的应用。
在共表达模式具有特定亲本/后代方案或排除方案的情况下，可以不将计算得到的溢出添加到总失真中。例如，图1P描绘了单种染料(CD25-PE探针)的计算结果。在将第二种染料(CD45-FITC)添加到面板后，如图1Q所示，可以看出FITC染料发射向PE FL2检测通道施加了溢出。气泡图上与FITC溢出对应的圆圈在Y轴上有特定截距，且具有特定直径。如此处示出，CD45-FITC探针可将PE FL2通道的十进制灵敏度降低到大约一半。例如，图1Q中的背景和最大间距间的距离是图1P描绘的该距离的大约一半。
在图1R中，用CD15-FITC探针替代图1Q的CD45-FITC探针。CD15抗原的表达水平下降，因此，就FITC检测通道中的信号来说，图1R中的该信号低于图1Q中的该信号。例如，可以看出最大间距(点线)不再位于第三十进位和第四十进位之间。然而，CD45与CD25共表达，CD15却不与CD25共表达(例如，根据数据库的默认设置)。因此，不存在CD15-FITC探针溢出到FL2PE通道上导致的有效失真。相关地，PE通道处没有出现背景增加现象。换句话讲，虽然仍旧存在溢出，但溢出不会对分析CD15阴性细胞可能存在的CD25表达造成影响。CD15+细胞在本例中不表达CD25。因此，基于细胞的生物学特征，不分析CD15+细胞上的CD25表达。因而可使用不同的门评估这两种不同的抗原。
图1S是共表达方案的另一图解，描绘了CD3-FITC探针和CD45-ECD探针都正在向PEFL2检测通道发射溢出光谱的结果。总失真比一个十进位的一半多一点。这种结果可能与可在T细胞中观察到的共表达模式相符。还可以看到进入FL1FITC检测通道的少量溢出。可使用气泡图解析这些贡献。举例来说，在考虑了与FL2通道处的溢出相对应的Y轴截距值的情况下，可以看出CD45-ECD溢出比CD3-FITC溢出大。FL2通道的相应气泡直径指明ECD对总失真的贡献更大。
因此，为了改善FL2通道的信号(例如提高灵敏度)，可能更有利的是除去FL2通道处的ECD溢出(例如，同时保留FITC溢出)。图1T描绘了这种结果，其中用CD45-APC探针替代图1S的CD45-ECD探针。因此，FL2PE通道的检出限得到显著改善。也就是说，背景(实线)与最大间距(点线)之间的距离变大。
在图1U中，分别用CD3-APC探针和CD45-ECD探针替代图1T的CD3-FITC探针和CD45-APC探针。如图1U所示，FL2PE通道处仍有一个十进位的大约一半的信号损失。
气泡图提供探针配置(例如抗原特异性、荧光团)能够以何种程度影响检测通道的检出限的有用指示。
示例性十色探针面板的结果显示方式在图1V中绘出。如区间A所示，为了优先化用于检测具有经调变表达特征的抗原的缀合物，预估的平均荧光强度(三角形)和检出限总增长(圆圈)之间距离较大可能是有利的，这种较大的距离可作为对相同抗原组的不同缀合物组合进行排位的标准。如区间B所示，明亮(三角形)平均荧光强度和暗淡(方盒形)平均荧光强度的估计值可基于典型的抗原表达密度和相对荧光素强度(例如等于(I)和(J)，如图1D所描绘)，并且例如可由于在指派给红色激光的相应主通道FL8上检测到的CDxy-APCA750-缀合物的离散表达特征而重叠。如区间C所示，对于指派给红色激光的通道FL8来说，检出限可能有等于(L)的总增长。如区间D所示，由于CDqw-ECD具有经调变的表达特性，可将典型的微弱表达密度(三角形)设置成比10^0高的0个十进位。
示例性十色面板探针的另一种结果的显示方式在图1W中绘出。如区间A所示，此面板中的PE-缀合物(参见图例)引起第三检测通道FL3的检出限(DL)出现比10^0高的0.6个十进位增大(例如，在参照Y轴上的截距时)，而气泡圆圈的直径对应于PE-缀合物对通道FL3的检出限总增长的贡献。因此，可以看出PE缀合物向通道FL3的检出限增长提供最大贡献。如区间B所示，此面板中的PC5/PC5.5缀合物(参见图例)引起比10^0高的0.2个十进位的中低程度增长。在许多情形中，这种大小的增长是可以接受的。区间B还指明，基于气泡直径的大小，可将PC5/PC5.5缀合物视为检测通道6检出限总增长的主要贡献物。
因此，在典型程序中，用户可选择特定硬件配置，此特定硬件配置可包括与各种检测器相关联的特定滤光片(例如带通滤光片)。在一些实施例中，可指派或预先确定特定硬件配置，而不允许这种选择。各种硬件配置可具有相关联的失真度值。在一些情况下，可从数据库检索硬件配置或失真数据。例如，数据库可包含指明特定带通检测器配置(例如红外配置)的失真度大于别的一些检测器配置的失真度的数据。因此，硬件配置不同，灵敏度和/或测量误差可能随之变化。在一些实施例中，数据库可包含预定数目的硬件配置，用户可从这些硬件配置中选择。举例来说，特定硬件配置可包含与NaviosTM流式细胞术系统或GalliosTM流式细胞术系统(这两个系统均可得自美国加利福尼亚州布瑞亚市贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Brea,California,USA))有关的数据。在一些情况下，特定硬件配置具有相关的失真度情形。硬件配置中包含的激光器的数量和/或检测通道的数量可能对特定探针面板中采用的荧光素的数量有影响。在一些情况下，带通滤光片的特征会影响失真度。相关地，PMT或其他检测器(如雪崩光电二极管)的品质也可能影响失真度。
面板设计和模拟所涉及的抗体选择
图2描绘了操作者选择程序200的某些方面，操作者利用这些方面可输入某些抗体和染料选择信息，供选择抗体面板用。例如，如步骤210a所示，操作者可选择抗原1(例如CD28)的特异性抗体，任选地一起在步骤210b中选择相应的染料(例如FITC)。此外，操作者可额外选择表达谱中相应抗原的特异性抗体(例如步骤220a、230a和240a)，任选地一起选择这些抗体各自对应的染料(例如步骤220b、220c和220d)。如此处示出，可从数据库的下拉菜单选择抗原特异性抗体参数，也可从数据库的下拉菜单选择染料。在某些情况下，可将染料选择过程配置成让操作者不能明确地选择染料。而是，可由数据库提供与所选抗体关联的染料。根据一些实施例，倘若用户没有向抗体指派染料，那么，系统可基于对整个探针面板(灵敏度等)的考虑，从提供可供相应抗体使用的所有缀合物的数据库识别出最适用于所有未指派抗体的染料。系统在执行完必要的计算和迭代(即，出现模拟数据输出)之后，可能才会显示其选择的荧光素。
本文公开的系统和方法可体现出此处示出的下拉式数据库和用户界面特征。因此，用户可指定关注的抗原，指定的抗原继而又会影响对抗体的选择。根据一些实施例，用户可直接在界面中选择抗体。在一些情况下，关注的抗原可能对应于特定细胞类型，例如T细胞。因而用户可选择对应于T细胞面板的一批抗体。
图2示出的菜单包括可呈现给用户的两列内容。左列内容对应于抗体特异性，右列内容对应于染料选择或指派。在过程的该阶段，用户可能已考虑好、也可能尚未考虑好特定的表达模式。例如，用户可能仅有一系列可能受其关注的抗原。在一些情况下，用户在选择某些抗原时，可能知道适宜选择的是更敏感的染料，还是较不敏感的染料。相关地，数据库往往包含与特定抗原的表达密度有关的数据。当由系统选择或指派染料时，系统可考虑这种数据。在一些情况下，表达密度可能取决于特定的细胞类型。举例来说，数据库可包含这样的信息，即特定标记物在一种类型的细胞中以最低程度表达，而同一种标记物在另一种类型的细胞中高度表达。如果用户没有在选择抗体时一并选择染料，那么系统在向该抗体推荐或指派染料时可能会考虑其他特征，例如细胞类型。根据一些实施例，在过程的该阶段，倘若用户没有选择染料，系统便不会指派染料。
通常情况下，不同染料具有不同的亮度，此亮度可用染料的量子产率和吸收系数量化，其中吸收系数指示染料吸收了多少从中通过的光，量子产率指示有多少被染料吸收的光将转化成荧光发射。在许多情况下，吸收系数和量子产率彼此对应。举例来说，PE染料被视为具有较高的吸收系数和量子产率，可将所吸收光的很大一部分转化成荧光发射。相比之下，FITC具有较低的吸收系数和量子产率，可将所吸收光的较少一部分转化成荧光发射。因此，一旦选定染料，就可以确定能够实现的灵敏度。所以与使用FITC的情形相比，使用PE可能赋予系统更高的灵敏度(例如，即使是考虑到以下情况：由于FITC分子尺寸小(小于1kD)，单个抗体分子可能共价结合到若干个FITC分子，而这种情形对于大的(大于200kD)PE分子而言则不能实现)。
在一些情况下，用户可以选择接受系统数据库提供的默认染料选择中的一种或多种。任选地，用户也可选择修改这些默认选择。根据一些实施例，在过程的该阶段，因为可能需要所有用户界面输入提供的全面信息才能选择适用于抗体的染料，所以系统可能不会推荐与抗体一起使用的染料。相关地，系统数据库可能包含典型/特定T细胞抗原(例如CD3抗原)的某种假设表达密度。在选择特定抗原特异性之后，系统可检索对于某种类型细胞上的抗原而言典型的特定表达密度。例如，在选择CD3抗原的特异性抗体之后，数据库可能包含将CD3抗原与T细胞关联起来的关系信息。又如，用户可能选择CD16、CD38等的抗体特异性。一些抗原在各种类型的细胞上有各种表达密度。因而，这些抗原在(例如)T细胞、B细胞和单核细胞上的表达密度可能不同。举例来说，在选择抗原特异性之后，数据库可能针对三种不同细胞类型提供三种典型表达密度。在一些实施例中，用户可根据需要，选择修改假定(即默认)的密度。
图2A、图2B和图2C分别示出了关于目标表型、表型排除和亲本/子代方案的类似操作选择特征。图2D描绘了关于抗原密度参数的操作选择特征。
如图2A所示，如果需要，基于数据库可能包含的抗体选择，用户具有限定各种表型的选项。在一些实施例中，数据库可能包含与用户限定表型匹配的有关典型抗原共表达模式的信息，呈现为预选或预定典型抗原共表达模式。数据库还可包含有关通常存在的抗原共表达模式的默认信息。此默认信息比预定细胞表型的特异性低，并允许对不在同一个门内的多个抗原进行组合。举例来说，T细胞是细胞计数所使用的突出的细胞表型。任选地，用户可限定自己需要的表型。在一些情况下，用户可向表型指派某种表达模式。如此处示出，用户还可选择跳过这一步，不指定细胞表型。在选择特定表型之后，数据库可提供相关的一组抗原特异性抗体。根据一些实施例，用户可通过直接选择抗体来限定表型。例如，如果在图2中已将染料指派给抗体，那么上式可响应用户在图2A左列选择的相应抗体，在右列显示该预选内容。右侧列可采用自动填充方式，让用户在其中预选染料。根据一些实施例，在过程的该阶段，用户或许不能再向抗体指派染料(例如，如果已在图2中完成指派)。然而，假使用户已在图2中将染料指派给了抗体，那么一旦在左列中选择相应抗体，这些染料便会显示在右列中。在一些情况下，可在不同表型中选择，或可将一些表型按优先次序排列。例如，可基于目标群体，或基于应当在特定表型上检测的特定抗原，来将一些表型按优先次序排列。在一些情况下，系统可基于表达密度来将抗原优先。例如，可赋予低密度表达的抗原高的优先级。
如图2B所示，如果需要，用户有权选择数据库可能包含的各种表型排除。例如，数据库可包含指示某种特定抗原决不会与另一种特定抗原共存于同一细胞表面的信息。任选地，用户可限定某些排除内容。如此处左列所描绘，用户可限定第一排除，该第一排除对应于上文结合图2讨论所选择的抗体，且显示为左列的标题节。用户可以采用这种方式，针对面板的多种抗体选择多种排除。例如，用户可指明抗原CD-X排除抗原CD-Y和CD-Z。此类选择可能会影响探针面板的图形显示，如在本文别处所论述。根据一些实施例，排除特定抗原可能不会影响相应检出限，原因是只有位于同一细胞表面上的标签才可能影响彼此的通道检出限。也就是说，一旦抗原不位于同一细胞表面上，相应的标签染料也不会位于同一细胞表面上，因此，它们相应的发射光谱可能不会彼此干扰。如图2B所示，用户还可选择不指定排除。
在某些情况下，用户可选择两种决不会共同表达的抗原。任选地，数据库可能作出某些有关排除的假设。例如，系统可假设特定的T细胞标记物和特定的B细胞标记物彼此排除。在一些情况下，系统可能允许用户指示不存在排除。因此，可向用户呈现各种选项，包括(a)接受数据库提供的排除；(b)主动指派排除；和/或(c)不指派排除，使得任何抗原能够与另一种抗原共存于任何细胞上。
如图2C所示，如果需要，用户有权选择数据库可能包含的各种亲本-后代关系。例如，数据库可包含指示某种特定抗原与另一种抗原具有亲本或后代关系的信息。任选地，用户也可选择不指定这种关系。如此处左列所描绘，用户可限定第一亲本和任何相关的后代，该限定可与上文结合图2讨论所选择的抗体对应。作为亲本-后代方案的一个例子，亲本-后代关系可意味着亲本标记物在亲本细胞上表达，细胞A除表达亚群/子代A蛋白之外还表达亲本蛋白，细胞B除表达亚群/子代B蛋白之外还表达亲本蛋白。例如，亲本T细胞可包含CD3抗原，一些子代T细胞可表达CD3抗原与子代细胞CD4抗原，一些子代T细胞可表达CD3抗原与子代细胞CD8抗原。CD4和CD8在子代细胞中的表达可相互排除。例如，子代细胞要么可以是CD4+/CD8-，要么可以是CD4-/CD8+。在一些情况下，每一个CD4+子代细胞都是CD3+，每一个CD8+子代细胞都是CD3+。这样的话，可认为亲本-后代关系对表达模式有影响。相关地，可认为亲本-后代关系对相关联失真的相关性有影响。举例来说，假使后代抗原是用将导致检测亲本标记抗原的通道中出现失真的染料标记的，那么可能不必考虑这种失真。例如，在所有CD4+细胞也都是CD3阳性的情况下，背景中可能不会出现CD4+(例如，不存在还是CD3-的CD4+细胞)。在一些情况下，亲本中的CD3标签可能导致子代CD4通道出现失真。
因此，亲本-后代关系可能对背景失真有影响。在失真施加于阳性群体的情况下，可将阳性群体描述成处于较大对数标度范围内的群体。在一些相关情况下，这种测量误差在实质上可能不与检测阳性群体的通道的检出限相关。根据一些实施例，亲本-后代关系除产生溢出和相关的失真之外，不对系统产生其他影响，另外，如果后代通道溢出到亲本通道中，导致的失真与溢出无关。倘若亲本通道溢出到后代通道中，便向系统施加“正常”失真。
如在本文别处所论述，针对特定荧光素的主要检测通道是用户打算检测与该荧光素相关联的信号的通道。就单个主通道来说，可能有一个或多个次要通道(举例来说，在这种情况下，主通道对应的荧光素发出的发射光谱溢出到另外的通道中)。例如，可将系统配置成主要在FL2通道中检测PE染料的信号，然而PE发射光谱可能溢出到另外的通道如FL3、FL4、FL5等中。从这个意义上来说，次要通道可以指示检测到不希望的信号强度的位置。可将此类溢出特性与亲本-后代关系一起用于评估或配置探针面板设计。在一些情况下，尽管存在向次要通道的强烈溢出，仍可将探针指派给主通道，此时次要通道代表亲本通道。同样如在本文别处所描述，针对典型群体的亲本/后代方案可呈现在数据库中。在一些情况下，用户可选择默认的亲本-后代方案继续。在一些情况下，用户可选择限定自己需要的亲本-后代方案。在一些情况下，用户可选择指定不存在亲本-后代方案。例如，就分析血细胞紊乱来说，某些表达模式可能非常罕见。在这种情况下，对用户来说可能理想的是指明不存在亲本-后代关系。
如图2D所示，如果需要，用户有权选择数据库可能包含的某些抗原密度参数。例如，数据库可能包含默认抗原密度。此类默认值可适用于人外周血中存在的典型群体。也可应用其他类型的默认值。因此，例如取决于用户是否有兴趣评估与细胞培养物中细胞相关联的材料，或者与骨髓相关联的材料，可能有不同的默认值和/或表达密度供用户选择。
还如图2D所描绘，可针对各抗体选择根据图2A指示的表型。选择了特定表型的每种抗体可以直方图呈现。此外，用户可以选择是接受还是修改被视为典型表达密度的表达密度。关于直方图下方的进度条，用户可以移动进度条上的按钮来改变阳性群体与阴性群体的相对量。因而可能影响可为特定群体假定的信噪比。信噪比改变会影响可能预期存在于另外的通道中的串扰或溢出。根据一些实施例，术语串扰和溢出可互换使用。因此，在假设信号较明亮的情况下，或在选择或调整较明亮信号的情况下，可假设在另外的通道中存在更大量的串扰或溢出。在某些情况下，用户可选择默认值(例如抗原密度和/或信号强度)继续。在某些情况下，用户可根据需要的特定表型(例如T细胞群体，或单核细胞群体，或非人细胞群体，或与人外周血或骨髓无关的群体，或其他群体)的期望特征来修改信号强度。
图3描绘了根据一些实施例的探针面板选择技术300的某些方面。如此处示出，可将像用户选择的抗体参数310(例如，如图2所描述)、流式细胞术装置配置320(例如，如图1所描述)和抗体数据库330之类的数据输入模拟器模块340中，或者模拟器模块340可访问这些数据。模拟器模块340运行，根据优先排列的表型和/或抗原表达建议最佳的组合，并基于模拟的探针面板生成显示检出限和群体分离度的图形(例如，图A、图B和图C)。如步骤350所示，用户可根据模拟结果选择探针面板。在此处描绘的实施例中，探针面板是为具有三台激光器和十色检测通道(可用同一个通道检测PC5和PC5.5)的流式细胞术装置配置选择的探针面板。此面板包括十种CD抗原的特异性抗体-染料缀合物。
下表1示出了示例性探针名单的各方面，该探针名单可能与数据库探针相关联，也可能是数据库探针的组成部分。如此处描述，各个探针可包含缀合有染料的特定抗原特异性抗体或其他结合剂。
应当理解，细胞结构或表面结构诸如分化簇(CD)，与涉及该结构或簇的抗体可以互换使用。例如，识别分化簇3(CD3)的抗体也可称为CD3或CD3抗体。在一些情况下，可使用术语“抗CD3抗体”。在一些情况下，存在尚未指派CD编号的细胞结构。遇到此类情况，也可用该结构本身的名称来命名抗体。在一些情况下，可使用抗-“结构”抗体命名法。
如在本文别处所论述，根据从数据库检索到的表达模式(或用户假定或指派的表达模式)，特定表达模式可与共表达方案、特定排除方案或亲本-后代方案对应。在一些情况下，可将选择的抗原指派给某种表型。根据这些类别的信息，系统可以双变量点图的表现形式图表显示数据，诸如在面板A、B和C中示出的那些。在一些情况下，这些表现形式还可包含背景失真估计值。
如此处示出，群体X可反映目的是检测特定群体中的抗原X的情况。在面板A中，从右上象限划界到左上象限的直线存在急剧转折，指示就表达抗原Y的群体来说，取决于抗原Y的密度，抗原Y的检出限存在剧烈增大。这些检出限特征与表达抗原Y的群体的抗原X检出限特征不同。从右上象限划界到右下象限的线没有转折，而是平行于图的轮廓线，因而指示抗原Y的检出限不依赖于相应细胞上抗原X的表达密度。因此这种图形输出可提示用户这种特定选择可能不是最佳的。
所以在用户选择或输入特定抗原表达模式(例如，与抗体参数310相关联的抗原表达模式)时，系统可根据用户的选择或输入，从数据库检索可靠的抗体-染料缀合物。随后用户就可观察到与抗原表达模式相关联的各种图形输出。根据一些实施例，系统可根据用户作出的抗原选择生成最佳化探针面板提议。根据一些实施例，用户可选择特定的抗体特异性情形或抗原表达模式，且系统可返回该情形或模式可能的全部缀合物组合的排列。在一些情况下，系统可根据按优先次序排列的抗原显示选择的缀合物组合。因此，可能对某些抗原进行优先级排序，随后可利用排序结果确定期望使用哪些缀合物组合来传递与灵敏度有关的最佳结果，并确定将哪些缀合物组合以图形输出显示。根据一些实施例，系统可根据与荧光素亮度表达模式等参数有关的优先排列的缀合物/表型返回最佳化缀合物组合。在一些情况下，可基于灵敏度来优先化排列抗原。例如，可能有利的是对一种抗原具有较高灵敏度，与此同时，而对第二种抗原只要有较低特异性就能满足要求。
如在本文别处所论述，图形输出可受多种因素影响。例如，显示内容可取决于表达模式、流式细胞术装置配置、和/或探针特征(例如，是否认为染料是对于给定抗体组合中的给定特异性来说最佳的染料，或者说是特别选择的染料)。
根据一些实施例，从数据库检索到的一部分甚至全部条目可能是默认值。相关地，系统推荐的一部分甚至全部探针面板提议可能是基于包含表达模式在内的一整套抗原计算得出的。例如，在譬如用户选择了不同的期望表达模式之后，十种抗原的十套默认值可能推荐不同的探针面板。修改某些参数(诸如表达模式或信号强度)可能导致显示内容改变。在一些情况下，模拟显示可以指明系统的特定推荐。在一些情况下，模拟显示可依据预设染料显示输出。在一些情况下，模拟显示可依据混合情况显示输出，混合情况是指一些染料由用户选择，另一些染料由系统选择。根据一些实施例，系统可根据与荧光素亮度表达模式等参数有关的按优先次序排列的缀合物/表型返回最佳化缀合物组合。与确定表型有关的抗原可显示在双变量点图或其他图示上。在图3中，示出了三种图形。本发明的实施例涵盖显示任意数量的图形。例如，如果选择了五种抗原，可能有十种图形，如表2所示。
根据一些实施例，用户可查看显示输出图形，并考虑到已按优先次序排列的任何抗原、对目标群体的任何了解和/或对目标共表达抗原的任何了解，随后评估检出限并确定是否预期存在较大失真。在一些情况下，系统可推荐特定探针面板，且用户无需考虑图形显示示出的内容，就可选择系统推荐的面板。
举例来说，如果CD3与特定抗原共表达，并且因为多种抗原溢出到检测通道中导致群体显著失真，用户就可以决定不选择这种探针面板继续。用户随后可以返回图2至图2D显示的任一步骤，修改他们的输入和/或从数据库检索到的默认输入。
检出限
使用流式细胞术的一个目的(例如在用免疫荧光素将细胞染色的情况下)是分析细胞表面上或细胞内部表达的蛋白质或标记物。以此方式，可能将细胞(或细胞亚群)分为特定抗原或标记物阳性的一类，或特定抗原或标记物阴性的一类。因此，举例来说，可将一些细胞视为特定标记物或抗原“阴性”细胞，并可将其他细胞视为特定标记物或抗原“阳性”细胞。为了确定细胞是阴性还是阳性，可能有益的是定义信号强度的阈值。定义这种阈值后，将抗原表达水平极低或没有抗原表达，从而产生比阈值低的信号强度的细胞视为“阴性”细胞，并将抗原表达水平足以产生比阈值高的信号强度的细胞视为“阳性”细胞。还可将这种信号强度阈值称作检出限。
因此，在某些情况下，检出限可以指在特定范围内判别阴性事件和阳性事件的阈值。也就是说，可能存在一条阳性/阴性界限，凭由该界限，不能被检测到的信号或荧光、或者说低水平信号或荧光与阴性事件对应。在一些情况下，非特异性荧光可能与阴性事件对应。相反，水平足够高的信号或荧光可被视为阳性事件。
如在本文别处所论述，特定检出限可基于涉及同种型数据、荧光强度、失真度等的公式计算。
同种型对照染色
典型的免疫分型规程涉及用抗体-染料缀合物标记生物样品的细胞，其中抗体-染料缀合物特异地结合至这些细胞表面上的蛋白。以此方式，可以分析这些细胞表达的蛋白。然而，由于缀合物探针本身的特性，可能出现探针与细胞的非特异性结合，这是我们不希望看到的。也就是说，即便未将特定探针设计成结合至某种细胞，该探针也可能与这种细胞结合。
于是，可使用同种型对照抗体来提供这种非特异性结合或非特异性荧光的阴性对照。同种型对照通常是从产生探针抗体的同一宿主产生的。举例来说，假如缀合物探针的抗体是由小鼠产生的，那么用作该探针的对照的同种型抗体也从小鼠产生。此外，产生同种型使得其具备针对已知不存在于样品中(或者不存在于目标细胞上)的抗原的特异性。
在用同种型对照将样品染色后，获得的信号可能指示抗体-染料缀合物非特异性地结合至细胞表面。这样一来，就可以使用同种型对照评估缀合物染色程序中可能存在的背景强度水平。例如，同种型对照可表明使用探针获得的荧光强度处于何种水平方可被视为具有特异性。也就是说，倘若在用设计的探针染色时，检测到的信号超过同种型对照提供的背景强度水平，就可能推断检测到的信号与阳性事件对应。
在实施过程中，可使用同种型对照实现以下目的：区分特异性结合与非特异性结合，设置特异性对照或设门对照，指定用于将细胞分类的门或图形区域或图形边界的位置，确定特定抗原的阳性率或阴性率，指派数据的阳性/阴性边界，等等。可在流式细胞术程序中使用同种型抗体对照。在流式细胞术程序中采用多重染色的情况下，使用同种型抗体对照可能特别有帮助。
在某些情况下，举例来说，假如抗原具有独特的双峰表达，并且阳性群体和阴性群体(例如，T细胞上的CD4和CD8)没有重叠，便可不使用对照而进行。
同种型对照可能有助于解决细胞分析规程中的信噪比问题。如果要确定某种所关注表达模式或细胞是否可能是给定的标记物阳性，那么同种型对照可帮助优化分辨灵敏度，而不会不适当地牺牲特异性。使用同种型对照时，可以评估检测到的信号是仅与非特异性结合对应，还是与非特异性结合和特异性结合的某种组合对应。如在本文别处所论述，可使用同种型对照来确定检出限。同种型可能增大背景，光谱重叠或溢出可能增大背景扩散，这两种现象都可能影响灵敏度。
图4描绘了同种型信号传导和分辨灵敏度的某些方面。例如，如面板A所示，左侧的同种型信号与阴性事件对应，右侧的检测到的信号与阳性事件对应。此处，阴性群体的背景相对阳性群体为低，因此，可以毫不费力地解析这两种群体(例如，利用明确限定的检出限)。相比之下，面板B示出了阴性群体的背景相对阳性群体为高的情况，因而可能较难解析这两种群体。相关地，面板C示出了阴性群体具有低背景(相对阳性群体)和高变异系数(CV)的情况，因而可能较难解析这两种群体。如果同种型对照呈现显著溢出，就可能出现这种情况。因此，为了能解析阴性群体和阳性群体，让阴性信号的背景相对阳性信号为低，并让阴性信号具有低扩散或低变异可能是有助的。
如在本文别处所论述，一个探针上的染料发出的光可能溢出到被设计为检测来自另一个探针的染料发出的光的特异性通道中。遇到此类情况，这种溢出可能与上述的阴性群体数据扩散类似。
在一些情况下，次要通道中的群体宽度可能由于主通道中检测到的同一群体上的另一种荧光标签产生溢出造成数据扩散而增大，这种群体宽度增大可能促使次要通道中的检出限增大。例如，随着阴性群体的测量误差增大，分布宽度也可能增大。在一些情况下，可能有较大的测量误差，另外，在主通道存在溢出的情况下，在次要通道中检测到的信号可能超过主通道不存在溢出的情况下次要通道内的同种型对照信号，然而前一种信号仍可对应阴性事件。在一些情况下，溢出可能导致检出限增大。例如，溢入特定检测通道的溢出量增加可起到增大该通道检出限的作用。但这一结果可能会因该特定通道的荧光检测更强而导致测量误差更大。
在一些情况下，可使用同种型抗体获得基线。在一些情况下，可使用未染色细胞获得基线。在过程中染色后运用洗涤步骤的次数越多，同种型在背景荧光方面发挥的作用就越可能接近未染色细胞群体发挥的作用。也就是说，充分洗涤可起到平衡背景荧光的作用，使得即便已添加了同种型染料，洗涤能移除所有非特异性结合的同种型。
在使用多色探针面板执行染色规程后，可能有多种荧光素与细胞表面相关联。为了评估用这些细胞上的单一特定缀合物检测到的抗原特异性阳性率，可能有助的是将这些细胞上的其他所有荧光素的发射考虑在内，其他所有荧光素的发射都可能起到增大特定单种荧光素的检出限的作用。
荧光强度
流式细胞术通常涉及使用具有某些性质(例如荧光强度或亮度值)的染料或荧光素。例如，PE染料的亮度强度可能是3420000，而FITC的亮度强度可能是39000。可对这些强度相对于彼此进行测量，以其中一种染料的强度作为最大强度参考值。如在本文别处所论述，在评估探针面板时，可能需要考虑各种荧光素的强度。
失真
背景群体的失真以及由此造成的检出限增大可能与细胞表面上或细胞内部的溢出荧光素的数量对应，或可能与进入相应检测通道的相关溢出信号的强度对应。因此，举例来说，溢出的量越大，背景失真就可能越宽。在一些情况下，可能将结合至细胞表面的抗体数量考虑在内。较大数量的用特定溢出荧光素标记的抗体被认为是对背景失真的贡献更大。在某些情况下，数据库可能包含例如基于某种细胞类型的典型假设强度的背景失真估计值。换句话讲，背景失真可能基于结合至该细胞类型的溢出荧光素标记的抗体的数量。
例如，可能会考虑表达CD3抗原连同一些其他共表达抗原Z的T细胞。通常情况下，T细胞在表面上具有极强的CD3表达。因此，在用旨在向特定通道提供发射信号的抗CD3探针进行染色的情况下，可能出现CD3抗体染料缀合物探针实际上在被设计成检测Z探针的通道内产生串扰，于是Z探针的检出限可能增大。执行多色实验时，可能出现复杂的溢出模式。例如，就十色实验来说，在考虑一个特定检测通道时，可能有必要考虑来自其他九种颜色的溢出。也就是说，其他九种颜色中的每一种都可能促成特定通道的检出限增大。在一些情况下，失真可能取决于正被分析的细胞类型和相关的表达模式。在一些情况下，失真可能取决于细胞类型上结合的带有溢出荧光素的抗体的数量。
重新参看抗CD3探针的例子，可能会考虑T细胞(CD3抗原密度高)和B细胞(不存在CD3抗原)，其中T细胞和B细胞都表达Z抗原。在用CD3探针对T细胞进行染色时，该染料可能溢出到Z通道检测器中，从而导致Z通道的检出限增大。相比之下，在用同样的CD3探针对B细胞进行染色时，因为B细胞上不存在CD3，故不存在(特异性)结合，因此不存在来自CD3探针染料的溢出，故而不认为CD3探针能够引起Z通道检出限增大。由此可以看出，失真度可能因细胞类型和相关的抗原表达模式不同而有变化。例如，特定探针通道可能针对一种细胞类型产生一组检出限，而针对另一种细胞类型产生另一组检出限。相关地，特定探针通道的一组检出限可能取决于正被分析的细胞所表达的抗原的类型。
举例来说，如果某类细胞不含抗原A(因此没有抗原A的特异性探针结合到其上)，那么可能不会在特用于检测抗原B的检测通道处观察到检出限增大。相反，如果某类细胞大量表达抗原A(该细胞上的抗原A与抗原A的探针结合，还向检测抗原B的检测通道提供溢出)，那么便可能在特用于检测抗原B的检测通道处观察到检出限增大。这样，检出限增大(或不存在检出限增大)可以染色细胞的表达模式为基础。
因此，失真度可能对检出限有影响。例如，在某通道检出限增大(例如，由于溢出导致增大一个十进位)的情况下，可能有必要观察或检测到该通道出现的较大信号，以便推断存在阳性事件。
例如，参见图8，可以看出PE染料(CD4-PE探针的)向检测ECD的FL3通道强烈溢出。这种溢出的结果是，相比于非特异性同种型染色，被PE特异性标记的群体的未补偿ECD信号比没有被PE特异性标记的背景群体的未补偿ECD信号亮数百倍。
在一些情况下，随着信号增强，CD4+群体进一步铺展开。因此，该群体发出的PE信号可能更强。故而就FL3标签(Y轴)来说，可能出现检出限增大。
补偿
通常情况下，较高的荧光信号可能伴随较高的测量绝对误差。例如，参见图5，由于PE染料发射溢出到FL3ECD检测通道中，PE阳性群体在用于检测ECD的FL3检测通道内产生信号，因此，该群体的绝对误差可能更大。可将这种绝对误差描述成标准偏差。在某些情况下，测量误差可能受泊松分布特征影响，从而不能用补偿程序将其降低，原因是这些补偿程序只能校正用溢出缀合物特异性标记的群体相对用溢出缀合物非特异性标记的群体的平均强度。如果测量相对误差(用相应的变异系数CV表示)的比较结果指示足够相似，则表明得到的是线性检测结果。
在某些情况下，变异系数的比值可能为2，此时，变异系数相对比较接近并属于同一数量级，标准偏差却可能相差100多倍或更多倍。
如图6A和6B所描绘，将用检测PE的PMT测得的表达信号事件的负荧光值和用检测ECD的PMT测得的表达信号事件的负荧光值相对彼此绘图，可能通过计算补偿人工生成双峰分布。如图所示的双峰计算可用于辨别两种测量抗体-染料缀合物中第一种缀合物阴性的事件，两种测量抗体-染料缀合物中第二种缀合物阴性的事件，或两种测量抗体-染料缀合物都是阴性的事件。图7示出了将用检测ECD的PMT测得的表达信号事件和用检测PC5的PMT测得的表达信号事件相对彼此绘图，两种表达信号事件分布宽度增大的现象。图7部分反映了以下事实：共表达可能影响阴性群体向溢出通道扩散。虽然这些附图未示出，但应当理解，阳性事件的扩散程度与人为阴性事件的扩散程度相当。
如图8所示，可能存在强烈溢出导致的检出限增大现象。某些情况下，可以在补偿程序中用软件和/或硬件执行计算，由此对溢出进行校正。在补偿过程中某一点，PE阴性群体和PE阳性群体在ECD轴上可能有相同的平均值，可将此现象称为正确补偿(参见例如图5)。如图5所描绘，经补偿的PE阳性群体可能有较大的测量误差，这样一来，相比于PE阴性群体，经补偿的PE阳性群体存在更大的数据扩散。因此，某一范围内的ECD信号强度可能小于测量误差的增大量。这些信号可能不再能被检测为阳性事件。在一些情况下，还可能出现经补偿群体分叉。
在将Y轴刻度的某部分转换成线性缩放(参见例如图7)之后，对数标度的下端可能被压缩。这种转换可指示ECD阳性群体的测量误差(例如宽度或扩散)大于ECD阴性群体的测量误差。在一些情况下，在对平均强度进行计算校正(称为补偿)后，FL3(ECD)阳性群体溢出到FL4(PC5)检测通道可能转化成较大的测量误差。在某些有细胞结合的荧光团溢出到FL4(PC5)检测通道的情况下，像ECD和PE之类的染料可以附接到用于检测同样的细胞的细胞结构的抗体，从而产生FL3(ECD)和FL2(PE)双阳性细胞，这种双阳性细胞可能出现进入FL4通道的叠加溢出。这种叠加溢出可能转化成叠加测量误差。可以说明这种误差的来源。举例来说，可将促成总体数据扩散的每一种贡献估计为线性值，再求这些线性值的总和。然后可将该结果再次转化成对数值。此外，数据库可包含有关同一细胞表面上可能表达的抗原的信息。可依据这种信息为FL3阳性群体选择哪些溢出信号加以组合。因此，可能有染料(如PE)还溢入FL4通道中的情况，然而，与此类染料相关联的抗原可能不会在FL3+的同一类型细胞上表达，因而不会促使该通道的总测量误差增大。
根据一些实施例，细胞类型、表达模式或表达图谱可能对结果有影响。例如，结果可能取决于抗原在细胞上的表达模式，以及抗体染料缀合物探针识别抗原的模式。因为一些染料有溢入次要通道的可能，所以每种荧光素的检出限都可能受影响。在某些存在溢出的情况下，处于刻度负值范围内的群体可能出现扩散或失真，且检出限可能增大。通常情况下，每种细胞类型的特定表达模式都是唯一的。例如，不太可能出现两种不同的细胞类型具有相同表达模式的情况。为了估计检出限增大量，确定哪些荧光信号将存在于细胞上可能有用。因此，本文所论述的技术涵盖确定用于评估探针面板的表达模式的技术。
图8中的图形描绘了使用缀合有PE染料的CD4抗原特异性抗体执行染色规程获得的结果。如此处示出，FL3检测通道(对ECD染料发射敏感)正在记录溢出，因而记录源自PE荧光素的背景失真。
例如，考虑CD3和CD4阳性的辅助型T细胞可能有帮助。在一些情况下，可能有利的是评估该细胞，观察其中是否有细胞因子受体，例如CD25(IL-2受体)或CD184(CXCR4)。细胞因子受体往往只有低拷贝数，因此，只在细胞表面上呈暗染(dimly staining)。因此，如果期望利用FL3(ECD)通道评估细胞因子受体染色情况，那么向PE通道指派辅助型T细胞标记物(例如CD4)可能并不合适。这是因为用PE标签染色的CD4+细胞会导致期望在其中检测细胞因子的FL3(ECD)检出限增大。
如图8所描绘，存在与CD4-群体检出限和CD4+群体检出限的差异有关的检出限增大。Y轴下段的线通过限定阴性群体来划定CD群体的界限。该特定坐标图描绘了显著量的溢出，和由其导致的从PE发射光谱至ECD检测通道的背景失真。检出限的增大因而相当显著。将此结果与坐标图左侧的阴性群体相比，可以看出损失了大量灵敏度(例如一个十进位的约一半)。因此，用ECD标签能在CD4+群体上检测到的拷贝数需要是用该标签能在CD4-群体上检测到的拷贝数的几倍(如6倍)高(例如信号更明亮)，这样才能检测到CD4+群体或将其记录为阳性事件。
在相关例子中，考虑不同的检测通道(例如被设计成检测来自PC7染料的发射光谱的FL5通道)是有用的。在该例子中，FL5通道检测比PE荧光素的发射波长更远的特定波长。因此，溢入FL5通道的PE发射光谱减少，故而转折线的斜率(例如，如图8所示)变小。换句话说，进入特定通道的溢出量越少，与该通道相关联的转折线的斜率(例如，如图8所示)越小。
特定波长值是可能影响结果的另一种参数。与特定PMT或检测器相关联的波长范围通常至少部分地由滤光片前方的带通滤光片决定。通常情况是，正被特定PMT检测的波长越大，PMT的灵敏度越低，因而PMT的固有误差(intrinsic error)越大。举例来说，PC7检测通道可被配置成检测大于755nm波长的光，而PE检测通道可被配置成检测575+/-15nm波长的光。因此，与PC7通道相关联的失真可能更大。可将这些影响纳入数据库或表格。可能考虑到的另一种因素涉及溢入次要通道的光量。例如，考虑通常会溢入另一次要通道的特定染料发出的光量可能有用。可考虑到与固有测量误差有关的次要通道性质，此性质可能取决于波长。
如图8所描绘，失真度由转折线的斜率(检出限)提供。失真度可能以强度参数(例如PE染料信号的强度)为基础。此外，次要通道在Y轴上的波长越大，斜率可能就越大。因此，失真度可能随波长增大而增大。在一些情况下，PE信号的强度可能也有这种现象。例如，溢出到ECD通道的PE的失真度可能不同于溢出到红外通道的PE的失真度，因为红外通道的失真度会更大。相关地，因为红外通道的光谱距离可能比PE通道大，所以溢出的光量可能较少。通常情况下，PMT检测器能够提供良好的线性范围，因而可使用线性方法。总失真度可能接近检出限增大量，或与检出限增大量相关联。如图8所示，失真度可以是象限转折线的斜率，因此检出限可用线性方式确定。
在计算检出限的一个实施例中，可以获得(i)X轴上的X值和(ii)失真度或斜率，由此得到Y值或检出限。
例如，可以提供将溢出的信号的相对表达密度FL(x)(例如，基于CD4抗原密度)，可由经验数据获得该值。还可以提供(例如)PE标签的相对表达荧光素强度FL(x)，该强度与荧光素的亮度对应。
示例性经验方法可能涉及用CD4-PE探针对T细胞群体进行染色，以及评估阳性群体(例如，与阴性群体分隔2.5个十进位)。可用这些数据产生结果表格。
因此，通过输入X值(例如，依据典型表达密度和染料亮度进行估计)以及斜率或线性关系，就可以确定Y值或检出测。在考虑包括多种抗体-染料缀合物的探针面板时，可能获得提供溢出至FL3通道的每一种标签的失真度。结果可能由于选择的染料不同而有变化。举例来说，CD4-PE探针可能提供较大程度分离，而CD4-FITC探针可提供较小程度分离。
在一些情况下，可将结果值线性化再加总，随后把线性化值的总和转化成对数值，以便获得对数距离。可向每种染料应用不同的失真度。此外，阳性群体和阴性群体可能有不同的信噪比。
根据一些实施例，在使用给定缀合物组合的情况下，对于CD-Y群体来说(CD-Y是正用单条通道测量的所关注特异性抗原)，对“未激活”信噪比(S/N)距离的估计值可由下式给出：
FL(y)＝相对表达密度FL(y)*相对荧光素强度FL(y)
在标记物经调变的情况下，可将S/N距离FL(y)设定为零(0)。在使用给定缀合物组合的情况下，对每一个别CD-X群体来说，来自一个或多个CD-X群体且导致用于测量CD-Y的通道失真的溢出估计值可由下式给出：
失真FL(x)->FL(y)＝失真度FL(x)->FL(y)*实际表达密度FL(x)*实际荧光素强度FL(x)
在CD-X是CD-Y的亚群，或者CD-Y是CD-X的排除标记物的情况下，可将FL(x)进入FL(y)导致的S/N失真设定为零(0)。来自具有多条通道(例如，总共10条通道，因此有9条CD-X通道)的系统的每条通道的失真可按下式累加：
FL(x)->FL(y)_tot＝logΣ10^(FL(x；1…9)->FL(y))
可针对系统中的每条通道，针对每种所关注抗原分别执行一组估计和汇总，以便能够按下式计算每种抗原的有效S/N距离：
有效S/N距离＝FL(y)–FL(x)->FL(y)_tot
可使用每条通道中每种抗原的有效S/N距离来进一步确定整个系统和面板的检出限。
根据一些实施例，荧光成员CD-Y(用FL(y)表示)的特定阳性的检出限(DL)是来自荧光成员CD-X(用FL(x)表示)的阳性溢出的逼近线性函数，等式如下：
DL(FL(y))＝DLIC(FL(y))+256*(DF(FL(x)->FL(y))*RI(FL(x)))
其中DLIC(FL(y))被定义为由介于0和1023之间的坐标指出的同种型对照染色的CD-Y荧光检出限；RI(FL(x))被定义为由FL(x)的十进位指出的位于DLIC(FL(x))上方的CD-X荧光强度；DF(FL(x)->FL(y)被定义为失真度，由每RI(FL(x))的DL(FL(y))增大量测得，表示为十进位FL(y)除以十进位FL(x)。
在一些方面，DF(FL(x)->FL(y))可根据以下等式，由阳性/阴性补偿程序计算并与关联：
DF(FL(x)->FL(y))＝(FL(y,x)*FLIC(x))/(FL(x)*FLIC(y))
其中FL(y,x)被定义为FL(x)阳性事件的FL(y)强度，并且其中FLIC(x)和FLIC(y)被定义为它们的相应抗原的同种型对照染色的强度。来自CD-X成员的溢出补偿强度的累积效应，即进入CD-Y的FL(x1,x2,…x(n-1))，可由下式给出：
总DL(FL(y))＝DLIC(FL(y))+256logΣ10^((DF(FL(x1,x2,…x(n-1))->FL(y)*RI(FL(x1,x2,…x(n-1)))))
这些计算在图1D的第二段落中也有描述。
根据一些实施例，可为每位患者提供针对散射群体或“沉默”染色(白细胞)群体设门的同种型对照数据。在其他实施例中，可针对每次应用(或针对每个面板)用阳性/阴性算法产生补偿数据，在这种情况下，可以建立用于计算失真度的数学程序或实验程序。在另外的实施例中，可基于同种型数据和/或补偿数据产生失真矩阵。在补偿之后，可将失真矩阵应用于每一个事件。在一些实施例中，单是知道补偿因数可能还不足以完成本文所述的计算。在其他实施例中，可利用给定的仪器或仪器配置以及一组染料进行实验，由此确定失真矩阵。知道了失真矩阵，就可能足以完成本文所述的计算。在另外的其他实施例中，特异阳性设门得到的值能够例如采用以下方式显示：分光图(prism)、树状图(tree)、三维叠加、比较图、轮廓图等。
参见图8，可以看出技术可涉及输入或选择X轴的值，该值对应于表达密度乘以荧光强度。这种数据可以在抗体表格模块中执行(还可从抗体表格模块读取或检索)，如在本文别处所论述。在一些情况下，这种数据值可能是估计值。在一些情况下，这种数据值可能以实验数据为基础。例如，可以分析CD4-PE染色实验来获得这种数据。此外，方法可涉及将失真度乘以标记物的(实际或估计的)强度。在一些情况下，表达密度或标记物模式(例如，就目标细胞而言)可能具有默认参数或默认值。这种信息可以在抗体数据库模块中执行。如在本文别处所描述，图1D的第二段落提供了示例性检出限计算的补充细节。
如图9所描绘，检出限增大可能与补偿因数和/或PMT电压无关。而是，检出限和/或检出限的增大量可能取决于发射光谱和滤光片配置。如图所示，可定制描绘结果方式的配置，结合来自独立PMT通道的传感器读数将失真移除(或换句话讲，施加补偿因数)，其中失真可能是来自所需PMT的被不正确测量的传感器读数形成的。具体地讲，图9显示了从ECD通道获得的检测结果，其中从检测结果减去了来自PE通道的传感器读数百分比。示出了PE通道减法运算的三种示例性变型形式：第一种减去了34％的PE通道信号，第二种减去了46％的PE通道信号，第三种减去了62％的PE通道信号。在检出限结果的每个图形中，被识别为阳性改变或阴性改变的事件数量不同，但是两种相比较的群体之间的检测转折线保持不变。移除失真提供了准确度和灵敏度都较高的结果集合。
图10示出了根据一些实施例的与某些染料有关的示例性溢出模式失真矩阵的某些方面。溢出可能不取决于PMT设置和补偿因数，并且可能取决于荧光素、滤光片和对准精度。在如图所示的各方面中，溢出矩阵可能是定性矩阵，用于在界面上向操作者快速显示选用特定染料或PMT检测器的效果。
图11示出了根据一些实施例的共表达矩阵的某些方面。在如图所示的各方面中，共表达矩阵可能是定性矩阵，用于在界面上向操作者快速显示选用特定抗原、染料或PMT检测器的效果。如图11所示，共表达矩阵可以指示以下情况的相互作用：列与行非排他性表达，列是行的排他性亚群，列与行互相排除(提供表达事件的对称图形)。
图12A描绘了根据一些实施例对示意性染色模式的估计。如果存在特定标记物溢入另一通道的阳性率，便可以观察到转折，如右图所示。用户可以改变对模拟的某些输入，以便改变显示的输出。举例来说，用户可以选择或改变包含在探针面板中的各种染料或抗体，以便改善特定共表达抗原的灵敏度。图12A的中图示出的情形尤其可取，因为与FL(x)阴性群体相比，FL(x)阳性群体的检出限不受FL(x)阳性率影响。
图12B描绘了根据一些实施例的可变PE检出限信号。图12B的PE信号可能与图12C描绘的水平方向对应。也就是说，图12B中显示的溢出也可能在图12C中显示，导致可变PE检出限取决于溢出染料的荧光强度，其中溢出染料的荧光强度沿着Y轴缩放。相比之下，在图12D中，溢出抗原已移动到其没有向PE通道施加溢出的位置(例如，CD45从用蓝色激光激发的ECD移动到用具有极强信号的红色激光激发的APC处)，结果是CD45-APC信号不影响PE通道的背景。另外，PE荧光团和APC荧光团是用不同激光波长激发的。这些未溢出的情形可能很罕见，尤其是采用多色(如十色)面板配置时，原因是通常情况下，影响各通道检出限的细胞上也会有荧光标签。
在图12E中，抗原Y在抗原X阳性细胞上高度灵敏表达。如果表达抗原Y的优先程度高，这可能是理想的情形。在比较阴性群体和阳性群体的情况下，不改变检出限。FLx群体的检出限对于FLy群体来说是低检出限。根据一些实施例，图12E可以指涉及高度表达非排他性共表达抗原的细胞的特殊情形，这些细胞有被特异性检测到的风险。在一些情况下，参考图12C的无注释双联体可能有帮助。
相比之下，在图12F中可以看出，在细胞上检测到抗原X标签牵涉影响FLy检出限的荧光素发射。还示出了群体重叠。相比之下，图12E中不存在这种重叠(或者说图12C的无注释双联体)。因此，一旦用户获得诸如图12E中描绘的那些结果，便可决定选择这种特定探针面板继续。相比之下，如果该共表达模式的优先程度高，那么获得诸如图12F中描绘的那些结果的用户便可以决定不选择这种特定探针面板继续。
图12G(以及图12C的无注释双联体)描绘了示出双阳性事件的双变量点图。图12H描绘了其中不存在双阳性事件的类似双变量点图。图12H的图代表排除的结果。
图12I描绘了其中不存在双阳性事件的另一种排除情形，该情形可向用户呈现合意的结果。考虑到排除抗原2的抗原1为阴性，可以看出这两种抗原不会存在于同一类型细胞上。因此，有兴趣评估细胞上的抗原2(通过左下象限表征)的用户可观察到无偏倚的检出限。用户不会看到表达抗原2的细胞，原因是归因于细胞的生物学特征，不存在双阳性群体。双阳性群体因而可能不是要分析的目标群体。然而，抗原2阳性(AG2-POS)和抗原2阴性(AG2-NEG)的分别可能是分析目标。类似地，抗原1阳性(AG1-POS)和抗原1阴性(AG1-NEG)的分别也可能是分析目标。遇到这些情形中的每一种，检出限不会改变。
因为不但X阳性细胞上没有抗原Y表达，Y阳性细胞上也没有抗原X表达，所以右上象限未填充。
图13描绘了根据一些实施例的探针面板评估系统和方法的某些方面。在一些情况下，可基于各种标准将表达模式分类。例如，在一些实施例中，可将表达模式分类为正常、淋巴细胞增殖，或者未成熟血细胞紊乱。如此处示出，可考虑表达模式的各种因素，例如荧光强度等。在一些情况下，图13的上面表中用于识别表达特征的细胞可标注“1”来代表标记物共表达，标注“0”来代表不存在标记物共表达。在一些情况下，图13的下面标中也用于识别表达特征的细胞可标注“0”来代表后代至亲本标记物共表达，标注“1”来代表不存在后代至亲本标记物共表达。因此，可使用该数据来指示荧光素标签可能会或是可能不会造成第二荧光团标签的检出限增大。例如，在不存在共表达的情况下，则可能无需考虑细胞上的荧光标签。也就是说，由于同一细胞上不存在共表达，故不会产生溢出信号，因而不会出现检出限增大的情况。如在本文别处所论述，本发明的实施例涵盖其他表达模式诸如亲本-后代模式的各方面。可使用表达模式信息来确定特定通道有关具有特定表达模式的特定群体的测量误差是否会有效增大。相关地，可使用表达模式信息来估计或确定失真，并/或进行重叠。在一些情况下，示例性表格说明溢出的来源，以便提供组合的失真结果。
图14描绘了根据一些实施例的探针面板评估技术(尤其是数值模拟技术)的某些方面。图14提供的表格部分地显示被一种或多种激发激光激发并在FL-通道(即PMT通道)中检测的各种荧光素的相对贡献。这些相对贡献提供了校正，移除与用另一PMT检测器和通道测量的荧光素有关的由给定PMT不合意地测得的参数或事件的基础。可计算有效失真矩阵，利用该矩阵确定激发激光、荧光素和PMT检测器的任意给定组合的此类相对贡献。
图15描绘了根据一些实施例的探针面板评估技术(尤其是溢出模式技术)的某些方面。图15提供的表格部分地显示给定荧光素相对组中单一荧光素的相对亮度，组中单一荧光素被选择为该染料面板的100％亮度或强度参考物。可将溢出模式和相对亮度进一步分类为产生特定失真水平，以便指明特定荧光素成员在影响用相关PMT检测器检测其他荧光素方面的相关性。可使用这些值，针对通道或染料的每种给定组合，计算每十进位失真信号强度的检出限增量。
图16A示出了根据一些实施例的探针面板系统的示例性方案。如此处所描绘，该系统包括模拟器图形模块、模拟器数值模块、溢出模式模块和抗体数据库模块。模拟器图形模块可供用户输入期望抗体面板的各方面，用于以图形方式输出模拟结果，以及用于修改默认模拟参数。模拟器数值模块可用于以数值方式输出模拟结果。溢出模式模块可用于根据标准滤光片组设置荧光素性质和失真度的默认模拟参数。抗体数据库模块可用于设置抗原表达密度、共表达模式和亲本-后代方案的默认模拟参数。
在一些情况下，例如，如图13所示，模拟器图形模块可被配置成实现与抗体面板相关的用户输入、显示与抗原共表达有关的默认数据(例如，“可能与下列抗原共表达/可能会关注与下列抗原共表达”)、显示与亚群共表达有关的默认数据(例如，“(显著表达)细胞不是下列抗原的(排除性)亚群”)、显示与高于阳性-阴性阈值的缀合物十进制平均信号强度有关的预估数据，以及以图形方式输出模拟结果。
图16B和图16C描绘了根据一些实施例的探针面板用户输入模块的某些方面。在用户输入抗原特异性之后，便可从抗体数据库模块检索相应的物料编号(PN)，随即在用户输入栏下方的栏中显示这些物料编号。用户可以为未占用通道输入哑指定。如果无法从抗体数据库的常备库中获得抗体-缀合物，并且尽管抗体缀合到除需要的染料标签外的那些染料标签，但仍可获得抗原特异性，便可以指定获得诸如定制设计服务(CDS)。
图16D描绘了根据一些实施例的模拟器图形模块的某些方面。如此处示出，系统可提供对有关抗原共表达的默认数据的显示(例如，“可能与下列抗原共表达/可能会关注与下列抗原共表达”)。在一些情况下，与表达模式对应的来源范围(例如，正常、淋巴细胞增殖或白血病)可通过输入0、1或2来切换或选择。用户提供的特异性可被显示为(例如)列标头和行标头。在一些实施例中，可将系统配置成接收用户的输入来覆盖默认数据。在一些实施例中，如果需要或期望，用户可重写表格的条目。在一些情况下，可从抗体数据库模块检索共表达数据(例如默认条目)。如此处指示，值“1”可代表“真”，此时存在共表达，而且共表达值得关注。相关地，值“0”可代表“假”，此时抗原不发生共表达，或者抗原共表达不值得关注。这种共表达数据可存储在抗体数据库模块中，并可从该模块检索。空白栏沿对角轴对称。
图16E描绘了根据一些实施例的模拟器图形模块的某些方面。如此处示出，系统可提供对有关抗原的亲本-后代关系的默认数据的显示(例如，“(显著表达)细胞不是下列抗原的后代群体”)。同样，来源范围可通过输入0、1或2来切换。如此处进一步显示，根据用户输入的抗原特异性可被显示为表格中的列标头和行标头。在一些情况下，如果需要或期望，用户可重写条目。在一些情况下，可从抗体数据库模块检索亲本-后代数据(例如默认数据)。值“1”可代表“真”，此时阳性细胞(列抗原)不是后代群体，因而造成行抗原通道内的失真。值“0”可代表“假”，此时阳性细胞(列抗原)是后代群体，因而不造成行抗原通道内的失真。例如，根据此处示出的表格，lambda不是kappa的后代，而FMC7是CD19的后代。根据一些实施例，FMC7还可能是kappa阴性。
图16F描绘了根据一些实施例的模拟器图形模块的某些方面。如此处示出，不同的曲线或线条可能对应不同的激发波长。这里的波长为488nm、638nm和405nm。用实线连接起来的圆圈与最复杂表达模式的背景对应。用虚线连接起来的正方形与缀合物的预期最低荧光强度对应。用点线连接起来的三角形与缀合物的预期最亮荧光强度对应。每一个别指示符(即，圆圈、正方形或三角形)位于与特定带通滤光片或检测通道范围的中心波长对应的X轴值上方。Y轴代表荧光强度的头四个对数十进位，其中阴性群体以最下方的十进位为中心。如在本文别处所论述，对于具有离散表达特征的抗原来说，虚线和点线在相应的X轴位置(带通波长)重合。此外，如在本文别处所论述，可以基于各种指示符之间的距离来对各种探针面板设计进行排序。例如，可基于三角形(点线)和圆圈(实线)之间的最大距离，还可基于正方形(虚线)和圆圈(实线)之间的最小距离，来对探针面板设计进行排序。
在一些情况下，排序可能涉及优先排列与复杂溢出模式对应并与微弱表达抗原相关联的探针面板。
图16G描绘了根据一些实施例的模拟器图形模块的某些方面。在这里，特定检测通道的全部失真贡献的显示内容位于每一个别通道上方。圆圈或气泡可根据相应的溢出荧光素来编码(例如，用颜色编码)。Y轴上的值或截距指明相应通道中的缀合物所引起的以十进制为单位的检出限绝对增量。例如，Y轴可代表以十进制为单位的背景增量，其中0.00是第一十进位和第二十进位之间的阈值(例如，阴性群体以第一十进位为中心)。圆圈的直径可能代表缀合物对相应通道的总背景失真的相对贡献。如在本文别处所论述，处理例如给定特定通道上最大圆圈的位置，可能有助于降低该通道的背景失真。在一些情况下，最小化或减少用于检测调变抗原的通道的圆圈的数量可能有帮助。
图16H描绘了根据一些实施例的模拟器数值模块的某些方面。如此处示出，表格包含按每种溢出缀合物(列标题)和失真通道解析的所有绝对失真的值，还示出了主通道中的溢出荧光素的每十进位信号强度以十进制为单位的背景增量。此外还包含涉及对总背景失真的最大贡献的大小的列和涉及背景总失真的列。叠加列指明根据位置参数的阳性-阴性阈值的1024个单元的图形比例中的象限或区域位置。还示出了有关背景失真的图形表示的源数据。
根据一些实施例，可基于下式确定单一溢出缀合物引起的绝对失真：
(缀合物强度)*(失真度)*(共表达指数)*(亲本-后代指数)
根据一些实施例，缀合物强度可以十进制为单位表示，并且可基于抗原密度和荧光素亮度，或通过使用关于缀合物强度的经验数据被确定为估计值。
根据一些实施例，可基于下式确定给定通道内的总失真：
LOG10(每种缀合物引起的线性化绝对失真的总和)
根据一些实施例，阳性-阴性阈值区域/象限位置可根据下式确定：
(总失真的十进位)*(256)+256
其中256是第一十进位和第二十进位之间的图形阈值，假设阴性群体是由该图形阈值圈定的。
图16I描绘了根据一些实施例的模拟器数值模块的某些方面。此处示出的表格包含按每种串扰缀合物解析的线性相对失真贡献(列标题)和以十进制为单位的失真通道。该表格可提供有关背景失真的图形表示的源数据(例如，图形，“失真贡献”)。表格值可基于下式获得：
图16J描绘了根据一些实施例的溢出模式模块的某些方面。此处示出的表格包含失真度，这些失真度可按每十进位的串扰(即溢出)荧光强度施加，要么可做实验确定，要么可基于下面的近似公式确定：
失真度＝[串扰指标]*[带通温度因数]
图16K描绘了根据一些实施例的溢出模式模块的某些方面。本文对串扰指标的定义如下：
串扰指标＝LOG(SNR(辅助信号)/LOG(SNR(主要信号)；
其中：SNR＝信噪比＝MFI(阳性群体)/MFI(阴性群体)；
并且其中MFI＝平均荧光强度。
图16L描绘了根据一些实施例的溢出模式模块的某些方面。如此处示出，对于525nm(FITC)来说，绝对失真可根据下式计算，其中DF(失真度)与CI(串扰指标)的比率为0.15：
绝对失真＝0.15×LOG(SNR(辅助))
也就是说，每十进位的辅助信号强度存在0.15个十进位的失真。同样如此处示出，对于660nm(APC)来说，绝对失真可根据下式计算，其中DF与CI的比率为0.42：
绝对失真＝0.42×LOG(SNR(辅助)
也就是说，APC通道(660/20带宽)中每十进位的辅助信号强度存在0.42个十进位的失真。
图16M和图16N描绘了根据一些实施例的抗体数据库模块的某些方面。图16M中的表格包含抗原表达密度数据(例如，根据CD8-PE＝阳性-阴性阈值上方2.5个十进位强度进行缩放)、物料编号数据和表达特征数据(例如，0＝调变，1＝离散)。图16N中的表格包含共表达模式的数据(例如，“可能与下列抗原共表达/可能会关注与下列抗原共表达”)。如此处示出，表格沿其中的对角单元对称。
图16O描绘了根据一些实施例的抗体数据库模块的某些方面。在一些实施例中，抗体数据库模块可能包含与亲本-后代模式有关的信息(例如，“(显著表达)细胞不是下列抗原的后代群体”)，并且可能是不对称的。根据一些实施例，这种数据库信息可包括估计值。根据一些实施例，这种数据库信息可包括实验值。
图17描绘了根据一些实施例的用于对溢出模式进行建模的数值方法的某些方面。如此处示出，评估溢出模式可能涉及用于处理多变量数据集的雷达检测方法。如图17所示，当抗原以其面板设置1702排列时，多变量雷达图示可根据抗原的检测通道显示抗原检出限。如第一图层1704所示，检测雷达的每一辐射轴表示从所测信号的第三十进位至第六十进位的荧光通道，每一十进位是20个位元的区段。第一内部阴影部分1706表示假设同种型对照的中心在第三十进位处时，未激活的检出限在该十进位内或者低于该十进位。如第二图层1708所示，第二内部阴影部分1710从第一内部阴影部分1706向外延伸，其中第二图层1708表示每一荧光通道的估计背景失真。形成第二内部阴影部分1710的估计失真的值是基于给定的缀合物组合，根据所述缀合物组合的溢出模式、相对荧光素强度、抗原密度、共表达矩阵和失真矩阵获得的。
第三图层1712还包括下限1714，该下限1714表示每一缀合物的期望荧光强度下限。所有调变或集中表达被设置为零，以作为期望荧光强度的下限1714的组成部分。第四图层1716还包括上限1718，该上限1718表示每一缀合物的期望荧光的上限。特定抗原和染料的离散表达对于期望荧光强度具有相等下限1714和上限1718值。
图18A和图18B示出了根据一些实施例，用于对溢出模式进行建模的数值方法的某些方面。如此处示出，溢出模式的评估可涉及检测雷达方法和/或失真指示符方法。在此类失真指示符图示中，每一DL可具有表示失真染料的色彩。Y轴可表示以十进制为单位的失真量，而X轴可表示每条失真的FL通道。数据点的直径(即，DL的大小)可表示单一缀合物对总体失真的相对贡献。
图19A和图19B示出了根据一些实施例，用于对溢出模式进行建模的数值方法的某些方面。如此处所示，溢出模式的评估可涉及克隆类型筛选方法，所述方法还可用多变量雷达方法表示。
当模拟本文示出的探针面板设计时，可使用所述探针面板设计来设置并操作流式细胞术设备。具体地讲，可为非瞬时性计算机可读介质的处理器或系统可接收关于流式细胞仪硬件配置的信息，关于包括多个探针的名单、名单中与相应的单通道特定检出限分别相关联的个体探针的信息，以及关于抗原共表达模式的信息。所述处理器，或者一个或多个另外的、信息上关联的处理器，可基于流式细胞仪的硬件配置、单通道特定检出限及抗原共表达模式，评估构成探针面板的个体探针的组合(该组合是探针名单的一部分)，并且还可确定与该流式细胞仪硬件配置、单通道特定检出限及抗原共表达模式使用的探针面板。最终，用于在流式细胞术程序中使用的探针面板可被输出，并由操作者用于针对流式细胞术器械和实验的探针面板设计。
用于面板设计和模拟的界面和参数选择
探针面板的确定可呈现在基于网络的界面中，以允许用户使用在线数据库和工具来设计用于流式细胞术实验的探针面板。系统和方法的具体实施例(如上文的图2至图2D中所描述)可提供给操作者，如图20A至图20F所示。系统或方法的各方面可作为单一形式、过渡形式，或者作为代表该方法中的多个步骤的多重形式提供给操作者。
图20A是允许选择硬件配置的界面屏幕2000(也被称为硬件配置屏幕2000)的示例性图像。选项卡选择2002允许在可输入数据的各个栏位之间移动，所述栏位如图所示是用于模拟面板的方法中的步骤的选项卡。选项卡标题栏2004可指示用户正查看或编辑方法的哪一步骤，该步骤在图20A中是“硬件配置”，表示为选项卡选择2002中的“步骤1”。下拉栏2006允许操作者从数据库选择所提供信息的硬件配置，以建立用于进行面板模拟的参数。硬件配置图形显示2008可向操作者显示硬件配置的细节，所述细节包括但不限于一个或多个激发激光器，该一个或多个激发激光器的激发波长，该一个或多个激发激光器的电压或其他供电数据，一个或多个PMT检测器，该一个或多个PMT检测器的电压或其他供电数据，或者该一个或多个PMT检测器的每一者的带通滤波器。在一些方面，硬件配置的选择可由数据库和系统自动决定。所选硬件配置可设置用于本文所述的面板设计和模拟的参数和值。提供了可选择的“下一步>”栏2010以用于前进到方法中的下一步骤。提供了通常可选择的“<后退”栏2012以用于前进到方法中的上一步骤，然而在所示出的硬件配置屏幕2000中，不存在上一步骤，因此“<后退”栏2012在硬件配置屏幕2000上并非是可选择的。
图20B是允许进行抗体选择的界面2014(也被称作抗体选择屏幕2014)的示例性图像。图20B中的选项卡标题栏2004的标题是“抗体选择”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤2”。多个特异性下拉栏2016允许操作者选择特异性，而多个染料下拉栏2018允许操作者选择染料。在一些实施例中，在特异性下拉栏2016中选择的特异性可为抗原或抗体选项。针对在特异性下拉栏2016中选择的每一特异性，可从所述多个染料下拉栏2018选择对应的染料。在一些方面，特异性下拉栏2016和染料下拉栏2018的选择可由数据库和系统自动确定。所选抗体可设置用于本文所述的面板设计和模拟的参数和值。提供了可选择的“下一步>”栏2010以用于前进到方法中的下一步骤。提供了可选择的“<后退”栏2012以用于前进到方法中的上一步骤。
图20C是允许进行目标表型选择的界面2020(也被称作目标表型屏幕2020)的示例性图像。图20C中的选项卡标题栏2004的标题是“目标表型”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤3”。目标群体下拉栏2022允许操作者选择与确实或者应当表达目标表型的特定抗原相关的目标群体。提供了多个“不相关抗原”2024，列出与所选的目标群体不相关联或者可不相关联的抗体和染料缀合物的选项。多个不相关抗原2024中的每一对抗体和染料包括可选择的复选框，以指示该抗体和染料对与所关注的抗原对应。提供了多个“所关注的抗原”2026，列出与所选目标群体相关或者据信与所选目标群体相关的抗体和染料缀合物的选项。该多个所关注的抗原2026的成员可用初始提供于多个不相关的抗原2024中的抗体和染料对来填充，或者可根据存储在数据库和系统中的关系数据来自动填充。特定抗体和染料对作为多个所关注的抗原2026的的成员关系可通过撤销选择针对该抗体和染料对的可选复选框来移除。在一些方面，对多个不相关抗原2024和多个所关注的抗原2026的选择可由数据库和系统自动确定。在一些方面，可提供所关注抗原整体选择栏2028，该栏具有用于选择所有抗体和染料对作为多个所关注的抗原2026的成员的可激活栏，以及用于指示所有抗体和染料对作为多个不相关抗原2024的成员的可激活栏。所选的目标表型、不相关抗原和所关注抗原可设置用于本文所述的面板设计和模拟的参数和值。虽然在图20C中未明确示出，但是提供了可选择的“下一步>”栏以用于前进到方法中的下一步骤，并且提供了可选择的“<后退”栏以用于前进到方法中的上一步骤。
图20D是允许确定相互排除抗原的界面2030(也被称作相互排除抗原屏幕2030)的示例性图像。图20D中的选项卡标题栏2004的标题是“相互排除抗原”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤4”。可提供可扩展抗原-抗体配对栏2032选项，其中当扩展时，抗原-抗体配对栏提供要排除的抗原列表2034；该列表可为可与单个栏中的抗原-抗体配对相互排除的潜在抗原的列表。要排除的抗原列表2034可具有每一所列抗原旁的复选框，以选择特定抗原来指示该抗原为被排除的，这指示：所选的一个或多个抗原并不与被确定为该栏的抗原-抗体配对的组成部分的抗原共表达。要排除的抗原列表2034还可包括一个或多个选择链接，该选择链接可使列表2034中的所有抗原被选中，或者撤销对该列表2034中的所有抗原的选择。被指示为排除的抗原可列于已确定的排除抗原列表2036中。该已确定的排除抗原列表2036可具有每一所列抗原旁的选中复选框，可撤销对所述复选框的选择来指示该特定抗原并不与给定抗原-抗体配对栏相互排除。在某些方面，要排除的抗原列表2034可由操作者选择，基于由操作者产生的基本原理选择一个或多个所列的抗原。在其他方面，该已确定的排除抗原列表2036可由数据库和系统指定；提供了可选择的“自动指定排除”栏2038，以允许操作者根据存储在数据库和系统中的数据来指示相互排除的抗原。相反地，提供了可选择的“放弃所有排除”栏2040来允许操作者撤销对所有先前指示的与一个或多个抗体-抗原配对栏相互排除的选择。所选的相互排除抗原可设置用于本文所述的面板设计和模拟的参数和值。虽然在图20D中未明确示出，但是提供了可选择的“下一步>”栏以用于前进到方法中的下一步骤，并且提供了可选择的“<后退”栏以用于前进到方法中的上一步骤。
图20E是允许确定亲本和后代抗原的界面2042(也被称作亲本和后代抗原屏幕2042)的示例性图像。图20E中的选项卡标题栏2004的标题是“亲本和后代”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤5”。提供了可扩展的抗原-抗体配对栏选择2044，当其扩展时，抗原-抗体配对栏提供后代抗原的列表2046；该列表可为后代抗原的列表，该后代抗原是被指示为单个栏中的抗原-抗体配对中抗原的亲本抗原的后代。后代抗原的列表2046可具有每一所列抗原旁的复选框，以选择特定抗原来指示该抗原为后代，这指示：所选的一个或多个抗原为相对于被指示为该栏的抗原-抗体配对中的选定抗原的分化抗原簇，是发育进程或步骤中较为后期的分化抗原簇。后代抗原的列表2046还可包括一个或多个选择链接，该选择链接可使列表2046中的所有抗原被选中，或者撤销对该列表2046中的所有抗原的选择。被指示为后代的抗原可列出于已确定的后代抗原列表2048中。该已确定的后代抗原列表2048可具有每一所列抗原旁的选中复选框，可撤销对所述复选框的选择来指示该特定抗原并非给定抗原-抗体配对栏的后代。在某些方面，后代抗原的列表2046可由操作者选择，基于由操作者产生的基本原理选择一个或多个所列的抗原。在其他方面，该后代抗原的列表2046可由数据库和系统指定；提供了可选择的“自动指定家族模式”栏2050，以允许操作者根据存储在数据库和系统中的数据来指示亲本和后代抗原关系。相反地，提供了可选择的“放弃所有家族模式”栏2052来允许操作者撤销对所有先前指示的一个或多个抗体-抗原配对栏的亲本和后代抗原关系的选择。所选的亲本和后代抗原关系可设置用于本文所述的面板设计和模拟的参数和值。虽然在图20E中未明确示出，但是提供了可选择的“下一步>”栏以用于前进到方法中的下一步骤，并且提供了可选择的“<后退”栏以用于前进到方法中的上一步骤。
图20F是允许确定抗原密度的界面2052(也被称作抗原密度屏幕2052)的示例性图像。图20F中的选项卡标题栏2004的标题是“抗原密度”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤6”。目标群体下拉栏2056允许操作者选择与特定抗原有关的目标群体，尤其是特定细胞类型或目标群体中特定抗原的密度。细胞区域中的抗原密度，或者针对细胞类型或目标群体的抗原密度，对应于该抗原的表达强度，以及该抗原可如何与其他抗原的群体相互作用或者用其他抗原的群体测量。信噪比显示区2058可指示以十进制为单位，来自目标群体及相应抗原的期望信号与背景噪声的比率。可提供离散/调变的选择栏2060，该栏可在多方面为单选按钮选择栏，以将信噪比显示区2058配置用于如上文所述，当根据离散或调变参数进行评估时，显示目标群体的表达。类似地，可提供区分选择栏2062，该栏可在多方面为单选按钮选择栏，以将信噪比显示区2058配置用于如上文所述，区分该目标群体的结果位于阳性表达和阴性表达之间，还是位于明亮阳性表达和暗淡阳性表达之间。可针对信噪比显示区2058设定滑块设置，以调节信噪比显示区2058的显示区域的比例和范围。在一些方面，该滑块设置可通过可选择的“自动设定滑块”栏2064来选择，使用抗原和目标群体呈现的数据来自动设定信噪比显示区2058的范围。在其他方面，操作者可通过手动调整滑块界面2066来指引信噪比显示区2058具有特定的比例，其中所述滑块界面2066可为单选滑块界面。所选的目标群体、离散：调变显示选项、区分选项、滑块设置以及抗原密度可设置用于本文所描述的面板设计和模拟的参数和值。虽然在图20F中未明确示出，但是提供了可选择的“下一步>”栏以用于前进到方法中的下一步骤，并且提供了可选择的“<后退”栏以用于前进到方法中的上一步骤。
图20G是显示用于给定抗原面板设计的面板表达模拟估计的界面2068(也被称为面板模拟屏幕2068)的示例性图像。输入硬件配置屏幕2000、抗体选择屏幕2014、目标表型屏幕2020、相互排除抗原屏幕2030、亲本和后代抗原屏幕2042以及抗原密度屏幕2052的信息可经提取和收集并用于计算期望的表达或染色模式。图20G中的选项卡标题栏2004的标题是“估计的染色模式”，并表示为选项卡选择2002中的“步骤7”。显示栏2070可提供针对给定面板设计所估计的抗原表达的数值和/或图形表示，包括但不限于本文所论述的图形表示。所示出的通常可选择的“下一步>”栏2010在面板模拟屏幕2068上并非为可选择的，这是因为在对应方法或评估中不存在可前进至的下一步。提供了可选择的“<后退”栏2012以用于前进到方法中的上一步骤。
在一些实施例中，基于网络的界面可向操作者呈现与某种细胞表型的各种抗原之间的关系有关的进一步细节。图21A是示例性的发育树(与地质树的形式类似)，示出了某种细胞表型的各CD成员(即抗原)之间的关系。这种发育树可示出抗原之间的亲本-子代关系，从而进一步示出抗原之间的姊妹关系、表亲关系和姑母关系。在一些方面，抗原可被识别为沿着不止一条发育路径发育，如果与其相同的抗原在发育树上出现，则可将这些抗原识别为“双胞胎”抗原。在另外的实施例中，可选择特定抗原栏，或可短暂高亮显示特定抗原栏(例如，将鼠标移至软件定义的用于代表CD成员或抗原的栏上方)，由此刺激系统进一步显示该特定抗原与发育树上的其他抗原之间的表达关系。举例来说，选择抗原栏或短暂高亮显示抗原栏可以指出有关所指示抗原的以下信息：发育树上与该选定抗原的表达互相排除的其他抗原，发育树上具有与该选定抗原相关的表达的其他抗原，发育树上具有与该选定抗原负相关的表达的其他抗原，发育树上的为该选定抗原的双胞胎的其他抗原，或者发育树上与该选定抗原以其他方式共表达的其他抗原。在其他方面，能够以列表或表格形式提供抗原之间的发育关系，如图21B中的示例性实施例所示。
使用测得的面板执行多色补偿
如上所述，还可应用预测和模拟面板表达的方法，获得或推断出来自测得的面板和样品中抗原的信号的大小和来源。可以计算出失真和共表达矩阵，然后使用它们补偿相互共表达或亲本-后代溢出，该补偿过程的多方面可通过设置恰当的设门参数来执行。在一些方面，用于激发缀合至抗体的染料的激光可能不止激发旨在激发的目标染料，且可使用补偿表格或矩阵来调整并校正这种溢出。图22A描绘了根据一些实施例的激光内补偿(intralaser compensation)的某些方面。类似地，图22B描绘了根据一些实施例的激光间补偿(interlaser compensation)的某些方面。图22A和图22B描绘了相同的补偿表格2200，该表格在列2202中示出了荧光素配置，在行2204中示出了PMT设置。补偿表格2200是用列2212中的各个荧光素身份(identities)和行2204中的PMT来确定的，且特定于选择的每种硬件配置和面板设计。图22A重点关注激光内补偿值，一种荧光素在给定激发激光波长触发下所产生溢出的这种补偿值可能会影响也被同样的激发激光波长触发的不同荧光素的PMT。相比之下，图22B重点关注激光间补偿值，一种荧光素在给定激发激光波长触发下所产生溢出的这种补偿值可能会影响被不同的激发激光波长触发的不同荧光素的PMT。
如图22A所示，被波长(λ)为405nm的激发光触发的荧光素位于FL9和FL10列中，对应检测通道位于FL9和FL10行中。如图所示，FL9检测和FL10检测分别针对Pacific Blue荧光素和Pacific Orange荧光素进行。该405nm比较图2206反映了每种荧光素的重叠区域，并用FL9和FL10行列的交叉区域表示成补偿表格2200。FL9和FL10行列交叉区域的填充内容是如上所述的用于校正失真的值或因数。类似地，被波长(λ)为638nm的激发光触发的荧光素位于FL6、FL7和FL8列中，对应检测通道位于FL6、FL7和FL8行中。如图所示，FL6、FL7和FL8检测分别针对APC荧光素、APC-Cy5或APC-A700荧光素，以及APC-Cy7或APC-A750荧光素进行。该638nm比较图2208反映了每种荧光素的重叠区域，并用FL6、FL7和FL8行列的交叉区域表示成补偿表格2200。FL6、FL7和FL8行列交叉区域的填充内容是如上所述的用于校正失真的值或因数。此外，被波长(λ)为488nm的激发光触发的荧光素位于FL1、FL2、FL3、FL4和FL5列中，对应的检测通道位于FL1、FL2、FL3、FL4和FL5行中。如图所示，FL1、FL2、FL3、FL4和FL5检测分别针对FITC荧光素、PE荧光素、ECD荧光素、PC5或PC5.5荧光素，以及PC7荧光素进行。该488nm比较图2210反映了每种荧光素的重叠区域，并用FL1、FL2、FL3、FL4和FL5行列的交叉区域表示成补偿表格2200。FL1、FL2、FL3、FL4和FL5行列交叉区域的填充内容是如上所述的用于校正失真的值或因数。
正如所料到的，可将给定荧光素和给定通道的交叉配置成不需要任何补偿值或补偿因数就能检测该荧光素，另外，这种交叉在补偿表格2200上被指示为对角线，且未用任何数值填充该补偿表格2200的单元格。
如图22B所示，荧光素还可以由波长不是被配置或设计成激发该荧光素的激发光触发。激光间补偿区域2212可包括补偿表格2200中位于激光内补偿区域以外的两个区段。激光间补偿区域2212的两个区段指明荧光素FL1至FL5的补偿值或补偿因数影响针对FL6至FL8的检测通道和针对FL9至FL10的检测通道，荧光素FL6至FL8的补偿值或补偿因数影响针对FL1至FL5的检测通道和针对FL9至FL10的检测通道，荧光素FL9至FL10的补偿值或补偿因数影响针对FL1至FL5的检测通道和针对FL6至FL8的检测通道。激光间补偿区域2212的两个区段的填充内容是如上所述的用于校正失真的值或因数。
图23描绘了根据一些实施例的用于确定失真的计算方法。具体地讲，图23显示了针对[白细胞]细胞表型使用十(10)种染料测得的荧光素表达的六张结果图。表格2301提供了能被检测到并用于开发设门参数和相关图形的抗体-染料缀合物列表，其中图23基于表格2301中的抗体-染料缀合物列表提供了对图形和设门技术的示例性选择。点图2302显示了流式细胞术系统测得的来自CD45-KrO抗体-染料缀合物的信号相对一般侧向散射光(SSC)绘制的图形。在点图2302中，第一十进位中的表达信号被认定为与[白细胞]表型相关的[白细胞]信号。剩余的五张点图是外推法的详细应用，具体操作是向第一十进位的[白细胞]信号应用信号设门技术。点图2304显示了SSC信号相对CD13-PC5.5(在针对PC5.5的PMT中测得的CD13信号)绘制的图形，并在其中标出了CD13的表达区域和表达密度。点图2306显示了SSC信号相对HLADR-PC7(在针对PC7的PMT中测得的HLADR信号)绘制的图形，并在其中标出了HLADR的表达区域和表达密度。点图2308显示了SSC信号相对CD117-APC(在针对APC的PMT中测得的CD117信号)绘制的图形，并在其中标出了CD117的表达区域和表达密度。点图2310显示了SSC信号相对CD34-APCA700(在针对APCA700的PMT中测得的CD34信号)绘制的图形，并在其中标出了CD34的表达区域和表达密度。点图2312显示了SSC信号相对CD33-APCA750(在针对APCA750的PMT中测得的CD33信号)绘制的图形，并在其中标出了CD33的表达区域和表达密度。从图23的六张点图可以明显看出，针对任何给定的抗体-染料缀合物测得的结果廓线看起来可能不同，并且任何给定抗体-染料缀合物的表达密度可能与存在于该细胞或表型中的其他抗体-染料缀合物组合的信号分离。
图24描绘了根据一些实施例的用于确定失真的计算方法。具体地讲，图24显示了针对[白细胞]细胞表型使用十(10)种染料测得的荧光素表达的六张结果图，指出了针对不同设门参数的预测检出水平的象限。表格2401提供了能被检测到并用于开发设门参数和相关图形的抗体-染料缀合物列表，其中图24基于表格2401中的抗体-染料缀合物列表提供了对图形和设门技术的示例性选择。第一点图2402显示了总SSC信号相对从针对[白细胞]细胞表型的CD34-APCA700抗体-染料缀合物测得的信号绘制的图形。指示CD34阳性事件群体的信号被识别为区域2414。剩余的五张点图反映了应用设门技术的方法。应用设门技术的目的是对照系统从其他荧光素缀合物测得的信号，识别信号是阳性还是阴性。点图2404显示了向从CD34-APCA700测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13抗原测得的阳性信号，同时保持CD33和CD117抗原阴性。点图2406显示了向从CD34-APCA700测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD17抗原测得的阳性信号，同时保持CD13和CD33抗原阴性。点图2408显示了向从CD34-APCA700测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD33抗原测得的阳性信号，同时保持CD13和CD117抗原阴性。点图2410显示了向从CD34-APCA700测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13和CD33抗原测得的阳性信号，同时保持CD117抗原阴性。点图2412显示了向从CD34-APCA700测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13、CD33和CD117抗原测得的阳性信号。
图25描绘了根据一些实施例的用于确定失真的计算方法。具体地讲，图25显示了针对[白细胞]细胞表型使用十(10)种染料测得的荧光素表达的六张结果图，指出了针对不同设门参数的预测检出水平的象限。表格2501提供了能被检测到并用于开发设门参数和相关图形的抗体-染料缀合物列表，其中图25基于表格2501中的抗体-染料缀合物列表提供了对图形和设门技术的示例性选择。点图2502显示了总SSC信号相对从针对[白细胞]细胞表型的CD117-APC抗体-染料缀合物测得的信号绘制的图形。指示CD117阳性事件群体的信号被识别为区域2514。剩余的五张点图反映了应用设门技术的方法。应用设门技术的目的是对照系统从其他荧光素缀合物测得的信号，识别信号是阳性还是阴性。点图2504显示了向从CD117-APC测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13抗原测得的阳性信号，同时保持CD33和CD34抗原阴性。点图2506显示了向从CD117-APC测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD33抗原测得的阳性信号，同时保持CD13和CD34抗原阴性。点图2508显示了向从CD117-APC测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD34抗原测得的阳性信号，同时保持CD13和CD33抗原阴性。点图2510显示了向从CD117-APC测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13和CD33抗原测得的阳性信号，同时保持CD34抗原阴性。点图2512显示了向从CD117-APC测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13、CD33和CD43抗原测得的阳性信号。
图26描绘了根据一些实施例的用于确定失真的计算方法。具体地讲，图26显示了针对[白细胞]细胞表型使用十(10)种染料测得的荧光素表达的七张结果图，指出了针对不同设门参数的预测检出水平的象限。表格2601提供了能被检测到并用于开发设门参数和相关图形的抗体-染料缀合物列表，其中图26基于表格2601中的抗体-染料缀合物列表提供了对图形和设门技术的示例性选择。点图2602显示了总SSC信号相对从针对[白细胞]细胞表型的CD33-APCA750抗体-染料缀合物测得的信号绘制的图形。指示CD33阳性事件群体的信号被识别为区域2616。剩余的六张点图反映了应用设门技术的方法。应用设门技术的目的是对照系统从其他荧光素缀合物测得的信号，识别信号是阳性还是阴性。点图2604显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13抗原测得的阳性信号，同时保持CD34、CD117和HLADR抗原阴性。点图2606显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD34抗原测得的阳性信号，同时保持CD13、CD117和HLADR抗原阴性。点图2608显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD117抗原测得的阳性信号，同时保持CD13、CD34和HLADR抗原阴性。点图2610显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从HLADR抗原测得的阳性信号，同时保持CD13、CD34和CD117抗原阴性。点图2612显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD13抗原测得的阳性信号，同时保持CD34和CD117抗原阴性。点图2614显示了向从CD33-APCA750测得的信号应用设门参数，从而进一步指示从CD34、CD117和HLADR抗原测得的阳性信号，同时保持CD13抗原阴性。
图27描绘了根据一些实施例的APC通道中的APCA700/A750失真模型的某些方面。该三维图示出了用APC通道PMT检测到的APCA750信号的不断增大的强度相对用APC通道PMT检测到的APCA700信号的不断增大的强度绘制的图形，这两种强度都是比对用APC通道PMT测得的总检出水平绘制的。位于选择的参考点处(例如在用APC通道检测到的1.00上方)的事件信号被预测或计算为阳性事件。相反地，位于选择的参考点下方的事件信号被预测或计算为阴性事件。用APC通道测得的位于最大APCA750强度和零APCA700强度点处的事件信号经历“单纯”失真，或只经历APCA750失真。相反地，用APC通道测得的位于最大APCA700强度和零APCA750强度点处的事件信号经历“单纯”失真，或只经历APCA700失真。如图27所示的模型能够进一步扩大尺寸，以便用于任意数目的失真荧光素。如图27所示的此类模型可用于计算，目的是移除来自失真荧光素的事件信号对由针对所需荧光团的通道和PMT记录的测量结果造成的影响。
图28描绘了示例性失真表2800，该表类似于结合图22A和图22B所述的失真表2200。从失真表2800可以看出，系统可以特异性地识别面板使用的(或者说面板设计模拟过程中使用的)特定染料。类似地，可以特异性地识别测量发射的仪器所用的(或者说面板设计模拟过程中使用的)硬件的PMT通道检测器的带通滤光片性质。在某些方面，对PMT通道的染料进行分组可以建立在针对给定染料的激发激光的波长基础上，然而，失真表的显示内容却可能以任何对操作者来说有用或适用的顺序呈现失真值分组。在比较两个失真表即失真表2200和失真表2800时，可以明显看出，用于任何特定硬件配置或面板设计的PMT检测器和染料的特性能够改变用于执行校正计算的失真值。
图29是标识目标抗原2902、染料2904和用于激活所认定染料的激发激光器2906的示例性布置的表格2900。如图所示，激发激光器2906的作用是激发相应的染料2904，这些染料3004与它们的目标抗原2902缀合。在某些方面，使用此类布置采集的经补偿数据可经由软件如Kaluza 1.2 beta导出至处理器和可操作系统或程序，诸如以20位元表格的形式导出到Excel工作表中。可针对每一事件单独地计算阳性和阴性事件分类，尤其在特异性评估的是抗体-染料缀合物的情况下。图29A至图29E描绘了根据一些实施例的实际数据的某些方面，这些数据是使用图29示出的目标抗原2902、染料2904和激发激光器2906布置得到的。
图29A描绘了根据本发明的一个实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，在向流式细胞术仪器所采集的CD62L-FITC相对CD4-PacBlue事件信号2902应用设门技术后的事件数据绘图结果。绘制的CD62L-FITC相对CD4-PacBlue(商标为Pacific Blue)事件信号2902显示了正交的差异，该差异反映了被评估的未激活通道。因此，可将所有事件的群体分类为以下不同事件群体：CD62L-FITC和CD4-PacBlue阴性群体2904、CD62L-FITC阳性和CD4-PacBlue阴性群体2906、CD62L-FITC阴性和CD4-PacBlue阳性群体2908，以及CD62L-FITC和CD4-PacBlue阳性群体2910。
图29B描绘了根据本发明的一些实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，在向流式细胞术仪器所采集的CD117-PE相对CD45RA-ECD事件信号2912应用设门技术后的事件数据绘图结果。因此，可将所有事件的群体分类为以下事件群体：CD117-PE和CD45RA-ECD阴性群体2914、CD117-PE阳性和CD45RA-ECD阴性群体2916、CD117-PE阴性和CD45RA-ECD阳性群体2918，以及CD117-PE和CD45RA-ECD阳性群体2920。绘制的CD117-PE相对CD45RA-ECD事件信号2912示出至少一个影响个体事件被分类为阳性或阴性的“转折”，该“转折”反映了被评估的通道。可以在事件2914的群体和事件2920的群体之间的区域中识别出第一转折，同时可以在事件2916的群体和事件2920的群体之间的区域中识别出第二转折。这些结果能够进一步反映不同群体的变异系数(CV)的多重叠加。
图29C描绘了根据本发明的一些实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，在向流式细胞术仪器所采集的CD69-PC5相对CD45RA-ECD事件信号2922应用设门技术后的事件数据绘图结果。因此，可将所有事件的群体分类为以下事件群体：CD69-PC5和CD45RA-ECD阴性群体2924、CD69-PC5阳性和CD45RA-ECD阴性群体2926、CD69-PC5阴性和CD45RA-ECD阳性群体2928，以及CD69-PC5和CD45RA-ECD阳性群体2930。绘制的CD69-PC5相对CD45RA-ECD事件信号2922示出至少一个影响个体事件被分类为阳性或阴性的“转折”，该“转折”反映了被评估的通道。可以在事件2924的群体和事件2930的群体之间的区域中识别出第一转折，同时可以在事件2926的群体和事件2930的群体之间的区域中识别出第二转折。这些结果能够进一步反映不同群体的变异系数(CV)的多重叠加。
图29D描绘了根据本发明的一些实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，在向流式细胞术仪器采集的事件数据应用设门技术可能没有效果或者不可行的情况下的事件数据绘图结果。具体地讲，示出了从流式细胞术仪器针对CD69-PC5相对CD16-APCA750事件信号2932采集的事件数据的绘图结果。因此，可将所有事件的群体分类为以下事件群体：CD69-PC5和CD16-APCA750阴性群体2934、CD69-PC5阳性和CD16-APCA750阴性群体2936、CD69-PC5阴性和CD16-APCA750阳性群体2938，以及CD69-PC5和CD16-APCA750阳性群体2940。然而，绘制的CD69-PC5相对CD16-APCA750事件信号2932并未示出能够限定“转折”从而将单个事件相对于评估通道可靠分类为阳性或阴性的明确区域。这些结果能够反映不同群体的变异系数(CV)的多重叠加。因此，在一些方面，可认为CD69-PC5相对CD16-APCA750的组合分析不适用于设门，应当在进一步分析或面板设计中避免。
图29E描绘了根据本发明的一些实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，在向流式细胞术仪器采集的事件数据应用设门技术可能没有效果或者不可行的情况下的事件数据绘图结果。具体地讲，示出了从流式细胞术仪器针对CD69-PC5相对CD56-APC事件信号2942采集的事件数据的绘图结果。因此，可将所有事件的群体分类为以下事件群体：CD69-PC5和CD56-APC阴性群体2944、CD69-PC5阳性和CD56-APC阴性群体2946、CD69-PC5阴性和CD56-APC阳性群体2948，以及CD69-PC5和CD56-APC阳性群体2950。然而，绘制的CD69-PC5相对CD56-APC事件信号2942并未示出能够限定“转折”从而将单个事件相对于评估通道可靠分类为阳性或阴性的明确区域。这些结果能够反映不同群体的变异系数(CV)的多重叠加。因此，在一些方面，可认为CD69-PC5相对CD56-APC的组合分析不适用于设门，应当在进一步分析或面板设计中避免。
图30是标识目标抗原3002、染料3004和用于激活所认定染料的激发激光器3006的示例性布置的表格3000。如图所示，激发激光器3006的作用是激发相应的染料3004，这些染料3004与它们的目标抗原3002缀合。
图30A描绘了根据本发明的一些实施例的实际数据的某些方面，具体地讲，流式细胞术仪器采集的事件数据的绘图结果，这些数据是使用图30示出的目标抗原3002、染料3004和激发激光器3006布置得到的。在图30A中，考虑到基于用于评估事件信号的PMT检测通道对阳性及阴性分类的整体评估结果，未使用设门技术或设门算法。特别地，示出了从流式细胞术仪器针对CD27-PC7相对CD3-PacO(Pacific Orange)事件信号3008采集的事件数据的绘图结果。可将所有事件的群体分类为以下事件群体：CD27-PC7和CD3-PacO阴性群体3010、CD27-PC7阳性和CD3-PacO阴性群体3012、CD27-PC7阴性和CD3-PacO阳性群体3014，以及CD27-PC7和CD3-PacO阳性群体3016。然而，如果没有应用本发明提出的设门技术，不同抗原-抗体缀合物事件信号的群体便可能被错归为另一事件信号群体阳性。例如，在图30A中，CD19-PC5.5阳性事件信号群体3018可能会由于CD27-PC7阳性和CD3-PacO阴性事件信号3012而被错误归类。这些结果能够再次体现不同种群的变异系数(CV)的多重叠加，并进一步反映出未使用设门技术可能出现的错误。
预测或确定检出限时可以使用和应用多种原则。例如，根据一些实施例，明亮染料可能对弱表达抗原极为奏效，而微弱染料和明亮染料可能都对强表达抗原极为奏效。另外，未激活通道可能非常适用于弱表达抗原，而沉默通道可能非常适用于强表达抗原。在一些情况下，可能有利的是考虑排除抗原之间的溢出。在一些情况下，可能有利的是避免非排他性共表达标记物之间的溢出。在一些情况下，可能有利的是考虑亚群标记物至亲本标记物的溢出。在一些情况下，如果目的是为了在阳性范围内区分，即，为了区分显著阳性事件和微弱阳性事件，可能有利的是避免亲本标记物至亚群标记物的溢出，或共表达标记物至亚群标记物或其他共表达标记物的溢出。在一些情况下，可能有利的是最小化每个检测通道的失真荧光素的数量。
本发明的各种实施例如下所示。在一些方面，本发明涉及确定在流式细胞术程序中采用何种探针面板来分析生物样品的方法，该方法包括：接收与包含多个探针的名单有关的信息，该名单中的各个探针分别与相应的单通道特异性检出限相关联；接收有关抗原共表达模式的信息；基于流式细胞仪的硬件配置、单通道特异性检出限及抗原共表达模式，评估作为探针面板的个体探针的组合，该组合是探针名单的一部分；确定用于所述流式细胞仪硬件配置、单通道特异性检出限及抗原共表达模式的探针面板；以及输出流式细胞术程序中采用的探针面板。在一些方面，该方法还可包括接收有关流式细胞仪硬件配置的信息。在其他方面，接收的有关流式细胞仪硬件配置的信息可包括有关至少一种激发激光强度、至少一种激发激光波长和至少一种光电倍增管检测通道范围的任何信息或全部信息。在另外的方面，接收的与包含多个探针的名单有关的信息还可能涉及访问具有包含多个探针的通道特异性检出限的资料库的非瞬时性计算机可读介质、操作者选择一种抗体及对应染料作为探针面板的至少一个成员、自动地从库中选择一种抗原及对应染料作为探针面板的至少一个成员以及自动地从库中为探针面板的每个成员选择一种抗原及对应染料这些操作中的任一种或全部。在一些实施例中，探针名单可能包括一个或多个哑成员。在一些方面，接收有关抗原共表达模式的信息可包括访问具有共表达关系的资料库的非瞬时性计算机可读介质。在另外的方面，评估作为探针面板的个体探针的组合可包括计算两个或更多个体探针的通道特异性检出限的任何重叠或失真。在一些方面，抗原共表达模式可包括特定细胞类型的抗原之间的共表达关系。
本发明的另外实施例可涉及确定在流式细胞术程序中采用何种探针面板来分析生物样品的系统，该系统可包括：信息输入设备；具有至少一台激发激光器和至少一台光电倍增管检测器硬件配置的流式细胞仪；存储在数据库中的探针库，探针库中的探针分别与相应的单通道特异性检出限相关联；存储在数据库中的抗原共表达模式；被配置为基于流式细胞仪硬件配置、个体探针的通道特异性检出限和抗原共表达模式评估从探针库中选出的个体探针的名单的处理器；以及对探针面板的检出限进行确定的输出设备，所述探针面板包括探针名单中的一部分探针。在一些方面，该系统的流式细胞仪硬件配置可包括最多十台光电倍增管检测器，然而在其他实施例中，流式细胞仪硬件配置可能包括不止十台光电倍增管检测器。在其他方面，该系统的流式细胞仪硬件配置还可包括最多四台激发激光器，然而在其他实施例中，流式细胞仪硬件配置可能包括不止四台激发激光器。在一些方面，其中信息输入设备可被配置成允许下列操作中的任一种或全部：操作者从探针库选择探针名单中的个体探针进行评估，操作者将个体探针的通道特异性检出限输入探针库，处理器自动地从探针库中为探针面板的每个成员选择抗体及对应染料。在另外的方面，处理器评估组合可计算两个或更多个体探针的通道特异性检出限的任何重叠或失真。
本发明的另外的实施例涉及利用流式细胞术程序分析生物样品的方法，该方法包括：使用流式细胞仪测量多个探针在生物样品中的光输出；接收有关流式细胞仪硬件配置的信息；接收与包含生物样品中使用的多根探针的名单有关的信息，该名单中的各个探针分别与相应的单通道特异性检出限相关联；接收有关抗原共表达模式的信息；为名单中的每个探针确定阳性标准和阴性标准，并基于流式细胞仪硬件配置、单通道特异性检出限和抗原共表达模式，确定名单的设门参数；以及根据确定的阳性标准、阴性标准和设门参数，评估多个探针在生物样品中的光输出。在一些方面，接收有关流式细胞仪硬件配置的信息还包括接收有关至少一种激发激光强度、至少一种激发激光波长和至少一种光电倍增管检测通道范围的信息。在一些方面，接收与包含多个探针的名单有关的信息还可包括访问具有包含多个探针的通道特异性检出限的资料库的非瞬时性计算机可读介质，和/或操作者为多根探针选择抗体和对应染料。在另外的方面，探针名单可包括一个或多个哑成员。在一些方面，接收有关抗原共表达模式的信息还可包括访问具有共表达关系的资料库的非瞬时性计算机可读介质。在其他方面，评估作为探针面板的个体探针的组合可包括计算两个或更多个体探针的通道特异性检出限的任何重叠或失真。在另外的其他方面，抗原共表达模式可包括特定细胞类型的抗原之间的共表达关系。
本发明的另外的实施例可涉及采用流式细胞术程序分析生物样品的系统，该系统可包括：操作者输入设备，操作者可利用该设备输入包含生物样品中使用的多个探针的名单；流式细胞仪硬件配置，该配置具有至少一台激发激光器和至少一台光电倍增管检测器；存储在数据库中的探针库，探针库中的各个探针分别与相应的单通道特异性检出限相关联；存储在数据库中的抗原共表达模式；被配置成评估由多个探针发出并由至少一台光电倍增管检测器检测到的光，和计算多个探针的通道特异性检出限的任何重叠和失真的处理器；以及对生物样品中存在或不存在探针进行确定的输出设备。在一些方面，该系统的流式细胞仪硬件配置可包括最多十台光电倍增管检测器。在其他方面，该系统的流式细胞仪硬件配置可包括最多四台激发激光器。在另外的方面，该系统可包括操作者输入设备，该操作者输入设备可被配置成允许操作者从探针库选择探针名单中的个体探针进行评估，或可被配置成允许操作者将个体探针的通道特异性检出限输入探针库。
本发明的另外实施例可能涉及确定在流式细胞术程序中选用何种探针面板来分析生物样品的方法，该方法包括：提供流式细胞仪硬件配置选择；提供抗体配对的多个选择；提供至少一种目标群体以供选择；提供多个抗体选择，并提供至少一种用于指示多个抗体中的某一抗体是目标抗原还是不相关抗原的选择；提供抗原-抗体配对的多个选择，并针对单一抗原-抗体配对，提供与其相互排除的抗原供选择；提供抗原-抗体配对的多个选择，并针对单一抗原-抗体配对，提供为其发育后代的抗原供选择；提供可调节抗原密度参数以供选择；以及响应于选择的流式细胞仪硬件配置、选择的多种抗体配对、选择的至少一种目标群体、选择的多种抗体、选择的至少一种抗原-抗体配对与其相互排除的多种抗原、选择的为至少一种抗原-抗体配对的发育后代的多种抗原和选择的可调节抗原密度参数等，提供对探针面板检出限预估值的显示。在一些实施例中，提供抗体配对的多个选择还可包括提供对每种抗体配对的选择，以及为每种抗体配对提供染料选择。在一些方面，提供至少一种目标群体以供选择可包括提供与目标群体的表型对应的选择。在一些方面，提供至少一种目标群体以供选择可被配置为考虑添加或移除目标群体。在一些方面，单一抗原-抗体配对与其相互排除的抗原选择可由相互排除数据库自动确定，而且单一抗原-抗体配对与其相互排除的抗原选择是自动选择的。在其他方面，为单一抗原-抗体配对的发育后代的抗原选择可由发育家族模式数据库自动确定，而且为单一抗原-抗体配对的发育后代的抗原选择是自动选择的。在一些方面，提供的可调节抗原密度参数可包括区分阳性检出限预估值和阴性检出限预估值的显示的选择，而在其他方面，提供的可调节抗原密度参数可以包括区分显著阳性检出限预估值和微弱阳性检出限预估值的显示的选择。在另外的方面，提供的可调节抗原密度参数包括显示离散或调变的检出限预估值的选择，而在另有其他方面，提供的可调节抗原密度参数包括根据探针面板的预估检出限缩放显示的选择。
可使用计算机、通信网络，或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器来执行本文描述的计算或操作中的每一种。附带计算机、通信网络或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器的示例性系统可见于美国专利申请No.13/935,154，该专利申请在此以引用方式并入。各个方法步骤可由相应模块执行，这些模块可包括被布置用于执行本文所述方法步骤的多种多样的数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任何一种。这些模块任选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件由于具有与其相关联的适当机器编程代码而适于执行这些步骤中的一个或多个，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的一部分)的模块集成到单个处理器板中或采用多种多样的集成式和/或分布式处理架构中的任何一种分到不同的处理器板中。这些方法和系统通常将采用有形介质，该有形介质体现为具有用于执行上述方法步骤的指令的机器可读代码。合适的有形介质可包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(诸如软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光学存储器诸如CD、CD-R/W、CD-ROM、DVD等上的磁记录；或其他任何数字或模拟存储介质)等。
应当理解，本文所述的流式细胞术系统可被配置为执行本发明方法的各方面。例如，系统的处理器组件或模块可以是微处理器控制模块，该微处理器控制模块被配置为从传感器输入设备或模块、从用户界面输入设备或模块、和/或从分析仪系统，任选地经由分析仪系统接口和/或网络接口以及通信网络接收细胞参数信号。在某些情况下，传感器输入设备可包括细胞分析系统(例如流式细胞仪)，或可以是细胞分析系统的一部分。在某些情况下，用户界面输入设备和/或网络接口可被配置为接收细胞分析系统(例如流式细胞仪)生成的细胞参数信号。在某些情况下，分析仪系统可包括细胞分析系统(例如流式细胞仪)，或可以是细胞分析系统的一部分。
处理器组件或模块还可以被配置为将任选地根据任一种本文公开技术处理的细胞参数信号传送到传感器输出设备或模块、到用户界面输出设备或模块、到网络接口设备或模块、到分析仪系统接口、或到它们的任何组合。根据本发明实施例的设备或模块中的每一个可包括位于被处理器处理的计算机可读介质上的一个或多个软件模块，或硬件模块，或它们的任何组合。可使用多种常用平台(诸如Windows、MacIntosh和Unix)中的任何一种，连同多种常用编程语言中的任何一种，来实现本发明的实施例。
用户界面输入设备可包括(例如)触摸板、键盘、指示设备(如鼠标)、轨迹球、图形输入板、扫描器、操纵杆、结合到显示器中的触摸屏、音频输入设备(诸如语音识别系统)、麦克风、以及其他类型的输入设备。用户输入设备还可以从有形存储介质或从通信网络下载计算机可执行代码，该代码体现为本文所公开方法或其各方面中的任何一者。应当理解，终端软件可以时常更新，还可酌情下载到终端。一般来讲，使用术语“输入设备”旨在包括用于将信息输入模块系统中的多种传统和专属的设备和方法。
用户界面输出设备可包括(例如)显示子系统、打印机、传真机、或非视觉显示器(诸如音频输出设备)。显示子系统可以是阴极射线管(CRT)、平板设备(诸如液晶显示器(LCD))、投影设备等。显示子系统还可以如经由音频输出设备提供非视觉显示。一般来讲，使用术语“输出设备”旨在包括用于从模块系统向用户输出信息的多种传统和专属的设备和方法。
总线子系统可提供用于使模块系统的各种组件和子系统彼此按预期的方式或根据需要进行通信的机制。模块系统的各种子系统和组件无需处于相同的物理位置，而是可以分布在分布式网络内的各个位置处。总线子系统可以是单条总线，也可以利用多重总线。
网络接口可提供通向外部网络或其他设备的接口。外部通信网络可被配置为根据需要或期望实现与其他方的通信。在许多实施例中，考虑到远程访问和处理，通信网络可以是基于网络或基于云的处理系统。该外部通信网络由此可以接收来自模块系统的电子数据包，并且根据需要或期望将任何信息传输回模块系统。除了提供系统内部的此类基础结构通信链接之外，通信网络系统还可以为诸如互联网之类的其他网络提供连接，并且可以包括有线、无线、调制和/或其他类型的接口连接。
本发明中所讨论的所有专利、专利公布、专利申请、期刊论文、书籍、技术参考文献等全文以引用方式并入本文中以用于所有目的。
应当理解，已对本发明的附图和描述进行了简化，以便示出与清楚地理解本发明相关的要素。应当理解，提供附图是为了进行示意性说明，这些附图不作为施工图提供。省略的细节和修改或替代实施例在本领域的技术人员的认知范围内。
应当理解，在本发明的某些方面，可用多个部件来替换单个部件，并且可用单个部件来替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一种或多种功能。除了这种替换不能有效实施本发明的某些实施例的情况之外，认为这种替换属于本发明的范围。
本文提供的实例旨在举例说明本发明的一些可行的特定具体实施方式。应当理解，这些实例主要旨在向本领域的技术人员举例说明本发明。在不脱离本发明实质的前提下，可以修改这些示意图或改变本文所述的操作。例如，在某些情况下，可按不同的顺序执行或实施本发明的方法步骤或操作，或者可添加、删除或修改操作的内容。
在附图中描绘或上文所述的组件的不同布置，以及未示出或描述的组件和步骤也是可能的。相似地，一些特征结构和子组合是可用的，且它们可以在与其他特征结构和子组合无关的情况下被采用。出于示例性和非限制性的目的描述了本发明的实施例，且替代性实施例对于本专利的读者而言将是显而易见的。因此，本发明不限于上文所描述或在附图中描绘的实施例，并且可以在不脱离以下权利要求的范围的前提下，采取各种实施例和修改形式。
Claims (32)
1.一种设计探针面板的方法，所述探针面板用于利用流式细胞仪区分样品中的细胞群，所述方法包括：
确定量化由原本应在第一通道内测量却溢入第二通道的第一标签的发射引起的溢出效应的失真度；
确定包括第一标签和第一探针的第一探针-标签组合的最大预期信号，其中，所述第一探针结合与样品中所关注细胞群相关联的第一抗原或标记物，并且其中，所述最大预期信号是基于第一标签的亮度和样品中所关注细胞上或内部的第一抗原或标记物的预期密度确定的；
基于所述失真度和所述第一探针-标签组合的所述最大预期信号，计算所述第二通道中第二抗原或标记物的检出限增量，其中，所述检出限是阈值信号强度，其将所述第二通道中检测到的对所述第二抗原或标记物呈阳性的细胞与所述第二通道中检测到的对所述第二抗原或标记物呈阴性的细胞相区分，所述检出限增量是由于第一标签发射到第二通道中引起的溢出效应所引起的；以及
基于计算得到的检出限增量，选择所述探针面板中包括的探针-标签组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述失真度是所述第二通道中检出限增量的预估值，所述预估值是所述第一探针-标签组合的发光强度的函数。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述失真度是所述第一探针-标签组合的所述发光强度的线性函数。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二通道中所述检出限增量是测量误差增大造成的，所述测量误差是所述第一探针-标签组合的所述发光强度的函数。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述失真度是使用串扰指标计算的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中使用代表对应于所述第一探针-标签组合的抗原与对应于第二探针-标签组合的抗原的共表达模式的系数，以数学方式修改所述失真度，所述第二探针-标签组合原本应在所述第二通道内测量。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括：
确定第一种可行探针面板中的每个标签的失真度，由此计算所述第二通道中第二抗原或标记物的检出限总增量，所述检出限总增量是由溢出效应引起的，所述溢出效应由第一种可行探针面板中原本应在第二通道以外的其他通道中测量的所有标签的组合发射到第二通道中引起。
8.根据权利要求7所述的方法，其中选择所述探针-标签组合是建立在将所述计算得到的检出限总增量与所述第二通道中的预期最小信号进行比较的基础上的。
9.根据权利要求7所述的方法，还包括计算所述第一种可行探针面板中每个探针的检出限总增量。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括：
计算第二种可行探针面板中每个探针的检出限总增量；以及
将针对所述第一种可行探针面板中的每个探针计算得到的检出限总增量与针对所述第二种可行探针面板中的每个探针计算得到的检出限总增量进行比较，在此基础上选择所述探针面板。
11.根据权利要求9所述的方法，还包括：
计算第二种可行探针面板中每个探针的检出限总增量；以及
基于针对所述第一种可行探针面板和所述第二种可行探针面板中的优先探针计算得到的检出限总增量选择所述探针面板。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一通道和所述第二通道是相邻的通道。
13.一种设计流式细胞仪的探针面板的方法，所述方法包括：
确定结合第一抗原或标记物的第一探针和结合第二抗原或标记物的第二探针；
确定所述第一探针的预期最小信号；
基于与所述第二探针相关联的可行标签的亮度和对第二抗原或标记物呈阳性的细胞上或内部的第二抗原或标记物的预期密度，确定所述第一探针的第一检出限，其中，所述第一探针的检出限是阈值信号强度，其将对所述第一抗原或标记物呈阳性的细胞与对所述第一抗原或标记物呈阴性的细胞相区分；
基于与所述第二探针相关联的不同可行标签的亮度和对第二抗原或标记物呈阳性的细胞上或内部的第二抗原或标记物的预期密度，确定所述第一探针的第二检出限；
基于所述第一探针的所述第一检出限、所述第二检出限和所述预期最小信号，选择与用于所述探针面板的所述第二探针相关联的标签。
14.根据权利要求13所述的方法，其中确定所述第一检出限包括将失真度乘以旨在测量与所述第二探针相关联的所述可行标签的检测通道中的最大预期信号。
15.根据权利要求14所述的方法，其中确定所述第一检出限还包括将所述失真度乘以代表抗原共表达模式的系数。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述系数要么是1，要么是0。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述最大预期信号部分地基于目标细胞上的预期抗原密度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述最大预期信号还基于与所述第二探针相关联的所述可行标签。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述最大预期信号部分地基于抗原共表达模式。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一探针原本应在第一通道内检测，并且其中确定所述第一探针的所述第一检出限包括将失真度乘以所述流式细胞仪中除所述第一通道外的每个通道的最大预期信号。
21.根据权利要求20所述的方法，其中确定所述第一探针的所述第一检出限基于CV扩大的线性叠加模型。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述失真度是颜色补偿引起的CV扩大的量度。
23.一种设计流式细胞仪的探针面板的方法，所述方法包括：
确定第一探针、第二探针和第三探针；
确定多种可行探针面板，每种可行探针面板包括所述第一探针、所述第二探针或所述第三探针的组合，每个探针具有与其相关联的可行标签；
基于所述第二探针及其相关联可行标签的组合的光谱溢出效应确定所述第一探针的检出限，由此评估第一种可行探针面板，其中，所述光谱溢出效应是与第二探针相关联的可行标签的亮度和目标细胞上对应于第二探针的特定抗原的预期密度的函数，并且其中，所述第一探针的检出限是阈值信号强度，其将对应于所述第一探针的对特定抗原呈阳性的细胞与对应于所述第一探针的对所述特定抗原呈阴性的细胞相区分；
基于所述第三探针及其相关联可行标签的组合的光谱溢出效应确定所述第二探针的所述检出限，由此评估第二种可行探针面板，其中，所述光谱溢出效应是与第三探针相关联的可行标签的亮度和目标细胞上对应于第三探针的特定抗原的预期密度的函数，并且其中，所述第二探针的检出限是阈值信号强度，其将对应于所述第二探针的对所述特定抗原呈阳性的细胞与对应于所述第二探针的对所述特定抗原呈阴性的细胞相区分；以及
基于确定的所述检出限，从所述多种可行探针面板中选出所述探针面板。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针中的至少一个探针特异地结合到抗原上。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针中的至少一个探针特异地结合到被分析物上。
26.根据权利要求23所述的方法，其中评估所述第一种可行探针面板包括：部分地基于与所述第一探针和所述第二探针相关联的抗原的共表达模式来确定所述第一探针的所述检出限。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原的共表达模式还包括特定细胞类型的抗原之间的共表达关系。
28.根据权利要求26所述的方法，其中如果与所述第一探针和所述第二探针相关联的所述抗原的共表达模式互相排除，便确定所述第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应为零。
29.根据权利要求26所述的方法，其中如果与所述第二探针相关联的所述抗原是与所述第一探针相关联的所述抗原的后代，便确定所述第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应为零。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二探针及其相关联标签的组合的光谱溢出效应量化为失真度和抗原共表达模式的函数。
31.根据权利要求23所述的方法，还包括显示所选探针面板中的一对探针的预期信号群体分布的图形表示。
32.根据权利要求31所述的方法，其中显示所述群体分布的所述图形表示包括显示所述第一探针和所述第二探针的所述确定检出限。
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