CN101669031A

CN101669031A - 使用与细胞外标记物结合的试剂组多重检测肿瘤细胞

Info

Publication number: CN101669031A
Application number: CN200880006450A
Authority: CN
Inventors: 奥拉·温克维斯特; 马格纳斯·索恩
Original assignee: Sentoclone AB
Current assignee: Jiangsu SentoClone Co., Ltd.
Priority date: 2007-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2010-03-10
Also published as: EP2472264A3; EP2472264B1; EP2472264A2; SI2472264T1; EP2126579A2; RU2009135780A; BRPI0807384A2; JP2011503520A; HUE028487T2; JP5409395B2; WO2008104380A3; RU2489720C2; US20110312511A1; WO2008104380A2; DK2472264T3

Abstract

本发明涉及了通过将两种或两种以上的试剂与细胞外标记物相结合，对癌细胞或癌细胞元件进行流式细胞术检测，其中至少一种试剂是癌症特异性的。

Description

使用与细胞外标记物结合的试剂组多重检测肿瘤细胞

技术领域

本发明涉及在生物学样品中检测癌细胞或癌细胞元件的方法，其中该方法包括加入与两种或两种以上细胞外标记物结合的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的。检测通过光谱测定方法进行。

背景技术

关于癌症预后因素的研究将局部淋巴结的组织学状态鉴定为患者存活的最重要的预测因子之一。由Raymond Cabanas(Cabanas等，1977)首先引入的前哨淋巴结的概念，提出从原发肿瘤出发的淋巴导流，通过一个特定的局部淋巴结——前哨淋巴结，然后继续。前哨淋巴结的概念要求从原发肿瘤的不同部分可能引出多个导流途径，因此患者可能具有一个以上的前哨淋巴结。前哨淋巴结对于每个个体来说是独特的。该淋巴结的肿瘤状态反映了局部淋巴区域的状态，并对预后具有强烈的影响，正如在恶性黑素瘤和乳腺癌的大规模跟踪研究中报道的那样。

已经报道，对于被诊断具有肿瘤细胞转移阴性的前哨淋巴结的黑素瘤患者来说，5年存活率高达89％。对于被诊断具有转移的前哨淋巴结的患者来说，5年存活率降低到70％(Morton等，2003)。可以推测，在被诊断不具有转移的前哨淋巴结的组中11％的死亡事实上是假阴性诊断病例。

由于前哨淋巴结的状态作为预后因素具有强烈的证据，因此前哨淋巴结活组织检查和最终评估转移性癌细胞是否存在，在许多国家已经变成分期的常规程序。

前哨淋巴结的诊断对于诊断前哨淋巴结后选择治疗策略也有影响。如果前哨淋巴结的状态可以被快速确定，它对于外科手术过程中作出决定也可以提供有价值的信息。

今天，前哨淋巴结评估的常规程序是对来自几个级别的淋巴结的福尔马林固定的、石蜡包埋的切片进行术后组织病理学检查。但是，可能错过位于切片之间的微型转移肿瘤。一种进一步的发展是在外科手术进行中对前哨淋巴结进行研究。在这种方法中，将薄的淋巴结冷冻切片(大约5μm厚)用苏木精和曙红染色。然后由病理学家在显微镜下检查冷冻切片。将结果报告返回手术室，然后可以作出决定，例如如果淋巴结含有肿瘤细胞，将手术扩展到切除淋巴结。手术后，有时也对样本进行特异性针对所检察的癌症类型的标记物的免疫组织化学染色，以便于检测微型转移肿瘤。所靶向的标记物的例子是恶性黑素瘤情况下的HMB-45和结肠和乳腺癌情况下的细胞角蛋白-20。

这些肿瘤细胞检测的常规程序具有各种不同的缺点。它们耗时，降低了在原发肿瘤手术过程中提供重要信息的可能性。最糟的是，它还是不准确的，因为只检查了小部分(非常薄的切片)淋巴结，这些切片之外的微型转移肿瘤将不可避免地检测不到。使用细胞角蛋白-20染色的冷冻切片的常规筛选来检测转移肿瘤的可能性，也依赖于转移肿瘤的尺寸。在用乳腺癌前哨淋巴结进行的具体研究中(Weaver等，2006)，错过≤0.10mm的转移肿瘤的几率被发现是61％。对于≤0.05mm和≤0.02的转移肿瘤来说，错过肿瘤细胞存在的几率分别为69％和75％。方法还依赖于检测肿瘤细胞的病理学家的个体技巧。现有方法的最终常见问题是在医院实验室中缺乏本技术领域的熟练工作人员，这与这些程序的可用性和花费有关。

已经报道了可选的检测方法，包括反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术方法。RT-PCR方法比组织病理学方法更灵敏，但是也耗时，并且已经发现该方法产生假阳性结果(Merrie等，1999；Noguchi等，1999)。此外，mRNA对降解敏感，该特征使得在常规的临床场所中操作和运输样本较为困难。

流式细胞术方法已被报道具有比常规技术更高的灵敏度(Leers等，2002)。到目前为止，含有流式细胞术作为检测淋巴结中肿瘤细胞的工具的方法，依赖于用针对细胞内标记物细胞角蛋白-20、一种由各种不同癌细胞(例如乳腺和结肠癌)产生的蛋白、以及DNA的单克隆抗体进行染色。

依赖于细胞角蛋白-20蕴含了假阳性诊断的风险，因为该蛋白不是肿瘤细胞专门表达的。实验显示，该蛋白也表达在健康对象的外周血中的细胞中。因此，出现了对确定阳性和阴性诊断之间的“截止”率的需要，这些诊断不可避免地带有错误结果的风险。

使用细胞内标记物例如细胞角蛋白-20或HMB-45在抗体染色过程中也需要额外步骤。单克隆抗体可达到它们的靶之前，必须用例如皂苷对细胞进行通透化处理，这在步骤中增加了至少30分钟。

此外，在肿瘤细胞之间表达图谱差别很大，仅使用单一标记物蕴含了产生假阴性结果的风险。

发明内容

本发明涉及在生物样品中检测癌细胞或癌细胞元件的方法，其中该方法包括加入与两种或两种以上细胞外标记物结合的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的。检测通过光谱测定方法进行。

因此，本发明包含使用添加到该生物样品中的试剂组的一个步骤，由此能够同时直接检测几种癌症特异性标记物，从而省略了前哨淋巴结解剖、对解剖样品进行染色以及随后由有经验的病理学家进行检查的步骤。因此，本发明允许了相当快速、耐用、标准化的基于非主观性的物理特征的分析方法，并具有较高的特异性、灵敏度和可重复性。

本发明有多种的应用。在第一种诊断应用中，该方法可以用于在前哨淋巴结、metinel淋巴结或其它淋巴结中检测癌细胞。如上所述，在前哨淋巴结中检测肿瘤细胞是用于癌症分期的常用步骤。使用与鉴定某种类型肿瘤的细胞外标记物结合的试剂组，允许以非常高的灵敏性和特异性检测肿瘤细胞。类似的方法也可用于在其它组织中检测癌细胞。

在第二种诊断应用中，本发明可用于确定具有未知来源的转移的患者中原发肿瘤的类型。通过使用一组或几组与特异性针对某些癌症类型和/或组织类型的细胞外标记物结合的试剂，方法可以在原发肿瘤位点的搜索中提供有价值的线索。

在本发明的另一种应用中，方法可用于监测用于针对癌症的细胞疗法(所谓的过继性免疫疗法)的细胞培养物。在过继性免疫疗法中使用前哨淋巴结淋巴细胞需要在单细胞悬浮液中检测癌细胞。在本应用中，可以使用与鉴定被治疗的癌症类型的细胞外标记物结合的试剂组，以便证实在将细胞施用回患者之前细胞培养物中不含癌细胞。本应用也可用于监测治疗中的患者，可以用作评估治疗方案的有效性的工具以及选择适合疗法的决定工具。

本发明在肿瘤细胞检测应用中的使用可以通过从不同类型的组织制备单细胞悬浮液来实现。在接下来的步骤中，将单细胞悬浮液或来自它的样品，与一组荧光团结合的、与鉴定应被检测的癌症类型的标记物结合的单克隆抗体一起温育。在温育时间和清洗后，使用流式细胞术分析样品，可以容易地获得分析结果。

正如提过的，单细胞悬浮液可以从各种不同的来源制备，例如淋巴系统、前哨淋巴结、metinel淋巴结、其它淋巴结、肿瘤组织、其它组织、血液和/或血浆。

在第二种诊断应用、原发肿瘤的鉴定中，单细胞悬浮液或者从流出未知来源的转移肿瘤的淋巴结、或者从转移肿瘤的活检组织制备。依赖于转移肿瘤在身体中被发现的部位，可以使用几组荧光团结合的单克隆抗体来鉴定通常转移到发现转移肿瘤的器官或组织中的特异性原发肿瘤类型。单细胞悬浮液可能需要分到几个样品中，都与不同组的抗体温育，以便筛选已经转移的肿瘤类型。在本发明的这种应用中，使用流式细胞术进行分析也是可能的。

用于针对癌症的细胞疗法的细胞培养物中肿瘤细胞不存在的证实，可以通过使用与在淋巴结中检测肿瘤细胞类似的方法来完成。在本发明的这种应用中，单细胞悬浮液从细胞培养物的样品制备。使用与肿瘤细胞检测应用同样类型的单克隆抗体组，将单细胞悬浮液温育、清洗，并在最后使用流式细胞术进行分析。

定义

本文使用的术语“试剂”是指所有能够与细胞外标记物结合或相互作用的试剂，覆盖了已知的试剂例如可商购的单克隆抗体，以及将被产生的试剂。适合的试剂的例子是单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、(Fab′)₂片段、Fv片段、肽、蛋白、RNA分子、多糖，或其任何组合。

术语“试剂组”意指含有两种或两种以上试剂的组，例如三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上或十种或十种以上试剂。所选的试剂的数量可能依赖于被筛选的标记物的数量和/或在用于定量个体细胞的数量的方法中使用的设备的能力，即设备能够同时检测多少种试剂。组中的癌症特异性试剂的数量依赖于具体的应用，但是，存在一种或一种以上癌症特异性试剂，例如两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上或十种或十种以上试剂。优选情况下使用更多的特异性试剂，例如至少20、至少30、至少40、至少50、至少75或至少100种，依赖于癌症特异性试剂的可用性。组中的癌症特异性试剂可以都特异性针对一种癌症类型，或者可以具有针对不同癌症类型的特异性。

本文使用的术语“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。抗体可以是单克隆的，也可以是多克隆的，可以来源于任何物种，包括(例如)小鼠、大鼠、兔、马、鸡或人类，或者可以是嵌合抗体。用于实施本发明的多克隆抗体，可以按照已知的步骤，通过用抗原免疫适合的动物(例如兔、山羊等)，从动物收集免疫血清，并且从免疫血清中分离多克隆抗体来生产。

用于实施本发明的单克隆抗体可以按照已知的技术在杂交瘤细胞系中生产。

包含在本发明的范围内的“抗体片段”包括例如Fab、F(ab′)₂和Fv片段，以及从IgG之外的抗体获得的相应的片段。这样的片段可以通过已知技术来生产。

本文使用的术语“细胞外标记物”是指表达在细胞表面上的标记物。

本文中使用的术语“组织特异性细胞外标记物”是指表达在属于某种类型的组织、例如上皮或间充质来源的组织的细胞表面上的标记物。

术语“癌症特异性细胞外标记物”是指表达在癌细胞表面上的标记物，而术语“癌症类型特异性细胞外标记物”是指表达在某种类型的癌细胞的表面上、即在结肠癌细胞、乳腺癌细胞等的表面上的标记物。术语“癌症亚型特异性细胞外标记物”是指表达在癌细胞表面上的标记物，其中标记物指示了癌细胞的具体特征，例如攻击性、转移特性、侵袭力、免疫抑制能力、化疗敏感性、以及用于免疫治疗的相关肿瘤抗原的存在。

术语“前哨淋巴结”意指从肿瘤接收淋巴流出物的第一个淋巴结。术语“metinel淋巴结”是指从转移肿瘤接收淋巴流出物的第一个淋巴结。

术语“真阳性”意指被正确地测试为阳性的测试样品。

术语“假阳性”意指被错误地测试为阳性的测试样品。

术语“真阴性”意指被正确地测试为阴性的测试样品。

术语“假阴性”意指被错误地测试为阴性的测试样品。

术语“灵敏度”意指使用下面的公式计算的量值：

术语“特异性”意指使用下面的公式计算的量值：

术语“阴性预测值(NPV)”意指使用下面的公式计算的量值：

术语“可重复性”意指测试可以同样的测试结果被独立地重复的能力，例如分析之间和之内的变异小于10％。

术语“试剂的标记”意指试剂与可通过仪器检测的分子相结合，可检测的分子例如酶、荧光分子、放射活性分子、生物素、寡核苷酸和/或多糖。

术语“截止值”意指该值被认为是为阳性和阴性患者病例(健康状态)之间提供了适合的区分的值。

试剂组可用于检测人类或动物体中、例如血液或组织中存在的癌细胞。但是，在具体的实施方案中，应用涉及了使用与细胞外标记物结合的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的，用于检测组织中弥散的癌细胞。

尽管试剂组可用于检测人类或动物体中任何位置的癌细胞，但在下面将要示例并详细描述的试剂组的使用是用于在淋巴系统中检测癌细胞，这不以任何方式将本发明限制到具体描述的情况。

正如上面提到的，评估前哨或metinel淋巴结中是否存在肿瘤细胞，对于癌症的分期是非常重要的，对于选择治疗策略也有影响。如果前哨或metinel淋巴结的状态可以被快速确定，可以为手术过程中作出决定提供有价值的信息。因此，本发明涉及了用于在生物学样品中检测癌细胞或癌细胞元件的方法，方法包括在该生物学样品中加入与两种或两种以上不同的细胞外标记物结合的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的。癌细胞或细胞元件的检测可以通过光谱测定方法执行。光谱测定方法可以是、但不限于能够检测样品的正向散射、侧向散射和荧光。光谱测定方法可以是、但不限于流式细胞术。

在本发明的优选实施方案中，光谱测定方法是流式细胞术。

正如上面提到的，已知的可用于检测前哨或metinel淋巴结中的癌细胞的技术具有许多缺点。

优点：较高的灵敏度

在当前用于检查淋巴结的组织病理学和免疫组织化学方法中，将淋巴结切成薄的冷冻切片并染色。但是，因为只检查了少部分淋巴结，在选择的切片外部的微型转移肿瘤将不可避免地不能检测到。此外，即使肿瘤细胞存在于切片中，组织病理学和免疫组织化学方法使用的人工筛查经常会错过小的转移肿瘤(≤0.10mm)和个体癌细胞(Weaver等)。

在本发明中，在移除前哨或metinel淋巴结后从来自前哨或metinel淋巴结的细胞制备了单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液的样品与靶向细胞外标记物的试剂组温育，然后通过能够对表达特异性细胞外标记物的个体细胞的数量和比例进行定量的方法，分析大量的细胞、例如100,000个或以上的细胞。因此，通过使用来自一个或多个前哨或metinel淋巴结的细胞的悬浮液，提供了代表一个或多个完整的淋巴结的细胞的随机化的群体。此外，对相对高数量的细胞进行分析，为肿瘤细胞是否存在提供了统计学上有保证的证据。

因此，本发明提供的超出已知技术的一个优点是非常高的灵敏度。即通过使用本文描述的试剂组，检测癌细胞的灵敏度可以为90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％，意味着90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、99％或99％以上、或100％的含有癌细胞的前哨或metinel淋巴结将被正确地诊断为阳性。

使用本发明的较高的灵敏度的优势，随着转移肿瘤尺寸的减小而显著增加。因为本发明分析了大量个体的细胞，检测到转移肿瘤的几率只依赖于淋巴结中存在的肿瘤细胞的总数。对于常规方法来说，已经显示出检测的几率也依赖于转移肿瘤的尺寸。例如，已经发现，通过抗细胞角蛋白免疫组织化学检测的灵敏度，对于最初通过组织病理学筛查分类为阴性的乳腺癌前哨淋巴结来说，仅仅为53％。已经发现，错过转移肿瘤的风险随着尺寸的减小而增加。错过≤0.10mm的转移肿瘤的几率被发现是61％。对于≤0.05mm和≤0.02mm的转移肿瘤来说，错过肿瘤细胞的存在的几率分别为69％和75％(Weaver等)。

使用苏木精和曙红染色的组织病理学的总体灵敏度是大约50％。对于用组织病理学进行筛查然后进行抗细胞角蛋白免疫组织化学检查来说，总体灵敏度是大约80％。即，本发明的方法与目前使用的在淋巴结样品中鉴定肿瘤细胞的方法相比，提供了高得多的灵敏度。

优点：较高的特异性

本发明的另一个优点是通过在同时分析几种标记物，获得了关于每个样品的更详细的信息，从而通过将细胞表达中的个体差异纳入考虑，降低了假阳性结果的风险。此外，方法不依赖于如前面描述的那样不是癌症特异性标记物的细胞角蛋白-20的检测，这进一步降低了假阳性诊断的风险。

即，通过使用本文描述的试剂组，检测癌细胞的特异性可以为95％或95％以上，例如96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、99％或99％以上、或100％，意味着95％或95％以上，例如96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％的没有癌细胞的前哨或metinel淋巴结将被正确地诊断为阴性。

表示本发明的增加的灵敏度和特异性的另一种方式是通过阴性预测值，即被诊断为没有癌细胞的前哨或metinel淋巴结被正确诊断的几率。该值反映了高灵敏度和特异性的组合。尽管目前使用的其它已知技术现在将特异性放在比灵敏度优先的位置上，但本发明允许同时维持高水平的灵敏度和特异性。

因此，在本发明中，将高灵敏度和特异性组合起来是可能的，即可以非常高的阴性预测值检测癌细胞。因此，本发明涉及了应用，其中检测癌细胞的阴性预测值可以为90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％，意味着如果通过本文描述的方法将样品鉴定为癌细胞阴性，该样品实际上是阴性的几率为90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或甚至100％。

在本文描述的方法中高的阴性预测值是有利的，因为患者在手术中被移除任何健康组织的风险被极大地降低了。

优点：较高的可重复性

本发明的另一个优点是它容易以高的可重复性进行。因此，分析之间和之内的变异小于10％，例如小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％。因此，步骤可以被标准化，并由广泛的专业人员，例如生物医学科学家和临床实验室科学家来执行。相比较而言，目前使用的组织病理学方法要求存在熟练的病理学家，这也导致了对样品高得多的主观评估，因为在两个不同病理学家的观察之间可能存在高达30-35％的变异。

优点：较为快速

本发明的另一个优点是分析人类或动物样品中是否存在癌细胞可以在非常短的时间内进行。如果方法用于在手术发生过程中诊断淋巴结转移肿瘤或微型转移肿瘤，将是特别适合的，允许在例如原发肿瘤手术过程中提供诊断。

因此，在本发明中，癌细胞可以在25分钟或更短时间内检测到，例如在20分钟或更短时间内、在15分钟或更短时间内、在10分钟或更短时间内。

作为对比，已知的免疫组织化学染色技术通常需要几个小时才能完成。

通过使用细胞内标记物细胞角蛋白-20染色细胞，具有细胞必须用皂苷进行通透化处理以允许试剂进入细胞，从而为过程增加了时间的缺点。使用细胞角蛋白-20进行分析的平均时间是大约45分钟。因此，通过使用与细胞外标记物结合的试剂，分析时间被显著减少了。

常规的冷冻组织切片的组织病理学分析可在20分钟内进行快速诊断，但是这种方法在用于检测例如微型转移肿瘤时的灵敏度与本文描述的试剂组的灵敏度相比低得多，因为如上所述，只有一小部分淋巴结被检查，并且样品的评估是主观性的。也进行了使用RT-PCR诊断淋巴结转移肿瘤的实验，获得了高灵敏度，但是进行这种分析通常需要的时间使它们完全不适用于在手术过程中作出决定。与此相比，按照本发明使用试剂组提供了非常高的灵敏度和特异性与短的分析时间的组合。

正如上面提到的，依赖于具体的应用，用于本发明的试剂组可以具有差异很大的组成。在下面的具体应用的例子中，将给出试剂组的组成，以便更好地描述本发明。但是，它们不应该被解释为以任何方式限制本发明。

试剂组的使用和试剂的选择

通过表型特性检测癌细胞可以跟从两种不同“策略”。第一种策略是寻找当细胞癌变时表达水平改变的标记物。在显示了某些癌症类型通常表达某种标记物、而源自同样组织的正常细胞不表达它的数据的支持下，人们可以作出细胞癌变的假设。在这种情况下，标记物可以被称为“癌症特异性的”或“癌症类型特异性的”。

第二种策略是寻找异位的细胞，即寻找在收集被分析细胞的组织中正常情况下将不表达的标记物。在某些标记物正常情况下在一种类型的组织中表达，但是在收集细胞的组织中不表达的数据的支持下，人们也可以作出细胞癌变的假设。在这种情况下，你正在寻找“组织特异性标记物”。

但是，从表型检测癌细胞不是直截了当的任务。癌细胞源自于正常的、“健康的”细胞，自然会有许多表面标记物为正常细胞和癌变细胞所共有。此外，癌细胞表现出不成熟的表达发育蛋白的表型，发育蛋白是在早期分化阶段为许多产生细胞株系的干细胞所共有的蛋白。差异通常在于某些标记物的表达水平。

此外，因为正常细胞变成癌变细胞的事件由遗传功能障碍引起，对于每个个体来说癌细胞的表达分布图是独特的，甚至在同样来源的癌细胞之间也有差异。

总而言之，同样的标记物在某些情况下提供了表达该标记物的细胞是癌细胞的证据，在另外情况下则不能。因此，将某些标记物指定为“癌症标记物”必须与其它信息一起作出，例如应被检测的癌症的类型、某种标记物被某种癌症类型表达的频率、以及表达标记物的细胞被发现的组织的信息。

因此，理想情况下，检测癌细胞应该考虑到个体差异。某一种标记物可以被某种类型癌症的许多细胞表达，但不是所有细胞。源自于某种组织的癌变细胞可能失去对该组织正常情况下表达的某种标记物的表达。

与仅仅依赖于一种标记物检测癌细胞的方法相反，使用与几种标记物结合的试剂组降低了假阳性和假阴性结果的风险。使用本发明允许同时检测几种癌症特异性标记物、癌症类型特异性标记物和组织特异性标记物。然后癌细胞不能表达某一种标记物可以通过检测另一种标记物来补偿。

在本发明用于检测前哨淋巴结、metinel淋巴结或其它淋巴结中的癌细胞的应用中，使用原发肿瘤作为阳性对照以证实测试，也是可能的。这进一步降低了错误的测试结果的风险。

已知的原发肿瘤：试剂的选择

其中本文描述的试剂组非常有用的一种方案是检测癌症的扩散，即在淋巴系统例如前哨和/或metinel淋巴结中转移肿瘤、包括微型转移肿瘤的存在。

用于这种方案的试剂组优选应该含有一种或多种与普遍的组织特异性细胞外标记物例如上皮和/或间充质细胞外标记物结合的试剂。几乎所有癌细胞都表达这些标记物中的至少一种，因为它们都源自于上皮或间充质细胞。相反，大多数存在于健康淋巴结中的细胞正常情况下不表达这些标记物。因此，通过包含至少一种与普遍的上皮和/或间充质标记物结合的试剂，可以确保检测到任何正常情况下不存在于淋巴结中的细胞。但是，因为某些具有自组织特异性细胞外标记物的非癌变细胞也存在于淋巴结中(例如含有间充质细胞外标记物的痣细胞)，因此将至少一种癌症特异性试剂包含在试剂组中是重要的。

因此，试剂组应该含有一种或多种与癌症特异性、癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性细胞外标记物结合的试剂。原则上说，任何这样的试剂或标记物都可以使用，它们可以是已经鉴定的，也可以是目前未知的。下面给出了一些例子，它们不对本发明构成限制。

可以使用的标记物包括特异性细胞外标记物、通用上皮标记物、上皮特异性抗原、表皮生长因子、间充质细胞外标记物、癌症类型特异性标记物和癌症亚型特异性标记物，以及“实体肿瘤和其它类型肿瘤”、结肠癌细胞、泌尿道膀胱癌细胞、恶性黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞的标记物。标记物的具体的例子是BC-10、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、G250、MDR1、MDR2、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1、STN、TA-90和β2-微球蛋白(B2M)。

可以使用的试剂包括与组织特异性细胞外标记物、通用上皮标记物、间充质细胞外标记物、癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性细胞外标记物结合的试剂，以及与选自乳腺癌、结肠癌、食道癌、肾癌、肝癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌的标记物或其任何组合的癌症类型特异性细胞外标记物结合的试剂。此外，可能的试剂包括与结肠癌、恶性黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞的特征性的一种或多种标记物结合的单克隆抗体或其片段。试剂的具体例子是针对癌胚抗原(CEA)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)、Ep-CAM、G250、RCAS1、STN、TA-90、BC-10、NY-ESO-1、MSH-R、PRL-R和PSMA的单克隆抗体。

正如上面提到的，与癌细胞的具体亚型特征性的标记物(癌症亚型特异性细胞外标记物)结合的试剂也可以包含在试剂组中。这样的标记物的例子可以是指示下列肿瘤/肿瘤细胞的特性的标记物，即攻击性、肿瘤转移性质、侵袭力、免疫抑制能力、化疗敏感性、以及用于免疫治疗的相关肿瘤抗原的存在。通过分析这样的标记物的存在，可以根据具体的肿瘤亚型定制癌症的治疗。例如，已知存在一系列被称为多药物抗性(MDR)蛋白的膜蛋白，可以在癌细胞中大量表达并能够将抗致癌药剂泵出癌细胞，使得癌细胞对抗致癌物质不敏感或敏感性降低。通过包含一种或多种与MDR结合的标记物，可以确定癌细胞是否将对化疗药剂治疗敏感，以及如果敏感的话，施用化疗药剂用作同样的治疗方案的一部分。但是，如果证明了癌细胞对化疗药剂不敏感，可以立即设立其它的治疗方案。

未知的原发肿瘤：试剂的选择

本文描述的试剂组的另一种应用是用于鉴定癌症转移的来源。即在患者中鉴定一个或多个转移肿瘤的位置，但是已经转移的原发肿瘤的位置是未知的。

理论上，原发肿瘤源自于肿瘤发生的器官或组织中存在的细胞。原发肿瘤的转移被定义为原发肿瘤的扩散所导致的癌症。肿瘤转移过程依赖于癌细胞获得两种独立的能力——增加的移动性和侵染性。转移的细胞与原始肿瘤中的细胞基本上是同样类型的。如果癌症在例如结肠中发生并转移到例如肝脏中，肝脏中的癌细胞是结肠癌细胞。但是，细胞已经获得了增加的移动性和侵染另一种器官的能力。

通过使用本发明的含有一种或多种与癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性细胞外标记物结合的试剂的试剂组，确定转移肿瘤的来源、即确定原发肿瘤在哪个组织中发生也是可能的。

试剂组还可以含有一种或多种与组织特异性细胞外标记物、例如通用上皮和/或间充质细胞外标记物结合的试剂。

转移肿瘤可以在人类或动物体中任何地方发现，但是，发现转移肿瘤的最常见的位点是在淋巴结、肝脏、肺、骨骼、脑、卵巢、肾上腺和腹腔中。

因此，试剂组应含有一种或多种与癌症特异性、癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性细胞外标记物结合的试剂。原则上，可以使用任何已经鉴定的或目前未知的这样的试剂或标记物。下面给出了一些例子，它们不对本发明构成限制。

可以使用的标记物包括特异性细胞外标记物、通用上皮标记物、上皮特异性抗原、表皮生长因子、间充质细胞外标记物和癌症类型特异性标记物，以及结肠癌细胞、泌尿道膀胱癌细胞、恶性黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞的标记物。标记物的具体的例子是BC-10、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、G250、MDR1、MDR2、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1、STN、TA-90和β2-微球蛋白(B2M)。

可以使用的试剂包括与组织特异性细胞外标记物、通用上皮标记物、间充质细胞外标记物、癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性标记物结合的试剂，以及与选自乳腺癌、结肠癌、食道癌、肾癌、肝癌、肺癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌的标记物或其任何组合的癌症类型特异性细胞外标记物结合的试剂。此外，可能的试剂包括与结肠癌、恶性黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞和肺癌细胞的特征性的一种或多种标记物结合的单克隆抗体或其片段。试剂的具体例子是针对癌胚抗原(CEA)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)、Ep-CAM、G250、RCAS1、STN、TA-90、BC-10、NY-ESO-1、MSH-R、PRL-R和PSMA的单克隆抗体。

试剂的标记

因为在本文描述的试剂组的使用中的一个重要步骤是鉴定带有特异性标记物的细胞的数量，因此用一种或多种可检测标记物来标记试剂可能是有利的。适合的标记物可以来自酶、荧光分子、放射活性标记物、生物素和/或寡核苷酸。

在本发明的优选实施方案中，试剂用荧光分子例如核特异性染料、藻胆蛋白、花青素衍生物、荧光素衍生物和罗丹明衍生物进行标记。在试剂组中使用的不同试剂优选用不同的标记物标记，以便它们可以彼此区分。当荧光分子用于标记时，方法优选可以通过荧光测量仪器例如流式细胞仪来进行。

典型步骤

来自具有癌症指征的患者的前哨淋巴结通过外科手术获得。简单来说，在外科手术过程中，通过在肿瘤周围注射示踪物质例如专利蓝染料来鉴定前哨淋巴结，该染料跟随淋巴流出液，并将第一个流出的淋巴结染为蓝色。

通过使用松配合的玻璃匀浆器，在添加有2％胎牛血清和0.02％叠氮化钠的5ml PBS(染色缓冲液)或在细胞培养基例如X-Vivo 15或Aim5中将淋巴结轻轻加压，获得了来自被研究的全部前哨淋巴结的单细胞悬浮液。

在2ml染色缓冲液中清洗1x10⁶个细胞的样品。

然后在100μl染色缓冲液中将细胞样品用选自组织特异性、癌症类型特异性和癌症亚型特异性细胞外标记物的荧光团结合的抗体进行标记，在室温温育15-30分钟。通过使用阳性对照对每种抗体进行滴定，确定使用的抗体的足够的量。典型情况下该量在0.1-0.5μg的范围内。为了除去过量的抗体，在进行流式细胞分析之前，将样品用2ml染色缓冲液清洗，并重新悬浮在300μl染色缓冲液中。

分析使用仪器FACSAria、FACSCanto(Becton Dickinson)或Cytomics FC 500(Beckman Coulter)进行。流式细胞分析通过从每种细胞样品收集100,000个事件来进行。

试剂盒

为了便于使用本发明，可以开发特制的试剂盒以大量应用本发明。这样的试剂盒可以包含所有必需的试剂、标记物和流体，以及执行某些测试所需的说明书。试剂盒也可以包括带有例如阳性和阴性测试结果之间的预定截止率，以便于解释测试结果的软件。

在本发明的优选实施方案中，试剂盒将包含一组荧光标记的单克隆抗体，其中抗体组适合于某种类型的测试。此外，试剂盒将包含使用流式细胞术进行测试所需的流体，以及能够可靠地解释分析产生的数据的软件。

截止值、流行率的确定和数据库的使用

用于解释每个测试产生的数据的软件的使用，依赖于可靠的统计学方法和背景数据，用于发现对于每个测试来说最适的截止值，因为灵敏度和特异性随着阳性和阴性测试结果之间的截止值的变化而变化。

背景数据可以通过对状态已知的或在相关群体中搜索的异常现象的流行率已知的大量样品进行测试而获得。每个测试产生的数据、例如对于每种标记物来说测试为阳性的事件的比例，将与测试对象所属的群体的分类信息、例如性别、年龄、疾病、疾病的阶段等，一起被收集。产生的数据可用于发现最适的截止值。

由于生物学(标记物在正常状态下也存在的表达程度的变化)和技术(背景噪音)原因，因为真正阴性的样品将显示出不同程度的“阳性”，也需要截止值。

在背景数据是使用具有已知状态(阳性或阴性)的样品产生的情况下，发现最适截止值相对简单，可以通过分析测试的灵敏度和特异性如何与截止值相关来获得。

选择截止值的一种方法是对于每个可能的截止值将灵敏度对(1-特异性)作图，即首先任意地或通过方法选择几个不同的截止值。获得的曲线被称为“受试者工作特征”曲线、ROC曲线。测试的准确性通过ROC曲线下的面积来度量。面积为1代表“完美的测试”，面积为0.5代表“无价值的测试”。

如果对假阴性结果的公差等于对假阳性结果的公差，应该选择使ROC曲线下的面积最大的截止值。但是，在许多情况下，当决定截止值时必须将测试的临床应用考虑在内。例如，对于筛选测试来说，重要的是使假阴性结果的数量最小化，适度的假阳性数量是可以接受的，因此将照此设定截止值，即截止值可以根据临床应用/目的来选择。

ROC曲线不能单独用于决定截止值，因为方法没有将搜索的异常现象的流行率考虑在内。为了使测试预测真正疾病状态的能力最适化，需要被检测的异常现象的流行率的背景数据。测试的灵敏度和特异性可以随着测试对象所属的群体中所搜索的病症的流行率而变化。因此，对于不同的群体需要确定不同的截止值。

在样品的真实状态未知的情况下，必须使用不同的发现最适截止值的方法。如果不同群体中异常现象的流行率是已知的，参比区间可用于这种目的。

参比区间是在相关群体中包含某个百分率值的值估计范围。最常用的百分率是95％。

为了确定截止值，必需计算两个参比区间，一个区间用于假定的阴性样品，一个区间用于假定的阳性样品。每个样品的分类将根据收集样品的群体中异常现象的流行率来进行。每个样品组的成比例的尺寸应与群体中异常现象的流行率相符合。基于对每个淋巴结的测试结果，每个样品可以被分类到假定的隐形组和假定的阳性组中。对于每个组可以产生参比区间，可以设定截止值以使一个参比区间与另一个参比区间的重叠最小化。也可以设置截止值以使例如假阴性诊断的风险最小化。

参比区间可以通过两种基本方法来计算。如果产生的数据与分布函数例如正态分布相符，可以使用参数方法来计算参比区间，意味着分布与数学定义的统计学分布例如正态分布相符。使用参数方法一般是优选的，因为参比区间的置信区间一般较为狭窄，除非样品大小非常大。如果产生的数据不符合任何数学定义的统计学分布，将不得不使用非参数(无分布)方法，其中估算的分布只使用分析产生的真实数据来计算，以便达到可接受的截止值。为了减小置信区间，将需要非常大的样品大小。

被检测的异常现象的流行率可以随着例如年龄、性别和疾病/指征而变化。因此，当使用本发明检测肿瘤细胞时，使用大量的背景数据为每个相关群体确定参比区间，可以进一步加强诊断效能。

将通过分析产生的数据与真实阳性或真实阴性的样品的早期数据进行比较，可以使阳性和阴性结果之间的截止值最适化，在灵敏度、特异性和NPV方面能够获得甚至更高的性能。

在本发明的优选实施方案中，对每个测试的解释使用与数据库相连的软件来进行，数据库具有与相关群体有关的每个被测试的标记物的背景数据。软件可能也可以产生用于同一数据库中的数据，这将允许对于每个测试和相关的群体来说，对截止值进行连续的精细调整。

因此，在另一方面，本发明涉及通过本文要求保护的流式细胞术方法获得的数据库储存结果，以及当数据材料增加时用于计算和连续精炼截止值的软件。数据库含有大量数据组，其中每个数据组含有关于大量细胞外表面标记物和相应的癌细胞类型的数据。此外，本发明涉及正如本文要求保护的鉴定癌细胞的方法，其中还包含了将从流式细胞术方法获得的数据组进行储存的步骤，这些数据组例如i)带有与一种或多种细胞外标记物结合的试剂的细胞的数量，ii)癌细胞的类型，iii)组织的类型，等等。储存数据的步骤还可以包含将已知来源的数据输入相应的数据组的步骤。

此外，另一方面，本发明涉及软件程序，当该程序在计算机上运行时，i)适于接收含有细胞外标记物数据的流式细胞术数据组，ii)适于将接收的数据与数据库中的数据进行比较，以及iii)适于提供输出，表明了a)癌细胞的存在或不存在，以及任选的b)癌细胞的类型。

出于比较的目的如何在数据库中评估细胞外标记物的例子，在实施例4中给出。

附图说明

图1图示了使用单一鉴定试剂在结肠癌细胞和白细胞的混合物中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。将不同数量的CCL221结肠癌细胞(从0到3％)导入到通过Ficoll纯化的外周血白细胞中，并使用直接结合的抗CA19-9抗体作为细胞表面检测抗体进行染色。肿瘤细胞的存在通过流式细胞术检测。SSC，侧向散射，指示了细胞的粒度。

图2图示了使用单一鉴定试剂在结肠癌细胞和白细胞的混合物中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。将不同数量的CCL221结肠癌细胞(从0到3％)导入到通过Ficoll纯化的外周血白细胞中，并使用直接结合的EpCAM类抗体作为细胞表面检测抗体进行染色。肿瘤细胞的存在通过流式细胞术检测。SSC，侧向散射，指示了细胞的粒度。

图3图示了使用四种鉴定试剂的组在结肠癌细胞和白细胞的混合物中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。将10％(A)或1％(B)的CCL221结肠癌细胞导入到通过Ficoll纯化的外周血白细胞中，并使用直接结合的抗体进行染色，同时用四种颜色检测细胞表面标记物CA19-9、CEA表位5和CEA表位4、以及STN。肿瘤细胞的存在通过流式细胞术检测。被CA19-1和CEA表位5识别的双重阳性细胞(左图)被电子门控，并通过第二对抗体STN和CEA表位4进行评估(右图)。

图4图示了使用四种鉴定试剂的组在结肠癌细胞和白细胞的混合物中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。将10％(A)或1％(B)的CCL221结肠癌细胞导入到通过Ficoll纯化的外周血白细胞中，并使用直接结合的抗体进行染色，同时用四种颜色检测细胞表面标记物CA19-9、CA242和CEA表位4、以及STN。肿瘤细胞的存在通过流式细胞术检测。被CA19-1和CA242识别的双重阳性细胞(左图)被电子门控，并通过第二对抗体STN和CEA表位4进行评估(右图)。

图5图示了使用四种鉴定试剂的组在结肠癌细胞和白细胞的混合物中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。将10％(A)或1％(B)的CCL221结肠癌细胞导入到通过Ficoll纯化的外周血白细胞中，并使用直接结合的抗体进行染色，同时用四种颜色检测细胞表面标记物CA19-9、CA15-3、EpCAM类、以及STN。肿瘤细胞的存在通过流式细胞术检测。被CA19-1和CA15-3识别的双重阳性细胞(左图)被电子门控，并通过第二对抗体STN和EpCAM类进行评估(右图)。

图6图示了来自结肠癌患者的前哨淋巴结的单细胞悬浮液中通过流式细胞术鉴定结肠癌细胞。分析使用识别四种不同结肠癌标记物CA19-9、CEA、STN和EpCAM类蛋白的抗体组进行。

图7图示了当用分析从淋巴结获得的单细胞悬浮液代替通过组织化学分析淋巴结的薄层切片时，假阴性结果的风险的降低。A图示了转移肿瘤(用红色的簇指示)位于最终被染色和在显微镜下评估的切片之外的位置。淋巴结中的肿瘤细胞将不出现在切片中，分析将产生假阴性结果。B图示了从完整淋巴结获得的单细胞悬浮液样品如何代表了整个淋巴结的状态。统计学相关的细胞数量的分析将产生真阳性结果。

图8图示了在按照实施例4中的描述，在结肠癌患者群体中评估标记物EpCAM和CA19-9的参比区间。A图示了对每个被染色的前哨淋巴结进行的同种型对照染色的结果。B图示了来自患者1的前哨淋巴结SN1、SN2和SN3的染色的结果。结果表明两种标记物在SN1和SN2中分别以高和中等水平存在，而在SN3中的表达接近检测水平。C图示了来自患者2的前哨淋巴结SN1和SN2的染色结果。结果表明两种标记物在SN1中都存在。在SN2中的存在接近检测水平。

图9、在对CK20染色后通过流式细胞术检测肿瘤细胞。将上样有DLD-1结肠癌细胞的PBMC连续稀释物对上皮细胞标记物CK20进行细胞内染色，并使用流式细胞术进行分析(1A)。图示了在一个结肠癌患者和一个健康个体的PBMC中发现了CK20阳性细胞(1B)。

图10、通过对肿瘤相关的细胞表面标记物EpCAM和CA19-9染色进行肿瘤细胞的流式细胞术检测。将结肠癌细胞系DLD-1在PBMC中连续稀释，稀释范围为加入的肿瘤细胞为0.012-9％，单独的PBMC被用作阴性对照。对EpCAM的表达进行分析，并针对SSC特性进行作图；数字表示EpCAM+事件的百分率(2A)。分析CA19-的表达针对SSC特性进行的作图，数字表示CA19-9阳性事件的百分率(2B)。肿瘤标记物的共表达通过将EpCAM针对CA19-9作图来检查，图中的数字表示在对应象限中事件的百分率(2C)。在图2C右边的列中，显示了被检测的细胞的总数，即EpCAM⁺CA19-9^-、EpCAM^-CA19-9⁺和EpCAM⁺CA19-9⁺细胞的和，以及从加入的肿瘤细胞数量预测的百分率。

图11、将两个独立研究进行关联的测定之间分析。使用以低的肿瘤细胞加入量(分别为0、0.012、0.037和0.11)上样有结肠癌细胞系DLD-1的PBMC，分析了收集10⁶个事件的测定间偏差。样品用针对EpCAM和CA19-9的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。进行了回归分析以对试验1和试验2的EpCAM表达(3A)、CA19-9表达(3B)和EpCAM/CA19-9表达(3C)进行比较。

图12、检测到的和预计的肿瘤细胞数之间的相关性。将上样有结肠癌细胞系DLD-1(分别为0.037、0.11、0.33、1和3％)的PBMCs样品，以及一个只含有PBMCs的样品，分成10个等份试样，用于评估测定内变异。样品用特异性针对EpCAM和CA19-9的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。对于EpCAM表达的百分率针对SSC特征的作图(4A)和CA19-9的表达针对SSC特征的作图(4B)进行了回归分析。检测(4C)单和双阳性细胞的总的存在，即EpCAM⁺CA19-9^-、EpCAM^-CA19-9⁺和EpCAM⁺CA19-9⁺细胞的和，正如在EpCAM对CA19-9的点状图中显示的。数据被显示为在y轴上检测到的肿瘤细胞的平均(±SD)百分率，在x轴上是预计的细胞数量。

图13、在前哨淋巴结中结肠癌转移肿瘤的存在。在流式细胞术分析之前，将来自7个被诊断患有结肠癌的患者的14个前哨淋巴结平行地进行针对CK20的细胞内染色或针对EpCAM和CA19-9的细胞外染色。对于每个前哨淋巴结来说，进行了使用相关同种型对照的染色，这里示例了对来自患者5的SN1的染色(5A)。在1号患者中，鉴定了三个前哨淋巴结。检测到了在SN1和SN2中存在转移肿瘤细胞，但是SN3仅含有接近检测水平的低数量的阳性事件，被认为是不含转移肿瘤(5B)。从2号患者获得的两个前哨淋巴结的流式细胞术分析表明转移肿瘤扩散到了SN1；在SN2中阳性事件的数量接近检测极限，因此SN2被认为是阴性的(5C)。

实施例

实施例1

在白细胞和结肠癌细胞混合物中通过流式细胞术检测结肠癌细胞

结果

为了评估细胞表面染色的肿瘤细胞的单细胞流式细胞术，我们将来自结肠癌细胞系CCL221的已知数量的结肠癌细胞加入到外周血白细胞中。因此，我们模拟了在淋巴结中含有少量转移肿瘤的情况。首先，我们使用已知表达在结肠癌细胞表面上的肿瘤标记物CA19-9。对于样品的分析来说，最好使用侧向散射(SSC)分析大小和粒度，使用反映FITC结合的染色细胞的FL-1进行。按照图1中的示例鉴定了具有增加的SSC和高荧光的双重阳性细胞。甚至加入的CCL221细胞低至0.33％也能够被容易地检测到。但是，观察到了少量的非特异性染色，即使是当样品中不存在肿瘤细胞时，表明了少部分的假阳性细胞。为了改进分析，使用了识别在结肠细胞上表达的EpCAM类细胞表面分子的抗体进行了实验，在PBL中添加了0.0122-3％的肿瘤细胞。再一次，肿瘤群体被容易地检测为表达高量EpCAM类蛋白和具有增加的SSC的细胞簇(图2)。甚至少至0.0122％的细胞也被检测为可辨别的细胞群体(图2)。使用EpCAM类蛋白作为靶细胞表面标记物没有假阳性细胞的问题，因为当没有加入肿瘤细胞时没有记录到双重阳性事件。因为众所周知，肿瘤细胞随着它们成熟性的丧失可能失去分子的表达，我们打算将一组细胞表面分子组合，以改进分析方法的诊断精确性，而不会有错过已经失去了某些细胞表面分子的表达的肿瘤细胞的风险。因此，我们试验了四种不同细胞表面标记物的组合。CA19-9和CEA的两种表位以及STN的组合，检测到了绝大多数细胞是四重阳性的(图3A，右图)。我们注意到一小部分，少于1％是三重阳性的(图3A，右图，Q1)，表明少量细胞实际上已经失去了一种CEA表位的表达。当将较少的细胞(1％)加入到PBLs中时，获得了同样的结果(图3B)。然后，我们试验了在结肠癌细胞上表达的四种细胞表面蛋白的不同组合，CA19-9、CA242、STN和CEA表位4。当识别PBLs中存在的CCL221细胞系时，该四重组合以同样的方式起作用(图4A)。再一次，大部分的细胞对于所有四种标记物CA19-9、CA242、STN和CEA表位4是阳性的(图4A，右图，Q2)，当加入少量CCL221细胞时结果相同(图4B，右图，Q2)。第三组被测试的细胞表面标记物的组合是CA19-9、CA15-3、EpCAM类蛋白和STN，得到了类似的结果(图5A和B)。当用源自于结肠癌患者的前哨淋巴结对系统进行测试时，通过流式细胞术我们能够容易地检测到结肠癌细胞的存在。使用标记物CA19-9和CEA鉴定到在前哨淋巴结中33％的细胞是携带有结肠癌细胞标记物的细胞(图6)。此外，电子门控的CA19-9⁺CEA⁺细胞和对STN和EpCAM类蛋白表达的分析，揭示出24％的细胞表现出四重阳性地表达所有被测试的标记物CA19-9⁺CEA⁺STN⁺EpCAM类蛋白⁺。但是，1.7％的细胞是对于组合CA19-9⁺CEA⁺STN⁺三重阳性的，7.7％的细胞对于CA19-9⁺CEA⁺EpCAM类细胞⁺阳性，证明了结肠癌细胞可能以不同程度失去某些细胞表面标记物的表达。

表1

针对结肠癌细胞上的表面标记物的抗体

名称	荧光团	抗原
名称	荧光团	抗原	B	Alexa647	CEA
C	Alexa488	CA242	B	Alexa647	CEA
C	Alexa488	CA242	D	PerCP	CA19-9
E	PE	STN	D	PerCP	CA19-9
E	PE	STN	F	Alexa488	CA15-3
G	Alexa647	EpCAM类	F	Alexa488	CA15-3

实施例2

在淋巴结中通过流式细胞术检测转移的结肠癌细胞

材料和方法

细胞的制备

外周血白细胞通过淋巴细胞分离液(Ficoll paque)获得。结肠癌细胞系CCL221按照提供者(ATCC)的建议进行培养。来自被诊断患有结肠癌的患者的前哨淋巴结通过外科手术获得。来自被研究的完整前哨淋巴结的单细胞悬浮液通过使用松配合的玻璃匀浆器对淋巴结轻轻加压来获得。

流式细胞术

将1×10⁶个细胞的样品在添加有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中清洗。然后将细胞样品用一组荧光团结合的选自针对组织特异性、癌症类型特异性和癌症亚型特异性细胞外标记物(参见上面表1中的适合的标记物的例子)的抗体进行染色，并在室温温育15-30分钟。在流式细胞术分析之前，为了除去大量的抗体，将样品用FACS缓冲液清洗。分析的结果可以立即获得。被研究的淋巴结显示出含有大量的转移肿瘤细胞，因为很大一部分含有四重阳性的细胞(图6)。

实施例3

在单细胞样品中通过流式细胞术检测结肠癌细胞以及分析方法的性能/稳靠性

分析了来自被研究的患者的前哨淋巴结、肿瘤细胞和PBMC的单细胞悬浮液。为了能够对结肠癌细胞进行定量，还研究了上样有结肠癌细胞系DLD-1的来自健康志愿者的PBMC样品。使用9％肿瘤细胞的起始浓度进行了7步3倍的连续稀释，得到了9％、3％、1％、0.33％、0.11％、0.037％和0.012％的浓度。在系列稀释中加入了只含有PBMC的样品。

为了对上皮细胞标记物CK20进行细胞内染色，首先将细胞在添加有2％BGS和0.05(w/v)叠氮化钠的PBS(染色缓冲液)中清洗，然后用Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson)按照制造商的说明书进行处理。然后将细胞保持在添加有0.3％皂苷(w/v)(Sigma)的染色缓冲液中。第一次染色用小鼠抗人类CK20抗体(Dakocytomation)或lgG2a同种型对照(Dakocytomation)进行30分钟。将细胞清洗，并与结合有别藻蓝蛋白(APC)(Jackson Immunoresearch)的山羊抗小鼠抗体或结合有荧光素异硫氰酸酯(FITC)(Jackson Immunoresearch)的驴抗小鼠抗体温育30分钟。

细胞表面标记物的染色在染色缓冲液中进行。将细胞清洗，然后与分别用Alexa fluor 488(AF488)(Molecular probes Invitrogen)或多甲藻素-叶绿素蛋白复合物(PerCP)(Prozyme)按照制造商的描述结合的抗上皮细胞粘附标记物(EpCAM)和抗糖类抗原19-9抗体(CA19-9)(Fujirebio diagnostics)温育30分钟。使用的同种型对照是结合有AF488的lgG2a(克隆G155-178)和结合有PerCP(Becton Dickinson)的IgG1(克隆MOPC-21)。从每个样品使用FACSAria(Becton Dickinson)进行，分别获取了100,000个事件(表2，表4)或1,000,000个事件(表3)，收集到的数据用FACSDiva软件进行分析。阳性事件通过将相应的荧光的对数对线性的侧向散射(SSC)特征进行作图来鉴定。设定了左上和右上的象限，以排除用PI最初测试出的死细胞和细胞碎片。针对EpCAM和CA19-9进行染色的样品也使用了绿色荧光(AF488)的对数对红色荧光(PerCP)的对数的点作图来进行分析。

表2、测定内变异

表3、测定内和测定间变异

表4、来自结肠癌患者的前哨淋巴结的研究

分析测定的性能、稳靠性

通过在进行流式细胞术分析之前将样品分成10个等份试样，测试了肿瘤表面标记物的流式细胞术分析的测定内变异。检测了添加0.037％、0.11％、0.33％、1％和3％DLD-1肿瘤细胞的连续稀释样品和只含有PBMC的样品。对于EpCAM和CA19-9来说，当分别显示时，阳性事件的数量在相应荧光的对数对线性的SSC特性的点状作图中确定。被检测到的细胞总数的分析通过将绿色荧光的对数对红色荧光的对数作图来进行，并将记录为EpCAM⁺CA19-9^-、EpCAM^-CA19-9⁺或EpCAM⁺CA19-9⁺的事件累积起来。获得的结肠癌细胞的平均检测、标准偏差和变异系数列于表2中。

被检测到具有EpCAM表达的肿瘤细胞的平均值接近预计值，表明几乎所有的DLD-1细胞表达EpCAM(表2)。从添加有0.11、0.33、1和3％DLD-1结肠癌细胞的样品获得的CV值在4.6-10.7％的范围内，表明测定内变异非常低。添加有0.037％细胞的检测到的细胞的平均数量是0.041％(范围为0.035-0.055％)，对于没有添加肿瘤细胞的PBMC来说是0.002(范围为0-0.004％)(表2)。当研究CA19-9的表达时，肿瘤细胞回收率的平均值低于预计值，再一次表明不是所有的肿瘤细胞都表达CA19-9(表2)。在PBMCs中的平均背景染色是0.036％，这干扰了低浓度肿瘤细胞的检测，但是对于添加有0.33、1和3％细胞的样品来说，分别有67、71和82％表现出表达CA19-9。对于添加有0.037-3％范围细胞来说，CA19-9检测的平均CV是8.4％，显示出低的测定内变异。

当测定EpCAM⁺CA19-9^-、EpCAM^-CA19-9⁺和EpCAM⁺CA19-9⁺的表达时，得到的平均值接近于预计的细胞数(表2)。此外，对每个样品收集了10⁶个细胞，以在细胞数接近阈值的情况下证实方法的有效性(表3)。当测试10个样品时，测量的标准偏差低(范围为0.001-0.016)，证明了低的测定内变异。在整个添加细胞的范围内(0-0.11％)，EpCAM⁺和CA19-9⁺细胞的检测的CVs普遍较低，也表明了测定的稳定性。但是，当测量接近于零的细胞数时，变异系数在数学上对标准偏差的小的变化敏感，限制了它在低细胞数情况下在计算中的可用性。对测试1和测试2中使用EpCAM、CA19-9和EpCAM/CA19-9抗体检测肿瘤细胞的性能进行了比较，一致性良好，回归系数接近于1(图11A-C)。

通过进行回归分析，测试了0到3％细胞样品的动力学范围(图12A-C)。对于EpCAM⁺(图12A)、CA19-9⁺(图12B)和双重阳性细胞(图12C)来说，样品的测定系数是1，证实了在调查的范围内稳定和可靠的性能。对于EpCAM⁺(图12A)和EpCAM⁺CA19-9^-、EpCAM^-CA19-9⁺和EpCAM⁺CA19-9⁺细胞的总和(图12C)来说，观察到的和预计的肿瘤细胞数量之间的关联性接近于从加入的细胞的理论数量所预期的。CA19-9显示出在大约73％的DLD-1肿瘤细胞上表达。

实施例4

在结肠癌患者的前哨淋巴结中评估标记物

材料和方法

在外科手术过程中，通过在肿瘤周围注射示踪物质鉴定了来自7个患者的前哨淋巴结。使用松配合的玻璃匀浆器从每个淋巴结制备了单细胞悬浮液。细胞外标记物的染色在染色缓冲液中进行。清洗细胞，并与分别结合有Alexa488和PerCP的抗EpCAM和抗CA19-9温育30分钟。

对于每个被染色的前哨淋巴结进行了同种型对照，示例为来自5号患者的SN1的染色(图8A)。

使用FACSAria流式细胞仪通过从每个样品获取100,000个事件来进行分析。

分析的结果显示在图8B和8C中(分别为1号和2号患者)。

分析的结果显示在下面的表2中。

数据、例如显示在上面的表中的数据，可用于发现每种标记物和标记物组合的最适截止值。但是，为了发现可靠的截止值，样品的大小需要更大。

在每个样品的真实状态已知的情况下，可以容易地计算不同截止值的灵敏度和特异性。然后可以使用例如上面显示的ROC曲线对每个群体产生最适的截止值。

在真实状态未知的情况下，将必须知道相关群体中前哨淋巴结中结肠癌细胞的流行率。基于每个淋巴结的试验结果，可以将每个样品分类到假定的阴性组和假定的阳性组中，其中每个组的大小比例将与相关患者群体中的流行率相匹配。然后对两个组计算参比区间。

如果产生的数据符合分布函数例如正态分布，可以使用参数方法计算参比区间。使用参数方法一般是优选的，因为参比区间的置信区间一般较为狭窄，除非样品大小非常大。

如果产生的数据不符合任何分布函数，将不得不使用非参数方法。为了减小置信区间，将需要非常大的样品大小。

对两组样品(假定的阳性和假定的阴性)的参比区间进行比较，可用于设定适合的截止值。截止值可以被设定为例如使区间的重叠最小化，或使假阴性诊断的风险最小化。

实施例5

在结肠癌细胞系中对CK20进行细胞内染色。参比实验

在来自结肠癌的淋巴结中检测转移肿瘤的标准方法是使用CK20抗体的免疫组织化学染色。为了评估该标记物用于通过流式细胞术检测转移肿瘤，进行了CK20的细胞外染色，并用APC结合的第二抗体进行检测。

对于起始测试来说，将减少数量的DLD-1结肠癌细胞系添加到PBMCs中。从添加的肿瘤细胞的浓度为9％开始，确定了所有CK20阳性细胞都被检测到(图9A，上图)。使用三倍的连续稀释液，在添加的细胞浓度低至0.037％的情况下检测到CK20阳性肿瘤细胞是可能的(图9A)。不添加DLD-1细胞的PBMC中的背景染色是0.009％CK20阳性细胞(图9A，下图)，同种型对照给出的非特异性染色的平均值为0.011％阳性细胞(数据未显示)，表明了假阳性事件的数量低。已经描述过来自健康个体的PBMC中的CK20阳性细胞，表明了血液中细胞角蛋白阳性上皮细胞的正常的短暂存在。当我们对PBMCs进行CK20细胞内染色时，例如在患有转移的疾病的结肠癌患者和健康个体中，我们分别能够检测到0.19％和0.16％的CK20阳性细胞(图9B，左图)。相反，当使用同种型对照时，检测到的阳性率是0.03％和0.02％(图9B，右图)。因此，似乎CK20阳性上皮细胞甚至以低的浓度存在于健康个体的血液中。

实施例6

结肠癌细胞系上的表面标记物的染色

因为甚至在健康个体中也鉴定到了低水平的CK20阳性细胞，并且细胞内染色更加繁琐，因此研究了直接结合的识别结肠癌细胞表面标记物的抗体的可用性。因此，用分别结合了荧光团AF488和PerCP的特异性针对两种肿瘤相关表面抗原EpCAM和CA19-9的抗体，对添加有DLD-1肿瘤细胞的连续稀释液进行了染色。

EpCAM表达在几乎所有DLD-1结肠癌细胞上(图9A)。检测到的细胞数量与对CK20的染色相关性良好。检测最低的添加的肿瘤细胞的数量(0.012％DLD-1细胞)被鉴定为0.014％EpCAM阳性细胞(图9A)。因为单独使用PBMCs的背景染色是0.004％的检测到的事件，我们得出结论，可以在小的细胞样品中以良好的精确性检测EpCAM阳性细胞。

抗原CA19-9表达在大约80％的DLD-1肿瘤细胞上(图10B)。CA19-9⁺和5个最高浓度下加入的细胞数之间的平均比率是0.80(范围为0.73-0.91)。在不添加结肠癌细胞的PBMCs中的背景染色，对于CA19-9来说略高于EpCAM，0.017％的细胞是CA19-9阳性的(图10B，下图)，与其相比0.004％的细胞是EpCAM阳性的(图10A，下图)。在添加细胞的浓度低至0.11％的情况下，肿瘤细胞的存在可以被容易地检测到，不干扰背景染色。所以，即使背景略高于用EpCAM进行的染色，CA19-9也显示出可以用作标记物通过流式细胞术检测结肠癌细胞。

使用绿色荧光(AF488)的对数对红色荧光(PerCP)的对数进行点作图，通过分析EpCAM对CA19-9的表达，评估了两种肿瘤相关标记物的共表达。在添加的细胞从9％向下到0.11％的情况下，检测到的细胞数量具有良好的关联性(图10C)。平均来说，84％的加入的细胞对EpCAM和CA19-9表达是双重阳性的(图10C，右上象限)，这与单染色数据相一致，由此CA19-9在80％的细胞上表达(图10B)。在连续稀释液中平均24％的细胞是EpCAM⁺CA19-9^-的(图10C，右下象限)。CA19-9单阳性细胞的数量非常低(平均0.5％)(图10C，左下象限)。因此绝大多数CA19-9⁺DLD-1细胞同时表达EpCAM。在两个轴上使用荧光将PBMCs中的背景染色增加到0.087％(图10C，下图)。因为大部分这些事件(0.079％)局限在左上象限中，因此增加的背景是由于较高数量的假阳性CA19-9事件。同种型对照(lgG2a AF488或IgG1PerCP)都没有给出任何显著的非特异性染色(数据未显示)。因此，通过对多个细胞表面标记物进行染色，可以便于检测上样有DLD-1结肠癌细胞系的PBMCs中的肿瘤细胞。

实施例7

在前哨淋巴结中检测肿瘤细胞

为了证实直接结合的特异性针对EpCAM和CA19-9的抗体在结肠癌患者中的可用性，分析了来自7个患者的14个前哨淋巴结的新鲜回收的单细胞悬浮液(表4)。细胞被平行地对CK20进行细胞内染色以进行比较。细胞角蛋白20、EpCAM和CA19-9的同种型对照被用于确定阳性细胞的存在(图13A)。平均来说，当使用CK20、EpCAM和CA19-9的同种型对照时，分别有0.32、0.21和0.16％的细胞被染色为阳性。

在1号患者中鉴定了三个前哨淋巴结(SN1-3)。在SN1中明显存在转移的结肠癌细胞，其中5.6％是CK20阳性的，同样部分的细胞被鉴定为是CA19-9阳性的(图13A)。EpCAM表现出表达在三分之一(34％)的转移肿瘤细胞上(或1.9％的总事件)。转移肿瘤细胞也出现在SN2中，0.57％的细胞是CK20阳性的，0.72％是CA19-9阳性的。EpCAM的表达是0.18％，与细胞角蛋白表达相比代表了32％的转移肿瘤细胞，与CA19-9阳性细胞相比是25％。但是，检测到的EpCAM阳性细胞的数量接近于同种型对照的水平。对SN3的研究揭示出仅有很少的对CK20、EpCAM或CA19-9阳性的事件，接近于通过同种型对照测定的检测水平，因此，SN3被认为对于转移的结肠癌细胞的存在来说是阴性的。

在2号患者中，在手术过程中鉴定了两个前哨淋巴结(图13B)。在SN1中，CK20和CA19-9染色时相当的，检测到的转移肿瘤细胞是0.69％和0.42％，而1.3％的检测到的事件是EpCAM⁺。再一次，在SN2中，使用所有三种标记物检测到的阳性事件的数量接近于通过同种型对照确定的检测极限，因此SN2被认为不含有转移肿瘤。与使用上样有肿瘤细胞的PBMCs的测试系统(图10)相比，淋巴结组织的样品均质性更低，产生了较高的背景。

讨论

在这里，我们提出了新的多重方法，用于快速、可重复地检测淋巴结中的转移肿瘤细胞。迄今为止，转移肿瘤的检测是基于对来自淋巴结材料的几个切片进行显微镜检查，由病理学家做出评估。该方法耗时、劳动强度大、花费高，并且各个病理学家的评估是主观的。例如，在评估从手术室取得的冷冻切片、以及外科医生等待裁决以决定是否继续和扩展手术程序的这种情况下，病理学家承受的压力会导致发生假阳性结果的风险的情况。此外，该过程仅允许分析几个6μm的切片，因为有部分淋巴结甚至没有被检查，因此产生假阴性结果的情况是可能的。为了绕过这些障碍，并允许对淋巴结中的转移肿瘤细胞进行快速、客观的评估，我们建立了研究完整淋巴结的统计学相关样品的系统，其中通过对出现在结肠癌细胞(这是正常情况下不会出现在淋巴结中的细胞)上的细胞表面分子进行多重染色(图6)，可靠地鉴定了转移肿瘤细胞的存在。至少四种标记物的组合通过降低假阳性和假阴性样品的数量，增加了测定的灵敏度和特异性。因此，与显微镜评估相比，检查的结果将具有增加的阳性和阴性预测值，允许外科医生根据淋巴结的检查更可靠地计划外科手术的范围。此外，因为从淋巴结提取单细胞是容易和有效的过程，并且使用了具有高亲和力和高结合速率(k_on)的抗体，检测试剂的结合是快速的，允许了短的温育时间，可以在几分钟之内通过流式细胞术得到客观的读数。使用流式细胞术进行分析允许了较高程度的标准化，并通过标准的使用简化了质量控制工作。

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Claims

1.在生物学样品中检测癌细胞或癌细胞元件的方法，方法包括。

i)在该生物学样品中加入与两种或两种以上不同的细胞外标记物结合的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的，

ii)对所获得的生物学样品进行流式细胞术。

2.权利要求1的方法，用于在组织中检测弥散的癌细胞。

3.权利要求1或2的方法，用于在淋巴系统中检测癌细胞。

4.权利要求3的方法，用于在前哨或metinel淋巴结中检测癌细胞。

5.前述权利要求任一项的方法，其中检测癌细胞的灵敏度为90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％。

6.前述权利要求任一项的方法，其中检测癌细胞的特异性为95％或95％以上，例如96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％，意味着95％或95％以上，例如96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％的没有癌细胞的前哨或metinel淋巴结将被正确地诊断为阴性。

7.前述权利要求任一项的方法，其中检测癌细胞的阴性预测值为90％或90％以上，例如91％或91％以上、92％或92％以上、93％或93％以上、94％或94％以上、95％或95％以上、96％或96％以上、97％或97％以上、98％或98％以上、或99％或99％以上、或100％。

8.前述权利要求任一项的方法，其中癌细胞在25分钟或更短时间内被检测到。

9.前述权利要求任一项的方法，其中测定之间和之内的变异小于10％，例如小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％。

10.前述权利要求任一项的方法，其中试剂组含有两种或两种以上试剂、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上或八种或八种以上试剂。

11.前述权利要求任一项的方法，其中试剂选自单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、(Fab′)₂片段、Fv片段、肽、蛋白、RNA分子、多糖，或其任一组合。

12.前述权利要求任一项的方法，其中试剂是单克隆抗体或其片段。

13.前述权利要求任一项的方法，其中试剂组含有两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上或八种或八种以上与癌症类型特异性标记物结合的试剂。

14.前述权利要求任一项的方法，其中试剂是被标记的。

15.权利要求14的方法，其中标记物选自酶、荧光分子、放射活性标记物、生物素、寡核苷酸和/或多糖。

16.前述权利要求任一项的方法，其中试剂用荧光分子标记。

17.前述权利要求任一项的方法，其中试剂组含有一种或多种与组织特异性细胞外标记物结合的试剂。

18.权利要求17的方法，其中组织特异性细胞外标记物是通用上皮和/或间充质细胞外标记物。

19.权利要求17或18的方法，其中一种或多种试剂与癌症类型特异性和/或癌症亚型特异性细胞外标记物结合。

20.权利要求17-19任一项的方法，其中通用上皮标记物选自上皮特异性抗原、表皮生长因子、Ep-CAM和/或E-钙粘着蛋白。

21.权利要求17-20任一项的方法，其中通用间充质标记物选自CD44、c-Kit和/或VEGF受体2。

22.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物选自实体肿瘤和其它肿瘤类型的标记物。

23.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物选自结肠癌细胞、泌尿道膀胱癌细胞、恶性黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、肾癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞和甲状腺癌细胞的标记物。

24.权利要求22或23的方法，其中结肠癌细胞特征性的标记物选自癌胚抗原(CEA)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原242(CA242)、Ep-CAM、G250、RCAS1、STN、TA-90。

25.权利要求24的方法，其中一种或多种试剂是与结肠癌特征性的一种或多种标记物结合的单克隆抗体或其片段。

26.权利要求25的方法，其中一种或多种试剂选自针对癌胚抗原(CEA)、CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、Ep-CAM、G250、RCAS1、STN和TA-90的单克隆抗体。

27.权利要求22或23的方法，其中泌尿道膀胱癌细胞特征性的标记物选自BC-10、CA19-9、癌胚抗原(CEA)和NY-ESO-1。

28.权利要求27的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种泌尿道膀胱癌细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

29.权利要求28的方法，其中一种或多种试剂选自针对BC-10、CA19-9、癌胚抗原(CEA)和NY-ESO-1的单克隆抗体。

30.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物是选自MSH-R、NY-ESO-1和TA-90的恶性黑素瘤细胞的标记物。

31.权利要求30的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种恶性黑素瘤细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

32.权利要求31的方法，其中一种或多种试剂选自针对MSH-R、NY-ESO-1和TA-90的单克隆抗体。

33.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物是选自CA15-3、CA125、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN和TA-90的乳腺癌细胞的标记物。

34.权利要求33的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种乳腺癌细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

35.权利要求34的方法，其中一种或多种试剂选自针对CA15-3、CA125、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN和TA-90的单克隆抗体。

36.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物是选自Ep-CAM、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1和B2M的前列腺癌细胞的标记物。

37.权利要求36的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种前列腺癌细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

38.权利要求37的方法，其中一种或多种试剂选自针对Ep-CAM、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1和B2M的单克隆抗体。

39.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物是选自CA15-3、CA125、G250、RCAS1、STN和B2M的卵巢癌细胞的标记物。

40.权利要求39的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种卵巢癌细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

41.权利要求40的方法，其中一种或多种试剂选自针对CA15-3、CA125、G250、RCAS1、STN和B2M的单克隆抗体。

42.权利要求17-21任一项的方法，其中癌症类型特异性标记物是选自CA15-3、CA125、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、RCAS1和TA-90的肺癌细胞的标记物。

43.权利要求42的方法，其中一种或多种试剂是与一种或多种肺癌细胞特征性的标记物结合的单克隆抗体或其片段。

44.权利要求43的方法，其中一种或多种试剂选自针对CA15-3、CA125、癌胚抗原(CEA)、Ep-CAM、RCAS1和TA-90的单克隆抗体。

45.权利要求17-44任一项的方法，其中一种或多种癌症亚型特异性标记物选自MDR1和MDR2。

46.权利要求17-45任一项的方法，其中试剂组含有两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上或八种或八种以上与癌症类型特异性标记物结合的试剂。

47.权利要求17-46任一项的方法，用于在前哨或metinel淋巴结中检测癌细胞。

48.前述权利要求任一项的方法，用于鉴定癌症转移的源点。

49.权利要求48的方法，其中转移是在肝脏、肺、骨骼、脑、卵巢、肾上腺、腹腔或淋巴结中的转移。

50.权利要求48或49的方法，其中与癌症类型特异性或癌症亚型特异性细胞外标记物结合的试剂包含一种或多种试剂。

51.权利要求50的方法，其中组织特异性细胞外标记物是通用上皮和/或间充质细胞外标记物。

52.权利要求48-51任一项的方法，其中通用上皮标记物选自上皮特异性抗原、表皮生长因子、Ep-CAM和/或E-钙粘着蛋白。

53.权利要求48-51任一项的方法，其中通用间充质标记物选自CD44、c-Kit和/或VEGF受体2。

54.权利要求48-53任一项的方法，其中的转移是脑部转移。

55.权利要求54的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、恶性黑素瘤的标记物或其组合。

56.权利要求54或55的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

57.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是肺部转移。

58.权利要求57的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌的标记物或其任一组合。

59.权利要求57或58的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

60.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是肝脏转移。

61.权利要求60的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自结肠癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌的标记物或其任一组合。

62.权利要求60或61的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

63.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是骨转移。

64.权利要求63的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、恶性黑素瘤、卵巢癌的标记物或其任一组合。

65.权利要求63或64的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

66.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是腹腔转移。

67.权利要求66的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自结肠癌、直肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、恶性黑素瘤、胃癌、食道癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、胃癌的标记物或其任一组合。

68.权利要求66或67的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

69.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是乳腺转移。

70.权利要求69的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自恶性黑素瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、胃癌的标记物或其任一组合。

71.权利要求69或70的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

72.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是肾上腺转移。

73.权利要求72的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自肺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌的标记物或其任一组合。

74.权利要求72或73的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

75.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是卵巢转移。

76.权利要求75的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自乳腺癌、恶性黑素瘤、胃癌、结肠癌、直肠癌的标记物或其任一组合。

77.权利要求75或76的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN和TA-90。

78.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是胸膜转移。

79.权利要求78的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、恶性黑素瘤的标记物或其任一组合。

80.权利要求78或79的方法，其中细胞外标记物选自CA15-3、CA125、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

81.权利要求48-53任一项的方法，其中转移是淋巴结中的转移。

82.权利要求81的方法，其中试剂结合的癌症类型特异性细胞外标记物选自结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、直肠癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、肝癌、恶性黑素瘤、甲状腺癌的标记物或其任一组合。

83.权利要求81或82的方法，其中细胞外标记物选自BC-10、CA15-3、CA125、CA19-9、CA242、CEA、Ep-CAM、G250、MSH-R、NY-ESO-1、PRL-R、PSMA、RCAS1、STN、TA-90和B2M。

84.用于前述权利要求任一项的方法中的试剂盒，该试剂盒含有用于鉴定细胞外标记物的试剂。

85.权利要求84的试剂盒，还含有流体、抗体和标记物，其中标记物优选已经与试剂/抗体结合。

86.权利要求84-85的试剂盒，还含有使用说明书。

87.权利要求84-86任一项的试剂盒，其中说明书采用计算机软件的形式。

88.权利要求85-87任一项的试剂盒，其中软件用于评估或监测结果。

89.权利要求84-88任一项的试剂盒，该试剂盒含有与细胞外标记物结合的用于在流式细胞仪中进行检测的试剂组，其中至少一种试剂是癌症特异性的。

90.含有多个数据组的数据库，其中每个数据组含有多个细胞外表面标记物和相应的癌细胞类型的数据。

91.权利要求1-83任一项所述的用于鉴定癌细胞的方法，还包括储存从流式细胞术方法获得的数据组的步骤。

92.权利要求91的方法，其中数据组含有下列数据中的两种或两种以上：i)带有与一种或多种细胞外标记物结合的试剂的细胞的数量，ii)癌细胞的类型，iii)组织的类型，等等。

93.权利要求90所述的数据库在鉴定癌细胞中的应用，所述鉴定通过使用与两种或两种以上不同的细胞外表面标记物结合的两种或两种以上试剂的试剂组的流式细胞术进行。