CN107406888A - 用于组合条形编码的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了用于产生一组组合条形码的组合物、方法和试剂盒，及其用于对样品，如单细胞或基因组DNA片段进行条形编码的用途。本文披露的一些实施例提供了包含一组分量条形码的组合物，该组分量条形码用于产生一组组合条形码。该组分量条形码可以包括，例如，n x m个单一分量条形码，其中n和m是整数，每个分量条形码包括：n个单一条形码亚单位序列中的一者；和一种或两种接头序列或其互补序列，其中将这些分量条形码配置为通过该一种或两种接头序列或其互补序列彼此连接，从而产生一组组合条形码。

Description

用于组合条形编码的方法和组合物
以引用方式并入任何优先权申请
本申请要求于2015年3月30日提交的美国临时专利申请号62/140,360和2015年4月24日提交的美国临时专利申请号62/152,644的优先权。这些相关申请的内容在此以引用方式明确地并入本文中。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表一起提交的。序列表被提供为题为BDCRI-013WO_SEQLISTING.TXT的文件，创建于2016年3月28日，大小是695个字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。
背景
单个反应的小型化和并行处理已经导致了现代科学实验和测量中显著的成本降低和生产量的增加。核酸条形编码可以包括以下方法，其中这些方法使用序列串(亦称为条形码序列)将每个样品的核酸区分标记从而将信息内容添加到序列中。条形编码可以包括在化学(条形码)空间中的分离，并且可以或可以不依赖于物理隔离。DNA条形编码可以允许将不同的序列合并。由于在与其他条形码样品组合之前，具有样品特异性条形码的单个标记的低通量，DNA条形编码可能难以执行。需要新的方法来产生用于样本标记的条形码的大量库。
概述
在本文披露的一些实施例中提供了含有用于产生一组组合条形码的分量条形码(component barcode)的组合物，这些分量条形码含有：n x m个单一分量条形码(其中n和m是正整数)，每个分量条形码包括：n个单一条形码亚单位序列中的一者；和一种或两种接头序列或其互补序列，其中将这些分量条形码分量配置为通过该一种或两种接头序列或其互补序列彼此连接，从而产生一组组合条形码。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列组中的每一个单一条形码亚单位序列包括分子标记、细胞标记、维度标记、通用标记、或其任何组合。在一些实施例中，不同接头序列的总数是m-1或m-2。在一些实施例中，每个分量条形码包括：条形码亚单位序列-接头；接头-条形码亚单位序列-接头的互补序列；或接头-条形码亚单位序列的互补序列。在一些实施例中，组合条形码组中的每一个组合条形码包括寡核苷酸，该寡核苷酸包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…条形码亚单位序列c-接头m-1-条形码亚单位序列d。在一些实施例中，寡核苷酸包含靶特异性区。在一些实施例中，靶特异性区是寡聚dT。在一些实施例中，组合条形码组中的每一个组合条形码包括：包含构造式为条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…-条形码亚单位序列c的第一个寡核苷酸；以及包含条形码亚单位序列d-…-接头3-条形码亚单位序列e-接头m-2-条形码亚单位序列f的第二个寡核苷酸。在一些实施例中，第一个寡核苷酸和第二个寡核苷酸中的每一个包括靶特异性区。在一些实施例中，靶特异性区中的一个是寡聚dT。在一些实施例中，一种或两种接头序列中的每一个是不同的。在一些实施例中，m是从2至10的整数。在一些实施例中，m是从2至4的整数。在一些实施例中，n是从4至100的整数。在一些实施例中，n＝24。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列具有相同的长度。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列中至少两个具有不同的长度。在一些实施例中，这些接头序列具有相同的长度。在一些实施例中，这些接头序列具有不同的长度。在一些实施例中，该组组合条形码等于或小于nm个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少100,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少200,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少300,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少400,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少1,000,000个单一组合条形码。
本文披露的一些实施例提供了对多个分区进行条形编码的方法，该方法包括：将m个分量条形码引入该多个分区中的每一个中，其中所述m个分量条形码选自n x m个不同的分量条形码的组(其中n和m是正整数)，每个分量条形码包括：n个单一条形码亚单位序列中的一者；以及一种或两种接头序列或其互补序列；并且连接m个分量条形码从而产生组合条形码，据此该多个分区中的每一个与含有m个分量条形码的单一组合条形码相关联。在一些实施例中，该多个分区中的每一个包括样品。在一些实施例中，该样品是DNA样品。在一些实施例中，该样品是RNA样品。在一些实施例中，该样品是单细胞。在一些实施例中，不同接头序列的总数是m-1或m-2。在一些实施例中，所述方法包括将m个分量条形码中的一个或两个与该样品的靶标进行杂交。在一些实施例中，所述方法包括将杂交到靶标上的m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，据此用组合条形码对该靶标进行标记。在一些实施例中，使用喷码机(inkjet printer)将这些分量条形码引入该多个分区中的每一个。
本文披露的一些实施例提供了对多个分区中的多个DNA靶标进行条形编码的方法，该方法包括：将m个分量条形码置于含有DNA靶标的该多个分区的每一个分区中，其中所述m个分量条形码选自n x m个不同的分量条形码的组(其中n和m是正整数)，每个分量条形码包括：n个单一条形码亚单位序列中的一者，以及一种或两种接头序列或其互补序列；并且连接m个分量条形码从而产生组合条形码，据此在该多个分区的每一个分区中的DNA靶标与含有m个分量条形码的单一组合条形码相关联。在一些实施例中，不同接头序列的总数是m-1或m-2。在一些实施例中，所述方法包括将m个分量条形码中的一个或两个与该DNA靶标进行杂交。在一些实施例中，所述方法包括将杂交到该DNA靶标的m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，从而产生含有组合条形码的延伸产物。在一些实施例中，所述方法包括将该延伸产物进行扩增。在一些实施例中，对该延伸产物的扩增包括等温的多链置换扩增(multiple strand displacement amplification)。在一些实施例中，所述方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。在一些实施例中，所述方法包括对这些经合并的扩增产物进行测序。在一些实施例中，所述方法包括使用这些组合条形码将这些序列进行组装。在一些实施例中，所述方法包括使用经组装的序列产生单倍型。在一些实施例中，使用涵盖至少100kb的重叠测序读数来产生单倍型。
本文披露的一些实施例提供了单细胞测序的方法，该方法包括：将m个分量条形码置于含有单细胞的多个分区的每一个分区中，其中所述m个分量条形码选自n x m个不同的分量条形码的组(其中n和m是正整数)，每个分量条形码包括：n个单一条形码亚单位序列中的一者，以及一种或两种接头序列或其互补序列；并且连接m个分量条形码从而产生组合条形码，据此在该多个分区的每一个分区中的单细胞的靶标与含有m个分量条形码的单一组合条形码相关联。在一些实施例中，不同接头序列的总数是m-1或m-2。在一些实施例中，该靶标是DNA。在一些实施例中，该靶标是RNA。在一些实施例中，所述方法包括将m个分量条形码中的一个或两个与该靶标进行杂交。在一些实施例中，所述方法包括将杂交到该靶标的m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，从而产生含有组合条形码的延伸产物。在一些实施例中，所述方法包括对该延伸产物的扩增。在一些实施例中，所述方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。在一些实施例中，所述方法包括对这些经合并的扩增产物进行测序。在一些实施例中，所述方法包括使用这些组合条形码对来自单细胞的序列进行组装。在一些实施例中，所述方法包括单细胞的大规模平行表征。
本文披露的一些实施例提供了对样品中的靶标进行空间条形编码的方法，该方法包括：提供固定在基底上的多个寡核苷酸；使样品与固定在基底上的该多个寡核苷酸接触；将靶标与特异性结合该靶标的探针进行杂交；捕获显示该靶标位置的图像；捕获该样品的图像；并将示出靶标位置的图像和样品的图像相关联从而对样品中的靶标进行空间条形编码。在一些实施例中，固定在基底上的这些寡核苷酸是寡聚dT引物。在一些实施例中，固定在基底上的这些寡核苷酸是随机引物。在一些实施例中，固定在基底上的这些寡核苷酸是靶特异性引物。在一些实施例中，所述方法包括将该靶标进行逆转录以产生cDNA。在一些实施例中，所述方法包括将dATP同聚物添加至cDNA。在一些实施例中，所述方法包括使用桥接扩增对cDNA进行扩增。在一些实施例中，该基底是流动池的一部分。在一些实施例中，所述方法包括在使样品与固定在基底上的多个寡核苷酸接触之前或之后将样品裂解。在一些实施例中，对样品进行裂解包括对该样品进行加热、使该样品与洗涤剂接触、改变该样品的pH、或其任何组合。在一些实施例中，该样品包括组织切片(tissue slice)、单层细胞、固定的细胞、组织切片部分(tissue section)、或其任何组合。在一些实施例中，该样品包括多个细胞。在一些实施例中，该多个细胞包括一种或多种细胞类型。在一些实施例中，一种或多种细胞类型中的至少一种是脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞、循环细胞或其任何组合。在一些实施例中，所述方法包括将该靶标进行扩增以产生固定在基底上的多个扩增子。在一些实施例中，该靶标包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有聚(A)尾的RNA、或其任何组合。在一些实施例中，所述方法包括对多个靶标进行空间条形编码。在一些实施例中，该探针的长度是18nt-100nt。在一些实施例中，该探针包括荧光标记。在一些实施例中，显示该靶标位置的图像是荧光图像。在一些实施例中，样品包括免疫组织化学染色、进行性染色、苏木精-伊红染色，或其组合。在一些实施例中，固体支持物包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体、或其任何组合。
本文披露的一些实施例提供了单细胞测序的方法，该方法包括：将含有选自第一组的40个单一条形码的第一条形码和第一引物的第一寡核苷酸置于含有单细胞的多个分区中；将含有选自第二组的40个单一条形码的第二条形码和第二引物的第二寡核苷酸置于含有单细胞的多个分区中；使第一寡核苷酸与来自单细胞的靶标接触；将第一寡核苷酸进行延伸从而产生含有第一条形码的第一链；使第二寡核苷酸与第一链接触；并且将第二寡核苷酸进行延伸从而产生含有第一条形码和第二条形码的第二链，据此将来自单细胞的靶标用第一条形码和第二条形码进行标记。在一些实施例中，所述方法包括将第二链进行扩增从而产生扩增产物。在一些实施例中，所述方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。在一些实施例中，所述方法包括对这些经合并的扩增产物进行测序。在一些实施例中，所述方法包括使用第一条形码和第二条形码对来自单细胞的序列进行组装。在一些实施例中，所述方法包括单细胞的大规模平行表征。在一些实施例中，该多个分区由1536孔微孔板构成。在一些实施例中，该靶标是mRNA。在一些实施例中，第一引物是寡聚dT引物。在一些实施例中，该靶标是DNA。
本文披露的一些实施例提供了包含一组组合条形码的组合物，其中该组组合条形码中的每个组合条形码包括：m个条形码亚单位序列，其中每一个选自n个单一条形码亚单位序列的组(其中n和m是正整数)；并且包括m-1或m-2接头序列，其中所述m个条形码亚单位序列通过所述m-1或m-2接头序列彼此连接，并且在该组组合条形码中单一组合条形码的总数超过384。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列组中的每一个单一条形码亚单位序列包括分子标记、细胞标记、维度标记、通用标记、或其任何组合。在一些实施例中，在组合条形码的组中单一组合条形码的总数等于或小于nm。在一些实施例中，组合条形码组中的每一个组合条形码包括寡核苷酸，该寡核苷酸包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…条形码亚单位序列c-接头m-1-条形码亚单位序列d。在一些实施例中，组合条形码组中的每一个组合条形码包括：包含构造式为条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…-条形码亚单位序列c的第一个寡核苷酸；以及包含条形码亚单位序列d-…-接头3-条形码亚单位序列e-接头m-2-条形码亚单位序列f的第二个寡核苷酸。在一些实施例中，该组组合条形码中的每一个包括一个或两个靶特异性区。在一些实施例中，该一个或两个靶特异性区中的一者是寡聚dT。在一些实施例中，m-1或m-2个接头序列中的每一个是不同的。在一些实施例中，m是从2至10的整数。在一些实施例中，m是从2至4的整数。在一些实施例中，n是从4至100的整数。在一些实施例中，n＝24。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列具有相同的长度。在一些实施例中，n个单一条形码亚单位序列具有不同的长度。在一些实施例中，m-1或m-2个接头序列具有相同的长度。在一些实施例中，m-1或m-2个接头序列具有不同的长度。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少100,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少200,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少300,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少400,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码具有至少1,000,000个单一组合条形码。在一些实施例中，该组组合条形码中的每一个附接至固体支持物。在一些实施例中，将该组组合条形码中的每一个用于标记分区。在一些实施例中，该分区是具有多于10,000个微孔的微孔阵列的一部分。在一些实施例中，该微孔阵列的每个微孔包括来自该组组合条形码的不同组合条形码。
在一方面本披露提供一种组合物，该组合物含有：一组试剂条形码，其中每个试剂条形码m具有长度n，其中不同试剂条形码的数目是n x m，并且其中不同组合条形码的可能的数目是nm。在一些实施例中，这些不同的组合条形码是这些试剂条形码的组合。在一些实施例中，这些不同的组合条形码相差至少1个核苷酸。在一些实施例中，这些不同的组合条形码相差至少2个核苷酸。在一些实施例中，nm/(n x m)是至少1:2000。在一些实施例中，nm/(n x m)是至少1:3000。在一些实施例中，nm/(n x m)是至少1:4000。在一些实施例中，其中不同的组合条形码的数目是至少100,000。在一些实施例中，不同的组合条形码的数目是至少200,000。在一些实施例中，不同的组合条形码的数目是至少300,000。在一些实施例中，不同的组合条形码的数目是至少400,000。在一些实施例中，不同的组合条形码的数目是331,776。在一些实施例中，m是至少2。在一些实施例中，m是至少3。在一些实施例中，m是至少4。在一些实施例中，m是4。在一些实施例中，n是从5至50。在一些实施例中，n是24。在一些实施例中，试剂条形码组中的试剂条形码具有不同的长度。在一些实施例中，第一条形码通过接头连接至条形码组中的第二条形码。在一些实施例中，该第一条形码包括靶特异性区。在一些实施例中，将靶特异性区杂交到靶多核苷酸的有义链上。在一些实施例中，该组合条形码是二分的。在一些实施例中，该组合条形码是三分的。在一些实施例中，该组合条形码部分地在靶多核苷酸的3’末端上，以及部分地在靶多核苷酸的5’末端上。在一些实施例中，将靶特异性区杂交到靶多核苷酸的反义链上。在一些实施例中，该组合物进一步包括靶多核苷酸。
在一方面本披露提供了：用于对样品进行条形编码的方法，该方法包括：将一组试剂条形码与多个分区接触，其中每种试剂条形码m具有的长度为n，其中不同的试剂条形码的数目是n x m，并且其中不同组合条形码的可能的数目是nm；将条形码试剂与靶标多核苷酸相关联；用这些条形码试剂对这些靶多核苷酸进行标记，其中每种靶多核苷酸包含不同的组合条形码。在一些实施例中，这些靶多核苷酸是DNA。在一些实施例中，这些靶多核苷酸是基因组DNA。在一些实施例中，这些靶多核苷酸是RNA。在一些实施例中，这些靶多核苷酸是染色体片段。在一些实施例中，这些靶多核苷酸的长度是至少100千碱基。在一些实施例中，这些靶多核苷酸来自单细胞。
在一方面，本披露提供了用于分离多个细胞的方法，该方法包括：将该多个细胞的单细胞以非泊松方式分离进基底的单独的孔中，其中该孔包含两种或更多种组合条形码试剂；并且用这些组合条形码试剂对来自细胞的核酸进行标记，从而产生经组合条形编码的核酸。在一些实施例中，分离包括将该多个细胞进行分配，使得基底的至少20％的孔具有单细胞。在一些实施例中，分离包括将该多个细胞进行分配，使得基底的至少40％的孔具有单细胞。在一些实施例中，分离包括将该多个细胞进行分配，使得基底的至少60％的孔具有单细胞。在一些实施例中，分离包括将该多个细胞进行分配，使得基底的至少80％的孔具有单细胞。在一些实施例中，分离包括将该多个细胞进行分配，使得基底的100％的孔具有单细胞。在一些实施例中，分离是非随机的。在一些实施例中，分离是通过分离装置进行的。在一些实施例中，该分离装置包括选自下组的装置，该组由以下各项组成：流式细胞仪、针阵列、和显微注射器、或其任何组合。在一些实施例中，该基底包括至少500个孔。在一些实施例中，该基底包括至少1,000个孔。在一些实施例中，该基底包括至少10,000个孔。在一些实施例中，该基底包括96、384，或1536个孔。在一些实施例中，这些组合条形码试剂的组合条形码试剂包括亚单位编码部分。在一些实施例中，该组合条形码试剂进一步包括与该亚单位编码部分邻接的接头。在一些实施例中，该接头位于该亚单位编码部分的5’、3’或5’和3’二者处。在一些实施例中，将来自不同组合条形码试剂的接头进行配置以杂交到一起，从而产生串联的组合条形码试剂。在一些实施例中，这些串联的条形码试剂对应于组合条形码。在一些实施例中，该组合条形码是二分的。在一些实施例中，该组合条形码部分地位于经组合条形编码的核酸的3’末端上，并且部分地位于经组合条形编码的核酸的5’末端上。在一些实施例中，该亚单位编码部分的长度是从4至30个核苷酸。在一些实施例中，该亚单位编码部分的长度是6个核苷酸。在一些实施例中，组合条形码试剂的每个亚单位编码部分包括单一亚单位编码序列。在一些实施例中，这些组合条形码试剂的组合条形码试剂包括靶特异性区。在一些实施例中，这些组合条形码试剂中仅一个包括靶特异性区。在一些实施例中，这些组合条形码试剂中仅两个包括靶特异性区。在一些实施例中，该靶特异性区选自下组，该组由以下各项组成：随机多聚体、寡聚dT，或基因特异性序列。在一些实施例中，将该靶特异性区进行适配从而杂交到靶核酸的有义链上。在一些实施例中，将靶特异性区进行适配从而杂交到靶核酸的反义链上。在一些实施例中，标记包括将这些组合条形码试剂与这些核酸杂交。在一些实施例中，杂交进一步包括通过同源接头将组合条形码试剂彼此进行杂交。在一些实施例中，该方法进一步包括将这些组合条形码试剂进行延伸。在一些实施例中，该延伸包括对这些组合条形码试剂的引物延伸。在一些实施例中，该延伸包括产生含有这些组合条形码试剂和核酸的序列的转录物。在一些实施例中，基底的孔包括组合条形码试剂的不同的组合。在一些实施例中，这些组合条形码试剂的不同的组合对应于不同的组合条形码。在一些实施例中，该方法进一步包括标记之后，将这些经组合条形编码的核酸进行合并。在一些实施例中，该方法进一步包括将这些经组合条形编码的核酸进行扩增，从而产生经组合条形编码的扩增子。在一些实施例中，扩增包括多链置换。在一些实施例中，扩增包括PCR。在一些实施例中，用杂交到这些组合条形码试剂序列的引物来进行扩增。在一些实施例中，用基因特异性引物和杂交到组合条形码试剂序列的引物来进行扩增。在一些实施例中，该方法进一步包括确定经组合条形编码的扩增子的序列。在一些实施例中，确定包括对经组合条形编码的扩增子的组合条形码的序列的一部分和经组合条形编码的扩增子的核酸序列的一部分进行的确定。在一些实施例中，该方法进一步包括在标记之前裂解细胞。在一些实施例中，该核酸是RNA。在一些实施例中，该核酸是mRNA。在一些实施例中，该核酸是DNA。在一些实施例中，该核酸是基因组DNA。在一些实施例中，所述细胞包括选自下组的细胞，该组由以下各项组成：人细胞、哺乳动物细胞、大鼠细胞、猪细胞、小鼠细胞、蝇细胞、蠕虫细胞、无脊椎动物细胞、脊椎动物细胞、真菌细胞、细菌细胞和植物细胞、或其任何组合。在一些实施例中，所述细胞包括肿瘤细胞。在一些实施例中，所述细胞包括患病的细胞。在一些实施例中，在孔中的这些组合条形码试剂的数目至少是2。在一些实施例中，在孔中的这些组合条形码试剂的数目至少是3。在一些实施例中，在孔中的这些组合条形码试剂的数目至少是4。在一些实施例中，在孔中的这些组合条形码试剂的数目是4。
在一方面本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包括一组组合条形码试剂，其中这些组合条形码试剂中仅一种包括靶特异性序列，其中组合条形码试剂组中的条形码包括接头，使得这些组合条形码试剂通过这些接头重叠，从而产生组合条形码。在一些实施例中，该组合条形码包括这些组合条形码试剂的组合。在一些实施例中，这些组合条形码的序列相差至少1个核苷酸。在一些实施例中，这些组合条形码的序列相差至少2个核苷酸。在一些实施例中，自组合条形码试剂组中产生的这些组合条形码的数目是至少100,000。在一些实施例中，自组合条形码试剂组中产生的这些组合条形码的数目是至少200,000。在一些实施例中，自组合条形码试剂组中产生的这些组合条形码的数目是至少300,000。在一些实施例中，自组合条形码试剂组中产生的这些组合条形码的数目是至少400,000。在一些实施例中，自组合条形码试剂组中产生的这些组合条形码的数目是331,776。在一些实施例中，这些组合条形码试剂的组合条形码试剂包括亚单位编码部分。在一些实施例中，该组合条形码试剂进一步包括与该亚单位编码部分邻接的接头。在一些实施例中，该接头位于该亚单位编码部分的5’、3’或5’和3’二者处。在一些实施例中，将来自不同组合条形码试剂的接头进行配置以杂交到一起，从而产生串联的组合条形码试剂。在一些实施例中，这些串联的条形码试剂包括组合条形码。在一些实施例中，该亚单位编码部分的长度是从5至35个核苷酸。在一些实施例中，该亚单位编码部分的长度是6个核苷酸。在一些实施例中，组合条形码的每个亚单位编码部分包括单一亚单位编码序列。在一些实施例中，每个试剂条形码m具有的亚单位编码长度为n，并且其中nm/(n x m)是至少2000。在一些实施例中，nm/(n x m)是至少3000。在一些实施例中，nm/(n x m)是至少4000。在一些实施例中，n x m是不同试剂条形码的数目。在一些实施例中，nm是不同组合条形码的可能的数目。在一些实施例中，这些组合条形码试剂的组合条形码试剂包括靶特异性区。在一些实施例中，该靶特异性区选自下组，该组由以下各项组成：随机多聚体、寡聚dT，或基因特异性序列。在一些实施例中，将该靶特异性区进行适配从而杂交到靶核酸的有义链上。在一些实施例中，将靶特异性区进行适配从而杂交到靶核酸的反义链上。在一些实施例中，该组合条形码是二分的。在一些实施例中，部分的组合条形码部分地在靶多核苷酸的3’末端上，并且部分地在靶多核苷酸的5’末端上。在一些实施例中，其中该试剂盒进一步包括基底。在一些实施例中，该基底包括至少1,000个微孔。在一些实施例中，这些微孔包括试剂条形码组中的至少两种试剂条形码。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括用于使用的说明书。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括缓冲液。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括基因特异性引物。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括扩增引物。
在一方面，本披露提供了用于全基因组测序的方法，该方法包括：使核酸染色体片段化为一种或多种染色体片段；将一种或多种染色体片段分离进含有两种或更多种试剂条形码的基底的孔中；用试剂条形码扩增这些染色体片段，从而产生经组合条形编码的片段；并且确定该经组合条形编码的片段的序列，从而进行全基因组测序。在一些实施例中，这些染色体片段的长度是至少100千碱基。在一些实施例中，这些染色体片段的长度是从50至300千碱基。在一些实施例中，这些片段化的产物具有从1x106至1x107的片段。在一些实施例中，分离包括从在孔中的1至5个片段中进行的分离。在一些实施例中，这1至5个片段是不重叠的。在一些实施例中，扩增包括多链置换。在一些实施例中，扩增是等温的。在一些实施例中，该方法进一步包括在确定之前将经组合条形编码的片段进行合并。在一些实施例中，确定包括对至少一部分的组合条形码和至少一部分的染色体片段进行测序。在一些实施例中，确定包括将序列读数基于它们的组合条形码序列分成多个组。在一些实施例中，这些组对应于基底的孔。在一些实施例中，该方法进一步包括将来自这些染色体片段的叠连群进行组装。在一些实施例中，该方法进一步包括将叠连群映射到母本或父本染色体上。在一些实施例中，该映射确定了这些染色体片段的单倍型定相。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1说明了本披露的这些组合条形码试剂的示例性实施例。
图2说明了本披露的这些组合条形码试剂的串联的示例性实施例。
图3说明了本披露用于进行核酸的组合条形编码的方法的示例性实施例。
图4描绘了使用本披露的组合条形码试剂产生叠连群的方法的示例性实施例。
图5描绘了使用本披露的组合条形码试剂对单细胞进行基因分型的方法的示例性实施例。
图6说明了将本披露的组合条形编码方法和随机条形编码方法组合的方法的示例性实施例。
图7说明了本披露的二分的组合条形码方法的示例性实施例。
图8说明了固定在固体支持物上的组合条形码的示例性实施例。
图9说明了用于对样品中的靶标进行空间条形编码的本披露的方法的示例性实施例。
优选实施例的详细说明
本披露提供了仅使用一小组的分量条形码试剂来生产不同条形编码试剂库的组合物和方法。本披露的方法提供了简单的分子生物学步骤来进行这些分量条形编码试剂的组合配对。在某些情况下，可以并行处理数十万到超过数百万个样本。例如，可以并行处理的样品的数目可以是至少100、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000；400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、或900,000个。在一些实施例中，可以并行处理的样品的数目可以是至多100、1,000、5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、或900,000个。在一些实施例中，可以并行处理至少1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、或1000万或更多个样品。在一些实施例中，可以并行处理至多1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、或1000万或更多个样品。
本披露提供了使用组合条形码试剂，用于核酸的组合条形编码的方法、组合物、试剂盒，以及系统。如在图1中所示，本披露的组合条形码试剂105/110/115/120可以包括靶特异性区、亚单位编码部分、和接头区、或其任何组合。亚单位编码部分XXXXXX可以具有亚单位编码序列。不同的亚单位编码部分可以具有不同的亚单位编码序列。如在图1中所示，组合条形码试剂105、110、115和120可以通过接头区串联到一起。可以将串联的组合条形码试剂进行延伸(例如，用引物延伸)，从而产生含有这些组合条形码试剂和靶多核苷酸的序列的转录物125。组合条形码试剂可以减少用于产生大量条形码库所需的试剂数量。
定义
除非另外定义，在此所使用的全部技术术语具有与本披露所属领域内的技术领域中的普通技术人员通常所理解的相同的意思。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、以及“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指示。除非另外说明，在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
如本文所用的，术语“关联的”或“相关联”可以表示两种或更多种物种可被识别为在某个时间点位于相同位置。关联可以表示两种或更多种物种存在于或曾经存在于相似的容器内。关联可以是信息学关联，其中例如将关于两种或更多种物种的数字信息存储，并且可以将其用于确定一个或多个物种在某个时间点位于相同位置。关联也可以是物理关联。在一些情况下，两种或更多种相关联的物种彼此之间或与共同的固体或半固体表面是“连接的”、“附接的”或“固定的”。关联可以指用于将标签附着到固体或半固体支持物(如珠)的共价或非共价手段。关联可以包括靶标和标记之间的杂交。
术语“分量条形码”、“试剂条形码”和“组合条形码试剂”可互换地使用，意指包括亚单位编码序列的多核苷酸序列，并且可以与一种或多种其他组合条形码试剂一起使用，从而产生组合条形码。例如，组合条形码试剂可以通过接头串联，从而产生组合条形码。
如本文所用的，术语“组合条形码”意指包括一种或多种组合条形码试剂的序列的多核苷酸序列。
如本文所用的，术语“互补性”意指用于两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一种核酸的核苷酸进行氢键键合，那么这两种核酸被认为是在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”(其中仅一些核苷酸结合)，或当总互补性存在于这两个单链分子之间时互补性可以是完整的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列是互补的，那么可以说该第一核苷酸序列是该第二序列的“互补序列”。如果第一核苷酸序列与第二序列的反向序列(即，核苷酸的顺序是相反的)是互补的，可以说该第一核苷酸序列是该第二序列的“反向互补序列”。如本文所用的，术语“互补序列”、“互补性”和“反向互补序列”可互换地使用。从本披露可以理解，如果一种分子可以与另一种分子杂交，则该分子可以是杂交分子的互补序列。
如本文所用的，术语“数字计数”意指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定与样品中的靶标相关联的单一标记的数目的步骤。这种随机方法将来自定位和识别相同分子之一的分子计数问题转化为关于检测一组预定义标记的一系列是/否的数字问题。
如本文所用的，术语“第一通用标记”意指对于本披露的条形码是通用的标记。第一通用标记可以是测序引物结合位点(例如，读数引物结合位点，即，用于亿明达序列仪(Illumina sequencer))。
如本文所用的，术语“标记(“label”或“labels)”意指核酸密码与样品中的靶标相关联。标记可以是，例如，核酸标记。标记可以是完全或部分扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可被识别为不同的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的连接，例如天然序列和非天然序列的连接。如本文所用的，术语“标记”与术语“标志”、“标签”或“标记-标签”可互换地使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施例中，标记可以用于确定样品的一致性、样品的来源、细胞和/或靶标的一致性。
如本文所用的，术语“非消耗性库”意指由许多不同的标记构成的随机条形码的库。非消耗性库可以包括大量的不同随机条形码，使得当该非消耗性库与靶标库相关联时，每种靶标很可能是与单一随机条形码相关联的。通过随机选择的统计学可以确定每种经标记的靶分子的单一性，这取决于与标记的多样性相比，集合中相同靶分子的拷贝数目。所得的经标记的靶分子组的大小可以通过条形编码处理的随机性质来确定，并且对检测的随机条形码的数目进行分析，然后允许计算存在于初始集合或样品中的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数目与单一随机条形码的数目的比率较低时，这些经标记的靶分子是特别单一(即，超过一个靶分子将被给定标记进行标记的概率很低)。
如本文所用的，“核酸”意指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对细胞而言可以是外源或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、外来核酸、吗啉代、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光黄素)、含有核苷酸的硫醇、生物素连接的核苷酸、荧光基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷、以及怀俄苷。“核酸”、“多核苷酸、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可互换地使用。
核酸可以包括一种或多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)以提供具有新的或增强特征的核酸(例如，改进的稳定性)。核酸可以包括核酸亲和标记。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两种最常见的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2′、3′、或5′羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将邻接的核苷彼此共价连接以形成线性高分子化合物。反过来，该线性高分子化合物各自的末端可以进一步连接从而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是适合的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，这些磷酸基团通常可以被称为形成核酸的核苷间骨架。核酸的键或骨架可以是3'至5'磷酸二酯键。
核酸可以包括经修饰的骨架和/或经修饰的核苷间键。经修饰的骨架可以包括在该骨架中保留磷原子的骨架和在该骨架中不具有磷原子的骨架。其中包含磷原子的适合的经修饰的核酸骨架可以包括，例如，硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基-磷酸三酯；甲基和其他烷基膦酸酯，如3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯；磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷二酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯(thionophosphoramidate)、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯；以及具有标准3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中一种或多种核苷酸间键是3′至3′、5′至5′或2′至2′键。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有以下结构的那些：吗啉代键(从核苷的糖部分中部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲亚氨基和亚甲肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的其他骨架。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”包括，例如其中只有呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键二者都被非呋喃糖基团取代的多核苷酸，仅呋喃糖环的取代还可以被称为糖替代物。可以保持杂环碱基部分或经修饰的杂环碱基部分，用于与合适的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。可以保留核苷酸，并且将这些核苷酸直接或间接地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的骨架可以包括给予PNA含酰胺的骨架的两种或更多种连接的氨基乙基甘氨酸单元。可以将这些杂环碱基部分直接或间接地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包括吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包括代替核糖环的6-元吗啉代环。在这些实施例的一些中，磷二酰胺酯或其他非-磷酸二酯核苷间键可以代替磷酸二酯键。
核酸可以包括连接的吗啉代单元(即，吗啉代核酸)，该吗啉代单元具有附接至吗啉代环的杂环碱基。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物可以具有较少的与细胞蛋白的不希望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。可以使用不同的连接基团将吗啉代类中的各种化合物连接在一起。多核苷酸模拟物的另外的类型可以被称为环己烯基核酸(CeNA)。通常出现在核酸分子中的呋喃糖环可以被环己烯基环取代。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并且使用亚磷酰胺化学过程将这些亚磷酰胺单体用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以形成与天然复合物具有相似稳定性的核酸互补序列的复合物。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2′-羟基基团连接至糖环的4′碳原子上，从而形成2′-C、4′-C-甲醛键(oxymethylene linkage)，从而形成二环糖部分。该键可以是亚甲基(-CH2-)，这是桥接2′氧原子和4′碳原子的基团(其中n是1或2)。LNA和LNA类似物可以表现出与互补性核酸非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3′-外切核苷酸降解的稳定性以及良好的溶解度特性。
在一些实施例中，核酸还可以包括核碱基(通常被简单地称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基(-C═C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶；胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代；8-氨基；8-硫醇；8-硫烷基；8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代、尤其是5-溴代；5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤；2-氨基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。经修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹，如经取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并(3′,′:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文所用的，术语“样品”意指含有靶标的组合物。通过所披露的方法、装置、和系统进行分析的合适样品包括细胞、单细胞、组织、器官、或生物体。
如本文所用的，术语“取样装置”或“装置”意指可以将样品的一部分取出和/或将该部分放置在基底上的装置。取样装置可以指，例如荧光激活的细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、叶片网格(blade grid)，和/或切片机。
如本文所用的，术语“固体支持物”意指多个随机条形码可以附接至其上的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心、多孔或空心球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状是如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。置于阵列中的多个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”可互换地使用。
固体支持物可以意指“基底”。基底可以是固体支持物的一种类型。基底可以意指连续的固体或半固体表面，本披露的方法可以在其上进行。例如，基底可以意指阵列、柱体、芯片、装置、和载玻片。如本文所用的，“固体支持物”和“基底”可互换地使用。
如本文所用的，术语“随机条形码”意指包括本披露的标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形编码的多核苷酸序列。可以将随机条形码用于对样品内的靶标进行定量化。可以将随机条形码用于控制在标记与靶标相关联之后可以发生的错误。例如，可以将随机条形码用于评估扩增或测序错误。与靶标相关联的随机条形码可以被称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如本文所用的，术语“随机条形编码”意指对核酸进行的随机标记(例如，条形编码)。随机条形编码可以利用递归泊松策略来对与靶标相关联的标记进行关联和量化。如本文所用的，术语“随机条形编码”与“随机标记”可互换地使用。
如本文所用的，术语“靶标”意指可以与随机条形码相关联的组合物。通过披露的方法、装置、和系统进行分析的示例性适合的靶标包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等。靶标可以是单链或双链的。在一些实施例中，靶标可以是蛋白质。在一些实施例中，靶标是脂质。
术语“逆转录酶”意指一组具有逆转录酶活性(即，该酶催化由RNA模板合成DNA)的酶。通常，这样的酶包括，但不限于，逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶、以及突变体、变体或其衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶，以及II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌Ll.LtrB内含子逆转录酶、嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)TeI4c内含子逆转录酶、或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。逆转录酶的其他类型可以包括非逆转录病毒逆转录酶(即，逆转录子、II组内含子，以及其中的多样性产生的逆转录因子)的许多类型。
术语“模板转换”意指逆转录酶将初始核酸序列模板转换至与从该初始模板合成的核酸的3’末端具有很少互补性或不具有互补性的新核酸序列模板的3’末端的能力。使用模板转换可以制备靶多核苷酸的核酸拷贝。模板转换允许，例如使用逆转录酶来制备DNA拷贝，该逆转录酶将初始核酸序列模板转换至与从该初始模板合成的DNA的3’末端具有很少互补性或不具有互补性的新核酸序列模板的3’末端，从而允许连续产物DNA的合成，该DNA直接将衔接子序列连接至未经连接的靶标寡核苷酸序列。模板转换可以包括衔接子、同聚物加尾(例如，聚腺苷酸化)、随机引物，或寡核苷酸的连接，聚合酶可以与该连接相关联。
随机条形码
如本文披露的，随机条形码可以是可用于对靶标进行随机标记(例如，条形码，标签)的多核苷酸序列。随机条形码可以包括一种或多种标记。示例性标记包括，但不限于，通用标记、细胞标记、分子标记、样品标记、板标记、空间标记、预空间标记，及其任何组合。随机条形码可以包括可将随机条形码连接至固体支持物的5’胺。随机条形码可以包括一种或多种通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记，以及分子标记。通用标记可以是最5’的标记。分子标记可以是最3’的标记。空间标记、维度标记，和细胞标记可以处于任何顺序。在一些情况下，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记、以及分子标记处于任何顺序。随机条形码可以包括靶结合区。该靶结合区可以与样品中的靶标(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包括可以与mRNA的聚-A尾相互作用的寡聚dT序列。在一些情况下，随机条形码(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记、以及分子标记)的标记可以通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多个核苷酸进行分离。
随机条形码可以包括一种或多种通用标记。对于在随机条形码组中的所有随机条形码(例如，附接至给定固体支持物)，一种或多种通用标记可以是相同的。在一些实施例中，对于附接至多个珠的所有随机条形码，一种或多种通用标记可以是相同的。在一些实施例中，通用标记包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的随机条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相联系的测序引物。在一些实施例中，通用标记可以包括能够PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施例中，该通用标记包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可用于引发随机条形码转录的序列。通用标记可以包括可用于延伸随机条形码或随机条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是，或是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至多约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些实施例中，可切割接头或经修饰的核苷酸是通用标记序列的一部分，以使得能够从所述支持物上切割掉随机条形码。如本文所用的，通用标记与“通用PCR引物”可互换地使用。
随机条形码可以包括维度标记。维度标记可以包括如下核酸序列，该核酸序列提供关于其中随机标记发生的维度信息。例如，维度标记可以提供关于对靶标进行随机条形编码的时间的信息。维度标记可以与样品中随机条形编码的时间相关联。维度标记可以在随机标记的时间处被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。该维度标记提供关于顺序的信息，其中靶标、靶标的组、和/或样品被随机条形编码。例如，在细胞周期的G0期可以对细胞群进行随机条形编码。在细胞周期的G1期，可以用随机条形码对这些细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用随机条形码对这些细胞再次进行脉冲处理，等等。在每个脉冲期(例如，细胞周期的每个时期)，随机条形码可以包括不同的维度标记。以这种方式，该维度标记提供关于哪些靶标在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以询问许多不同的生物阶段。示例性生物阶段可以包括，但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)、和转录物降解。在另一个实例中，在用药物和/或治疗处理之前和/或之后，可以对样品(例如，细胞，细胞群)进行随机标记。不同靶标的拷贝数目的变化可以说明样品对药物和/或治疗的响应。
在一些实施例中，维度标记是可激活的。可激活的维度标记可以被激活，例如，在特定的时间点处。可激活的维度标记可以被组成型地激活(例如，没有被关闭)。可激活的维度标记可以被可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。该维度标记可以是可逆地可激活至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次或更多次。该维度标记可以是可逆地可激活1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次或更多次。例如，可以用荧光；光；化学事件(例如，切割，另一种分子的连接，修饰的添加(例如，聚乙二醇化、SUMO修饰化、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)；光化学事件(例如，光锁定)；以及引入非天然的核苷酸将该维度标记激活。
对于所有附接至给定固体支持物(例如，珠)的随机条形码，维度标记可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)可以是不同的。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码包括相同的维度标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少60％的随机条形码包括相同的维度标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少95％的随机条形码包括相同的维度标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106或更高的单一维度标记序列。维度标记的长度可以，例如，是或是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。维度标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或更少或更多个核苷酸。维度标记的长度可以是例如，约5个至约200个核苷酸，或约10个至约150个核苷酸。在一些实施例中，维度标记的长度是从约20个至约125个核苷酸。
随机条形码可以包括空间标记。空间标记可以包括如下核酸序列，该核酸序列提供关于与随机条形码相关联的靶分子的空间定向信息。空间标记可以与样品中的坐标相关联。该坐标可以是固定的坐标。例如可以参考基底固定坐标。空间标记可以参考二维或三维网格。可以参考界标固定坐标。在空间中界标是可被识别的。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物学结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然的界标，如具有可识别的鉴定物(如色码、条形码、磁性、荧光、放射性)的结构，或单一尺寸或形状。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器，或液滴)相关联。在一些情况下，将多个空间标记一起用于编码在空间中的一种或多种位置。
对于所有附接至给定固体支持物(例如，珠)的随机条形码，空间标记可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)可以是不同的。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码包括相同的空间标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上至少60％的随机条形码包括相同的空间标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上至少95％的随机条形码包括相同的空间标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106或更高的单一空间标记序列。空间标记的长度可以是，或至少是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些实施例中，空间标记的长度是最多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4个核苷酸。空间标记的长度可以是例如，从约5个至约200个核苷酸。空间标记的长度可以是例如，从约10个至约150个核苷酸。空间标记的长度可以是从约20个至约125个核苷酸。
随机条形码可以包括细胞标记。细胞标记可以包括如下核酸序列，该核酸序列提供用于确定哪个靶核酸来源于哪个细胞的信息。在一些实施例中，对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有随机条形码，细胞标记是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)可以是不同的。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的随机条形码包括相同的细胞标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上的至少60％的随机条形码包括相同的细胞标记。在一些实施例中，在同一固体支持物上至少95％的随机条形码包括相同的细胞标记。
多个固体支持物(例如，珠)可以表现多达106或更高的单一细胞标记序列。细胞标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。细胞标记的长度可以是或是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或更少或更多个核苷酸。细胞标记的长度可以是例如，从约5至约200个核苷酸。细胞标记的长度可以是例如，从约10至约150个核苷酸。细胞标记的长度可以是例如，从约20至约125个核苷酸。
随机条形码可以包括分子标记。分子标记可以包括如下的核酸序列，该核酸序列针对与随机条形码杂交的特定类型的靶核酸种类提供鉴定信息。分子标记可以包括如下核酸序列，该核酸序列为与随机条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸种类的特定出现提供计数器。在一些实施例中，一组不同的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施例中，可以存在多达106或更多个附接至给定固体支持物(例如，珠)的单一分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达105或更多个附接至给定固体支持物(例如，珠)的单一分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达104或更多个附接至给定固体支持物(例如，珠)的单一分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达103或更多个附接至给定固体支持物(例如，珠)的单一分子标记序列。在一些实施例中，可以存在多达102或更多个附接至给定固体支持物(例如，珠)的单一分子标记序列。分子标记的长度可以是至少约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。分子标记的长度可以是至多约300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4或更少个核苷酸。
随机条形码可以包括靶结合区。在一些实施例中，这些靶结合区包括与靶标(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如与特定基因序列杂交)的核酸序列。在一些实施例中，靶结合区包括可附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施例中，所述靶结合区包括能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后该随机条形码可以连接到包括与所述限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
随机条形码可以包括靶结合区。靶结合区可以与感兴趣的靶标杂交。例如，靶结合区可以包括寡聚dT，该寡聚dT可以与含有聚-腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶特异性区杂交。靶结合区的长度可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多个核苷酸。靶结合区的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个或更多个核苷酸。靶结合区的长度可以是从5个至30个核苷酸。当随机条形码包括基因特异性靶结合区时，随机条形码可以被称为基因特异性随机条形码。
靶结合区可以包括非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指独立于靶核酸的特定序列可与多个靶核酸结合的序列。例如，靶结合区可以包括与mRNA分子上的聚-A尾杂交的随机多聚体序列或寡聚dT序列。随机多聚体序列可以是例如随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施例中，对于附接至给定珠的所有随机条形码，靶结合区是相同的。在一些实施例中，对于附接至给定珠的多个随机条形码，这些靶结合区包括两种或更多种不同的靶标结合序列。靶结合区的长度可以是，或是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶结合区的长度是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。
随机条形码可以包括定向特性，该定向特性可以用于定向(例如，比对)这些随机条形码。随机条形码可以包括用于等电聚焦的部分。不同的随机条形码可以包括不同的等电聚焦点。当这些随机条形码被引入到样品中时，该样品可以经历等电聚焦，以便于将这些随机条形码定位成已知的方式。以这种方式，该定向特性可以用于开发样品中随机条形码的已知的映射图。示例性定向特性包括，但不限于，电泳迁移率(例如，基于随机条形码的尺寸)、等电点、旋转、导电性，和/或自组装。例如，随机条形码可以包括自组装的定向特性，当激活时可以自组装成特定定向(例如，核酸纳米结构)。
随机条形码可以包括亲和力特性。空间标记可以包括亲和力特性。亲和力特性可以被包括在化学和/或生物部分中，该特性可以促进随机条形码与另一种实体(例如，细胞受体)的结合。例如，亲和力特性可以包括抗体。抗体对于样品上的特定部分(例如，受体)可以是特异性的。抗体可以将随机条形码引导至特定的细胞类型或分子。可以对在特定的细胞类型或分子处和/或在其附近的靶标进行随机标记。除了空间标记的核苷酸序列，亲和力特性还可以提供空间信息，因为该抗体可以将随机条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是人源化的。抗体可以是嵌合的。抗体可以是裸抗体。抗体可以是融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫学活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。
抗体可以是抗体片段。抗体片段可以是抗体(如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等)的一部分。抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区构成的分离的片段，比如由重链和轻链的可变区和重组单链多肽分子构成的“Fv”片段，其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接。示例性抗体可以包括，但不限于，针对癌细胞的抗体、针对病毒的抗体、结合至细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)的抗体，以及治疗性抗体。
本披露所述的细胞标记和/或任何标记可以进一步包括具有定义长度的一组单一核酸子序列，例如各自7个核苷酸(相当于一些汉明(Hamming)纠错码中使用的位数)，其被设计成提供纠错能力。类似于其他的纠错码，汉明码基于冗余原理，并且可以通过向待经嘈杂介质传输的数据中添加冗余校验位来构建。此类纠错码可以用冗余校验位编码样品鉴定物，并且“传输”呈字码的这些样品鉴定物。汉明码可以参考基于能够校正单比特差错的固有冗余来识别单一二进制码的算术过程。例如，汉明码可以与核酸条形码匹配，以便筛选在核酸扩增期间发生的单个核苷酸错误。通过使用汉明码识别单个核苷酸错误，从而可以允许校正核酸条形码。
汉明码可以由选自二进制子空间中的多维球体(即，例如，超球面)中心的可能的字码亚组来表示。单比特差错可能落入与特定字码相关联的超球面内，并且因此可以被校正。另一方面，可以检测不与特定字码相关联的双比特差错，但是不校正。考虑到第一个超球面在坐标(0，0，0)(即，例如，使用x-y-z坐标系统)上居中，其中通过落入从中心坐标的1的半径内可以校正任何单比特差错；即，例如，单比特差错坐标为(0，0，0)；(0，1，0)；(0，0，1)；(1，0，0)或(1，1，0)。同样地，可以构建第二个超球面，其中通过落入其中心坐标(1，1，1)(即，例如，(1，1，1)；(1，0，1)；(0，1，0)；或(0，1，1)的1的半径内，单比特差错可以被校正。
在一些实施例中，用于产生纠错码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是至少3个核苷酸、至少7个核苷酸、至少15个核苷酸，或至少31个核苷酸。在一些实施例中，其他长度的核酸子序列可以用来产生纠错码。
当随机条形码包括不止一种标记(例如，不止一种细胞标记或不止一种分子标记)类型时，这些标记可以散布在接头标记序列中。接头标记序列的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。可以将接头标记序列用于促进随机条形码的合成。该接头标记可以包括纠错码(例如，汉明码)。
组合条形码
可以将大量不同的组合条形码用于标记大量样品，如单细胞或核酸片段，用于平行分析(如测序)。如本文披露的，一组大量的组合条形码可以产生自相对小数目的条形码亚单位序列，其中这些条形码亚单位序列通过各种组合彼此连接。以这种方式，通过不同条形码亚单位序列的数目、组合条形码中彼此连接的条形码亚单位序列的数目，或二者中的相对较小的增加，产生的不同组合条形码的数目可以显著地增加。
本文披露的一些实施例提供了包括一组组合条形码的组合物。组合条形码可以包括两种或更多种通过接头序列、靶标核苷酸序列，或二者彼此连接的条形码亚单位序列。两种或更多种条形码亚单位序列可以，例如，通过一种或多种接头序列的杂交，随后进行延伸而彼此连接，形成组合条形码。例如，连接至条形码亚单位序列的接头序列可以与连接至另一种条形码亚单位序列的接头序列杂交，并且在延伸反应中使用其他条形码亚单位序列作为模板来并入其他条形码亚单位序列等。在一些实施例中，两种条形码亚单位序列二者均可以与靶核苷酸序列杂交，随后进行两种延伸反应，从而将两种条形码亚单位序列并入靶核苷酸序列。
在一些实施例中，组合条形码中条形码亚单位序列的数目，并且由此该组合条形码的长度可以被接头序列的设计影响。例如，为了产生具有m个条形码亚单位序列的组合条形码，可以使用m-1或m-2个接头序列(其中m是≥2的整数)。如果使用n个单一条形码亚单位序列以产生具有m个条形码亚单位序列的组合条形码，可以产生最大数目为nm的单一组合条形码。在一些实施例中，该组合条形码可以包括寡核苷酸，该寡核苷酸包含以下构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…条形码亚单位序列c-接头m-1-条形码亚单位序列d。在一些实施例中，该组合条形码可以包括包含构造式条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…-条形码亚单位序列c的第一寡核苷酸；以及包含构造式条形码亚单位序列d-…-接头3-条形码亚单位序列e-接头m-2-条形码亚单位序列f的第二寡核苷酸。该第一寡核苷酸和该第二寡核苷酸可以通过靶核苷酸序列彼此连接。在一些实施例中，在组合条形码中，条形码亚单位序列a、条形码亚单位序列b、条形码亚单位序列c…中的每一个选自n个单一条形码亚单位序列的组。在一些实施例中，在组合条形码中，条形码亚单位序列a、条形码亚单位序列b、条形码亚单位序列c…的一些或所有可以是相同的。在一些实施例中，在组合条形码中条形码亚单位序列a、条形码亚单位序列b、条形码亚单位序列c…的一些或所有可以是不同的。
在一些实施例中，一组组合条形码包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、至少200,000、至少300,000、至少400,000、至少500,000、至少1,000,000、至少10,000,000、至少100,000,000、至少1,000,000,000，或更多个单一组合条形码。
组合条形码可以包括一种或多种本文披露的随机条形码。例如，组合条形码可以包括一种或多种通用标记、细胞标记、分子标记、样品标记、板标记、空间标记、预空间标记、或其任何组合。在一些实施例中，随机条形码(如细胞标记、样品标记、空间标记等)可以包括两种或更多种条形码亚单位序列，例如，至少2、至少3、至少4、至少5种，或更多种条形码亚单位序列。
在一些实施例中，可以将这些组合条形码固定在固体支持物上(如在微孔阵列中的珠或微孔)。如在图8中所示，可以用第一多个组合条形码涂覆固体支持物(如珠或微粒)。在一些实施例中，这些组合条形码可以包括一种或多种通用序列(US)、细胞标记、接头、分子标记、靶特异性区(如寡聚(dT)序列)。在一些实施例中，该固体支持物可以包括具有与第一多个组合条形码相同结构(但不一定是相同序列)的第二多个组合条形码，除了具有空间引物而不是靶特异性区之外。在一些实施例中，第二多个组合条形码的数目(例如，数目1/10、1/100、1/1,000)少于第一多个组合条形码。在一些实施例中，使用第二多个组合条形码来经通用PCR引入空间标记。第二多个组合条形码可以通过印刷或分散到每个孔中来进行添加。在一些实施例中，该第二多个组合条形码可以通过用第一珠将第二珠递送到相同孔中来递送。
分量条形码
如本文披露的，包括条形码亚单位序列的两种或更多种分量条形码中的每一种可以经一种或多种接头序列彼此连接，从而产生组合条形码。例如，每种分量条形码可以包括条形码亚单位序列和一种或多种接头序列或其互补序列，并且将两种或更多种分量条形码配置为通过该一种或两种接头序列或其互补序列彼此连接，从而产生一组组合条形码。分量条形码可以包括条形码亚单位序列、接头序列、靶特异性区、或其任何组合。例如，分量条形码可以包括以下配置中的一种：a)条形码亚单位序列-接头序列(即，该分量条形码包括条形码单位序列和接头序列二者，其中相对于接头序列，条形码亚单位序列位于分量条形码的5’部分处)；b)接头序列-条形码亚单位序列-接头序列的互补序列；c)接头序列-条形码亚单位序列的互补序列；d)接头序列的条形码亚单位序列-互补序列；e)接头序列的接头序列-条形码亚单位序列-互补序列；或f)接头序列-条形码亚单位序列。在一些实施例中，条形码亚单位序列和接头序列可以不直接通过化学键连接。例如，条形码亚单位序列和接头序列可以通过化学或生物部分连接。
分量条形码或组合条形码试剂可以包括含有条形码亚单位序列的亚单位编码部分。组合条形码试剂可以包括1、2、3、4、或5，或更多个亚单位编码部分。组合条形码试剂可以包括至少或至多1、2、3、4，或5个亚单位编码部分。在一些情况下，组合条形码试剂具有1个亚单位编码部分。亚单位编码部分可以包括亚单位编码序列。可互换使用的亚单位编码序列或条形码亚单位序列可以意指组合条形码试剂中核苷酸的单一序列。亚单位编码部分的长度可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、或45个，或更多个核苷酸。亚单位编码部分的长度可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、或45个核苷酸。在一些情况下，亚单位编码部分的长度是6个核苷酸。
在一些实施例中，亚单位编码部分的每个位置处具有4个核苷酸(例如，A、T、C，和G)的选项。如果每个亚单位编码部分具有的长度为n个核苷酸(其中n是正整数)，对于亚单位编码部分可能的单一亚单位编码序列的数目可以是4n。例如，如果亚单位编码部分的长度是6个核苷酸，并且每个位置处具有4个核苷酸的选项，可能的单一亚单位编码序列的总数可以是4,096个密码。
可能的亚单位编码序列的亚组可以用作本披露的组合条形码试剂。可以对可能的亚单位编码序列的亚组基于它们的纠错特性进行选择。例如，可能的亚单位编码序列的亚组可以具有走够远的序列(例如，具有不同足够的序列，距离)，使得这些亚单位编码序列可以针对碱基错误(例如，1或2个碱基错误)进行纠正。在另一个实例中，亚单位编码序列的亚组可以具有将本披露的纠错条形码(例如，汉明码)并入序列的长度和数目。
在亚组中亚单位编码序列的数目可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、或45个，或更多。在一些实施例中，在亚组中亚单位编码序列的数目是至多5、10、15、20、25、30、35、40、或45个。在一些实施例中，在亚组中亚单位编码序列的数目是24。亚单位编码序列可以是彼此不同的。亚单位编码序列可以相差或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个核苷酸。在一些实施例中，亚单位编码序列可以相差至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。亚单位编码序列可以是序列的非交叉杂交的组。亚单位编码序列可以是能纠错的。
组合条形码试剂可以包括一种或多种接头。接头可以用于将组合条形码试剂连接在一起(例如，将组合条形码试剂串联在一起)。可以配置接头，将其与另一种组合条形码试剂(例如，从而串联这些组合条形码试剂)的接头进行杂交。接头可以是组合条形码试剂的亚单位编码的3’。接头可以是组合条形码试剂的亚单位编码的5’。接头可以是组合条形码试剂的亚单位编码的3’和5’二者。接头的长度可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，接头的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个核苷酸。在一些实施例中，可以将第一组合条形码试剂的接头序列与第二组合条形码试剂的接头序列进行杂交。在一些实施例中，第一组合条形码试剂的接头序列可以是第二组合条形码试剂的接头序列的互补序列。在一些实施例中，可以将第一组合条形码试剂的接头序列与第二组合条形码试剂的接头序列(具有或具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个错配)进行杂交。在一些实施例中，第一组合条形码试剂的接头序列可以与第二组合条形码试剂的接头序列(具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个错配)进行杂交。
在一些实施例中，组合条形码试剂包括靶特异性区。靶特异性区可以与本披露的靶多核苷酸(例如，来自单细胞)相关联(例如，杂交)。靶特异性区可以包括寡聚dT、基因特异性序列，或随机多聚体序列。靶特异性区可以与本披露的双链靶多核苷酸的有义链进行杂交。靶特异性区可以与本披露的双链靶多核苷酸的反义链进行杂交。靶特异性区的长度可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个核苷酸。在一些实施例中，靶特异性区的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个核苷酸。
在一些实施例中，组合条形码试剂包括一种或多种细胞标记、分子标记、通用标记、靶结合区、或本披露的任何标记、或其任何组合。
组合条形码试剂可以由任何类型的核酸(例如，PNA，LNA)组成。可以将组合条形码试剂附接至固体或半固体支持物(例如，珠、凝胶颗粒、抗体、水凝胶、琼脂糖)。可以将组合条形码试剂固定在本披露的基底上(例如，阵列)。组合条形码试剂可以并入生物包装(如病毒、脂质体、微球等)中。组合试剂可以包含部分。部分可以充当鉴定物(例如，荧光部分，放射性部分)。
分量条形码的组
本文披露的一些实施例提供了包括用于产生一组组合条形码的一组分量条形码的组合物。在组中单一组合条形码试剂的数目可以是n x m，其中n是亚单位编码序列(n个)的数目，并且m是组合条形码(m个)中亚单位编码部分的数目，并且其中n和m是正整数。例如，当亚单位编码序列的亚组是24时，并且在组合条形码中有4个亚单位编码部分时，可以存在96个总的单一组合条形码试剂。使用n x m个单一分量条形码产生的该组单一组合条形码的最大数目是nm，其中在组合条形码中，n是亚单位编码序列的数目，并且m是亚单位编码部分的数目。例如，如果在组合条形码中有24个亚单位编码序列和4个亚单位编码部分，最大组的331,776个单一组合条形码可以产生自96个单一组合条形码试剂的组。
在组合条形码中亚单位编码部分的数目可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个或更多个。在组合条形码中亚单位编码部分的数目可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一些实施例中，在组合条形码中亚单位编码部分的数目是4(如在图1中所示)。
组合条形码试剂组中的一些组合条形码试剂可以包括靶特异性区。在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目可以是或是至少1、2、3、4、或5个或更多个。在一些实施例中，在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目可以是至多1、2、3、4，或5个。如在图2A-C中所示，在一些实施例中，在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目至少是2。在一些情况下，在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目是2(图2A-B)。在一些实施例中，在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目至少是1。在一些情况下，在包括靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目是1(图2C)。
一组组合条形码试剂可以包括一些包含靶特异性区的组合条形码试剂以及一些不包含靶特异性区的组合条形码试剂。在一些情况下，一组组合条形码试剂包括具有靶特异性区的一种组合条形码试剂，并且其余组合条形码试剂可能不具有靶特异性区(例如，可以包括亚单位编码部分/序列以及一种或多种接头)。在一些情况下，一组组合条形码试剂包括具有靶特异性区的两种组合条形码试剂，并且其余组合条形码试剂可能不具有靶特异性区(例如，可以包括亚单位编码部分/序列以及一种或多种接头)。
在可能不具有靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多个。在一些实施例中，在可能不具有靶特异性区的组中组合条形码试剂的数目可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。
一组组合条形码试剂可以编码多个组合条形码。组合条形码可以包括来自该组(即，针对给定靶多核苷酸)的组合条形码试剂的总序列。组合条形码可以是针对给定靶多核苷酸的串联组合条形码试剂的总序列(例如，通过接头连接在一起)。组合条形码可以包括这些组合条形码试剂的接头序列。组合条形码可以排除这些组合条形码试剂的接头序列(例如，仅包括这些亚单位编码序列)。组合条形码可以是针对给定靶多核苷酸的这些组合条形码试剂的亚单位编码部分序列的总序列。
在一些实施例中，组合条形码可以意指(例如，当在以下情况下形成)通过一种或多种接头序列彼此杂交和/或通过一种或多种靶特异性区与靶多核苷酸杂交的两种或更多种组合条形码试剂。在一些实施例中，组合条形码可以意指通过延伸、逆转录，和/或扩增并入具有或不具有靶多核苷酸的单个多核苷酸中的两种或更多种组合条形码试剂。
在一些实施例中，组合条形码可以是二分的。一部分组合条形码可以连接至靶多核苷酸的5’末端。一部分组合条形码可以连接至靶多核苷酸的3’末端。全部组合条形码可以连接至靶多核苷酸的5’末端。全部组合条形码可以连接至靶多核苷酸的3’末端。
组合条形码试剂的组合可以制得组合条形码。组合条形码可以包括一种或多种细胞标记、分子标记、通用标记、靶结合区、本披露的任何标记、或其任何组合。在一些情况下，组合条形码试剂可以不包括标记。例如，如果组合条形码由4种组合条形码试剂组成，1种组合条形码试剂可以不包括标记，并且该组合条形码的3种组合条形码试剂可以包括本文披露的任何标记。组合条形码试剂可以包括本披露的随机条形码。
组合条形码试剂的组可以是随机的。例如，在组合条形码中接头序列的全部或其中一些可以是相同的。因此，可以将这些分量条形码按任何顺序连接。组合条形码试剂的组可以是非随机的。例如，在组合条形码中所有的接头序列可以是不同的。因此，分量条形码的顺序可以按特定顺序进行连接。
在一些实施例中，将组合条形码试剂附接至本文披露的任何固体或半固体支持物。例如，可以将这些组合条形码试剂附接至珠和凝胶颗粒的组合，或在溶液中的第一组合条形码试剂与附接至珠的第二组合条形码试剂的组合，或在微孔内固定在基底上的第一组合条形码试剂和在溶液中的第二组合条形码试剂或存在于在微孔内的固体颗粒上。在一些实施例中，将组合条形码试剂嵌入水凝胶或类似材料中，其可用作海绵状支架，用于生物样品和核酸的固定位置定位。
固体支持物
本文披露的组合条形码试剂和/或组合条形码可以附接至固体支持物(例如，珠、基底)。本文披露的组合条形码试剂和/或组合条形码可以位于固体支持物(例如，在阵列的微孔)中。如本文所用的，术语“拴系”、“附接”，和“固定”可互换地使用，并且意指用于将随机条形码附接至固体支持物的共价或非共价手段。各种不同固体支持物中的任一种可用作固体支持物，用于附接预合成的组合条形码试剂或用于原位固相合成组合条形码试剂。
在一些情况下，固体支持物是珠。珠可以包括任何类型的实心、多孔或空心球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其由塑料、陶瓷、金属或聚合材料构成，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。珠可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状是如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。
珠可以包括多种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，其一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、交联琼脂糖、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙及其任何组合。
珠的直径可以是，或至少是约5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm，或50μm。珠的直径可以是至多约5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm，或50μm。珠的直径可以与基底的孔的直径相关。例如，相比孔的直径，珠的直径可以是或是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更长或更短。在一些实施例中，相比孔的直径，珠的直径可以是至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更长或更短。珠的直径可以与细胞(例如，由基底的孔截留的单细胞)的直径相关。相比细胞的直径，珠的直径可以是或是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、或300％，或更长或更短。在一些实施例中，相比细胞的直径，珠的直径可以是至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、或300％，或更长或更短。
可以将珠附接至和/或嵌入本披露的基底。可以将珠附接和/或嵌入凝胶、水凝胶、聚合物，和/或基质中。使用存在于珠中可以充当位置地址的随机条形码上的空间标记，可以鉴定在基质(例如，凝胶、基质、支架，或聚合物)中珠的空间位置。
珠的实例可以包括但不限于链霉亲和素珠、琼脂糖珠、磁珠、微珠、缀合抗体的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、缀合A蛋白的珠、缀合G蛋白的珠、缀合A/G蛋白的珠、缀合L蛋白的珠、缀合寡聚dT的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠以及BcMagTM羧基封端的磁珠。
珠可以关联有(例如浸渍有)量子点或荧光染料，以使其在一个荧光光通道或多个光通道中是荧光的。珠可以关联有氧化铁或氧化铬，以使其具有顺磁性或铁磁性。珠是可被识别的。使用照相机可以将珠成像。珠可以具有与珠相关联的可检测的密码。例如，珠可以包括RFID标签。珠可以包括任何可检测的标签(例如，UPC密码、电子条形码、经蚀刻的鉴定物)。珠的尺寸可以变化，例如由于在有机或无机溶液中的溶胀。珠可以是疏水性的或亲水性的。珠可以是生物相容的。
可以将固体支持物(例如，珠)可视化。固体支持物可以包括可视化标签(例如，荧光染料)。可以用鉴定物(例如，数字)将固体支持物(例如，珠)蚀刻。通过对固体支持物(例如，珠)成像可以将鉴定物可视化。
固体支持物可以包括不溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、结构单元或附接至其上的其他反应性部分时，它可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少附接至其上的这样一个反应性部分时，它可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以在溶液中不受约束地使用，如以微量滴定孔形式；以流通形式，如在柱中；或在试纸条中。
固体支持物可以包括膜、纸、塑料、涂覆的表面、平表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采用树脂、凝胶、微球或其他几何构型的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片；微粒；纳米颗粒；平板；阵列；毛细管；平支持物，如玻璃纤维过滤器，玻璃表面，金属表面(钢、金、银、铝、硅以及铜)，玻璃支持物，塑料支持物，硅支持物，芯片，过滤器，膜，微孔板，载玻片；塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)；和/或晶片；梳状物(comb)；针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)；或平表面(如晶片(例如，硅晶片)、带有具有或不具有滤底的凹陷的晶片)的凹陷或纳升孔的阵列中的珠。
固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可能能够渗透细胞内间隙(例如，细胞器周围)。聚合物基质可能能够贯穿循环系统进行泵送。
固体支持物可以是生物分子。例如，固体支持物可以是核酸、蛋白质、抗体、组蛋白、细胞区室、脂质、碳水化合物等。固体支持物是生物分子，可以将这些固体支持物进行扩增、翻译、转录、分解，和/或修饰(例如，聚乙二醇化、SUMO修饰化、乙酰化、甲基化)。固体支持物是生物分子，可以提供除了附接至该生物分子的空间标记之外的空间和时间信息。例如，当未经修饰时，生物分子可以包括第一构象，但当被修饰时，生物分子可以变为第二构象。这些不同的构象可以将本披露的随机条形码暴露给靶标。例如，生物分子可以包括由于生物分子折叠而不可接受的随机条形码。在对生物分子修饰(例如乙酰化)时，该生物分子可以改变构象以暴露随机标记。修饰的时间可以为本披露随机条形编码的方法提供另一种时间维度。
在一些实施例中，包含本披露组合条形码试剂的生物分子可以位于细胞的细胞质中。在激活时，生物分子可以移动到细胞核中，因此可以进行随机条形编码。以这种方式，生物分子的修饰可以编码针对由随机条形码识别的靶标的另外的时空信息。
维度标记可以提供关于生物事件(例如，细胞分裂)空间-时间的信息。例如，可以将维度标记添加至第一细胞，该第一细胞可以分裂产生第二子细胞，该第二子细胞可以包括所有、一些，或不包括维度标记。在原始细胞和子细胞中可以激活维度标记。以这种方式，维度标记可以提供关于在不同空间中组合条形编码的时间的信息。
基底
基底可以意指固体支持物的类型。基底可以意指可包括本披露的组合条形码试剂的固体支持物。基底可以包括多个微孔。微孔可以包括限定体积的小反应室。微孔可以截留一种或多种细胞。微孔可以截留仅一种细胞。微孔可以截留一种或多种固体支持物。微孔可以截留仅一种固体支持物。在一些情况下，微孔截留单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包括本披露的组合条形码试剂。
阵列的微孔可以按各种形状和大小制造。孔几何形状可以包括但不限于圆柱形、圆锥形，半球形、矩形或多面体(例如，由若干平面组成的三维几何体，例如六角柱、八角柱、倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱椎或倒截棱锥)。微孔可以包括组合了这些几何形状中的两种或更多种的形状。例如，微孔可以是部分圆柱形的，其余部分具有倒锥形的形状。微孔可以包括两个并列圆柱体，一个的直径(例如大致对应于珠的直径)大于另一个(例如大致对应于细胞的直径)，这两个圆柱体通过延伸圆柱体的全长(深度)的竖直通道(即，平行于圆柱轴)连接。微孔的开口可以在基底的上表面上。微孔的开口可以在基底的下表面上。微孔的封闭端(或底部)可以是平的。微孔的封闭端(或底部)可以具有曲面(例如，凸出或凹陷)。基于待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的类型可以确定微孔的形状和/或大小。
孔之间的基底部分可以具有拓扑结构。例如，孔之间的基底部分可以是圆形的。孔之间的基底部分可以是尖的。孔之间的基底间隔部分可以是平的。孔之间的基底部分可能不是平的。在一些情况下，孔之间的基底部分是圆形的。换言之，不包括孔的基底部分可以具有曲面。曲面可以被制造成使得该曲面的最高点(例如，顶点)可以处于两个或更多个孔的边缘(例如，与孔等距离)之间的最远点。曲面可以被制造成使得曲面的起始位于第一微孔的边缘处，并产生在第二微孔末端处结束的抛物线。该抛物线可以在二维范围内延伸，以捕获在孔的六边形网格附近的微孔。曲面可以被制造成使得这些孔之间的表面比孔的开口的平面更高和/或更弯曲。曲面的高度可以是或是至少0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7微米，或更大。在一些实施例中，曲面的高度可以是至多0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7微米，或更大。
可以就孔的直径和深度而言来表征微孔尺寸。如在此使用的，微孔的直径是指可以内切于微孔几何体的平面横截面内的最大圆。微孔直径的范围可以是在待俘获在微孔内的细胞或固体支持物直径的从约1倍至约10倍。微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。在一些实施例中，微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍、或至多1倍。微孔直径可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
可以就绝对尺寸而言指定微孔的直径。微孔的直径可以在从约5微米至约60微米的范围内。微孔直径可以是或是至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、或至少60微米。微孔直径可以是至多60微米、至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、或至多5微米。微孔直径可以是约30微米。
可以选择微孔深度以提供细胞和固体支持物的有效捕获。可以选择微孔深度以提供包含在孔内的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。可以选择直径与高度(即，纵横比)的比率，使得一旦细胞和固体支持物沉积在微孔内，它们将不会由于微孔上方的流体运动而移位。可以选择微孔的尺寸，使得微孔具有足够的空间以容纳各种大小的固体支持物和细胞，而不会由于微孔上方的流体运动而移动。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的从约1倍至约10倍。微孔深度可以是或是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的至多10倍、至多5倍、至多4倍、至多3倍、至多2倍、至多1.5倍，或至多1倍。微孔深度可以是待俘获在微孔内的细胞或固体支持物的直径的约2.5倍。
可以就绝对尺寸而言指定微孔的深度。微孔深度的范围可以是从约10微米至约60微米。微孔深度可以是或是至少10微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少50微米，或至少60微米。微孔深度可以是至多60微米、至多50微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米，或至多10微米。微孔深度可以是约30微米。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积的范围可以是从约200微米3至约120,000微米3。微孔体积可以是至少200微米3、至少500微米3、至少1,000微米3、至少10,000微米3、至少25,000微米3、至少50,000微米3、至少100,000微米3，或至少120,000微米3。微孔体积可以是至多120,000微米3、至多100,000微米3、至多50,000微米3、至多25,000微米3、至多10,000微米3、至多1,000微米3、至多500微米3，或至多200微米3。微孔体积可以是约25,000微米3。微孔体积可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18,000微米3至约30,000微米3)。
微孔体积可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3，或更高。微孔体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3，或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3，或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50纳升3，或更高。微孔体积可以是或是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3，或更高。微孔体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3，或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3，或更高。可以容纳进微孔的流体体积可以是至多5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50皮升3，或更高。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔的体积可以就从一个微孔到另一个微孔的体积变化而言来进一步表征。微孔体积的变异系数(表示为百分比)的范围可以是从约1％至约10％。微孔体积的变异系数可以是至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％，或至少10％。微孔体积的变异系数可以是至多10％、至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％，或至多1％。微孔体积的变异系数可以具有在由这些值包括的范围内的任何值，例如在约1.5％和约6.5％之间。在一些实施例中，微孔体积的变异系数可以是约2.5％。
在本披露的方法、装置和系统中使用的微孔体积与珠的表面积(或随机条形码寡核苷酸可以附接的固体支持物的表面积)的比率的范围可以是从约2.5至约1,520微米。该比率可以是至少2.5、至少5、至少10、至少100、至少500、至少750、至少1,000，或至少1,520。该比率可以是至多1,520、至多1,000、至多750、至多500、至多100、至多10、至多5，或至多2.5。该比率可以是约67.5。微孔体积与珠(或用于固定的固体支持物)的表面积的比率可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约30至约120)。
微孔阵列的孔可以被安排成一维、二维，或三维阵列。在一些实施例中，三维阵列可以例如通过堆积一系列的两个或更多个二维阵列(即，通过堆积包括微孔阵列的两个或更多个基底)来实现。
可以对微孔之间的模式和间隔进行选择，以便优化在每个孔中捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)的效率，并且最大化阵列的每单位面积的孔数目。微孔可以根据各种随机或非随机模式分布。例如，它们可以在基底的表面上完全随机地分配，或者它们可以被安排成方形网格、矩形网格、六角网格等。在一些情况下，微孔被安排成六角的。孔之间的中心距(或间隔)可以从约5微米至约75微米变化。在一些情况下，微孔之间的间隔是约10微米。在其他实施例中，孔之间的间隔是至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35微米、至少40微米、至少45微米、至少50微米、至少55微米、至少60微米、至少65微米、至少70微米，或至少75微米。微孔间隔可以是至多75微米、至多70微米、至多65微米、至多60微米、至多55微米、至多50微米、至多45微米、至多40微米、至多35微米、至多30微米、至多25微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、至多5微米。微孔间隔可以是约55微米。微孔间隔可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约18微米至约72微米)。
微孔阵列可以包括在微孔之间的表面特征，其被设计成帮助引导细胞和固体支持物进入孔和/或防止它们沉降在孔之间的表面上。适合的表面特征的实例可以包括但不限于环绕孔或跨过孔之间的表面的隆起的、呈脊形的或尖形的表面特征。
微孔阵列中的孔的总数由孔的模式和间隔以及阵列的总尺寸决定。在阵列中微孔的数目可以在从约96至约5,000,000或更高的范围内。在阵列中微孔的数目可以是至少96、至少384、至少1,536、至少5,000、至少10,000、至少25,000、至少50,000、至少75,000、至少100,000、至少500,000、至少1,000,000，或至少5,000,000。在阵列中微孔的数目可以是至多5,000,000、至多1,000,000、至多75,000、至多50,000、至多25,000、至多10,000、至多5,000、至多1,536、至多384，或至多96个孔。在阵列中微孔的数目可以是约96、384，和/或1536。微孔的数目可以是约150,000。在阵列中微孔的数目可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约100至325,000)。
使用任何数目的制造技术可以制造微孔阵列。可以使用的制造方法的实例包括，但不限于，体微机械加工技术(如光刻法和湿化学蚀刻、等离子蚀刻或深反应离子蚀刻)；微模塑和微压花；激光微机械加工；3D打印或使用可固化材料的其他直接写入制造工艺；以及类似技术。
可以从任何数目的基底材料来制造微孔阵列。对材料的选择将取决于所使用的制造技术的选择，反之亦然。适合的材料的实例可以包括，但不限于，硅、熔融二氧化硅、玻璃、聚合物(例如，琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、基于硫醇-烯的树脂)、金属或金属膜(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)等。在一些情况下，微孔包括光学粘合剂。在一些情况下，微孔由光学粘合剂制得。在一些情况下，微孔阵列包括PDMS和/或由其制得。在一些情况下，微孔由塑料制得。亲水材料对于制造微孔阵列而言是令人希望的(例如，以增强润湿性并最小化细胞和其他生物材料的非特异性结合)。还可以使用可处理或涂覆的疏水材料(例如，通过氧等离子体处理，或聚环氧乙烷表层的接枝)。使用多孔亲水材料来制造微孔阵列可以是令人希望的，以便有助于装置中截留的气泡的毛细管芯吸/通气。微孔阵列可以由单个材料进行制造。微孔阵列可以包括两种或更多种已经结合在一起或机械连接的不同材料。
使用具有各种大小与形状中任一种的基底可以制造微孔阵列。例如，其内制造有微孔的基底的形状(或印迹)可以是正方形、矩形、圆形或不规则形状。微孔阵列基底的印迹可以类似于微量滴定板的印迹。微孔阵列基底的印迹可以类似于标准显微镜载玻片的印迹，例如约75mm长x25mm宽(约3”长x1”宽)或约75mm长x50mm宽(约3”长x2”宽)。其内制造有微孔的基底的厚度的范围可以是从约0.1mm厚至约10mm厚或更厚。微孔阵列基底的厚度可以是至少0.1mm厚、至少0.5mm厚、至少1mm厚、至少2mm厚、至少3mm厚、至少4mm厚、至少5mm厚、至少6mm厚、至少7mm厚、至少8mm厚、至少9mm厚，或至少10mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是至多10mm厚、至多9mm厚、至多8mm厚、至多7mm厚、至多6mm厚、至多5mm厚、至多4mm厚、至多3mm厚、至多2mm厚、至多1mm厚、至多0.5mm厚，或至多0.1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是约1mm厚。微孔阵列基底的厚度可以是这些范围内的任何值，例如，微孔阵列基底的厚度可以在约0.2mm和约9.5mm之间。微孔阵列基底的厚度可以是均匀的。
多种表面处理和表面修饰技术可以用于改变微孔阵列表面的特性。实例可以包括但不限于，氧等离子体处理以使得疏水材料表面更亲水、使用湿或干蚀刻技术以使玻璃和硅表面光滑(或粗糙)、将聚氧乙烯或其他聚合物层(如，普朗尼克)或牛血清白蛋白吸附或接枝到基底表面以使它们更亲水并且更不易于生物分子和细胞的非特异性吸附、使用硅烷反应以将化学反应性官能团接枝到另外的惰性硅和玻璃表面等。光脱保护技术可以用于选择性地活化阵列结构中的特定位置处的化学反应性官能团，例如，选择性添加或活化微孔的内壁上的化学反应性官能团(如伯胺或羧基基团)可以用于将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶联至微孔壁。利用的表面处理或表面修饰的选择取决于所希望的表面特性的类型和制成微孔阵列的材料的类型两者或任一者。
微孔的开口可以是密封的(例如，在细胞裂解步骤过程中)以防止相邻微孔之间的靶核酸进行交叉杂交。微孔(或微孔阵列)可以使用例如夹紧在微孔阵列基底的表面上的固体材料(即，板或箔)的柔性膜或片或者合适的珠来密封或加帽，其中所述珠的直径大于所述微孔的直径。
使用固体材料的柔性膜或片形成的密封可以包括例如无机纳米孔膜(例如，氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性体膜(例如，PDMS)或亲水性聚合物膜(例如，涂覆有已经用裂解缓冲液水合的琼脂糖薄膜的聚合物膜)。
用于对微孔加帽的固体支持物(例如，珠)可以包括本披露的固体支持物(例如，珠)中的任一种。在一些情况下，这些固体支持物是交联葡聚糖珠(例如，Sephadex)。交联葡聚糖的范围可以是从约10微米至约80微米。用于加帽的交联葡聚糖珠可以是从20微米至约50微米。在一些实施例中，珠可以比微孔直径大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％。用于加帽的珠可以比微孔直径大至多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％。
密封或帽可以允许缓冲液穿进穿出微孔，同时阻止大分子(例如，核酸)从所述孔中迁移出来。通过密封或帽可以阻挡至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个，或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开微孔。通过密封或帽可以阻挡至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个或更多个核苷酸的大分子迁移进入或离开微孔。
固体支持物(例如，珠)可以分布在基底中。通过离心或其他非磁性手段可以将固体支持物(例如，珠)分布在基底的孔中、从基底的孔中去除、或否则通过包括一种或多种微孔阵列的装置进行输送。基底的微孔可以用固体支持物预加载。基底的微孔可以容纳至少1、2、3、4、或5，或更多种固体支持物。基底的微孔可以容纳至多1、2、3、4、或5，或更多种固体支持物。在一些情况下，基底的微孔可以容纳一种固体支持物。
可以使用微孔的替代物来区室化单独的细胞和珠，例如，单个固体支持物和单细胞可以被限制在乳液中的单个液滴中(例如在液滴数字微流体系统中)。
细胞可以被限制在多孔珠中，这些珠本身包括多个拴系的随机条形码。可以将单独的细胞和固体支持物在任何类型的容器、微容器、反应室、反应容器等中区室化。
或可以不使用微孔而进行单细胞组合条形编码。可以不使用任何物理容器而进行单细胞组合条形编码测定。例如，可以不使用物理容器而进行组合条形编码，通过将细胞和珠彼此靠近地嵌入聚合物层或凝胶层内以在不同的细胞/珠对之间产生扩散屏障进行。在另一个实例中，可以不使用物理容器在原位、在体内、在固体组织上，和/或在亚细胞内进行组合条形编码。
微孔阵列可以是测定系统的可消耗的部件。微孔阵列可以是可重复使用的。微孔阵列可以被配置成被用作用于手动进行测定的独立式装置，或者它们可以被配置成包括提供测定程序的完全或部分自动的仪器系统的固定或可移除部件。在所披露的方法的一些实施例中，随机条形码的珠基文库可以沉积在微孔阵列中作为测定程序的一部分。在一些实施例中，可以将珠预加载到微孔阵列的孔中，并且作为例如用于进行核酸靶标的随机条形编码和数字计数的试剂盒的一部分提供给用户。
在一些实施例中，提供两个配对的微孔阵列，一个预先加载有被第一磁体保持在适当位置的珠，并且另一个由用户用来加载单独的细胞。在将细胞分配到第二微孔阵列之后，这两个阵列可以面对面放置，并且第一磁体被去除，而第二磁体被用于将所述珠从第一阵列下拉到第二阵列的对应微孔中，从而确保所述珠位于第二微孔阵列中的细胞上方，并且因此最小化细胞裂解后靶分子的扩散损失，同时最大限度地将靶分子有效附接至所述珠上的随机条形码。
本披露的微孔阵列可以用固体支持物(例如，珠)预加载。微孔阵列的每个孔可以包括单个固体支持物。在微孔阵列中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以用单个固体支持物预加载。在微孔阵列中至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以用单个固体支持物预加载。固体支持物可以包括本披露的随机条形码和/或组合条形码。在不同固体支持物上的随机条形码的细胞标记可以是不同的。在同一固体支持物上随机条形码的细胞标记可以是相同的。
三维基底
三维阵列可以是任何形状。三维基底可以由在本披露的基底中使用的任何材料构成。在一些情况下，三维基底包括DNA折纸(DNA origami)。DNA折纸结构结合DNA作为构建材料来制成纳米级形状。该DNA折纸过程可以包括使用多个合理设计的“主要DNA链，将一种或多种长“支架”DNA链折叠成特定形状。主要链的序列可以被设计成使得它们与支架链的特定部分进行杂交，并且在这样做时，将支架链压制成特定的形状。DNA折纸可以包括支架链和多个合理设计的主要链。支架链可以具有任何足够的非重复序列。
可以选择主要链的序列，使得DNA折纸具有至少一种随机标记可以附接其上的形状。在一些实施例中，该DNA折纸可以是具有至少一个内表面和至少一个外表面的任何形状。内表面可以是空间上排除与样品表面相互作用的DNA折纸的任何表面区域，而外表面是空间上不排除与样品表面相互作用的DNA折纸的任何表面区域。在一些实施例中，该DNA折纸具有一个或多个开口(例如，两个开口)，使得颗粒(例如，固体支持物)可以到达DNA折纸的内表面。例如，在某些实施例中，DNA折纸具有一个或多个开口，这些开口允许小于10微米、5微米、1微米、500nm、400nm、300urn、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、45nm，或40nm的颗粒接触DNA折纸的内表面。
DNA折纸可以响应于一种或多种特定环境刺激改变形状(构象)。因此当DNA折纸呈现一些构象时，DNA折纸的区域可以是内表面，但当该装置呈现出其他构象时，该区域可以是外表面。在一些实施例中，DNA折纸可以通过呈现新构象响应于特定环境刺激。
在一些实施例中，可以选择DNA折纸的主要链，使得DNA折纸大体上是桶状或管状。可以选择DNA折纸的主要链，使得该桶状在两个末端处关闭或在一个或两个末端处打开，从而允许颗粒进入桶的内部并且到达其内表面。在某些实施例中，DNA折纸的桶状可以是六角管。
在一些实施例中，可以选择DNA折纸的主要链(staple strand)，使得DNA折纸具有第一结构域和第二结构域，其中第一结构域的第一末端通过一种或多种单链DNA铰链附接至第二结构域的第一末端，并且第一结构域的第二末端通过一种或多种分子闩附接至第二结构域的第二末端。如果所有的分子闩通过其各自的外部刺激进行接触，可以选择多个主要链，使得第一结构域的第二末端不与第二结构域的第二末端附接。分子闩可以形成自两种或更多种主要链，包括至少一种主要链，该主要链具有至少一种能够结合外部刺激(如核酸、脂质，或蛋白质)的刺激结合结构域，以及至少一种其他主要链，该主要链具有至少一种结合刺激结合结构域的闩结构域。该刺激结合结构域与闩结构域的结合支持DNA折纸的第一构象的稳定性。
在固体支持物和基底上组合条形码的合成
在一些实施例中，在固体支持物(例如，珠)上可以合成组合条形码试剂。预合成的组合条形码试剂(例如，包括可以与固体支持物连接的5’胺)可以通过涉及在固体支持物和随机条形码上的官能团对的各种固定技术中的任一种附接至固体支持物(例如，珠)。组合条形码试剂可以包括官能团。固体支持物(例如，珠)可以包括官能团。组合条形码试剂官能团和固体支持物官能团可包括，例如，生物素、链霉亲和素、一种或多种伯胺、一个或多个羧基、一个或多个羟基、一种或多种醛、一种或多种酮及其任何组合。可以通过例如，将组合条形码试剂上的5’氨基基团(例如，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联至官能化的固体支持物的羧基基团来将组合条形码拴系于固体支持物。可以通过进行多次漂洗步骤从所述反应混合物中除去残留的未偶联的组合条形码试剂。在一些实施例中，所述组合条形码试剂和固体支持物通过接头分子(例如，短的官能化的烃分子或聚环氧乙烷分子)使用类似的附接化学而间接附接。这些接头可以是可切割的接头，例如酸不稳定接头或可光切割接头。
使用任何数目的固相寡核苷酸合成技术(如磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成，和亚磷酰胺合成)，在固体支持物(例如，珠)上可以合成这些组合条形码试剂。单个核苷酸能以逐步的方式与生长中的拴系组合条形码试剂偶联。在一些实施例中，若干寡核苷酸的短的预合成序列(或嵌段)可以与生长中的拴系组合条形码试剂偶联。
组合条形码试剂可以通过散布逐步或嵌段偶联反应用一轮或多轮分离-聚池合成进行合成，其中合成珠的总池被分成多个单独的较小的池，然后其各自经受不同的偶联反应，随后重组和混合单独的池，以使生长中的组合条形码试剂序列跨整个珠池随机化。分离-聚池合成是组合合成工艺的一个实例，其中使用最少数目的化学偶联步骤合成最大数目的化合物。由此产生的化合物文库的潜在多样性由可用于每个偶联步骤的单一结构单元(例如核苷酸)的数目以及用于产生所述文库的偶联步骤的数目决定。例如，在每个步骤包括10轮偶联，使用4种不同核苷酸的分离-聚池合成将产生410＝1,048,576个单一核苷酸序列。在一些实施例中，分离-聚池合成可以使用酶方法如聚合酶延伸或连接反应而不是化学偶联来进行。例如，在每轮分离-聚池聚合酶延伸反应中，在给定的池中拴系于珠的随机条形码的3'末端可以与一组半随机引物的5'末端杂交，例如具有5’-(M)k-(X)i-(N)j-3’结构的引物，其中(X)i是i个核苷酸长的随机核苷酸序列(所述引物组包括(X)i的所有可能的组合)，(N)j是特定核苷酸(或j个核苷酸的系列)，并且(M)k是特定核苷酸(或k个核苷酸的系列)，其中不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)加入到每个池中并通过聚合酶并入拴系的寡核苷酸中。
缀合至固体支持物或在固体支持物上合成的组合条形码试剂的数目可以包括至少100、1000、10000、或1000000，或更多种组合条形码试剂。缀合至固体支持物或在固体支持物上合成的组合条形码试剂的数目可以包括至多100、1000、10000、或1000000，或更多种组合条形码试剂。缀合至固体支持物(如珠)或在固体支持物上合成的组合条形码试剂的数目可以是或是比细胞中靶核酸的数目多至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。缀合至固体支持物(如珠)或在固体支持物上合成的组合条形码试剂的数目可以比细胞中靶核酸的数目多至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍。至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的随机条形码可以与靶核酸结合。至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的随机条形码可以与靶核酸结合。通过在固体支持物上的组合条形码试剂可以捕获至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100，或更多个不同的靶核酸。通过在固体支持物上的组合条形码试剂可以捕获至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100，或更多个不同的靶核酸。
对多个分区进行条形编码的方法
本披露提供用一组组合条形码对多个分区进行条形编码的方法。在一些实施例中，该多个分区可以是微孔阵列中的多个微孔。在一些实施例中，在微孔阵列中微孔的数目可以是至少96、至少384、至少1,536、至少5,000、至少10,000、至少25,000、至少50,000、至少75,000、至少100,000、至少500,000、至少1,000,000，或至少5,000,000或更多。在一些实施例中，每个微孔阵列可以包括与用于另一种微孔阵列的阵列条形码区分开的阵列条形码。
在一些实施例中，这些方法可以包括将多种分量条形码引入多个分区中的每一个，其中这些分量条形码选自一组如本文披露的分量条形码。在一些实施例中，可以将在多个分区中的每一个中的这些分量条形码彼此连接从而形成组合条形码。在来自样品的靶多核苷酸存在或缺失的情况下，可以将分量条形码彼此连接。
如在图3中描述的，可以将组合条形码试剂305、310、315、和320分配到任何特定的微孔325(例如，微孔330的阵列)中。通过例如，如移取、点样或非接触印刷的方法可以进行分配。例如，使用递送方法(如珠或其他颗粒)，还可以将组合条形码试剂随机添加至孔中。例如，喷码机头部可以将组合条形码试剂分配到每个孔中。可以将条形码试剂分配到或产生于单独的分区中。示例性分区可以包括，但不限于，管、微量滴定板中的孔、流动池、中空纤维、载玻片上的微孔、中空封闭的或开放的颗粒、封闭的液滴、颗粒(如珠)或其他固体或液体或凝胶颗粒或用于将一种样品与另一种样品分离的其他物理分区。物理隔离也可以通过将2维表面上的单独样品或3维固体或支架上的基底进行位置分离来实现。
可以按这样的方式设计组合条形码试剂，使用接头使得来自每个亚单位编码部分的每个亚单位编码序列可以按预编程的顺序组合。在每个微孔325中的最终的密码可以是单一的。对于任何给定的组合条形码试剂组合，可以确定微孔的位置。以这种方式，可以将组合条形码试剂用于确定在微孔阵列330上的微孔325中的样品的空间位置。
本披露提供了仅使用一小组的分量条形码试剂(例如，组合条形编码)，以使得产生条形编码试剂多样性的大量库成为可能的组合物和方法。可以将组合条形编码的方法与随机条形编码的方法组合。在某些情况下，可以并行处理数十万到超过数百万个样本。例如，可以并行处理的样品的数目可以是至少10万、20万、30万、40万、50万、60万、70万、80万、或90万个样品。可以并行处理的样品的数目可以是至多10万、20万、30万、40万、50万、60万、70万、80万、或90万个样品。可以并行处理的样品的数目可以是至少1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、或1000万或更多个样品。可以并行处理的样品的数目可以是至多1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、或1000万或更多个样品。
本文披露了一种同时对条码标记许多(数千至数百万)个体样品的核酸进行条形码标记的方法。条形码标签可以由一串随机或预定的/已知的核酸序列(条形码)中的一种或多种组成。该条形码可以包括合成寡核苷酸和/或天然的或非天然的DNA片段。例如条形码的长度可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个，或更多个核苷酸。条形码的长度可以是或是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个，或更多个核苷酸。
除了不同的DNA序列，这些组合条形码可以由不同的材料组成或以不同的形式出现。例如，分量条形码可以是珠和凝胶颗粒的组合，或溶液中的第一寡核苷酸(与在珠上的第二寡核苷酸组合)，或微孔内固定在基底上的第一寡核苷酸和在溶液中或在微孔内存在于固体颗粒上的第二寡核苷酸的组合。还可以将条形码嵌入水凝胶或类似材料(其可用作海绵状支架)中，用于生物样品和核酸的固定位置定位。例如，薄组织切片部分上的细胞可以被裂解，并且可以将释放的核酸内容物捕获就位。所捕获的核酸可以结合位置特异性条形码或组合条形码，并且如果需要，可以被进一步复制，并在位置处检测或释放并分离，用于通过如下一代测序的方法来进一步表征。
可以将样品分配到微孔中。在一些实施例中，该样品可以是单细胞。在一些实施例中，该样品可以是组织切片。可以在分配这些组合条形码试剂之前分配样品。可以在分配这些组合条形码试剂之后分配样品。可以用分配(例如，分离)装置来分配样品。示例性分配/分离装置可以包括，但不限于流式细胞仪、针阵列，和显微注射器。可以将微孔阵列附接至分离/分配装置，使得可以将该样品直接分离/分配到微孔阵列的孔中。
可以将包括本披露的条形码的样品(即，已经经历本披露的条形编码方法的样品)用于下游应用(如测序)。DNA测序后，除了获得的样品核酸序列，每个序列读数都可以承载样品条形码串，使得能够将这种读数分配给样品池中的特定样品，例如使用计算机处理。
可以将样品以非随机方式分配到基底的孔中。在微孔阵列中分配/分离的每个样品的位置可以是已知的。以这种方式，该分布可能不遵循随机和/或是随机的。可以将样品以非泊松方式分配到基底的孔中。泊松分布或曲线是离散概率分布，如果这些事件以已知的平均速率发生并且彼此独立，该分布表示在固定时间段内发生的多种事件的概率。泊松分布公式如下：f(k；λ)＝(e-λλk/k！)，其中k是事件发生的数目，并且λ是给定间隔期间内预期发生次数的正实数。非泊松分布可以是不遵循泊松方程的分布。
可以将包含核酸、单细胞、来自单细胞的核酸、组合条形码试剂、以及对于引物延伸和扩增(例如，聚合酶dNTP、缓冲液)所必需的试剂、或其任何组合的微孔进行密封。微孔密封可以用于防止相邻微孔之间靶核酸的交叉杂交。可以用胶带和/或任何粘合剂将微孔密封。密封剂可以是澄清的。密封剂可以是不透明的。密封剂可以允许光通过，从而能够对经密封的微孔的内容物(例如UV可见光，荧光)进行目视检测。分区(例如，微孔阵列)中的核酸(例如，来自样品)可以与分配在微孔中的组合条形码试剂相关联(例如，杂交)。
可以将孔内的组合条形码试剂和靶多核苷酸进行延伸和/或扩增，以产生包括这些组合条形码试剂序列的转录物和/或扩增子。可以通过以下方法进行扩增，包括但不限于PCR、引物延伸、逆转录、等温扩增、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circle amplification)、RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、和装配PCR、终点PCR(end-point PCR)、以及抑制PCR、或其任何组合。在一些情况下，用等温扩增来进行扩增和/或延伸。在一些情况下，用多链置换来进行扩增和/或延伸。
延伸和/或扩增后，可以将这些微孔的内容物进行合并。合并这些内容物可以减少用于下游过程的样品制备中的错误。可以将微孔样品合并到一种容器(例如，管)中。可以将微孔样品合并到不止一种容器(例如，用于样品/板索引的管)中。
可以用分子生物学对经合并的微孔样品进行操纵。例如，可以将经合并的样品经受一轮或多轮扩增。可以将经合并的样品进行纯化步骤(例如，使用Ampure珠、尺寸选择、凝胶/柱过滤、去除rRNA或任何其他RNA杂质、杂质的酶降解、脉冲凝胶电泳，和通过蔗糖梯度或氯化铯梯度的沉淀，以及尺寸排阻色谱(凝胶-渗透色谱))。
可以制备经合并的微孔样品用于测序。测序制备可以包括通过衔接子连接(例如，TA连接)或引物延伸(例如，其中引物包括流动细胞衔接子的序列)添加测序(例如，流动细胞衔接子)。用于连接衔接子与核酸片段的方法是众所周知的。衔接子可以是双链、单链或部分单链的。在一些方面，衔接子由具有互补性(例如，约10至30个碱基，或约15至40个碱基的完全互补性)区域的两个寡核苷酸形成，从而使得当两个寡核苷酸杂交在一起时，它们形成双链区域。任选地，这两个寡核苷酸中的一个或两个可具有与另一寡核苷酸不互补的区域，因而在该衔接子的一个或两个末端形成单链突出端。单链突出端可以突出约1个至约8个碱基，或约2个至约4个碱基。突出端可与通过采用限制性内切酶切割产生的突出端互补，以利于“粘端”连接。衔接子可包含其他特征，例如引物结合位点和限制位点。在某些方面，限制性位点可能是针对IIS型限制性酶或其他切除其识别序列之外的酶(例如EcoP151)。可以对经合并的样品进行测序(例如，通过本文所述的方法)。
对经组合条形编码的核酸测序可以包括对至少一部分的组合条形码(例如，用于制备组合条形码的组合条形码试剂的序列)进行测序。测序可以包括对至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的靶多核苷酸的组合条形码进行测序。测序可以包括对至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的靶多核苷酸的组合条形码进行测序。测序可以包括对至少一部分的靶多核苷酸进行测序。测序可以包括对至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的靶多核苷酸进行测序。测序可以包括对至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的靶多核苷酸进行测序。测序可以包括对至少一部分的组合条形码和至少一部分的靶多核苷酸进行测序。测序可以包括对组合条形码和靶多核苷酸之间的连接进行测序。测序可以包括配对末端测序。配对末端测序可以允许对来自单个多核苷酸双链体上的两个位置处的序列的两个或更多个读数进行测定。
DNA测序后，除了获得的样品核酸序列，每个序列读数都可以承载样品条形码串和/或靶核酸序列，使得能够将这种读数分配给样品池中的特定样品，例如使用计算机处理。例如，可以将包括来自第一微孔的组合条形码序列的读数合并在一起，而可以将包含来自第二微孔的组合条形码序列的读数合并在一起。可以分析和/或处理针对每个微孔(例如，箱)的读数。例如，当起始材料是染色体DNA片段时，读数可以被处理以形成叠连群，和/或可以如PCT申请号PCT/US 2016/22712中所述进行单倍型定相，该PCT申请的内容通过引用以其全文并入本文。
例如，叠连群(连续序列)可以由读取的短程表征数据形成。可以将读数进行分级。在每个箱中，可以对该箱中读取的短程探针签名进行检索和记录。对分级读取的亚组使用常规的叠连群分析，可以将短程签名用于确定在箱中的叠连群读数的读取顺序和距离。可以将相邻箱的叠连群定向并且连接以形成更大的叠连群。
在一些实施例中，根据短程探测将读数进行分级。在对短程探针签名初始比较之后，形成具有高置信度读数的簇。然后，针对该簇中的读数确定读取顺序和距离。检索并记录对针对每个读数簇的远程探针信息，并形成针对该簇的综合远程得分。对于每个条目，可以通过在该簇中所有读数上获取(读取)比较得分的最大值(或其他算术组合)来形成该综合得分。结果是相对于基因组的簇分级，并且该全局定位信息可用于确定相邻簇。然后可以将相邻的经分级的簇的叠连群定向并且连接以形成更大的叠连群。
对多个DNA靶标进行条形编码
本文披露的一些实施例提供了对多个分区中多个DNA靶标进行条形编码的方法。使用如本文披露的组合条形码，可以对多个分区进行条形编码。例如，可以用选自一组分量条形码的分量条形码的单一组合对每个分区进行条形编码。在一些实施例中，在多个分区中的每个组合条形码包括结合在该分区中的一种或多种DNA靶标的靶特异性区。可以将多个DNA靶标(如基因组DNA片段)引入该多个分区中。在一些实施例中，每个分区包括不止1个DNA靶标。在一些实施例中，每个分区包括不止1个来自相同染色体的DNA靶标。在一些实施例中，每个分区可以包括平均不超过1、不超过2、不超过3、不超过5、不超过10，不超过100个DNA靶标。在一些实施例中，在已经用分量条形码引入分区之后，将DNA靶标引入分区中。在一些实施例中，在已经用分量条形码引入分区之前，将DNA靶标引入分区中。在一些实施例中，将在每个分区中的一种或多种分量条形码与在分区中的一种或多种DNA靶标进行杂交。在一些实施例中，可以将与DNA靶标进行杂交的分量条形码用作用于延伸反应的引物，以产生包括DNA靶标和组合条形码的延伸产物。在一些实施例中，可以对延伸产物进行扩增和测序。
图4描绘了用于产生叠连群的本披露的组合条形码方法的示例性实施例。可以将核酸(例如，染色体)片段化。可以通过任何方法(如例如，声处理、剪切、和酶片段化处理)产生片段化。这些片段的长度可以是或是至少10、50、100、150、200、250、300、350、或400千碱基或更多。这些片段的长度可以是至多10、50、100、150、200、250、300、350、或400千碱基或更多。片段化处理可以产生至少1x103、1x104、1x105、1x106、1X107、或1X108或更多片段。片段化处理可以产生至多1x103、1x104、1x105、1x106、1X107、或1X108或更多片段。在孔中分离的片段可以是约1-20、1-15、1-10、1-5、5-20、5-15、5-10、10-15、或10-20个片段/孔。在这些孔中分离的片段可以是重叠的。在这些孔中分离的片段可以是不重叠的。可以将核酸片段405分离到微孔阵列415的孔410中。一些或所有微孔阵列的孔可以包括一种或多种组合条形码试剂420和425(例如，组合条形码试剂的已知的分组，从而产生单一组合条形码)。可以将这些微孔密封。可以将这些微孔的内容物进行延伸/扩增(例如，通过引物延伸和/或多链置换)从而产生包含组合条形码430的转录物。可以对包含组合条形码430的转录物/扩增子进行测序。测序分析可以包括分级读数，这些读数基于对应于相同微孔的其组合条形码序列。可以将这些读数生成为叠连群。可以将这些叠连群用于(例如，亲本SNP的)单倍型定相。
单细胞测序
本文披露的一些实施例提供了用于单细胞测序的方法。使用如本文披露的组合条形码，可以对多个分区进行条形编码。例如，可以用选自一组分量条形码的分量条形码的单一组合对每个分区进行条形编码。在一些实施例中，在该多个分区的每个中的组合条形码各自包括结合在分区中的单细胞的一种或多种靶多核苷酸上的靶特异性区。在一些实施例中，该靶多核苷酸包括DNA。在一些实施例中，该靶多核苷酸包括RNA。
可以将多个单细胞引入多个分区(比如微孔阵列的微孔)中。在一些实施例中，使用流式细胞仪可以将这些细胞进行富集，用于所期望的特性。在一些实施例中，将该多个单细胞引入到微孔阵列的微孔中可以包括将该多个细胞以流式细胞置于微孔阵列的微孔中。将该多个单细胞以流式细胞置于微孔阵列的微孔中可以包括每次使用流式细胞仪将单细胞置于微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，该多个分区是由多于1536个微孔构成的。在一些实施例中，该多个分区是5微米或更多微米的微孔阵列形式。在一些实施例中，将该多个分区按尺寸限定，如通过空间定位。
图5说明了用于对单细胞测序的示例性方法。待条形编码的样品可以包括单细胞和/或来自单细胞的核酸。可以将单细胞505分离到微孔阵列515的孔510中。在一些实施例中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以包括单细胞。在一些实施例中，至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％的孔可以包括单细胞。可以按非泊松方式将细胞分配到孔中。可以按非随机方式将细胞分配到孔中。可以按泊松方式将细胞分配到孔中。可以按随机方式将细胞分配到孔中。
可以将这些细胞裂解，从而释放这些细胞的核酸内容物。可以将这些孔在裂解之前进行密封。可以将这些细胞的核酸内容物与在微孔520/525(例如，组合条形码试剂的已知分组，从而产生单一组合条形码)中的一种或多种组合条形码试剂相关联。可以将这些微孔的内容物进行延伸/扩增(例如，通过引物延伸和/或多链置换)从而产生包含组合条形码530的转录物。可以对包含组合条形码530的转录物/扩增子进行测序。测序分析可以包括分级读数，这些读数基于对应于相同微孔的其组合条形码序列。可以对单细胞的基因表达分析进行读取分析。读数可用于分析细胞(例如，确定细胞类型、诊断作为病症或疾病的一部分的细胞、确定基因型细胞，确定或预测细胞对治疗或方案的反应，和/或测量随着时间的推移细胞表达谱的变化)。
在一些情况下，本披露的方法可以包括随机条形编码和组合条形编码。例如，并且在图6中示出，可以将细胞605以非泊松方式分布于微孔阵列615的孔610中，使得孔中含有单细胞。这些细胞可以将被裂解。可以将来自这些细胞的核酸620与含有寡聚dT和细胞标记的多个随机条形码625接触，并且可以将本披露的分子标记与靶标(例如，mRNA)接触。随机条形码可以进行逆转录，从而产生随机条形编码的cDNA 630。可以将随机条形编码的cDNA与可以进行第二链合成的一种或多种组合条形码试剂635/640接触。用于第二链合成的一种或多种组合条形码试剂635/640可以包括通用序列(例如，测序引物结合位点，即，Illumina读数1)。第二链合成可以形成经随机条形编码并且组合条形编码的核酸分子645。可以使经随机条形编码并且组合条形编码的核酸分子645经受下游文库制备方法(例如，合并，测序衔接子添加)并且进行测序。可以将随机条形码用于计数在样品605中靶核酸620的数目。可以将组合条形码用于鉴定细胞来源于其中的微孔阵列615的孔610。
在一些情况下，本披露的方法可以包括二分的组合条形编码。例如，并且在图7中示出，可以将细胞705以非泊松方式分布于微孔阵列715的孔710中，使得孔中含有单细胞。这些细胞可以将被裂解。可以将来自这些细胞的核酸720与一种或多种可以接触靶标(例如，mRNA)的3’组合条形码试剂725接触。可以将一种或多种3’组合条形码试剂725进行逆转录，从而产生3’组合条形编码的cDNA 730。可以将3’组合条形编码的cDNA 730与可以进行第二链合成的一种或多种5’组合条形码试剂740接触。用于第二链合成的一种或多种5’组合条形码试剂740可以包括通用序列(例如，测序引物结合位点，即，Illumina读数1)。第二链合成可以形成二分的经组合条形编码的核酸分子745。可以使二分的经组合条形编码的核酸分子745经受下游文库制备方法(例如，合并、测序衔接子添加)并且进行测序。可以将二分的组合条形码用于鉴定细胞来源于其中的微孔阵列715的孔710。
本文披露的方法可以用于在不同的时间点处比较细胞和/或核酸转录。本披露的方法可以用于诊断受试者，或将患病受试者的细胞/核酸与健康受试者的细胞/核酸进行比较。例如，微孔阵列的每个孔可以包括来自不同受试者的细胞。
本文披露的方法可用于例如药物测试或临床试验测试。例如，包含组合条形码试剂的基底的这些微孔可以包括调控剂。调控剂可以包括药物、治疗、蛋白质、RNA、脂质体、脂质或任何治疗分子(例如临床试验分子、经FDA批准的分子、未经FDA批准的分子)。在将样品分离到孔中之前，可将调控剂引入孔中。在孔中分离样品后可以将调控剂引入孔中(例如，调控剂可以与孔中的样品接触)。在一个实例中，微孔阵列的每个孔可以包括来自不同的受试者的细胞。可以用调控剂对这些细胞进行处理。测序结果可用于确定调控剂如何影响样品(例如，单细胞)的基因表达。测序结果可用于确定来自受试者群体的哪个受试者可能受调控剂影响，和/或用于诊断群体中的受试者。
随机条形编码的方法
本披露提供了用于样品的组合条形编码和/或随机条形编码的方法。可以将组合条形编码和随机条形编码的方法进行组合。这些方法可以包括将随机条形码靠近样品放置，裂解样品，将不同靶标与随机条形码相关联，对这些靶标进行扩增和/或对靶标进行数字计数。该方法可以进一步包括对获得自随机条形码上的空间标记的信息进行分析和/或可视化。可以将样品(例如，样品、薄切片、细胞的部分)与含有随机条形码的固体支持物接触。在样品中的靶标可以与随机条形码相关联。可以收集这些固体支持物。可以在固体支持物上进行cDNA合成。可以不在固体支持物上进行cDNA合成。cDNA合成可以将来自在随机条形码中的标记的标记信息并入正在合成的新cDNA靶分子中，从而产生靶条形码分子。使用PCR对这些靶条形码分子进行扩增。通过测序方法可以确定在靶条形码分子上的靶标序列和随机条形码标记。
接触样品和随机条形码
本披露提供了将样品(例如，细胞)分布到基底的多个孔中的方法，其中这些孔包括组合条形码试剂，并且其中该分布以非泊松方式发生。细胞到孔中的分布/分离可以是非随机(例如，将细胞特异性地分到阵列中的特定位置)的。以这种方式，这些细胞的分布可以被视为是非泊松。
可以将包括例如，细胞、器官、或组织薄切片的样品接触随机条形码。这些固体支持物可以是自由浮动的。可以将这些固体支持物嵌入半固体或固体阵列中。这些随机条形码可能不与固体支持物相关联。这些随机条形码可以是单独核苷酸。这些随机条形码可以与基底相关联。当随机条形码靠近靶标时，可以将这些靶标与随机条形码进行杂交。可以将随机条形码以不可消耗的比率接触，使得每个不同的靶标可以与本披露的不同随机条形码相关联。为了确保靶标与随机条形码之间的有效关联，可以将靶标与随机条形码交联。
样品的两种不同靶标可以接触相同的单一随机条形码的可能性可以是或是至少10-6、10-5、10-4、10-3、10-2，或10-1或更高。样品的两种不同靶标可以接触相同的单一随机条形码的可能性可以是至多10-6、10-5、10-4、10-3、10-2，或10-1或更高。来自相同细胞的相同基因的两种靶标可以接触相同的随机条形码的可能性可以是或是至少10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、或10-1或更高。来自相同细胞的相同基因的两种靶标可以接触相同的随机条形码的可能性可以是至多10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、或10-1或更高。
在一些情况下，可以将来自细胞群的细胞分开(例如，分离)到本披露的基底的孔中。在分开之前可以将细胞群进行稀释。可以将这些细胞群进行稀释，使得至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单细胞。可以将这些细胞群进行稀释，使得至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的基底的孔接收单细胞。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数目是或是至少％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数目。可以将这些细胞群进行稀释，使得在经稀释的细胞群中的细胞数目是或是至少％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％在基底上的孔的数目。在一些情况下，将细胞群稀释使得细胞的数目是基底中孔的数目的约10％。
单细胞于基底的孔中的分布可以遵循泊松分布。例如，可以存在基底的孔具有不止一个细胞的、至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％，或更高的可能性。可以存在基底的孔具有不止一个细胞的、至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％，或更高的可能性。单细胞在基底的孔中的分布可以是随机的。单细胞在基底的孔中的分布可以是非随机的。可以将细胞进行分离，使得基底的孔仅接收一个细胞。
细胞裂解
随着细胞和随机条形码的分布，可以裂解这些细胞以释放靶分子。可以通过各种手段，例如通过化学的或生化手段、通过渗透冲击、或通过热裂解手段、机械裂解或光学裂解来完成细胞裂解。可以通过加入包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X-100、吐温-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶标与随机条形码的关联性，可以通过例如降低温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
将随机条形码附接至靶核酸分子
在将这些细胞裂解并且由此释放核酸分子后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的随机条形码随机地相关联。例如，关联可以包括将随机条形码的靶标识别区与靶核酸分子的互补部分进行杂交(例如，随机条形码的寡聚dT可以与靶标的聚-A尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进特定的稳定杂交体的形成。
附接可以进一步包括将随机条形码的靶标识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，所述靶结合区可以包括能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘端突出端)特异性杂交的核酸序列。所述测定方法可以进一步包括用限制酶(例如EcoRI)处理所述靶核酸以产生限制性位点突出端。然后该随机条形码可以连接到包括与所述限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4DNA连接酶)可以用于连接两个片段。
随后可以对来自多个细胞(或多个样品)(例如，靶条形码分子)的经标记的靶标进行合并，例如通过对随机条形码和/或靶条形码分子附接其上的珠进行收回。基于固体支持物的附接的靶条形码分子的集合的收回可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现。一旦这些靶条形码分子已经合并，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。另外的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、切割反应、解离反应、和/或核酸延伸反应。另外的处理反应可以在微孔内进行，即，没有来自多个细胞的经标记的靶核酸分子的第一合并。
逆转录
本披露提供了使用逆转录来产生随机的靶标-条形码缀合物的方法。随机的靶标-条形码缀合物可以包括随机条形码以及靶核酸(即，随机条形编码的cDNA分子)的全部或部分的互补性序列。相关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而进行。该逆转录引物可以是寡聚dT引物、随机六核苷酸引物、或靶特异性寡核苷酸引物。寡聚dT引物的长度为12-18个核苷酸，并结合至在哺乳动物mRNA的3’末端的内源性聚-A尾。随机六核苷酸引物可在多个互补位点结合至mRNA。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
扩增
可以进行一种或多种核酸扩增反应以产生经标记的靶核酸分子的多个拷贝。扩增能以多重方式进行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。该扩增反应可用于将测序衔接子添加至所述核酸分子。这些扩增反应可以包括扩增至少一部分的样品标记(如果存在的话)。这些扩增反应可以包括扩增至少一部分的细胞和/分子标记。这些扩增反应可以包括扩增至少一部分的样品标签、细胞标记、空间标记、分子标记、靶核酸，或其组合。扩增反应可以包括扩增多个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或100％。该方法可以进一步包括进行一种或多种cDNA合成反应，从而产生含有样品标记、细胞标记、空间标记、和/或分子标记的靶条形码分子的一种或多种cDNA拷贝。
在一些实施例中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如在此使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特异性DNA序列体外扩增的反应。如在此使用的，PCR可包括所述反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和装配PCR。
对经标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括，但不限于，多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、全转录组扩增(WTA)、全基因组扩增(WGA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增，或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链式反应(LCR)、和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前切割的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些情况下，该扩增可能不产生环化转录。
可以将抑制PCR用于本披露的扩增方法。由于当用于扩增的一个或多个引物对应于整个重复序列或重复序列的一部分时的低效扩增，抑制PCR可以意指其末端反向重复序列侧翼的小于特定大小的分子的选择性排除。对此其原因可能在于片段互补末端的生产性PCR引物退火和非生产性自退火之间的平衡。在固定大小的侧翼末端反向重复序列上，插入物越短，抑制作用越强，反之亦然。同样地，在固定的插入物尺寸下，末端反向重复序列越长，抑制作用越强。
抑制PCR可以使用在PCR扩增前连接到DNA片段末端的衔接子。在熔融和退火时，在链的5'和3’末端具有自互补性衔接子的单链DNA片段可以形成在PCR过程中抑制片段扩增的抑制性“网球拍”形结构。
在一些情况下，在此披露的方法进一步包括对所述标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应，以产生随机标记的扩增子。经标记的扩增子可以是双链分子。该双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。所述双链分子的一条或两条链可以包括样品标记、空间标记、细胞标记、和/或分子标记。该随机标记的扩增子可以是单链分子。该单链分子可包括DNA、RNA或它们的组合。本披露的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一种或多种非天然的核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或多个循环中。添加非天然核苷酸也可以用于鉴别扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行所述一种或多种扩增反应可以包括使用一个或多个引物。一个或多个引物可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。一个或多个引物可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。一个或多个引物可以包括少于12-15个核苷酸。一个或多个引物可以退火至多个随机标记的靶标的至少一部分。一个或多个引物可以退火至多个随机标记的靶标的3’末端或5’末端。所述一个或多个引物可以退火至该多个随机标记的靶标的内部区。内部区可以是来自多个随机标记的靶标的3’末端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900，或1000个核苷酸。该一个或多个引物可以包括固定的引物面板。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个定制引物。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个对照引物。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个基因特异性引物。
该一个或多个引物可以包括本披露的任何通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。该一种或多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记、靶标、或其任何组合。该一个或多个引物可以包括通用引物和定制引物。可以将定制引物设计成扩增一种或多种靶标。这些靶标可以包括在一个或多个样品中的总核酸的亚组。这些靶标可以包括在一个或多个样品中的总随机标记的靶标的亚组。该一个或多个引物可以包括至少96个或更多个定制引物。该一个或多个引物可以包括至少960个或更多个定制引物。该一个或多个引物可以包括至少9600个或更多个定制引物。该一个或多个定制引物可以退火至两个或更多个不同的经标记的核酸。该两个或更多个不同的经标记的核酸可以对应于一个或多个基因。
可以将任何扩增方案用于本披露的方法。例如，在一个方案中，第一轮PCR使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物可以扩增分子(例如，附接至珠)。第二轮PCR使用侧翼于Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以便使PCR产物进入Illumina测序文库中。使用150bp x 2测序进行的测序可以揭示读数1上的细胞标记和分子索引、读数2上的基因，以及索引1读数上的样品索引。
可以按一轮或多轮进行扩增。在一些情况下存在多轮扩增。扩增可以包括两轮或更多轮的扩增。第一扩增可以是X’的延伸，以产生基因特异性区域。当样品核酸与新产生的链杂交时，第二扩增可以发生。
在一些实施例中，杂交不需要在核酸分子的末端发生。在一些实施例中，使较长核酸的完整链中的靶核酸进行杂交和扩增。例如在基因组DNA或mRNA中的较长部分中的靶标。靶标可以是来自多核苷酸的末端多于50t、多于100t、或多于1000t。
测序
对不同随机标记的核酸的数目的确定可以包括确定标记的靶标、空间标记、分子标记、样品标记、以及细胞标记或其任何产物(例如，标记的扩增子、标记的cDNA分子)的序列。可以对扩增的靶标进行测序。对随机标记的核酸或其任何产物的序列的确定可以包括进行测序反应以确定样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记的至少一部分的序列，和/或随机标记的靶标、其互补序列、其反向互补序列的至少一部分的序列、或其任何组合。
对核酸(例如，扩增的核酸、标记的核酸、标记的核酸的cDNA拷贝等)序列的确定可以使用各种测序方法来进行，这些测序方法包括但不限于，通过合成的测序(SBS)、通过杂交的测序(SBH)、通过连接的测序(SBL)、量化增量荧光核苷酸附加测序(QIFNAS)、分段连接与切割、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠、摆动测序(wobble sequencing)、多重测序、聚合集群(polymerized colony)(POLONY)测序；纳米格滚环测序(nanogrid rolling circlesequencing)(ROLONY)、等位基因特异性寡核苷酸连接检验(allele-specific oligoligation assay)(例如，寡聚连接检验(OLA)、使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出、连接的持锁探针、或使用连接的环形持锁探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)等。
在一些情况下，确定所述标记的核酸或其任何产物的序列包括配对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料终止剂测序、多重引物DNA测序、引物步移、桑格双脱氧测序法、马克西姆-吉尔伯特(Maxim-Gilbert)测序、焦磷酸测序、真正的单分子测序或其任何组合。可替代地，可以通过电子显微镜分析法或化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来确定经标记的核酸或其任意产物的序列。
也可以使用高通量测序方法，如使用平台(如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos、或Polonator平台)的循环阵列测序。测序可以包括MiSeq测序。测序可以包括HiSeq测序。
随机标记的靶标可以包括代表来自生物体基因组基因的约0.01％至生物体基因组基因的约100％的核酸。例如，可以使用包括多个多聚体的靶标互补区域，通过从样品中捕获含有互补序列的基因，对约0.01％的生物体基因组基因至约100％的生物体基因组基因进行测序。在一些实施例中，经标记的核酸包括代表来自约0.01％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物的核酸。例如，可以使用包括聚-T尾的靶标互补区域，通过从样品中捕获mRNA，对约0.501％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物进行测序。
测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至多约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至多约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至少约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对经标记的核酸和/或随机条形码的至多约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。
测序可以包括至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000或更多个测序读数/运行。测序可以包括至多约200、300、400、500、600、700、800、900、1,000或更多个测序读数/运行。在一些情况下，测序包括至少约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000或更多个测序读数/运行的测序。在一些情况下，测序包括至多约1,500；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；或10,000或更多个测序读数/运行的测序。测序可以包括至少1000万、5000万、1亿、1.5亿、2亿、2.5亿、3亿、3.5亿、4亿、4.5亿、5亿、5.5亿、6亿、6.5亿、7亿、7.5亿、8亿、8.5亿、9亿、9.5亿、或10亿或更多个测序读数/运行的测序。测序可以包括至多1000万、5000万、1亿、1.5亿、2亿、2.5亿、3亿、3.5亿、4亿、4.5亿、5亿、5.5亿、6亿、6.5亿、7亿、7.5亿、8亿、8.5亿、9亿、9.5亿、或10亿或更多个测序读数/运行的测序。测序可以包括总计为至少1亿、2亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、11亿、12亿、13亿、14亿、15亿、16亿、20亿、30亿、40亿、或50亿或更多个测序读数的测序。测序可以包括总计为至多1亿、2亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、11亿、12亿、13亿、14亿、15亿、16亿、20亿、30亿、40亿、或50亿或更多个测序读数的测序。测序可以包括小于或等于约1,600,000,000个测序读数/运行。测序可以包括小于或等于约200,000,000个读数/运行。
空间条形编码的方法
本文披露的一些实施例提供了对来自样品的靶标中的核酸进行空间条形编码的方法。在一些实施例中，将多个寡核苷酸固定于基底(如，载玻片)上。在一些实施例中，该基底可以涂覆有聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体、或其任何组合。在一些实施例中，这些寡核苷酸包括靶特异性区，如寡聚(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体等。
可以将包括例如，切片、单层细胞、固定的细胞、组织切片部分的样品与在基底上的寡核苷酸接触。这些细胞可以包括一种或多种细胞类型。例如，这些细胞可以是脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞、循环细胞或其任何组合。例如，通过重力流可以使这些细胞接触，其中可以使这些细胞沉淀并且产生单层细胞。该样品可以是组织薄切片。可以将薄切片置于基底上。该样品可以是一维的(例如，形成平面)。可以将该样品(例如，细胞)涂布于基底上，例如，通过在基底上生长/培养这些细胞。
细胞裂解
随着细胞和随机条形码的分布，可以就这些细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过多种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解。可以通过添加包括洗涤剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X-100、吐温-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶标与随机条形码的关联性，可以通过例如降低温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施例中，使用滤纸可以将该样品裂解。可以用在滤纸上部的裂解缓冲液浸渍该滤纸。在压力下可以将滤纸应用于样品，该压力可以促进样品的裂解，以及样品的靶标与基底的杂交。
在一些实施例中，可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解、和/或化学裂解进行裂解。化学裂解可以包括使用消化酶类，如蛋白酶K、胃蛋白酶、以及胰蛋白酶。可以通过将裂解缓冲液添加到基底中进行裂解。裂解缓冲液可以包括Tris HCl。裂解缓冲液可以包括至少约0.01、0.05、0.1、0.5、或1M，或更高浓度的Tris HCl。裂解缓冲液可以包括至多约0.01、0.05、0.1、0.5、或1M或更高浓度的Tris HCL。裂解缓冲液可以包括约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更高。在一些实施例中，该裂解缓冲液的pH是约7.5。该裂解缓冲液可以包括盐(例如，LiCl)。在裂解缓冲液中盐的浓度可以是至少约0.1、0.5、或1M，或更高。在裂解缓冲液中盐的浓度可以是至多约0.1、0.5、或1M，或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中盐的浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包括洗涤剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、曲通X、吐温、NP-40)。在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％，或更高。在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、或7％，或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中洗涤剂的浓度是约1％十二烷基硫酸锂。该裂解方法中所用时间可以依赖于所用洗涤剂的量。在一些实施例中，所用洗涤剂越多，裂解所需时间越短。裂解缓冲液可以包括螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。在裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至少约1、5、10、15、20、25、或30mM或更高。在裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至多约1、5、10、15、20、25、或30mM或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中的螯合剂的浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包括还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。在裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至少约1、5、10、15、或20mM或更高。在裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至多约1、5、10、15、或20mM或更高。在一些实施例中，在裂解缓冲液中还原剂的浓度是约5mM。在一些实施例中，裂解缓冲液可以包括约0.1M Tris HCl、约pH 7.5、约0.5M LiCl、约1％十二烷基硫酸锂、约10mM EDTA，以及约5mM DTT。可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃，或30℃的温度下进行裂解。可以将裂解持续约1、5、10、15、或20分钟，或更久。裂解的细胞可以包括至少约100000、200000、300000、400000、500000、600000、或700000个靶核酸分子，或更多。裂解的细胞可以包括至多约100000、200000、300000、400000、500000、600000、或700000个靶核酸分子，或更多。
在一些实施例中，可以将寡核苷酸与从这些细胞中释放的核酸进行杂交。这些核酸可以包括DNA(如基因组DNA)或RNA(如信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有聚(A)尾的RNA)、或其任何组合。可以将与这些寡核苷酸杂交的核酸用作模板，用于延伸反应，如逆转录、DNA聚合等。
可以将从裂解的细胞中释放出的核酸分子与基底上的多个探针(例如，与基底上的探针杂交)相关联。当该探针包括寡聚dT时，可以将mRNA分子与探针杂交，并且进行逆转录。可以将寡核苷酸的寡聚dT部分充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。标记的RNA分子的逆转录可通过添加逆转录引物而进行。在一些情况下，逆转录引物是寡dT引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡dT引物的长度为12-18个核苷酸，并结合至在哺乳动物mRNA的3’末端的内源性聚(A)+尾部。随机六核苷酸引物可在多个互补位点结合至mRNA。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
逆转录可以重复地发生以产生多个标记的cDNA分子。本文公开的方法可包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次逆转录反应。该方法可包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100次逆转录反应。
在一些实施例中，使用化学切割可以将核酸从基底中去除。例如，可以将存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基用于促进将其从固体支持物中去除。例如，酶可以用于从基底中去除核酸。例如，通过限制性内切核酸酶消化，可以将核酸从基底中去除。例如，使用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含有dUTP或ddUTP的核酸可以从基底中去除核酸。例如，可以使用用于核苷酸切除(例如，碱基切除修复酶(例如，脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶))的酶将核酸从基底中去除。在一些实施例中，可以使用可光解(photocleavable)基团以及光将核酸从基底中去除。在一些实施例中，可以使用可切割接头从基底中去除核酸。例如，可切割性接头可以包括以下各项中的至少一种：生物素/亲和素、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性链亲和素、Ig蛋白A、光不稳定性接头、酸或碱不稳定性接头基团、或适体。
当探针是基因特异性时，可以将这些分子与探针杂交，并且进行逆转录和/或扩增。在一些实施例中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，可以将其扩增。扩增可以多路方式进行，其中多个靶核酸序列同时进行扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
例如，用桥接扩增可以将扩增在基底上进行。cDNA可以是同聚物尾部，使用基底上的寡聚dT探针，以产生用于桥接扩增的相容末端。在桥接扩增中，与模板核酸的3'末端互补的引物可以是共价附接至固体颗粒的每对引物的第一引物。当含有模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延伸以形成双链体分子，该双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒中释放模板分子，并通过第一引物将互补性DNA链附接至颗粒。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，该第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的片段互补。该杂交可导致互补链在通过共价键固定到第一引物的第一和第二引物之间形成桥接，并通过杂交形成第二引物。在延伸阶段，通过在相同的反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以按相反方向延伸，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且该双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子的一端分别经第一和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一端是未附接的。在该第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以与先前未使用的另外的互补引物杂交在相同的颗粒上，以形成新的单链桥。将现在杂交的两个先前未使用的引物延伸从而将两个新桥转换成双链桥。
扩增反应可以包括将至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％，或100％的多个核酸进行扩增。
对经标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的指数式扩增。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特异性DNA序列体外扩增的反应。PCR可涵盖该反应的派生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及装配PCR。
在一些情况下，对经标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于，多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circleamplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶标、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前切割的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。
在一些情况下，本文披露的这些方法进一步包括在扩增的扩增子(例如，靶标)上进行巢式聚合酶链式反应。该扩增子可以是双链分子。该双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可包含样品标签或分子鉴定物标记。可替代地，该扩增子可以是单链分子。该单链分子可包括DNA、RNA或它们的组合。本发明的核酸可包括合成的或改变的核酸。
在一些情况下，该方法重复扩增经标记的核酸以产生多个扩增子。本文公开的方法可包括进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次扩增反应。可替代地，该方法包括进行至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100次扩增反应。
扩增可进一步包括将一个或多个对照核酸添加至包括多个核酸的一个或多个样品中。扩增可进一步包括将一个或多个对照核酸添加至多个核酸中。对照核酸可以包括对照标记。
扩增可以包括使用一种或多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或多个循环中。添加非天然核苷酸也可以用于鉴别扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行所述一种或多种扩增反应可以包括使用一个或多个引物。该一个或多个引物可以包括一个或多个寡核苷酸。该一种或多种寡核苷酸可以包括至少约7至9个核苷酸。该一个或多个寡核苷酸可以包括少于12-15个核苷酸。该一个或多个引物可以退火至多个经标记的核酸的至少一部分。该一个或多个引物可以退火至多个经标记的核酸的3’端和/或5’端。该一个或多个引物可以退火至多个经标记的核酸的内部区。内部区可以是从该多个经标记的核酸的3’端的至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。该一个或多个引物可以包括固定的引物面板。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个定制引物。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个对照引物。该一个或多个引物可以包括至少一个或多个管家基因引物。该一个或多个引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。该一个或多个定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子鉴定物标记、核酸或它们的产物。该一个或多个引物可以包括通用引物和定制引物。该定制引物可以被设计成扩增一个或多个靶核酸。这些靶核酸可以包括一个或多个样品中总核酸的亚群。在一些情况下，这些引物是附接至本披露的阵列的探针。
检测
可以将一种或多种靶标特异性的探针用于检测在基底上的一种或多种靶标。在一些实施例中，这些探针可以是荧光标记的。杂交探针的成像可以是由例如，荧光成像产生的。在一些实施例中，可以去除探针，并且将不同组的探针用于检测不同组的靶标。
例如，使用检测探针(例如，荧光探针)可以检测靶标(例如，分子、扩增的分子)。可以将阵列与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个检测探针杂交。可以将阵列与至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个检测探针杂交。在一些实施例中，将该阵列与4个检测探针杂交。
检测探针可以包括与感兴趣的基因序列互补的序列。该检测探针的长度可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。该检测探针的长度可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个或更多个核苷酸。检测探针可以包括与感兴趣的基因(例如，靶标)中的序列完美互补的序列。这些检测探针可以包括与感兴趣的基因(例如，靶标)中的序列不完美互补的序列。这些检测探针可以包括与感兴趣的基因序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个错配的序列。这些检测探针可以包括与感兴趣的基因序列具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个错配的序列。
这些检测探针可以包括可检测的标记。示例性可检测标记可以包括荧光团、生色团、小分子、纳米颗粒、半抗原、酶、抗体、磁性、或其任何组合。
可以将杂交探针进行成像。该图像可以用于基于可检测信号的强度(例如，荧光信号)来确定感兴趣基因的相对表达水平。可以将扫描激光荧光显微镜或读取器用于从基底(例如，微阵列)获取发射的光的数字图像。可以将聚焦的光源(通常是激光)跨杂交基底进行扫描，使杂交区域发射光信号(如荧光)。在扫描操作期间可以收集和测量荧光团特异性荧光数据，并且然后可以通过适当的算法、软件和计算机硬件重构基底的图像。然后可以将探针核酸特征的期望的或预期的位置与在那些位置处测量的荧光强度组合，以产生随后用于确定靶标样品的基因表达水平或核酸序列的数据。从预期的探针位置处收集数据的过程可以被称为“特征提取”。数字图像可以由数千到数以百万计像素组成，通常尺寸范围为5至50微米。数字图像中的每个像素可以由16位整数表示，允许65,535种不同的灰度值。读取器可以顺序地从扫描基底获取像素，并将它们写入可存储在计算机硬盘驱动器上的图像文件中。在每个点位置处底物可以含有若干不同荧光标记的探针DNA样品。扫描器用适当波长的激光重复扫描整个基底，以激发每个探针DNA样品并将它们存储在它们单独的图像文件中。借助于编程的计算机来分析图像文件并随后进行查看。
可以用共焦激光扫描仪对基底进行成像。扫描仪可以扫描基底载玻片，以通过用特定染料的适当波长的激光进行顺序扫描，针对所使用的每种染料产生一个图像。每种染料可以具有已知的激发光谱和已知的发射光谱。扫描仪可以包括将激光束反射到物镜的分束器，反过来该物镜又将光束聚焦在载玻片的表面以引起荧光球形发射。发射的一部分可以通过透镜和分束器返回。在通过分束器之后，荧光束可以被反射镜反射，穿过发射光滤光器、聚焦检测器透镜和中心针孔。
探测与成像数据之间的关联
通过将显示靶标位置的图像与样品的图像相关联，可以产生靶标的空间条形码。可以将来自基底扫描的数据与在基底上未裂解样品的图像相关联。可以覆盖数据，从而生成图。使用产生的信息和本文描述的方法可以构建来自样品的靶标位置图。可以将该图用于定位靶标的物理位置。该图可用于识别多个靶标的位置。该多个靶标可以是相同种类的靶标，或该多个靶标可以是多个不同的靶标。例如，可以构建大脑图以显示多个靶标的数量和位置。
该图可以产生自来自单个样品的数据。可以使用来自多个样品的数据构建该图，从而产生组合图。可以用来自数十、数百，和/或数千个样品的数据来构建该图。从多个样品构建的图可以显示与多个样品共同的区域相关联的靶标的分布。例如，可以在相同的图上显示重复测定。可以在相同的图上显示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个重复(例如，覆盖)。可以在相同的图上显示至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个重复(例如，覆盖)。空间分布和靶标数目可以由各种统计来表示。
组合来自多个样品的数据可以增加组合图的位置分辨率。可以通过阵列上的共同界标和/或x-y位置来记录多个样品的定向，其中跨样品的单独位置测量至少是部分不连续的。复用上述方法将允许获得样品中靶核酸的高分辨率图谱。
数据分析和相关性对于确定特定细胞类型(例如，罕见细胞、癌细胞)的存在和/或缺失是有用的。数据相关性对于确定靶核酸在细胞内或样品内不同位置中的相对比例是有用的。
本文披露的方法和组合物对于医学专业人士(例如，病理学家)可以是伴随式诊断，其中可以通过目视观察病理图像并将该图像与遗传表达(例如癌基因表达的鉴定)相关联来对受试者进行诊断。方法和组合物对于鉴定来自细胞群的细胞，以及确定样品中这些细胞的遗传异质性可以是有用的。方法和组合物对于确定样品的基因型可以是有用的。
本披露提供了用于复制基底的方法。可以用针对不同感兴趣的基因的不同探针对基底进行再探测，或可选择性地选择特异性基因。例如，可以将样品置于包含多个寡聚(dT)探针的基底上。mRNA可以与探针杂交。可以将包含寡聚(dT)探针的复制底物与初始载玻片接触并重复mRNA。包含RNA基因特异性探针的复制底物可以与初始载玻片接触以进行复制。
mRNA可以逆转录为cDNA。cDNA可以是同聚物尾和/或可以被扩增(例如，经桥接扩增)。阵列可以与复制阵列接触。该复制阵列可以包括能结合感兴趣的cDNA的基因特异性探针。该复制阵列可以包括用聚腺苷酸化序列结合cDNA的聚A探针。
可以进行的复制的数目可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更多。可以进行的复制的数目可以是至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，或更多。
在一些实施例中，该初始基底包括多个基因特异性探针，并且该复制基底包括对应于与基因特异性探针相同基因的相同基因特异性探针，或不同探针。
成像
可以对与基底接触的样品进行分析(例如，用免疫组织化学、染色和/或成像)。免疫组织化学的示例性方法可以包括将通过将标记引入能够识别待检测的生物物质的物质而获得的标记的探针生物物质与组织切片进行反应的步骤，从而经生物物质之间的特定结合反应，将存在于组织切片上待检测的生物物质可视化。
对于组织学样本，可以将组织块固定在合适的固定剂(通常是福尔马林)中，并将其嵌入熔化的石蜡中。可以在薄片切片机上切割蜡块以产生含有组织的石蜡的薄切片。可以将样本片应用到基底上、风干并加热，从而导致样本粘附在玻璃载玻片上。可以将残余石蜡用合适的溶剂(通常为二甲苯、甲苯或其他)溶解。可以将这些所谓的去石蜡化溶剂在染色之前用洗涤脱水型试剂去除。可以从冷冻样本中制备切片，在10％福尔马林中短暂固定，然后注入脱水试剂。可以在染色之前将脱水试剂用水性染色剂去除。
在一些实施方案中，可以使用Papanicolaou染色技术(例如，进行性染色和/或苏木精伊红[H&E]，即回归染色)。HE(苏木精-伊红)染色使用苏木精和伊红作为染料。苏木精是蓝紫色染料，并且具有染色嗜碱性组织(如细胞核、骨组织、部分软骨组织、和浆液成分)的性质。伊红是一种红色至粉红色的染料，并且具有染色嗜酸细胞组织(如细胞质、软组织结缔组织、红细胞、纤维蛋白、和内分泌颗粒)的性质。
由于用于可视化抗原-抗体反应的显色过程，免疫组织化学(IHC)可以被称为“免疫染色”，否则该抗原-抗体反应是不可见的(以下可将术语“免疫组织化学染色”用于免疫组织化学)。凝集素染色是一种技术，该技术可以按非免疫和特异性方式使用凝集素的与特定糖链结合的性质，以便使用凝集素检测组织样本中的糖链。
可以将HE染色、免疫组织化学、和凝集素染色用于检测例如，在细胞样本中癌细胞的位置。例如，当需要确认在细胞样本中的癌细胞的位置时，病理学家为了确定细胞样本中癌细胞的存在或缺失，可以制备组织切片部分并将其放置在本披露的基底上。可以对阵列上的部分进行HE染色、成像，或任何免疫组织化学分析，以便于获得其形态信息和/或任何其他识别特征(例如罕见细胞的存在或缺失)。可以将样品裂解，并且可以使用本披露的方法来确定核酸分子的存在或缺失。可以将核酸信息与图像进行比较(例如，空间比较)，从而指示样品中核酸的空间位置。
在一些实施例中，用染色增强剂(例如，化学渗透增强剂)染色组织。促进染色剂渗入组织中的组织化学渗透增强剂的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)；表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇、聚氧乙烯醚(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)和其他吐温衍生物)、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)、曲通X-100、Brij 35、Nonidet P-40；洗涤剂样物质，如溶血卵磷脂，皂苷；非离子洗涤剂，如X-100等；非质子溶剂，如二甲亚砜(DMSO)；醚类，如四氢呋喃，二噁烷等；酯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯，乙酸异丙酯；烃类，如甲苯；氯化溶剂，如二氯甲烷、二氯乙烷、氯苯等；酮类，如丙酮；腈类，例如乙腈；和/或增加细胞膜渗透性的其他试剂。
在一些实施例中，提供了促进哺乳动物组织样品染色的组合物。该组合物可以包含染色剂(例如苏木精、或苏木精和伊红-Y)、至少一种组织化学渗透增强剂(例如表面活性剂)、非质子溶剂、和/或PEG、或其任何组合。
在一些实施例中，将样品成像(例如，使用IHC或不使用IHC之前或之后)。成像可以包括显微镜检查，例如明场成像、斜射照明、暗场成像、色散染色、相位差、差示干涉对比、干涉反射显微镜、荧光、共聚焦、电子显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、和单平面照明、或其任何组合。成像可以包括使用阴性染色剂(例如，苯胺黑、钼酸铵、乙酸双氧铀、甲酸铀酰、磷钨酸、四氧化锇)。成像可以包括使用可以散射电子的重金属(例如金、锇)。
成像可以包括将一部分样品(例如，载玻片/阵列)进行成像。成像可以包括对至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的样品进行成像。成像可以包括对至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的样品进行成像。可以在离散步骤中进行成像(例如，图像可能不需要是连续的)。成像可以包括取至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个不同的图像。成像可以包括取至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个不同的图像。
图9说明了本披露的同聚物加尾方法的示例性实施例。本披露提供了包括附接至基底表面的多个探针905的基底910。该基底910可以是微阵列。该多个探针905可以包括寡聚(dT)。该多个探针905可以包括基因特异性序列。该多个探针105可以包括随机条形码。可以将样品(例如，细胞)915置于基底910上和/或在其上生长。可以对含有样品的基底进行分析920，例如通过成像和/或免疫组织化学。可以将样品915在基底910上进行裂解925。可以将来自样品915的核酸930与在基底910上的该多个探针905相关联(例如，杂交)。在一些实施例中，可以将核酸930进行逆转录、同聚物加尾、和/或扩增(例如，用桥接扩增)。可以将扩增的核酸用检测探针940(例如，荧光探针)进行询问935。这些检测探针940可以是基因特异性探针。可以将在基底910上的检测探针940的结合位置与基底的图像相关联，从而产生表明在样品中核酸空间位置的图。
在一些实施例中，这些方法可以包括使945成为原始基底910的复制946。该复制基底946可以包括多个探针931。该多个探针931可以与在原始基底910上的该多个探针905相同。该多个探针931可以不同于在原始基底910上的该多个探针905。例如，该多个探针905可以是寡聚(dT)探针，并且在复制基底946上的该多个探针931可以是基因特异性探针。可以如原始基底那样处理复制基底，例如通过检测(例如，荧光)探针用询问进行。
样品
细胞
用于在本披露的方法中使用的样品可以包括一种或多种细胞。样品可以意指一种或多种细胞。在一些实施例中，所述细胞是从癌组织切除的癌细胞，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌等。在一些情况下，所述细胞源自癌症，但是从体液(例如，循环肿瘤细胞)收集。癌的非限制性实例可以包括腺瘤(adenoma)、腺癌(adenocarcinoma)、鳞状细胞癌、基底细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、软骨肉瘤、以及纤维肉瘤。
在一些实施例中，所述细胞是已被病毒感染并含有病毒寡核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述病毒感染可以由选自下组的病毒引起，该组由以下各项组成：双链DNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、单链(+链或“有义”)DNA病毒(例如细小病毒)、双链RNA病毒(例如呼肠孤病毒)、单链(+链或有义)RNA病毒(例如微小核糖核酸病毒、披膜病毒)、单链(-链或反义)RNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、单链((+链或有义)RNA病毒，在其生命周期中具有DNA中间体)RNA-RT病毒(例如逆转录病毒)和双链DNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。示例性病毒可以包括，但不限于，SARS、HIV、冠状病毒、Ebola、Malaria、Dengue、丙型肝炎、乙型肝炎，以及流感病毒。
在一些实施例中，这些细胞是细菌。这些可以包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。可以使用所披露的方法、装置和系统分析的细菌的实例包括但不限于马杜拉放线菌属(Actinomedurae)、衣氏放线菌、炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌属、粪肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、诺卡氏菌属、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm)、变异链球菌、肺炎链球菌等。革兰氏阴性细菌包括但不局限于：猫阿菲波菌(Afipia felis)、类杆菌(Bacteriodes)、杆状巴尔通体、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、伯氏疏螺旋体、回归热疏螺旋体、布鲁氏菌(Brucella)、肉芽肿鞘杆菌、弯曲杆菌、大肠杆菌、土拉热弗朗西丝菌、阴道加德纳菌、埃及嗜血杆菌(Haemophilius aegyptius)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilius ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilius influenziae)、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟菌、牙龈卟啉单胞菌、斯氏普罗维登斯菌(Providencia sturti)、铜绿假单胞菌、肠炎沙门菌(Salmonella enteridis)、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、波伊德志贺氏菌、念珠状链杆菌、化脓链球菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌、以及类似物。其他细菌可以包括鸟分枝杆菌(Myobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Myobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Myobacterium tuberculosis)、Bartonellahenseiae、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、伯氏考克斯体、肺炎支原体、螨立克次体、普氏立克次氏体、立氏立克次体、姜虫病立克次氏体、斑疹伤寒立克次氏体、尿素分解脲原体、肺炎双球菌、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌、脑膜炎球菌、以及类似物。
在一些实施例中，所述细胞是真菌。可以使用所披露的方法、装置和系统分析的真菌的非限制性实例包括但不限于曲霉属、假丝酵母属(Candidae)、白色念珠菌、粗球孢子菌、隐球菌属(Cryptococci)及其组合。
在一些实施例中，所述细胞是原生动物或其他寄生虫。待使用本披露的方法、装置和系统分析的寄生虫的实例包括但不限于结肠小袋纤毛虫、微小隐孢子虫、卡晏环孢子虫(Cyclospora cayatanensis)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoa)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、比氏肠孢虫(Enterocytozoon bieneusi)、兰伯贾第虫、利什曼原虫(Leishmaniae)、疟原虫(Plasmodii)、鼠弓形体、锥体虫(Trypanosomae)、梯形阿米巴(trapezoidal amoeba)、蠕虫(worm)(例如，蠕虫(helminthes))，尤其是寄生蠕虫，包括但不限于线虫纲(蛔虫(roundworm)，例如鞭虫、钩虫、蛲虫、蛔虫(ascarid)、丝状虫(filarid)等)、绦虫纲(例如，绦虫)。
如本文所用的，术语“细胞”可以意指一种或多种细胞。在一些实施例中，所述细胞是正常细胞，例如不同发育阶段的人类细胞，或来自不同器官或组织类型的人类细胞(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子，或者来自心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠、小肠的细胞)。在一些实施例中，所述细胞可以是未分化的人类干细胞或已被诱导分化的人类干细胞。在一些实施例中，所述细胞可以是人类胎儿细胞。人类胎儿细胞可以获得自怀有胎儿的母亲。在一些实施例中，所述细胞是罕见细胞。罕见细胞可以是例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、循环干细胞、干细胞、未分化干细胞、癌干细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞、滋养层、免疫系统细胞(宿主或移植物)、细胞片段、细胞器(例如线粒体或细胞核)、病原体感染的细胞等。
在一些实施例中，所述细胞是非人类细胞，例如其他类型的哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)。在一些实施例中，所述细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施例中，所述细胞可以是任何原核或真核细胞。
在一些实施例中，第一细胞样品获得自不患有疾病或病症的人，并且第二细胞样品获得自患有该疾病或病症的人。在一些实施例中，这些人是不同的。在一些实施例中，所述人是相同的，但是细胞样品是在不同时间点取的。在一些实施例中，所述人是患者，并且所述细胞样品是患者样品。所述疾病或病症可以是癌症、细菌感染、病毒感染、炎性疾病、神经退行性疾病、真菌疾病、寄生虫病、遗传性障碍或其任何组合。
在一些实施例中，适用于本披露方法的细胞尺寸为直径在从约2微米至约100微米的范围中。在一些实施例中，这些细胞具有的直径是至少2微米、至少5微米、至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少30微米、至少40微米、至少50微米、至少60微米、至少70微米、至少80微米、至少90微米、或至少100微米。在一些实施例中，这些细胞具有的直径是至多100微米、至多90微米、至多80微米、至多70微米、至多60微米、至多50微米、至多40微米、至多30微米、至多20微米、至多15微米、至多10微米、至多5微米、或至多2微米。这些细胞可以具有的直径是范围内的任何值，例如从约5微米至约85微米。在一些实施例中，这些细胞具有的直径是约10微米。
在一些实施例中，在将细胞与珠关联之前和/或在微孔中对所述细胞进行分选。例如，所述细胞可以通过荧光活化细胞分选或磁活化细胞分选进行分选，或通过流式细胞术进行分选。所述细胞可以按尺寸进行过滤。在一些情况下，滞留物含有与所述珠相关联的细胞。在一些情况下，流过物(flow through)含有与所述珠相关联的细胞。
样品可以是核酸。该样品可以包括核酸。该样品可以是单细胞。当该样品是单细胞时，可以将该细胞裂解从而释放来自单细胞的核酸。该样品可以是多个细胞。不同孔中的样品可以来自相同的受试者。不同孔中的样品可以来自不同的受试者。不同孔中的样品可以来自不同的组织(例如，脑、心脏、肺、肾、脾)。不同孔中的样品可以来自相同的组织。
跨基底扩散
当根据本披露的方法对样品(例如，细胞)进行随机条形编码和/或组合条形编码时，细胞可以裂解。细胞的裂解可导致裂解内容物(例如，细胞内容物)的扩散，从而远离裂解的初始位置。换言之，裂解内容物可以移动到比由细胞占据的表面积更大的表面区域中。
样品裂解混合物(例如，包括靶标)的扩散可以通过各种参数进行调节，这些参数包括但不限于裂解混合物的粘度、裂解混合物的温度、靶标大小、基底中物理障碍的大小、裂解混合物的浓度等。例如，可以进行的裂解反应的温度是在至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、或40℃，或更高温度下。可以进行的裂解反应的温度是在至多1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、或40℃，或更高温度下。裂解混合物的粘度可以通过例如，添加增稠剂(例如甘油、珠)以减慢扩散速率来改变。裂解混合物的粘度可以通过例如，添加稀释试剂(例如水)以增加扩散速率来改变。基底可以包括可以改变靶标从样品中的扩散速率的物理障碍(例如孔、微孔、微丘(microhill))。可以改变裂解混合物的浓度以增加或降低靶标从样品中的扩散速率。裂解混合物的浓度可以增加或降低至少1、2、3、4、5、6、7、8、或9倍，或更多倍。裂解混合物的浓度可以增加或降低至多1、2、3、4、5、6、7、8、或9倍，或更多倍。
扩散速率可以是增加的。扩散速率可以是降低的。相比未经改变的裂解混合物，裂解混合物的扩散速率可以增加或降低至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍，或更多倍。相比未经改变的裂解混合物，裂解混合物的扩散速率可以增加或降低至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍，或更多倍。与未经改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。与未经改变的裂解混合物相比，裂解混合物的扩散速率可以增加或降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
数据分析和显示软件
对靶标空间分辨率的数据分析和可视化
本披露提供了用于使用随机条形编码和/或组合条形编码和数字计数来估计靶标的数量和位置的方法。从本披露的方法获得的数据可以在图上被可视化。从本披露的方法获得的数据可以在微孔阵列的图上被可视化(例如，使得每个样品的结果可以追溯到微孔阵列中的位置)。使用产生的信息和本文描述的方法可以构建来自样品的靶标数目和位置的图。可以将该图用于定位靶标的物理位置。该图可用于识别多个靶标的位置。该多个目标可以是相同种类的靶标，或该多个靶标可以是多个不同的靶标。例如，可以构建大脑图以显示多个靶标的数字计数和位置。
该图可以产生自来自单个样品的数据。可以使用来自多个样品的数据构建该图，从而产生组合图。可以用来自数十、数百、和/或数千个样品的数据来构建该图。从多个样品构建的图可以显示与多个样品共同的区域相关联的靶标的数字计数的分布。例如，可以在相同的图上显示重复测定。可以在相同的图上显示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个重复(例如，覆盖)。可以在相同的图上显示至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个，或更多个重复(例如，覆盖)。空间分布和靶标数目可以由各种统计来表示。
在所述仪器系统的一些实施例中，所述系统将包括计算机可读媒质，其包括用于为通过进行单细胞、随机条形编码化测定而产生的序列数据集提供数据分析提供数据分析的代码。可以由数据分析软件提供的数据分析功能性的实例包括但不限于(i)用于由对在运行测定时产生的随机条形编码和/或组合条形码试剂文库进行测序提供的样品标记、细胞标记、分子标记和靶序列数据的解码/多路解编的算法，(ii)用于基于数据来确定读数数目/基因/细胞和单一转录物分子数目/基因/细胞和创建汇总表的算法，(iii)序列数据的统计分析，例如用于由基因表达数据来聚簇细胞，或用于预测转录物分子数目/基因/细胞的测定的置信区间等，(iv)用于鉴定罕见细胞子群的算法，例如，使用主分量分析、层次聚簇、k均值聚簇、自组织映射、神经网络等，(v)用于将基因序列数据与已知参照序列进行比对和对突变、多态性标志物和剪接变体进行检测的序列比对能力，以及(vi)分子标记的自动化聚簇，以补偿扩增或测序误差。在一些实施例中，可商购的软件可用于进行数据分析的全部或一部分，例如，Seven Bridges(https://www.sbgenomics.com/)软件可用于针对整个细胞集合编译每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目表。在一些实施例中，数据分析软件可以包括用于以有用的图形格式输出测序结果的选项，例如指示出现在细胞集合的每个细胞中的一个或多个基因的拷贝数目的热图。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于从测序结果提取生物学意义的算法，例如通过将在细胞集合的每个细胞中出现的一个或多个基因的拷贝数目与细胞类型、罕见细胞类型、或者源自患有特定疾病或病况的受试者的细胞相关联。在一些实施例中，数据分析软件可以进一步包括用于比较不同生物样品的细胞群的算法。
在一些实施例中，所有数据分析功能性可以被包装在单个软件包内。在一些实施例中，完整的数据分析能力集可以包括一套软件包。在一些实施例中，数据分析软件可以是独立于测定仪器系统的用户可用的独立式包装。在一些实施例中，所述软件可以是基于网络的，并且可以允许用户共享数据。
系统处理器和网络
通常，包括在当前披露的仪器系统中的计算机或处理器可以被进一步理解为逻辑设备，其可以读取来自介质或网络端口的指令，其可以任选地与具有固定介质的服务器连接。该系统可以包括CPU、磁盘驱动器、任选的输入装置(如键盘和/或鼠标)以及任选的监测器。可以通过从指定的通信介质传至在本地或远程位置的服务器来实现数据通信。通信媒质可以包括发送或接收数据的任何工具。例如，通信介质可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可以提供经由万维网的通信。可以设想的是，与本披露有关的数据可以通过这样的网络或连接进行传输，以由接收方接收或审阅。
可以与本披露的示例性实施例结合使用计算机系统的第一示例性架构的示例性实施例。所述示例性计算机系统可以包括用于处理指令的处理器。处理器的非限制性实例包括：英特尔XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、三星32位RISC ARM 1176JZ(F)-Sv1.0TM处理器、ARM Cortex-A8三星S5PC100TM处理器、ARM Cortex-A8苹果A4TM处理器、迈威尔(Marvell)PXA 930TM处理器或功能等效的处理器。多个执行线程可以用于并行处理。在一些实施例中，也可以使用多处理器或具有多个核心的处理器，无论是以单个计算机系统、成群地还是通过网络跨系统分配的，所述网络包括多个计算机、手机或个人数据助理装置。
可以将高速缓存连接至或并入处理器中，以便为最近已经被或频繁地被处理器使用的指令或数据提供高速存储器。可以通过处理器总线将处理器与北桥连接。北桥通过存储总线与随机存取内存(RAM)连接并且管理处理器对RAM的访问。北桥还可通过芯片集总线与南桥连接。南桥进而与外设总线连接。外设总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外设总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集并且管理处理器、RAM与外设总线上的外设部件之间的数据传输。在一些替代性架构中，可以将北桥的功能性并入处理器中而取代使用单独的北桥芯片。
该系统可以包括附接至外设总线的加速器卡。加速器可以包括现场可编程门阵列(FPGA)或其他用于加速某些处理的硬件。例如，加速器可以用于自适应性数据重构或用于评价扩展集处理中所用的代数表达式。
软件和数据可以被存储在外部存储器中并且可以被加载到RAM或缓存中，用于为处理器所用。系统包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM，和其他功能等效的操作系统，以及在操作系统之上运行的用于根据本发明的示例性实施例管理数据存储和优化的应用软件。
在该实例中，系统还包括网络接口卡(NIC)，并且与外设总线连接，用于为外部存储器(如附网存储(NAS))和其他可以用于分布式并行处理的计算机系统提供网络接口。
网络的一个示例性图表可以包括多个计算机系统、多个手机、个人数据助理和附网存储(NAS)。在示例性实施例中，系统可以管理数据存储并针对存储在附网存储(NAS)中的数据优化数据访问。数学模型可以用于数据并且使用跨计算机系统、和手机以及个人数据助理系统的分布式并行处理进行评价。计算机系统和手机以及个人数据助理系统还可以为存储在附网存储(NAS)中的数据的自适应性数据重构提供并行处理。多种多样的其他计算机架构和系统也可以与本发明的不同实施例结合使用。例如，刀片式服务器可以用来提供并行处理。处理器刀片可以通过底板进行连接，以提供并行处理。存储器也可以通过单独的网络接口与底板连接或作为附网存储(NAS)。
在一些示例性实施例中，处理器可以保持分开的存储空间并且通过网络接口、底板或其他连接器传输数据，用于通过其他处理器进行并行处理。在其他实施例中，一些或所有处理器可以使用共享的虚拟地址存储空间。
根据一个示例性实施例的多处理器计算机系统的框图，所述系统可以包括共享的虚拟地址存储空间。该系统可以包括多个可以访问共享的存储子系统的处理器。该系统可以在存储子系统中并入多个可程编硬件存储算法处理器(MAP)。每个MAP可以包括存储器以及一种或多种现场可编程门阵列(FPGA)。MAP可以提供可配置性功能单元并且具体算法或算法部分可以被提供给FPGA，用于与对应的处理器密切配合进行处理。例如，MAP可以用于相对于数据模型来评价代数表达式以及用于在示例性实施例中进行自适应型数据重构。在这个实例中，每个MAP都可被所有处理器全球访问，用于这些目的。在一种配置中，每个MAP都可以使用直接内存访问(DMA)来访问相关的存储器，从而允许它独立于对应的微处理器并且与其不同步地执行任务。在这种配置中，MAP可以将结果直接反馈给至另一MAP，用于流水操作和并行执行算法。
以上计算机架构和系统仅仅是实例，并且多种多样的其他计算机、手机和个人数据助理架构和系统可以与示例性实施例结合使用，包括使用一般处理器、协同处理器、FPGA和其他可编程逻辑装置、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)以及其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些实施例中，全部或部分的计算机系统可以在软件或硬件中实施。任何种类的数据存储介质都可以与示例性实施例结合使用，包括随机存取内存、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、附网存储(NAS)以及其他局部或分布式数据存储装置和系统。
在示例性实施例中，可以使用在任何以上或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实施本披露的计算机子系统。在其他实施例中，可以部分地或完全地在以下项中实现所述系统的功能：固件、可编程逻辑装置(如现场可编程门阵列(FPGA))、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件。例如，可以通过使用硬件加速器卡(如加速器卡)通过硬件加速来实施集处理器和优化器。
试剂盒
本文披露的是用于进行单细胞、随机条形编码、和/或组合条形编码测定的试剂盒。该试剂盒可以包括本披露的组合物或组合物的混合物(例如，具有任何类型和数目的任何组合条形码试剂)。该试剂盒可以包括本披露的一种或多种组合条形码试剂。该试剂盒可以包括本披露的一种或多种随机条形码。该试剂盒可以包括一种或多种基底(例如，微孔阵列)作为包括一种或多种微孔阵列的独立式基底(或芯片)，或在一种或多种流动细胞或柱体内进行包装。该试剂盒的一种或多种基底可以包括在孔中预加载的组合条形码试剂和/或随机条形码试剂。在一些情况下，这些随机的条形码试剂可以是在基底的孔中预加载的，并且该试剂盒包含用于用户向孔中进行添加的组合条形码试剂。
在一些情况下，试剂盒可以包括一组组合条形码试剂。组合条形码试剂的第二种可以包括一种组合条形码试剂，其包含靶特异性区(例如，有义或反义链)，以及可能不包含靶特异性区的其他组合条形码试剂，但可以包括将所有组合条形码试剂连接在一起的接头(例如，使得这些组合条形码试剂在靶核酸的一端连接在一起(参见图2C))。
这些试剂盒可以包括一种或多种固体支持物悬浮液，其中在悬浮液中的这些单独固体支持物包括本披露的多个附接的随机条形码。这些试剂盒可以包括可能不附接至固体支持物的随机条形码。该试剂盒可以包括密封剂。在一些实施例中，该试剂盒可以进一步包括用于安装独立式基底的机械固定器，以便产生促进将样品和试剂用移液管移取进基底中的反应孔。
该试剂盒可以进一步包括用于进行随机条形编码测定的试剂，例如裂解缓冲液、漂洗缓冲液，或杂交缓冲液。该试剂盒可以进一步包括用于进行核酸延伸反应(例如，逆转录反应和引物延伸反应)的试剂(例如，酶、引物、dNTP、NTP、RNA酶抑制剂、或缓冲液)。该试剂盒可以进一步包括用于进行扩增反应以制备测序文库的试剂(例如，酶、通用引物、测序引物、靶特异性引物、或缓冲液)。试剂盒可以包括用于对分子进行同聚物加尾的试剂(例如，末端转移酶，和dNTP)。该试剂盒可以包括用于例如，本披露的任何酶促裂解的试剂(例如，ExoI核酸酶、限制性内切酶)。可以将这些试剂预加载到基底的孔(例如，其中具有组合条形码试剂)中。
该试剂盒可以包括对文库扩增引物进行测序。该试剂盒可以包括本披露的第二链合成引物。该试剂盒可以包括本披露的任何引物(例如，基因特异性引物、随机多聚体、测序引物、以及通用引物)。
该试剂盒可以包括一种或多种模具，例如，这些模具包括用于铸造基底(例如，微孔阵列)的微柱的阵列，以及一种或多种固体支持物(例如，珠)，其中在悬浮液内的这些单独珠包括本披露的多个附接的随机条形码。该试剂盒可以进一步包括用于在铸造基底(例如，琼脂糖、水凝胶、PDMS、光学粘合剂等)中使用的材料。
该试剂盒可以包括用固体支持物预加载的一种或多种基底，这些固体支持物包括本披露的多个附接的随机条形码。在一些情况下，基底的每个微孔中可以存在一种固体支持物。在一些实施例中，该多个随机条形码可以直接附接至基底的表面，而不是附接至固体支持物。在这些实施例的任何一个中，所述一个或多个微孔阵列能以独立式基底(或芯片)的形式提供，或者它们可以被包装在流动池或柱体中。
在一些实施例中，该试剂盒可以包括并入一种或多种基底中的一种或多种柱体。在一些实施例中，该一种或多种柱体进一步包括一种或多种预加载的固体支持物，其中悬浮液中的单独固体支持物包括本披露的多个附接的随机条形码。在一些实施例中，这些珠被预分配到柱体的一种或多种微孔阵列中。在一些实施例中，处于悬浮液形式的珠可以被预加载并储存在柱体的试剂孔内。在一些实施例中，所述一个或多个柱体进一步包括预先加载并储存在柱体的试剂储器内的其他测定试剂。
试剂盒通常可以包括用于执行本文描述的一种或多种方法的说明书。可以将在试剂盒中包含的说明书附在包装材料上，或可以作为包装插页包含其中。虽然说明书通常是书面材料或印刷材料，但并不限于此。本披露考虑了任何能够存储这些指令并将其传达给终端用户的介质。这样的介质可以包括，但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、柱体、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)、RF标签等。如本文所用的，术语“说明书”可以包括提供指令的因特网站点的地址。
装置
流动池
可以将微孔阵列基底包装在流动池内，所述流动池提供与流体处理系统的其余部分的方便界面结合并且有助于被递送至微孔阵列和/或乳滴的流体(例如，细胞和固体支持物悬浮液、裂解缓冲液、漂洗缓冲液等)的交换。设计特征可以包括：(i)一个或多个用于引入细胞样品、固体支持物悬浮液或其他测定试剂的入口，(ii)一个或多个被设计成提供均匀填充和有效流体交换同时最小化回涡或死区的微孔阵列室，以及(iii)一个或多个用于将流体递送到样品收集点或废物储器的出口。流动池的设计可以包括与多个微孔阵列界面结合的多个微孔阵列室，这样使得可以平行处理一个或多个不同细胞样品。流动池的设计可以进一步包括用于跨阵列室的宽度产生匀流速度剖面图(即“活塞流”)的特征，以提供细胞和珠到微孔的更均匀递送，例如，通过使用作为“流动扩散器(flow diffuser)”的位于室入口附近和微孔阵列上游的多孔隔板，或通过将每个阵列室分成若干分段，这些分段共同覆盖相同的总阵列区，但是通过它们分开的入口液流平行地流动。在一些实施例中，流动池可以围绕或并入多于一个微孔阵列基底。在一些实施例中，整合的微孔阵列/流动池组件可以构成系统的固定部件。在一些实施例中，微孔阵列/流动池组件可以是可从仪器移除的。
通常，将优化流体通道和一个或多个阵列室在流动池设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到微孔阵列的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。在一些实施例中，流体通道的宽度将处于50um和20mm之间。在其他实施例中，流体通道的宽度可以是至少50um、至少100um、至少200um、至少300um、至少400um、至少500um、至少750um、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm、至少20mm、至少50mm、至少100mm、或至少150mm。在又其他的实施例中，流体通道的宽度可以是至多150mm、至多100mm、至多50mm、至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750um、至多500um、至多400um、至多300um、至多200um、至多100um、或至多50um。在一个实施例中，流体通道的宽度是约2mm。这些流体通道的宽度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约250um至约3mm)。
在一些实施例中，流体通道的深度可以在50um和2mm之间。在其他实施例中，流体通道的深度可以是至少50um、至少100um、至少200um、至少300um、至少400um、至少500um、至少750um、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm、或至少2mm。在又其他的实施例中，流体通道的深度可以是至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750um、至多500um、至多400um、至多300um、至多200um、至多100um、或至多50um。在一个实施例中，流体通道的深度是约1mm。流体通道的深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约800um至约1mm)。
流动池可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术和材料制造而来。例如，流动池可以被制造为单独零件并且随后被机械地夹固或永久地结合到微孔阵列基底上。适合的制造技术的实例包括常规机器加工、CNC机器加工、注塑、3D打印、对齐并层压一层或多层激光切割或冲切聚合物薄膜或多种微制造技术中的任一种，如光刻法和湿化学蚀刻、干蚀刻、深反应离子蚀刻或激光微机械加工。一旦流动池零件已经被制造出，则它可以机械地附接至微孔阵列基底，例如通过将它抵着微孔阵列基底夹紧(使用或未使用垫圈)，或者可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术中的任一种(取决于使用的材料的选择)使它直接结合到微孔阵列基底上，例如通过使用阳极键合、热键合、或多种粘合剂或粘附膜中的任一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
流动池可以使用本领域的普通技术人员已知的多种材料制造而来。通常，所使用的材料的选择将取决于所使用的制造技术的选择，反之亦然。适合的材料的实例包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、各种聚合物中的任何一种(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)、非粘性材料(如特氟龙(PTFE))或这些材料的组合。
柱体
在系统的一些实施例中，微孔阵列(具有或不具有附接流动池)可以被包装在消耗性柱体内，所述柱体与仪器系统界面结合。柱体的设计特征可以包括(i)一个或多个入口，用于与仪器形成流体连接或将细胞样品、珠悬浮液或其他测定试剂手动引入柱体中；(ii)一个或多个旁路通道，即用于自计量细胞样品和珠悬浮液，以避免满溢或回流；(iii)一个或多个整合的微孔阵列/流动池组件、或一个或多个室，其内定位有一个或多个微阵列基底；(iv)整合的微型泵或其他流体致动机构，用于控制流体流经装置；(v)整合的微型阀(或其他牵制机构)，用于将预加载试剂(例如，珠悬浮液、组合条形码试剂、随机条形码)区室化或控制流体流动通过装置；(vi)用于为俘获空气提供逃逸路径的一个或多个通气孔；(vii)一个或多个样品和试剂废物储器；(viii)一个或多个出口，用于与仪器形成流体连接或提供经处理的样品收集点；(ix)机械接口特征，用于相对于仪器系统重复性定位可移除的消耗性柱体，并且用于提供进入，这样使得外磁体可以与微孔阵列非常接近；(x)整合的温度控制部件或热接口，用于提供与仪器系统的良好热接触；以及(xi)光学接口特征，例如透明窗，用于对微孔阵列进行光学询问。
所述柱体可以被设计成平行地处理不止一个样品。柱体可以进一步包括适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合的一个或多个可移除样品收集室。该柱体自身可以适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合。如在本披露中使用的术语“柱体”可以意在包括在进行测定期间含有样品和珠的零件的任何组件。
柱体可以进一步包括部件，所述部件被设计成产生防止大分子扩散(或增加其路径长度和扩散时间)的物理或化学屏障，以便最小化微孔之间的交叉污染。此类屏障的实例可以包括但不限于用于将细胞和固体支持物(例如，珠)递送到微孔阵列的一套蛇形通道，在裂解或孵育步骤过程中经过按压与微孔阵列基底表面接触的可伸缩压板或可变形膜，使用较大的珠(例如如上所述的交联葡萄糖珠)来堵塞微孔的开口，或在裂解或孵育步骤过程中使不互混的疏水流体从柱体内的储器中释放出来以有效地分离并隔区化阵列中的每个微孔。
可以优化流体通道和一个或多个阵列室在柱体设计中的尺寸，以便(i)提供细胞和珠到微孔阵列的均匀递送，和(ii)最小化样品和试剂消耗。流体通道的宽度可以处于50微米和20mm之间。在其他实施例中，流体通道的宽度可以是至少50微米、至少100微米、至少200微米、至少300微米、至少400微米、至少500微米、至少750微米、至少1mm、至少2.5mm、至少5mm、至少10mm、或至少20mm。在又其他的实施例中，流体通道的宽度可以是至多20mm、至多10mm、至多5mm、至多2.5mm、至多1mm、至多750微米、至多500微米、至多400微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米、或至多50微米。流体通道的宽度可以是约2mm。这些流体通道的宽度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约250um至约3mm)。
在柱体中的这些流体通道可以具有深度。柱体设计中的流体通道的深度可以处于50微米和2mm之间。流体通道的深度可以是至少50微米、至少100微米、至少200微米、至少300微米、至少400微米、至少500微米、至少750微米、至少1mm、至少1.25mm、至少1.5mm、至少1.75mm、或至少2mm。流体通道的深度可以是至多2mm、至多1.75mm、至多1.5mm、至多1.25mm、至多1mm、至多750微米、至多500微米、至多400微米、至多300微米、至多200微米、至多100微米、或至多50微米。这些流体通道的深度可以是约1mm。这些流体通道的深度可以落入由任何这些值所限制的任何范围内(例如，从约800微米至约1mm)。
柱体可以使用本领域的普通技术人员已知的多种技术和材料制造而来。通常，使用多种机械组装或粘合技术中的任何一种将柱体制造为一系列单独的零部件并且随后组装。适合的制造技术的实例包括但不限于常规机器加工、CNC机器加工、注塑、热成形以及3D打印。一旦柱体部件已经被制造出，可以使用螺钉、夹子等将它们进行机械组装，或使用多种技术中的任合一种(取决于所使用的材料的选择)使它们永久结合，例如通过使用热粘合/焊接或多种粘合剂或粘附膜中的任何一种，包括基于环氧树脂的、基于丙烯酸的、基于硅酮的、可UV固化的、基于聚氨酯的或基于氰基丙烯酸酯的粘合剂。
柱体部件可以使用多种适合的材料中的任何一种来制造，包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、多种聚合物中的任何一种(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS；弹性体)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、非粘性材料(如特氟龙(PTFE))、金属(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)或其任何组合。
柱体的入口和出口特征可以被设计成提供与仪器的方便且防漏的流体连接，或可以用作开放储器，用于将样品和试剂手动地用移液管移取进出柱体。入口和出口连接器的方便机械设计的实例可以包括但不限于螺纹连接器、鲁尔锁紧连接器、鲁尔滑锁(Luerslip)或“滑动型(slip tip)”连接器、压入配合连接器以及类似物。柱体的入口和出口可以进一步包括帽、弹簧加载盖或塞、或聚合物膜，当柱体被定位在该仪器中时，其被打开或刺破，并且用于防止在储存过程中柱体内表面的污染或当柱体被从仪器上移除时防止流体溢出。柱体的一个或多个出口可以进一步包括可移除的样品收集室，其适于与独立式PCR热循环仪或测序仪界面结合。
柱体可以包括整合的微型泵或其他流体致动机构，用于控制流体流经装置。适合的微型泵或流体致动机构的实例可以包括但不限于机电或气动致动的微型注射器或柱塞机构、气动地或通过外部活塞致动的膜隔膜泵、气动致动的试剂小袋或气囊、或电渗泵。
柱体可以包括微型阀，用于将预加载试剂隔区化或控制流体流经装置。适合的微型阀的实例可以包括但不限于使用可以被熔化或溶解的蜡或聚合物塞或可以被刺破的聚合物膜制造的一次性“阀”；使用可变形膜构造的夹管阀和使用可变形膜片构造的气动、磁、电磁或机电(螺线管)致动的止回阀以及微型门阀。
柱体可以包括通气孔，以便提供滞留空气的逃逸路径。可以根据多种技术构造通气孔，例如使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他疏水材料的多孔塞，所述材料允许毛细管芯吸空气但阻止被水渗透。
柱体的机械接口特征可以提供了柱体相对于仪器系统的易于移除但高度精确且可重复的定位。适合的机械接口特征可以包括但不限于定位销、定位导件、机械止动件等。机械设计特征可以包括凸凹特征，用于使外部设备(例如，磁体或光学部件)与微孔阵列室非常接近。
柱体还可以包括温度控制部件或热接口特征，用于与外部温度控制模块配合。适合的温度控制元件的实例可以包括但不限于电阻加热元件、微型红外发射光源、珀耳帖(Peltier)加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等。热接口特征可以由作为良好热导体的材料(例如，铜、金、银等)制成并且可以包括一个或多个能够与外部加热块或冷却块产生良好热接触的平表面。
柱体可以包括光学接口特征，用于对微孔阵列进行光学成像或光谱学询问。柱体可以包括光学透明窗，例如，微孔基底本身或与微孔阵列相对的流动池的或微阵列室的侧面，所述透明窗由满足用于探测微孔阵列的成像或光谱技术的频谱要求的材料制成。适合的光学窗材料的实例可以包括但不限于玻璃、熔融二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC)。
在至少一些先前描述的实施例中，在一个实施例中使用的一种或多种元件可以可互换地用于另一个实施例中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行多种其他省略、添加和修改。所有这些修改和改变都旨在落在由所附权利要求限定的主题的范围内。
对于本文中使用的基本上任何复数和/或单数术语，当适用于上下文和/或应用时，本领域技术人员可以将其从复数转换为单数形式和/或从单数转换为复数形式。为了清楚起见，在此可以明确地列出各种单数/复数变换。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、以及“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指示。除非另外说明，在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求(例如，所附权利要求书的主体)中的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域的普通技术人员将进一步理解的是，如果意指特定数目的所引入的权利要求陈述，那么将在该权利要求中明确陈述这种意图，并且在缺乏这类陈述的情况下，不呈现这种意图。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求书可以包含引导性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，用来引入权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应被解释为意味着不定冠词“一个/一种(“a”或“an”)”引入的权利要求叙述将包含这样引入的权利要求的任何特定权利要求限定于仅包含一个这样的叙述的实施例中，即使当相同的权力要求包括引导性短语“一个或多个”或“至少一个”，不定冠词如“一个/一种(“a”或“an”)”同样适用(例如，“一个/一种(“a”或“an”)”应解释为表示“至少一个“或”一个或多个“)；对于使用用于引入权利要求叙述的定冠词也是如此。另外，即使明确地叙述了引入的权利要求叙述的具体数目，本领域技术人员将认识到，这种叙述应被解释为表示至少所述的数字(例如，没有其他修饰的“两种叙述”的基本叙述表示至少两种叙述，或两种或更多种叙述)。此外，在那些使用类似于“A、B、和C等中的至少一个”的惯例的例子中，通常这种构造意图在本领域技术人员将理解的意义上的惯例(例如，“具有A、B、和C中至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在那些使用类似于“A、B、或C等中的至少一个”的惯例的例子中，通常这种构造意图在本领域技术人员将理解的意义上的惯例(例如，“具有A、B、或C中至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域的普通技术人员将进一步理解地是无论是在描述、权利要求书还是图示中，呈现两个或更多个选择性术语的机会任何分离性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包含这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，术语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本披露的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员应意识到本披露还由此描述了马库什组的任何单独的成员或成员亚组。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，例如就提供书面描述的方面而言，本文披露的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及子范围的组合。任何列举的范围可容易地理解为充分描述，并使相同的范围能够分解成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制实例，此处讨论的各范围都能够容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将认识到的那样，所有例如“不超过”、“至少”、“大于”、“小于”等的语言都包括所列数值且表示能够随后如上所述分解成子范围的范围。最后，本领域技术人员会理解到，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2、或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4、或5个物品的组，等等。
虽然本文已经披露了各个方面和实施例，但是其他方面和实施例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文披露的各个方面和实施例是出于说明性目的而呈现的，而不旨在是限制性的，其真实范围和精神由以下权利要求书指出。
序列表
<110> 赛卢拉研究公司（Cellular Research, Inc.）
格伦·弗（Fu, Glenn）
斯蒂芬·P·A·福多尔（Fodor, Stephen P.A.）
<120> 用于组合条形编码的方法和组合物
<130> BDCRI.013WO
<150> 62/152,644
<151> 2015-04-24
<150> 62/140,360
<151> 2015-03-30
<160> 2
<170> 用于 Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚A
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚dT
<400> 2
tttttttttt ttttttttt 19

Claims (113)

1.一种组合物，该组合物含有用于产生一组组合条形码的一组分量条形码，该组分量条形码包括：
n x m个单一分量条形码，其中n和m是正整数，每个分量条形码包括：
n个单一条形码亚单位序列中的一者；和
一种或两种接头序列或其互补序列，
其中将这些分量条形码配置为通过该一种或两种接头序列或其互补序列彼此连接，从而产生一组组合条形码。
2.如权利要求1所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列组中的每一个单一条形码亚单位序列包括分子标记、细胞标记、维度标记、通用标记、或其任何组合。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中不同接头序列的总数是m-1或m-2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中每个分量条形码包括：
a)条形码亚单位序列-接头；
b)接头-条形码亚单位序列-接头的互补序列；或
c)接头-条形码亚单位序列的互补序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码中的每一个包括寡核苷酸，该寡核苷酸包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…条形码亚单位序列c-接头m-1-条形码亚单位序列d。
6.如权利要求5所述的组合物，其中该寡核苷酸包括靶特异性区。
7.如权利要求6所述的组合物，其中该靶特异性区是寡聚dT。
8.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码中的每一个包括：
第一寡核苷酸，其包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…-条形码亚单位序列c；和
第二寡核苷酸，其包含条形码亚单位序列d-…-接头3-条形码亚单位序列e-接头m-2-条形码亚单位序列f。
9.如权利要求8所述的组合物，其中该第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的每一个包括靶特异性区。
10.如权利要求9所述的组合物，其中这些靶特异性区中的一者是寡聚dT。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中该一种或两种接头序列中的每一个是不同的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中m是从2至10的整数。
13.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中m是从2至4的整数。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中n是从4至100的整数。
15.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中n＝24。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列具有相同的长度。
17.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列中至少两个具有不同的长度。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中这些接头序列具有相同的长度。
19.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中这些接头序列具有不同的长度。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有等于或小于nm个的单一组合条形码。
21.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少100,000个单一组合条形码。
22.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少200,000个单一组合条形码。
23.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少300,000个单一组合条形码。
24.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少400,000个单一组合条形码。
25.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少1,000,000个单一组合条形码。
26.一种对多个分区进行条形编码的方法，该方法包括：
将m个分量条形码引入该多个分区中的每一个中，其中该m个分量条形码选自n x m个不同分量条形码的组，其中n和m是正整数，每个分量条形码包括：
n个单一条形码亚单位序列中的一者；和
一种或两种接头序列或其互补序列；并且
连接该m个分量条形码，以产生组合条形码，
据此该多个分区中的每个与包含该m个分量条形码的单一组合条形码相关联。
27.如权利要求26所述的方法，其中该多个分区中的每一个包括样品。
28.如权利要求27所述的方法，其中该样品是DNA样品。
29.如权利要求27所述的方法，其中该样品是RNA样品。
30.如权利要求27所述的方法，其中该样品是单细胞。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中不同接头序列的总数是m-1或m-2。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，该方法包括将该m个分量条形码中的一个或两个与该样品的靶标进行杂交。
33.如权利要求32所述的方法，该方法包括将杂交到该靶标上的该m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，据此用组合条形码对该靶标进行标记。
34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中使用喷码机将分量条形码引入该多个分区中的每一个中。
35.一种对多个分区中的多个DNA靶标进行条形编码的方法，该方法包括：
将m个分量条形码置于含有DNA靶标的该多个分区的每一个中，其中所述m个分量条形码选自n x m个不同分量条形码的组，其中n和m是正整数，每个分量条形码包括：
n个单一条形码亚单位序列中的一者；和
一种或两种接头序列或其互补序列；并且
连接该m个分量条形码，以产生组合条形码，
据此在该多个分区的每一个中的DNA靶标与含有该m个分量条形码的单一组合条形码是相关联的。
36.如权利要求35所述的方法，其中不同接头序列的总数是m-1或m-2。
37.如权利要求35或36所述的方法，该方法包括将该m个分量条形码中的一个或两个与该DNA靶标进行杂交。
38.如权利要求37所述的方法，该方法包括使与DNA靶标杂交的该m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，从而产生含有组合条形码的延伸产物。
39.如权利要求38所述的方法，该方法包括将该延伸产物进行扩增。
40.如权利要求39所述的方法，其中对该延伸产物的扩增包括等温的多链置换扩增。
41.如权利要求39或40所述的方法，该方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。
42.如权利要求41所述的方法，该方法包括对经合并的扩增产物进行测序。
43.如权利要求42所述的方法，该方法包括使用这些组合条形码将这些序列进行组装。
44.如权利要求43所述的方法，该方法包括使用这些经组装的序列产生单倍型。
45.如权利要求44所述的方法，其中使用涵盖至少100kb的重叠测序读数来产生单倍型。
46.一种对单细胞进行测序的方法，包括：
将m个分量条形码置于含有单细胞的多个分区中的每个中，其中所述m个分量条形码选自n x m个不同分量条形码的组，其中n和m是正整数，每个分量条形码包括：
n个单一条形码亚单位序列中的一者；和
一种或两种接头序列或其互补序列；并且
连接该m个分量条形码，以产生组合条形码，
据此在该多个分区的每一个中的单细胞的靶标与该含有m个分量条形码的单一组合条形码是相关联的。
47.如权利要求46所述的方法，其中不同接头序列的总数是m-1或m-2。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中该靶标是DNA。
49.如权利要求46或47所述的方法，其中该靶标是RNA。
50.如权利要求46-49中任一项所述的方法，该方法包括将该m个分量条形码中的一个或两个与该靶标进行杂交。
51.如权利要求50所述的方法，该方法包括将杂交到该靶标上的m个分量条形码中的一个或两个进行延伸，从而产生含有该组合条形码的延伸产物。
52.如权利要求51所述的方法，该方法包括将该延伸产物进行扩增。
53.如权利要求52所述的方法，该方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。
54.如权利要求53所述的方法，该方法包括对经合并的扩增产物进行测序。
55.如权利要求54所述的方法，该方法包括使用这些组合条形码对来自单细胞的序列进行组装。
56.如权利要求55所述的方法，该方法包括单细胞的大规模平行表征。
57.一种对样品中的靶标进行空间条形编码的方法，该方法包括
提供固定在基底上的多个寡核苷酸；
使样品与固定在基底上的该多个寡核苷酸接触；
将该靶标用特异性结合该靶标的探针进行杂交；
捕获显示该靶标位置的图像；
捕获该样品的图像；并
将示出靶标位置的图像和样品的图像相关联从而对样品中的靶标进行空间条形编码。
58.如权利要求57所述的方法，其中固定在该基底上的这些寡核苷酸是寡聚dT引物。
59.如权利要求57所述的方法，其中固定在该基底上的这些寡核苷酸是随机引物。
60.如权利要求57所述的方法，其中固定在该基底上的这些寡核苷酸是靶特异性引物。
61.如权利要求57-60中任一项所述的方法，该方法包括逆转录该靶标，从而产生cDNA。
62.如权利要求61所述的方法，该方法包括将dATP同聚物添加至cDNA。
63.如权利要求62所述的方法，该方法包括使用桥接扩增对该cDNA进行扩增。
64.如权利要求57-63中任一项所述的方法，其中每种基底是流动池的一部分。
65.如权利要求57-64中任一项所述的方法，该方法包括在使样品与固定在该基底上的多个寡核苷酸接触之前或之后将该样品裂解。
66.如权利要求65所述的方法，其中对该样品进行裂解包括对该样品进行加热、使该样品与洗涤剂接触、改变该样品的pH、或其任何组合。
67.如权利要求57-66中任一项所述的方法，其中该样品包括组织切片、单层细胞、固定的细胞、组织切片部分、或其任何组合。
68.如权利要求57-66中任一项所述的方法，其中该样品包括多个细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中该多个细胞包括一种或多种细胞类型。
70.如权利要求69所述的方法，其中该一种或多种细胞类型中的至少一种是脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞、循环细胞或其任何组合。
71.如权利要求57-70中任一项所述的方法，该方法包括将该靶标进行扩增，以产生固定在该基底上的多个扩增子。
72.如权利要求57-70中任一项所述的方法，其中该靶标包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有聚(A)尾的RNA、或其任何组合。
73.如权利要求57-72中任一项所述的方法，该方法包括对多个靶标进行空间条形编码。
74.如权利要求57-73中任一项所述的方法，其中该探针的长度是18-100nt。
75.如权利要求57-74中任一项所述的方法，其中该探针包括荧光标记。
76.如权利要求75所述的方法，其中显示该靶标位置的图像是荧光图像。
77.如权利要求57-76中任一项所述的方法，其中该样品包括免疫组织化学染色、进行性染色、苏木精-伊红染色，或其组合。
78.如权利要求57-77中任一项所述的方法，其中该固体支持物包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体、或其任何组合。
79.一种对单细胞进行测序的方法，该方法包括：
将含有选自第一组的40个单一条形码的第一条形码和第一引物的第一寡核苷酸置于含有单细胞的多个分区中；
将含有选自第二组的40个单一条形码的第二条形码和第二引物的第二寡核苷酸置于含有单细胞的多个分区中；
使该第一寡核苷酸与来自该单细胞的靶标接触；
将该第一寡核苷酸进行延伸从而产生含有该第一条形码的第一链；
使该第二寡核苷酸与该第一链接触；并且
将该第二寡核苷酸进行延伸从而产生含有该第一条形码和该第二条形码的第二链，
据此将来自该单细胞的靶标用该第一条形码和该第二条形码进行标记。
80.如权利要求79所述的方法，该方法包括将该第二链进行扩增从而产生扩增产物。
81.如权利要求80所述的方法，该方法包括将来自该多个分区的扩增产物进行合并。
82.如权利要求80或81所述的方法，该方法包括对经合并的扩增产物进行测序。
83.如权利要求82所述的方法，该方法包括使用该第一条形码和该第二条形码对来自单细胞的这些序列进行组装。
84.如权利要求83所述的方法，该方法包括单细胞的大规模平行表征。
85.如权利要求79-84中任一项所述的方法，其中该多个分区是由1536个微孔板组成。
86.如权利要求79-85中任一项所述的方法，其中该靶标是mRNA。
87.如权利要求86所述的方法，其中该第一引物是寡聚dT引物。
88.如权利要求79-85中任一项所述的方法，其中该靶标是DNA。
89.一种含有一组组合条形码的组合物，其中该组组合条形码中的每种组合条形码包括：
m个条形码亚单位序列，各自选自n个单一条形码亚单位序列的组，其中n和m是正整数；以及
m-1或m-2个接头序列，
其中该m个条形码亚单位序列通过m-1或m-2个接头序列彼此连接，并且在该组组合条形码中单一组合条形码的总数超过384。
90.如权利要求89所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列组中的每一个单一条形码亚单位序列包括分子标记、细胞标记、维度标记、通用标记、或其任何组合。
91.如权利要求89或90所述的组合物，其中在该组组合条形码中的单一组合条形码的总数等于或小于nm。
92.如权利要求89-91中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码中的每一个包括寡核苷酸，该寡核苷酸包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…条形码亚单位序列c-接头m-1-条形码亚单位序列d。
93.如权利要求89-91中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码中的每一个包括：
第一寡核苷酸，其包含构造式：条形码亚单位序列a-接头1-条形码亚单位序列b-接头2-…-条形码亚单位序列c；和
第二寡核苷酸，其包含条形码亚单位序列d-…-接头3-条形码亚单位序列e-接头m-2-条形码亚单位序列f。
94.如权利要求89-93中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码中的每一个包括一个或两个靶特异性区。
95.如权利要求94所述的组合物，其中该一个或两个靶特异性区中的一个是寡聚dT。
96.如权利要求89-95中任一项所述的组合物，其中m-1或m-2个接头序列中的每一个是不同的。
97.如权利要求89-96中任一项所述的组合物，其中m是从2至10的整数。
98.如权利要求89-96中任一项所述的组合物，其中m是从2至4的整数。
99.如权利要求89-98中任一项所述的组合物，其中n是从4至100的整数。
100.如权利要求89-98中任一项所述的组合物，其中n＝24。
101.如权利要求89-100中任一项所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列具有相同的长度。
102.如权利要求89-100中任一项所述的组合物，其中该n个单一条形码亚单位序列具有不同的长度。
103.如权利要求89-102中任一项所述的组合物，其中该m-1或m-2个接头序列具有相同的长度。
104.如权利要求89-102中任一项所述的组合物，其中该m-1或m-2个接头序列具有不同的长度。
105.如权利要求89-104中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少100,000个单一组合条形码。
106.如权利要求89-104中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少200,000个单一组合条形码。
107.如权利要求89-104中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少300,000个单一组合条形码。
108.如权利要求89-104中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少400,000个单一组合条形码。
109.如权利要求89-104中任一项所述的组合物，其中该组组合条形码具有至少1,000,000个单一组合条形码。
110.如权利要求89-109中任一项所述的组合物，其中将该组组合条形码中的每一个附接至固体支持物。
111.如权利要求89-110中任一项所述的组合物，其中将该组组合条形码中的每一个用于标记分区。
112.如权利要求111所述的组合物，其中该分区是具有多于10,000个微孔的微孔阵列的一部分。
113.如权利要求112所述的组合物，其中该微孔阵列的每个微孔包括来自该组组合条形码的不同组合条形码。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165610A (zh) * 2017-12-22 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种单细胞全基因组扩增试剂盒
CN109658981A (zh) * 2018-12-10 2019-04-19 海南大学 一种单细胞测序的数据分类方法
CN111492068A (zh) * 2017-12-19 2020-08-04 贝克顿迪金森公司 与寡核苷酸相关联的颗粒
CN111712579A (zh) * 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
CN112382340A (zh) * 2020-11-25 2021-02-19 中国科学院深圳先进技术研究院 用于dna数据存储的二进制信息到碱基序列的编解码方法和编解码装置
CN112530522A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 中国科学院深圳先进技术研究院 序列纠错方法、装置、设备和存储介质
CN112961902A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
CN116451780A (zh) * 2022-01-05 2023-07-18 密码子（杭州）科技有限公司 用于在分子中存储信息的方法和设备

Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
WO2011041485A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Gene Security Network, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
EP2854058A3 (en) 2010-05-18 2015-10-28 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
JP6328934B2 (ja) 2010-12-22 2018-05-23 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲性出生前親子鑑定法
JP6153874B2 (ja) 2011-02-09 2017-06-28 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
EP4108782B1 (en) 2011-12-22 2023-06-07 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB2513024B (en) 2012-02-27 2016-08-31 Cellular Res Inc A clonal amplification method
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
KR102512979B1 (ko) 2013-06-04 2023-03-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
EP4234716A3 (en) 2013-06-25 2023-12-06 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample
GB2525104B (en) 2013-08-28 2016-09-28 Cellular Res Inc Massively Parallel Single Cell Nucleic Acid Analysis
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
JP2017504307A (ja) 2013-10-07 2017-02-09 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム
EP3561075A1 (en) 2014-04-21 2019-10-30 Natera, Inc. Detecting mutations in tumour biopsies and cell-free samples
EP3259371B1 (en) 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
CA2982146A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
EP3294906B1 (en) 2015-05-11 2024-07-10 Natera, Inc. Methods for determining ploidy
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
MX2018005611A (es) 2015-11-03 2018-11-09 Harvard College Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico.
CA3004310A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
US20190040461A1 (en) * 2015-11-04 2019-02-07 Celemics, Inc. Method for extracting and characterizing molecular clones
US10633648B2 (en) 2016-02-12 2020-04-28 University Of Washington Combinatorial photo-controlled spatial sequencing and labeling
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
EP3452614B1 (en) 2016-05-02 2023-06-28 Becton, Dickinson and Company Accurate molecular barcoding
US10354747B1 (en) * 2016-05-06 2019-07-16 Verily Life Sciences Llc Deep learning analysis pipeline for next generation sequencing
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
WO2017205691A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Cellular Research, Inc. Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
WO2017222453A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Hauling Thomas Nucleic acid sequencing
CN109923216B (zh) 2016-08-31 2024-08-02 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
CN109983125B (zh) 2016-08-31 2024-06-04 哈佛学院董事及会员团体 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
CN109952612B (zh) 2016-11-08 2023-12-01 贝克顿迪金森公司 用于表达谱分类的方法
KR20190077061A (ko) 2016-11-08 2019-07-02 셀룰러 리서치, 인크. 세포 표지 분류 방법
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10324041B2 (en) * 2016-12-21 2019-06-18 Abbott Japan Co., Ltd. Optical imaging system using lateral illumination for digital assays
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
WO2018132610A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
CN110291207A (zh) * 2017-01-27 2019-09-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于长程测序的条形码化dna
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
EP3585889A1 (en) 2017-02-21 2020-01-01 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
WO2018156935A1 (en) * 2017-02-24 2018-08-30 The Regents Of The University Of California Particle-drop structures and methods for making and using the same
WO2018217625A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Molecular barcoding
WO2018222941A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Counsyl, Inc. Preparation of concatenated polynucleotides
AU2018281745B2 (en) 2017-06-05 2022-05-19 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
CN107354209B (zh) * 2017-07-14 2021-01-08 广州精科医学检验所有限公司 组合标签、接头及确定含有低频突变核酸序列的方法
CN107604046B (zh) * 2017-11-03 2021-08-24 上海交通大学 用于微量dna超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法
JP2021506342A (ja) 2017-12-14 2021-02-22 ティーエーアイ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドＴａｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 移植のための移植片適合性の評価
CA3090426A1 (en) 2018-04-14 2019-10-17 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna
WO2019204702A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Error-correcting dna barcodes
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019213237A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
SG11202101934SA (en) 2018-07-30 2021-03-30 Readcoor Llc Methods and systems for sample processing or analysis
EP3844299A1 (en) * 2018-08-28 2021-07-07 Becton Dickinson and Company Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
CN113767175A (zh) * 2018-08-28 2021-12-07 10X基因组学股份有限公司 增加空间阵列分辨率
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN113490677A (zh) * 2018-11-14 2021-10-08 佛西吉诺米克公司 用于测序的多聚体和用于制备并且分析所述多聚体的方法
US11421273B2 (en) 2018-12-03 2022-08-23 California Institute Of Technology In situ readout of DNA barcodes
JP7332694B2 (ja) * 2018-12-04 2023-08-23 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 細胞標的の空間指向性量子バーコード化
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
ES2945227T3 (es) 2019-01-23 2023-06-29 Becton Dickinson Co Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
US12071617B2 (en) 2019-02-14 2024-08-27 Becton, Dickinson And Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
WO2020180659A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 1Cellbio Inc. Nucleic acid labeling methods and composition
WO2020180670A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for separating decoded arrays
WO2020190871A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Spatially mapped rna sequencing from single cells
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN110172504A (zh) * 2019-04-19 2019-08-27 武汉明了生物科技有限公司 一种外源基因的检测方法与试剂盒
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN114051534A (zh) 2019-07-22 2022-02-15 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
JP7522189B2 (ja) 2019-11-08 2024-07-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
ES2946357T3 (es) 2019-12-23 2023-07-17 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) * 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
US20230151441A1 (en) * 2020-04-02 2023-05-18 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based population scale screening
CN115916999A (zh) 2020-04-22 2023-04-04 10X基因组学有限公司 用于使用靶向rna耗竭进行空间分析的方法
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021233996A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Alacris Theranostics Gmbh Method and system for fighting pandemic
EP4414459A3 (en) 2020-05-22 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
AU2021283184A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207B1 (en) 2020-06-10 2024-09-25 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
EP4172362B1 (en) 2020-06-25 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
EP4182328A4 (en) 2020-07-17 2024-05-29 13.8, Inc. METHODS, COMPOSITIONS AND SYSTEMS FOR IMAGING POSITIONS OF SINGLE MOLECULES IN MULTI-DIMENSIONAL SPACE
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20230357834A1 (en) * 2020-09-26 2023-11-09 The Regents Of The University Of California Hybrid protocols and barcoding schemes for multiple sequencing technologies
JP2023548653A (ja) * 2020-10-06 2023-11-20 ニュークレオトレース・ピーティワイ・リミテッド デジタルデータを表すオリゴヌクレオチド
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CA3177753A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-23 Quantum-Si Incorporated Molecular barcode analysis by single-molecule kinetics
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
CN115011679B (zh) * 2021-05-12 2023-04-11 浙江大学 一种超高通量单细胞测序方法
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023019024A2 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University A method for single-cell dna sequencing via in situ genomic amplification and combinatorial barcoding
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023064904A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method for profiling of cells from groups of cells

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
CN102227440A (zh) * 2008-09-30 2011-10-26 雅培制药有限公司 改良的抗体文库
WO2012162267A2 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
WO2013022961A9 (en) * 2011-08-08 2013-04-25 The Broad Institute Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
US20140303005A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
CA2917782A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Sequence capture method using specialized capture probes (heatseq)
CN104404160A (zh) * 2014-12-09 2015-03-11 南京大学 一种mit引物设计方法和利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法

Family Cites Families (513)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510244A (en) 1980-04-17 1985-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cell labeling with antigen-coupled microspheres
US4725536A (en) 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
IE72468B1 (en) 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
EP0426756A4 (en) 1988-07-26 1991-11-21 Genelabs Incorporated Rna and dna amplification techniques
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
JP3164814B2 (ja) 1990-08-27 2001-05-14 科学技術振興事業団 均一化ｃＤＮＡライブラリーの作製法
DE69132843T2 (de) 1990-12-06 2002-09-12 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben
JPH04337446A (ja) 1991-05-15 1992-11-25 Hitachi Ltd 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
JP3954092B2 (ja) 1993-06-25 2007-08-08 アフィメトリックス インコーポレイテッド 核酸配列のハイブリダイゼーションと配列決定
US6087186A (en) 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
US5500356A (en) 1993-08-10 1996-03-19 Life Technologies, Inc. Method of nucleic acid sequence selection
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5714330A (en) 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US6495518B1 (en) 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
GB2293238A (en) 1994-09-13 1996-03-20 Inceltec Ltd Primers for replication and/or amplification reactions
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6600996B2 (en) 1994-10-21 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Computer-aided techniques for analyzing biological sequences
EP0709466B1 (en) 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences
KR19990008052A (ko) 1995-04-25 1999-01-25 마이클 피 노바 기억 장치를 갖는 원격적으로 프로그램 가능한 매트릭스 및 이의 용도
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US5763175A (en) 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5830712A (en) 1996-02-06 1998-11-03 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Selective template deletion method
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
EP1736554B1 (en) 1996-05-29 2013-10-09 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
JPH1021373A (ja) 1996-07-05 1998-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 画像解析装置
US7169556B2 (en) 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020172953A1 (en) 1996-07-29 2002-11-21 Mirkin Chad A. Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6100029A (en) 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US5935793A (en) 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
CA2291180A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
WO1999028505A1 (en) 1997-12-03 1999-06-10 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
WO2000014282A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6197554B1 (en) 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
US20020019005A1 (en) 1999-02-18 2002-02-14 Arcaris, Inc. Process for identification of genes encoding proteins having cell proliferation-promoting activity
US6629040B1 (en) 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
JP2002539849A (ja) 1999-03-26 2002-11-26 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ ユニバーサルアレイ
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
EP1046717B1 (en) 1999-04-20 2010-10-06 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Method and probes for determining a concentration of target nucleic acid molecules and method for analyzing data obtained by the method
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6326148B1 (en) 1999-07-12 2001-12-04 The Regents Of The University Of California Detection of copy number changes in colon cancer
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
JP2001078768A (ja) 1999-09-16 2001-03-27 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現の測定法
SE9903988D0 (sv) 1999-11-03 1999-11-03 Amersham Pharm Biotech Ab Method of analysis
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
CN1500150A (zh) 1999-12-29 2004-05-26 ��Ĭ���� 在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
CA2396810A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Phylos, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US20050214825A1 (en) 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
DK1259643T3 (da) 2000-02-07 2009-02-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming
GB2364054B (en) 2000-03-24 2002-05-29 Smithkline Beecham Corp Method of amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof
DK1715063T3 (da) 2000-03-29 2011-05-16 Lgc Ltd Hydridiseringsbeacon og fremgangsmåde til hurtig sekvensdetektion og distinktion
DK2278029T3 (en) 2000-04-10 2016-10-03 Taxon Biosciences Inc Methods of study and genetic analysis of populations
US20030207300A1 (en) 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7630063B2 (en) 2000-08-02 2009-12-08 Honeywell International Inc. Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
AU2001282881B2 (en) 2000-07-07 2007-06-14 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
CA2418502A1 (en) 2000-08-11 2002-03-07 Nanosphere Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CA2356123A1 (en) 2000-08-25 2002-02-25 Riken Method of preparing normalized and/or subtracted cdna
JP4915492B2 (ja) 2000-08-25 2012-04-11 独立行政法人理化学研究所 ノーマライズ／サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの作成方法
US6934408B2 (en) 2000-08-25 2005-08-23 Amnis Corporation Method and apparatus for reading reporter labeled beads
ATE380883T1 (de) 2000-10-24 2007-12-15 Univ Leland Stanford Junior Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
WO2002046472A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20020142345A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Nelsen Anita J. Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays
US20030049616A1 (en) 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
WO2002070684A2 (en) 2001-01-11 2002-09-12 Lion Bioscience Ag Gene library for screening methods
CA2435612C (en) 2001-01-25 2014-12-23 Tm Bioscience Corporation Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
KR20030082535A (ko) 2001-03-09 2003-10-22 뉴젠 테크놀로지스 인코포레이티드 Ｒｎａ 서열의 증폭을 위한 방법 및 조성물
JP2005233974A (ja) 2001-03-21 2005-09-02 Olympus Corp 生化学的検査方法
US7027932B2 (en) 2001-03-21 2006-04-11 Olympus Optical Co., Ltd. Biochemical examination method
WO2002079490A2 (en) 2001-03-28 2002-10-10 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles
US20030170675A1 (en) 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
WO2002083922A2 (en) 2001-04-11 2002-10-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Modified random primers for probe labeling
AUPR480901A0 (en) 2001-05-04 2001-05-31 Genomics Research Partners Pty Ltd Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal
CA2344599C (en) 2001-05-07 2011-07-12 Bioneer Corporation Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
WO2002101358A2 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Illumina, Inc. Multiplexed detection methods
JP4244534B2 (ja) 2001-06-12 2009-03-25 横河電機株式会社 バイオチップ
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US6830931B2 (en) 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
EP1478774A4 (en) 2001-10-09 2006-11-29 Nanosphere Inc ELECTRONIC DETECTION OF DNA BASED ON AN ASSEMBLY AND IMPLEMENTING NANOPARTICLE-LIKE PROBES
US20030077611A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Sention Methods and systems for dynamic gene expression profiling
EP2196544A1 (en) 2001-11-21 2010-06-16 Applied Biosystems, LLC Kit for ligation detection assays using codeable labels
US20030175749A1 (en) 2001-12-08 2003-09-18 Jong-Yoon Chun Annealing control primer and its uses
US8110351B2 (en) 2002-01-16 2012-02-07 Invitrogen Dynal As Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
JP2005515792A (ja) 2002-01-29 2005-06-02 グローバル ジェノミクス アクティエボラーグ 核酸を操作するための方法および手段
CA2474509C (en) 2002-02-14 2012-01-31 Immunivest Corporation Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer
US20030186251A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Brookhaven Science Associates, Llc Genome sequence tags
US20050175993A1 (en) 2002-04-12 2005-08-11 Chia-Lin Wei Method for making full-length coding sequence cDNA libraries
US20070178478A1 (en) 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
GB0212391D0 (en) 2002-05-29 2002-07-10 Axis Shield Asa Assay
US20040096368A1 (en) 2002-06-28 2004-05-20 Igen International, Inc. Assay systems and components
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
US7192700B2 (en) 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
WO2004018623A2 (en) 2002-08-16 2004-03-04 Clinical Microarrays, Inc. Substrates for isolating, reacting and microscopically analyzing materials
CA2497420C (en) 2002-09-03 2016-04-19 Quanta Biosciences, Inc. Improved compositions and methods for cdna synthesis
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
EP1546376B9 (en) 2002-09-30 2009-08-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
WO2004040001A2 (en) 2002-10-02 2004-05-13 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
CA2505472A1 (en) 2002-11-11 2004-05-27 Affymetrix, Inc. Methods for identifying dna copy number changes
US7822555B2 (en) 2002-11-11 2010-10-26 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
US20040224325A1 (en) 2002-12-20 2004-11-11 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of DNA
JP2006520463A (ja) 2003-01-23 2006-09-07 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド ポリマー集団を解析するための方法
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8206913B1 (en) 2003-03-07 2012-06-26 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process
DE602004029560D1 (de) 2003-03-07 2010-11-25 Rubicon Genomics Inc Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
EP1641809B2 (en) 2003-07-05 2018-10-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
EP1651776A2 (de) 2003-07-24 2006-05-03 Qiagen GmbH Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren
JP2007502116A (ja) 2003-08-13 2007-02-08 アフィメトリックス インコーポレイテッド 核酸サンプルを調製するための方法およびキット
GB0319332D0 (en) 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
US20050048498A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
US7341837B2 (en) 2003-09-02 2008-03-11 Lawton Robert L Soluble analyte detection and amplification
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
CA2536565A1 (en) 2003-09-10 2005-05-12 Althea Technologies, Inc. Expression profiling using microarrays
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
EP1709203A2 (en) 2004-01-23 2006-10-11 Lingvitae AS Improving polynucleotide ligation reactions
ATE451478T1 (de) 2004-02-12 2009-12-15 Population Genetics Technologi Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7432055B2 (en) 2004-03-05 2008-10-07 Uchicago Argonne Llc Dual phase multiplex polymerase chain reaction
US7294466B2 (en) 2004-05-07 2007-11-13 Cepheid Multiplexed detection of biological agents
US20050250147A1 (en) 2004-05-10 2005-11-10 Macevicz Stephen C Digital profiling of polynucleotide populations
JP2008505345A (ja) 2004-06-07 2008-02-21 アイアールエム エルエルシー 分注システム、ソフトウェア、および関連する方法
US20060035258A1 (en) 2004-08-06 2006-02-16 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US20060041385A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Bauer Kenneth D Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
CN101056883B (zh) 2004-09-10 2012-10-10 人类遗传标记控股有限公司 包括含有嵌入性假核苷酸(ipn)的嵌入性核酸(ina)的扩增阻断剂
EP1647600A3 (en) 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
US7435084B2 (en) 2004-12-14 2008-10-14 Align Technology, Inc. System and methods for casting physical tooth model
KR20070105967A (ko) 2004-11-03 2007-10-31 아이리스 몰레큘라 다이아그노스틱스, 인코오포레이티드 균질 분석물 탐지
EP2418018B1 (en) 2004-12-23 2013-05-22 Abbott Point of Care Inc. Methods for the separation nucleic acids
EP1836302B1 (en) 2004-12-23 2010-04-14 Amersham Biosciences Corp. Ligation-based rna amplification
US9222129B2 (en) 2005-02-10 2015-12-29 Riken Method for amplification of nucleotide sequence
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
EP1856293A2 (en) 2005-03-16 2007-11-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
EP2518161A1 (en) 2005-03-18 2012-10-31 Fluidigm Corporation Method for detection of mutant alleles
US20090264635A1 (en) 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US7695886B2 (en) 2005-05-19 2010-04-13 Fuji Xerox Co., Ltd. Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US20070065844A1 (en) 2005-06-08 2007-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Solution-based methods for RNA expression profiling
US7796815B2 (en) 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
US20070117121A1 (en) 2005-09-16 2007-05-24 Hutchison Stephen K cDNA library preparation
US8831887B2 (en) 2005-10-12 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Absolute PCR quantification
US8313711B2 (en) 2005-11-01 2012-11-20 Freeslate, Inc. Liquid dispensing for high-throughput experimentation
US7375211B2 (en) 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US7636465B2 (en) 2005-12-09 2009-12-22 Cytyc Corporation Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
US7544473B2 (en) 2006-01-23 2009-06-09 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US8492098B2 (en) 2006-02-21 2013-07-23 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
US7880142B2 (en) 2006-04-04 2011-02-01 Sidec Technologies Ab Extended electron tomography
US20080194414A1 (en) 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
US9074242B2 (en) 2010-02-12 2015-07-07 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2007136874A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 President And Fellows Of Harvard College Genomic library construction
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
WO2007147079A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Living Microsystems, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
EP2069472A4 (en) 2006-10-05 2012-06-20 Nanopoint Inc SYSTEMS AND METHODS FOR ACTIVE MICROFLUIDIC CELL MANIPULATION
WO2008057163A2 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Carnegie Mellon University Preparation of functional gel particles with a dual crosslink network
WO2008047428A1 (fr) 2006-10-18 2008-04-24 Osaki Electric Co., Ltd. COMPTEUR ÉLECTRONIQUE DE kWh
WO2008051928A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 The Salk Institute For Biological Studies Target-oriented whole genome amplification of nucliec acids
US8603749B2 (en) 2006-11-15 2013-12-10 Biospherex, LLC Multitag sequencing ecogenomics analysis-US
US8050476B2 (en) 2006-11-22 2011-11-01 General Electric Company Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification
EP2677308B1 (en) 2006-12-14 2017-04-26 Life Technologies Corporation Method for fabricating large scale FET arrays
JP5489469B2 (ja) 2007-01-16 2014-05-14 オリンパス株式会社 蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法
US9063133B2 (en) 2007-01-30 2015-06-23 The Regents Of The University Of California Methods and devices for biomolecular arrays
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
WO2008096318A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Identification system
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
SI2472264T1 (sl) 2007-02-27 2016-06-30 SentoClone International AB Karolinska Institute Science Park Multipleksna detekcija tumorskih celic z uporabo plošč vezavnih sredstev na zunajcelične markerje
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2009-02-06 성균관대학교산학협력단 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
JP2008256428A (ja) 2007-04-03 2008-10-23 Intec Systems Institute Inc マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法
US20080268508A1 (en) 2007-04-30 2008-10-30 Sowlay Mohankumar R Methods and kits for negative selection of desired nucleic acid sequences
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090061513A1 (en) 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
US7635566B2 (en) 2007-06-29 2009-12-22 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
DK2036989T3 (da) 2007-09-12 2012-10-22 Pasteur Institut Polynukleotid, der er egnet til enkeltcellebaseret reporterassay tilovervågning af genekspressionsmønstre med høj spatiotemporalopløsning
EP2203749B1 (en) 2007-10-05 2012-08-29 Affymetrix, Inc. Highly multiplexed particle-based assays
US10300482B2 (en) 2010-12-09 2019-05-28 Akonni Biosystems, Inc. Sample analysis system
US20090253586A1 (en) 2008-02-21 2009-10-08 Gentel Biosciences, Inc. Substrates for multiplexed assays and uses thereof
US8687189B2 (en) 2008-03-03 2014-04-01 Ajjer, Llc Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy
US8206925B2 (en) 2008-04-14 2012-06-26 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases
US20090298709A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
US20100120097A1 (en) 2008-05-30 2010-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US20100069250A1 (en) 2008-08-16 2010-03-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
WO2010053980A2 (en) 2008-11-04 2010-05-14 The Johns Hopkins University Dna integrity assay (dia) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy
CA2744003C (en) 2008-11-21 2016-03-15 Mediomics Llc Biosensor for detecting multiple epitopes on a target
US20100159533A1 (en) 2008-11-24 2010-06-24 Helicos Biosciences Corporation Simplified sample preparation for rna analysis
US8492096B2 (en) 2008-12-24 2013-07-23 Boris Pasche TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer
AU2010206843B2 (en) 2009-01-20 2015-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
CA2754446A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Pyridine derivative
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
WO2010117620A2 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
AU2010232439C1 (en) 2009-04-02 2017-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
WO2010127186A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
US20120058520A1 (en) 2009-05-14 2012-03-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for synthesis of double-stranded dna corresponding to rna, and method for amplification of the dna
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
GB0909923D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Oxford Gene Tech Ip Ltd Picowell capture devices for analysing single cells or other particles
US20120058902A1 (en) 2009-06-25 2012-03-08 Livingston Robert J Method of measuring adaptive immunity
US8330957B2 (en) 2009-06-29 2012-12-11 Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing
CN102686728B (zh) 2009-06-29 2018-09-18 卢米耐克斯公司 具有发夹构象的嵌合引物及其使用方法
CN102482668A (zh) 2009-08-20 2012-05-30 群体遗传学科技有限公司 分子内核酸重排的组合物和方法
WO2011028818A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
EP2473625B1 (en) 2009-09-01 2018-03-07 Koninklijke Philips N.V. Devices and methods for microarray selection
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
WO2011041308A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quest Diagnostics Investments Incorporated Bcr-abl truncation mutations
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
AU2011207544A1 (en) 2010-01-19 2012-09-06 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing
EP2848704B1 (en) 2010-01-19 2018-08-29 Verinata Health, Inc Sequencing methods for prenatal diagnoses
EP2529026B1 (en) 2010-01-25 2013-11-13 Rd Biosciences Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
WO2011106738A2 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Use of tcr clonotypes as biomarkers for disease
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
AU2011237729B2 (en) 2010-04-05 2014-04-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
SG185544A1 (en) 2010-05-14 2012-12-28 Fluidigm Corp Nucleic acid isolation methods
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
EP2580351B1 (en) 2010-06-09 2018-08-29 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
US20120004132A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Affymetrix, Inc. Detection of Nucleic Acids and Proteins
WO2012004834A1 (ja) 2010-07-07 2012-01-12 株式会社アドバンテスト 試験装置および試験方法
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
US20120040843A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Dublin City University Centrifugal capture system
EP2623613B8 (en) 2010-09-21 2016-09-07 Population Genetics Technologies Ltd. Increasing confidence of allele calls with molecular counting
EP2436766A1 (en) 2010-09-29 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for improved protein interaction screening
WO2012042374A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
US20120088691A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gao Chen Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads
WO2012048341A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
AU2011336707A1 (en) 2010-11-29 2013-07-04 Dako Denmark A/S Methods and systems for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay
US9394511B2 (en) 2010-12-05 2016-07-19 Wenbin Jiang Rapid single cell based parallel biological cell sorter
ES2615733T3 (es) 2010-12-16 2017-06-08 Gigagen, Inc. Métodos para el análisis masivo paralelo de ácidos nucleicos en células individuales
JP6328934B2 (ja) 2010-12-22 2018-05-23 ナテラ， インコーポレイテッド 非侵襲性出生前親子鑑定法
WO2012092515A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
EP3567121B1 (en) 2011-01-17 2023-08-30 Life Technologies Corporation Workflow for detection of ligands using nucleic acids
WO2012103154A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
US20120190021A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
WO2012108864A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
SG192870A1 (en) 2011-02-23 2013-09-30 Regents Board Of Use of template switching for dna synthesis
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
KR20120110431A (ko) 2011-03-29 2012-10-10 에스케이하이닉스 주식회사 반도체 메모리 장치
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
DK3246416T3 (da) 2011-04-15 2024-09-02 Univ Johns Hopkins Sikkert sekventeringssystem
WO2012149042A2 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
DK3415619T3 (da) 2011-04-28 2021-03-08 Univ Leland Stanford Junior Identifikation af polynukleotider forbundet med en prøve
GB201108259D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
HUE062102T2 (hu) 2011-05-24 2023-09-28 BioNTech SE Individualizált vakcinák a rák ellen
WO2012162621A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Brandeis University Methods for suppression pcr
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines
WO2013003498A2 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Life Technologies Corporation Acoustic cytometry methods and protocols
WO2013019075A2 (ko) 2011-08-01 2013-02-07 연세대학교산학협력단 핵산분자의 제조방법
JP5816486B2 (ja) 2011-08-18 2015-11-18 オリンパス株式会社 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法
EP3263718A1 (en) 2011-09-16 2018-01-03 Lexogen GmbH Nucleic acid transcription method
WO2013062931A2 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Furchak Jennifer A molecular beacon based assay for the detection of biomarkers of breast cancer metastasis
US9777338B2 (en) 2011-11-11 2017-10-03 Meso Scale Technologies, Llc. Co-binder assisted assay methods
KR101337094B1 (ko) 2011-11-30 2013-12-05 삼성에스디에스 주식회사 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법
WO2013096802A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
EP2823303A4 (en) 2012-02-10 2015-09-30 Raindance Technologies Inc MOLECULAR DIAGNOSTIC SCREEN TYPE ASSAY
WO2013123125A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
EP3309262B1 (en) * 2012-02-24 2019-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
GB2513024B (en) 2012-02-27 2016-08-31 Cellular Res Inc A clonal amplification method
WO2013137737A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Flexgen B.V. Methods of creating and screening of dna encoded combinatorial libraries of chemical antibodies
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
HUE029357T2 (en) 2012-05-08 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions
US20150132754A1 (en) 2012-05-14 2015-05-14 Cb Biotechnologies, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
SG11201407901PA (en) 2012-05-21 2015-01-29 Fluidigm Corp Single-particle analysis of particle populations
CN104508492B (zh) 2012-05-25 2018-07-27 北卡罗来纳-查佩尔山大学 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法
EP2861761A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
AU2013273953B2 (en) 2012-06-15 2018-12-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High throughput sequencing of multiple transcripts of a single cell
EP2861787B1 (en) 2012-06-18 2017-09-20 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
JP6285929B2 (ja) 2012-07-17 2018-02-28 カウンシル，インコーポレーテッド 遺伝的変異を検出するためのシステムおよび方法
WO2014015098A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. A method of normalizing biological samples
SG11201500313YA (en) 2012-07-24 2015-02-27 Sequenta Inc Single cell analysis using sequence tags
US10870099B2 (en) 2012-07-26 2020-12-22 Illumina, Inc. Compositions and methods for the amplification of nucleic acids
EP3578669B1 (en) 2012-08-08 2024-07-10 F. Hoffmann-La Roche AG Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN113528634A (zh) 2012-08-14 2021-10-22 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150005199A1 (en) * 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN104884605B (zh) 2012-08-24 2018-05-18 耶鲁大学 用于高通量多重检测的系统、装置和方法
EP3901280A1 (en) 2012-10-17 2021-10-27 Spatial Transcriptomics AB Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
GB201218909D0 (en) 2012-10-22 2012-12-05 Univ Singapore Assay for the parallel detection of biological material based on PCR
CN107090491A (zh) 2012-11-05 2017-08-25 鲁比康基因组学公司 条形编码核酸
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
WO2014116729A2 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing
EP2948252A1 (en) 2013-01-24 2015-12-02 SABIC Global Technologies B.V. Microwell plate made from a polyester-polycarbonate
US10017761B2 (en) 2013-01-28 2018-07-10 Yale University Methods for preparing cDNA from low quantities of cells
EP2951557B1 (en) 2013-02-01 2022-10-05 Becton Dickinson and Company Methods and systems for assessing sample behavior in a flow cytometer
WO2014124046A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
KR102190198B1 (ko) 2013-02-08 2020-12-14 10엑스 제노믹스, 인크. 폴리뉴클레오티드 바코드 생성
WO2014126937A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Suspension arrays and multiplexed assays based thereon
US9621600B2 (en) 2013-02-26 2017-04-11 PortAura Group Method and system for providing recommendations using location information
US20140274811A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
EP3611262B1 (en) 2013-03-15 2020-11-11 Lineage Biosciences, Inc. Methods of sequencing the immune repertoire
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
WO2014145458A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
CA2909861C (en) 2013-04-25 2022-12-06 Firefly Bioworks, Inc. Multiplexed analysis of target nucleic acids
US10822605B2 (en) 2013-05-03 2020-11-03 Gensinta, Inc. Method and apparatus for producing sequence verified DNA
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
WO2014201273A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput rna-seq
EP3008201B1 (en) 2013-06-12 2019-08-07 The General Hospital Corporation Methods for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
WO2014204939A2 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Kim Lewis Methods for quantitative determination of protein-nucleic acid interactions in complex mixtures
EP4234716A3 (en) 2013-06-25 2023-12-06 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample
CA2915499A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US20160153973A1 (en) 2013-07-09 2016-06-02 Lucas David Smith Device and method of rapid linker mediated label-based immunoassays
GB2525104B (en) 2013-08-28 2016-09-28 Cellular Res Inc Massively Parallel Single Cell Nucleic Acid Analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
EP3041957A4 (en) 2013-09-04 2017-03-29 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
ES2875998T3 (es) 2013-09-30 2021-11-11 Vesicode Ab Procedimientos de perfilado de complejos moleculares mediante el uso de códigos de barras dependientes de la proximidad
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
JP2017504307A (ja) 2013-10-07 2017-02-09 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム
EP3058092B1 (en) 2013-10-17 2019-05-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
US9709479B2 (en) 2013-10-25 2017-07-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for tracking cell identity
WO2015061844A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 The University Of Sydney Assay to stratify cancer patients
WO2015070037A2 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
SG10201807112XA (en) 2013-12-30 2018-09-27 Atreca Inc Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes
EP3099820A4 (en) 2014-01-27 2018-01-03 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
US20150218620A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods to capture and/or remove highly abundant rnas from a heterogenous rna sample
ES2741740T3 (es) 2014-03-05 2020-02-12 Adaptive Biotechnologies Corp Métodos que usan moléculas sintéticas que contienen segmentos de nucleótidos aleatorios
EP3132059B1 (en) 2014-04-17 2020-01-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
CA2947426C (en) 2014-04-29 2020-01-07 Illumina, Inc. Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
EP3901278A1 (en) 2014-05-19 2021-10-27 William Marsh Rice University Allele-specific amplification using a composition of overlapping non-allele-specific primer and allele-specific blocker oligonucleotides
EP3161157B1 (en) 2014-06-24 2024-03-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital pcr barcoding
WO2015200869A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
EP3161160B1 (en) 2014-06-26 2021-10-13 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
EP3626834B1 (en) 2014-07-15 2022-09-21 Qiagen Sciences, LLC Semi-random barcodes for nucleic acid analysis
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
SG11201702060VA (en) 2014-09-15 2017-04-27 Abvitro Inc High-throughput nucleotide library sequencing
US9529672B2 (en) 2014-09-25 2016-12-27 Everspin Technologies Inc. ECC word configuration for system-level ECC compatibility
IL299976B1 (en) 2014-10-17 2024-07-01 Illumina Cambridge Ltd Continuity-preserving transposition
US20180320241A1 (en) 2014-12-19 2018-11-08 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
EP3248018B1 (en) 2015-01-22 2020-01-08 Becton, Dickinson and Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
US10760120B2 (en) 2015-01-23 2020-09-01 Qiagen Sciences, Llc High multiplex PCR with molecular barcoding
WO2016130578A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
EP3259371B1 (en) 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
ES2906221T3 (es) 2015-02-27 2022-04-13 Becton Dickinson Co Métodos para el marcado con códigos de barras de ácidos nucleicos para secuenciación
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107614700A (zh) 2015-03-11 2018-01-19 布罗德研究所有限公司 基因型和表型偶联
US20160266094A1 (en) 2015-03-13 2016-09-15 University Of Iowa Research Foundation Cellular barcode
WO2016149418A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing
WO2016160965A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Rubicon Genomics, Inc. Methods and compositions for repair of dna ends by multiple enzymatic activities
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
WO2016168825A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods for performing spatial profiling of biological molecules
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US9618871B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Kyocera Document Solutions Inc. Image forming apparatus
JP2018516569A (ja) 2015-05-22 2018-06-28 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ 次世代ゲノムウォーキングのための方法ならびに関連する組成物およびキット
EP3303587A4 (en) 2015-05-28 2018-11-21 Kaarel Krjutskov Blocking oligonucleotides
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US11248262B2 (en) 2015-08-24 2022-02-15 Qiagen Gmbh Method for generating a RNA-sequencing library
CN115928221A (zh) 2015-08-28 2023-04-07 Illumina公司 单细胞核酸序列分析
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US11156611B2 (en) 2015-09-24 2021-10-26 Abvitro Llc Single cell characterization using affinity-oligonucleotide conjugates and vessel barcoded polynucleotides
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
CA3004310A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Atreca, Inc. Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells
US20170136458A1 (en) 2015-11-18 2017-05-18 Wafergen, Inc. Systems and methods for pooling samples from multi-well devices
US20190040381A1 (en) 2015-12-04 2019-02-07 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Cloning and expression system for t-cell receptors
EP3397764A4 (en) 2015-12-30 2019-05-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. DIGITAL QUANTIFICATION OF PROTEINS
US20170205404A1 (en) 2016-01-19 2017-07-20 General Electric Company Multifunctional beads and methods of use for capturing rare cells
WO2017139690A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
WO2017164936A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 The Broad Institute, Inc. Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics in single cells
CN109312331B (zh) 2016-04-01 2022-08-02 贝勒医学院 全转录组扩增的方法
EP3452614B1 (en) 2016-05-02 2023-06-28 Becton, Dickinson and Company Accurate molecular barcoding
US20190161743A1 (en) 2016-05-09 2019-05-30 President And Fellows Of Harvard College Self-Targeting Guide RNAs in CRISPR System
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
WO2017205691A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Cellular Research, Inc. Molecular label counting adjustment methods
TWI600309B (zh) 2016-05-28 2017-09-21 Hon Hai Prec Ind Co Ltd 角度調整機構
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
LT3263715T (lt) 2016-06-28 2020-06-25 Hifibio Pavienių ląstelių transkriptomo analizės būdas
WO2018017949A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Verily Life Sciences Llc Quantitative massively parallel proteomics
WO2018020489A1 (en) 2016-07-24 2018-02-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and kits for analyzing dna binding moieties attached to dna
US20180037942A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Cellular Research, Inc. Enzyme-independent molecular indexing
CA3033506A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
JPWO2018061699A1 (ja) 2016-09-29 2019-06-24 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
WO2018061695A1 (ja) 2016-09-29 2018-04-05 富士フイルム株式会社 マルチプレックスｐｃｒに供するプライマーの設計方法
KR102650753B1 (ko) 2016-10-01 2024-03-26 버클리 라잇츠, 인크. 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법
WO2018075693A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
CN108473975A (zh) 2016-11-17 2018-08-31 领星生物科技（上海）有限公司 检测肿瘤发展的系统和方法
EP3551768B1 (en) 2016-12-12 2024-03-06 Grail, LLC Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
MX2019007444A (es) 2016-12-22 2019-08-16 Guardant Health Inc Metodos y sistemas para analisis de moleculas de acido nucleico.
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
WO2018132635A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
US20180208975A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Assay for simultaneous genomic and proteomic analysis
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
FI3583214T3 (fi) 2017-02-02 2023-12-19 New York Genome Center Inc Menetelmiä ja koostumuksia biologisen näytteen sisältämien kohteiden tunnistamiseksi tai kvantifioimiseksi
JP7169290B2 (ja) 2017-03-24 2022-11-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー マルチプレットを決定するための合成マルチプレット
JP2020513826A (ja) 2017-03-24 2020-05-21 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール 分子の多重検出方法
CN111051526A (zh) 2017-05-23 2020-04-21 生捷科技控股公司 用于实施生物分子空间分布分析的方法
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
KR102550778B1 (ko) 2017-05-26 2023-07-03 에이비비트로 엘엘씨 고-처리량 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 시퀀싱 및 전사체 분석
AU2018277019A1 (en) 2017-05-29 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College A method of amplifying single cell transcriptome
AU2018281745B2 (en) 2017-06-05 2022-05-19 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
WO2019055852A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Apton Biosystems, Inc. PROFILING OF HETEROGENEOUS UNICELLULAR ORGANISMS USING MOLECULAR BARCODE CODING
ES2969957T3 (es) 2017-09-25 2024-05-23 Becton Dickinson Co Corrección de errores del código de barras del receptor inmunitario
WO2019076768A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As METHOD AND KIT FOR PREPARING DNA BANK
WO2019084046A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 The Broad Institute, Inc. ENRICHING SINGLE CELL CELLULAR CONSTITUENT OF BARCODE SEQUENCING LIBRARY
WO2019099906A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods to measure functional heterogeneity among single cells
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
EP3720605A1 (en) 2017-12-07 2020-10-14 Massachusetts Institute Of Technology Single cell analyses
WO2019113499A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput methods for identifying gene interactions and networks
CN110462060B (zh) 2017-12-08 2022-05-03 10X基因组学有限公司 用于标记细胞的方法和组合物
WO2019118355A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
CN118547046A (zh) 2017-12-22 2024-08-27 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
PT3735470T (pt) 2018-01-05 2024-01-31 Billiontoone Inc Modelos de controlo de qualidade para garantir a validade dos ensaios baseados em sequenciamento
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
US20210046482A1 (en) 2018-03-12 2021-02-18 Silicon Valley Scientific, Inc. Method and apparatus for processing tissue and other samples encoding cellular spatial position information
CN113383083A (zh) 2018-04-27 2021-09-10 埃克斯基因美国公司 用于制备多核苷酸的方法和组合物
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019213237A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN110499251A (zh) 2018-05-17 2019-11-26 中国科学院大连化学物理研究所 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
US20200040379A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Cellular Research, Inc. Nuclei barcoding and capture in single cells
WO2020033164A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Vanderbilt University Systems and methods for simultaneous detection of antigens and antigen specific antibodies
EP3837378B1 (en) 2018-08-17 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Aptamer barcoding
EP3844299A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 Becton Dickinson and Company Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
EP3899030A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Natera, Inc. Methods for analysis of circulating cells
ES2945227T3 (es) 2019-01-23 2023-06-29 Becton Dickinson Co Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
US12071617B2 (en) 2019-02-14 2024-08-27 Becton, Dickinson And Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
EP4090764A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
EP4090762A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for single cell secretomics
US20210230583A1 (en) 2020-01-29 2021-07-29 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
WO2021155284A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Becton Dickinson And Company Mesophilic dna polymerase extension blockers
CN115087746A (zh) 2020-02-12 2022-09-20 贝克顿迪金森公司 细胞内AbSeq
WO2021173719A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Becton, Dickinson And Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021247593A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
EP4179110A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Becton, Dickinson and Company Cdna spike-in control for single cell analysis
WO2022026909A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
WO2022108946A1 (en) 2020-11-17 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics
WO2022109339A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Use of dextramer in single cell analysis
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050064435A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
CN102227440A (zh) * 2008-09-30 2011-10-26 雅培制药有限公司 改良的抗体文库
WO2012162267A2 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
WO2013022961A9 (en) * 2011-08-08 2013-04-25 The Broad Institute Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
US20140303005A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
CA2917782A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Sequence capture method using specialized capture probes (heatseq)
CN104404160A (zh) * 2014-12-09 2015-03-11 南京大学 一种mit引物设计方法和利用高通量测序构建浮游动物条形码数据库的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEONID V. BYSTRYKH 等: ""Generalized DNA Barcode Design Based on Hamming Codes"", 《PLOS ONE》 *
邹艳辉 等: ""生物条形码检测技术的最新研究进展"", 《生物新药杂志》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111492068A (zh) * 2017-12-19 2020-08-04 贝克顿迪金森公司 与寡核苷酸相关联的颗粒
CN111712579A (zh) * 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
CN108165610A (zh) * 2017-12-22 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种单细胞全基因组扩增试剂盒
CN109658981B (zh) * 2018-12-10 2022-10-04 海南大学 一种单细胞测序的数据分类方法
CN109658981A (zh) * 2018-12-10 2019-04-19 海南大学 一种单细胞测序的数据分类方法
CN112382340B (zh) * 2020-11-25 2022-11-15 中国科学院深圳先进技术研究院 用于dna数据存储的编解码方法和编解码装置
CN112382340A (zh) * 2020-11-25 2021-02-19 中国科学院深圳先进技术研究院 用于dna数据存储的二进制信息到碱基序列的编解码方法和编解码装置
CN112530522A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 中国科学院深圳先进技术研究院 序列纠错方法、装置、设备和存储介质
CN112530522B (zh) * 2020-12-15 2022-10-28 中国科学院深圳先进技术研究院 序列纠错方法、装置、设备和存储介质
CN112961902A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
CN112961902B (zh) * 2021-02-26 2023-02-24 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
CN116451780A (zh) * 2022-01-05 2023-07-18 密码子（杭州）科技有限公司 用于在分子中存储信息的方法和设备
CN116451780B (zh) * 2022-01-05 2024-07-05 密码子（杭州）科技有限公司 用于在分子中存储信息的方法和设备

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