JP2021506342A - 移植のための移植片適合性の評価 - Google Patents
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Abstract
この発明は、全および/または特異的セルフリー核酸(cf−DNAなど)および/または細胞溶解を測定することによる、移植または埋め込みのための移植片の適合性を評価するための方法および組成物に関する。
Description
関連出願
この出願は、2017年12月14日に出願された米国仮出願番号62/599,011の35 U.S.C.§119下の利益を主張し、その内容は全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
この出願は、2017年12月14日に出願された米国仮出願番号62/599,011の35 U.S.C.§119下の利益を主張し、その内容は全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
この発明は、全および/または移植片特異的セルフリー(cell-free)DNAなどのセルフリー(cell-free)核酸を測定することによる、移植または埋め込みのための移植片の適合性を評価するための方法および関連する組成物に関する。
この発明は、全および/または移植片特異的セルフリー(cell-free)DNAなどのセルフリー(cell-free)核酸を測定することによる、移植または埋め込みのための移植片の適合性を評価するための方法および関連する組成物に関する。
発明の概要
一側面において、移植片の適合性を評価する方法が提供される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料を取得することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値が、レポート中で提供される。一側面において、本明細書中で提供される方法のいずれか1つによって取得した値の1つ以上を伴うレポートが提供される。
一側面において、移植片の適合性を評価する方法が提供される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料を取得することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値が、レポート中で提供される。一側面において、本明細書中で提供される方法のいずれか1つによって取得した値の1つ以上を伴うレポートが提供される。
一態様において、提供される方法のいずれか1つは、1以上の他の試料中の全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を取得すること、および/または1以上の他の試料中の特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を取得すること、をさらに含むことができ、ここで、1以上の他の試料は、1または複数の後続する時点からのものである。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の試料および/または1以上の他の試料は、移植片の取得(例として、移植片を保管すること、移植片を灌流すること、等々)の15、20、25、30、35、40、45、50、または55分以下など、数分以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の試料および/または1以上の他の試料は、移植片の取得(例として、移植片を保管すること、移植片を灌流すること、等々)の15、20、25、30、35、40、45、50、または55分以下など、数分以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の試料および/または1以上の他の試料は、移植片の取得(例として、移植片を保管すること、移植片を灌流すること、等々)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18時間以下またはそれより長い時間以下など、数時間以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、最初の試料は、移植片の取得の1時間以内に取得され、および、1以上の他の試料は、閾値またはベースラインが到達される迄などの、15、20、25、30、35、40、45、50、または55分の間隔以内、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18時間またはそれより長い時間毎の間隔以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、最初の試料は、移植片の取得の1時間以内に取得され、および、1以上の他の試料は、閾値またはベースラインが到達される迄などの、15、20、25、30、35、40、45、50、または55分の間隔以内、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18時間またはそれより長い時間毎の間隔以内に取得される。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の他の後続する時点は、1時間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の他の後続する時点は、1日毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の他の後続する時点は、1週間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の他の後続する時点は、2週間毎の間隔でのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の他の後続する時点は、1か月毎の間隔でのものである。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)は、移植片特異的セルフリー核酸(DNAなど)である。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料および/または1以上の他の試料を取得することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料を提供することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料および/または1以上の他の試料を取得することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の試料を提供することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、移植片のモニタリングは、本明細書中で提供される方法のいずれか1つを含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、試料は、媒体、血液、血漿または血清を含む。
一側面において、本明細書中で提供される値のいずれか1つ以上を含むレポートが提供される。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、レポートは、1以上の試料中の全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または1以上の試料中の全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、試料は、媒体、血液、血漿または血清を含む。
一側面において、本明細書中で提供される値のいずれか1つ以上を含むレポートが提供される。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、レポートは、1以上の試料中の全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または1以上の試料中の全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を含む。
提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、レポートは、1以上の他の試料からの全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または1以上の他の試料からの特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値をさらに含み、ここで、1以上の他の試料は、1または複数の後続する時点からのものである。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも1日後である。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも1週間後である。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも2週間後である。提供されるレポートのいずれか1つの、一態様において、後続する時点は、少なくとも1か月後である。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、全セルフリー核酸(DNAなど)の量を取得するための方法は、リアルタイムPCRまたはデジタルPCRなどでの増幅を含む。リアルタイムPCRまたはデジタルPCRなどでの増幅を含むかかる方法のいずれか1つの、一態様において、1以上の標的が増幅させられる。これらの方法のいずれか1つの、一態様において、RNasePが、増幅の標的であるかまたは標的の1つである。数々のリファレンス遺伝子のいずれかを、分析のために増幅させることができる。増幅の標的としての役割を担うことができる他のリファレンス遺伝子は、当業者に知られるものとなる。
本明細書中で提供されるかかる方法のいずれか1つの、一態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量を取得するための方法は(例えば、移植片が異種移植片であるとき)、リアルタイムPCRでなどの増幅を含む。かかる方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、移植片に特異的な1以上の標的およびレシピエントまたは潜在的なレシピエントに特異的な1以上の標的の定量化を取得すること、を含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、1以上の移植片特異的標的および/または1以上のレシピエントまたは潜在的なレシピエント標的を取得することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、定量化は、試料(単数または複数)中へとスパイクされ得る内部標準などの標準に対して相対的に、各標的について得られる。
本明細書中で提供されるかかる方法のいずれか1つの、一態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量を取得するための方法は、ミスマッチPCR増幅法を含むことができる。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数の一塩基バリアント(SNV)標的の各々について、試料またはその一部分に対する少なくとも1つのプライマー対でのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイからの結果を取得することを含み、ここで、少なくとも1つのプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも1つのプライマー対は、SNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目のミスマッチ)であるがSNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを伴うプライマーを含み、およびSNV標的の1つの配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、各SNV標的について、少なくとも1つの別のプライマー対での定量化アッセイからの結果を取得することをさらに含み、ここで、少なくとも1つの別のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも1つの別のプライマー対は、SNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数の一塩基バリアント(SNV)標的の各々について、試料またはその一部分に対する少なくとも2つのプライマー対でのPCR定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイを行うことを含み、ここで、各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも2つのプライマー対の1つは、SNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目の)であるがSNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを含み、およびSNV標的の1つの配列(例として、アレル)を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも2つのプライマー対の別のものは、SNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、試料またはその一部分に対して行われた、少なくとも2つのプライマー対での、複数の一塩基バリアント(SNV)標的の各々についての、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)定量化アッセイなどの、増幅に基づいた増幅アッセイからの結果を取得することを含み、ここで、各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも2つのプライマー対の1つは、SNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目の)であるがSNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを含み、およびSNV標的の1つの配列(例として、アレル)を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも2つのプライマー対の別のものは、SNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、試料に対する、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対などの本明細書中で提供されるとおりの少なくとも1つのプライマー対での、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイからの結果を取得すること、特異的な核酸および/または非特異的な核酸の遺伝子型に基づいて有用な結果を選択すること、および、有用な結果に基づいて試料中の非特異的な核酸の量を決定することを含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、複数のSNV標的を同定することをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、非特異的な核酸の遺伝子型を推測することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、1)試料またはその一部分に対して行われた、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対などの、少なくとも1つのプライマー対(ここで、少なくとも2つなどの少なくとも1つのプライマー対の1つは、SNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目の)であるがSNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを含み、およびSNV標的の1つの配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる)での、複数のSNV標的の各々についての、PCR定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイ、および、2)特異的な遺伝子型に基づく有用な結果の決定および/または非特異的であると思われる遺伝子型の予測、からの結果を取得することを含む。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、少なくとも2つのプライマー対があるとき、別のプライマー対は、各SNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させ、およびSNV標的の各々についての別のプライマー対での定量化結果が得られる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、1)試料またはその一部分に対して行われた、各プライマー対がフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対(ここで、少なくとも2つのプライマー対の1つは、SNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目の)であるがSNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを含み、およびSNV標的の1つの配列(例として、アレル)を特異的に増幅させ、ならびに少なくとも2つのプライマー対の別のものは、SNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる)での、複数のSNV標的の各々についての、PCR定量化アッセイなどの、増幅に基づいた定量化アッセイ、および、2)特異的な遺伝子型に基づく有用な結果の決定および/または非特異的であると思われる遺伝子型の予測、からの結果を取得することを含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、各SNV標的につき少なくとも1つの別のプライマー対、および/または、それでのPCR定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイで結果を取得すること、をさらに含む。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、少なくとも1つの別のプライマー対は、SNV標的の別の配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ミスマッチ(例として、最後から2番目の)であるがSNV標的の1つの配列(例として、アレル)に対する相対的な3’ダブルミスマッチであるものを含み、およびSNV標的の別の配列(例として、アレル)を特異的に増幅させる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、かかるミスマッチ法は、結果に基づいて特異的核酸の量を評価することをさらに含む。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、結果は、有用な結果である。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、結果は、有用な結果である。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、方法は、PCR定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイの有用な結果を選択することをさらに含む。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、選択された有用な結果は、中央値平均などに、平均される。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、結果は、ロバスト統計でさらに分析されることができる。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、結果は、ロバスト標準偏差などの標準偏差、および/またはロバスト変動係数などの変動係数、または%ロバスト変動係数などの%変動係数で、さらに分析されることができる。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、PCR定量化アッセイなどの増幅に基づいた定量化アッセイの有用な結果は、非特異的な核酸および/または特異的な核酸の遺伝子型に基づいて選択される。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、方法は、非特異的な核酸および/または特異的な核酸の遺伝子型を取得することをさらに含む。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、方法は、非特異的な核酸および/または特異的な核酸の遺伝子型を取得することをさらに含む。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、SNV標的につき少なくとも1つのプライマー対、少なくとも2つのプライマー対、少なくとも3つのプライマー対、少なくとも4つのプライマー対またはそれ以上がある。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、複数のSNV標的は、少なくとも45、48、50、55、60、65、70、75、80、85または90またはそれ以上である。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、複数のSNV標的は、少なくとも90、95またはそれ以上の標的である。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、複数のSNV標的は、90、95またはそれ以上の標的よりも少ない。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、複数のSNV標的は、105または100の標的よりも少ない。
かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、ミスマッチのプライマー(単数または複数)は、フォワードプライマー(単数または複数)である。かかるミスマッチ法のいずれか1つの、一態様において、各SNV標的についてのプライマー対についてのリバースプライマーは同じである。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量は、特異的な核酸の、全または非特異的な核酸に対する、比またはパーセンテージである。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、試料から核酸を抽出することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量は、特異的な核酸の、全または非特異的な核酸に対する、比またはパーセンテージである。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、試料から核酸を抽出することをさらに含む。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、前増幅(pre-amplification)ステップをさらに含む。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、前増幅ステップは、定量化アッセイ(単数または複数)の前に行われる。
一態様において、本明細書中で提供される方法についての態様のいずれか1つは、提供されるレポートのいずれか1つについての態様とすることができる。一態様において、本明細書中で提供されるレポートについての態様のいずれか1つは、本明細書中で提供される方法のいずれか1つについての態様とすることができる。
一態様において、本明細書中で提供される方法についての態様のいずれか1つは、提供されるレポートのいずれか1つについての態様とすることができる。一態様において、本明細書中で提供されるレポートについての態様のいずれか1つは、本明細書中で提供される方法のいずれか1つについての態様とすることができる。
図面の簡単な説明
添付の図面は、縮尺どおりに描かれていることを意図していない。図面は、例証的であるにすぎず、および、本開示の実施可能性には要求されない。
添付の図面は、縮尺どおりに描かれていることを意図していない。図面は、例証的であるにすぎず、および、本開示の実施可能性には要求されない。
発明の詳細な記載
灌流容器中のex vivoでの移植片の全セルフリーDNAは、一般的には、移植片からの細胞およびドナーからの血液からのあらゆる細胞の溶解および/またはアポトーシスを表すことになる。理論により拘束されるものではないが、移植片が劣化し始めると、細胞のアポトーシスが増加し、および全セルフリーDNAもまた増加すると考えられる。移植のための適切な移植片は、一般的に、低いかまたは定常状態レベルの全セルフリーDNAを有する。
灌流容器中のex vivoでの移植片の全セルフリーDNAは、一般的には、移植片からの細胞およびドナーからの血液からのあらゆる細胞の溶解および/またはアポトーシスを表すことになる。理論により拘束されるものではないが、移植片が劣化し始めると、細胞のアポトーシスが増加し、および全セルフリーDNAもまた増加すると考えられる。移植のための適切な移植片は、一般的に、低いかまたは定常状態レベルの全セルフリーDNAを有する。
本開示の側面は、移植片の適合性を評価するための方法に関する。全および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)値を経時的に取得するために、本明細書中で提供されるかまたは別様に当該技術分野において知られている方法を、複数回使用することができる。また包含されるのは、1以上のこれらの値を包含することができるレポートである。かかるレポートは、臨床医に価値のある情報を提供することができる。いくつかの態様において、臨床医は、次いで疾患状態(または移植片の適合性)を評価することおよび/またはそれに従って対象のための処置判断をすることができる。
本明細書中で使用される、「移植片」は、対象中にまたはその中へと移植されまたは埋め込まれ得る、臓器の少なくとも一部分などの、細胞または組織を含む生物材料を指す。いくつかの態様において、移植片は、移植片を保存または回復させるためなどで、体外(ex vivo)で維持された臓器の少なくとも一部分などの、細胞または組織を含む外植された材料である。本明細書中で提供される方法のいずれか1つを、将来的な生着のためのその適合性を評定するために使用することができる。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、材料は、対象からの除去の後および別の対象中への生着の前などの、EVLP肺である。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、移植片は、全臓器または1よりも多い臓器である。移植するかまたは埋め込むことができる臓器の例は、心臓、腎臓(単数または複数)、腎臓、肝臓、肺(単数または複数)、膵臓、腸、等々を包含するがこれに限定されない。1以上の臓器の例は、心臓と肺との組み合わせを包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、他の態様において、移植片は、全臓器よりも小さく、および最大でも、弁など、その一部分である。移植片は、同じ種のものであり得るか、または異なる種のものであり得る。
したがって、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、移植片は、レシピエントがヒトであるなど、ブタまたはウシでないときに、それぞれ、ブタまたはウシからのものであるなど、異なる種からのものである(または異種移植片である)。本明細書中で提供される移植片のタイプのいずれか1つは、異種移植片であり得る。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、移植片は、ブタまたはウシの弁である。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、他の態様において、移植片は、同じ種からのものである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、他の態様において、移植片は、脱細胞処理された異種移植片などの、脱細胞処理された移植片である。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、移植片は、自家移植片である。本明細書中で提供される方法または組成物のいずれか1つが、本明細書中に記載される移植片のいずれか1つを評価するために使用され得る。
本明細書中で使用される、試料は、生物学的試料とすることができる。かかる生物学的試料の例は、全血、血漿、血清、等々を包含する。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、試料は、移植片を中に入れられたかまたはこれと接触している媒体であり得るかまたはこれを含み得る。かかる試料のいずれか1つの、一態様において、媒体は、血液または血液代用品、保存溶液、またはあらゆる他の溶液であってin vitroの文脈などで移植片を中に入れられることができるかまたはこれと接触するもの、を含むことができる。かかる試料のいずれか1つの、一態様において、1または複数の臓器などの移植片は、灌流システム中に含有されることができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、試料は、移植片を中に入れられたかまたはこれと接触している媒体であり得るかまたはこれを含み得る。かかる試料のいずれか1つの、一態様において、媒体は、血液または血液代用品、保存溶液、またはあらゆる他の溶液であってin vitroの文脈などで移植片を中に入れられることができるかまたはこれと接触するもの、を含むことができる。かかる試料のいずれか1つの、一態様において、1または複数の臓器などの移植片は、灌流システム中に含有されることができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、移植片(例として、細胞、組織、臓器)は、移植片保管媒体中に維持される。臓器保存溶液などの移植片保管媒体は、当該技術分野においてよく知られている。移植片保管媒体は、細胞内(例として、灌流された)または細胞外とすることができ、および、保存される移植片に依存し得る。ほとんどの移植片を保存するためのアプローチは、単純な静的冷蔵貯蔵(SCS)および動的保存(dynamic preservation)を包含する。動的保存の例は、低温機械灌流(HMP)、常温機械灌流、および酸素吹込灌流(oxygen persufflation)を包含する。典型的には、低温との組み合わせで、移植片保管媒体は、血液が存在する摘出において凝固を防止し、ex vivoの取り扱いに関連するストレスおよび劣化を低減し、および微生物成長のリスクを減少させることができる。このため、いくつかの態様において、移植片保管媒体は、浸透圧活性剤、電解質、水素イオン緩衝剤、コロイド(単数または複数)、代謝阻害剤、代謝物、および抗酸化剤を含むことができる。細胞膨張を防止し得る、浸透圧活性剤の例は、ラクトビオン酸塩、ラフィノース、クエン酸塩、およびグルコン酸塩を包含する。浸透圧効果を発揮することができる、電解質は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムイオンを包含する。
水素イオン緩衝剤の例は、リン酸、ヒスチジン、およびN−(2−ヒドロキシエチル)−ピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)緩衝剤を包含する。最初の血管洗い流しおよび灌流の間使用され得る、コロイドの例は、アルブミンおよびHESを包含する。細胞構成要素の分解を抑制し得る、代謝阻害剤の例は、アロプリノール、抗プロテアーゼ、およびクロルプロマジンを包含する。再灌流相の間に代謝を復元することを助けることができる、代謝物の例は、アデノシン、グルタチオン、およびリン酸を包含する。酸素フリーラジカル損傷を阻害することができる、抗酸化剤の例は、ステロイド、ビタミンE、デフェロキサミン、およびトリプトファンを包含する。
移植片保管媒体は商業的に入手可能であり、および、例は、BELZER UW(登録商標)冷蔵保管溶液(VIASPAN(商標)またはUniversity of Wisconsin(UW)溶液)、CELSIOR(登録商標)、CUSTODIOL(登録商標)、およびIGL-1(登録商標)を包含する。
いくつかの側面において、方法は、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するためのステップを包含する。
本明細書中で使用される、「値」は、「量」に関しての情報を持つあらゆる指標である。指標は、量についての絶対値または相対値とすることができる。本明細書中で使用される、「量」は、核酸(DNAなど)の量(quantity)を指す。さらに、値は、量、頻度、比、パーセンテージ等々とすることができる。
いくつかの側面において、方法は、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するためのステップを包含する。
本明細書中で使用される、「値」は、「量」に関しての情報を持つあらゆる指標である。指標は、量についての絶対値または相対値とすることができる。本明細書中で使用される、「量」は、核酸(DNAなど)の量(quantity)を指す。さらに、値は、量、頻度、比、パーセンテージ等々とすることができる。
いくつかの事例において、値は、「閾値」と比較することができる。本明細書中で使用される、「閾値」は、状態を示唆し、疾患状態の存在もしくは不在またはリスクの存在もしくは不在を示唆する、あらゆる所定のレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、様々な形を取ることができる。それは、中央値または平均などの、単一のカットオフ値とすることができる。それは、1つの定義された群におけるリスクが別の定義された群におけるリスクの2倍である場合など、比較群に基づいて確立することができる。別の例としては、閾値は、状態、疾患状態またはリスクの存在がない、または処置の経過もしくは他の改善措置の後などの、ベースライン値である。かかるベースラインは、試験されているリスクまたは疾患状態または状態と関連していない正常または他の状態を示唆するものとすることができる。
本明細書中で使用される、「特異的セルフリー核酸」は、全セルフリー核酸(DNAなど)の内にあるセルフリー核酸(DNAなど)のサブセットを指す。いくつかの態様において、特異的セルフリー核酸(DNAなど)は、移植片特異的(GS)なセルフリー核酸(DNAなど)である。GS cf−DNAは、推定上、移植片またはその細胞から落ちたDNAを指し、その配列は、移植片を取得した対象の遺伝子型と(全体でまたは一部で)マッチする。本明細書中で使用される、GS cf−DNAは、GS cf−DNA集団中のある配列(単数または複数)であって、レシピエントまたは潜在的なレシピエントのcf−DNAから区別可能である(例として、特定のヌクレオチド座(単数または複数)で異なる配列を有する)cf−DNA配列を指してもよく、または、それはGS cf−DNA集団全体を指してもよい。
核酸(DNAなど)の量(単数または複数)についての値は、本明細書中で提供される方法のいずれか1つによって「取得する」ことができ、および、あらゆる取得ステップ(単数または複数)は、参照により本明細書中に組み込まれまたは別様に本明細書中で提供される方法のいずれか1つを包含することができる。本明細書中で使用されるとおりの「取得すること」は、それぞれの情報または材料を獲得することができるあらゆる方法を指す。よって、それぞれの情報を、実験的な方法によって獲得することができる。それぞれの材料は、いくつかの態様において、様々な実験的または実験室的方法によって、作り出す、設計する等々することができる。それぞれの情報または方法はまた、レポート中などの情報を、または材料を、与えられるかまたはこれを提供されることによっても、獲得することができる。材料は、いくつかの態様において、商業的手段により(すなわち、購入することにより)与えられ得るかまたは提供され得る。
本明細書中で提供されるとおり、適合性は、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての1以上の値および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての1以上の値を使用して決定することができる。
理想的には、分析されるセルフリーDNAのほとんどが臓器から来るものであり、および、血液は洗い流される。しかしながら、ドナーからの無傷の白血球は、依然として臓器中に存在する可能性がある。また、細胞の溶解は、全セルフリーDNA分析のための灌流液の質を低下させる可能性がある。よって、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、灌流液試料などの試料から、コンタミネーションさせる無傷の細胞が、1以上の(例として、1、2、または3以上の)遠心分離ステップによって除去される。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、コンタミネーションさせる白血球の有効な洗い流しの後で、意味のあるcfDNA分析のためにベースラインを確立することができる。
理想的には、分析されるセルフリーDNAのほとんどが臓器から来るものであり、および、血液は洗い流される。しかしながら、ドナーからの無傷の白血球は、依然として臓器中に存在する可能性がある。また、細胞の溶解は、全セルフリーDNA分析のための灌流液の質を低下させる可能性がある。よって、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、灌流液試料などの試料から、コンタミネーションさせる無傷の細胞が、1以上の(例として、1、2、または3以上の)遠心分離ステップによって除去される。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、コンタミネーションさせる白血球の有効な洗い流しの後で、意味のあるcfDNA分析のためにベースラインを確立することができる。
適合性はまた、全セルフリー核酸(DNAなど)の量についての1以上の値および/またはフラグメント分析からの1以上の値を使用しても決定することができる。
フラグメント分析は、短および/または長核酸フラグメントを評価することによって行うことができる。本明細書中で使用される、「長フラグメント」は、170bpsよりも大きいフラグメント(例として、長さ171〜300bpsの間)を指し、一方で「短フラグメント」は、170bps以下のフラグメント(例として、長さ75〜170bpsの間)である。かかる方法は、一般的に、長フラグメントおよび/または短フラグメントを標的とするプライマーで行われる。
フラグメント分析は、短および/または長核酸フラグメントを評価することによって行うことができる。本明細書中で使用される、「長フラグメント」は、170bpsよりも大きいフラグメント(例として、長さ171〜300bpsの間)を指し、一方で「短フラグメント」は、170bps以下のフラグメント(例として、長さ75〜170bpsの間)である。かかる方法は、一般的に、長フラグメントおよび/または短フラグメントを標的とするプライマーで行われる。
フラグメントは、Aluフラグメントとすることができる。Aluエレメントは、元々Arthrobacter luteus(Alu)制限エンドヌクレアーゼの作用によって特徴づけられた、DNAの短いストレッチである。Aluリピートは、ヒトゲノム中で最も豊富な配列であり、ゲノムにつき約140万のコピー数を伴う。Alu配列は、典型的には300ヌクレオチドである、短鎖散在反復配列(SINE)であり、これはゲノムの10%よりも多くを占める。本明細書中で提供されるのは、一態様において長Aluフラグメントおよび/または短Aluフラグメントを分析することにより、cf−DNA試料の細胞溶解の潜在的なコンタミネーション寄与を測定することを包含することができる、方法である。
提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、方法は、値(単数または複数)に基づいて移植または埋め込みのための移植片の適合性(例として、健康、状態、または疾患状態)を評価することをさらに包含する。いくつかの態様において、本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、1以上の値(例として、全および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量について)の増加を、不適合性とまたは適合性が低下していることと相関付ける、あるいは、1以上の値(例として、全および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量について)の減少を、適合性とまたは適合性が増加していることと相関付けることを、含むことができる。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、相関付けることは、適合性を、または適合性が増加もしくは減少していることを決定するために、レベル(例として、濃度、比またはパーセンテージ)を閾値または別の時点からの値と比較することを含む。よって、レベルにおける変遷を、経時的にモニタリングするものとすることができる。本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、グラフ(graph)の適合性を評価するために核酸(DNAなど)の量についての値を閾値または別の時点からの値と比較する1以上のステップを包含することができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一態様において、方法は、評価するための追加の試験(単数または複数)をさらに包含し得る。追加の試験(単数または複数)は、本明細書中で提供される方法または当該技術分野において知られている方法のいずれか1つであり得る。
臨床医にとって特に有用であるのは、本明細書中で提供される値(単数または複数)を含有するレポートであることが見出されている。提供されるレポートのいずれか1つの、いくつかの態様において、レポートは、1以上の閾値をもまた包含する。一側面において、ゆえに、かかるレポートが提供される。レポートは、視覚化できるかまたは表示できる形などの、口頭、書類(またはハードコピー)もしくは電子的な形であり得る。いくつかの態様において、本明細書中で提供されるとおりの各アッセイについての「生の」結果が、レポート中で提供され、および、このレポートから、核酸(DNAなど)の量(単数または複数)を分析するためのさらなるステップを取ることができる。他の態様において、レポートは、核酸(DNAなど)の量についての複数の値を提供する。量から、いくつかの態様において、臨床医は、移植または埋め込みのための移植片の適合性、または、移植片を時間もしくは処置もしくは何らかの他の改善措置にわたってモニタリングする必要性を、評価し得る。
いくつかの態様において、量は、データベース中にあるかまたはデータベース中へと入力される。一側面において、かかる値を伴うデータベースが提供される。量(単数または複数)から、臨床医は、処置またはモニタリングの必要性を評価し得る。したがって、本明細書中で提供される方法のいずれか1つにおいて、方法は、1よりも多い時点での量(単数または複数)を評価することを含むことができる。かかる評価は、本明細書中で提供される方法または組成物のいずれか1つを用いて行うことができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つにおいて、方法は、1または複数の別の時点での核酸(DNAなど)の量を評価することを包含することができる。かかる評価は、本明細書中で提供される方法のいずれか1つを用いて行うことができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つにおいて、方法は、1または複数の別の時点での核酸(DNAなど)の量を評価することを包含することができる。かかる評価は、本明細書中で提供される方法のいずれか1つを用いて行うことができる。
全セルフリー核酸(DNAなど)ならびに特異的セルフリー核酸(DNAなど)を決定するための方法は、本明細書中で提供されるか、または別様に当該技術分野において知られている。例えば、PCT出願第PCT/US2016/030313号の方法が、本明細書中で提供されるとおりの試料中の特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するために使用され得る。よって、本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、PCT出願第PCT/US2016/030313号において記載された方法のいずれか1つの、ステップを包含することができ、および、かかる方法およびステップは、参照により本明細書中に組み込まれる。同様に、米国出願公開第US-2015-0086477-A1号の、セルフリーDNAを測定する方法もまた、参照により本明細書中に組み込まれ、および、かかる方法は、セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するための本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、一部として包含されることができる。
さらなる例としては、リアルタイムPCRまたはデジタルPCRなどのPCRを伴う増幅が、セルフリー核酸(DNAなど)および/または特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するために使用され得る。例えば、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、全セルフリー核酸(DNAなど)は、RNase Pを標的として使用したTaqmanリアルタイムPCRで決定される。他の方法は、本明細書中の他の箇所で提供されるか、または、当業者には明らかである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、本明細書中で提供される値を決定する方法のいずれか1つを包含することができる。
上で言及したとおり、いくつかの態様において、本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、特異的セルフリー核酸(DNAなど)の量についての値を決定するためにミスマッチ増幅(例として、MOMA)を活用する定量的アッセイのステップを包含し得る。かかるアッセイにおける使用のためのプライマーが取得され得、および、本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、定量的アッセイを行うための1以上のプライマー対を取得するステップを包含することができる。一般的に、プライマーは、核酸の量を定量化することにおけるそれらの使用を円滑にするような固有の特性を保有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは、3’ヌクレオチド(例として、最後から2番目の3’ヌクレオチド)でミスマッチすることができる。
提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、このミスマッチは、3’ヌクレオチドにあるが、SNV位置に隣接している。提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、SNV位置に対する相対的なプライマーのミスマッチの位置取りは、図1に示されるとおりである。一般的に、かかるフォワードプライマーは、3’ミスマッチを伴ってさえも、増幅反応中で増幅産物を(適切なリバースプライマーと連動して)生産し、これによって、それぞれのSNVを伴う核酸の、増幅およびその結果もたらされる検出を可能にさせる。特定のSNVが存在せず、かつSNV標的の他方のアレルに対するダブルミスマッチがある場合には、増幅産物は一般的に生産されない。好ましくは、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、各SNV標的について、それによって各アレルの特異的増幅が他のアレル(単数または複数)の増幅なしに起こることができるようなプライマー対が得られる。
「特異的増幅」は、別の核酸の実質的な増幅のない、または、バックグラウンドまたはノイズを上回るような別の核酸配列の増幅のない、特異的な標的の増幅を指す。いくつかの態様において、特異的増幅は、特異的なアレルの増幅のみを結果としてもたらす。
本明細書中で使用される、「一塩基バリアント」は、核酸配列内に単一のヌクレオチドでの配列変化があるものを指す。いくつかの態様において、SNVは、SNVについて1つのメジャーアレルおよび1つのマイナーアレルがあるということを意味する両アレル性のSNVである。いくつかの態様において、SNVは、集団内でなど、2よりも多いアレルを有し得る。一般的に、「マイナーアレル」は、遺伝子座に対する、核酸のセットにおいてより低頻度のアレルを指し、一方で「メジャーアレル」は、核酸のセットにおいてより高頻度のアレルを指す。本明細書中で提供される方法は、いくつかの態様においては、低いレベルで存在するときでさえ、核酸の混合物内のメジャーおよびマイナーアレルの核酸を定量化することができる。
SNVなどの、核酸配列内に配列同一性の変化があるものは、一般的に「標的」と呼ばれる。本明細書中で使用される、「SNV標的」は、核酸配列内に単一のヌクレオチドでの配列変化があるものを指す。SNV標的は、1よりも多いアレルを有し、および好ましい態様において、SNV標的は、両アレル性である。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、SNV標的は、SNP標的である。これらの態様のいくつかにおいて、SNP標的は、両アレル性である。提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、核酸の量は、複数のSNV標的に対するプライマーでの定量的PCRアッセイなどの、増幅に基づいた定量的アッセイを試みることによって決定される。「複数のSNV標的」は、各標的に対して少なくとも2つのアレルがある場合の、1よりも多いSNV標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各SNV標的は、両アレル性であることが期待され、および、SNV標的の各アレルに特異的なプライマー対が、各アレルの核酸を特異的に増幅させるために使用され、ここで増幅は、特異的なアレルが試料中に存在する場合に起こる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、両アレル性である各SNV標的については、各々が2つのアレルのうちの1つに特異的である2つのプライマー対があり、および、よって、それが増幅させるアレルに対するシングルミスマッチと、それが増幅させないアレル(ここでも、これらのアレルの核酸が存在するのであれば)に対するダブルミスマッチとを有する。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、各SNV標的についての2つのプライマー対のリバースプライマーは同じである。
これらのコンセプトを、本明細書中で提供される方法のいずれか1つのためのプライマー対の設計において使用することができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特異的な遺伝子座のフラグメントを増幅させるために、反対側の鎖(例として、センス鎖およびアンチセンス鎖)を結合させるように設計されているということが理解されるべきである。プライマー対のフォワードおよびリバースプライマーは、例えば本開示によるSNV標的のアレルの存在を検出するため、いずれかの適切なサイズの核酸フラグメントを増幅させるように、設計され得る。本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、本明細書中で記載されるとおりの1以上のプライマー対を取得するための1以上のステップを包含することができる。
一般的に、本明細書中で提供されるとおりの「有用な結果」は、試料中の核酸のレベルを定量化するのに使用することができる結果である。提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、特異的および/または非特異的核酸の量は、それぞれ、核酸についての有用な結果にわたる平均を表す。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、この平均は、絶対値としてまたはパーセンテージとして与えられる。好ましくは、本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、この平均は、中央値である。
特異的な核酸の、比またはパーセンテージなどの量は、必要に応じて、メジャーおよびマイナーアレルの量ならびに遺伝子型を用いて、決定され得る。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、アレルを、前もってのジェノタイピング(例として、それぞれ、レシピエントまたは潜在的なレシピエントの、および/または移植片がそこから得られたものである対象の)に基づいて決定することができる。ジェノタイピングのための方法は、当該技術分野において周知である。かかる方法は、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどのシーケンシング、他の分離技術またはPCRアッセイを包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、かかる遺伝子型を取得するステップを包含することができる。
本明細書中に記載されるプライマー対は、マルチプレックスPCRアッセイなどのマルチプレックスアッセイに使用されてもよいということが理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、プライマー対は、PCR反応において他のプライマー対と互換性があるように設計される。例えば、プライマー対は、少なくとも2つ、少なくとも5つ、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40等々の、PCR反応における他のプライマー対と互換性があるように設計され得る。本明細書中で使用される、PCR反応におけるプライマー対は、同じPCR反応においてそれらの標的を増幅させることを可能とする場合に、「互換性がある」。いくつかの態様において、プライマー対は、同じPCR反応中にマルチプレックス化されたときに、プライマー対がそれらの標的核酸(DNAなど)を増幅することから阻害されるのが1%以下、2%以下、5%以下、10%以下、15%以下、20%以下、25%以下、30%以下、35%以下、40%以下、45%以下、50%以下、または60%以下である場合に、互換性がある。
プライマー対は、プライマー二量体の形成、および、別のプライマー対と干渉し得る鋳型上のオフターゲット部位への結合、を包含するがこれに限定されない数々の理由のために、互換性がないことがあり得る。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対との二量体の形成を防止するように、または、オフターゲットの結合部位の数を限定するように、設計され得る。マルチプレックスアッセイにおける使用のためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当該技術分野において知られており、および別様に本明細書中に記載されている。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、ミスマッチ増幅に基づいた定量的アッセイは、それによって核酸が増幅され、および核酸の量を決定することができる、あらゆる定量的アッセイである。かかるアッセイは、本明細書中に記載されるMOMAプライマーで核酸が増幅されおよび定量化されることによるものを包含する。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代シーケンシング、およびそのようなものを包含する。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、定量的アッセイは、定量的PCRアッセイを包含する。定量的PCRは、リアルタイムPCR、デジタルPCR、Taqman、等々を包含する。本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、PCRは、「リアルタイムPCR」である。かかるPCRは、増幅プロセスが依然として進行している間にも液相中において反応速度をモニタリングすることができるPCR反応を指す。従来型PCRとは対照的に、リアルタイムPCRは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量化する能力を与える。特異的な染料からの蛍光強度の増加に基づいて、増幅がそのプラトーに達する前であっても標的の濃度を決定することができる。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つにおいて、PCRは、デジタルPCRであり得る。デジタルPCRには、希釈された増幅産物を、不連続な試験部位のほとんどがゼロまたは1つの増幅産物のいずれかを含むように、複数の不連続な試験部位へと分割することが関与する。増幅産物は、次いで、試料中の選択された興味の対象のゲノム領域の頻度の表現を提供するために分析される。不連続な試験部位につき1つずつの増幅産物の分析は、2値の「イエスかノーの」結果を、結果としてもたらし、これは、各不連続な試験部位について、選択された興味の対象のゲノム領域が定量化されること、および、互いとの関係での、選択された興味の対象のゲノム領域の相対頻度が決定されることを許容する。
ある側面において、加えてまたは代替として、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して複合分析が行われ得る。2以上の所定の領域の分析からの結果を、数々の増幅産物を定量化し、およびその相対頻度を決定することに使用することができる。試料中の頻度を決定するために2以上の所定の領域を使用することは、例として、増幅効率における変動を通して、偏りの可能性を低減し、これは単一検出アッセイを通してでは容易に明らかにならないものであり得る。デジタルPCRを使用したDNAを定量化するための方法は、当該技術分野において知られており、および例えば米国特許公開公報第US20140242582号において、以前に記載されている。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つは、セルフリーDNAなどの核酸を抽出することを含むことができる。かかる抽出は、当該技術分野において知られているかまたは別様に本明細書中で提供されるあらゆる方法(例として、Current Protocols in Molecular Biology、最新版、またはQIAamp circulating nucleic acid kitもしくは他の適当な商業的に入手可能なキット、を参照)を使用してすることができる。血液からセルフリーDNAを単離するための例示的な方法が記載される。EDTAまたはDTAなどの抗凝固剤を含有する血液が採集される。cf−DNAを含有する血漿が、血液中に存在する細胞から分離される(例として、遠心分離または濾過によって)。任意の第2の分離が、あらゆる残存する細胞を血漿から除去するために行われてもよい(例として、第2の遠心分離または濾過ステップ)。cf−DNAを、次いで、当該技術分野において知られているいずれかの方法を使用して、例として、Qiagenにより生産されたものなどの市販のキットを使用して、抽出することができる。
cf−DNAを抽出するための他の例示的な方法もまた、当該技術分野において知られている(例として、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007;Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210;Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319;Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955;Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613;およびand Swinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526、を参照)。
本明細書中で提供される方法のいずれか1つの、いくつかの態様において、前増幅ステップが行われる。かかる前増幅の例示的な方法は次のとおりであり、およびかかる方法は、本明細書中で提供される方法のいずれか1つに包含されることができる。プールされたプライマーが合計4μMであった、おおよそ13の標的とともに、Q5 DNAポリメラーゼを使用したPCRにおいて、おおよそ15ngのセルフリー血漿DNAが増幅される。試料は、おおよそ25サイクルを受ける。反応は、合計25μlである。増幅の後、試料は、AMPUREビーズ浄化、ビーズ精製、または単純にExoSAP-IT(商標)、またはZymoを包含する、数種のアプローチを使用して浄化されることができる。
本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または、前述で記載された態様において特には議論されていない様々な配置で使用され得、ゆえに、それらの適用において前述の記載において規定されているかまたは図面中で例証されている詳細および配置にまでは限定されない。例えば、一態様中に記載された側面は、他の態様中に記載された側面と、あらゆる様式で組み合わせられ得る。
また、本発明の態様は、その例が提供されている1以上の方法としても実装され得る。方法(単数または複数)の一部分として行われる動作は、あらゆる適切なやり方で順序付けられ得る。したがって、態様は、その行為が例証されたものとは異なる順序で行われて構成されていてもよく、これは、たとえ例証的な態様において逐次的な動作として示されていても、いくつかの動作を同時に行うことを包含してもよい。
クレーム要素を修飾するための請求項中の「第1の」、「第2の」、「第3の」等々といった順序の用語の使用は、それ自体によっては、いかなる優先順位、先行性、または1つのクレーム要素の別のものに対する順序も、または方法の動作が行われる時間的順序も、含意しない。かかる用語は、単にある名称を有する1つのクレーム要素を、同じ名称(ただし順序の用語を使用していることを除く)を有する別の要素から区別するための標識として使用される。
本明細書中で使用される言い回しおよび専門用語は、説明記載のためのものであって、限定するものとみなされてはならない。「包含する(including)」、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「関与する(involving)」およびそれらのバリエーションの使用は、それ以降に列記される事項および追加の事項を網羅することを意味している。
本明細書中で使用される言い回しおよび専門用語は、説明記載のためのものであって、限定するものとみなされてはならない。「包含する(including)」、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「関与する(involving)」およびそれらのバリエーションの使用は、それ以降に列記される事項および追加の事項を網羅することを意味している。
本発明の数種の態様を詳細に記載してきたが、様々な改良および改善が、当業者には容易に起こり得る。かかる改良および改善は、本発明の精神および範囲の内にあることが意図される。したがって、前述の記載は、一例にすぎないのであって、限定するものとは意図されない。以下の記載は、本明細書中で提供される方法の例を提供する。
例
例1− ゲルセパレータ血漿調製チューブ(PPT)の評定
8mLのニートなSTEEN(商標)を8.5mL PPTに加え、および1100×gで10分間スピンした。比較のために、1.0mLのヒトバフィーコート(赤血球が混じっている血漿−白血球混合物)を、7.0mLのニートなSTEEN(商標)に加え、および、1100×gで10分間、8.5mL PPTチューブ中でスピンした。物理的観測は、ゲルの栓上の流体相の遠心分離後の明瞭化および栓の下への細胞画分の移動という所見を包含した。分離後のゲルの最上部に観察された細い線は、ゲル材料中の赤血球フラグメントへの包埋に起因し、これは、全血を血漿セパレータゲルへとスピンさせたときにもまた見られる現象であった。
例1− ゲルセパレータ血漿調製チューブ(PPT)の評定
8mLのニートなSTEEN(商標)を8.5mL PPTに加え、および1100×gで10分間スピンした。比較のために、1.0mLのヒトバフィーコート(赤血球が混じっている血漿−白血球混合物)を、7.0mLのニートなSTEEN(商標)に加え、および、1100×gで10分間、8.5mL PPTチューブ中でスピンした。物理的観測は、ゲルの栓上の流体相の遠心分離後の明瞭化および栓の下への細胞画分の移動という所見を包含した。分離後のゲルの最上部に観察された細い線は、ゲル材料中の赤血球フラグメントへの包埋に起因し、これは、全血を血漿セパレータゲルへとスピンさせたときにもまた見られる現象であった。
実験は、ex vivo肺灌流(EVLP)の肺を通って循環するSTEEN溶液内に存在し得る実質的な白血球/RBC補完物をシミュレートするために、STEEN溶液中へのコントロールされたバフィーコートのスパイクを使用した。ゲルセパレータの下でPPTの底に小さな赤色を帯びたペレットを形成した、ゲルセパレータを通しての細胞の移動は、STEEN(商標)溶液中に懸濁された細胞が、PPTのゲルの栓を通って、PPT中のヒト全血試料の遠心分離の間に観察されたものと似たような様式で流体相から良く分離されたペレットを形成したということを示唆する。これは、EVLPの間のSTEEN灌流液採集の試料については、PPTから注がれるスピン後の上清が、コンタミネーションさせる白血球からのDNAによる問題のあるコンタミネーションなしのcf−DNA分析のために適切なものになるということを示唆する。
精製ヒト血漿対STEEN溶液の中へとスパイクされたバフィーコート細胞の細胞移動を実証する、条件付き対応ありコントロール(conditional paired control)のステップを、結果として行った。移植レシピエントの全血をPPT中で遠心分離することによってcf−DNA抽出および分析のために血漿を精製し、次いで、コニカルチューブ中にてPPT上清を低速で手早く再遠心分離したことで、あらゆる残余の細胞デブリをペレット化させた。EVLP内STEEN灌流液の流体相(全血とは対照的なものとしての)からの顕微鏡的レベルの白血球のクリアランスの程度を評定するために、上で記載されたとおりに調製した上清を、15mLコニカルチューブ中へと注ぎ、および1400×gでの第2のスピンに10分間供した。
第2のスピンからの上清を、次いで、小さい細胞ペレットの破壊を防ぐために200μLをチューブの底に残してコニカルチューブから除去した。採集した上清を、あらゆる残存する細胞質のために血球計算法によって顕微鏡的に検査した。ペレットを包含するチューブの底の200μLの体積を、再懸濁し、これもまた血球計を通して顕微鏡的に見た。図6は、顕微鏡的な結果を示す。
ゲルセパレータPPTを通したバフィーコート−STEEN(商標)混合物の単一の低速スピン、これにはクリーンアップの低速(1400×gで10分間)のスピンが後に続くが、これは残存する血漿−STEEN(商標)流体相を、本質的に完全に、コンタミネーションさせる白血球のない状態にしておき、STEEN(商標)灌流液中のcf−DNAの意味のある分析を可能にさせる。実験は、STEEN溶液およびその構成成分分子(例えば、デキストラン40)は、cf−DNA分析のために採集したSTEENに基づいたEVLP灌流溶質からコンタミネーションさせる白血球を同様に除去するための、上で記載された血漿精製のためのプロトコルの能力には、実質的に影響しない、ということを実証している。
例2− ニートなSTEEN(商標)中のヒトDNAの存在/不在の決定
4mL体積のニートなSTEEN(商標)溶液、低cf−DNAの陽性抽出対照(PEC;ヒト血漿)および陰性抽出対照(NEC;ヌクレアーゼフリー水)を、自動化DNA抽出ワークフローを使用してトリプリケートで抽出した。抽出プロセスからの溶出液を、cf−DNAの定量化について検証済みである高感度なPCR法によって、ヒトリファレンス遺伝子の検出のためにモニタリングした。比較のために、PCR検出アッセイを、抽出なしでのニートなSTEEN(商標)溶液にもまた適用した。
4mL体積のニートなSTEEN(商標)溶液、低cf−DNAの陽性抽出対照(PEC;ヒト血漿)および陰性抽出対照(NEC;ヌクレアーゼフリー水)を、自動化DNA抽出ワークフローを使用してトリプリケートで抽出した。抽出プロセスからの溶出液を、cf−DNAの定量化について検証済みである高感度なPCR法によって、ヒトリファレンス遺伝子の検出のためにモニタリングした。比較のために、PCR検出アッセイを、抽出なしでのニートなSTEEN(商標)溶液にもまた適用した。
ヒトDNAは、非抽出STEEN(商標)または抽出STEEN(商標)のいずれにおいても検出されなかった。これは、STEEN(商標)中のヒトDNAのベースラインレベルが、最小限の極めて低い、およびこの高感度アッセイの検出のレベルを下回るものであるということを示唆する。STEEN(商標)が、いくらかでもヒトDNAを含んでいるとするならば、おそらくそれはcf−DNA測定に交絡をもたらすには低すぎるレベルである。
例3− DNAの内因性の長または短フラグメントを使用した、ニートなSTEEN(商標)溶液中のDNAの評定
ニートなSTEEN(商標)溶液の3つの4mL抽出物を抽出し、および、陽性抽出対照(PEC;ヒト血漿試料)、陰性抽出対照(NEC;ヌクレアーゼフリー水)、非抽出STEEN(商標)溶液、および非抽出0.1×TE緩衝液を包含する短および長フラグメントDNA試験を使用してトリプリケートで分析した。
ニートなSTEEN(商標)溶液の3つの4mL抽出物を抽出し、および、陽性抽出対照(PEC;ヒト血漿試料)、陰性抽出対照(NEC;ヌクレアーゼフリー水)、非抽出STEEN(商標)溶液、および非抽出0.1×TE緩衝液を包含する短および長フラグメントDNA試験を使用してトリプリケートで分析した。
長および短フラグメントcf−DNAを標準的な自動化cf−DNA抽出の後で、正常な、よく特徴づけされたPECにおいて歴史的に期待されるレベルで検出した。同じランにおいて、このより高感度な長および短フラグメント定量化アッセイを使用して、およびリファレンス遺伝子qPCRアッセイを使用して例2において得られた結果と一致して、NEC、非抽出STEEN(商標)溶液または抽出STEEN(商標)溶液中ではDNA増幅は検出されなかった。よって、STEEN(商標)溶液は、ヒトDNAを、cf−DNA評定に交絡をもたらす可能性があるとみられるレベルでは含有しないということが見出された。
例4− せん断ゲノム(gDNA)または短フラグメントgDNAの、STEEN(商標)溶液対ヒト血漿中へのスパイクイン(リファレンス遺伝子qPCRによる定量的検出)
ゲノムDNA(gDNA)を、コントロールされた様式で超音波処理によってフラグメント化し、および、ニートなSTEEN(商標)溶液(ヘパリンなどの添加物を加えていない)および血漿中へと定義された濃度でスパイクさせ、次いで、自動化cf−DNA抽出方法論を使用して抽出した。結果としてもたらされた抽出溶出液中のcf−DNAの濃度を、表2に示されるとおり、スパイクインされたDNAの回収のパーセントを決定するためにリファレンス遺伝子qPCR法を使用して測定した。
ゲノムDNA(gDNA)を、コントロールされた様式で超音波処理によってフラグメント化し、および、ニートなSTEEN(商標)溶液(ヘパリンなどの添加物を加えていない)および血漿中へと定義された濃度でスパイクさせ、次いで、自動化cf−DNA抽出方法論を使用して抽出した。結果としてもたらされた抽出溶出液中のcf−DNAの濃度を、表2に示されるとおり、スパイクインされたDNAの回収のパーセントを決定するためにリファレンス遺伝子qPCR法を使用して測定した。
ゲノムDNA抽出効率は、複数タイプの抽出方法論の知られている特性と調和して、たとえ短いフラグメント化されたDNA(例として、cf−DNA)の効率的な翻訳のために最適に高効率となるようにcf−DNA抽出のために使用される化学が選択されていても、血漿またはSTEEN(商標)溶液からは程遠い。正常な血漿マトリックスは低いベースラインのcf−DNA含有量を有するということを認識して、表2におけるデータは、自動化cf−DNA方法論が、ヒト血漿から全cf−DNAを単離することを可能とする、ということを実証する。
短フラグメントgDNAで同じ原則を検査するために、短DNAフラグメント対照の25,000コピーを、STEEN(商標)溶液およびヒト血漿の試料中(せん断ヒトgDNA量の変動する量のバックグラウンドを含有する)へとスパイクさせ、次いで自動化cf−DNA抽出プロトコルに供した。抽出溶出液中における短フラグメントの回収のパーセントを、リファレンス遺伝子qPCR法を使用して決定した。結果は以下で表3中に示される。
正常な血漿マトリックスは低いベースラインのcf−DNA含有量を有するということを認識して、表3におけるデータは、自動化cf−DNA抽出方法論が、ヒト血漿から抽出したときに観察されたそれと同様の効率で、STEEN(商標)溶液から短DNAフラグメントを単離することを可能とするということを実証している。これは、EVLP試料の処理の間の細胞溶解からの細胞アポトーシスの決定に役立つ。
例5− EVLP系中で使用した濃度でのヘパリンによるPCR阻害の程度の評定
gDNAおよびヘパリンを、50IU/mLまでの様々な濃度でSTEEN(商標)溶液へ加えた。自動化抽出システムを使用して、cf−DNAを抽出し、および定量化し、および、抽出効率を、リファレンス遺伝子qPCRを使用して測定した。結果は、図7中に示される。
gDNAおよびヘパリンを、50IU/mLまでの様々な濃度でSTEEN(商標)溶液へ加えた。自動化抽出システムを使用して、cf−DNAを抽出し、および定量化し、および、抽出効率を、リファレンス遺伝子qPCRを使用して測定した。結果は、図7中に示される。
周知のリファレンス遺伝子の定量化によって測定されたとおりの、PCRの阻害は、典型的に全血単位献血バッグにおいて使用されるヘパリンの濃度である、おおよそ50IU/mLのヘパリンで目立っている。この高い濃度のヘパリンでは、ゲノムのリファレンス遺伝子の回収は、図7に示されるとおり、劇的に下降する。採血チューブに類似したヘパリンの濃度(おおよそ15IU/mL)、EVLP回路の開始での灌流液のヘパリンの濃度(おおよそ1.5IU/mL)、およびEVLP補充の6時間後のそれら(おおよそ0.65IU/mL)は、有意にPCRを阻害することになるヘパリンの濃度を十分に下回る。
例6− リファレンス遺伝子qPCR法によって測定したとおりのex vivo肺灌流(EVLP)灌流液中のヒトDNAの定量化
最初のチューブ1〜5からの2mL体積を、細胞およびデブリを除去するための0回(試料レベル1)、1回(試料レベル2A)、および2回(試料レベル3)の1100×g×10分のスピンの後で自動化DNA抽出に供した。リファレンス遺伝子qPCR法を使用して、全DNA濃度について、抽出されたDNA溶出液を分析した。結果は表4に示される。
最初のチューブ1〜5からの2mL体積を、細胞およびデブリを除去するための0回(試料レベル1)、1回(試料レベル2A)、および2回(試料レベル3)の1100×g×10分のスピンの後で自動化DNA抽出に供した。リファレンス遺伝子qPCR法を使用して、全DNA濃度について、抽出されたDNA溶出液を分析した。結果は表4に示される。
ヒト肺までの灌流回路内に曝露がないことと一致して、チューブ1中には、ヒトDNAは検出されなかった。しかしながら、比較的高い濃度のヒトDNA(856〜1924ng/ml)が、遠心分離の前のチューブ2〜5(レベル1)中に検出された。遠心分離(レベル2aおよび3)による流体相からの無傷の有核細胞の漸進的な除去で、存在する全DNAの濃度は、主として細胞のほとんどを除去したレベル2aスピンの結果として予想どおり低減されたが、レベル2aおよび3のセルフリー上清中では比較的高いままであった。
灌流液試料2〜5(レベル2aおよび3)において観察されたcf−DNAの濃度は、一例として、正常ヒト対象および心移植拒絶のあるほとんどの患者からの血漿中で歴史的に観察されていた正常な循環cf−DNAレベルと比較して、目立って上昇している。しかしながら、例7において記されたとおり、試料は、真の興味の対象のcf−DNAが含有される流体相から細胞を分離するための採集の2時間以内の必須のスピンなしに、翌日配送で出荷されていた。翌日配送の出荷が受け取られる迄その遠心分離が可能でなかった、これらの現時点のEVLP試料については、測定された高い「cf−DNA」レベルは、採取後白血球溶解からまたはEVLPの間に起こる細胞溶解のいずれかから結果としてもたらされた可能性がある。
例7− 自動化細胞計数機(Cell-Dyne)によって評価された、遠心精製の機能としての灌流液試料の細胞含有量
0回(レベル1)、1回(レベル2A)、および2回(レベル3)の1100×g低速スピンの後のチューブ1〜5から上清アリコートを採集した。これらのアリコートに対する細胞計数分析を、Cell-Dyne 3700 Hematology Analyzerを使用して行った(表5を参照)。
0回(レベル1)、1回(レベル2A)、および2回(レベル3)の1100×g低速スピンの後のチューブ1〜5から上清アリコートを採集した。これらのアリコートに対する細胞計数分析を、Cell-Dyne 3700 Hematology Analyzerを使用して行った(表5を参照)。
細胞計数分析は、これらの細胞カウントレベルでのCell-Dyne法の本来の変動の範囲内で、チューブ2と3との、およびチューブ4と5との、近い類似性を示す。これらの類似性は、最初に受け取ったチューブと遠心分離後のチューブとの外観の比較によってマッチさせられている。
重要なことに、レベル2aから3までを通しての灌流液試料の遠心分離は、無傷の、計数可能な細胞を除去するのに極めて有効であることが見出された。しかしながら、ほとんどの細胞チューブの1つ(チューブ3)におけるRBCおよびWBCのわずかな残余物は、分析のための出荷の前の第3のスピンが役立ち得るということを提案する。
重要なことに、レベル2aから3までを通しての灌流液試料の遠心分離は、無傷の、計数可能な細胞を除去するのに極めて有効であることが見出された。しかしながら、ほとんどの細胞チューブの1つ(チューブ3)におけるRBCおよびWBCのわずかな残余物は、分析のための出荷の前の第3のスピンが役立ち得るということを提案する。
例8− EVLP灌流液試料中のcf−DNAフラグメント化の評定
チューブ2〜5の元のままのレベル4上清、および正常血漿対照検体の、デュプリケートでの2mLアリコートから、自動化抽出技術を使用して、DNAを抽出した。抽出溶出液を、細胞アポトーシス(ごく短いDNAフラグメントを生産するin vivoの典型的な細胞死の形式)、対、試料処理の間に典型的に起こる細胞溶解(これは、より長いDNAフラグメントを生産する)の差別的な寄与の尺度として、DNAの長および短フラグメントを差別的に検出するための方法を使用して分析した。溶出液中の長フラグメントDNAの比率(デュプリケートの決定の平均)が、図4に示される。
チューブ2〜5の元のままのレベル4上清、および正常血漿対照検体の、デュプリケートでの2mLアリコートから、自動化抽出技術を使用して、DNAを抽出した。抽出溶出液を、細胞アポトーシス(ごく短いDNAフラグメントを生産するin vivoの典型的な細胞死の形式)、対、試料処理の間に典型的に起こる細胞溶解(これは、より長いDNAフラグメントを生産する)の差別的な寄与の尺度として、DNAの長および短フラグメントを差別的に検出するための方法を使用して分析した。溶出液中の長フラグメントDNAの比率(デュプリケートの決定の平均)が、図4に示される。
レベル4における抽出されたDNAでは、UTチューブ2〜5から調製された無細胞の上清は、溶解された白血球DNAで検体の流体相の真のcf−DNA補完物をコンタミネーションさせるものとなる白血球溶解の有意な程度を示唆することが以前に決定されたレベルを超える、高い比率の長フラグメントDNAを含有する。分析のための出荷の前に2〜3の短い遠心分離ステップによって、試料採集の後ですぐにそれらの白血球およびあらゆる他の無傷の細胞を除去しない限り、これは灌流の間のex vivo肺損傷の尺度としてのcf−DNAレベルの解釈を有意に複雑化するものとなる。
例9− EVLP灌流液試料中の全体的なDNAフラグメント長さ分布の評定(バイオアナライザミクロキャピラリに基づいた電気泳動)
チューブ2〜5からのレベル4の灌流液DNAを自動化抽出システムによって抽出した。1μlの抽出された溶出液を、Agilent High Sensitivity DNA Bioanalyzerチップ上へとロードし、および、TAI’s Bioanalyzer 2100でランを行った。このミクロキャピラリに基づいた電気泳動セルは、DNAフラグメント長さ分布の迅速かつ高感度な調査を可能にさせる。代表的な追跡は、図5に示される。
図5における代表的な電気泳動およびゲル像は、アポトーシス性のDNA放出と一致する150bp前後のcf−DNAの小さいピーク、および、500〜15,000bpから拡張したはるかに大きなピークを示す。この500〜15,000bpのピークは、灌流液試料中の顕著な細胞溶解を示唆し、および、独立して長フラグメント比率試験の所見を裏付けている(例3を参照)。
チューブ2〜5からのレベル4の灌流液DNAを自動化抽出システムによって抽出した。1μlの抽出された溶出液を、Agilent High Sensitivity DNA Bioanalyzerチップ上へとロードし、および、TAI’s Bioanalyzer 2100でランを行った。このミクロキャピラリに基づいた電気泳動セルは、DNAフラグメント長さ分布の迅速かつ高感度な調査を可能にさせる。代表的な追跡は、図5に示される。
図5における代表的な電気泳動およびゲル像は、アポトーシス性のDNA放出と一致する150bp前後のcf−DNAの小さいピーク、および、500〜15,000bpから拡張したはるかに大きなピークを示す。この500〜15,000bpのピークは、灌流液試料中の顕著な細胞溶解を示唆し、および、独立して長フラグメント比率試験の所見を裏付けている(例3を参照)。
例10− EVLP前のSTEEN(商標)中へとスパイクされた短DNAフラグメント対照の回収効率の評定
25,000コピーの短DNAフラグメント対照、および15ng/mlのせん断ヒトgDNA(平均の長さ150bpまでせん断された)を、例1および2において無細胞であって検出可能な内因性DNAを有しないと決定されていたチューブ1(レベル1)の流体のアリコート中へとスパイクさせた。DNAを、このチューブ1のスパイクされた試料から、自動化DNA抽出プロトコルを使用して抽出し、および、DNA抽出溶出液中の短フラグメントDNA対照およびせん断gDNAの回収パーセントを、リファレンス遺伝子qPCR法を使用して決定した。加えて、短対長(short vs long)DNAフラグメントアッセイを、スパイクされた試料のDNAの長フラグメント比率(これは、実験的なデザイン中に採用されたせん断プロトコルに基づいて低いことが期待される)を決定するために使用した。結果は以下で表6〜8中に示される。
25,000コピーの短DNAフラグメント対照、および15ng/mlのせん断ヒトgDNA(平均の長さ150bpまでせん断された)を、例1および2において無細胞であって検出可能な内因性DNAを有しないと決定されていたチューブ1(レベル1)の流体のアリコート中へとスパイクさせた。DNAを、このチューブ1のスパイクされた試料から、自動化DNA抽出プロトコルを使用して抽出し、および、DNA抽出溶出液中の短フラグメントDNA対照およびせん断gDNAの回収パーセントを、リファレンス遺伝子qPCR法を使用して決定した。加えて、短対長(short vs long)DNAフラグメントアッセイを、スパイクされた試料のDNAの長フラグメント比率(これは、実験的なデザイン中に採用されたせん断プロトコルに基づいて低いことが期待される)を決定するために使用した。結果は以下で表6〜8中に示される。
表6〜8中に提示されたデータは、利用した自動化cf−DNA抽出方法論が、EVLP前のSTEEN溶液を含有する標準EVLP添加物から短DNAフラグメント(cf−DNAのアポトーシスに典型的なものである)を抽出するのに良好な性能を示すということを実証する。抽出効率は、同じ方法を使用してヒト血漿試料から短フラグメントDNAを抽出したときに歴史的に見られているそれに匹敵する。一般則として、短DNAフラグメントはいかなるDNA抽出法によっても長DNAフラグメントほど簡単に抽出されないが、本手順は、良好にそれをするように最適化されており、および、それはSTEEN溶液からも、ならびに血漿からも、実際にそのようにするのである。
例11− EVLP灌流液試料中のコンタミネーションさせる細胞のタイプの免疫表現型同定(フローサイトメトリー)
レベル1のチューブ2〜5からの5mlアリコートを、図3に示される試料処理プロトコルにつき、15mLコニカルチューブ中へと移し、および1100×gで10分間遠心分離した(レベル2b)。上清を除去し、および、フローサイトメトリー分析のためにペレットを500μl PBS中に再懸濁させた。結果は、各チューブについて、以下に示される。
レベル1のチューブ2〜5からの5mlアリコートを、図3に示される試料処理プロトコルにつき、15mLコニカルチューブ中へと移し、および1100×gで10分間遠心分離した(レベル2b)。上清を除去し、および、フローサイトメトリー分析のためにペレットを500μl PBS中に再懸濁させた。結果は、各チューブについて、以下に示される。
チューブ2〜5についてフローサイトメトリー分析によって作成した表は、試料が、標準ヒト白血球抗体パネルによって解明されたとおり細胞組成において匹敵することを示す。これは、細胞スピン調製物のマッチングにおいて見られた細胞形態学と一致する。
例12− 材料および方法(例6〜11)
5つの匿名化された、遠心分離されていない、ヒトex vivo肺灌流(EVLP)手順からの試料を取得した(最初のチューブ1〜5)。使用したEVLP手順は、40%ドナー予測心拍出量(CO)の灌流を標的とし、血流の段階的な増加と連動しての正常な深部体温への肺の段階的な復温を包含した(Machuca et al., J Thorac Dis. 2014, 6(8):1054-1106)。増加したコロイド浸透圧を伴う、保護的肺換気および無細胞灌流は、ヒト血清アルブミンおよびデキストラン40の使用を通して成し遂げられた。方法論は、人道機器適用免除(HDE)の下でFDAに承認されている。EVLPの間、肺の灌流回路は、in vivo条件を模倣している。換気されたex vivoの肺が、赤血球なしのSTEEN(商標)溶液で灌流される。ガス交換、肺血管抵抗、コンプライアンス、および他の常温条件下における重要な変動要因などのパラメーターが、モニタリングされる。
5つの匿名化された、遠心分離されていない、ヒトex vivo肺灌流(EVLP)手順からの試料を取得した(最初のチューブ1〜5)。使用したEVLP手順は、40%ドナー予測心拍出量(CO)の灌流を標的とし、血流の段階的な増加と連動しての正常な深部体温への肺の段階的な復温を包含した(Machuca et al., J Thorac Dis. 2014, 6(8):1054-1106)。増加したコロイド浸透圧を伴う、保護的肺換気および無細胞灌流は、ヒト血清アルブミンおよびデキストラン40の使用を通して成し遂げられた。方法論は、人道機器適用免除(HDE)の下でFDAに承認されている。EVLPの間、肺の灌流回路は、in vivo条件を模倣している。換気されたex vivoの肺が、赤血球なしのSTEEN(商標)溶液で灌流される。ガス交換、肺血管抵抗、コンプライアンス、および他の常温条件下における重要な変動要因などのパラメーターが、モニタリングされる。
無細胞STEEN灌流液を使用しているとき、6時間以上のEVLPが、臨床的に標準とされている。緩衝化された細胞外溶液であるSTEEN(商標)溶液は、浸透圧のためのヒト血清アルブミン、および、過剰な白血球相互作用から上皮を覆いかつ保護するために使用される穏やかなスカベンジャーであるデキストラン40を包含する(Steen et al., Lancet 2001, 357:825-829;Steen et al., Ann Thorac Surg. 2003, 76:244-252;Steen et al., Ann Thorac Surg. 2007;83:2191)。溶液は、肺移植オプションの長期的な評定を手助けし、および、ex vivoで単離されている肺の健康を促進するように設計されている。STEEN(商標)溶液を使用したEVLPは、よって、以前は拒絶されていた可能性を増加させ得る潜在性を有するが、ex vivoで回復された肺は、肺移植のための潜在的な臓器の利用可能性を増加させるために使用することができたと考えられる。
5つの試料を、2つのヒト肺灌流手順から採集した。試料は、未処理で、冷蔵パックにて翌日配送で出荷された。試料は全く冷凍されなかった。試料の詳細は以下で表9中に提供される。
5つの試料を、図3に概説される遠心分離ステップに供した。結果としてもたらされた上清および細胞ペレットを、以下に記載される実験において使用した。
細胞分析のために、図3の右半分(レベル2B)に表示されているとおり、4つの受け取ったチューブ(レベル1からのチューブ2〜5)の各々からの5mLアリコートを、細胞防腐剤を伴うかまたは防腐剤なしのいずれかでスパイクされる、2つの別々の15mLコニカルチューブ中へと移した。チューブを、1100×gで10分間遠心分離した。チューブ2と3、およびチューブ4と5は、類似した外観を示した。結果としてもたらされたレベル2b上清を除去し、および残存する細胞ペレットを、フローサイトメトリーおよび細胞計数のために、0.5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁させた。
細胞分析のために、図3の右半分(レベル2B)に表示されているとおり、4つの受け取ったチューブ(レベル1からのチューブ2〜5)の各々からの5mLアリコートを、細胞防腐剤を伴うかまたは防腐剤なしのいずれかでスパイクされる、2つの別々の15mLコニカルチューブ中へと移した。チューブを、1100×gで10分間遠心分離した。チューブ2と3、およびチューブ4と5は、類似した外観を示した。結果としてもたらされたレベル2b上清を除去し、および残存する細胞ペレットを、フローサイトメトリーおよび細胞計数のために、0.5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁させた。
cf−DNA抽出およびフラグメント分析のために、図3にレベル2aとして示されているとおり、受け取ったチューブ(レベル1のチューブ1〜5)の各々からの8.5mLアリコートを、それらのチューブから同様に標識された別々のPPTチューブ中へと移した。PPTチューブを、次いで、1100×gで10分間遠心分離した。チューブ1は、細胞ペレットを生み出さなかった。各レベル2a上清の500μLアリコートを、細胞計数分析(Cell Dyne)のために採集し、および、残存するおおよそ8mLの上清を新しい15mLコニカルチューブへと移し、これを次いで、1100×gでの第2の低速スピンに10分間供した(図3のレベル3)。このスピンステップの後には、視覚的に明白な残余の細胞ペレットがなくなった。
細胞計数分析、フローサイトメーター、および初期RNAseP DNA定量化のために、レベル3上清のアリコートを採集した(500μL)。チューブ中の底部先端の最後の500μLを回避して、残存する上清を新しい15mLコニカルチューブへと移し、および15,000×gで15分間遠心分離した。結果として生じた元のままのレベル4上清(図3)を、cf−DNA抽出および定量化/フラグメント分析のために採集した。
Claims (35)
- 移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を評価する方法であって、該方法は:
潜在的な移植片(例として、ex vivo)から放出される全cfDNAおよび/または移植片特異的cfDNAの量を取得すること(例として、潜在的なレシピエントの血液細胞との潜在的な移植片の接触の前に)、および
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を決定するための量(単数または複数)を評価すること、
任意に、全および/または移植片特異的cf−DNAの量(単数または複数)を定量化するための方法を、量を取得するために行うこと
を含む、前記方法。 - 潜在的なレシピエントからの血液細胞との、潜在的な移植片またはその細胞の接触に後続する、潜在的な移植片(例として、ex vivo)から放出される全および/または移植片特異的cf−DNAの量を取得することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を評価する方法であって、該方法は:
潜在的なレシピエントからの血液細胞との、潜在的な移植片またはその細胞の接触に後続する、潜在的な移植片(例として、ex vivo)から放出される全および/または移植片特異的cf−DNAの量を取得すること、および
移植または埋め込みのための潜在的な移植片の適合性を決定するための量(単数または複数)を評価すること、
任意に、全および/または移植片特異的cf−DNAの量(単数または複数)を定量化する方法を、量を取得するために行うこと
を含む、前記方法。 - 細胞溶解の量を決定することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞溶解の量を決定することが、フラグメント分析を行うことを含む、請求項4に記載の方法。
- フラグメント分析が、長および/または短フラグメントを定量化することを含む、請求項5に記載の方法。
- 試料(単数または複数)への1、2、3またはそれ以上の遠心分離ステップをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在的な移植片またはその細胞を取得することをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在的なレシピエントから血液を取得することをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の追加の時点で、全および/または移植片特異的cf−DNAの量を取得することおよび/または細胞溶解の量を決定することをさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 全および/または移植片特異的cf−DNAの量(単数または複数)および/または細胞溶解の量を、閾値(単数または複数)かまたは追加の(例として、より早い)時点(単数または複数)から取得した量(単数または複数)と比較することをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)が、潜在的な移植片またはそこからの細胞が含有されるかまたは血液細胞と接触する媒体の試料中において取得される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)が、灌流液試料中において取得される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)が、EVLP試料中において取得される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在的なレシピエントから血液細胞(例として、血液)を取得することをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在的な移植片またはその細胞が、潜在的なドナーのものかまたは潜在的なドナーと同じ種の動物のものであるとすることができる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- cf−DNAが、潜在的な移植片から媒体中へと放出される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 媒体が、潜在的な移植片が含有されるかまたはこれと接触する保管、灌流もしくは他の保存媒体である、請求項17に記載の方法。
- 潜在的な移植片が、1または複数の臓器である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 臓器が、心臓、もしくは肺、もしくは心臓および肺であるか、または複数の臓器がこれを含む、請求項19に記載の方法。
- 媒体の試料を取得すること、および試料中の全および/または移植片特異的cf−DNAおよび/または細胞溶解の量を取得することをさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の追加の時点で潜在的な移植片から媒体中へと放出された全cf−DNAおよび/または移植片特異的cf−DNAおよび/または細胞溶解の量を取得することをさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 全cf−DNAおよび/または移植片特異的cf−DNAおよび/または細胞溶解の量(単数または複数)を、閾値(単数または複数)かまたは追加の(例として、より早い)時点(単数または複数)から取得した量(単数または複数)と比較することをさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 全セルフリーDNAおよび/または移植片特異的cf−DNAおよび/または細胞溶解の量(単数または複数)についての値を提供することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)についての値が、レポート中で提供される、請求項24に記載の方法。
- 移植片の適合性に関して決定を行うことをさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 潜在的な移植片が経時的にモニタリングされる、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 移植片が、(例として、埋め込みまでの)15分毎、30分毎、1時間毎、1日毎、1週間毎、2週間毎または1か月毎に評価される、請求項27に記載の方法。
- 全セルフリーDNAおよび/または移植片特異的cf−DNAおよび/または細胞溶解が、リアルタイムPCRまたはデジタルPCRなどのPCRを含むものなどの定量的増幅に基づいた方法を使用して測定される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 全セルフリーDNAおよび/または移植片特異的cf−DNAが、次世代シーケンシング法またはミスマッチPCR増幅法を使用して測定される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)についての値が、閾値かまたは異なる(例として、前の)時点からの値を上回るとき、移植片の適合性が減少していることまたは不適合性を示唆する、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 量(単数または複数)についての値が、閾値かまたは異なる(例として、前の)時点からの値を下回るとき、移植片の適合性が増加していることまたは適合性を示唆する、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 移植片または潜在的なドナーもしくはレシピエントの処置が行われるか、または、かかる処置に関する情報が与えられる、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか一項の値(単数または複数)もしくは量(単数または複数)、または請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた値(単数または複数)もしくは量(単数または複数)を含むレポート。
- 1以上の追加の時点からの1以上の閾値および/または値がレポートに包含される、請求項34に記載の方法。
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