KR102512979B1 - Rna-가이드된 전사 조절 - Google Patents

Rna-가이드된 전사 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR102512979B1
KR102512979B1 KR1020217023393A KR20217023393A KR102512979B1 KR 102512979 B1 KR102512979 B1 KR 102512979B1 KR 1020217023393 A KR1020217023393 A KR 1020217023393A KR 20217023393 A KR20217023393 A KR 20217023393A KR 102512979 B1 KR102512979 B1 KR 102512979B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
sequence
rna
nucleic acid
target
Prior art date
Application number
KR1020217023393A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210095235A (ko
Inventor
죠지 엠. 처치
프라산트 지. 말리
케빈 엠. 에스벨트
Original Assignee
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 filed Critical 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
Priority to KR1020237009424A priority Critical patent/KR20230042154A/ko
Publication of KR20210095235A publication Critical patent/KR20210095235A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102512979B1 publication Critical patent/KR102512979B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Lubricants (AREA)

Abstract

표적 핵산을 포함하는 DNA에 상보적인 1개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, DNA에 결합하며 1개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질을 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 제3 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1개 이상의 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 DNA로 공동-국재화되고, 여기서 전사 조절 단백질 또는 도메인이 표적 핵산의 발현을 조절하는 것인, 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법이 제공된다.

Description

RNA-가이드된 전사 조절 {RNA-GUIDEDED TRANSCRIPTIONAL REGULATION}
관련 출원 데이터
본원은 2013년 6월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/830,787을 우선권 주장하며, 이로써 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미국 국립 보건원으로부터의 승인 번호 P50 HG005550 및 미국 에너지국으로부터의 DE-FG02-02ER63445 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
박테리아성 및 고세균성 CRISPR-Cas 시스템은 침입 외래 핵산 내에 존재하는 상보적 서열의 분해를 지시하는 Cas 단백질과 복합체화된 짧은 가이드 RNA에 의존한다. 문헌 [Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); 및 Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011)]을 참조한다. 최근, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 유형 II CRISPR 시스템을 시험관내에서 재구성한 결과, 정상적으로 트랜스-코딩된 tracrRNA ("트랜스-활성화 CRISPR RNA")와 융합된 crRNA ("CRISPR RNA")가, crRNA와 매칭되는 표적 DNA 서열을 서열-특이적으로 절단하도록 Cas9 단백질을 지시하는데 충분한 것으로 입증되었다. 표적 부위에 상동성인 gRNA의 발현은 Cas9 동원 및 표적 DNA의 분해를 유도한다. 문헌 [H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008)]을 참조한다.
본 개시내용의 측면은 가이드 RNA, DNA 결합 단백질 및 이중 가닥 DNA 표적 서열의 복합체에 관한 것이다. 특정 측면에 따르면, 본 개시내용의 범위 내의 DNA 결합 단백질은, 가이드 RNA와 복합체를 형성하는 단백질을 포함하는데, 여기서 가이드 RNA는 상기 복합체를 이중 가닥 DNA 서열로 가이드하고 여기서 상기 복합체가 DNA 서열에 결합한다. 본 개시내용의 이러한 측면은 이중 가닥 DNA로의 또는 그와의 RNA 및 DNA 결합 단백질의 공동-국재화로서 지칭될 수 있다. 이러한 방식으로, DNA 결합 단백질-가이드 RNA 복합체는 표적 DNA의 발현을 조절하기 위해 표적 DNA에 전사 조절 단백질 또는 도메인을 국재화시키는데 사용될 수 있다.
특정 측면에 따르면, 표적 핵산을 포함하는 DNA (데옥시리보핵산)에 상보적인 1개 이상의 RNA (리보핵산)를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, DNA에 결합하며 1개 이상의 RNA에 의해 가이드되는, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 제3 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1개 이상의 RNA, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 DNA로 공동-국재화되고, 여기서 전사 조절 단백질 또는 도메인이 표적 핵산의 발현을 조절하는 것인, 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 외래 핵산은 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질에 융합된 전사 조절 단백질 또는 도메인을 추가로 코딩한다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA를 코딩하는 외래 핵산은 RNA-결합 도메인의 표적을 추가로 코딩하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 외래 핵산은 전사 조절 단백질 또는 도메인에 융합된 RNA-결합 도메인을 추가로 코딩한다.
한 측면에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 포유동물 세포이다.
한 측면에 따르면, RNA는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오티드이다. 한 측면에 따르면, RNA는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오티드이다.
한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 전사 활성인자이다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 질환 또는 유해 상태를 치료하기 위해 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 표적 핵산은 질환 또는 유해 상태와 연관된다.
한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 가이드 RNA이다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 tracrRNA-crRNA 융합체이다. 한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 스페이서 서열 및 트레이서 메이트 서열을 포함한다. 가이드 RNA는 또한, 일부가 tracr 메이트 서열에 혼성화되는 tracr 서열을 포함할 수 있다. 가이드 RNA는 또한, tracrRNA-crRNA 융합체를 생산하기 위해 트레이서 메이트 서열 및 tracr 서열을 연결하는 링커 핵산 서열을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은, 예컨대 혼성화에 의해 표적 DNA에 결합한다.
한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 말단절단된 스페이서 서열을 포함한다. 한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 스페이서 서열의 5' 말단에 1개의 염기 말단절단을 갖는 말단절단된 스페이서 서열을 포함한다. 한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 스페이서 서열의 5' 말단에 2개의 염기 말단절단을 갖는 말단절단된 스페이서 서열을 포함한다. 한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 스페이서 서열의 5' 말단에 3개의 염기 말단절단을 갖는 말단절단된 스페이서 서열을 포함한다. 한 측면에 따르면, 가이드 RNA는 스페이서 서열의 5' 말단 에 4개의 염기 말단절단을 갖는 말단절단된 스페이서 서열을 포함한다. 따라서, 스페이서 서열은 스페이서 서열의 5' 말단에 1 내지 4개의 염기 말단절단을 가질 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 스페이서 서열은 표적 핵산 서열에 혼성화되는 약 16 내지 약 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 스페이서 서열은 표적 핵산 서열에 혼성화되는 약 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 측면에 따르면, 링커 핵산 서열은 약 4 내지 약 6개의 핵산을 포함할 수 있다.
특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 60 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 64 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 65 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 66 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 67 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 68 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 69 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 70 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 80 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 90 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 100 내지 약 500개의 핵산을 포함할 수 있다.
특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 60 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 64 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 65 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 66 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 67 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 68 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 69 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 70 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 80 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 90 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다. 특정 측면에 따르면, tracr 서열은 약 100 내지 약 200개의 핵산을 포함할 수 있다.
예시적인 가이드 RNA가 도 5b에 도시된다.
한 측면에 따르면, DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA이다.
특정 측면에 따르면, 표적 핵산을 포함하는 DNA (데옥시리보핵산)에 상보적인 1개 이상의 RNA (리보핵산)를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, DNA에 결합하며 1개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 제3 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1개 이상의 RNA, 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA, 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 DNA로 공동-국재화되고, 여기서 전사 조절 단백질 또는 도메인이 표적 핵산의 발현을 조절하는 것인, 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 외래 핵산은 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질에 융합된 전사 조절 단백질 또는 도메인을 추가로 코딩한다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA를 코딩하는 외래 핵산은 RNA-결합 도메인의 표적을 추가로 코딩하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 외래 핵산은 전사 조절 단백질 또는 도메인에 융합된 RNA-결합 도메인을 추가로 코딩한다.
한 측면에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 포유동물 세포이다.
한 측면에 따르면, RNA는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오티드이다. 한 측면에 따르면, RNA는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오티드이다.
한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 전사 활성인자이다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 질환 또는 유해 상태를 치료하기 위해 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 표적 핵산은 질환 또는 유해 상태와 연관된다.
한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 가이드 RNA이다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 tracrRNA-crRNA 융합체이다.
한 측면에 따르면, DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA이다.
특정 측면에 따르면, 표적 핵산을 포함하는 DNA (데옥시리보핵산)에 상보적인 1개 이상의 RNA (리보핵산)를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, DNA에 결합하며 1개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질을 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 제3 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1개 이상의 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 DNA로 공동-국재화되고, 여기서 전사 조절 단백질 또는 도메인이 표적 핵산의 발현을 조절하는 것인, 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질을 코딩하는 외래 핵산은 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질에 융합된 전사 조절 단백질 또는 도메인을 추가로 코딩한다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA를 코딩하는 외래 핵산은 RNA-결합 도메인의 표적을 추가로 코딩하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 외래 핵산은 전사 조절 단백질 또는 도메인에 융합된 RNA-결합 도메인을 추가로 코딩한다.
한 측면에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 포유동물 세포이다.
한 측면에 따르면, RNA는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오티드이다. 한 측면에 따르면, RNA는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오티드이다.
한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 전사 활성인자이다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 질환 또는 유해 상태를 치료하기 위해 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 표적 핵산은 질환 또는 유해 상태와 연관된다.
한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 가이드 RNA이다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 tracrRNA-crRNA 융합체이다.
한 측면에 따르면, DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA이다.
한 측면에 따르면, 표적 핵산을 포함하는 DNA에 상보적인 1개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 제2 외래 핵산, 및 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 제3 외래 핵산을 포함하며, 여기서 1개 이상의 RNA, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 표적 핵산에 대한 공동-국재화 복합체의 구성원인 세포가 제공된다.
한 측면에 따르면, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질을 코딩하는 외래 핵산은 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질에 융합된 전사 조절 단백질 또는 도메인을 추가로 코딩한다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA를 코딩하는 외래 핵산은 RNA-결합 도메인의 표적을 추가로 코딩하고, 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩하는 외래 핵산은 전사 조절 단백질 또는 도메인에 융합된 RNA-결합 도메인을 추가로 코딩한다.
한 측면에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 포유동물 세포이다.
한 측면에 따르면, RNA는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오티드이다. 한 측면에 따르면, RNA는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오티드이다.
한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 전사 활성인자이다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 전사 조절 단백질 또는 도메인은 질환 또는 유해 상태를 치료하기 위해 표적 핵산의 발현을 상향조절한다. 한 측면에 따르면, 표적 핵산은 질환 또는 유해 상태와 연관된다.
한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 가이드 RNA이다. 한 측면에 따르면, 1개 이상의 RNA는 tracrRNA-crRNA 융합체이다.
한 측면에 따르면, DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA이다.
특정 측면에 따르면, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질은 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질이다. 특정 측면에 따르면, RNA 가이드된 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질이다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 1개의 불활성 뉴클레아제 도메인을 가지며 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 동일한 가닥 상에 있다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 동일한 가닥 상에 있고, 상동 재조합을 일으킨다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 이중 가닥 파괴를 생성한다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 비상동 말단 연결을 일으키는 이중 가닥 파괴를 생성한다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 서로에 대해 오프셋된다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 서로에 대해 오프셋되고, 이중 가닥 파괴를 생성한다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 인접 닉은 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 서로에 대해 오프셋되고, 비상동 말단 연결을 일으키는 이중 가닥 파괴를 생성한다. 한 측면에 따르면, 방법은 공여자 핵산 서열을 코딩하는 제3 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 2개 이상의 닉은 표적 핵산과 공여자 핵산 서열의 상동 재조합을 일으킨다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하고, 여기서 2개 이상의 인접 닉이 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 표적 핵산의 단편화를 일으키는 이중 가닥 파괴를 생성하여 표적 핵산의 발현을 방지하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 유형 II CRISPR 시스템의 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하고, 여기서 2개 이상의 인접 닉이 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 표적 핵산의 단편화를 일으키는 이중 가닥 파괴를 생성하여 표적 핵산의 발현을 방지하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하고, 1개의 불활성 뉴클레아제 도메인을 가지며 2개 이상의 RNA에 의해 가이드되는 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제가 발현되고, 여기서 1개 이상의 Cas9 단백질 닉카제가 2개 이상의 RNA와 함께 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되고, DNA 표적 핵산을 닉킹하여 2개 이상의 인접 닉을 생성하고, 여기서 2개 이상의 인접 닉이 이중 가닥 DNA의 상이한 가닥 상에 있고, 표적 핵산의 단편화를 일으키는 이중 가닥 파괴를 생성하여 표적 핵산의 발현을 방지하는 것인, 세포에서 DNA 표적 핵산을 변경시키는 방법이 제공된다.
한 측면에 따르면, 각각의 RNA가 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인 2개 이상의 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산, 및 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 포함하며, 여기서 2개 이상의 RNA 및 1개 이상의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 DNA 표적 핵산에 대한 공동-국재화 복합체의 구성원인 세포가 제공된다.
한 측면에 따르면, RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제는 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제이다. 한 측면에 따르면, RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제는 1개의 불활성 뉴클레아제 도메인을 갖는 Cas9 단백질 닉카제이다.
한 측면에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 한 측면에 따르면, 세포는 포유동물 세포이다.
한 측면에 따르면, RNA는 약 10 내지 약 500개의 뉴클레오티드를 포함한다. 한 측면에 따르면, RNA는 약 20 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면에 따르면, 표적 핵산은 질환 또는 유해 상태와 연관된다.
한 측면에 따르면, 2개 이상의 RNA는 가이드 RNA이다. 한 측면에 따르면, 2개 이상의 RNA는 tracrRNA-crRNA 융합체이다.
한 측면에 따르면, DNA 표적 핵산은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA이다.
본 발명의 특정 실시양태의 추가의 특징 및 이점은 하기 실시양태의 설명 및 그의 도면, 및 청구범위로부터 보다 충분히 명백해질 것이다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 도면을 포함한다. 요청 및 필요한 요금의 지불시 사무국으로부터 컬러 도면을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본이 제공될 것이다. 본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 하기 예시적 실시양태의 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1a 및 도 1b는 RNA-가이드된 전사 활성화의 개략도이다. 도 1c는 리포터 구축물의 설계이다. 도 1d는 Cas9N-VP64 융합체가 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 및 면역형광 검정 (IF) 둘 다에 의해 검정시에 RNA-가이드된 전사 활성화를 나타낸다는 것을 입증하는 데이터를 보여준다. 도 1e는 Cas9N, MS2-VP64, 및 적절한 MS2 압타머 결합 부위를 보유하는 gRNA의 존재 하에 리포터 구축물로부터의 gRNA 서열-특이적 전사 활성화를 입증하는, FACS 및 IF에 의한 검정 데이터를 보여준다. 도 1f는 개별 gRNA 및 다중 gRNA에 의한 전사 유도를 입증하는 데이터를 도시한다.
도 2a는 Cas9-gRNA 복합체 및 TALE에 의한 표적화의 랜드스케이프를 평가하기 위한 방법론을 도시한다. 도 2b는 Cas9-gRNA 복합체가 평균적으로 그의 표적 서열에서 1-3개의 돌연변이에 내성이 있다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다. 도 2c는 Cas9-gRNA 복합체가, PAM 서열에 국재화된 것들을 제외하고는 주로 점 돌연변이에 비감수성이라는 것을 입증하는 데이터를 도시한다. 도 2d는 2개의 염기 미스매치의 도입이 Cas9-gRNA 복합체 활성을 유의하게 손상시킨다는 것을 입증하는 열 플롯 데이터를 도시한다. 도 2e는 18-량체 TALE가 평균적으로 그의 표적 서열에서 1-2개의 돌연변이에 내성을 나타낸다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다. 도 2f는 18-량체 TALE가, 그의 표적에서 미스매치된 단일 염기에 주로 비감수성인 Cas9-gRNA 복합체와 유사하다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다. 도 2g는 2개의 염기 미스매치의 도입이 18-량체 TALE 활성을 유의하게 손상시킨다는 것을 입증하는 열 플롯 데이터를 도시한다.
도 3a는 가이드 RNA 설계의 개략도를 도시한다. 도 3b는 5' 오버행으로 이어지는 오프셋 닉 및 3' 오버행으로 이어지는 오프셋 닉에 대한 비-상동 말단 연결의 백분율 비율을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 3c는 5' 오버행으로 이어지는 오프셋 닉 및 3' 오버행으로 이어지는 오프셋 닉에 대한 표적화의 백분율 비율을 보여주는 데이터를 도시한다.
도 4a는 RuvC PDB ID: 4EP4 (청색) 위치 D7에서의 금속 배위 잔기의 개략도 (좌측), 배위된 Mg-이온 (회색 구체) 및 3M7K로부터의 DNA (자주색)를 포함하는 PDB ID: 3M7K (오렌지색) 및 4H9D (시안색)로부터의 HNH 엔도뉴클레아제 도메인의 개략도 (중앙) 및 분석된 돌연변이체의 목록 (우측)이다. 도 4b는 Cas9 돌연변이체 m3 및 m4 및 또한 VP64와의 이들 각각의 융합체에 대한 검출불가능한 뉴클레아제 활성을 보여주는 데이터를 도시한다. 도 4c는 도 4b에서의 데이터의 보다 고해상도 검사이다.
도 5a는 Cas9-gRNA 활성을 결정하기 위한 상동 재조합 검정의 개략도이다. 도 5b는 무작위 서열 삽입을 갖는 가이드 RNA 및 상동 재조합의 백분율 비율을 도시한다.
도 6a는 OCT4 유전자에 대한 가이드 RNA의 개략도이다. 도 6b는 프로모터-루시페라제 리포터 구축물에 대한 전사 활성화를 도시한다. 도 6c는 내인성 유전자의 qPCR을 통한 전사 활성화를 도시한다.
도 7a는 REX1 유전자에 대한 가이드 RNA의 개략도이다. 도 7b는 프로모터-루시페라제 리포터 구축물에 대한 전사 활성화를 도시한다. 도 7c는 내인성 유전자의 qPCR을 통한 전사 활성화를 도시한다.
도 8a는 정규화된 발현 수준의 계산을 위한 고수준 특이성 분석 프로세싱 흐름 개략도를 도시한다. 도 8b는 편재된 구축물 라이브러리 내에 생성된 미스매치의 수에 대한 결합 부위의 백분율의 분포의 데이터를 도시한다. 좌측: 이론적 분포. 우측: 실제 TALE 구축물 라이브러리로부터 관찰된 분포. 도 8c는 미스매치의 수에 대한 결합 부위에 대해 집계된 태그 카운트의 백분율의 분포의 데이터를 도시한다. 좌측: 양성 대조군 샘플로부터 관찰된 분포. 우측: 비-대조군 TALE가 유도된 샘플로부터 관찰된 분포.
도 9a는 그의 표적 서열에서 1-3개의 돌연변이에 내성을 보여주는 Cas9-gRNA 복합체의 표적화 랜드스캐이프의 분석에 대한 데이터를 도시한다. 도 9b는 PAM 서열에 국재된 것들을 제외하고는 점 돌연변이에 대해 비감수성을 보여주는 Cas9-gRNA 복합체의 표적화 랜드스케이프의 분석에 대한 데이터를 도시한다. 도 9c는 2개의 염기 미스매치의 도입이 활성을 유의하게 손상시킨다는 것을 보여주는 Cas9-gRNA 복합체의 표적화 랜드스케이프의 분석에 대한 열 플롯 데이터를 도시한다. 도 9d는 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 추정 PAM이 NGG 및 또한 NAG임을 확인하는 뉴클레아제 매개 HR 검정으로부터의 데이터를 도시한다.
도 10a는 18-량체 TALE가 그의 표적 서열에서 다중 돌연변이를 허용한다는 것을 확인하는 뉴클레아제 매개 HR 검정으로부터의 데이터를 도시한다. 도 10b는 3가지 상이한 크기 (18-량체, 14-량체 및 10-량체)의 TALE의 표적화 랜드스케이프의 분석으로부터의 데이터를 도시한다. 도 10c는 근사 단일-염기 미스매치 해상도를 나타내는 10-량체 TALE에 대한 데이터를 도시한다. 도 10d는 근사 단일-염기 미스매치 해상도를 나타내는 10-량체 TALE에 대한 열 플롯 데이터를 도시한다.
도 11a는 설계된 가이드 RNA 도시한다. 도 11b는 다양한 가이드 RNA에 대한 비상동 말단 연결의 백분율 비율을 도시한다.
도 12a는 Sox2 유전자를 도시한다. 도 12b는 Nanog 유전자를 도시한다.
도 13a-13f는 2개의 추가의 Cas9-gRNA 복합체의 표적화 랜드스케이프를 도시한다.
도 14a는 2개의 gRNA (야생형(서열식별번호:88) 및 돌연변이체(서열식별번호:89-90))의 특이성 프로파일을 도시한다. 상이한 서열은 적색으로 강조 표시하였다. 도 14b 및 14c는 이 검정이 평가 대상 gRNA에 대해 특이적임을 도시한다 (데이터는 도 13d로부터 재플롯팅됨).
도 15a-15d는 스페이서 서열 대 표적에서 단일 또는 이중-염기 미스매치 (적색으로 강조 표시됨)를 보유하는 gRNA2 (도 15a-b) 및 gRNA3 (도 15c-d)을 도시한다. 서열은 서열식별번호:91-131에서 제시된 것과 같다.
도 16a-16d는 시험된 2개의 독립된 gRNA의 뉴클레아제 검정을 도시한다: 스페이서의 5' 말단에서 말단절단된 gRNA1 (도 16a-b) 및 gRNA3 (도 16c-d). 서열은 서열식별번호:66, 185-186 및 133-140에서 제시된 것과 같다.
도 17a-17b는 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 PAM이 NGG이고, 또한 NAG임을 보여주는 뉴클레아제 매개 HR 검정을 도시한다. 서열은 서열식별번호:67-69 및 141에서 제시된 것과 같다.
도 18a-18b는 18량체 TALE가 그의 표적 서열에 다중 돌연변이를 허용한다는 것을 확인하는 뉴클레아제 매개 HR 검정을 도시한다. 서열은 서열식별번호:70-73에서 제시된 것과 같다.
도 19a-19c는 TALE 단량체 특이성 대 TALE 단백질 특이성의 비교를 도시한다. 서열은 서열식별번호:142-150에서 제시된 것과 같다.
도 20a-20b는 오프셋 닉킹과 관련된 데이터를 도시한다. 서열은 서열식별번호:151-158에서 제시된 것과 같다.
도 21a-21c는 오프셋 닉킹 및 NHEJ 프로파일을 도시한다. 서열은 서열식별번호:159-184 및 187에서 제시된 것과 같다.
본 개시내용의 실시양태는 DNA에 전사 조절 단백질 또는 도메인을, 표적 핵산을 조절하는 방식으로 공동-국재화시키기 위한 DNA 결합 단백질의 사용에 기초한다. 다양한 목적을 위해 DNA에 결합하는 이러한 DNA 결합 단백질은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 DNA 결합 단백질은 자연 발생의 것일 수 있다. 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 DNA 결합 단백질은 본원에서 가이드 RNA로 지칭되는 RNA에 의해 가이드될 수 있는 것들을 포함한다. 이러한 측면에 따르면, 가이드 RNA와 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질은 DNA에서 공동-국재화 복합체를 형성한다. 특정 측면에 따르면, DNA 결합 단백질은 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질일 수 있다. 이러한 측면에 따르면, 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 결합 단백질의 변경 또는 변형으로부터 생성될 수 있다. 뉴클레아제 활성을 갖는 이러한 DNA 결합 단백질은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어 유형 II CRISPR 시스템으로 존재하는, Cas9 단백질과 같은, 뉴클레아제 활성을 갖는 자연 발생 DNA 결합 단백질을 포함한다. 이러한 Cas9 단백질 및 유형 II CRISPR 시스템은 관련 기술분야에 널리 문헌화되어 있다. 모든 보충 정보를 포함하여 문헌 [Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 DNA 결합 단백질은 이중 가닥 DNA를 닉킹하거나 컷팅하는 기능을 한다. 이러한 뉴클레아제 활성은 뉴클레아제 활성을 나타내는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 갖는 DNA 결합 단백질로부터 생성될 수 있다. 이러한 예시적인 DNA 결합 단백질은, 각각 이중 가닥 DNA의 특정한 가닥을 컷팅 또는 닉킹하는 역할을 하는 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인을 가질 수 있다. 뉴클레아제 활성을 갖는 예시적인 폴리펩티드 서열은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, McrA-HNH 뉴클레아제 관련 도메인 및 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 따라서, 예시적인 DNA 결합 단백질은 자연적으로 하나 이상의 McrA-HNH 뉴클레아제 관련 도메인 및 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 것들이다. 특정 측면에 따르면, DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 활성이 불활성화되도록 변경되거나 달리 변형된다. 이러한 변경 또는 변형은 뉴클레아제 활성 또는 뉴클레아제 도메인을 불활성화시키기 위해 하나 이상의 아미노산을 변경시키는 것을 포함한다. 이러한 변형은 뉴클레아제 활성을 나타내는 폴리펩티드 서열 또는 폴리펩티드 서열들, 즉 뉴클레아제 도메인이 DNA 결합 단백질에 부재하도록, 뉴클레아제 활성을 나타내는 폴리펩티드 서열 또는 폴리펩티드 서열들, 즉 뉴클레아제 도메인을 제거하는 것을 포함한다. 뉴클레아제 활성을 불활성화시키기 위한 다른 변형은 본 개시내용을 기초로 하여 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 따라서, 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 활성이 불활성화되도록 변형된 폴리펩티드 서열, 또는 뉴클레아제 활성을 불활성화시키기 위한 폴리펩티드 서열 또는 서열들의 제거를 포함한다. 뉴클레아제-기능부재 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 활성이 불활성화되었더라도 DNA에 결합하는 능력을 유지한다. 따라서, DNA 결합 단백질은 DNA 결합에 요구되는 폴리펩티드 서열 또는 서열들을 포함하지만, 뉴클레아제 활성을 나타내는 하나 이상의 또는 모든 뉴클레아제 서열이 결여될 수 있다. 따라서, DNA 결합 단백질은 DNA 결합에 요구되는 폴리펩티드 서열 또는 서열들을 포함하지만, 불활성화된 뉴클레아제 활성을 나타내는 하나 이상의 또는 모든 뉴클레아제 서열을 가질 수 있다.
한 측면에 따르면, 2개 이상의 뉴클레아제 도메인을 갖는 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 도메인 전부가 아닌 그 중 하나가 불활성화되도록 변형 또는 변경될 수 있다. 이러한 변형 또는 변경된 DNA 결합 단백질은, DNA 결합 단백질이 이중 가닥 DNA의 단 1개의 가닥만을 컷팅 또는 닉킹하는 정도까지, DNA 결합 단백질 닉카제로 지칭된다. RNA에 의해 DNA로 가이드되는 경우에, DNA 결합 단백질 닉카제는 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제로 지칭된다.
예시적인 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제 활성이 결여된 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질이다. 예시적인 DNA 결합 단백질은 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질이다. 예시적인 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질 닉카제다.
에스. 피오게네스에서, Cas9는 단백질에서 2개의 촉매 도메인 (DNA의 상보적 가닥을 절단하는 HNH 도메인 및 비-상보적 가닥을 절단하는 RuvC-유사 도메인)에 의해 매개되는 과정을 통해 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)의 3bp 상류에서 평활-말단 이중-가닥 파괴를 생성한다. 문헌 [Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012)]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Cas9 단백질은 문헌 [Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477]에 대한 보충 정보에서 확인되는 하기 것들을 비롯하여 다수의 유형 II CRISPR 시스템으로 존재하는 것으로 공지되어 있다: 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis) C7; 코리네박테리움 디프테라이에(Corynebacterium diphtheriae); 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens) YS-314; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 키타사토(Kitasato); 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 빌레펠트(Bielefeld); 코리네박테리움 글루타미쿰 R; 코리네박테리움 크로펜스테티이(Corynebacterium kroppenstedtii) DSM 44385; 미코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus) ATCC 19977; 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica) IFM10152; 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) PR4; 로도코쿠스 조스티이(Rhodococcus jostii) RHA1; 로도코쿠스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) B4 uid36573; 아시도테르무스 셀룰롤리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11B; 아르트로박터 클로로페놀리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6; 크리벨라 플라비다(Kribbella flavida) DSM 17836 uid43465; 써모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata) DSM 43183; 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium) Bd1; 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) DJO10A; 슬라키아 헬리오트리니레두센스(Slackia heliotrinireducens) DSM 20476; 페르세포넬라 마리나(Persephonella marina) EX H1; 박테리오데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) NCTC 9434; 카프노시토파가 오크라세아(Capnocytophaga ochracea) DSM 7271; 플라보박테리움 사이크로필룸(Flavobacterium psychrophilum) JIP02 86; 악케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila) ATCC BAA 835; 로세이플렉수스 카스텐홀치이(Roseiflexus castenholzii) DSM 13941; 로세이플렉수스(Roseiflexus) RS1; 시네코시스티스(Synechocystis) PCC6803; 엘루시미크로비움 미누툼(Elusimicrobium minutum) Pei191; 비배양된 흰개미 군 1 박테리아 계통형 Rs D17; 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes) S85; 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 10987; 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua); 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei); 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) GG; 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) UCC118; 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae) A909; 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 NEM316; 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 2603; 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에 에퀴시밀리스(Streptococcus dysgalactiae equisimilis) GGS 124; 스트렙토코쿠스 에퀴 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus) MGCS10565; 스트렙토코쿠스 갈롤리티쿠스(Streptococcus gallolyticus) UCN34 uid46061; 스트렙토코쿠스 고르도니이 칼리스(Streptococcus gordonii Challis) subst CH1; 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) NN2025 uid46353; 스트렙토코쿠스 뮤탄스; 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) M1 GAS; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS5005; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS2096; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS9429; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10270; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS6180; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS315; 스트렙토코쿠스 피오게네스 SSI-1; 스트렙토코쿠스 피오게네스 MGAS10750; 스트렙토코쿠스 피오게네스 NZ131; 스트렙토코쿠스 써모필레스(Streptococcus thermophiles) CNRZ1066; 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMD-9; 스트렙토코쿠스 써모필레스 LMG 18311; 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) A3 로크 마리(Loch Maree); 클로스트리디움 보툴리눔 B 에클룬드(Eklund) 17B; 클로스트리디움 보툴리눔 Ba4 657; 클로스트리디움 보툴리눔 F 랑겔란드(Langeland); 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum) H10; 피네골디아 마그나(Finegoldia magna) ATCC 29328; 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale) ATCC 33656; 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum); 미코플라스마 모빌레(Mycoplasma mobile) 163K; 미코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans); 미코플라스마 시노비아에(Mycoplasma synoviae) 53; 스트렙토바실루스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis) DSM 12112; 브라디리조비움(Bradyrhizobium) BTAi1; 니트로박터 함부르겐시스(Nitrobacter hamburgensis) X14; 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) BisB18; 로도슈도모나스 팔루스트리스 BisB5; 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans) DS-1; 디노로세오박터 쉬바에(Dinoroseobacter shibae) DFL 12; 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) Pal 5 FAPERJ; 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) Pal 5 JGI; 아조스피릴룸(Azospirillum) B510 uid46085; 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum) ATCC 11170; 디아포로박터(Diaphorobacter) TPSY uid29975; 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae) EF01-2; 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides) 053442; 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides) 알파14; 네이세리아 메닌기티데스 Z2491; 데술포비브리오 살렉시겐스(Desulfovibrio salexigens) DSM 2638; 캄필로박터 제주니 도일레이(Campylobacter jejuni doylei) 269 97; 캄필로박터 제주니 81116; 캄필로박터 제주니; 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) RM2100; 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus); 월리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes); 톨루모나스 아우엔시스(Tolumonas auensis) DSM 9187; 슈도알테로모나스 아틀란티카(Pseudoalteromonas atlantica) T6c; 슈와넬라 페알레아나(Shewanella pealeana) ATCC 700345; 레지오넬라 뉴모필라 파리(Legionella pneumophila Paris); 악티노바실루스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 130Z; 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida); 프란시셀라 툴라렌시스 노비시다(Francisella tularensis novicida) U112; 프란시셀라 툴라렌시스 홀라르크티카(Francisella tularensis holarctica); 프란시셀라 툴라렌시스 FSC 198; 프란시셀라 툴라렌시스 툴라렌시스; 프란시셀라 툴라렌시스 WY96-3418; 및 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola) ATCC 35405. 따라서, 본 개시내용의 측면은 본원에 기재된 바와 같이 뉴클레아제 기능부재된 또는 닉카제가 된 유형 II CRISPR 시스템으로 존재하는 Cas9 단백질에 관한 것이다.
Cas9 단백질은 통상의 기술자에 의해 문헌에서 Csn1로서 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 실험의 대상인 에스. 피오게네스 Cas9 단백질 서열이 하기 제시된다. 문헌 [Deltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Figure 112021084968259-pat00001
본원에 기재된 RNA-가이드된 게놈 조절의 방법의 특정 측면에 따르면, Cas9는 뉴클레아제 활성이 감소되거나, 실질적으로 감소되거나 또는 제거되도록 변경된다. 한 측면에 따르면, Cas9 뉴클레아제 활성은 RuvC 뉴클레아제 도메인 또는 HNH 뉴클레아제 도메인의 변경에 의해 감소되거나, 실질적으로 감소되거나 또는 제거된다. 한 측면에 따르면, RuvC 뉴클레아제 도메인은 불활성화된다. 한 측면에 따르면, HNH 뉴클레아제 도메인은 불활성화된다. 한 측면에 따르면, RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인은 불활성화된다. 추가의 측면에 따르면, RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인이 불활성화된 Cas9 단백질이 제공된다. 추가의 측면에 따르면, RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인이 불활성화되어 있는 한, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질이 제공된다. 추가의 측면에 따르면, RuvC 뉴클레아제 도메인 또는 HNH 뉴클레아제 도메인 중 어느 하나가 불활성화되어 뉴클레아제 활성에 대한 뉴클레아제 도메인 활성이 유지되고 있는 Cas9 닉카제가 제공된다. 이러한 방식으로, 이중 가닥 DNA 중 단지 1개의 가닥만이 컷팅 또는 닉킹된다.
추가의 측면에 따르면, Cas9에서 1개 이상의 아미노산이 변경되거나 달리 제거되어 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질을 제공하는, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질이 제공된다. 한 측면에 따르면, 아미노산은 D10 및 H840을 포함한다. 문헌 [Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012)]을 참조한다. 추가의 측면에 따르면, 아미노산은 D839 및 N863을 포함한다. 한 측면에 따르면, D10, H840, D839 및 H863 중 1개 이상 또는 모두가 뉴클레아제 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는 아미노산으로 치환된다. 한 측면에 따르면, D10, H840, D839 및 H863 중 1개 이상 또는 모두가 알라닌으로 치환된다. 한 측면에 따르면, D10, H840, D839 및 H863 중 1개 이상 또는 모두가 뉴클레아제 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는 아미노산, 예컨대 알라닌으로 치환된 Cas9 단백질은 뉴클레아제-기능부재 Cas9 또는 Cas9N으로 지칭되고, 감소 또는 제거된 뉴클레아제 활성을 나타내거나, 또는 검출 수준 내에서 뉴클레아제 활성이 부재하거나 실질적으로 부재한다. 이러한 측면에 따르면, Cas9N에 대한 뉴클레아제 활성은 공지된 검정의 이용시에 검출불가능할 수 있으며, 즉 공지된 검정의 검출 수준 미만이다.
한 측면에 따르면, 뉴클레아제 기능부재 Cas9 단백질은, DNA에 결합하고 RNA에 의해 가이드되는 단백질의 능력을 유지하는 그의 상동체 및 오르토로그를 포함한다. 한 측면에 따르면, 뉴클레아제 기능부재 Cas9 단백질은 D10, H840, D839 및 H863 중 1개 이상 또는 모두가 알라닌으로 치환된, 에스. 피오게네스로부터의 자연 발생 Cas9에 대해 제시된 서열, 및 상기 서열에 대해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 단백질 서열을 포함하며, 이는 DNA 결합 단백질, 예컨대 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질이다.
한 측면에 따르면, 뉴클레아제 기능부재 Cas9 단백질은 RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인의 단백질 서열이 제외된 에스. 피오게네스로부터의 자연 발생 Cas9에 대해 제시된 서열, 및 또한 상기 서열에 대해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는 단백질 서열을 포함하며, 이는 DNA 결합 단백질, 예컨대 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질이다. 이러한 방식으로, 본 개시내용의 측면은, DNA 결합, 예를 들어 가이드 RNA와의 공동-국재화 및 DNA에 대한 결합의 역할을 하는 단백질 서열 및 그에 상동성인 단백질 서열을 포함하며, 뉴클레아제 기능부재 Cas9 단백질을 생산하기 위해 RuvC 뉴클레아제 도메인 및 HNH 뉴클레아제 도메인은 자연 발생 Cas9 단백질의 단백질 서열로부터 불활성화 또는 제거될 수 있기 때문에, 이들 도메인에 대한 단백질 서열을 포함할 필요는 없다 (DNA 결합에 필요하지 않은 정도까지).
본 개시내용의 목적을 위해, 도 4a는 Cas9에 대한 상동성을 갖는 공지된 단백질 구조에서의 금속 배위 잔기를 도시한다. 잔기는 Cas9 서열의 위치를 기초로 표지된다. 좌측: Cas9 서열에서 D10에 상응하는 RuvC 구조, PDB ID: 4EP4 (청색) 위치 D7은 Mg-이온 배위 위치가 강조되어 있다. 중앙: 배위된 Mg-이온 (회색 구체) 및 3M7K로부터의 DNA (자주색)를 포함하는 PDB ID: 3M7K (오렌지색) 및 4H9D (시안색)로부터의 HNH 엔도뉴클레아제 도메인의 구조. Cas9 아미노산 D839 및 N863에 대한 서열 상동성을 갖는 3M7K 및 4H9D 위치 D53 및 N77에서의 잔기 D92 및 N113을 막대로 나타내었다. 우측: 제조하여 뉴클레아제 활성에 대해 분석된 돌연변이체의 목록: Cas9 야생형; D10이 알라닌으로 치환된 Cas9m1; D10이 알라닌으로, H840이 알라닌으로 치환된 Cas9m2; D10이 알라닌으로, H840이 알라닌으로, D839가 알라닌으로 치환된 Cas9m3; 및 D10이 알라닌으로, H840이 알라닌으로, D839가 알라닌으로, N863이 알라닌으로 치환된 Cas9m4.
도 4b에 나타낸 바와 같이, Cas9 돌연변이체: m3 및 m4, 및 또한 VP64와의 그의 각각의 융합체는 표적화된 유전자좌에서 심층 서열분석시에 검출불가능한 뉴클레아제 활성을 나타내었다. 플롯은 게놈 위치에 대한 돌연변이 빈도를 보여주며, 여기서 적색 선은 gRNA 표적과의 경계이다. 도 4c는 도 4b에서의 데이터의 보다 고해상도 검사이고, 돌연변이 랜드스케이프가 비변형된 유전자좌와 대등한 프로파일을 보여준다는 것이 확인된다.
한 측면에 따르면, 뉴클레아제-기능부재 Cas9에 또는 가이드 RNA에 대한 전사 활성화 도메인의 테더링에 의해 인간 세포에서 RNA-가이드된 게놈 조절을 가능하게 하는 조작된 Cas9-gRNA 시스템이 제공된다. 본 개시내용의 한 측면에 따르면, 하나 이상의 전사 조절 단백질 또는 도메인 (상기 용어는 상호교환가능하게 사용됨)은 뉴클레아제-결핍 Cas9 또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)에 연결되거나 또는 달리 결합된다. 전사 조절 도메인은 표적화된 유전자좌에 상응한다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 전사 조절 도메인을 Cas9N에 또는 gRNA에 융합, 결합 또는 연결시킴으로써 상기 도메인을 표적화된 유전자좌에 국재화시키기 위한 방법 및 물질을 포함한다.
한 측면에 따르면, 전사 활성화가 가능한 Cas9N-융합 단백질이 제공된다. 한 측면에 따르면, VP64 활성화 도메인 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Zhang et al., Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011)] 참조)은 Cas9N의 C 말단에 연결, 융합, 결합 또는 달리 테더링된다. 한 방법에 따르면, 전사 조절 도메인은 Cas9N 단백질에 의해 표적 게놈 DNA의 부위에 제공된다. 한 방법에 따르면, 전사 조절 도메인에 융합된 Cas9N은 하나 이상의 가이드 RNA와 함께 세포 내에 제공된다. 전사 조절 도메인이 융합되어 있는 Cas9N은 표적 게놈 DNA에 또는 그 부근에 결합된다. 하나 이상의 가이드 RNA는 표적 게놈 DNA에 또는 그 부근에 결합된다. 전사 조절 도메인은 표적 유전자의 발현을 조절한다. 구체적 측면에 따르면, Cas9N-VP64 융합체는 프로모터 부근의 서열을 표적화하는 gRNA와의 조합시에 리포터 구축물의 전사를 활성화하여, RNA-가이드된 전사 활성화를 나타낸다.
한 측면에 따르면, 전사 활성화가 가능한 gRNA-융합 단백질이 제공된다. 한 측면에 따르면, VP64 활성화 도메인은 gRNA에 연결, 융합, 결합 또는 달리 테더링된다. 한 방법에 따르면, 전사 조절 도메인은 gRNA에 의해 표적 게놈 DNA의 부위에 제공된다. 한 방법에 따르면, 전사 조절 도메인에 융합된 gRNA는 Cas9N 단백질과 함께 세포 내에 제공된다. Cas9N은 표적 게놈 DNA에 또는 그 부근에 결합된다. 전사 조절 단백질 또는 도메인이 융합되어 있는 하나 이상의 가이드 RNA는 표적 게놈 DNA에 또는 그 부근에 결합된다. 전사 조절 도메인은 표적 유전자의 발현을 조절한다. 구체적 측면에 따르면, 전사 조절 도메인과 융합된 Cas9N 단백질 및 gRNA는 리포터 구축물의 전사를 활성화시켜, RNA-가이드된 전사 활성화를 나타낸다.
무작위 서열을 gRNA 내로 삽입하고 Cas9 기능에 대해 검정하여 gRNA의 어느 영역이 변형에 내성을 갖는지를 확인함으로써 전사 조절이 가능한 gRNA 테더를 구축하였다. 키메라 gRNA의 crRNA 부분의 5' 말단 또는 tracrRNA 부분의 3' 말단에 무작위 서열 삽입을 보유하는 gRNA는 기능성을 유지하는 반면, 키메라 gRNA의 tracrRNA 스캐폴드 부분 내로의 삽입은 기능 상실을 일으킨다. 무작위 염기 삽입에 대한 gRNA 유연성을 요약하는 도 5a-b를 참조한다. 도 5a는 Cas9-gRNA 활성을 결정하기 위한 상동 재조합 (HR) 검정의 개략도이다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 키메라 gRNA의 crRNA 부분의 5' 말단 또는 tracrRNA 부분의 3' 말단에 무작위 서열 삽입을 보유하는 gRNA는 기능성을 유지하는 반면, 키메라 gRNA의 tracrRNA 스캐폴드 부분 내로의 삽입은 기능 상실을 일으킨다. gRNA 서열 내의 삽입 지점은 적색 뉴클레오티드에 의해 표시된다. 과학 이론에 얽매이기를 원하지 않으면서, 5' 말단에서의 무작위 염기 삽입시에 증가된 활성은 보다 긴 gRNA의 증가된 반감기로 인한 것일 수 있다.
gRNA에 VP64를 부착시키기 위해, RNA 줄기-루프에 결합하는 MS2 박테리오파지 코트-단백질의 2개 카피를 gRNA의 3' 말단에 첨부하였다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Fusco et al., Current Biology: CB13, 161-167 (2003)]을 참조한다. 이들 키메라 gRNA를 Cas9N 및 MS2-VP64 융합 단백질과 함께 발현시켰다. 리포터 구축물로부터의 서열-특이적 전사 활성화는 3가지 성분 모두의 존재 하에 관찰되었다.
도 1a는 RNA-가이드된 전사 활성화의 개략도이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 전사 활성화가 가능한 Cas9N-융합 단백질을 생성하기 위해, VP64 활성화 도메인을 직접적으로 Cas9N의 C 말단에 테더링하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 전사 활성화가 가능한 gRNA 테더를 생성하기 위해, RNA 줄기-루프에 결합하는 MS2 박테리오파지 코트-단백질의 2개 카피를 gRNA의 3' 말단에 첨부하였다. 이들 키메라 gRNA를 Cas9N 및 MS2-VP64 융합 단백질과 함께 발현시켰다. 도 1c는 전사 활성화를 검정하는데 사용된 리포터 구축물의 설계를 보여준다. 2개의 리포터는 독특한 gRNA 표적 부위를 보유하고, 대조 TALE-TF 표적 부위를 공유한다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, Cas9N-VP64 융합체는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 및 면역형광 검정 (IF) 둘 다에 의해 검정시에 RNA-가이드된 전사 활성화를 나타낸다. 구체적으로, 대조 TALE-TF는 리포터 둘 다를 활성화시킨 반면, Cas9N-VP64 융합체는 gRNA 서열 특이적 방식으로 리포터를 활성화시킨다. 도 1e에 나타낸 바와 같이, Cas9N, MS2-VP64 및 적절한 MS2 압타머 결합 부위를 보유하는 gRNA의 3개 성분 모두의 존재 하에서만 리포터 구축물로부터의 gRNA 서열-특이적 전사 활성화가 FACS 및 IF 둘 다에 의해 관찰되었다.
특정 측면에 따르면, Cas9N, 하나 이상의 gRNA 및 전사 조절 단백질 또는 도메인을 사용하여 내인성 유전자를 조절하는 방법이 제공된다. 한 측면에 따르면, 내인성 유전자는 표적 유전자로서 본원에 지칭되는 임의의 바람직한 유전자일 수 있다. 하나의 예시적인 측면에 따르면, 조절을 위한 유전자 표적은 ZFP42 (REX1) 및 POU5F1 (OCT4)을 포함하며, 이들은 둘 다 다능성의 유지에 관여하는 엄격하게 조절된 유전자이다. 도 1f에 나타낸 바와 같이, 전사 출발 부위의 DNA 상류의 ~5kb 스트레치를 표적화하는 10개의 gRNA (DNase 과민 부위를 녹색으로 강조함)를 REX1 유전자에 대해 설계하였다. 프로모터-루시페라제 리포터 구축물을 사용하여 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Takahashi et al., Cell 131 861-872 (2007)] 참조) 또는 내인성 유전자의 qPCR을 통해 직접적으로 전사 활성화를 검정하였다.
도 6a-c는 Cas9N-VP64를 사용한 RNA-가이드된 OCT4 조절에 관한 것이다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 전사 출발 부위의 DNA 상류의 ~5kb 스트레치를 표적화하는 21개의 gRNA를 OCT4 유전자에 대해 설계하였다. DNase 과민 부위는 녹색으로 강조된다. 도 6b는 프로모터-루시페라제 리포터 구축물을 사용한 전사 활성화를 보여준다. 도 6c는 내인성 유전자의 qPCR을 통한 직접적 전사 활성화를 보여준다. 개별 gRNA의 도입은 전사를 중간 정도로 자극하지만, 다중 gRNA는 상승작용적으로 작용하여 강건한 다중-배수 전사 활성화를 자극한다.
도 7a-c는 Cas9N, MS2-VP64 및 gRNA+2X-MS2 압타머를 사용한 RNA-가이드된 REX1 조절에 관한 것이다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 전사 출발 부위의 DNA 상류의 ~5kb 스트레치를 표적화하는 10개의 gRNA를 REX1 유전자에 대해 설계하였다. DNase 과민 부위는 녹색으로 강조된다. 도 7b는 프로모터-루시페라제 리포터 구축물을 사용한 전사 활성화를 보여준다. 도 7c는 내인성 유전자의 qPCR을 통한 직접적 전사 활성화를 보여준다. 개별 gRNA의 도입은 전사를 중간 정도로 자극하지만, 다중 gRNA는 상승작용적으로 작용하여 강건한 다중-배수 전사 활성화를 자극한다. 한 측면에서, gRNA에서의 2X-MS2 압타머의 부재는 전사 활성화를 일으키지 않는다. 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Maeder et al., Nature Methods 10, 243-245 (2013) 및 Perez-Pinera et al., Nature Methods 10, 239-242 (2013)]을 참조한다.
따라서, 방법은 다중 가이드 RNA와 Cas9N 단백질 및 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한 전사 조절 단백질 또는 도메인의 사용에 관련된다.
Cas9 및 gRNA 테더링 접근법은 둘 다 효과적이었고, 전자의 경우 ~1.5-2배 더 높은 효력을 나타내었다. 이러한 차이는 3-성분 복합체 어셈블리와 대조적으로 2-성분에 대한 요건으로 인한 것일 수 있다. 그러나, gRNA 테더링 접근법은 원칙적으로 각각의 gRNA가 상이한 RNA-단백질 상호작용 쌍을 사용하는 한 상이한 이펙터 도메인이 별개의 gRNA에 의해 동원되도록 할 수 있다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Karyer-Bibens et al. Biology of the Cell / Under the Auspices of the European Cell Biology Organization 100, 125- 138 (2008)]을 참조한다. 본 개시내용의 한 측면에 따르면, 다양한 표적 유전자는 특이적 가이드 RNA 및 일반적 Cas9N 단백질, 즉 다양한 표적 유전자와 동일하거나 유사한 Cas9N 단백질을 사용하여 조절될 수 있다. 한 측면에 따르면, 멀티플렉스 유전자 조절의 방법은 동일하거나 유사한 Cas9N을 사용하여 제공된다.
본 개시내용의 방법은 또한 Cas9N 단백질 및 본원에 기재된 가이드 RNA를 사용하여 표적 유전자를 편집함으로써 인간 세포의 멀티플렉스 유전적 및 후성적 조작을 제공하는 것에 관한 것이다. Cas9-gRNA 표적화를 목표로 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Jiang et al., Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조), 표적 서열 변이의 매우 큰 공간에 대한 Cas9 친화도의 심층 조사를 위한 방법이 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 dsDNA 절단 독성에 의해 도입된 복잡성 및 천연 뉴클레아제-활성 Cas9를 사용한 특이성 시험에 의해 초래된 돌연변이유발 복구를 회피하면서, 인간 세포에서의 Cas9 표적화의 직접적 고처리량 판독을 제공한다.
본 개시내용의 추가 측면은 일반적으로 표적 유전자의 전사 조절을 위한 DNA 결합 단백질 또는 시스템의 용도에 관한 것이다. 통상의 기술자는 본 개시내용을 기초로 예시적인 DNA 결합 시스템을 용이하게 확인할 것이다. 이러한 DNA 결합 시스템은 자연 발생 Cas9 단백질과 같이, 어떠한 뉴클레아제 활성도 가질 필요가 없다. 따라서, 이러한 DNA 결합 시스템은 뉴클레아제 활성을 불활성화시킬 필요가 없다. 하나의 예시적인 DNA 결합 시스템은 TALE이다. 게놈 편집 도구로서, 통상적으로 TALE-FokI 이량체가 사용되고, 게놈 조절을 위해 TAEL-VP64 융합체가 고도로 효과적인 것으로 밝혀졌다. 한 측면에 따르면, TALE 특이성을 도 2a에 나타낸 방법론을 이용하여 평가하였다. 라이브러리의 각각의 성분이 d토마토 형광 단백질을 유도하는 최소 프로모터를 포함하는 구축물 라이브러리를 설계한다. 전사 출발 부위 m의 하류에 24bp (A/C/G) 무작위 전사체 태그를 삽입하고, 2개의 TF 결합 부위를 프로모터의 상류에 위치시켰다: 하나는 모든 라이브러리 요소에 의해 공유되는 불변 DNA 서열이고, 두번째 것은 돌연변이의 많은 조합이 프로그램가능 DNA 표적화 복합체가 결합하도록 설계된 표적 서열로부터 떨어져 존재하는 서열의 다수의 집합을 포괄하도록 조작된 결합 부위의 '편재된' 라이브러리를 보유하는 가변 특징부이다. 이것은 표적 서열 뉴클레오티드가 79% 빈도로 나타나고 각각의 다른 뉴클레오티드가 7% 빈도로 발생하도록 각각의 위치에서의 뉴클레오티드 빈도를 보유하도록 조작된 축중성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 달성된다. 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Patwardhan et al., Nature Biotechnology 30, 265-270 (2012)]을 참조한다. 이어서, 리포터 라이브러리를 서열분석하여, 라이브러리 요소에서 24bp d토마토 전사체 태그와 그의 상응하는 '편재된' 표적 부위 사이의 회합을 밝혀냈다. 전사체 태그의 큰 다양성은 다양한 표적 사이의 태그의 공유가 극히 드물 것이라는 것을 보장하는 반면, 표적 서열의 편재된 구축은 소수의 돌연변이를 갖는 부위가 더 많은 돌연변이를 갖는 부위보다 더 많은 태그와 회합될 것이라는 것을 의미한다. 다음으로, d토마토 리포터 유전자의 전사가 공유된 DNA 부위에 결합하도록 조작된 대조-TF, 또는 표적 부위에 결합하도록 조작된 표적-TF로 자극된다. 각각의 발현된 전사체 태그의 존재비가 자극된 세포 상에서 RNAseq를 수행함으로써 각각의 샘플에서 측정되고, 이어서 보다 먼저 확립된 회합 표를 사용하여 그의 상응하는 결합 부위로 재맵핑한다. 대조-TF는 그의 결합 부위가 모든 라이브러리 요소에 걸쳐 공유되기 때문에 동등하게 모든 라이브러리 구성원을 여기시킬 것으로 예상되고, 반면에 표적-TF는 발현된 성분의 분포가 그에 의해 우선적으로 표적화되는 것들에 대해 치우칠 것으로 예상된다. 이러한 가정은 표적-TF에 대해 수득된 태그 카운트를 대조-TF에 대해 수득된 것들로 나눔으로써 각각의 결합 부위에 대한 정규화된 발현 수준을 계산하기 위해 단계 5에서 사용된다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, Cas9-gRNA 복합체의 표적화 랜드스케이프는 그가 평균적으로 그의 표적 서열에서 1-3개의 돌연변이에 내성이 있다는 것을 나타낸다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, Cas9-gRNA 복합체는 또한 PAM 서열에 국재화된 것들을 제외하고는 주로 점 돌연변이에 비감수성이다. 두드러지게, 이러한 데이터는 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 추정 PAM이 NGG 뿐만 아니라 NAG임을 나타낸다. 도 2d에 나타낸 바와 같이, 2개의 염기 미스매치의 도입은 Cas9-gRNA 복합체 활성을 유의하게 손상시키지만, 단지 이들이 gRNA 표적 서열의 3' 말단에 보다 가까운 8-10개의 염기에 국재화된 경우에만 그러하다 (열 플롯에서 표적 서열 위치는 5' 말단으로부터 출발하여 1-23 표지됨).
또 다른 널리 사용되는 게놈 편집 도구인, TALE 도메인의 돌연변이 내성을 본원에 기재된 전사 특이성 검정을 이용하여 결정하였다. 도 2e에 나타낸 바와 같이, 18-량체 TALE에 대한 TALE 오프-표적화 데이터는 그가 평균적으로 그의 표적 서열에서 1-2개의 돌연변이에 내성일 수 있으며, 그의 표적에서 대다수의 3개의 염기 미스매치 변이체를 활성화하는데 실패한 것을 나타낸다. 도 2f에 나타낸 바와 같이, 18-량체 TALE는 그의 표적에서 미스매치된 단일 염기에 주로 비감수성인 Cas9-gRNA 복합체와 유사하다. 도 2g에 나타낸 바와 같이, 2개의 염기 미스매치의 도입은 18-량체 TALE 활성을 유의하게 손상시킨다. TALE 활성은 그의 표적 서열의 5' 말단에 보다 가까운 미스매치에 보다 감수성이다 (열 플롯에서 표적 서열 위치는 5' 말단으로부터 출발하여 1-18 표지됨).
결과를, 다양한 크기의 TALE에 의한 표적화의 랜드스케이프를 평가하는 것에 관련된 도 10a-c의 대상인 뉴클레아제 검정으로 표적화된 실험을 이용하여 확인하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 뉴클레아제 매개 HR 검정을 이용하여, 18-량체 TALE가 그의 표적 서열에서 다중 돌연변이를 허용한다는 것을 확인하였다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, 도 2에서 기재된 접근법을 이용하여, 3가지 상이한 크기 (18-량체, 14-량체 및 10-량체)의 TALE의 표적화 랜드스케이프를 분석하였다. 보다 짧은 TALE (14-량체 및 10-량체)는 그의 표적화에서 점점 더 특이적이지만, 또한 거의 한 자릿수만큼 활성이 감소된다. 도 10c 및 10d에 나타낸 바와 같이, 10-량체 TALE는 근사 단일-염기 미스매치 해상도를 나타내며, 2개의 미스매치를 보유하는 표적에 대해 거의 모든 활성이 손실된다 (열 플롯에서 표적 서열 위치는 5' 말단에서 출발하여 1-10 표지됨). 종합하여, 이들 데이터는 보다 짧은 TALE를 조작하는 것이 게놈 조작 적용에서 보다 높은 특이성을 생성할 수 있는 반면에 TALE 뉴클레아제 적용에서의 FokI 이량체화에 대한 요건이 오프-표적 효과를 회피하는데 필수적이라는 것을 나타낸다. 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1 156-1 160 (1996) 및 Pattanayak et al., Nature Methods 8, 765-770 (2011)]을 참조한다.
도 8a-c는 실험 데이터로부터의 예로 예시된 정규화된 발현 수준의 계산을 위한 고수준 특이성 분석 프로세싱 흐름에 관한 것이다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 구축물 라이브러리는 리포터 유전자 전사체 내로 혼입될 결합 부위 서열의 편재 분포 및 무작위 서열 24bp 태그를 갖도록 생성된다 (상단). 전사된 태그는 그들이 Cas9 또는 TALE 결합 서열에 다 대 일로 맵핑되어야 하도록 고도로 축중된다. 구축물 라이브러리를 서열분석하여 (제3 수준, 좌측) 태그가 결합 부위와 공동-발생한다는 것을 확립함으로써, 결합 부위 대 전사된 태그의 회합 표를 생성하였다 (제4 수준, 좌측). 라이브러리 바코드 (여기서 담청색 및 담황색에 의해 나타냄; 수준 1-4, 좌측)를 사용하여 다양한 결합 부위에 대해 구축된 다중 구축물 라이브러리를 한 번에 서열분석할 수 있다. 이어서, 구축물 라이브러리를 세포 집단 내로 형질감염시키고, 일련의 다양한 Cas9/gRNA 또는 TALE 전사 인자를 집단의 샘플에서 유도한다 (제2 수준, 우측). 하나의 샘플은 항상 구축물 내의 고정된 결합 부위 서열 (상단 수준, 녹색 박스)에 표적화된 고정된 TALE 활성인자에 의해 유도되고; 이러한 샘플은 양성 대조군 (녹색 샘플, 또한 + 부호로 나타냄)의 역할을 한다. 이어서, 유도된 샘플에서 리포터 mRNA 분자로부터 생성된 cDNA를 서열분석하고, 샘플에서 각각의 태그에 대한 태그 카운트를 얻기 위해 분석한다 (제3 및 제4 수준, 우측). 구축물 라이브러리 서열분석과 같이, 양성 대조군을 포함하는 다중 샘플을 서열분석하고, 샘플 바코드를 첨부함으로써 함께 분석하였다. 여기서 담적색은 서열분석되고 양성 대조군 (녹색)과 함께 분석된 하나의 비-대조 샘플을 나타낸다. 각각의 리드에 구축물 결합 부위가 아닌 전사된 태그만이 나타나기 때문에, 이어서, 구축물 라이브러리 서열분석으로부터 수득한 결합 부위 대 태그 회합 표를 사용하여 각각의 샘플에서 각각의 결합 부위로부터 발현된 태그의 총 카운트를 총계한다 (제5 수준). 이어서, 각각의 비-양성 대조군 샘플에 대한 총계를 양성 대조군 샘플에서 수득한 총계로 나눔으로써 이를 각각의 결합 부위에 대한 정규화된 발현 수준으로 변환한다. 미스매치의 수에 대한 정규화된 발현 수준의 플롯의 예가 도 2b 및 2e, 및 도 9a 및 도 10b에 제공된다. 잘못된 태그에 대한, 구축물 라이브러리와 회합될 수 없는 태그에 대한, 및 다중 결합 부위와 명백히 공유된 태그에 대한 필터링의 몇몇 수준이 상기 전반적인 공정 흐름에 포함되지 않는다. 도 8b는 편재된 구축물 라이브러리 내에 생성된 미스매치의 수에 대한 결합 부위의 백분율의 예시적 분포를 도시한다. 좌측: 이론적 분포. 우측: 실제 TALE 구축물 라이브러리로부터 관찰된 분포. 도 8c는 미스매치의 수에 대한 결합 부위에 대해 집계된 태그 카운트의 백분율의 예시적 분포를 도시한다. 좌측: 양성 대조군 샘플로부터 관찰된 분포. 우측: 비-대조 TALE가 유도된 샘플로부터 관찰된 분포. 양성 대조군 TALE가 구축물 내의 고정된 부위에 결합하기 때문에, 집계된 태그 카운트의 분포는 도 8b에서의 결합 부위의 분포를 밀접하게 반영하고, 반면에 더 적은 미스매치를 갖는 부위가 더 높은 발현 수준을 유도하기 때문에 분포는 비-대조 TALE 샘플의 경우에 좌측으로 치우친다. 하단: 표적-TF에 대해 수득된 태그 카운트를 대조-TF에 대해 수득된 것으로 나눔으로써 이들 사이의 상대적 풍부화를 계산하는 것은 표적 부위에서의 돌연변이의 수에 대한 평균 발현 수준을 나타낸다.
이들 결과는 다양한 Cas9-gRNA 복합체를 사용하여 생성된 특이성 데이터에 의해 추가로 재확인된다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 다양한 Cas9-gRNA 복합체는 그의 표적 서열에서 1-3개의 돌연변이에 내성이 있다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, Cas9-gRNA 복합체는 또한 PAM 서열에 국재화된 것들을 제외하고는 주로 점 돌연변이에 대해 비감수성이다. 그러나, 도 9c에 나타낸 바와 같이, 2개의 염기 미스매치의 도입은 활성을 유의하게 손상시킨다 (열 플롯에서 표적 서열 위치는 5' 말단으로부터 출발하여 1-23 표지됨). 도 9d에 나타낸 바와 같이, 뉴클레아제 매개 HR 검정을 이용하여 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 추정 PAM이 NGG 및 또한 NAG임을 확인하였다.
특정 측면에 따르면, 결합 특이성은 본원에 기재된 방법에 따라 증가된다. 다중 복합체 사이의 상승작용은 Cas9N-VP64에 의한 표적 유전자 활성화의 요인이기 때문에, 개별 오프-표적 결합 이벤트는 최소 효과를 가져야 하고, 따라서 Cas9N의 전사 조절 적용은 자연적으로 상당히 특이적이다. 한 측면에 따르면, 오프셋 닉은 게놈-편집의 방법에 사용된다. 대다수의 닉은 드물게 NHEJ 이벤트를 일으키고 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Certo et al., Nature Methods 8, 671-676 (2011)] 참조), 따라서 오프-표적 닉킹의 효과를 최소화한다. 대조적으로, 오프셋 닉을 유도하여 이중 가닥 파괴 (DSB)를 생성하는 것은 유전자 파괴를 유도하는데 있어서 고도로 효과적이다. 특정 측면에 따르면, 5' 오버행은 3' 오버행과는 대조적으로 보다 유의한 NHEJ 이벤트를 생성한다. 유사하게, 3' 오버행은 NHEJ 이벤트에 비해 HR을 선호하지만, HR 이벤트의 총 수는 5' 오버행이 생성하는 경우보다 유의하게 더 낮다. 따라서, 상동 재조합을 위해 닉을 사용하고, 오프-표적 Cas9-gRNA 활성의 효과가 최소화되도록 이중 가닥 파괴를 생성하기 위해 오프셋 닉을 사용하는 방법이 제공된다.
도 3a-c는 멀티플렉스 오프셋 닉킹 및 가이드 RNA와의 오프-표적 결합을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 신호등 리포터를 사용하여 표적화된 닉 또는 파괴의 도입시의 HR 및 NHEJ 이벤트에 대해 동시에 검정하였다. HDR 경로를 통해 해상된 DNA 절단 이벤트는 GFP 서열을 복원하는 반면, 돌연변이유발 NHEJ는 GFP를 프레임 밖으로, 하류 m체리 서열을 프레임 내로 프레임시프트되게 한다. 검정을 위해, 센스 가닥을 표적화하는 7개 (U1-7) 및 안티센스 가닥을 표적화하는 7개 (D1-7)의, 200bp 스트레치의 DNA를 포함하는 14개의 gRNA를 설계하였다. 상보적 가닥을 닉킹하는 Cas9D 10A 돌연변이체를 사용하여, gRNA의 다양한 2-원 조합을 사용하여 다수의 프로그래밍된 5' 또는 3' 오버행을 유도하였다 (14개의 gRNA에 대한 닉킹 부위를 표시함). 도 3b에 나타낸 바와 같이, 오프셋 닉을 유도하여 이중 가닥 파괴 (DSB)를 생성하는 것은 유전자 파괴를 유도하는데 있어서 고도로 효과적이다. 두드러지게, 5' 오버행으로 이어지는 오프셋 닉은 3' 오버행과는 대조적으로 보다 많은 NHEJ 이벤트를 일으킨다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 3' 오버행의 생성은 또한 NHEJ 이벤트에 비해 HR의 비가 우세하지만, HR 이벤트의 총 수는 5' 오버행이 생성하는 경우보다 유의하게 더 낮다.
도 11a-b는 Cas9D10A 닉카제 매개 NHEJ에 관한 것이다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 신호등 리포터를 사용하여 표적화된 닉 또는 이중-가닥 파괴의 도입시의 NHEJ 이벤트를 검정하였다. 간략하게, DNA 절단 이벤트의 도입시에, 파괴가 돌연변이유발 NHEJ를 통해 진행되면, GFP는 프레임 밖으로 번역되고, 하류 m체리 서열은 프레임 내에서 적색 형광을 생성하게 된다. 센스 가닥을 표적화하는 7개 (U1-7) 및 안티센스 가닥을 표적화하는 7개 (D1-7)의, 200bp 스트레치의 DNA를 포함하는 14개의 gRNA를 설계하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 모든 표적에 걸쳐 DSB 및 강건한 NHEJ를 일으키는 야생형 Cas9와 달리, (Cas9D 10A 돌연변이체 사용시) 대부분의 닉이 드물게 NHEJ 이벤트를 일으키는 것으로 관찰되었다. 모든 14개의 부위는 DNA의 인접 200bp 스트레치 내에 위치하고, 표적화 효율에서 10배가 넘는 차이가 관찰되었다.
특정 측면에 따르면, 1개 이상, 2개 이상 또는 다수의 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 세포에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법이 본원에 기재된다. 세포 내로 도입된 외래 핵산은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 또는 단백질들, 및 전사 조절 단백질 또는 도메인을 코딩한다. 함께, 가이드 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인은 공동-국재화 복합체로서 지칭되며, 상기 용어는 가이드 RNA, 뉴클레아제-기능부재 Cas9 단백질 및 전사 조절 단백질 또는 도메인이 DNA에 결합하고 표적 핵산의 발현을 조절한다는 정도로 통상의 기술자에 의해 이해된다. 특정의 추가의 측면에 따르면, 세포 내로 도입된 외래 핵산은 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들 및 Cas9 단백질 닉카제를 코딩한다. 함께, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질 닉카제는 공동-국재화 복합체로서 지칭되며, 상기 용어는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질 닉카제가 DNA에 결합하고 표적 핵산을 닉킹한다는 정도로 통상의 기술자에 의해 이해된다.
본 개시내용에 따른 세포는 외래 핵산이 본원에 기재된 바와 같이 도입되고 발현될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 본원에 기재된 본 개시내용의 기본 개념은 세포 유형에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용에 따른 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 동물 세포, 식물 세포, 진균 세포, 고세균 세포, 유박테리아 세포 등을 포함한다. 세포는 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 식물 세포 및 동물 세포를 포함한다. 특정한 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 또한, 세포는 표적 핵산을 조절하는데 유익하거나 바람직한 임의의 것을 포함한다. 이러한 세포는 질환 또는 유해 상태를 유발하는 특정한 단백질의 발현이 결핍된 것들을 포함할 수 있다. 이러한 질환 또는 유해 상태는 통상의 기술자에게 용이하게 공지되어 있다. 본 개시내용에 따르면, 특정한 단백질의 발현에 원인이 되는 핵산은, 표적 핵산 및 특정한 단백질의 상응하는 발현의 상향조절이 일어나도록 본원에 기재된 방법 및 전사 활성인자에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 방법은 치유적 치료를 제공한다.
표적 핵산은, 본원에 기재된 바와 같은 공동-국재화 복합체가 조절 또는 닉킹에 유용할 수 있는 임의의 핵산 서열을 포함한다. 표적 핵산은 유전자를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, DNA, 예컨대 이중 가닥 DNA는 표적 핵산을 포함할 수 있고, 공동-국재화 복합체는 표적 핵산에서 또는 그에 인접하여 또는 그 부근에서 공동-국재화 복합체가 표적 핵산에 대해 바람직한 효과를 가질 수 있는 방식으로 DNA에 결합할 수 있거나, 또는 그와 달리 공동-국재화될 수 있다. 이러한 표적 핵산은 내인성 (또는 자연 발생) 핵산 및 외인성 (또는 외래) 핵산을 포함할 수 있다. 본 개시내용을 기초로 하여 통상의 기술자는 표적 핵산을 포함하는 DNA에 공동-국재화되는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 용이하게 확인 또는 설계할 수 있을 것이다. 통상의 기술자는 또한, 마찬가지로 표적 핵산을 포함하는 DNA에 공동-국재화되는 전사 조절 단백질 또는 도메인을 확인할 수 있을 것이다. DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA를 포함한다.
외래 핵산 (즉, 세포의 천연 핵산 조성물의 부분이 아닌 것들)이, 이러한 도입에 대해 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 형질감염, 형질도입, 바이러스 형질도입, 미세주사, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 나노입자 포격, 형질전환, 접합 등을 포함한다. 통상의 기술자는 용이하게 확인가능한 문헌 공급원을 이용하여 이러한 방법을 용이하게 이해하고 적합화할 것이다.
전사 활성인자인 전사 조절 단백질 또는 도메인은 VP16 및 VP64, 및 본 개시내용을 기초로 하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인가능한 다른 것들을 포함한다.
질환 및 유해 상태는 특정한 단백질의 발현의 비정상적 손실을 특징으로 하는 것들이다. 이러한 질환 또는 유해 상태는 특정한 단백질의 상향조절로 치료될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 공동-국재화 복합체가 표적 핵산을 포함하는 DNA에 회합 또는 달리 결합되고, 공동-국재화 복합체의 전사 활성인자가 표적 핵산의 발현을 상향조절하는 것인, 질환 또는 유해 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 예를 들어, PRDM16 및 갈색 지방 분화를 촉진하고 대사 섭취를 증가시키는 다른 유전자의 상향조절이 대사 증후군 또는 비만을 치료하는데 사용될 수 있다. 항염증 유전자의 활성화는 자가면역 및 심혈관 질환에 유용하다. 종양 억제 유전자의 활성화는 암의 치료에 유용하다. 통상의 기술자는 본 개시내용을 기초로 하여 이러한 질환 및 유해 상태를 용이하게 확인할 것이다.
하기 실시예는 본 개시내용을 대표하는 것으로서 제시된다. 이들 실시양태 및 다른 등가의 실시양태가 본 개시내용, 도면 및 첨부된 청구범위의 관점에서 명백할 것이기 때문에, 이들 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 I
Cas9 돌연변이체
기지의 구조를 갖는 Cas9에 상동성인 서열을 검색하여, 그의 RuvC 및 HNH 도메인의 본래의 활성을 제거할 수 있는 Cas9에서의 후보 돌연변이를 확인하였다. HHpred (www.toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)를 이용하여, Cas9의 전체 서열을 전체 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) (January 2013)와 대조하여 조회하였다. 다시, Cas9의 HNH 도메인에 대해 유의한 서열 상동성을 갖는 2종의 상이한 HNH 엔도뉴클레아제인 PacI 및 추정 엔도뉴클레아제 (각각 PDB ID: 3M7K 및 4H9D)를 검색하였다. 이들 단백질을, 마그네슘 이온 배위에 관여하는 잔기를 찾기 위해 조사하였다. 이어서, 상응하는 잔기를 Cas9에 대한 서열 정렬에서 확인하였다. Cas9의 동일한 아미노산 유형에 대해 정렬된 각각의 구조 내에서 2개의 Mg-배위 측쇄가 확인되었다. 이들은 3M7K D92 및 N113, 및 4H9D D53 및 N77이다. 이들 잔기는 Cas9 D839 및 N863에 상응하였다. 또한, PacI 잔기 D92 및 N113의 알라닌으로의 돌연변이가 뉴클레아제를 촉매작용이 결여되도록 만든다고 보고되었다. 이러한 분석에 기초하여 Cas9 돌연변이 D839A 및 N863A를 만들었다. 또한, HHpred는 Cas9와 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) RuvC (PDB ID: 4EP4)의 N-말단 사이의 상동성을 예측하기도 한다. 이러한 서열 정렬은 Cas9에서 RuvC 도메인의 기능을 제거한 이전의 보고된 돌연변이 D10A를 포함한다. 이것이 적절한 돌연변이인지 확인하기 위해, 금속 결합 잔기를 이전과 같이 결정하였다. 4EP4에서, D7은 마그네슘 이온의 배위를 돕는다. 이 위치가 Cas9 D10에 상응하는 서열 상동성을 가지므로, 이러한 돌연변이가 금속 결합의 제거를 도와, Cas9 RuvC 도메인으로부터의 촉매 활성을 제거한다는 것을 확인하였다.
실시예 II
플라스미드 구축
Cas9 돌연변이체를 퀵체인지(Quikchange) 키트 (애질런트 테크놀로지스(Agilent technologies))를 사용하여 제조하였다. 표적 gRNA 발현 구축물은 (1) IDT로부터 개별 지블록(gBlock)으로 직접 주문하여 pCR-BluntII-TOPO 벡터 (인비트로젠(Invitrogen))에 클로닝한 것이거나; 또는 (2) 진위즈(Genewiz)에 의해 주문 합성된 것이거나; 또는 (3) 올리고뉴클레오티드의 깁슨(Gibson) 어셈블리를 사용하여 gRNA 클로닝 벡터 (플라스미드 #41824)에 어셈블리된 것이다. 붕괴된 GFP가 수반되는 HR 리포터 검정에 사용하기 위한 벡터를, 정지 코돈을 보유하는 GFP 서열과 애드진(Addgene)으로부터의 EGIP 렌티벡터 (플라스미드 #26777)에 어셈블리된 적절한 단편의 융합 PCR 어셈블리에 의해 구축하였다. 이어서, 이러한 렌티벡터를 사용하여 GFP 리포터 안정한 라인을 확립하였다. 이 연구에서 사용되는 TALEN은 표준 프로토콜을 이용하여 구축하였다. 본원에 그 전문이 참조로 포함된 문헌 [Sanjana et al., Nature Protocols 7, 171-192 (2012)]을 참조한다. 표준 PCR 융합 프로토콜 절차를 이용하여 Cas9N과 MS2 VP64를 융합시켰다. OCT4 및 REX1에 대한 프로모터 루시페라제 구축물 (플라스미드 #17221 및 플라스미드 #17222)을 애드진으로부터 입수하였다.
실시예 III
세포 배양 및 형질감염
HEK 293T 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS, 인비트로젠), 페니실린/스트렙토마이신 (pen/strep, 인비트로젠), 및 비-필수 아미노산 (NEAA, 인비트로젠)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM, 인비트로젠) 고 글루코스에서 배양하였다. 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다.
뉴클레아제 검정에 수반되는 형질감염은 다음과 같다: 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 0.4 x 106개 세포를 2μg Cas9 플라스미드, 2μg gRNA 및/또는 2μg DNA 공여자 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 3일 후에 세포를 수거하여, FACS에 의해 분석하거나, 또는 게놈 절단물의 직접 검정을 위해 DNAeasy 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 ~1 X 106개 세포의 게놈 DNA를 추출하였다. 이러한 경우, 세포로부터 유래된 게놈 DNA로 PCR을 수행하여 표적화 영역을 증폭시키고, 앰플리콘을 MiSeq 퍼스널 시퀀서(MiSeq Personal Sequencer) (일루미나(Illumina))에 의해 유효범위 >200,000개 판독물로 심층 서열분석하였다. 이러한 서열분석 데이터를 분석하여 NHEJ 효율을 추정하였다.
전사 활성화 검정에 수반되는 형질감염의 경우: 0.4 x 106개 세포를 (1) 2μg Cas9N-VP64 플라스미드, 2μg gRNA 및/또는 0.25μg의 리포터 구축물; 또는 (2) 2μg Cas9N 플라스미드, 2μg MS2-VP64, 2μg gRNA-2XMS2압타머 및/또는 0.25μg의 리포터 구축물로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 24-48시간 후에 세포를 수거하여, FACS 또는 면역형광 방법을 이용하여 검정하거나, 또는 그의 전체 RNA를 추출하고, 이후에 RT-PCR에 의해 분석하였다. 여기서 OCT4 및 REX1에 대한 표준 택맨(taqman) 프로브 (인비트로젠)가 사용되었으며, 각 샘플을 GAPDH에 대해 정규화하였다.
Cas9-gRNA 복합체 및 TALE의 특이성 프로파일에 대한 전사 활성화 검정에 수반되는 형질감염의 경우: 0.4 x 106개 세포를 (1) 2μg Cas9N-VP64 플라스미드, 2μg gRNA 및 0.25μg의 리포터 라이브러리; 또는 (2) 2μg TALE-TF 플라스미드 및 0.25μg의 리포터 라이브러리; 또는 (3) 2μg 대조-TF 플라스미드 및 0.25μg의 리포터 라이브러리로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 24시간 후에 (리포터의 자극이 포화 모드가 되는 것을 피하기 위함) 세포를 수거하였다. RNAeasy-플러스 키트 (퀴아젠)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 슈퍼스크립트(Superscript)-III (인비트로젠)을 사용하여 표준 RT-pcr을 수행하였다. 전사체-태그의 표적화된 pcr 증폭에 의해 차세대 서열분석을 위한 라이브러리가 생성되었다.
실시예 IV
Cas9-TF 및 TALE-TF 리포터 발현 수준의 계산을 위한 전산 및 서열 분석
이러한 과정을 위한 고수준 논리 흐름도가 도 8a에 도시되고, 추가의 세부사항이 여기에 제시된다. 구축물 라이브러리 조성에 대한 세부사항은, 도 8a (레벨 1) 및 8b를 참조한다.
서열분석: Cas9 실험의 경우, 구축물 라이브러리 (도 8a, 레벨 3, 좌측) 및 리포터 유전자 cDNA 서열 (도 8a, 레벨 3, 우측)을 일루미나 MiSeq 상에서 150bp 중첩 쌍형성된 말단 판독물로서 수득하고, TALE 실험의 경우, 상응하는 서열을 일루미나 HiSeq 상에서 51bp 비-중첩 쌍형성된 말단 판독물로서 수득하였다.
구축물 라이브러리 서열 처리: 정렬: Cas9 실험의 경우, 노보얼라인(novoalign) V2.07.17 (www.novocraft.com/main/index/php)을 이용하여, 8bp 라이브러리 바코드의 쌍에 의해 플랭킹된 234bp의 구축물에 상응하는 250bp 참조 서열의 세트에 대해 쌍형성된 판독물을 정렬시켰다 (도 8a, 제3 레벨, 좌측 참조). 노보얼라인에 제공된 참조 서열에는, 구축물 라이브러리 바코드가 명확하게 제시되면서 23bp 축중성 Cas9 결합 부위 영역 및 24bp 축중성 전사체 태그 영역 (도 8a, 제1 레벨 참조)이 N으로 명시되어 있다. TALE 실험의 경우, 참조 서열의 길이가 203bp이고, 축중성 결합 부위 영역의 길이가 18bp 대 23bp인 것을 제외하고 동일한 절차를 이용하였다. 유효성 검사: 각각의 판독물 쌍에 대한 좌측 및 우측 판독물이 참조 서열에 대해 개별적으로 정렬되도록 구성된 파일에 대한 노보얼라인 결과. 둘 모두가 참조 서열에 대해 특유하게 정렬된 판독물 쌍만이 추가의 유효성 조건에 적용되었으며, 이러한 모든 조건을 통과한 판독물 쌍만을 남겨두었다. 유효성 조건은 다음을 포함하였다:
(i) 2개의 구축물 라이브러리 바코드는 각각 참조 서열 바코드에 대해 적어도 4군데 위치에서 정렬되어야 하고, 2개의 바코드는 동일한 구축물 라이브러리에 대한 바코드 쌍에 대해 정렬되어야 한다.
(ii) 참조 서열의 N 영역에 대해 정렬된 모든 염기는 노보얼라인에 의해 A, C, G 또는 T로 지명되어야 한다. Cas9 실험 뿐만 아니라 TALE 실험에서도 좌측 및 우측 판독물이 참조 N 영역에서 중첩되지 않았으며, 이에 따라 이러한 N 염기가 노보얼라인에 의해 불분명하게 지명될 가능성이 발생하지 않았다는 점을 주목한다. (iii) 마찬가지로, 노보얼라인-지명된 삽입부 또는 결실부가 이들 영역에서 나타나지 않아야 한다. (iv) (이러한 무작위 서열은 오직 A, C, 및 G로부터 생성되므로) T가 전사체 태그 영역에서 나타나지 않아야 한다. 이러한 조건 중 어느 하나를 위반하는 판독물 쌍을 불합격 판독물 쌍 파일에 수집하였다. 이러한 유효성 검사를 주문형 perl 스크립트를 사용하여 시행하였다.
유도된 샘플 리포터 유전자 cDNA 서열 처리: 정렬: 먼저 SeqPrep (www.github.com/jstjohn/SeqPrep로부터 다운로드됨)을 사용하여 중첩 판독물 쌍을 79bp 공통 절편에 병합시킨 후에, 노보얼라인 (상기 버전)을 사용하여 이들 79bp 공통 절편들을, (구축물 라이브러리 서열분석의 경우) 샘플 바코드가 명확하게 제시되면서 24bp 축중성 전사체 태그가 N으로 명시된 참조 서열의 세트에 대해 쌍형성되지 않은 단일 판독물로서 정렬시켰다 (도 8a, 제3 레벨, 우측 참조). TALE 및 Cas9 cDNA 서열 영역은 둘 다 8bp 샘플 바코드 서열의 쌍에 의해 플랭킹된 cDNA의 동일한 63bp 영역에 상응하였다. 유효성 검사: 하기를 제외한 동일한 조건이 구축물 라이브러리 서열분석에 적용되었다 (상기 참조): (a) 여기서, 판독물 쌍의 이전의 SeqPrep 병합으로 인해, 유효성 처리는 판독물 쌍 내의 두 판독물의 특유한 정렬을 필터링하는 것이 아니라 오직 병합된 판독물의 특유한 정렬을 필터링해야 한다. (b) 유효성 처리가 오직 참조 서열의 전사체 태그 영역에만 적용되고, 별도의 결합 부위 영역에는 적용되지 않도록, 오직 전사체 태그만이 cDNA 서열 판독물에서 나타나야 한다.
결합 부위 대 전사체 태그 회합의 표의 어셈블리: 주문형 perl을 사용하여, 유효 구축물 라이브러리 서열로부터 상기 표를 작성하였다 (도 8a, 제4 레벨, 좌측). A, C, 및 G 염기로 구성된 24bp 태그 서열은 구축물 라이브러리의 전반에 걸쳐 본질적으로 특유해야 하지만 (공유 확률 = ~2.8e-11), 결합 부위 대 태그 회합의 초기 분석에서 태그 서열의 무시할 수 없는 분획이 실제로 다중 결합 서열에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 아마도 주로 결합 서열에서의 서열 오류, 또는 구축물 라이브러리를 생성하는데 사용되는 올리고에서의 올리고 합성 오류의 조합에 의해 유발된 것일 것이다. 태그 공유에 더하여, 유효 판독물 쌍에서 결합 부위와 회합되어 발견되는 태그는 바코드 미스매치로 인해 이들이 어느 구축물 라이브러리로부터 유래된 것인지 분명하지 않은 경우에 구축물 라이브러리 판독물 쌍 불합격 파일에서 발견될 수도 있을 것이다. 마지막으로, 태그 서열은 그 자체가 서열 오류를 함유할 수 있다. 이러한 에러의 근원을 처리하기 위해, 태그를 3가지 속성으로 분류하였다: (i) 안전 대 불안, 여기서 불안은 태그가 구축물 라이브러리 불합격 판독물 쌍 파일에서 발견될 수 있음을 의미한다; 공유 대 비공유, 여기서 공유는 태그가 다중 결합 부위 서열과 회합되어 발견되었다는 것을 의미한다; 및 2+ 대 1-유일, 여기서 2+는 태그가 유효 구축물 라이브러리 서열 가운데서 적어도 2회 나타나고, 이에 따라 서열 오류를 함유할 가능성이 더 작은 것으로 간주됨을 의미한다. 이러한 3가지 기준을 조합하여, 각 결합 부위와 회합된 태그의 8가지 클래스를 만들었다: 가장 많이 안전한 (그러나 가장 덜 풍부한) 클래스는 오직 안전, 비공유, 2+ 태그만을 포함하고, 가장 덜 안전한 (그러나 가장 많이 풍부한) 클래스는 안전성, 공유여부, 또는 발생 횟수에 관계없이 모든 태그를 포함한다.
정규화된 발현 수준의 계산: 주문형 perl 코드를 사용하여 도 8a, 레벨 5-6에 지시된 단계를 시행하였다. 먼저, 각각의 유도된 샘플에서 수득한 태그 수를, 구축물 라이브러리에 대하여 이전에 계산된 결합 부위 대 전사체 태그 표를 사용하여 각 결합 부위에 대해 집계하였다 (도 8c 참조). 이어서, 각 샘플에 대하여, 각 결합 부위에 대해 집계된 태그 수를 양성 대조군 샘플에 대해 집계된 태그 수로 나누어, 정규화된 발현 수준을 생성하였다. 이러한 계산과 관련된 추가의 고려사항은 다음을 포함한다:
1. 각 샘플에서, 유효성-검사된 cDNA 유전자 서열 가운데서 결합 부위 대 전사체 태그 회합 표에서 찾아볼 수 없었던 "신규" 태그의 하위세트가 발견되었다. 이러한 태그는 후속 계산에서 무시하였다.
2. 결합 부위 대 전사체 태그 회합 표에 상기 기재된 태그의 8개 클래스 각각에 대하여 상기 기재된 태그 수의 집계를 수행하였다. 구축물 라이브러리 내의 결합 부위가 중앙 서열에 유사한 서열은 빈번하게 생성하지만, 증가하는 개수의 미스매치를 갖는 서열은 점점 더 드물게 생성하는 편재성을 나타내기 때문에, 소수의 미스매치를 갖는 결합 부위는 일반적으로 태그의 큰 수로 집계되는 한편, 보다 많은 미스매치를 갖는 결합 부위는 보다 적은 수로 집계된다. 따라서, 일반적으로는 가장 안전한 태그 클래스의 사용이 바람직할 수 있으나, 2개 이상의 미스매치를 갖는 결합 부위의 평가는 결합 부위당 적은 수의 태그에 기초할 수 있을 것이며, 이로 인해 안전한 수 및 비는, 태그 그 자체는 보다 더 신뢰할만하더라도, 통계적으로 보다 덜 신뢰할만하게 되었다. 이러한 경우에, 모든 태그가 사용되었다. 이러한 고려사항은, n개 미스매칭 위치에 대해 별도로 집계된 태그 수의 개수가 미스매칭 위치의 조합의 개수 (=
Figure 112021084968259-pat00002
)에 따라 상승하여, n에 따라 현저하게 증가하고; 따라서 상이한 개수(n)의 미스매치에 대해 집계된 태그 수의 평균 (도 2b, 2e, 및 도 9a 및 10b에 제시됨)은 n≥2에 대해 집계된 태그 수의 통계적으로 매우 큰 세트에 기초한다는 사실에 의거하여 약간 보정된다.
3. 마지막으로, TALE 구축물 라이브러리에 구축된 결합 부위는 18bp였고, 태그 회합은 이들 18bp 서열에 기초하여 할당되었으나, 일부 실험은 18bp 구축물 결합 부위 영역 내의 중앙 14bp 또는 10bp 영역에 결합하도록 프로그램화된 TALE를 사용하여 수행하였다. 이러한 TALE에 대한 발현 수준의 계산에서, 태그를 회합 표 내의 18bp 결합 부위의 상응하는 영역에 기초하여 결합 부위에 집합시켜, 이러한 영역 외부의 결합 부위 미스매치는 무시하였다.
실시예 V
Cas9N-VP64를 사용하는 RNA-가이드된 SOX2 및 NANOG 조절
본원에 기재된 sgRNA (압타머-변형된 단일 가이드 RNA) 테더링 접근법은 상이한 이펙터 도메인이 별개의 sgRNA에 의해 동원되는 것을 허용하며, 다만, 각각의 sgRNA는 상이한 RNA-단백질 상호작용 쌍을 사용하고, 동일한 Cas9N-단백질을 사용하는 멀티플렉스 유전자 조절을 가능하게 하는 것이다. 도 12a SOX2 및 도 12b NANOG 유전자에 대하여, 전사 개시 부위의 상류 ~1kb DNA 스트레치를 표적화하는 10개의 gRNA를 설계하였다. DNase 과민성 부위는 녹색으로 강조 표시된다. 내인성 유전자의 qPCR을 통해 전사 활성화를 검정하였다. 두 경우에, 개별 gRNA의 도입은 전사를 중간 정도로 자극하였으나, 다중 gRNA는 수-배의 강한 전사 활성화를 상승작용적으로 자극하도록 작용하였다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=3)이다. 도 12a-b에 도시된 바와 같이, 2개의 추가의 유전자, SOX2 및 NANOG는 프로모터 DNA의 상류 ~1kb 스트레치 이내를 표적화하는 sgRNA에 의해 조절되었다. 전사 개시 부위에 근접한 sgRNA가 강한 유전자 활성화를 발생시켰다.
실시예 VI
Cas9-gRNA 복합체에 의한 표적화의 랜드스케이프 평가
도 2에 기재된 접근법을 이용하여, 2개의 추가의 Cas9-gRNA 복합체 (도 13a-c) 및 (도 13d-f)의 표적화 랜드스케이프를 분석하였다. 2개의 gRNA는, gRNA2는 최대 2-3개의 미스매치를 허용하고 gRNA3은 최대 1개만을 허용하는 매우 상이한 특이성 프로파일을 갖는다. 이러한 측면은 1개의 염기 미스매치 (도 13b, 13e) 및 2개의 염기 미스매치 플롯 (도 13c, 13f) 둘 다에서 반영된다. 도 13c 및 13f에서, 데이터 디스플레이를 개선하기 위해 정규화된 발현 수준이 컬러 스케일(color scale)의 상한을 넘어서는 이상치인 미스매치 쌍을 별표 '*'가 함유된 황색 박스로 표시하면서, 정규화된 발현 수준을 계산하는데 이용가능한 데이터가 충분하지 않은 염기 미스매치 쌍을 'x'가 함유된 회색 박스로 표시한다. 통계적 유의성 기호는 다음과 같다: P<.0005/n에 대하여 ***, P<.005/n에 대하여 **, P<.05/n에 대하여 *, 및 P>=.05/n에 대하여 N.S. (비-유의함), 여기서 n은 비교물의 개수이다 (표 2 참조).
실시예 VII
확인, 리포터 검정의 특이성
도 14a-c에 도시된 바와 같이, 특이성 데이터가 2가지 상이한 sgRNA:Cas9 복합체를 사용하여 생성되었다. 상응하는 돌연변이체 sgRNA가 리포터 라이브러리를 자극하지 못하였으므로, 이 검정이 평가 대상 sgRNA에 대해 특이적임을 확인하였다. 도 14a: 2개의 gRNA (야생형 및 돌연변이체; 상이한 서열은 적색으로 강조 표시됨)의 특이성 프로파일을, 야생형 gRNA 표적 서열에 대해 설계된 리포터 라이브러리를 사용하여 평가하였다. 도 14b: 상응하는 돌연변이체 gRNA가 리포터 라이브러리를 자극하지 못하였으므로, 이 검정이 평가 대상 gRNA에 대해 특이적임을 확인하였다 (데이터는 도 13d로부터 재플롯팅됨). 통계적 유의성 기호는 다음과 같다: P<.0005/n에 대하여 ***, P<.005/n에 대하여 **, P<.05/n에 대하여 *, 및 P>=.05/n에 대하여 N.S. (비-유의함), 여기서 n은 비교물의 개수이다 (표 2 참조). 상이한 sgRNA는 상이한 특이성 프로파일을 가질 수 있으며 (도 13a, 13d), 구체적으로, sgRNA2는 최대 3개의 미스매치를 허용하고, sgRNA3은 최대 1개만을 허용한다. 다른 위치에서의 미스매치가 또한 활성에 영향을 미치는 것으로 관찰되었을지라도, 미스매치에 대한 최대의 감도는 스페이서의 3' 말단에 국한되었다.
실시예 VIII
확인, 단일 및 이중-염기 gRNA 미스매치
도 15a-d에 도시된 바와 같이, 표적화 실험에 의해, 검정된 sgRNA에서의 스페이서의 3' 말단의 12 bp 내의 단일-염기 미스매치는 검출가능한 표적화를 발생시킨다는 것을 확인하였다. 그러나, 이 영역에서의 2 bp 미스매치는 활성의 유의한 손실을 초래하였다. 뉴클레아제 검정을 이용하여, 2개의 독립된 gRNA를 시험하였다: 스페이서 서열 대 표적에서 단일 또는 이중-염기 미스매치 (적색으로 강조 표시됨)를 보유하는 gRNA2 (도 15a-b) 및 gRNA3 (도 15c-d). 검정된 gRNA에서의 스페이서의 3' 말단의 12bp 내의 단일-염기 미스매치는 검출가능한 표적화를 발생시키지만, 이 영역에서의 2bp 미스매치는 빠른 활성 손실을 초래한다는 것을 확인하였다. 이들 결과는 도 13의 결과와 일치하는, 상이한 gRNA 사이의 특이성 프로파일의 차이를 더 강조한다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=3)이다.
실시예 IX
확인, 5' gRNA 말단절단
도 16a-d에 도시된 바와 같이, 스페이서의 5' 부분에서의 말단절단은 sgRNA 활성을 유지하였다. 뉴클레아제 검정을 이용하여, 2개의 독립된 gRNA를 시험하였다: 스페이서의 5' 말단에서 말단절단된 gRNA1 (도 16a-b) 및 gRNA3 (도 16c-d). 1-3 bp의 5' 말단절단은 잘 허용되지만, 보다 큰 결실은 활성의 손실을 초래하는 것으로 관찰되었다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=3)이다.
실시예 X
확인, 에스. 피오게네스 PAM
도 17a-b에 도시된 바와 같이, 뉴클레아제 매개 HR 검정을 이용하여, 에스. 피오게네스 Cas9에 대한 PAM가 NGG이고, 또한 NAG임을 확인하였다. 데이터는 평균 +/- SEM (N=3)이다. 추가의 연구에 따르면, 표적화 서열의 마지막 13 nt를 공유하는 대안적 NGG 표적을 갖지 않는 인간 엑손에서 생성된 약 190K Cas9 표적의 세트를 대안적 NAG 부위의 존재 여부 또는 이전의 13 nt에 미스매치를 갖는 NGG 부위에 대해 스캐닝하였다. 단지 0.4%만이 이러한 대안적 표적을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 XI
확인, TALE 돌연변이
뉴클레아제 매개 HR 검정을 이용하여 (도 18a-b), 18량체 TALE가 그의 표적 서열에 다중 돌연변이를 허용한다는 것을 확인하였다. 도 18a-b에 도시된 바와 같이, 표적의 중앙부에서의 특정 돌연변이는, 뉴클레아제 검정에서 표적화된 실험을 통해 결정된 바와 같이 보다 높은 TALE 활성을 발생시켰다.
실시예 XII
TALE 단량체 특이성 대 TALE 단백질 특이성
개개의 반복부-가변성 이잔기(diresidue) (RVD)의 역할을 분리시키기 위해, RVD의 선택이 염기 특이성에 기여하였으며, 또한 TALE 특이성이 전체적으로 단백질의 결합 에너지의 함수임을 확인하였다. 도 19a-c는 TALE 단량체 특이성 대 TALE 단백질 특이성의 비교를 보여준다. 도 19a: 도 2에 기재된 접근법의 변형을 이용하여, 6개의 NI 또는 6개의 NH 반복부의 인접한 세트를 보유하는 2가지 14량체 TALE-TF의 표적화 랜드스케이프를 분석하였다. 이러한 접근법에서, 중앙부에 축중성 6량체 서열을 보유하는 리포터의 축소된 라이브러리를 만들어, TALE-TF 특이성 검정에 사용하였다. 도 19b-c: 두 경우에, 예상된 표적 서열이 풍부화된 것을 주목하였다 (즉, NI 반복부의 경우 6개의 A를 보유하고, NH 반복부의 경우 6개의 G를 보유함). 이러한 TALE는 각각 여전히 중앙의 6량체 표적 서열에 1-2개의 미스매치를 허용한다. 단량체의 선택이 염기 특이성에 기여하며, 또한 TALE 특이성은 전체적으로 단백질의 결합 에너지의 함수이다. 한 측면에 따르면, 보다 짧은 조작된 TALE 또는 고친화도 및 저친화도 단량체의 조성물을 보유하는 TALE는 게놈 조작 응용에서 보다 높은 특이성을 일으키고, 뉴클레아제 응용에서의 FokI 이량체화는 보다 짧은 TALE를 사용하는 경우에 오프-표적 영향을 더 감소시킨다.
실시예 XIII
오프셋 닉킹, 천연 유전자좌
도 20a-b는 오프셋 닉킹과 관련된 데이터를 보여준다. 게놈-편집과 관련하여, 오프셋 닉을 만들어 DSB를 생성하였다. 대다수의 닉은 비-상동 말단 접합 (NHEJ) 매개 indel을 생성하지 않으며, 이에 따라 오프셋 닉을 유도하는 경우에, 오프-표적 단일 닉 사건은 아마도 매우 낮은 indel 비율을 생성할 것이다. 오프셋 닉을 유도하여 DSB를 생성하는 것은 통합된 리포터 유전자좌 및 천연 AAVS1 게놈 유전자좌 둘 다에서 유전자 파괴를 유도하는데 효과적이다. 도 20a: 200bp DNA 스트레치를 커버하는 8개의 gRNA (4개는 센스 가닥을 표적화하고 (s1-4), 4개는 안티센스 가닥을 표적화함 (as1-4))를 갖는 천연 AAVS1 유전자좌를 표적화하였다. 상보적 가닥에 닉이 생성된 Cas9D10A 돌연변이체를 사용하여, gRNA의 다양한 2-원 조합을 이용하여 소정 범위의 프로그램화된 5' 또는 3' 오버행을 유도하였다. 도 20b: 생어(Sanger) 서열분석 기반 검정을 이용하여, 단일 gRNA는 검출가능한 NHEJ 사건을 유도하지 않는 반면에, 오프셋 닉을 유도하여 DSB를 생성하는 것은 유전자 파괴를 유도하는데 매우 효과적이라는 것을 관찰하였다. 주목할만한게, 5' 오버행을 생성하는 오프셋 닉은 3' 오버행과는 대조적으로 보다 많은 NHEJ 사건을 발생시킨다. 생어 서열분석 클론의 개수가 막대 위에 강조 표시되고, 예측되는 오버행 길이가 상응하는 x-축 범례 아래 표시된다.
실시예 XIV
오프셋 닉킹, NHEJ 프로파일
도 21a-c는 오프셋 닉킹 및 NHEJ 프로파일에 관한 것이다. 3가지 상이한 오프셋 닉킹 조합의 대표적인 생어 서열분석 결과가 박스로 강조 표시된 표적화 gRNA의 위치와 함께 제시된다. 또한, 상동 재조합 (HR) 매개 복구를 위한 표준 모델과 일치하게, 오프셋 닉을 통한 5' 오버행의 조작은 3' 오버행보다 더 강한 NHEJ 사건을 발생시켰다 (도 3b). NHEJ의 자극에 더하여, 강한 HR 유도가 5' 오버행이 생성되었을 때 관찰되었다. 3' 오버행의 생성은 HR 비율을 개선시키지 않았다 (도 3c).
실시예 XV
표 1
내인성 유전자 조절을 위한 gRNA 표적
Cas9-gRNA 매개 활성화 실험에 사용되는 REX1, OCT4, SOX2 및 NANOG 프로모터 내의 표적이 열거된다.
Figure 112021084968259-pat00003
실시예 XVI
표 2
Cas9-gRNA 및 TALE 특이성 데이터의 통계적 분석의 개요
표 2(a) 특정한 개수의 표적 부위 돌연변이를 갖는 표적 서열에 결합하는 TALE 또는 Cas9-VP64 활성화제의 정규화된 발현 수준의 비교에 대한 P-값. 정규화된 발현 수준을 도면 칼럼 내에 표시된 도면 내의 박스플롯으로 표시하였고, 여기서 박스는 표적 부위로부터의 미스매치의 개수에 대한 이들 수준의 분포를 나타낸다. P-값을 각각의 박스플롯 내의 미스매치의 각 연속적 쌍의 개수에 대한 t-테스트 (t-테스트는 1 샘플 또는 2 샘플 t-테스트임)를 이용하여 계산하였다 (방법 참조). 통계적 유의성을 본페로니(Bonferroni)-보정된 P-값 역치 (보정은 각각의 박스플롯 내의 비교물의 개수에 기초함)를 사용하여 평가하였다. 통계적 유의성 기호는 다음과 같다: P<.0005/n에 대하여 ***, P<.005/n에 대하여 **, P<.05/n에 대하여 *, 및 P>=.05/n에 대하여 N.S. (비-유의함), 여기서 n은 비교물의 개수이다. 표 2(b) 도 2d에서의 시드 영역의 통계적 특성화: 20bp 표적 부위의 3' 말단의 후보 시드 영역 내에서 돌연변이된 위치 쌍 대 모든 다른 위치 쌍에 대한, 2개의 돌연변이를 갖는 표적 서열에 결합하는 Cas9N VP64+gRNA에 대한 발현 값들 사이의 분리 정도를 나타내는 log10(P-값). 최대 -log10 (P-값) (위에 강조 표시됨)에 의해 지시되는 최대 분리가 표적 부위의 마지막 8-9bp에서 발견된다. 이들 위치는 이 표적 부위의 "시드" 영역이 시작되는 부분을 나타내는 것으로 해석될 수 있다. P-값을 계산하는 방법에 대한 정보에 대해 방법 내의 섹션 "시드 영역의 통계적 특성화"를 참조한다.
Figure 112021084968259-pat00004
실시예 XVII
실시예에서의 단백질 및 RNA의 서열
A. m4 돌연변이체를 기초로 하는 Cas9N-VP64 활성인자 구축물의 서열을 하기 나타내었다. 3개 버전을 구축하였고 Cas9m4 VP64 및 Cas9m4 VP64N 융합 단백질 포맷이 가장 높은 활성을 보여주었다. m3 및 m2 돌연변이체에 상응하는 벡터 (도 4a)를 또한 구축하였다 (
Figure 112021084968259-pat00005
도메인을 강조함).
>Cas9m4 VP64
Figure 112021084968259-pat00006
Figure 112021084968259-pat00007
Figure 112021084968259-pat00008
>Cas9m4 VP64N 서열
Figure 112021084968259-pat00009
Figure 112021084968259-pat00010
Figure 112021084968259-pat00011
>Cas9m4 VP64C
Figure 112021084968259-pat00012
Figure 112021084968259-pat00013
Figure 112021084968259-pat00014
B. MS2-활성인자 구축물의 서열, 및 2X MS2 압타머 도메인을 갖는 상응하는 gRNA 백본 벡터를 하기 제공하였다
(
Figure 112021084968259-pat00015
도메인을 강조함). 전자의 2개 버전을 구축하였고 MS2VP64N 융합 단백질 포맷이 가장 높은 활성을 보여주었다.
>MS2VP64N
Figure 112021084968259-pat00016
>MS2VP64C
Figure 112021084968259-pat00017
>gRNA2XMS2
Figure 112021084968259-pat00018
C. d토마토 형광 기반 전사 활성화 리포터 서열을 하기 열거하였다
(
Figure 112021084968259-pat00019
을 강조함).
>TF 리포터 1
Figure 112021084968259-pat00020
>TF 리포터 2
Figure 112021084968259-pat00021
D. TALE 및 Cas9-gRNA 특이성 검정에 사용된 리포터 라이브러리의 일반적 포맷을 하기 제공하였다
(
Figure 112021084968259-pat00022
Figure 112021084968259-pat00023
을 강조함).
> 특이성 리포터 라이브러리
Figure 112021084968259-pat00024
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College <120> RNA-Guided Transcriptional Regulation <130> 010498.00503 <140> PCT/US14/040868 <141> 2014-06-04 <150> US 61/830787 <151> 2013-06-04 <160> 184 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala 1010 1015 1020 Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe 1025 1030 1035 Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala 1040 1045 1050 Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu 1055 1060 1065 Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val 1070 1075 1080 Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr 1085 1090 1095 Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys 1100 1105 1110 Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro 1115 1120 1125 Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val 1130 1135 1140 Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys 1145 1150 1155 Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys 1175 1180 1185 Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu 1190 1195 1200 Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly 1205 1210 1215 Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val 1220 1225 1230 Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys 1250 1255 1260 His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys 1265 1270 1275 Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala 1280 1285 1290 Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 1295 1300 1305 Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala 1310 1315 1320 Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser 1325 1330 1335 Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr 1340 1345 1350 Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1355 1360 1365 <210> 2 <211> 4332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VP64-activator construct <400> 2 gccaccatgg acaagaagta ctccattggg ctcgctatcg gcacaaacag cgtcggctgg 60 gccgtcatta cggacgagta caaggtgccg agcaaaaaat tcaaagttct gggcaatacc 120 gatcgccaca gcataaagaa gaacctcatt ggcgccctcc tgttcgactc cggggagacg 180 gccgaagcca cgcggctcaa aagaacagca cggcgcagat atacccgcag aaagaatcgg 240 atctgctacc tgcaggagat ctttagtaat gagatggcta aggtggatga ctctttcttc 300 cataggctgg aggagtcctt tttggtggag gaggataaaa agcacgagcg ccacccaatc 360 tttggcaata tcgtggacga ggtggcgtac catgaaaagt acccaaccat atatcatctg 420 aggaagaagc ttgtagacag tactgataag gctgacttgc ggttgatcta tctcgcgctg 480 gcgcatatga tcaaatttcg gggacacttc ctcatcgagg gggacctgaa cccagacaac 540 agcgatgtcg acaaactctt tatccaactg gttcagactt acaatcagct tttcgaagag 600 aacccgatca acgcatccgg agttgacgcc aaagcaatcc tgagcgctag gctgtccaaa 660 tcccggcggc tcgaaaacct catcgcacag ctccctgggg agaagaagaa cggcctgttt 720 ggtaatctta tcgccctgtc actcgggctg acccccaact ttaaatctaa cttcgacctg 780 gccgaagatg ccaagcttca actgagcaaa gacacctacg atgatgatct cgacaatctg 840 ctggcccaga tcggcgacca gtacgcagac ctttttttgg cggcaaagaa cctgtcagac 900 gccattctgc tgagtgatat tctgcgagtg aacacggaga tcaccaaagc tccgctgagc 960 gctagtatga tcaagcgcta tgatgagcac caccaagact tgactttgct gaaggccctt 1020 gtcagacagc aactgcctga gaagtacaag gaaattttct tcgatcagtc taaaaatggc 1080 tacgccggat acattgacgg cggagcaagc caggaggaat tttacaaatt tattaagccc 1140 atcttggaaa aaatggacgg caccgaggag ctgctggtaa agcttaacag agaagatctg 1200 ttgcgcaaac agcgcacttt cgacaatgga agcatccccc accagattca cctgggcgaa 1260 ctgcacgcta tcctcaggcg gcaagaggat ttctacccct ttttgaaaga taacagggaa 1320 aagattgaga aaatcctcac atttcggata ccctactatg taggccccct cgcccgggga 1380 aattccagat tcgcgtggat gactcgcaaa tcagaagaga ccatcactcc ctggaacttc 1440 gaggaagtcg tggataaggg ggcctctgcc cagtccttca tcgaaaggat gactaacttt 1500 gataaaaatc tgcctaacga aaaggtgctt cctaaacact ctctgctgta cgagtacttc 1560 acagtttata acgagctcac caaggtcaaa tacgtcacag aagggatgag aaagccagca 1620 ttcctgtctg gagagcagaa gaaagctatc gtggacctcc tcttcaagac gaaccggaaa 1680 gttaccgtga aacagctcaa agaagactat ttcaaaaaga ttgaatgttt cgactctgtt 1740 gaaatcagcg gagtggagga tcgcttcaac gcatccctgg gaacgtatca cgatctcctg 1800 aaaatcatta aagacaagga cttcctggac aatgaggaga acgaggacat tcttgaggac 1860 attgtcctca cccttacgtt gtttgaagat agggagatga ttgaagaacg cttgaaaact 1920 tacgctcatc tcttcgacga caaagtcatg aaacagctca agaggcgccg atatacagga 1980 tgggggcggc tgtcaagaaa actgatcaat gggatccgag acaagcagag tggaaagaca 2040 atcctggatt ttcttaagtc cgatggattt gccaaccgga acttcatgca gttgatccat 2100 gatgactctc tcacctttaa ggaggacatc cagaaagcac aagtttctgg ccagggggac 2160 agtcttcacg agcacatcgc taatcttgca ggtagcccag ctatcaaaaa gggaatactg 2220 cagaccgtta aggtcgtgga tgaactcgtc aaagtaatgg gaaggcataa gcccgagaat 2280 atcgttatcg agatggcccg agagaaccaa actacccaga agggacagaa gaacagtagg 2340 gaaaggatga agaggattga agagggtata aaagaactgg ggtcccaaat ccttaaggaa 2400 cacccagttg aaaacaccca gcttcagaat gagaagctct acctgtacta cctgcagaac 2460 ggcagggaca tgtacgtgga tcaggaactg gacatcaatc ggctctccga ctacgacgtg 2520 gctgctatcg tgccccagtc ttttctcaaa gatgattcta ttgataataa agtgttgaca 2580 agatccgata aagctagagg gaagagtgat aacgtcccct cagaagaagt tgtcaagaaa 2640 atgaaaaatt attggcggca gctgctgaac gccaaactga tcacacaacg gaagttcgat 2700 aatctgacta aggctgaacg aggtggcctg tctgagttgg ataaagccgg cttcatcaaa 2760 aggcagcttg ttgagacacg ccagatcacc aagcacgtgg cccaaattct cgattcacgc 2820 atgaacacca agtacgatga aaatgacaaa ctgattcgag aggtgaaagt tattactctg 2880 aagtctaagc tggtctcaga tttcagaaag gactttcagt tttataaggt gagagagatc 2940 aacaattacc accatgcgca tgatgcctac ctgaatgcag tggtaggcac tgcacttatc 3000 aaaaaatatc ccaagcttga atctgaattt gtttacggag actataaagt gtacgatgtt 3060 aggaaaatga tcgcaaagtc tgagcaggaa ataggcaagg ccaccgctaa gtacttcttt 3120 tacagcaata ttatgaattt tttcaagacc gagattacac tggccaatgg agagattcgg 3180 aagcgaccac ttatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtgtggga caagggtagg 3240 gatttcgcga cagtccggaa ggtcctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt taaaaagacc 3300 gaagtacaga ccggaggctt ctccaaggaa agtatcctcc cgaaaaggaa cagcgacaag 3360 ctgatcgcac gcaaaaaaga ttgggacccc aagaaatacg gcggattcga ttctcctaca 3420 gtcgcttaca gtgtactggt tgtggccaaa gtggagaaag ggaagtctaa aaaactcaaa 3480 agcgtcaagg aactgctggg catcacaatc atggagcgat caagcttcga aaaaaacccc 3540 atcgactttc tcgaggcgaa aggatataaa gaggtcaaaa aagacctcat cattaagctt 3600 cccaagtact ctctctttga gcttgaaaac ggccggaaac gaatgctcgc tagtgcgggc 3660 gagctgcaga aaggtaacga gctggcactg ccctctaaat acgttaattt cttgtatctg 3720 gccagccact atgaaaagct caaagggtct cccgaagata atgagcagaa gcagctgttc 3780 gtggaacaac acaaacacta ccttgatgag atcatcgagc aaataagcga attctccaaa 3840 agagtgatcc tcgccgacgc taacctcgat aaggtgcttt ctgcttacaa taagcacagg 3900 gataagccca tcagggagca ggcagaaaac attatccact tgtttactct gaccaacttg 3960 ggcgcgcctg cagccttcaa gtacttcgac accaccatag acagaaagcg gtacacctct 4020 acaaaggagg tcctggacgc cacactgatt catcagtcaa ttacggggct ctatgaaaca 4080 agaatcgacc tctctcagct cggtggagac agcagggctg accccaagaa gaagaggaag 4140 gtggaggcca gcggttccgg acgggctgac gcattggacg attttgatct ggatatgctg 4200 ggaagtgacg ccctcgatga ttttgacctt gacatgcttg gttcggatgc ccttgatgac 4260 tttgacctcg acatgctcgg cagtgacgcc cttgatgatt tcgacctgga catgctgatt 4320 aactctagat ga 4332 <210> 3 <211> 4365 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VP64-activator construct <400> 3 gccaccatgc ccaagaagaa gaggaaggtg ggaaggggga tggacaagaa gtactccatt 60 gggctcgcta tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtca ttacggacga gtacaaggtg 120 ccgagcaaaa aattcaaagt tctgggcaat accgatcgcc acagcataaa gaagaacctc 180 attggcgccc tcctgttcga ctccggggag acggccgaag ccacgcggct caaaagaaca 240 gcacggcgca gatatacccg cagaaagaat cggatctgct acctgcagga gatctttagt 300 aatgagatgg ctaaggtgga tgactctttc ttccataggc tggaggagtc ctttttggtg 360 gaggaggata aaaagcacga gcgccaccca atctttggca atatcgtgga cgaggtggcg 420 taccatgaaa agtacccaac catatatcat ctgaggaaga agcttgtaga cagtactgat 480 aaggctgact tgcggttgat ctatctcgcg ctggcgcata tgatcaaatt tcggggacac 540 ttcctcatcg agggggacct gaacccagac aacagcgatg tcgacaaact ctttatccaa 600 ctggttcaga cttacaatca gcttttcgaa gagaacccga tcaacgcatc cggagttgac 660 gccaaagcaa tcctgagcgc taggctgtcc aaatcccggc ggctcgaaaa cctcatcgca 720 cagctccctg gggagaagaa gaacggcctg tttggtaatc ttatcgccct gtcactcggg 780 ctgaccccca actttaaatc taacttcgac ctggccgaag atgccaagct tcaactgagc 840 aaagacacct acgatgatga tctcgacaat ctgctggccc agatcggcga ccagtacgca 900 gacctttttt tggcggcaaa gaacctgtca gacgccattc tgctgagtga tattctgcga 960 gtgaacacgg agatcaccaa agctccgctg agcgctagta tgatcaagcg ctatgatgag 1020 caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc tgagaagtac 1080 aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat ggctacgccg gatacattga cggcggagca 1140 agccaggagg aattttacaa atttattaag cccatcttgg aaaaaatgga cggcaccgag 1200 gagctgctgg taaagcttaa cagagaagat ctgttgcgca aacagcgcac tttcgacaat 1260 ggaagcatcc cccaccagat tcacctgggc gaactgcacg ctatcctcag gcggcaagag 1320 gatttctacc cctttttgaa agataacagg gaaaagattg agaaaatcct cacatttcgg 1380 ataccctact atgtaggccc cctcgcccgg ggaaattcca gattcgcgtg gatgactcgc 1440 aaatcagaag agaccatcac tccctggaac ttcgaggaag tcgtggataa gggggcctct 1500 gcccagtcct tcatcgaaag gatgactaac tttgataaaa atctgcctaa cgaaaaggtg 1560 cttcctaaac actctctgct gtacgagtac ttcacagttt ataacgagct caccaaggtc 1620 aaatacgtca cagaagggat gagaaagcca gcattcctgt ctggagagca gaagaaagct 1680 atcgtggacc tcctcttcaa gacgaaccgg aaagttaccg tgaaacagct caaagaagac 1740 tatttcaaaa agattgaatg tttcgactct gttgaaatca gcggagtgga ggatcgcttc 1800 aacgcatccc tgggaacgta tcacgatctc ctgaaaatca ttaaagacaa ggacttcctg 1860 gacaatgagg agaacgagga cattcttgag gacattgtcc tcacccttac gttgtttgaa 1920 gatagggaga tgattgaaga acgcttgaaa acttacgctc atctcttcga cgacaaagtc 1980 atgaaacagc tcaagaggcg ccgatataca ggatgggggc ggctgtcaag aaaactgatc 2040 aatgggatcc gagacaagca gagtggaaag acaatcctgg attttcttaa gtccgatgga 2100 tttgccaacc ggaacttcat gcagttgatc catgatgact ctctcacctt taaggaggac 2160 atccagaaag cacaagtttc tggccagggg gacagtcttc acgagcacat cgctaatctt 2220 gcaggtagcc cagctatcaa aaagggaata ctgcagaccg ttaaggtcgt ggatgaactc 2280 gtcaaagtaa tgggaaggca taagcccgag aatatcgtta tcgagatggc ccgagagaac 2340 caaactaccc agaagggaca gaagaacagt agggaaagga tgaagaggat tgaagagggt 2400 ataaaagaac tggggtccca aatccttaag gaacacccag ttgaaaacac ccagcttcag 2460 aatgagaagc tctacctgta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt ggatcaggaa 2520 ctggacatca atcggctctc cgactacgac gtggctgcta tcgtgcccca gtcttttctc 2580 aaagatgatt ctattgataa taaagtgttg acaagatccg ataaagctag agggaagagt 2640 gataacgtcc cctcagaaga agttgtcaag aaaatgaaaa attattggcg gcagctgctg 2700 aacgccaaac tgatcacaca acggaagttc gataatctga ctaaggctga acgaggtggc 2760 ctgtctgagt tggataaagc cggcttcatc aaaaggcagc ttgttgagac acgccagatc 2820 accaagcacg tggcccaaat tctcgattca cgcatgaaca ccaagtacga tgaaaatgac 2880 aaactgattc gagaggtgaa agttattact ctgaagtcta agctggtctc agatttcaga 2940 aaggactttc agttttataa ggtgagagag atcaacaatt accaccatgc gcatgatgcc 3000 tacctgaatg cagtggtagg cactgcactt atcaaaaaat atcccaagct tgaatctgaa 3060 tttgtttacg gagactataa agtgtacgat gttaggaaaa tgatcgcaaa gtctgagcag 3120 gaaataggca aggccaccgc taagtacttc ttttacagca atattatgaa ttttttcaag 3180 accgagatta cactggccaa tggagagatt cggaagcgac cacttatcga aacaaacgga 3240 gaaacaggag aaatcgtgtg ggacaagggt agggatttcg cgacagtccg gaaggtcctg 3300 tccatgccgc aggtgaacat cgttaaaaag accgaagtac agaccggagg cttctccaag 3360 gaaagtatcc tcccgaaaag gaacagcgac aagctgatcg cacgcaaaaa agattgggac 3420 cccaagaaat acggcggatt cgattctcct acagtcgctt acagtgtact ggttgtggcc 3480 aaagtggaga aagggaagtc taaaaaactc aaaagcgtca aggaactgct gggcatcaca 3540 atcatggagc gatcaagctt cgaaaaaaac cccatcgact ttctcgaggc gaaaggatat 3600 aaagaggtca aaaaagacct catcattaag cttcccaagt actctctctt tgagcttgaa 3660 aacggccgga aacgaatgct cgctagtgcg ggcgagctgc agaaaggtaa cgagctggca 3720 ctgccctcta aatacgttaa tttcttgtat ctggccagcc actatgaaaa gctcaaaggg 3780 tctcccgaag ataatgagca gaagcagctg ttcgtggaac aacacaaaca ctaccttgat 3840 gagatcatcg agcaaataag cgaattctcc aaaagagtga tcctcgccga cgctaacctc 3900 gataaggtgc tttctgctta caataagcac agggataagc ccatcaggga gcaggcagaa 3960 aacattatcc acttgtttac tctgaccaac ttgggcgcgc ctgcagcctt caagtacttc 4020 gacaccacca tagacagaaa gcggtacacc tctacaaagg aggtcctgga cgccacactg 4080 attcatcagt caattacggg gctctatgaa acaagaatcg acctctctca gctcggtgga 4140 gacagcaggg ctgaccccaa gaagaagagg aaggtggagg ccagcggttc cggacgggct 4200 gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 4260 cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 4320 gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg attaactcta gatga 4365 <210> 4 <211> 4425 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VP64-activator construct <400> 4 gccaccatgg acaagaagta ctccattggg ctcgctatcg gcacaaacag cgtcggctgg 60 gccgtcatta cggacgagta caaggtgccg agcaaaaaat tcaaagttct gggcaatacc 120 gatcgccaca gcataaagaa gaacctcatt ggcgccctcc tgttcgactc cggggagacg 180 gccgaagcca cgcggctcaa aagaacagca cggcgcagat atacccgcag aaagaatcgg 240 atctgctacc tgcaggagat ctttagtaat gagatggcta aggtggatga ctctttcttc 300 cataggctgg aggagtcctt tttggtggag gaggataaaa agcacgagcg ccacccaatc 360 tttggcaata tcgtggacga ggtggcgtac catgaaaagt acccaaccat atatcatctg 420 aggaagaagc ttgtagacag tactgataag gctgacttgc ggttgatcta tctcgcgctg 480 gcgcatatga tcaaatttcg gggacacttc ctcatcgagg gggacctgaa cccagacaac 540 agcgatgtcg acaaactctt tatccaactg gttcagactt acaatcagct tttcgaagag 600 aacccgatca acgcatccgg agttgacgcc aaagcaatcc tgagcgctag gctgtccaaa 660 tcccggcggc tcgaaaacct catcgcacag ctccctgggg agaagaagaa cggcctgttt 720 ggtaatctta tcgccctgtc actcgggctg acccccaact ttaaatctaa cttcgacctg 780 gccgaagatg ccaagcttca actgagcaaa gacacctacg atgatgatct cgacaatctg 840 ctggcccaga tcggcgacca gtacgcagac ctttttttgg cggcaaagaa cctgtcagac 900 gccattctgc tgagtgatat tctgcgagtg aacacggaga tcaccaaagc tccgctgagc 960 gctagtatga tcaagcgcta tgatgagcac caccaagact tgactttgct gaaggccctt 1020 gtcagacagc aactgcctga gaagtacaag gaaattttct tcgatcagtc taaaaatggc 1080 tacgccggat acattgacgg cggagcaagc caggaggaat tttacaaatt tattaagccc 1140 atcttggaaa aaatggacgg caccgaggag ctgctggtaa agcttaacag agaagatctg 1200 ttgcgcaaac agcgcacttt cgacaatgga agcatccccc accagattca cctgggcgaa 1260 ctgcacgcta tcctcaggcg gcaagaggat ttctacccct ttttgaaaga taacagggaa 1320 aagattgaga aaatcctcac atttcggata ccctactatg taggccccct cgcccgggga 1380 aattccagat tcgcgtggat gactcgcaaa tcagaagaga ccatcactcc ctggaacttc 1440 gaggaagtcg tggataaggg ggcctctgcc cagtccttca tcgaaaggat gactaacttt 1500 gataaaaatc tgcctaacga aaaggtgctt cctaaacact ctctgctgta cgagtacttc 1560 acagtttata acgagctcac caaggtcaaa tacgtcacag aagggatgag aaagccagca 1620 ttcctgtctg gagagcagaa gaaagctatc gtggacctcc tcttcaagac gaaccggaaa 1680 gttaccgtga aacagctcaa agaagactat ttcaaaaaga ttgaatgttt cgactctgtt 1740 gaaatcagcg gagtggagga tcgcttcaac gcatccctgg gaacgtatca cgatctcctg 1800 aaaatcatta aagacaagga cttcctggac aatgaggaga acgaggacat tcttgaggac 1860 attgtcctca cccttacgtt gtttgaagat agggagatga ttgaagaacg cttgaaaact 1920 tacgctcatc tcttcgacga caaagtcatg aaacagctca agaggcgccg atatacagga 1980 tgggggcggc tgtcaagaaa actgatcaat gggatccgag acaagcagag tggaaagaca 2040 atcctggatt ttcttaagtc cgatggattt gccaaccgga acttcatgca gttgatccat 2100 gatgactctc tcacctttaa ggaggacatc cagaaagcac aagtttctgg ccagggggac 2160 agtcttcacg agcacatcgc taatcttgca ggtagcccag ctatcaaaaa gggaatactg 2220 cagaccgtta aggtcgtgga tgaactcgtc aaagtaatgg gaaggcataa gcccgagaat 2280 atcgttatcg agatggcccg agagaaccaa actacccaga agggacagaa gaacagtagg 2340 gaaaggatga agaggattga agagggtata aaagaactgg ggtcccaaat ccttaaggaa 2400 cacccagttg aaaacaccca gcttcagaat gagaagctct acctgtacta cctgcagaac 2460 ggcagggaca tgtacgtgga tcaggaactg gacatcaatc ggctctccga ctacgacgtg 2520 gctgctatcg tgccccagtc ttttctcaaa gatgattcta ttgataataa agtgttgaca 2580 agatccgata aagctagagg gaagagtgat aacgtcccct cagaagaagt tgtcaagaaa 2640 atgaaaaatt attggcggca gctgctgaac gccaaactga tcacacaacg gaagttcgat 2700 aatctgacta aggctgaacg aggtggcctg tctgagttgg ataaagccgg cttcatcaaa 2760 aggcagcttg ttgagacacg ccagatcacc aagcacgtgg cccaaattct cgattcacgc 2820 atgaacacca agtacgatga aaatgacaaa ctgattcgag aggtgaaagt tattactctg 2880 aagtctaagc tggtctcaga tttcagaaag gactttcagt tttataaggt gagagagatc 2940 aacaattacc accatgcgca tgatgcctac ctgaatgcag tggtaggcac tgcacttatc 3000 aaaaaatatc ccaagcttga atctgaattt gtttacggag actataaagt gtacgatgtt 3060 aggaaaatga tcgcaaagtc tgagcaggaa ataggcaagg ccaccgctaa gtacttcttt 3120 tacagcaata ttatgaattt tttcaagacc gagattacac tggccaatgg agagattcgg 3180 aagcgaccac ttatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtgtggga caagggtagg 3240 gatttcgcga cagtccggaa ggtcctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt taaaaagacc 3300 gaagtacaga ccggaggctt ctccaaggaa agtatcctcc cgaaaaggaa cagcgacaag 3360 ctgatcgcac gcaaaaaaga ttgggacccc aagaaatacg gcggattcga ttctcctaca 3420 gtcgcttaca gtgtactggt tgtggccaaa gtggagaaag ggaagtctaa aaaactcaaa 3480 agcgtcaagg aactgctggg catcacaatc atggagcgat caagcttcga aaaaaacccc 3540 atcgactttc tcgaggcgaa aggatataaa gaggtcaaaa aagacctcat cattaagctt 3600 cccaagtact ctctctttga gcttgaaaac ggccggaaac gaatgctcgc tagtgcgggc 3660 gagctgcaga aaggtaacga gctggcactg ccctctaaat acgttaattt cttgtatctg 3720 gccagccact atgaaaagct caaagggtct cccgaagata atgagcagaa gcagctgttc 3780 gtggaacaac acaaacacta ccttgatgag atcatcgagc aaataagcga attctccaaa 3840 agagtgatcc tcgccgacgc taacctcgat aaggtgcttt ctgcttacaa taagcacagg 3900 gataagccca tcagggagca ggcagaaaac attatccact tgtttactct gaccaacttg 3960 ggcgcgcctg cagccttcaa gtacttcgac accaccatag acagaaagcg gtacacctct 4020 acaaaggagg tcctggacgc cacactgatt catcagtcaa ttacggggct ctatgaaaca 4080 agaatcgacc tctctcagct cggtggagac agcagggctg accccaagaa gaagaggaag 4140 gtggaggcca gcggttccgg acgggctgac gcattggacg attttgatct ggatatgctg 4200 ggaagtgacg ccctcgatga ttttgacctt gacatgcttg gttcggatgc ccttgatgac 4260 tttgacctcg acatgctcgg cagtgacgcc cttgatgatt tcgacctgga catgctgatt 4320 aactctagag cggccgcaga tccaaaaaag aagagaaagg tagatccaaa aaagaagaga 4380 aaggtagatc caaaaaagaa gagaaaggta gatacggccg catag 4425 <210> 5 <211> 587 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MS2-activator construct <400> 5 ccaccatggg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc ttctagaatg gcttctaact 60 ttactcagtt cgttctcgtc gacaatggcg gaactggcga cgtgactgtc gccccaagca 120 acttcgctaa cgggatcgct gaatggatca gctctaactc gcgttcacag gcttacaaag 180 taacctgtag cgttcgtcag agctctgcgc agaatcgcaa atacaccatc aaagtcgagg 240 tgcctaaagg cgcctggcgt tcgtacttaa atatggaact aaccattcca attttcgcca 300 cgaattccga ctgcgagctt attgttaagg caatgcaagg tctcctaaaa gatggaaacc 360 cgattccctc agcaatcgca gcaaactccg gcatctacga ggccagcggt tccggacggg 420 ctgacgcatt ggacgatttt gatctggata tgctgggaag tgacgccctc gatgattttg 480 accttgacat gcttggttcg gatgcccttg atgactttga cctcgacatg ctcggcagtg 540 acgcccttga tgatttcgac ctggacatgc tgattaactc tagatga 587 <210> 6 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MS2-activator construct <400> 6 gccaccatgg gacctaagaa aaagaggaag gtggcggccg cttctagaat ggcttctaac 60 tttactcagt tcgttctcgt cgacaatggc ggaactggcg acgtgactgt cgccccaagc 120 aacttcgcta acgggatcgc tgaatggatc agctctaact cgcgttcaca ggcttacaaa 180 gtaacctgta gcgttcgtca gagctctgcg cagaatcgca aatacaccat caaagtcgag 240 gtgcctaaag gcgcctggcg ttcgtactta aatatggaac taaccattcc aattttcgcc 300 acgaattccg actgcgagct tattgttaag gcaatgcaag gtctcctaaa agatggaaac 360 ccgattccct cagcaatcgc agcaaactcc ggcatctacg aggccagcgg ttccggacgg 420 gctgacgcat tggacgattt tgatctggat atgctgggaa gtgacgccct cgatgatttt 480 gaccttgaca tgcttggttc ggatgccctt gatgactttg acctcgacat gctcggcagt 540 gacgcccttg atgatttcga cctggacatg ctgattaact ctagagcggc cgcagatcca 600 aaaaagaaga gaaaggtaga tccaaaaaag aagagaaagg tagatccaaa aaagaagaga 660 aaggtagata cggccgcata g 681 <210> 7 <211> 557 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MS2-activator construct <220> <221> misc_feature <222> (320)..(339) <223> wherein N is G, A, T or C <400> 7 tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60 gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120 gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180 tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240 gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300 tggaaaggac gaaacaccgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng ttttagagct agaaatagca 360 agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgctctgc 420 aggtcgactc tagaaaacat gaggatcacc catgtctgca gtattcccgg gttcattaga 480 tcctaaggta cctaattgcc tagaaaacat gaggatcacc catgtctgca ggtcgactct 540 agaaattttt tctagac 557 <210> 8 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Activation reporter construct <400> 8 tagggataac agggtaatag tgtcccctcc accccacagt ggggcgaggt aggcgtgtac 60 ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagaattc 120 gccaccatgg actacaagga tgacgacgat aaaacttccg gtggcggact gggttccacc 180 gtgagcaagg gcgaggaggt catcaaagag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 240 tccatgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 300 acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 360 ctgtcccccc agttcatgta cggctccaag gcgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 420 gattacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 480 gacggcggtc tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcac gctgatctac 540 aaggtgaaga tgcgcggcac caacttcccc cccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 600 atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 660 atccaccagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagaccatc 720 tacatggcca agaagcccgt gcaactgccc ggctactact acgtggacac caagctggac 780 atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgctc cgagggccgc 840 caccacctgt tcctgtacgg catggacgag ctgtacaagt aa 882 <210> 9 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Activation reporter construct <400> 9 tagggataac agggtaatag tggggccact agggacagga ttggcgaggt aggcgtgtac 60 ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagaattc 120 gccaccatgg actacaagga tgacgacgat aaaacttccg gtggcggact gggttccacc 180 gtgagcaagg gcgaggaggt catcaaagag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 240 tccatgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 300 acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 360 ctgtcccccc agttcatgta cggctccaag gcgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 420 gattacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 480 gacggcggtc tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcac gctgatctac 540 aaggtgaaga tgcgcggcac caacttcccc cccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 600 atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 660 atccaccagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagaccatc 720 tacatggcca agaagcccgt gcaactgccc ggctactact acgtggacac caagctggac 780 atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgctc cgagggccgc 840 caccacctgt tcctgtacgg catggacgag ctgtacaagt aa 882 <210> 10 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specificity reporter library <220> <221> misc_feature <222> (22)..(44) <223> wherein N is G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (154)..(177) <223> wherein N is G, A, T or C <400> 10 tagggataac agggtaatag tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgaggt aggcgtgtac 60 ggtgggaggc ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagaattc 120 gccaccatgg actacaagga tgacgacgat aaannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnact 180 tccggtggcg gactgggttc caccgtgagc aagggcgagg aggtcatcaa agagttcatg 240 cgcttcaagg tgcgcatgga gggctccatg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 300 ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc 360 cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc ccccagttca tgtacggctc caaggcgtac 420 gtgaagcacc ccgccgacat ccccgattac aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag 480 tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggtctggtga ccgtgaccca ggactcctcc 540 ctgcaggacg gcacgctgat ctacaaggtg aagatgcgcg gcaccaactt cccccccgac 600 ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc 660 cgcgacggcg tgctgaaggg cgagatccac caggccctga agctgaagga cggcggccac 720 tacctggtgg agttcaagac catctacatg gccaagaagc ccgtgcaact gcccggctac 780 tactacgtgg acaccaagct ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 840 cagtacgagc gctccgaggg ccgccaccac ctgttcctgt acggcatgga cgagctgtac 900 aagtaagaat tc 912 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 11 ctggcggatc actcgcggtt agg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 12 cctcggcctc caaaagtgct agg 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 13 acgctgattc ctgcagatca ggg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 14 ccaggaatac gtatccacca ggg 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 15 gccacaccca agcgatcaaa tgg 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 16 aaataataca ttctaaggta agg 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 17 gctactgggg aggctgaggc agg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 18 tagcaataca gtcacattaa tgg 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 19 ctcatgtgat ccccccgtct cgg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 20 ccgggcagag agtgaacgcg cgg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 21 ttccttccct ctcccgtgct tgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 22 tctctgcaaa gcccctggag agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 23 aatgcagttg ccgagtgcag tgg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 24 cctcagcctc ctaaagtgct ggg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 25 gagtccaaat cctctttact agg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 26 gagtgtctgg atttgggata agg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 27 cagcacctca tctcccagtg agg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 28 tctaaaaccc agggaatcat ggg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 29 cacaaggcag ccagggatcc agg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 30 gatggcaagc tgagaaacac tgg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 31 tgaaatgcac gcatacaatt agg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 32 ccagtccaga cctggccttc tgg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 33 cccagaaaaa cagaccctga agg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 34 aagggttgag cacttgttta ggg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 35 atgtctgagt tttggttgag agg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 36 ggtcccttga aggggaagta ggg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 37 tggcagtcta ctcttgaaga tgg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 38 ggcacagtgc cagaggtctg tgg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 39 taaaaataaa aaaactaaca ggg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 40 tctgtggggg acctgcactg agg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 41 ggccagaggt caaggctagt ggg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 42 cacgaccgaa acccttctta cgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 43 gttgaatgaa gacagtctag tgg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 44 taagaacaga gcaagttacg tgg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 45 tgtaaggtaa gagaggagag cgg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 46 tgacacacca actcctgcac tgg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 47 tttacccact tccttcgaaa agg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 48 gtggctggca ggctggctct ggg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 49 ctcccccggc ctcccccgcg cgg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 50 caaaacccgg cagcgaggct ggg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 51 aggagccgcc gcgcgctgat tgg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 52 cacacacacc cacacgagat ggg 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 53 gaagaagcta aagagccaga ggg 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 54 atgagaattt caataacctc agg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 55 tcccgctctg ttgcccaggc tgg 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 56 cagacaccca ccaccatgcg tgg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 57 tcccaattta ctgggattac agg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 58 tgatttaaaa gttggaaacg tgg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 59 tctagttccc cacctagtct ggg 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 60 gattaactga gaattcacaa ggg 23 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target probe <400> 61 cgccaggagg ggtgggtcta agg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reporter construct <400> 62 gtcccctcca ccccacagtg ggg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reporter construct <400> 63 ggggccacta gggacaggat tgg 23 <210> 64 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 64 taatactttt atctgtcccc tccaccccac agtggggcca ctagggacag gattggtgac 60 agaaaagccc c 71 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 65 ggggccacta gggacaggat 20 <210> 66 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Guide RNA <400> 66 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuagcu uguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 67 gtcccctcca ccccacagtg cag 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 68 gtcccctcca ccccacagtg caa 23 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 69 gtcccctcca ccccacagtg cgg 23 <210> 70 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 70 tgtcccctcc accccacagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aa 52 <210> 71 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 71 tgtccccccc accccacagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aa 52 <210> 72 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 72 aaaaccctcc accccacagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aa 52 <210> 73 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 73 tgtcccctcc ttttttcagt ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aa 52 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 74 caccggggtg gtgcccatcc tgg 23 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 75 ggtgcccatc ctggtcgagc tgg 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 76 cccatcctgg tcgagctgga cgg 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 77 ggccacaagt tcagcgtgtc cgg 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 78 cgcaaataag agctcaccta cgg 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 79 ctgaagttca tctgcaccac cgg 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 80 ccggcaagct gcccgtgccc tgg 23 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 81 gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 82 gccgtccagc tcgaccagga tgg 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 83 ggccggacac gctgaacttg tgg 23 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 84 taacagggta atgtcgaggc cgg 23 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 85 aggtgagctc ttatttgcgt agg 23 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 86 cttcagggtc agcttgccgt agg 23 <210> 87 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 87 gggcacgggc agcttgccgg tgg 23 <210> 88 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 88 gagatgatcg ccccttcttc tgg 23 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 89 gagatgatcg ccccttcttc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 90 gtgatgaccg gccgttcttc 20 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 91 gtcccctcca ccccacagtg ggg 23 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 92 gagatgatcg cccgttcttc tgg 23 <210> 93 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 93 guccccucca ccccacagug 20 <210> 94 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 94 guccccucca ccccacaguc 20 <210> 95 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 95 guccccucca ccccacagag 20 <210> 96 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 96 guccccucca ccccacacug 20 <210> 97 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 97 guccccucca ccccacugug 20 <210> 98 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 98 guccccucca ccccagagug 20 <210> 99 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 99 guccccucca ccccucagug 20 <210> 100 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 100 guccccucca cccgacagug 20 <210> 101 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 101 guccccucca ccgcacagug 20 <210> 102 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 102 guccccucca cgccacagug 20 <210> 103 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 103 guccccucca gcccacagug 20 <210> 104 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 104 guccccuccu ccccacagug 20 <210> 105 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 105 guccccucga ccccacagug 20 <210> 106 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 106 guccccucca ccccacagac 20 <210> 107 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 107 guccccucca ccccacucug 20 <210> 108 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 108 guccccucca ccccugagug 20 <210> 109 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 109 guccccucca ccggacagug 20 <210> 110 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 110 guccccucca ggccacagug 20 <210> 111 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 111 guccccucgu ccccacagug 20 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 112 ggggccacta gggacaggat ggg 23 <210> 113 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 113 gagaugaucg ccccuucuuc 20 <210> 114 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 114 gagaugaucg ccccuucuug 20 <210> 115 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 115 gagaugaucg ccccuucuac 20 <210> 116 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 116 gagaugaucg ccccuucauc 20 <210> 117 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 117 gagaugaucg ccccuuguuc 20 <210> 118 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 118 gagaugaucg ccccuacuuc 20 <210> 119 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 119 gagaugaucg ccccaucuuc 20 <210> 120 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 120 gagaugaucg cccguucuuc 20 <210> 121 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 121 gagaugaucg ccgcuucuuc 20 <210> 122 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 122 gagaugaucg cgccuucuuc 20 <210> 123 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 123 gagaugaucg gcccuucuuc 20 <210> 124 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 124 gagaugaucc ccccuucuuc 20 <210> 125 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 125 gagaugaugg ccccuucuuc 20 <210> 126 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 126 gagaugaucg ccccuucuag 20 <210> 127 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 127 gagaugaucg ccccuugauc 20 <210> 128 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 128 gagaugaucg ccccaacuuc 20 <210> 129 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 129 gagaugaucg ccgguucuuc 20 <210> 130 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 130 gagaugaucg ggccuucuuc 20 <210> 131 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 131 gagaugaugc ccccuucuuc 20 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 132 gagatgatcg ccccttcttc tgg 23 <210> 133 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 133 ggggccacua gggacaggau 20 <210> 134 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 134 gggccacuag ggacaggau 19 <210> 135 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 135 ggccacuagg gacaggau 18 <210> 136 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 136 gccacuaggg acaggau 17 <210> 137 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 137 gagaugaucg ccccuucuuc 20 <210> 138 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 138 gaugaucgcc ccuucuuc 18 <210> 139 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 139 gaucgccccu ucuuc 15 <210> 140 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> RNA target sequence <400> 140 gccccuucuu c 11 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 141 gtcccctcca ccccacagtg c 21 <210> 142 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> wherein N id G, A, T or C <400> 142 tgtcnnnnnn accc 14 <210> 143 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 143 tgtcaaaaaa accc 14 <210> 144 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 144 tgtcgggggg accc 14 <210> 145 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 145 tgtcaaaaaa accc 14 <210> 146 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 146 tgtcgggggg accc 14 <210> 147 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 147 tgtccccccc accc 14 <210> 148 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 148 tgtctttttt accc 14 <210> 149 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 149 tgtccccccc accc 14 <210> 150 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 150 tgtctttttt accc 14 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 151 ggatcctgtg tccccgagct ggg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 152 gttaatgtgg ctctggttct ggg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 153 ggggccacta gggacaggat tgg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 154 cttcctagtc tcctgatatt ggg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 155 tggtcccagc tcggggacac agg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 156 agaaccagag ccacattaac cgg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 157 gtcaccaatc ctgtccctag tgg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 158 agacccaata tcaggagact agg 23 <210> 159 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 159 gggatcctgt gtccccgagc tgggaccacc ttatattccc agggccggtt aatgtggctc 60 tggttctggg tactt 75 <210> 160 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 160 gggatcctgt gtccccgagc tgggaccacc ttatattccc agggccggtt aatgtggttc 60 tgggtactt 69 <210> 161 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 161 gggatcctgt gtccccgagc tgggaccacc ttatattccc agggcagggc cggttggacc 60 accttatatt cccagggcag ggccggttaa tgtggctctg gttctgggta ctt 113 <210> 162 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 162 gggatcctgt gtccccgtct ggttctgggt actt 34 <210> 163 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligoncleotide sequence <400> 163 gggatcctgt gtccccgagc tgggaccacc ttatattctg ggtactt 47 <210> 164 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 164 gggatcctgt ggtactt 17 <210> 165 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 165 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtcccctcc accccacagt 60 ggggccacta gggacaggat tggtgacaga aaa 93 <210> 166 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 166 agggccggtt aatgaatgtg gctctggttc tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca 60 cagtggggcc actagacaga aaa 83 <210> 167 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 167 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtcccccag tggggccact 60 gattggtgac agaaaa 76 <210> 168 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 168 agggccggtt caggattggt gacagaaaa 29 <210> 169 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 169 agggccggtt aatgtggcga ttggtgacag aaaa 34 <210> 170 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 170 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtccccgat tggtgacaga 60 aaa 63 <210> 171 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 171 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtcccctcc accccacagt 60 ggggacagga ttggtgacag aaaa 84 <210> 172 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 172 agggccggtt aatgtggtga cagaaaa 27 <210> 173 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 173 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtcccctcc accccagggg 60 acagtctgtc ccctccaccc cagggacagg attggtgaca gaaaa 105 <210> 174 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 174 agggccggtt aatgtggctc tggttctggg tacttttatc tgtcccctcc accactaggg 60 acaggattgg tgacagaaaa 80 <210> 175 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 175 cccacagtgg ggccactagg gacaggattg gtgacagaaa agccccatac ccc 53 <210> 176 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 176 cccacagtgg ggccactacc cc 22 <210> 177 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 177 cccacagtgg ggccactagt agaaaagccc catccttagg cctcccccat ccttaggcct 60 cctccttcct agtctcctga tattgggtct aacccc 96 <210> 178 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 178 cccacagtgg ggccactagg gacaggattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc 60 tccttcctag tctcctgata ttgggtctaa cccc 94 <210> 179 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 179 cccacagtgg ggccaccctt aggcctcctc cttcctagtc tcctgatatt gggtctaacc 60 cc 62 <210> 180 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 180 cccacagtgg ggccactagt gatattgggt ctaacccc 38 <210> 181 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> target oligonucleotide sequence <400> 181 cccacagtgg ggccactagg gacaggattg gtgacaaaaa agccccatcc ttacgcctcc 60 tccttcctag tctcctgata ttgggtctaa cccc 94 <210> 182 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 182 cccacagtgg ggccactagg gacaggcctc ctccttccta gtctcctgat attgggtcta 60 acccc 65 <210> 183 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 183 cccacagtgg ggccactagg gacaggggga caggattggt gacagaaaag ccccatcctt 60 aggcctcctc cttcctagtc tcctgatatt gggtctaacc cc 102 <210> 184 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target oligonucleotide sequence <400> 184 cccacaggat tggtgacaga aaagccccat ccttaggcct cctccttcct agtctcctga 60 tattgggtct aacccc 76

Claims (13)

  1. 각각의 가이드 RNA가 스페이서 서열, tracr 메이트(mate) 서열 및 tracr 서열을 갖고, tracr 서열의 일부가 tracr 메이트 서열에 혼성화되고, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열이 링커 핵산 서열에 의해 연결되고, 각각의 스페이서 서열이 DNA 표적 핵산 내의 인접 부위에 상보적인, 2개의 가이드 RNA를 세포에 제공하고,
    공여자 핵산 서열을 세포에 제공하고,
    유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 세포에 제공하는 것을 포함하며,
    여기서 2개의 가이드 RNA 각각이 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제와 DNA 표적 핵산으로 공동-국재화되어 5'-오버행을 갖는 오프셋 닉을 야기하고,
    공여자 핵산 서열이 상동 재조합을 이용하여 오프셋 닉에서 DNA 표적 핵산으로 삽입되고,
    단, 인간 체내에서 수행되는 것이 아닌,
    상동 재조합을 이용하여 공여자 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2개의 가이드 RNA가 2개의 가이드 RNA를 코딩하는 제1 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것에 의해 세포로 제공되고,
    유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제를 코딩하는 제2 외래 핵산을 세포 내로 도입하는 것에 의해 세포로 제공되고,
    2개의 가이드 RNA 및 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 발현되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유형 II CRISPR 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 닉카제가 Cas9 단백질 닉카제인 방법.
  4. 제1항에 있어서, DNA 표적 핵산이 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA 또는 외인성 DNA인 방법.
  5. 제1항에 있어서, tracr 서열이 90 내지 500개의 뉴클레오티드인 방법.
  6. 제1항에 있어서, tracr 서열이 90 내지 200개의 뉴클레오티드인 방법.
  7. 제1항에 있어서, tracr 서열이 100 내지 200개의 뉴클레오티드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 세포가 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 가이드 RNA가 10 내지 500개의 뉴클레오티드인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 가이드 RNA가 20 내지 100개의 뉴클레오티드인 방법.
  12. 제1항에 있어서, DNA 표적 핵산이 질환 또는 유해 상태와 연관되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 2개의 가이드 RNA가 tracrRNA-crRNA 융합체인 방법.
KR1020217023393A 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절 KR102512979B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237009424A KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361830787P 2013-06-04 2013-06-04
US61/830,787 2013-06-04
PCT/US2014/040868 WO2014197568A2 (en) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-guideded transcriptional regulation
KR1020157036892A KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157036892A Division KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237009424A Division KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210095235A KR20210095235A (ko) 2021-07-30
KR102512979B1 true KR102512979B1 (ko) 2023-03-22

Family

ID=52008736

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157036892A KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절
KR1020217023393A KR102512979B1 (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절
KR1020237009424A KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157036892A KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237009424A KR20230042154A (ko) 2013-06-04 2014-06-04 Rna-가이드된 전사 조절

Country Status (15)

Country Link
US (2) US11981917B2 (ko)
EP (3) EP3603679B1 (ko)
JP (5) JP6621738B2 (ko)
KR (3) KR102282990B1 (ko)
CN (2) CN105451778B (ko)
AU (4) AU2014274939B2 (ko)
BR (1) BR112015030491A8 (ko)
CA (2) CA3176690A1 (ko)
ES (1) ES2930537T3 (ko)
IL (3) IL302205A (ko)
MX (2) MX2015016798A (ko)
MY (2) MY177814A (ko)
RU (2) RU2756865C2 (ko)
SG (3) SG10201913068PA (ko)
WO (1) WO2014197568A2 (ko)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
ES2991004T3 (es) 2011-12-22 2024-12-02 Harvard College Métodos para la detección de analitos
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2014065596A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
JP2016501531A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作および治療適用のための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US9970024B2 (en) * 2012-12-17 2018-05-15 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided human genome engineering
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
CN105451778B (zh) 2013-06-04 2021-08-03 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-导向的转录调控
MX2015017313A (es) 2013-06-17 2016-11-25 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapéuticas de los sistemas y composiciones crispr-cas, para actuar sobre trastornos y enfermedades utilizando componentes víricos.
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP4245853A3 (en) * 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
ES2777217T3 (es) 2013-06-17 2020-08-04 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas de guía en tándem, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
EP3418379B1 (en) 2013-09-18 2020-12-09 Kymab Limited Methods, cells & organisms
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
SG10201804974RA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
CN118813621A (zh) 2013-12-12 2024-10-22 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
ES2745769T3 (es) 2014-03-10 2020-03-03 Editas Medicine Inc Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10)
AU2015234204A1 (en) * 2014-03-20 2016-10-06 Universite Laval CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
EP3177718B1 (en) 2014-07-30 2022-03-16 President and Fellows of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US9970030B2 (en) 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
CA2963693A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
KR102629128B1 (ko) 2014-12-03 2024-01-25 애질런트 테크놀로지스, 인크. 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3230451B1 (en) 2014-12-12 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
CA2986310A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
KR20180031671A (ko) 2015-06-09 2018-03-28 에디타스 메디신, 인코포레이티드 이식의 개선을 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
MX2017016289A (es) 2015-06-18 2018-08-15 Broad Inst Inc Mutaciones de la enzima crispr que reducen los efectos fuera del blanco.
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
WO2017053879A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
MX2018005611A (es) 2015-11-03 2018-11-09 Harvard College Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico.
IL259100B2 (en) 2015-11-30 2023-09-01 Univ Duke Therapeutic targets for human dystrophin gene repair using gene editing and methods for use
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20190264186A1 (en) * 2016-01-22 2019-08-29 The Broad Institute Inc. Crystal structure of crispr cpf1
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3443086B1 (en) 2016-04-13 2021-11-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CA3210120C (en) 2016-04-25 2024-04-09 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
IL289989B (en) 2016-06-02 2022-09-01 Sigma Aldrich Co Llc Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017216771A2 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
WO2018017754A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
US11566263B2 (en) 2016-08-02 2023-01-31 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
WO2018129368A2 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
AU2017407272B2 (en) 2017-03-30 2024-06-13 Kyoto University Method for inducing exon skipping by genome editing
KR20250007033A (ko) 2017-04-20 2025-01-13 이제네시스, 인크. 유전자 변형 동물의 생성 방법
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
KR102746733B1 (ko) 2017-06-09 2024-12-24 에디타스 메디신, 인코포레이티드 조작된 cas9 뉴클레아제
CN107266583B (zh) * 2017-06-27 2021-02-09 深圳大学 一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
MX2020009487A (es) 2018-03-14 2020-12-10 Editas Medicine Inc Sistemas y metodos para el tratamiento de hemoglobinopatias.
CN116349651A (zh) 2018-03-19 2023-06-30 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
KR20210142210A (ko) 2019-03-19 2021-11-24 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물
JP7525140B2 (ja) * 2020-01-31 2024-07-30 国立大学法人京都大学 タンパク質翻訳の制御システム
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
US20220049303A1 (en) 2020-08-17 2022-02-17 Readcoor, Llc Methods and systems for spatial mapping of genetic variants
US11884915B2 (en) 2021-09-10 2024-01-30 Agilent Technologies, Inc. Guide RNAs with chemical modification for prime editing
WO2024193739A1 (en) * 2023-03-23 2024-09-26 Ostravska Univerzita Method for producing proteins in host cells

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4123610A (en) 1977-03-09 1978-10-31 The United States Government Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4981985A (en) 1987-10-20 1991-01-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania Synthesis of photolabile chelators for multivalent cations
US4844617A (en) 1988-01-20 1989-07-04 Tencor Instruments Confocal measuring microscope with automatic focusing
US5151189A (en) 1990-09-17 1992-09-29 Gelman Sciences, Inc. Cationic charge modified microporous membrane
WO1993016176A1 (en) 1992-02-13 1993-08-19 Bio-Metric Systems, Inc. Immobilization of chemical species in crosslinked matrices
US5594235A (en) 1993-06-17 1997-01-14 Ultrapointe Corporation Automated surface acquisition for a confocal microscope
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5830708A (en) 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
US6284284B1 (en) 1995-06-06 2001-09-04 Advanced Tissue Sciences, Inc. Compositions and methods for production and use of an injectable naturally secreted extracellular matrix
DE69737450T2 (de) 1996-06-06 2007-11-29 Solexa, Inc., Hayward Sequenzierung durch ligation kodierter adapter
US5948617A (en) 1997-06-13 1999-09-07 Biospeparations, Inc. Methods of in situ hybridization
US6083726A (en) 1998-02-03 2000-07-04 Lucent Technologies, Inc. Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization
AU754952B2 (en) 1998-06-24 2002-11-28 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
US6632655B1 (en) 1999-02-23 2003-10-14 Caliper Technologies Corp. Manipulation of microparticles in microfluidic systems
WO2000065094A2 (en) 1999-04-22 2000-11-02 The Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Assay of gene expression patterns by multi-fluor fish
US20020015952A1 (en) 1999-07-30 2002-02-07 Anderson Norman G. Microarrays and their manufacture by slicing
AU8015300A (en) 1999-10-12 2001-04-23 Ohio State University, The Reactive polymeric valve, dispensing devices and methods using same
AU1774501A (en) 1999-11-17 2001-05-30 Research Foundation Of State University Of New York, The Three dimensional data storage device and method for reading
EP1263773A4 (en) 2000-03-14 2005-08-31 Active Motif OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES, METHODS OF SYNTHESIS AND METHODS OF IMPLEMENTATION
EP1287165B1 (en) 2000-06-02 2007-06-13 Bayer Corporation Method for detection and localization of genes in situ using branched-DNA hybridisation
AU3090102A (en) 2000-12-14 2002-06-24 Gen Probe Inc Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
EP1370690B1 (en) 2001-03-16 2012-03-14 Kalim Mir Arrays and methods of use
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US20060248349A1 (en) 2001-09-24 2006-11-02 Rathjen Alicemarie G Method for preparing and using personal and genetic profiles
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
GB2382137A (en) 2001-11-20 2003-05-21 Mats Gullberg Nucleic acid enrichment
US20090246879A1 (en) 2002-12-20 2009-10-01 Callida Genomics Materials and Methods Relating to Nano-Tags and Nano-Brands
DE602004036672C5 (de) 2003-01-29 2012-11-29 454 Life Sciences Corporation Nukleinsäureamplifikation auf Basis von Kügelchenemulsion
CA2897376A1 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Radoje T. Drmanac Modular system and probes for dna analysis
ES2594054T3 (es) 2003-05-20 2016-12-15 Lucid, Inc. Microscopio confocal para la formación de imágenes de secciones seleccionadas del cuerpo de un paciente
WO2005047543A2 (en) 2003-06-10 2005-05-26 Applera Corporation Ligation assay
US7193054B2 (en) 2003-08-26 2007-03-20 University Of Rochester Nanofabrication using actin filaments
US20080050718A1 (en) 2003-11-14 2008-02-28 Gesteland Raymond F Methods, Articles, and Compositions for Identifying Oligonucleotides
US7381529B2 (en) 2003-12-31 2008-06-03 Intel Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids using scanning probe microscopy and nanocodes
AU2005216549A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 President And Fellows Of Harvard College Polony fluorescent in situ sequencing beads
WO2005085850A1 (en) 2004-02-27 2005-09-15 Tianxin Wang Methods for multiplexed analyte detection
WO2006076017A2 (en) 2004-04-30 2006-07-20 Applera Corporation Methods and kits for identifying target nucleotides in mixed populations
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7253947B2 (en) 2004-10-07 2007-08-07 New York University Portable automated confocal microscope
AU2005304112B2 (en) * 2004-11-09 2009-06-04 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Potent LNA oligonucleotides for the inhibition of HIF-1a expression
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
ITRM20050068A1 (it) 2005-02-17 2006-08-18 Istituto Naz Per Le Malattie I Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine.
US20060234261A1 (en) 2005-03-08 2006-10-19 Pierce Niles A Colorimetric readout of hybridization chain reaction
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US20070020650A1 (en) 2005-04-01 2007-01-25 Avak Kahvejian Methods for detecting proteins
WO2007086900A2 (en) 2005-04-08 2007-08-02 Mycosol, Inc. Stilbazium research assays
CA2615323A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US7842793B2 (en) 2005-06-14 2010-11-30 The California Institute Of Technology Methods of making nucleic acid nanostructures
EP2463386B1 (en) 2005-06-15 2017-04-12 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
DK1910572T3 (en) 2005-06-20 2016-03-14 Advanced Cell Diagnostics Inc Methods for Detecting Nucleic Acids in Single Cells and for Identifying Rare Cells from Large Heterogeneous Cell Populations
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
WO2007076128A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US7864996B2 (en) 2006-02-17 2011-01-04 Lucid, Inc. System for macroscopic and confocal imaging of tissue
JP2009529676A (ja) 2006-03-10 2009-08-20 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 近接場照射の方法および装置
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
WO2007111937A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Applera Corporation Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
SG170802A1 (en) 2006-03-31 2011-05-30 Solexa Inc Systems and devices for sequence by synthesis analysis
AU2007237909A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 Applied Biosystems, Llc. Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US7964347B2 (en) 2006-06-15 2011-06-21 Krassen Dimitrov Labels for electronic detection of individual molecules and methods for their detection
EP2057435A4 (en) 2006-06-23 2011-04-20 Life Technologies Corp SYSTEMS AND METHOD FOR COOLING IN DEVICES FOR BIOLOGICAL ANALYSIS
US7745129B1 (en) 2006-07-12 2010-06-29 Kenneth David Schatz Methods for sequencing of a necleic acid
US20100009868A1 (en) 2006-09-11 2010-01-14 The Arizona Board of Regents a body corporate acti ng for and behalf of Arizona State university Self-Assembled Combinatorial Encoding Nanoarrays for Multiplexed Biosensing
US20090208965A1 (en) 2006-10-25 2009-08-20 Ikonisys, Inc. Automated method for detecting cancers and high grade hyperplasias
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US7883869B2 (en) 2006-12-01 2011-02-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
MX2009009071A (es) 2007-03-02 2009-09-24 Danisco Cultivos con resistencia mejorada a fagos.
US8145677B2 (en) 2007-03-27 2012-03-27 Faleh Jassem Al-Shameri Automated generation of metadata for mining image and text data
US9217151B2 (en) 2007-05-16 2015-12-22 California Institute Of Technology Versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
AU2008265691B2 (en) 2007-06-19 2014-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag High throughput nucleic acid sequencing by expansion
US20110294135A1 (en) 2007-08-02 2011-12-01 BioDesic, LLC Compositions and methods for analyte detection and quantitation
JP2010539982A (ja) 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
AU2008308457A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Halcyon Molecular Sequencing nucleic acid polymers with electron microscopy
US20090139311A1 (en) 2007-10-05 2009-06-04 Applied Biosystems Inc. Biological Analysis Systems, Devices, and Methods
US20110020291A1 (en) 2007-11-17 2011-01-27 Debrabrata Banerjee Use of stem cells for wound healing
CN101586150B (zh) 2008-05-23 2016-09-28 陕西佰美基因股份有限公司 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
CN102171234A (zh) 2008-08-05 2011-08-31 康奈尔大学 光交联核酸水凝胶
US8519115B2 (en) 2008-08-14 2013-08-27 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US20100087325A1 (en) 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
US8309306B2 (en) 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
EP3587594B1 (en) 2008-12-19 2022-04-13 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
JP4528345B2 (ja) 2009-01-28 2010-08-18 シャープ株式会社 動画再生装置、動画再生方法、動画再生方法をコンピュータで実現するためのプログラム及びそのプログラムを記録した記録媒体
FR2948475A1 (fr) 2009-07-24 2011-01-28 Bionext Procede de caracterisation d'objets tridimensionnels
US8431151B2 (en) 2009-08-06 2013-04-30 Syracuse University Antimicrobial nanostructured hydrogel web containing silver
AU2010306862B2 (en) 2009-10-13 2015-08-27 Bruker Spatial Biology, Inc. Protein detection via nanoreporters
EP2496715B1 (en) 2009-11-03 2016-01-27 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection sequencing (qnps)
US9089512B2 (en) 2009-12-18 2015-07-28 President And Fellows Of Harvard College Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery
US20110257031A1 (en) 2010-02-12 2011-10-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid, biomolecule and polymer identifier codes
WO2011112634A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 California Institute Of Technology Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
GB201004292D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Olink Ab Assay for localised detection of analytes
AU2011237729B2 (en) 2010-04-05 2014-04-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
AU2011253222B2 (en) 2010-05-10 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
WO2011143583A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Illumina, Inc. Binding assays for markers
CN103180459B (zh) 2010-07-09 2016-10-19 赛尔冉迪思股份有限公司 3-d目的基因组区域的测序策略
WO2012056440A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
EP2633080B1 (en) 2010-10-29 2018-12-05 President and Fellows of Harvard College Method of detecting targets using fluorescently labelled nucleic acid nanotube probes
WO2012067911A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Nabsys, Inc. Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes
BR112013020773B1 (pt) 2011-02-15 2023-01-24 Leica Biosystems Newcastle Limited Método para a detecção localizada in situ de rna, método para a determinação da presença e da localização de uma sequência genética e método para a localização e/ou detecção in situ de um rna específico
JP5687514B2 (ja) 2011-02-17 2015-03-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸配列解析装置
DK2500436T3 (en) 2011-03-17 2016-08-29 Pasteur Institut A method, probe and kit for in situ hybridization of DNA and use thereof
DE102012008759A1 (de) 2011-05-04 2012-11-08 Genovoxx Gmbh Nukleosid-Triphosphat-Konjugate und Methoden zu deren Anwendung
EP2714938B1 (en) 2011-05-27 2017-11-15 President and Fellows of Harvard College Methods of amplifying whole genome of a single cell
WO2012164565A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
PL222511B1 (pl) 2011-06-08 2016-08-31 Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie Endorybonukleazy dsRNA
US10501791B2 (en) 2011-10-14 2019-12-10 President And Fellows Of Harvard College Sequencing by structure assembly
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
EP3272356A1 (en) 2012-02-24 2018-01-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
PT2800811T (pt) * 2012-05-25 2017-08-17 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
US9082418B2 (en) 2012-07-16 2015-07-14 Marvell International Ltd. Methods for reading data from a storage medium using a reader and storage devices
US11225683B2 (en) 2012-07-20 2022-01-18 Lsi Medience Corporation Photocoupling method using probe containing photoresponsive nucleic acids
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
AU2013302966B2 (en) 2012-08-15 2017-06-08 Lucid, Inc. Systems and methods for imaging tissue
CN102908119A (zh) 2012-09-26 2013-02-06 温州医学院眼视光研究院 一种共焦扫描成像系统及其像差控制方法
WO2014065596A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CA3034794A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140242664A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
JP2016501531A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作および治療適用のための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US9970024B2 (en) 2012-12-17 2018-05-15 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided human genome engineering
US10544405B2 (en) 2013-01-16 2020-01-28 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US9411930B2 (en) 2013-02-01 2016-08-09 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9330295B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Brown University Spatial sequencing/gene expression camera
JP6622183B2 (ja) 2013-03-15 2019-12-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）を用いたＲＮＡ誘導型ゲノム編集の特異性の増大
EP2992115B1 (en) 2013-04-30 2020-03-04 California Institute of Technology Multiplex labeling of molecules by sequential hybridization barcoding
US10510435B2 (en) 2013-04-30 2019-12-17 California Institute Of Technology Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization
DK3004349T3 (en) * 2013-05-29 2018-06-06 Cellectis Sa A method for producing precise DNA cleavage using CAS9 nickase activity
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
CN105451778B (zh) 2013-06-04 2021-08-03 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-导向的转录调控
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2015058052A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 The Broad Institute Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
EP3080259B1 (en) 2013-12-12 2023-02-01 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
GB201401885D0 (en) 2014-02-04 2014-03-19 Olink Ab Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR)
JP6456969B2 (ja) 2014-02-21 2019-01-23 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 膨張顕微鏡法
KR102105236B1 (ko) 2014-11-21 2020-04-28 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 무효소 및 무증폭 시퀀싱
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
US11535882B2 (en) 2015-03-30 2022-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
MX2018005611A (es) 2015-11-03 2018-11-09 Harvard College Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico.
US10386300B2 (en) 2015-12-21 2019-08-20 Verily Life Sciences Llc Spectrally and spatially multiplexed fluorescent probes for in situ cell labeling
US10844426B2 (en) 2016-03-17 2020-11-24 President And Fellows Of Harvard College Methods for detecting and identifying genomic nucleic acids
IL302802A (en) 2016-07-05 2023-07-01 California Inst Of Techn Fractional initiator hybridization chain reaction
CN117551741A (zh) 2017-03-31 2024-02-13 乌尔蒂维尤股份有限公司 Dna-抗原交换和扩增

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell.,152(5):1173-1183(2013.2.28.)*
Nat Methods.,10(3):239-242(2013.2.3.)*
SCIENCE.,337:816-821(2012.6.28.)*
SCIENCE.,339:823-826(2013.2.15.)*

Also Published As

Publication number Publication date
MX2015016798A (es) 2016-10-26
EP3003392B1 (en) 2019-10-23
JP7119055B2 (ja) 2022-08-16
MY177814A (en) 2020-09-23
JP6621738B2 (ja) 2019-12-18
CN113846096A (zh) 2021-12-28
US11981917B2 (en) 2024-05-14
SG10201913068PA (en) 2020-02-27
AU2020203977B2 (en) 2021-05-27
EP3603679B1 (en) 2022-08-10
AU2014274939B2 (en) 2020-03-19
KR20210095235A (ko) 2021-07-30
MY197877A (en) 2023-07-22
EP4159243A1 (en) 2023-04-05
RU2015156198A3 (ko) 2018-05-08
NZ715280A (en) 2021-06-25
RU2756865C2 (ru) 2021-10-06
IL302205A (en) 2023-06-01
IL284773A (en) 2021-08-31
JP2019122384A (ja) 2019-07-25
EP3603679A1 (en) 2020-02-05
JP7376650B2 (ja) 2023-11-08
WO2014197568A2 (en) 2014-12-11
AU2021221488A1 (en) 2021-09-16
SG10201710030QA (en) 2018-01-30
IL284773B2 (en) 2023-09-01
JP2022166077A (ja) 2022-11-01
JP2016521554A (ja) 2016-07-25
US20240175057A1 (en) 2024-05-30
KR20160014036A (ko) 2016-02-05
SG11201509962QA (en) 2016-01-28
BR112015030491A2 (pt) 2017-07-25
CN105451778B (zh) 2021-08-03
RU2019114706A (ru) 2019-10-11
EP3003392A2 (en) 2016-04-13
CN105451778A (zh) 2016-03-30
CA2914638A1 (en) 2014-12-11
IL284773B1 (en) 2023-05-01
US20230131972A1 (en) 2023-04-27
AU2020203977A1 (en) 2020-07-02
KR20230042154A (ko) 2023-03-27
NZ753951A (en) 2021-09-24
WO2014197568A3 (en) 2015-03-12
JP2021045153A (ja) 2021-03-25
NZ753950A (en) 2021-09-24
RU2690935C2 (ru) 2019-06-06
JP7036511B2 (ja) 2022-03-15
AU2024204479A1 (en) 2024-07-18
RU2019114706A3 (ko) 2020-09-25
AU2014274939A1 (en) 2016-01-07
CA3176690A1 (en) 2014-12-11
JP2024012387A (ja) 2024-01-30
IL242959B (en) 2021-08-31
EP3003392A4 (en) 2017-05-03
BR112015030491A8 (pt) 2019-12-24
KR102282990B1 (ko) 2021-07-28
MX2021009672A (es) 2021-09-08
ES2930537T3 (es) 2022-12-16
AU2021221488B2 (en) 2024-03-28
RU2015156198A (ru) 2017-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102512979B1 (ko) Rna-가이드된 전사 조절
US10767194B2 (en) RNA-guided transcriptional regulation
KR102481330B1 (ko) Rna-가이드된 유전자 조절 및 편집을 위한 직교 cas9 단백질
NZ753950B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation
NZ753951B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation
NZ715280B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20210722

Application number text: 1020157036892

Filing date: 20151229

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210726

Comment text: Request for Examination of Application

PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220211

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20221216

PG1601 Publication of registration