RU2690935C2 - Направляемая рнк регуляция транскрипции - Google Patents
Направляемая рнк регуляция транскрипции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2690935C2 RU2690935C2 RU2015156198A RU2015156198A RU2690935C2 RU 2690935 C2 RU2690935 C2 RU 2690935C2 RU 2015156198 A RU2015156198 A RU 2015156198A RU 2015156198 A RU2015156198 A RU 2015156198A RU 2690935 C2 RU2690935 C2 RU 2690935C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- nucleic acid
- rna
- protein
- domain
- Prior art date
Links
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title abstract description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 160
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 159
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 159
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 94
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 100
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 77
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 74
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 41
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 34
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 34
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 28
- 101000709520 Chlamydia trachomatis serovar L2 (strain 434/Bu / ATCC VR-902B) Atypical response regulator protein ChxR Proteins 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 16
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 14
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 12
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 62
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 abstract 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 121
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 79
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 71
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 34
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 25
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 25
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 24
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102100024364 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 8 Human genes 0.000 description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 11
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 6
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 5
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 102100039486 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 description 2
- 241000423296 Gluconacetobacter diazotrophicus PA1 5 Species 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108060003760 HNH nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000029812 HNH nuclease Human genes 0.000 description 2
- 101000609775 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Proteins 0.000 description 2
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101150085710 OCT4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000013515 script Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 241001041760 Acidothermus cellulolyticus 11B Species 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 241000417230 Actinobacillus succinogenes 130Z Species 0.000 description 1
- 241000778935 Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 Species 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000257169 Bacillus cereus ATCC 10987 Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 241000586987 Bifidobacterium dentium Bd1 Species 0.000 description 1
- 241001209261 Bifidobacterium longum DJO10A Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000589173 Bradyrhizobium Species 0.000 description 1
- 241001453247 Campylobacter jejuni subsp. doylei Species 0.000 description 1
- 241000941427 Campylobacter lari RM2100 Species 0.000 description 1
- 241001034636 Capnocytophaga ochracea DSM 7271 Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241001509423 Clostridium botulinum B Species 0.000 description 1
- 241001509504 Clostridium botulinum F Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241001487058 Corynebacterium efficiens YS-314 Species 0.000 description 1
- 241000671338 Corynebacterium glutamicum R Species 0.000 description 1
- 241001525611 Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385 Species 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241001082278 Desulfovibrio salexigens DSM 2638 Species 0.000 description 1
- 241000688137 Diaphorobacter Species 0.000 description 1
- 241000933091 Dinoroseobacter shibae DFL 12 = DSM 16493 Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000448576 Elusimicrobium minutum Pei191 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000608038 Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85 Species 0.000 description 1
- 241000359186 Finegoldia magna ATCC 29328 Species 0.000 description 1
- 241000382842 Flavobacterium psychrophilum Species 0.000 description 1
- 101150106478 GPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108050008753 HNH endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000000310 HNH endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001453258 Helicobacter hepaticus Species 0.000 description 1
- 101001057565 Heliocidaris crassispina Exogastrula-inducing polypeptide Proteins 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 1
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001596092 Kribbella flavida DSM 17836 Species 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 1
- 241001427851 Lactobacillus salivarius UCC118 Species 0.000 description 1
- 241001193656 Legionella pneumophila str. Paris Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001378931 Methanococcus maripaludis C7 Species 0.000 description 1
- 241000825684 Mycobacterium abscessus ATCC 19977 Species 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 241000107400 Mycoplasma mobile 163K Species 0.000 description 1
- 241001135743 Mycoplasma penetrans Species 0.000 description 1
- 241000051161 Mycoplasma synoviae 53 Species 0.000 description 1
- 101150012532 NANOG gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001648684 Nitrobacter hamburgensis X14 Species 0.000 description 1
- 241001037736 Nocardia farcinica IFM 10152 Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000601272 Parvibaculum lavamentivorans DS-1 Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000549884 Persephonella marina EX-H1 Species 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 241000773205 Pseudarthrobacter chlorophenolicus A6 Species 0.000 description 1
- 241000695265 Pseudoalteromonas atlantica T6c Species 0.000 description 1
- 101710086053 Putative endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000647111 Rhodococcus erythropolis PR4 Species 0.000 description 1
- 241001459443 Rhodococcus jostii RHA1 Species 0.000 description 1
- 241001113889 Rhodococcus opacus B4 Species 0.000 description 1
- 241001303434 Rhodopseudomonas palustris BisB18 Species 0.000 description 1
- 241001303431 Rhodopseudomonas palustris BisB5 Species 0.000 description 1
- 241000134686 Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 Species 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000516659 Roseiflexus Species 0.000 description 1
- 241000504328 Roseiflexus castenholzii DSM 13941 Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000933177 Shewanella pealeana ATCC 700345 Species 0.000 description 1
- 241001496704 Slackia heliotrinireducens DSM 20476 Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000756832 Streptobacillus moniliformis DSM 12112 Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241001209210 Streptococcus agalactiae A909 Species 0.000 description 1
- 241001540742 Streptococcus agalactiae NEM316 Species 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 1
- 241001167808 Streptococcus gallolyticus UCN34 Species 0.000 description 1
- 241001147754 Streptococcus gordonii str. Challis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 241000672607 Streptococcus mutans NN2025 Species 0.000 description 1
- 241000320123 Streptococcus pyogenes M1 GAS Species 0.000 description 1
- 241000103155 Streptococcus pyogenes MGAS10270 Species 0.000 description 1
- 241000103160 Streptococcus pyogenes MGAS10750 Species 0.000 description 1
- 241000103154 Streptococcus pyogenes MGAS2096 Species 0.000 description 1
- 241001520169 Streptococcus pyogenes MGAS315 Species 0.000 description 1
- 241001148739 Streptococcus pyogenes MGAS5005 Species 0.000 description 1
- 241001332083 Streptococcus pyogenes MGAS6180 Species 0.000 description 1
- 241000103156 Streptococcus pyogenes MGAS9429 Species 0.000 description 1
- 241001496716 Streptococcus pyogenes NZ131 Species 0.000 description 1
- 241001455236 Streptococcus pyogenes SSI-1 Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 1
- 241001496699 Thermomonospora curvata DSM 43183 Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241000322994 Tolumonas auensis DSM 9187 Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000999858 Treponema denticola ATCC 35405 Species 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000847071 Verminephrobacter eiseniae EF01-2 Species 0.000 description 1
- 102100028885 Vitamin K-dependent protein S Human genes 0.000 description 1
- 241000605939 Wolinella succinogenes Species 0.000 description 1
- 241000883281 [Clostridium] cellulolyticum H10 Species 0.000 description 1
- 241000714896 [Eubacterium] rectale ATCC 33656 Species 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 108010035806 endodeoxyribonuclease PacI Proteins 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- -1 linker nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001496653 uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs-D17 Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3513—Protein; Peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Представлены способы модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетках, включающие введение в клетки первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК, комплементарных к ДНК, причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, введение в клетки второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей безнуклеазный белок Cas9, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими РНК, введение в клетки третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен, причем одна или несколько РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются, при этом одна или несколько РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 21 ил., 2 табл., 17 пр.
Description
Данные о родственных заявках
Настоящая заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США No. 61/830,787, поданной 4 июня 2013 г., которая включена сюда путем ссылки во всей полноте на все случаи.
Заявление о правительственных интересах
Настоящее изобретение было совершено при поддержке правительства по гранту No. Р50 HG005550 от Национальных институтов здравоохранения и DE-FG02-02ER63445 от Министерства энергетики США. Правительство имеет определенные права на это изобретение.
Уровень техники
Бактериальные и архейные системы CRISPR-Cas зависят от коротких направляющих РНК, которые в комплексе с белками Cas направляют деградацию комплементарных последовательностей, присутствующих в проникающей чужеродной нуклеиновой кислоте. См. Deltcheva Ε. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNAse III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas G, Barrangou R., Horvath P. & Siksnys V. Cas9-rRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 109, E2579-2586 (2012); Jinek M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Research 39, 9275-9282 (2011); и Bhaya D., Davison M. & Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics 45, 273-297 (2011). Недавняя реконструкция системы CRISPR S. pyogenes II-го типа in vitro показала, что crPHK ("CRISPR-РНК"), слитая с обычной транс-кодируемой tracr-РНК ("транс-активирующая CRISPR-РНК"), достаточна для того, чтобы направить белок Cas9 на специфичное к последовательности расщепление целевых последовательностей ДНК, соответствующих этой cr-РНК. Экспрессия направляющей РНК (gRNA, гидРНК), гомологичной сайту мишени, приводит к привлечению Cas9 и деградации ДНК мишени. См. H. Deveau et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008).
Сущность изобретения
Различные аспекты настоящего изложения касаются комплекса из направляющей РНК, ДНК-связывающего белка и последовательности двухцепочечной ДНК-мишени. Согласно некоторым аспектам, ДНК-связывающие белки в рамках настоящего изобретения включают белок, образующий комплекс с направляющей РНК, причем направляющая РНК направляет комплекс на последовательность двухцепочечной ДНК, при этом комплекс связывается с этой последовательностью ДНК. Этот аспект настоящего изобретения может быть назван совместной локализацией РНК и ДНК-связывающего белка на или с двухцепочечной ДНК. Таким образом, комплекс ДНК-связывающего белка с направляющей РНК можно использовать для локализации регулирующего транскрипцию белка или домена на ДНК мишени с тем, чтобы регулировать экспрессию целевой ДНК.
Согласно некоторым аспектам, предусмотрен способ модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК (рибонуклеиновых кислот), комплементарных ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоте), причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими РНК, введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен, причем одна или несколько РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются, при этом одна или несколько РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, также кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком. Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько РНК, также кодирует мишень РНК-связывающего домена, а чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, также кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
Согласно одному аспекту, клетка представлена эукариотической клеткой. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой млекопитающих.
Согласно одному аспекту, РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов. Согласно одному аспекту, РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния. Согласно одному аспекту, целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представлены направляющей РНК. Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК. Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя последовательность спейсера и последовательность, гибридизующуюся с tracr (tracr mate). Направляющая РНК также может включать в себя последовательность tracr, часть которой гибридизуется с последовательностью tracr mate. Направляющая РНК также может включать в себя последовательность линкерной нуклеиновой кислоты, которая связывает последовательность tracr mate и последовательность tracr, что приводит к слиянию tracr-РНК и cr-РНК. Последовательность спейсера связывается с целевой ДНК, как-то посредством гибридизации.
Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя усеченную последовательность спейсера. Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя усеченную последовательность спейсера, укороченную на 1 основание на 5'-конце последовательности спейсера. Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя усеченную последовательность спейсера, укороченную на 2 основания на 5'-конце последовательности спейсера. Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя усеченную последовательность спейсера, укороченную на 3 основания на 5'-конце последовательности спейсера. Согласно одному аспекту, направляющая РНК включает в себя усеченную последовательность спейсера, укороченную на 4 основания на 5'-конце последовательности спейсера. Соответственно, последовательность спейсера может быть укорочена на 1-4 основания на 5'-конце последовательности спейсера.
Согласно некоторым воплощениям, последовательность спейсера может содержать от 16 до 20 нуклеотидов, гибридизующихся с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым воплощениям, последовательность спейсера может содержать примерно 20 нуклеотидов, гибридизующихся с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно некоторым аспектам, последовательность линкерной нуклеиновой кислоты может содержать от 4 до 6 нуклеотидов.
Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 60 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 64 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 65 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 66 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 67 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 68 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 69 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 70 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 80 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 90 до 500 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 100 до 500 нуклеотидов.
Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 60 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 64 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность traer может содержать от 65 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 66 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 67 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 68 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 69 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 70 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 80 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 90 до 200 нуклеотидов. Согласно некоторым аспектам, последовательность tracr может содержать от 100 до 200 нуклеотидов.
Типичная направляющая РНК представлена на фиг. 5В.
Согласно одному аспекту, ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
Согласно некоторым аспектам, предусмотрен способ модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК (рибонуклеиновых кислот), комплементарных ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоте), причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок из системы CRISP II типа, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими РНК, введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен, причем одна или несколько РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются, при этом одна или несколько РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок из системы CRISP II типа, также кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком из системы CRISP II типа. Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько РНК, также кодирует мишень РНК-связывающего домена, а чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, также кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
Согласно одному аспекту, клетка представлена эукариотической клеткой. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой млекопитающих.
Согласно одному аспекту, РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов. Согласно одному аспекту, РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния. Согласно одному аспекту, целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представлены направляющей РНК. Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
Согласно одному аспекту, ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, предусматривающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК (рибонуклеиновых кислот), комплементарных ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоте), причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, введение второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей безнуклеазный белок Cas9, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими РНК, и введение в клетку третей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен, при этом одна или несколько РНК, безнуклеазный белок Cas9, и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются, и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая безнуклеазный белок Cas9, также кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с безнуклеазным белком Cas9. Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько РНК, также кодирует мишень РНК-связывающего домена, а чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, также кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
Согласно одному аспекту, клетка представлена эукариотической клеткой. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой млекопитающих.
Согласно одному аспекту, РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов. Согласно одному аспекту, РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния. Согласно одному аспекту, целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представлены направляющей РНК. Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
Согласно одному аспекту, ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
Согласно одному аспекту, предусмотрена клетка, содержащая первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько РНК, комплементарных ДНК, причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту, вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, и третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую регулирующий транскрипцию белок или домен, при этом одна или несколько РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен входят в состав комплекса совместной локализации для целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, также кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком. Согласно одному аспекту, чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько РНК, также кодирует мишень РНК-связывающего домена, а чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, также кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
Согласно одному аспекту, клетка представлена эукариотической клеткой. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой млекопитающих.
Согласно одному аспекту, РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов. Согласно одному аспекту, РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно одному аспекту, регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния. Согласно одному аспекту, целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представлены направляющей РНК. Согласно одному аспекту, одна или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
Согласно одному аспекту, ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
Согласно некоторым аспектам, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок представлен РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком системы CRISPR II-го типа. Согласно некоторым аспектам, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок представляет собой безнуклеазный белок Cas9.
Согласно некоторым аспектам, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никазу, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза экспрессируются, при этом по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на ДНК целевой нуклеиновой кислоты и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов (nicks).
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никазу системы CRISPR II-го типа, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза системы CRISPR II-го типа экспрессируются, при этом по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза системы CRISPR II-го типа локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на целевой нуклеиновой кислоте - ДНК и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов (nicks).
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один белок-никазу Cas9 с одним неактивным нуклеазным доменом, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один белок-никаза Cas9 экспрессируются, при этом по меньшей мере один белок-никаза Cas9 локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на ДНК целевой нуклеиновой кислоты и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов (nicks).
В соответствии со способами изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на одной той же нити двухцепочечной ДНК. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на одной и той же нити двухцепочечной ДНК, что приводит к гомологичной рекомбинации. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и создают двухцепочечные разрывы. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и создают двухцепочечные разрывы, что приводит к негомологичному соединению концов. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и смещены относительно друг друга. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК, смещены относительно друг друга и создают двухцепочечные разрывы. Согласно одному аспекту, два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК, смещены относительно друг друга и создают двухцепочечные разрывы, что приводит к негомологичному соединению концов. Согласно одному аспекту, способ дополнительно включает введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность донорной нуклеиновой кислоты, при этом два или несколько одноцепочечных разрывов приводят к гомологичной рекомбинации целевой нуклеиновой кислоты с последовательностью донорной нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никазу, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза экспрессируются, при этом по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на ДНК целевой нуклеиновой кислоты и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов, причем эти два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и создают двухцепочечные разрывы, что приводит к фрагментации целевой нуклеиновой кислоты, тем самым предотвращая экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никазу системы CRISPR II-го типа, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза системы CRISPR II-го типа экспрессируются, при этом по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза системы CRISPR II-го типа локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на ДНК целевой нуклеиновой кислоты и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов, причем эти два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и создают двухцепочечные разрывы, что приводит к фрагментации целевой нуклеиновой кислоты, тем самым предотвращая экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, предусмотрен способ изменения целевой нуклеиновой кислоты входящей в состав ДНК в клетке, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один белок-никазу Cas9 с одним неактивным нуклеазным доменом, который направляется двумя или несколькими РНК, причем эти две или несколько РНК и по меньшей мере один белок-никаза Cas9 экспрессируются, при этом по меньшей мере один белок-никаза Cas9 локализуется совместно с двумя или несколькими РНК на ДНК целевой нуклеиновой кислоты и надрезает ДНК целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего образуются два или несколько соседних одноцепочечных разрывов, причем эти два или несколько соседних одноцепочечных разрывов находятся на разных нитях двухцепочечной ДНК и создают двухцепочечные разрывы, что приводит к фрагментации целевой нуклеиновой кислоты, тем самым предотвращая экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, предусмотрены клетки, содержащие первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую две или несколько РНК, причем каждая РНК комплементарна к области ДНК прилегающей к целевой нуклеиновой кислоте, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никазу, при этом две или несколько РНК и по меньшей мере один РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза входят в состав комплекса совместной локализации для ДНК целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному аспекту, РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза представлен РНК-направляемым ДНК-связывающим белком никазы из системы CRISPR II-го типа. Согласно одному аспекту, РНК-направляемый ДНК-связывающий белок-никаза представлен белком никазы Cas9 с одним неактивным нуклеазным доменом.
Согласно одному аспекту, клетка представлена эукариотической клеткой. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных. Согласно одному аспекту, клетка представлена клеткой млекопитающих.
Согласно одному аспекту, РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов. Согласно одному аспекту, РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
Согласно одному аспекту, целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
Согласно одному аспекту, две или несколько РНК представлены направляющей РНК. Согласно одному аспекту, две или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
Согласно одному аспекту, ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
Другие признаки и преимущества определенных воплощений настоящего изобретения станут более понятными из нижеследующего описания воплощений и их чертежей, а также из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Патент или патентная заявка содержит рисунки, выполненные в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветными рисунками будут предоставляться Ведомством по запросу при оплате необходимой пошлины. Вышеизложенные и другие признаки и преимущества настоящих воплощений станут более понятными из нижеследующего подробного описания воплощений вместе с прилагаемыми рисунками.
На фиг. 1А и фиг. 1В представлены схемы РНК-направляемой активации транскрипции. На фиг. 1С представлено схематическое изображение конструкции-репортера. На фиг. 1D представлены данные, свидетельствующие, что слитые белки Cas9N-VP64 проявляют РНК-направляемую активацию транскрипции при измерении методами сортировки клеток с активируемой флуоресценцией (FACS) и иммунофлуоресценции (IF). На фиг. 1Е представлены данные оценки методом FACS и IF, свидетельствующие о специфичной к последовательности гидРНК активации транскрипции репортерными конструкциями в присутствии Cas9N, VP64 MS2 и гидРНК, несущей соответствующие сайты связывания аптамера MS2. На фиг. 1F представлены данные, свидетельствующие об индукции транскрипции под действием индивидуальных гидРНК и множественных гидРНК.
На фиг. 2А представлена методология оценки ландшафта нацеливания у комплексов Cas9-гидРНК и TALEs. На фиг. 2 В представлены данные, показывающие, что комплекс Cas9-гидРНК допускает в среднем 1-3 мутации в последовательностях своих мишеней. На фиг. 2С представлены данные, показывающие, что комплекс Cas9-гидРНК почти нечувствителен к точечным мутациям, за исключением тех, которые локализуются в последовательности РАМ. На фиг. 2D представлены данные в виде термограммы (heat-plot), показывающие, что введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность комплекса Cas9-гидРНК. На фиг. 2Е представлены данные, показывающие, что 18-мер TALE допускает в среднем 1-2 мутации в последовательности своей мишени. На фиг. 2F приведены данные, показывающие, что 18-мер TALE, аналогично комплексам Cas9-гидРНК, почти нечувствителен к несоответствию по 1 основанию у своей мишени. На фиг. 2G представлены данные в виде термограммы, показывающие, что введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность 18-мера TALE.
На фиг. 3А представлено схематическое изображение структуры направляющих РНК. На фиг. 3В представлены данные, показывающие частоту негомологичного соединения концов для смещенных одноцепочечных разрывов, образующих (неспаренные) свисающие 5'-концы, и смещенных одноцепочечных разрывов, образующих свисающие 3'-концы. На фиг. 3С представлены данные, показывающие частоту в % нацеливания для смещенных одноцепочечных разрывов, образующих свисающие 5'-концы, и смещенных одноцепочечных разрывов, образующих свисающие 3'-концы.
На фиг. 4А схематически представлен координирующий металл остаток в RuvC из PDB ID: 4ЕР4 (синий) в положении D7 (слева), схема эндонуклеазных доменов HNH из PDB IDs: 3М7К (оранжевый) и 4H9D (голубой), включая координированный ион Mg (серый шар) и ДНК из 3М7К (фиолетовая) (посредине), и список проанализированых мутантов (справа). На фиг. 4В представлены данные, показывающие отсутствие заметной нуклеазной активности у мутантов Cas9 m3 и m4, а также соответствующих слияний их с VP64. На фиг. 4С представлен вид данных из фиг. 4В при более высоком разрешении.
На фиг. 5А представлена схема метода гомологичной рекомбинации для определения активности Cas9-гидРНК. На фиг. 5 В представлены направляющие РНК со вставками случайных последовательностей и частота гомологичной рекомбинации.
На фиг. 6А представлена схема направляющих РНК для гена ОСТ4. На фиг. 6В представлена активация транскрипции для конструкции репортера промотор-люцифераза. На фиг. 6С представлена активация транскрипции по данным количественного метода ПЦР эндогенных генов.
На фиг. 7А представлена схема направляющих РНК для гена REX1. На фиг. 7В представлена активация транскрипции для конструкции репортера промотор-люцифераза. На фиг. 7С представлена активация транскрипции по данным количественного метода ПЦР эндогенных генов.
На фиг. 8А схематически представлена блок-схема анализа специфичности высокого уровня для расчета нормированных уровней экспрессии. На фиг. 8В представлены данные по распределению сайтов связывания в зависимости от числа несоответствий, генерируемых в смещенной библиотеке конструкций. Слева: теоретическое распределение. Справа: фактическое распределение в реальной библиотеке конструкций TALE. На фиг. 8С представлены данные о распределении тегов, агрегированных с сайтами связывания, в зависимости от числа несоответствий. Слева: фактическое распределение в положительном контрольном образце. Справа: фактическое распределение в образце, в котором был индуцирован не контрольный TALE.
На фиг. 9А представлены данные по анализу ландшафта нацеливания у комплекса Cas9-гидРНК, свидетельствующие о допустимости 1-3 мутаций в последовательности его мишени. На фиг. 9В представлены данные по анализу ландшафта нацеливания у комплекса Cas9-гидPHK, свидетельствующие о допустимости точечных мутаций, за исключением тех, которые локализованы в последовательности РАМ. На фиг. 9С представлены данные в виде термограммы по анализу ландшафта нацеливания у комплекса Cas9-гидРНК, показывающие, что введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность. На фиг. 9D представлены данные анализа опосредованной нуклеазой HR, подтверждающие, что предполагаемый РАМ для Cas9 S. pyogenes представлен не только NGG, но и NAG.
На фиг. 10А представлены данные анализа опосредованной нуклеазой гомологичной рекомбинации, подтверждающие, что 18-меры TALE допускают множественные мутации в последовательности своей мишени. На фиг. 10B представлены данные по анализу ландшафта нацеливания у TALEs 3 разных размеров (18-мера, 14-мера и 10-мера). На фиг. 10С представлены данные для 10-мера TALE, показывающие несоответствия с разрешением почти в 1 основание. На фиг.10D представлены данные в виде термограммьп для 10-мера TALE, показывающие несоответствия с разрешением почти в 1 основание.
На фиг. 11A представлены разработанные направляющие РНК. На фиг. 11B представлена частота негомологичного соединения концов для различных направляющих РНК.
На фиг. 12А изображен ген Sox2. На фиг. 12B изображен ген Nanog.
На фигурах 13A-13F изображен ландшафт нацеливания двух дополнительных комплексов Cas9-гидРНК.
На фиг. 14А отображен профиль специфичности двух гидРНК (дикого типа (SEQ ID NO: 88) и мутантов (SEQ ID NOs: 89-90). Различия в последовательности выделены красным цветом. На фигурах 14B и 14С показано, что данный анализ был специфичен для гидРНК, которую оценивали (другое изображение данных с фигуры 13D).
На фигурах 15A-15D изображена гидРНК2 (Фигуры 15А-В) и гидРНК3 (фигуры 15C-D), которые несут одиночные мутации или мутации по два основания (выделенные красным) в последовательности спейсера по сравнению с мишенью. Представлены последовательности SEQ ID NO: 91-131.
На фигурах 16A-16D представлен нуклеазный анализ двух независимых гидРНК, где анализировали гидРНК1 (фигуры 16А-В) и гидРНК3 (фигуры 16C-D), которые усечены с 5' конца своего спейсера. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 66, 185-186 и 133-140.
На фигурах 17А-17B изображен опосредованный нуклеазой анализ HR, где показано, что РАМ у S. pyogenes Cas9 представлена NGG а также NAG. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 67-69 и 141.
На фигурах 18А-18B изображен опосредованный нуклеазой анализ HR, где было подтверждено, что 18-мер TALE невосприимчив в множественным мутациям в своей последовательности-мишени. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 70-73.
На фигурах 19А-19С показано сравнение специфичности мономера TALE против специфичности белка TALE. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 142-150.
На фигурах 20А-20B приведены данные, касающиеся смещенных одноцепочечных разрывов. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 151-158.
На фигурах 21А-21С приведены данные, касающиеся смещенных одноцепочечных разрывов и профилей NHEJ. Представлены последовательности SEQ ID NOs: 159-184 и 187.
Раскрытие сущности изобретения
Воплощения настоящего изобретения основываются на использовании ДНК-связывающих белков для совместной локализации регулирующих транскрипцию белков или доменов на ДНК таким образом, чтобы управлять целевой нуклеиновой кислотой. Такие ДНК-связывающие белки хорошо известны специалистам в данной области и их используют для связывания ДНК в различных целях. Такие ДНК-связывающие белки могут быть природного происхождения. ДНК-связывающие белки, входящие в объем настоящего изобретения, включают такие, которые могут направляться РНК, именуемой здесь направляющей РНК. Согласно этому аспекту, направляющая РНК и РНК-направляемый ДНК-связывающий белок образуют совместно локализуемый комплекс на ДНК. Согласно некоторым аспектам, ДНК-связывающий белок может представлять собой безнуклеазный ДНК-связывающий белок. Согласно этому аспекту, безнуклеазный ДНК-связывающий белок может быть результатом изменения или модификации ДНК-связывающего белка, обладающего нуклеазной активностью. Такие ДНК-связывающие белки, обладающие нуклеазной активностью, известны специалистам и включают ДНК-связывающие белки природного происхождения, обладающие нуклеазной активностью, как-то белки Cas9, присутствующие, к примеру, в системах CRISPR II-го типа. Такие белки Cas9 и системы CRISPR II-го типа хорошо описаны в данной области. Напр., см. Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477, которая включена сюда путем ссылки во всей полноте, включая всю дополнительную информацию.
Типичные ДНК-связывающие белки, обладающие нуклеазной активностью, функционируют для надрезания или разрезания двухцепочечной ДНК. Такая нуклеазная активность может быть следствием того, что ДНК-связывающий белок содержит одну или несколько полипептидных последовательностей, проявляющих нуклеазную активность. Такие типичные ДНК-связывающие белки могут содержать два отдельных нуклеазных домена, причем каждый домен отвечает за разрезание или надрезание определенной нити двухцепочечной ДНК. Типичные полипептидные последовательности, обладающие нуклеазной активностью, известны специалистам и включают нуклеазный домен MCRA-HNH и нуклеазный домен типа RuvC. Соответственно, примерами ДНК-связывающих белков служат те, которые по своей природе содержат один или несколько нуклеазных доменов MCRA-HNH и нуклеазных доменов типа RuvC. Согласно некоторым аспектам, ДНК-связывающий белок подвергается модификации или иным изменениям для инактивации нуклеазной активности. Такие изменения или модификации включают изменения одной или нескольких аминокислот для инактивации нуклеазной активности или нуклеазного домена. Такие модификации включают удаление полипецтидной последовательности или полипептидных последовательностей, проявляющих нуклеазную активность, т.е. нуклеазного домена, с тем, чтобы в ДНК-связывающем белке отсутствовала полипептидная последовательность или полипептидные последовательности, проявляющие нуклеазную активность, т.е. нуклеазный домен. Другие модификации для инактивации нуклеазной активности станут понятными специалистам в данной области на основе настоящего описания. Соответственно, безнуклеазный ДНК-связывающий белок включает полипептидные последовательности, подвергнутые модификации для инактивации нуклеазной активности, или же удаление полипептидной последовательности или последовательностей для инактивации нуклеазной активности. Безнуклеазный ДНК-связывающий белок сохраняет способность к связыванию с ДНК, даже если нуклеазная активность была инактивирована. Соответственно, ДНК-связывающий белок включает полипептидную последовательность или последовательности, необходимые для связывания с ДНК, но может отсутствовать одна или несколько или же все нуклеазные последовательности, проявляющие нуклеазную активность. Соответственно, ДНК-связывающий белок включает полипептидную последовательность или последовательности, необходимые для связывания с ДНК, но у одной или нескольких или же всех нуклеазных последовательностей может быть инактивирована нуклеазная активность.
Согласно одному аспекту, ДНК-связывающий белок, содержащий два или несколько нуклеазных доменов, может быть модифицирован или изменен так, чтобы инактивировать все нуклеазные домены, кроме одного. Такой модифицированный или измененный ДНК-связывающий белок именуется ДНК-связывающим белком-никазой, если этот ДНК-связывающий белок разрезает или надрезает только одну нить двухцепочечной ДНК. А если он направляется на ДНК с помощью РНК, то такой ДНК-связывающий белок-никаза именуется РНК-направляемым ДНК-связывающим белком-никазой.
Типичным ДНК-связывающим белком является РНК-направляемый ДНК-связывающий белок системы CRISPR II-го типа, у которого отсутствует нуклеазная активность. Типичным ДНК-связывающим белком является безнуклеазный белок Cas9. Типичным ДНК-связывающим белком является белок-никаза Cas9.
У S. pyogenes Cas9 создает двухцепочечный разрыв с тупыми концами за 3 п.о. до примыкающего к протоспейсеру мотива (РАМ) с помощью процесса, опосредованного двумя каталитическими доменами в этом белке: доменом HNH, который расщепляет комплементарную нить ДНК, и доменом типа RuvC, который расщепляет некомплементарную нить. См. Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012), включенную сюда путем ссылки во всей полноте. Белки Cas9, как известно, существуют во многих системах CRISPR II-го типа, включая следующие, приведенные в дополнительной информации к Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHA1; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 11B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida DSM 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bd1; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX H1; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RS1; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Pei191; uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC118; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst. CH1; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes M1 GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS 10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS 10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 18311; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum В Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAi1; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 11170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitides 053442; Neisseria meningitides alpha14; Neisseria meningitides Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81116; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U112; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis tularensis; Francisella tularensis WY96-3418; и Treponema denticola ATCC 35405. Соответственно, аспекты настоящего изобретения направлены на белок Cas9, присутствующий в системе CRISPR II-го типа, который стал безнуклеазным или который стал никазой, как описано здесь.
Белок Cas9 может упоминаться специалистами в литературе как Csn1. Последовательность белка Cas9 S. pyogenes, который является предметом описанных здесь экспериментов, представлена ниже. См. Deltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте.
Согласно некоторым аспектам описанных здесь способов РНК-направляемой регуляции генома, Cas9 подвергается изменениям для снижения, существенного снижения или устранения нуклеазной активности. Согласно одному аспекту, нуклеазная активность Cas9 уменьшается, существенно уменьшается или инактивируется путем изменения нуклеазного домена RuvC или нуклеазного домена HNH. Согласно одному аспекту, инактивируется нуклеазный домен RuvC. Согласно одному аспекту, инактивируется нуклеазный домен HNH. Согласно одному аспекту, инактивируется нуклеазный домен RuvC и нуклеазный домен HNH. Согласно другому аспекту, предусматриваются белки Cas9, у которых инактивирован нуклеазный домен RuvC и нуклеазный домен HNH. Согласно другому аспекту, предусматриваются безнуклеазные белки Cas9, у которых инактивирован нуклеазный домен RuvC и нуклеазный домен HNH. Согласно другому аспекту, предусматривается никаза Cas9, у которой инактивирован либо нуклеазный домен RuvC, либо нуклеазный домен HNH, при этом оставшийся нуклеазный домен остается активным для нуклеазной активности. Таким образом, разрезается или надрезается только одна нить двухцепочечной ДНК.
Согласно другому аспекту, предусматриваются безнуклеазные белки Cas9, у которых одна или несколько аминокислот у Cas9 изменяются или же удаляются для получения безнуклеазных белков Cas9. Согласно одному аспекту, аминокислоты включают D10 и Н840. См. Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012). Согласно другому аспекту, аминокислоты включают D839 и N863. Согласно одному аспекту, одна или несколько или все аминокислоты D10, Н840, Н863 и D839 заменяются такой аминокислотой, которая снижает, существенно снижает или устраняет нуклеазную активность. Согласно одному аспекту, одна или несколько или все аминокислоты D10, Н840, Н863 и D839 заменяются на аланин. Согласно одному аспекту, белок Cas9, у которого одна или несколько или все аминокислоты D10, Н840, D839 и Н863 заменены такой аминокислотой, которая снижает, существенно снижает или устраняет нуклеазную активность, типа аланина, именуется безнуклеазным Cas9 или Cas9N и проявляет сниженную или отсутствующую нуклеазную активность, или же нуклеазная активность отсутствует или практически отсутствует на уровне предела обнаружения. Согласно этому аспекту, нуклеазная активность у Cas9N может не обнаруживаться известными методами, т.е. она ниже предела обнаружения известными методами.
Согласно одному аспекту, безнуклеазный белок Cas9 охватывает и его гомологи и ортологи, которые сохраняют способность белка к связыванию с ДНК и способность направляться РНК. Согласно одному аспекту, безнуклеазный белок Cas9 включает последовательность, приведенную для природного Cas9 из S. pyogenes, у которой одна или несколько или все аминокислоты D10, Н840, Н863 и D839 заменены на аланин, а также последовательности белков, которые по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологичны этой последовательности и являются ДНК-связывающими белками типа РНК-направляемых ДНК-связывающих белков.
Согласно одному аспекту, безнуклеазный белок Cas9 включает последовательность, приведенную для природного Cas9 из S. pyogenes, за исключением последовательности нуклеазного домена RuvC и нуклеазного домена HNH, а также последовательности белков, которые по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% гомологичны этой последовательности и являются ДНК-связывающими белками типа РНК-направляемых ДНК-связывающих белков. Таким образом, аспекты настоящего изобретения включают последовательность белка, отвечающую за связывание с ДНК, к примеру, для совместной локализации с направляющей РНК и связывание с ДНК, и белковые последовательности, гомологичные ей, но не обязательно включают белковые последовательности нуклеазного домена RuvC и нуклеазного домена HNH (если только они не нужны для связывания ДНК), поскольку эти домены могут быть инактивированы или удалены из последовательности природного белка Cas9 для получения безнуклеазного белка Cas9.
В целях настоящего изобретения, на фиг. 4А представлены координирующие металл остатки в структурах известных белков, гомологичных Cas9. Остатки пронумерованы согласно их положению в последовательности Cas9. Слева: структура RuvC, PDB ID: 4ЕР4 (синий), положение D7, которое соответствует D10 в последовательности Cas9, выделено в положениях, координирующих ион Mg. Посредине: структуры эндонуклеазных доменов HNH у PDB ID: 3M7K (оранжевый) и 4H9D (голубой), включая скоординированный ион Mg (серый шар) и ДНК из 3M7K (фиолетовый). Остатки D92 и N113 в 3M7K и позиции D53 и N77 в 4H9D, которые гомологичны по последовательности аминокислотам D839 и N863 в Cas9, представлены в виде палочек. Справа: список мутантов, полученных и проанализированных на нуклеазную активность: Cas9 дикого типа; Cas9m1, у которого D10 заменен на аланин; Cas9m2, у которого D10 и Н840 заменены на аланин; Cas9m3, у которого D10, Н840 и D839 заменены на аланин; и Cas9m4, у которого D10, Н840, D839 и N863 заменены на аланин.
Как видно из фиг. 4B, мутанты Cas9: m3 и m4, а также соответствующие им слияния с VP64 не проявляли заметной нуклеазной активности по результатам глубокого секвенирования локуса мишени. На графиках представлена частота мутаций в зависимости от положения в геноме, а красными линиями отмечена мишень гидРНК. На фиг. 4С представлены данные из фиг. 4B при более высоком разрешении, которые подтверждают, что мутационный ландшафт проявляет сравнимый с немодифицированными локусами профиль.
Согласно одному аспекту, предусмотрена сконструированная система Cas9-гидРНК, которая позволяет осуществлять РНК-направляемую регуляцию генома в клетках человека путем привязывания доменов активации транскрипциио к безнуклеазному Cas9 либо к направляющей РНК. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, один или несколько регулирующих транскрипцию белков или доменов (данные термины применяются взаимозаменяемо) присоединяются или иным образом соединяются с безнуклеазным Cas9 либо с одной или несколькими направляющими РНК (гидРНК). Регулирующие транскрипцию домены соответствуют локусам мишени. Соответственно, аспекты настоящего изобретения включают способы и материалы для локализации регулирующих транскрипцию доменов на локусах мишенях путем слияния, соединения или присоединения таких доменов к Cas9N либо к гидРНК.
Согласно одному аспекту, предусмотрен слитый с Cas9N белок, способный активировать транскрипцию. Согласно одному аспекту, к С-концу Cas9N присоединяется, сливается, соединяется или иным образом прикрепляется домен активации VP64 (см. Zhang et al., Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте). Согласно одному способу, регулирующий транскрипцию домен доставляется на сайт целевой геномной ДНК белком Cas9N. Согласно одному способу, слитый с регулирующим транскрипцию доменом Cas9N поступает внутрь клетки вместе с одной или несколькими направляющими РНК. Cas9N со слитым с ним регулирующим транскрипцию доменом связывается на или возле целевой геномной ДНК. Одна или несколько направляющих РНК связываются на или возле целевой геномной ДНК. Регулирующий транскрипцию домен регулирует экспрессию гена-мишени. Согласно одному конкретному аспекту, слитый белок Cas9N-VP64 в сочетании с гидРНК, воздействующей на последовательности вблизи от промотора, активируют транскрипцию репортерных конструкций, тем самым проявляется РНК-направляемая активация транскрипции.
Согласно одному аспекту, предусмотрен слитый с гидРНК белок, способный активировать транскрипцию. Согласно одному аспекту, к гидРНК присоединяется, сливается, соединяется или иным образом прикрепляется домен активации VP64. Согласно одному способу, регулирующий транскрипцию домен попадает на сайт целевой геномной ДНК при помощи гидРНК. Согласно одному способу, соединенная с регулирующим транскрипцию доменом гидРНК поступает внутрь клетки вместе с белком Cas9N. Cas9N связывается на или возле целевой геномной ДНК. Одна или несколько направляющих РНК со слитым с ними регулирующим транскрипцию белком или доменом связываются на или возле целевой геномной ДНК. Регулирующий транскрипцию домен регулирует экспрессию гена-мишени. Согласно одному конкретному аспекту, белок Cas9N-VP64 и гидРНК, соединенная с регулирующим транскрипцию доменом, активируют транскрипцию репортерных конструкций, тем самым проявляется РНК-направляемая активация транскрипции.
Были сконструированы составные гидРНК, способные регулировать транскрипцию, путем определения тех участков гидРНК, которые допускают изменения, путем вставки случайных последовательностей в гидРНК и анализа функции Cas9. Направляющие РНК, несущие вставки случайных последовательностей либо на 5'-конце участка cr-РНК, либо на 3'-конце участка tracr-PHK в химерной гидРНК, сохраняют функциональность, тогда как вставки в каркасный участок tracr-PHK химерной гидРНК ведут к потере функции. См. фиг. 5А-В, на которой суммированы данные по устойчивости гидРНК к случайным вставкам оснований. На фиг. 5А представлена схема метода гомологичной рекомбинации (HR) для определения активности Cas9-гидРНК. Как видно из фиг. 5B, направляющие РНК, несущие вставки случайных последовательностей либо на 5'-конце участка cr-РНК, либо на 3'-конце участка tracr-PHK в химерной гидРНК, сохраняют функциональность, тогда как вставки в каркасный участок tracr-PHK химерной гидРНК ведут к потере функции. Точки вставки в последовательность гидРНК обозначены в виде красных нуклеотидов. Не придерживаясь какой-либо научной теории, повышение активности при случайных вставках оснований на 5'-конце может быть обусловлено увеличением периода полужизни у более длинной гидРНК.
Для присоединения VP64 к гидРНК пришивали две копии области стебель-петля РНК, связывающей белок оболочки бактериофага MS2, к 3'-концу гидРНК. См. Fusco et al., Current Biology: CB13, 161-167 (2003), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте. Эти химерные гидРНК экспрессировали вместе со слитым с Cas9N белком VP64 MS2. В присутствии всех 3 компонентов наблюдалась активация специфичной к последовательности транскрипции из репортерных конструкций.
На фиг. 1А представлена схема РНК-направляемой активации транскрипции. Как видно из фиг. 1А, для получения слитого с Cas9N белка, способного активировать транскрипцию, к С-концу Cas9N непосредственно пришивали домен активации VP64. Как видно из фиг. 1B, для получения составной гидРНК, способной активировать транскрипцию, к 3'-концу гидРНК пришивали две копии области стебель-петля РНК, связывающей белок оболочки бактериофага MS2. Эти химерные гидРНК экспрессировали вместе со слитым с Cas9N белком VP64 MS2. На фиг. 1С представлена схема репортерных конструкций, используемых для анализа активации транскрипции. Два репортера несут разные сайты-мишени для гидРНК и одинаковый контрольный сайт-мишень TALE-TF. Как видно из фиг 1D, слитый белок Cas9N-VP64 проявляет РНК-направляемую активацию транскрипции при измерении методами сортировки клеток с активируемой флуоресценцией (FACS) и иммунофлуоресценции (IF). В то время, как контрольный TALE-TF активирует оба репортера, слитый белок Cas9N-VP64 активирует репортеры специфичным к последовательности гидРНК образом. Как видно из фиг. 1Е, специфичная к последовательности гидРНК активация транскрипции у репортерных конструкций наблюдалась методами FACS и IF только в присутствии всех 3 компонентов: Cas9N, VP64 MS2 и гидРНК, несущей соответствующие сайты связывания аптамера MS2.
Согласно некоторым аспектам, предусмотрены способы регуляции эндогенных генов с помощью Cas9N, одной или нескольких гидРНК и регулирующего транскрипцию белка или домена. Согласно одному аспекту, эндогенным геном может быть любой желательный ген, именуемый здесь геном-мишенью. Согласно одному типичному аспекту, подлежащие регуляции гены включают ZFP42 (REX1) и POU5F1 (ОСТ4), которые оба являются жестко регулируемыми генами, участвующими в поддержании плюрипотентности. Как видно из фиг. 1F, для гена REX1 было разработано 10 гидРНК, направленных на отрезок ДНК в ~ 5 т.п.о. перед сайтом инициации транскрипции (сверхчувствительные к ДНКазе сайты выделены зеленым цветом). Активацию транскрипции анализировали либо с помощью репортерной конструкции промотор-люцифераза (см. Takahashi et al., Cell, 131: 861-872 (2007), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте), либо непосредственно методом кПЦР эндогенных генов.
Фиг. 6А-С касается РНК-направляемой регуляции ОСТ4 с помощью Cas9N-VP64. Как видно из фиг. 6А, для гена ОСТ4 было разработано 21 гидРНК, направленных на отрезок ДНК в ~ 5 т.п.о. перед сайтом инициации транскрипции. Сверхчувствительные к ДНКазе сайты выделены зеленым цветом. На фиг. 6B представлена активация транскрипции с помощью репортерной конструкции промотор-люцифераза. На фиг. 6С представлена активация транскрипции анализируемая непосредственно методом кПЦР эндогенных генов. В то время, как введение индивидуальных гидРНК умеренно стимулировало транскрипцию, несколько гидРНК действовали синергически, вызывая устойчивую многократную активацию транскрипции.
Фиг. 7А-С касается РНК-направляемой регуляции REX1 с помощью Cas9N, VP64 MS2 и гидРНК + аптамер 2X-MS2. Как видно из фиг. 7А, для гена REX1 было разработано 10 гидРНК, направленных на отрезок ДНК в ~ 5 т.п.о. перед сайтом инициации транскрипции. Сверхчувствительные к ДНКазе сайты выделены зеленым цветом. На фиг. 7B представлена активация транскрипции с помощью репортерной конструкции промотор-люцифераза. На фиг. 7С представлена активация транскрипции непосредственно методом кПЦР эндогенных генов. В то время, как введение индивидуальных гидРНК умеренно стимулировало транскрипцию, несколько гидРНК действовали синергически, вызывая устойчивую многократную активацию транскрипции. В одном аспекте, отсутствие аптамеров 2X-MS2 на гидРНК не вызывает активации транскрипции. См. Maeder et al., Nature Methods 10, 243-245 (2013); и Perez-Pinera et al., Nature Methods 10, 239-242 (2013); каждая из которых включена сюда путем ссылки во всей полноте.
Соответственно, способы направлены на использование множественных направляющих РНК с белком Cas9N и регулирующим транскрипцию белком или доменом для регуляции экспрессии гена-мишени.
Оба подхода и с Cas9, и с пришиванием гидРНК оказались эффективными, причем первый из них проявляет в ~ 1,5-2 раза большую активность. Это различие, вероятно, связано с необходимостью сборки 2-компонентного, в отличие от 3-компонентного комплекса. Тем не менее, метод пришивания гидРНК в принципе позволяет рекрутировать различные эффекторные домены различными гидРНК, если только каждая из гидРНК использует другую взаимодействующую пару РНК-белок. См. Karyer-Bibens et al. Biology of the Cell / Under the Auspices of the European Cell Biology Organization 100, 125-138 (2008), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, различные гены-мишени можно регулировать с помощью специфичных направляющих РНК и общего белка Cas9N, т.е. одного и того же или близкого белка Cas9N для различных генов-мишеней. Согласно одному аспекту, предусмотрены способы мультиплексной регуляции генов с помощью одного и того же или близкого белка Cas9N.
Способы настоящего изобретения также направлены на редактирование генов-мишеней с помощью описанных здесь белков Cas9N и направляющих РНК, чтобы обеспечить мультиплексную генетическую и эпигенетическую инженерию клеток человека. Поскольку таргетинг Cas9-гидРНК является спорным вопросом (см. Jiang et al., Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте), то предусмотрены способы углубленного изучения сродства Cas9 для очень большого ряда вариантов последовательностей мишеней. Соответственно, аспекты настоящего изобретения обеспечивают прямое высокопроизводительное изучение нацеливания Cas9 в клетках человека, при этом избегая осложнений, вызванных токсичностью разрезанной дцДНК и репарацией мутагенных повреждений, возникающих при тестировании на специфичность с помощью нативного Cas9, обладающего нуклеазной активностью.
Другие аспекты настоящего изобретения направлены на использование ДНК-связывающих белков или систем вообще для регуляции транскрипции генов-мишеней. Специалист в данной области легко сможет установить типичные ДНК-связывающие системы, исходя из настоящего описания. Такие ДНК-связывающие системы могут и не обладать такой нуклеазной активностью, как у природного белка Cas9. Соответственно, у таких ДНК-связывающих систем и не нужно инактивировать нуклеазную активность. Одной из типичных ДНК-связывающих систем является TALE. В качестве инструмента редактирования генома обычно используются димеры TALE-FokI, а для регулирования генома очень эффективными оказались слияния TALE-VP64. Согласно одному аспекту, специфичность TALE оценивали по методологии, представленной на фиг. 2А. Создавали библиотеку конструкций, в которой каждый элемент библиотеки содержит минимальный промотор для экспрессии флуоресцентного белка dTomato. После сайта инициации транскрипции m вставлен рандомизованный тег транскрипта в 24 п.о. (A/C/G), а перед промотором располагаются два TF-связывающих сайта: один - это постоянная последовательность ДНК, общая для всех элементов библиотеки, а второй - переменная, несущая "смещенную" библиотеку сайтов связывания, которая разработана так, чтобы она охватывала большую коллекцию последовательностей, содержащую много комбинаций мутаций относительно целевой последовательности, с которой должен связываться программируемый комплекс нацеливания на ДНК. Это осуществляется с помощью вырожденных олигонуклеотидов, составленных так, чтобы нуклеотиды в каждом положении находились с определенной частотой, а именно целевой нуклеотид в последовательности встречался с частотой 79%, а каждый из остальных нуклеотидов - с частотой 7%. См. Patwardhan et al., Nature Biotechnology 30, 265-270 (2012), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте. Затем библиотеку репортеров секвенировали, чтобы выявить связь между метками транскрипта dTomato в 24 п.о. и соответствующим "смещенным" целевым сайтом элемента библиотеки. Большое разнообразие меток транскриптов гарантирует, что общие метки между различными мишенями будут встречаться крайне редко, а "смещенность" целевых последовательностей означает, что сайты с небольшим числом мутаций будут связаны с большим количеством меток, чем сайты с большим числом мутаций. Далее стимулируют транскрипцию генов репортеров dTomato либо контрольным TF, который связывается с общим сайтом ДНК, или целевым TF, который должен связываться с целевым сайтом. В каждом образце измеряют содержание каждой экспрессированной метки транскрипта путем секвенирования РНК у стимулированных клеток, которое затем сопоставляют с соответствующими сайтами связывания с помощью установленной ранее таблицы соответствия. Как ожидается, контрольный TF будет стимулировать всех представителей библиотеки одинаково, так как его сайт связывания является общим для всех элементов библиотеки, тогда как целевой TF должен сдвинуть распределение экспрессируемых элементов в сторону тех, на которые он преимущественно воздействует. Это предположение используется на стадии 5 при вычислении нормализованного уровня экспрессии для каждого сайта связывания путем деления уровня метки, полученного для целевого TF, на уровень, полученный для контрольного TF.
Как видно из фиг. 2B, ландшафт нацеливания у комплекса Cas9-гидРНК свидетельствует, что он допускает в среднем 1-3 мутации в последовательностях своих мишеней. Как видно из фиг. 2С, комплекс Cas9-гидРНК также почти нечувствителен к точечным мутациям, за исключением тех, которые локализуются в последовательности РАМ. А именно, эти данные показывают, что предполагаемый РАМ для Cas9 S. pyogenes представлен не только NGG, но и NAG. Как видно из фиг. 2D, введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность комплекса Cas9-гидРНК, но только тогда, когда они локализуются на 8-10 оснований ближе к 3'-концу последовательности мишени гидРНК (на термограмме позиции в последовательности мишени отмечены как 1-23, начиная с 5'-конца).
Мутационную толерантность у другого широко используемого инструмента для редактирования генома, доменов TALE, определяли описанным здесь методом анализа транскрипционной специфичности. Как видно из фиг. 2Е, данные по взаимодействию TALE с мишенью для 18-мера TALE показывают, что он допускает в среднем 1-2 мутации в последовательности своей мишени и не способен активировать большую часть вариантов с несоответствием по 3 основаниям у своих мишеней. Как видно из фиг. 2F, 18-мер TALE, аналогично комплексам Cas9-гидРНК, почти нечувствителен к несоответствию по 1 основанию у своей мишени. Как видно из фиг. 2G, введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность 18-мера TALE. Активность TALE более чувствительна к несоответствиям ближе к 5'-концу последовательности своей мишени (на графике термограмме позиции в последовательности мишени отмечены как 1-18, начиная с 5'-конца).
Эти результаты были подтверждены нуклеазным методом в целенаправленных экспериментах, которые являются предметом фиг. 10А-С, направленных на изучение ландшафта нацеливания у TALEs различного размера. Как видно из фиг. 10А, методом анализа опосредованной нуклеазой HR было подтверждено, что 18-меры TALE допускают множественные мутации в последовательности своих мишеней. Как видно из фиг. 10B, анализировали ландшафт нацеливания у TALEs 3 разных размеров (18-мера, 14-мера и 10-мера) с помощью методики, описанной на фиг. 2. Более короткие TALEs (14-мер и 10-мер) более специфичны с точки зрения нацеливания, но также снижается активность почти на порядок. Как видно из фиг. 10С и 10D, 10-мер TALE проявляет разрешение несоответствий почти в одно основание, теряя почти всю активность в отношении мишеней, несущих 2 несоответствия (на графике термограмме позиции в последовательности мишени отмечены как 1-10, начиная с 5'-конца). В целом эти данные означают, что разработка более коротких TALEs может давать более высокую специфичность в применении к геномной инженерии, тогда как при нуклеазном применении TALEs возникает необходимость в димеризации FokI, чтобы избежать эффекта промашки. См. Kim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 93, 1156-1160 (1996); и Pattanayak et al., Nature Methods 8, 765-770 (2011); каждая из которых включена сюда путем ссылки во всей полноте.
Фиг. 8А-С касается последовательности операций при анализе специфичности высокого уровня для расчета нормированных уровней экспрессии, которая проиллюстрирована примерами из экспериментальных данных. Как видно из фиг. 8А, создаются библиотеки конструкций со смещенным распределением последовательностей сайтов связывания и рандомизованными последовательностями тегов в 24 п.о., которые будут включены в транскрипты генов-репортеров (сверху). Транскрибируемые теги сильно вырождены с тем, чтобы они соответствовали связывающим последовательностям Cas9 или TALE по принципу многие-к-одному. Библиотеки конструкций секвенируют (3-й уровень, слева), чтобы установить, какие теги встречаются вместе с сайтами связывания, получая таблицу соответствия между сайтами связывания и транскрибируемыми тегами (4-й уровень, слева). Можно одновременно секвенировать несколько библиотек конструкций, построенных для различных сайтов связывания, используя библиотечные штрих-коды (обозначенные здесь светло-голубым и светло-желтым цветом; уровни 1-4, слева). Библиотеки конструкций затем трансфецируют в популяции клеток и в образцах популяций индуцируют комплект различных Cas9/гидРНК или факторов транскрипции TALEs (2-й уровень, справа). Один образец всегда индуцируется с помощью фиксированного активатора TALE, нацеленного на фиксированную последовательность сайта связывания в данной конструкции (верхний уровень, зеленая рамка); этот образец служит в качестве положительного контроля (зеленый образец, также указан знаком +). Затем секвенируют и анализируют кДНК, полученные из молекул-репортеров мРНК в индуцированных образцах, чтобы получить число тегов для каждого тега в образце (3-й и 4-й уровень, справа). Как и при секвенировании библиотек конструкций, секвенируют и анализируют вместе несколько образцов, включая положительный контроль, прибавляя к ним штрих-коды образцов. Здесь светло-красным цветом обозначен один не контрольный образец, который секвенировали и анализировали вместе с положительным контролем (зеленый). Поскольку при каждом секвенировании проявляются только транскрибируемые теги, а не сайты связывания у конструкций, то затем для подсчета общего числа тегов, экспрессированных из каждого сайта связывания в каждом образце (5-й уровень), используется таблица соответствия между сайтами связывания и тегами, полученная при секвенировании библиотек конструкций. Затем числа для каждого образца без положительного контроля преобразуются в нормированные уровни экспрессии для каждого сайта связывания путем деления их на числа, полученные в образце положительного контроля. Примеры графиков нормированных уровней экспрессии от количества несоответствий представлены на фиг. 2B и 2Е и на фиг. 9А и фиг. 10B. На этой общей блок-схеме не представлено несколько уровней фильтрования для ошибочных тегов, для не связанных с библиотекой конструкций тегов и для тегов, явно связанных с несколькими сайтами связывания. На фиг. 8B представлен пример по распределению процента сайтов связывания в зависимости от числа несоответствий, генерируемых в смещенной библиотеке конструкций. Слева: теоретическое распределение. Справа: фактическое распределение в реальной библиотеке конструкций TALE. На фиг. 8С представлен пример по распределению процента тегов, агрегированных с сайтами связывания, в зависимости от числа несоответствий. Слева: фактическое распределение в положительном контрольном образце. Справа: фактическое распределение в образце, в котором был индуцирован не контрольный TALE. Поскольку положительный контрольный TALE связывается с фиксированным сайтом в конструкции, то распределение числа агрегированных тегов точно отражает распределение сайтов связывания на фиг. 8B, тогда как в не контрольном образце TALE распределение сдвигается влево, потому что сайты с меньшим числом несоответствий индуцируют более высокие уровни экспрессии. Внизу: вычисление относительного соотношения между ними путем деления числа тегов, полученного для целевого TF, на число, полученное для контрольного TF, дает средний уровень экспрессии в зависимости от количества мутаций в целевом сайте (мишени).
Эти результаты также подтверждаются данными по специфичности, полученными с использованием другого комплекса Cas9-гидРНК. Как видно из фиг. 9А, другой комплекс Cas9-гидРНК допускает 1-3 мутации в последовательности своей мишени. Как видно из фиг. 9B, этот комплекс Cas9-гидРНК также почти нечувствителен к точечным мутациям, за исключением тех, которые локализованы в последовательности РАМ. Как видно из фиг. 9С, введение несоответствия по 2 основаниям существенно ухудшает активность (на термограмме позиции в последовательности мишени отмечены как 1-23, начиная с 5'-конца). Как видно из фиг. 9D, методом анализа опосредованной нуклеазой HR подтверждается, что предполагаемый РАМ для Cas9 S. pyogenes представлен не только NGG, но и NAG.
Согласно некоторым аспектам, специфичность связывания повышается в соответствии с описанными здесь способами. Поскольку синергия между несколькими комплексами является фактором при активации генов мишени под действием Cas9N-VP64, то регуляция транскрипции с применением Cas9N, естественно, будет весьма специфичной, так как отдельные случаи связывания вне мишени должны иметь минимальное влияние. Согласно одному аспекту, в способах редактирования генома используются смещенные надрезы (off-set nicks). Большая часть одноцепочечных разрывов редко приводит к случаям NHEJ (см. Certo et al., Nature Methods 8, 671-676 (2011), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте), тем самым сводя к минимуму эффекты надреза вне мишени. Напротив, использование смещенных одноцепочечных разрывов для получения двухцепочечных разрывов (DSBs) очень эффективно вызывает разрушение гена. Согласно некоторым аспектам, свисающие 5'-концы вызывают более значительные события NHEJ, чем свисающие 3'-концы. Точно так же, свисающие 3'-концы благоприятствуют событиям HR перед NHEJ, хотя общее количество случаев HR существенно ниже, чем при образовании свисающих 5'-концов. Соответственно, предусмотрены способы использования одноцепочечных разрывов для гомологичной рекомбинации и смещенных одноцепочечных разрывов для получения двухцепочечных разрывов, чтобы свести к минимуму эффекты активности Cas9-гидРНК вне мишени.
Фиг. 3А-С касается мультиплексного применения смещенных одноцепочечных разрывов и способов уменьшения связывания вне мишени с помощью направляющих РНК. Как видно из фиг. 3А, для одновременного анализа событий HR и NHEJ после введения прицельных одноцепочечных разрывов или разрывов использовали репортер "светофор". При репарации расщепленной ДНК по механизму HDR (направляемая гомологией репарация) восстанавливается последовательность GFP, тогда как мутагенное NHEJ вызывает сдвиг рамки считывания, при этом GFP выходит из рамки считывания, а нижележащая последовательность mCherry попадает в рамку. Для анализа составляли 14 гидРНК, охватывающих отрезок ДНК в 200 п.о.: 7 для смысловой нити (U1-7) и 7 для антисмысловой (D1-7). С помощью мутанта Cas9D10A, который надрезает комплементарную нить, использовали различные двусторонние комбинации гидРНК для получения целого ряда запрограммированных свисающих 5'- или 3'-концов (отмечены сайты надреза для всех 14 гидРНК). Как видно из фиг. 3B, использование смещенных одноцепочечных разрывов для создания двухцепочечных разрывов (DSBs) очень эффективно вызывает разрушение гена. А именно, смещенные надрезы, образующие свисающие 5'-концы, дают больше случаев NHEJ, чем свисающие 3'-концы. Как видно из фиг. 3С, образование свисающих 3'-концов благоприятствует преобладанию HR перед NHEJ, но общее количество случаев HR существенно ниже, чем при образовании свисающих 5'-концов.
Фиг. 11А-В касается NHEJ, опосредованного никазой Cas9D10A. Как видно из фиг. 11А, для анализа событий NHEJ после введения прицельных одноцепочечных разрывов или двухцепочечных разрывов использовали репортер "светофор". Вкратце, если репарация разрывов при расщеплении ДНК идет по механизму мутагенного NHEJ, то GFP при трансляции выходит из рамки считывания, а нижележащая последовательность mCherry попадает в рамку, издавая красную флуоресценцию. Составляли 14 гидРНК, охватывающих отрезок ДНК в 200 п.о.: 7 для смысловой нити (U1-7) и 7 для антисмысловой (D1-7). Как видно из фиг. 11B, оказалось, что, в отличие от Cas9 дикого типа, который образует DSBs и дает хорошее NHEJ по всем мишеням, большинство одноцепочечных разрывов (с помощью мутанта Cas9D10A) редко приводят к событиям NHEJ. Все 14 сайтов располагаются на непрерывном отрезке ДНК в 200 п.о., причем наблюдались более чем 10-кратные различия по эффективности нацеливания.
Согласно некоторым аспектам, здесь описаны способы модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетках, которые включают введение в клетки одной или нескольких, двух или нескольких либо множества чужеродных нуклеиновых кислот. Чужеродные нуклеиновые кислоты, введенные в клетки, кодируют направляющую РНК или направляющие РНК, безнуклеазный белок или белки Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен. Направляющая РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен все вместе именуются комплексом совместной локализации, как этот термин понимается специалистами в данной области, в той степени, что направляющая РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен связываются с ДНК и регулируют экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым другим аспектам, чужеродные нуклеиновые кислоты, введенные в клетки, кодируют направляющую РНК или направляющые РНК и белок никазы Cas9. Направляющая РНК и белок никазы Cas9 все вместе именуются комплексом совместной локализации, как этот термин понимается специалистами в данной области, в той степени, что направляющая РНК и белок никазы Cas9 связываются с ДНК и делают надрезы целевой нуклеиновой кислоты.
Клетки по настоящему изобретению включают любые клетки, в которые можно вводить и экспрессировать чужеродные нуклеиновые кислоты, как описано здесь. Следует иметь в виду, что основные концепции настоящего изобретения, описанного здесь, не ограничиваются типом клеток. Клетки по настоящему изобретению включают эукариотические клетки, прокариотические клетки, клетки животных, растительные клетки, грибковые клетки, архейные клетки, эубактериальные клетки и др. Клетки включают такие эукариотические клетки, как дрожжевые клетки, растительные клетки и клетки животных. Предпочтительными клетками являются клетки млекопитающих. Кроме того, клетки включают такие клетки, у которых была бы выгодна или желательна регуляция целевой нуклеиновой кислоты. Такие клетки могут включать клетки, которые дефектны по экспрессии определенного белка, что ведет к заболеванию или болезненному состоянию. Такие заболевания или болезненные состояния хорошо известны специалистам. В соответствии с настоящим изобретением, на нуклеиновую кислоту, отвечающую за экспрессию определенного белка, можно воздействовать описанными здесь способами и активатором транскрипции, что ведет к повышающей регуляции целевой нуклеиновой кислоты и экспрессии соответствующего конкретного белка. Таким образом, описанные здесь способы обеспечивают терапевтическое лечение.
Целевые нуклеиновые кислоты включают такие последовательности нуклеиновой кислоты, для регуляции или надреза которых может применяться комплекс совместной локализации, как описано здесь. Целевые нуклеиновые кислоты включают гены. В целях настоящего изобретения ДНК, как-то двухцепочечная ДНК, может включать в себя целевую нуклеиновую кислоту, а комплекс совместной локализации может связываться или иным образом совместно локализироваться на ДНК на или вблизи или возле целевой нуклеиновой кислоты, причем таким образом, чтобы комплекс совместной локализации мог оказывать желательный эффект на целевую нуклеиновую кислоту. Такие целевые нуклеиновые кислоты могут включать в себя эндогенные (или природные) нуклеиновые кислоты и экзогенные (или чужеродные) нуклеиновые кислоты. Исходя из настоящего изобретения, специалист легко сможет установить или разработать такие направляющые РНК и белки Cas9, которые совместно локализуются на ДНК, включая целевую нуклеиновую кислоту. Также специалист легко сможет установить регулирующие транскрипцию белки или домены, которые точно так же совместно локализуются на ДНК, включая целевую нуклеиновую кислоту. ДНК означает геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
Чужеродные нуклеиновые кислоты (то есть те, что не входят в состав природных нуклеиновых кислот в клетке) можно вводить в клетки любым методом, известным специалистам для такого введения. Такие способы включают трансфекцию, трансдукцию, вирусную трансдукцию, микроинъекцию, липофекцию, нуклеофекцию, бомбардировку наночастицами, трансформацию, конъюгацию и др. Специалисты смогут легко понять и адаптировать такие методы, используя легко определимые литературные источники.
Регулирующие транскрипцию белки или домены, которые являются активаторами транскрипции, включают VP16 и VP64 и другие, легко определяемые специалистами в данной области на основании настоящего описания.
Заболевания или болезненные состояния представляет собой те, которые характеризуются аномальной потерей экспрессии определенного белка. Такие заболевания или болезненные состояния можно лечить посредством повышающей регуляции конкретного белка. Соответственно, предусмотрены способы лечения заболеваний или болезненных состояний, где совместная локализация комплекс, в которых описанный здесь комплекс совместной локализации связывается или иным образом ассоциируется с ДНК, включая целевую нуклеиновую кислоту, а активатор транскрипции из комплекса совместной локализации усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Например, повышающая регуляция PRDM16 и других генов, вызывающих дифференцировку и усиление метаболизма бурого жира, может применяться для лечения метаболического синдрома или ожирения. Активация противовоспалительных генов применима при аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваниях. Активация генов-супрессоров опухолей применима при лечении рака. Специалисты в данной области смогут легко установить такие заболевания и болезненные состояния на основании настоящего описания.
Следующие примеры приводятся в качестве репрезентативных для настоящего изобретению. Эти примеры не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения, поскольку эти и другие эквивалентные воплощения станут очевидными в свете настоящего описания, рисунков и прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример I. Мутанты Cas9
Проводили поиск последовательностей, гомологичных Cas9 с известной структурой, для выявления таких возможных мутаций у Cas9, которые могли бы устранить естественную активность его доменов RuvC и HNH. Используя HHpred (адрес в интернете: toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred), вводили полную последовательность Cas9 для поиска по всей базе данных Protein Data Bank (января 2013 г.). Этот поиск выдал две разные эндонуклеазы HNH со значительной гомологией последовательности к домену HNH у Cas9; а именно PacI и предполагаемые эндонуклеазы (PDB IDs: 3M7K и 4H9D, соответственно). Эти белки изучали, чтобы найти остатки, участвующие в координировании иона магния. Затем соответствующие остатки были идентифицированы при выравнивании их последовательностей с Cas9. В каждой структуре были идентифицированы две координирующие Mg боковые цепи, которые выравнивались с аминокислотами одного и того же типа у Cas9. Это D92 и N113 у 3M7K и D53 и N77 у 4H9D. Эти остатки соответствуют D839 и N863 у Cas9. Также сообщалось, что у PacI мутации остатков D92 и N113 на аланин делают нуклеазу каталитически дефектной. Мутации D839A и N863A у Cas9 были сделаны на основе этого анализа. Кроме того, HHpred также предсказывает гомологию между Cas9 и N-концом RuvC Thermus thermophilus (PDB ID: 4EP4). Это выравнивание последовательностей охватывает приведенную ранее мутацию D10A, которая устраняет функцию домена RuvC у Cas9. Чтобы проверить, что это правильная мутация, определяли связывающие металл остатки, как и ранее. У 4ЕР4 остаток D7 помогает координировать ион магния. Это положение в последовательности обладает гомологией, соответствующей D10 у Cas9, подтверждая, что эта мутация способствует устранению связывания металла, а тем самым и каталитической активности домена RuvC у Cas9.
Пример II. Конструирование плазмид
Мутантов Cas9 получали с помощью набора QuikChange (Agilent Technologies). Конструкции, экспрессирующие целевые гидРНК, либо (1) заказывали непосредственно в виде индивидуальных gBlocks у фирмы IDT и клонировали в вектор pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen); либо (2) синтезировали по заказу на фирме Genewiz; либо (3) собирали из олигонуклеотидов методом Gibson assembly в клонирующий вектор для гидРНК (плазмида #41824). Векторы для анализа репортера HR с разорванным GFP конструировали путем слияния методом ПЦР-сборки (assembly PCR) последовательности GFP, несущей стоп-кодон, а соответствующие фрагменты собирали в лентивектор EGIP фирмы Addgene (плазмида #26777). Эти лентивекторы затем использовали для получения стабильных линий репортера GFP. TALE-нуклеазы (TALENs), используемые в данном исследовании, конструировали по стандартным методикам. См. Sanjana et al., Nature Protocols 7, 171-192 (2012), которая включена сюда путем ссылки во всей полноте. Слияние Cas9N с VP64 из MS2 проводили по стандартным методикам слияния методом ПЦР. Конструкции промотор-люцифераза для ОСТ4 и REX1 получали из фирмы Addgene (плазмида #17221 и плазмида #17222).
Пример III. Культивирование и трансфекция клеток
Клетки HEK 293Т культивировали в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM, Invitrogen) с высоким содержанием глюкозы и с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Invitrogen), пенициллина/стрептомицина (pen/strep, Invitrogen) и заменимых аминокислот (NEAA, Invitrogen). Клетки содержали при 37°C и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.
Трансфекции для нуклеазных методов проводили следующим образом: 0,4×106 клеток трансфецировали 2 мкг плазмиды Cas9, 2 мкг гидРНК и/или 2 мкг плазмиды с донорской ДНК с помощью Lipofectamine 2000 в соответствии с методикой производителя. Через 3 дня после трансфекции клетки собирали и либо анализировали методом FACS, либо экстрагировали геномную ДНК из ~ 1×106 клеток с помощью набора DNAeasy (Qiagen) для непосредственного анализа геномных разрывов. Для этого проводили ПЦР для амплификации целевого участка, используя геномную ДНК, полученную из клеток, а ампликоны подвергали глубокому секвенированию на MiSeq Personal Sequencer (Illumina) с охватом >200000 раз. Данные по секвенированию подвергали анализу для оценки эффективности NHEJ.
Трансфекции для анализа активации транскрипции: 0,4×106 клеток трансфецировали (1) 2 мкг плазмиды Cas9N-VP64, 2 мкг гидРНК и/или 0,25 мкг репортерной конструкции; или (2) 2 мкг плазмиды Cas9N, 2 мкг VP64 MS2, 2 мкг гидРНК-аптамер 2X-MS2 и/или 0,25 мкг репортерной конструкции. Через 24-48 ч после трансфекции клетки собирали и анализировали методом FACS или методом иммунофлуоресценции либо экстрагировали из них тотальную РНК, а затем анализировали методом ОТ-ПЦР. При этом использовали стандартные зонды TaqMan фирмы Invitrogen для ОСТ4 и REX1, а нормирование для каждого образца выполняли по GAPDH.
Трансфекции для анализа активации транскрипции на профиль специфичности комплексов Cas9-гидРНК и TALEs: 0,4×106 клеток трансфецировали (1) 2 мкг плазмиды Cas9N-VP64, 2 мкг гидРНК и 0,25 мкг репортерной библиотеки; или (2) 2 мкг плазмиды TALE-TF и 0,25 мкг репортерной библиотеки; или (3) 2 мкг плазмиды контроль-TF и 0,25 мкг репортерной библиотеки. Клетки собирали через 24 ч после трансфекции (чтобы избежать стимуляции репортеров, находящихся в режиме насыщения). Экстрагирование тотальной РНК проводили с помощью набора RNAeasy-plus (Qiagen), а стандартный ОТ-ПЦР выполняли с помощью Superscript-III (Invitrogen). Библиотеки для секвенирования следующего поколения получали методом прицельной ПЦР-амплификации транскриптов с тегами.
Пример IV. Вычисления и анализ последовательности для расчета уровней экспрессии репортеров Cas9-TF и TALE-TF
На фиг. 8А схематически представлена блок-схема высокого уровня для этого процесса, а здесь приводятся дополнительные подробности. Подробнее насчет состава библиотек конструкций см. фиг. 8А (уровень 1) и 8B.
Секвенирование. Для экспериментов с Cas9, последовательности из библиотеки конструкций (фиг. 8А, уровень 3, слева) и последовательности кДНК генов-репортеров (фиг. 8А, уровень 3, справа) получали в виде перекрывающихся парных конечных прочтений в 150 п.о. на приборе Illumina MiSeq, тогда как для экспериментов с TALE соответствующие последовательности получали в виде неперекрывающихся парных конечных прочтений в 51 п.о. на приборе Illumina HiSeq.
Обработка последовательностей из библиотеки конструкций. Выравнивание. Для экспериментов с Cas9, для выравнивания парных прочтений с комплектом контрольных последовательностей в 250 п.о., что соответствует 234 п.о. из конструкций, фланкированных парами штрих-кодов библиотеки по 8 п.о., использовали Novoalign V2.07.17 (сайт в интернете: novocraft.com/main/index/php) (см. фиг. 8А, 3-й уровень, слева). У контрольных последовательностей, вводимых в Novoalign, вырожденные участки сайта связывания Cas9 в 23 п.о. и вырожденные участки тегов транскриптов в 24 п.о. (фиг. 8А, первый уровень) приводятся как Ns, а штрих-коды библиотеки конструкций приводятся в явном виде. Для экспериментов с TALE использовали те же методики, за исключением того, что контрольные последовательности были длиной в 203 п.о., а вырожденные участки сайта связывания были длиной в 18 п.о., а не 23 п.о. Проверка достоверности. На выходе из Novoalign получали файлы, в которых прочтения слева и справа для каждой пары прочтений индивидуально выравнивались с контрольными последовательностями. Только те пары прочтений, в которых оба прочтения выравнивались с эталонной последовательностью, подвергали дополнительным условиям проверки, и сохраняли только те пары прочтений, которые удовлетворяли всем этим условиям. Условия достоверности включали: (i) каждый из двух штрих-кодов библиотеки конструкций должен выравниваться по крайней мере по 4 позициям со штрих-кодом контрольной последовательности, и оба штрих-кода должны выравниваться с парой штрих-кодов для той же библиотеки конструкций; (ii) все основания, выравнивающиеся с N-участками контрольной последовательности, должны быть обозначены Novoalign как А, С, G или Т. Обратите внимание, что ни для экспериментов с Cas9, ни с TALE, прочтения слева и справа не перекрывались в контрольном N-участке, так что возможность неоднозначного обозначения Novoalign этих N-оснований не возникала; (iii) точно так же, в этих участках не должны появляться выявляемые Novoalign вставки или делеции; (iv) не должно быть Т в участках тегов транскриптов (так как эти случайные последовательности создавались только из А, С и G). Пары прочтений, у которых любое из этих условий нарушалось, собирали в файл отклоненных пар прочтений. Эти проверки на достоверность выполнялись при помощи пользовательских скриптов Perl.
Обработка последовательностей кДНК гена репортера в индуцированных образцах. Выравнивание. Сначала использовали SeqPrep (загруженный из сайта в интернете github.com/jstjohn/SeqPrep) для слияния перекрывающихся пар прочтений в один общий сегмент в 79 п.о., после чего использовали Novoalign (версия выше) для выравнивания этих общих сегментов по 79 п.о. в виде единого неспаренного прочтения с комплектом контрольных последовательностей (см. фиг. 8А, 3-й уровень, слева), в котором (как и при секвенировании библиотеки конструкций) вырожденные участки тегов транскриптов в 24 п.о. приводятся как Ns, а штрих-коды библиотеки конструкций приводятся в явном виде. И для TALE, и для Cas9 участки последовательностей кДНК соответствовали одним и тем же участкам кДНК в 63 п.о., фланкированным парами последовательностей штрих-кодов образца по 8 п.о. Проверка применимости. Применяли те же условия достоверности, что и при секвенировании библиотеки конструкций (см. выше), за исключением того, что: (а) вследствие предварительного слияния SeqPrep пар прочтений, при проверке на достоверность не нужны были фильтры на однозначное выравнивание обоих прочтений из одной пары прочтений, а только на однозначное выравнивание слившихся прочтений; (b) при прочтении последовательностей кДНК встречались только теги транскриптов, поэтому проверка на достоверность проводилась только по этим участкам тегов из контрольных последовательностей, а не по отдельным участкам сайтов связывания.
Составление таблицы соответствия между сайтами связывания и тегами транскриптов. Для составления этих таблиц по проверенным последовательностям библиотеки конструкций (фиг. 8А, 4-й уровень, слева) использовали пользовательский скрипт Perl. Хотя последовательности тегов в 24 п.о., состоящие из оснований А, С и G, должны быть практически уникальными по всей библиотеке конструкций (вероятность общности = ~ 2,8×10-11), однако в самом начале анализ соответствия между сайтами связывания и тегами показал, что довольно значительная доля последовательностей тегов на самом деле является общей для нескольких последовательностей сайтов связывания, что может быть вызвано в основном сочетанием ошибок в последовательности сайтов связывания или ошибок в синтезе олигонуклеотидов, используемых для получения библиотек конструкций. Наряду с совместным использованием тегов, теги, оказавшиеся связанными с сайтами связывания в проверенных парах прочтений, также могли оказаться в файле отклоненных пар прочтений библиотеки конструкций, если не было ясно, из-за несоответствия штрих-кодов, из какой библиотеки конструкций они могут быть. Наконец, сами последовательности тегов могут содержать ошибки в последовательности. Чтобы разобраться с этими источниками ошибок, теги классифицировали по трем атрибутам: (i) надежный или ненадежный, где ненадежный означает то, что тег может находиться в файле отклоненных пар прочтений библиотеки конструкций; (ii) совместный или не совместный, где совместный означает то, что тег оказался связан с последовательностями нескольких сайтов связывания; и (iii) 2+ или только 1, где 2+ означает то, что тег встречался по крайней мере дважды среди проверенных последовательностей библиотеки конструкций и поэтому считается, что он вряд ли содержит ошибки последовательности. Сочетание этих трех критериев дает 8 классов тегов, связанных с каждым сайтом связывания, причем самый надежный (но наименее распространенный) класс включает только теги типа надежный, не совместный, 2+; а наименее надежный (но самый распространенный) класс включает все теги, независимо от надежности, совместного использования или встречаемости.
Расчет нормированных уровней экспрессии. Для выполнения операций, указанных на фиг. 8А, уровни 5-6, использовали пользовательский код Perl. Во-первых, для каждого сайта связывания суммировали число тегов, полученное для каждого индуцированного образца, используя таблицу соответствия между сайтами связывания и тегами транскриптов, составленную ранее для библиотеки конструкций (см. фиг. 8С). Затем для каждого образца суммарное число тегов по каждому сайту связывания делили на суммарное число тегов для положительного контрольного образца, получая нормированные уровни экспрессии. Дополнительные соображения, касающиеся этих расчетов, включают:
1). У каждого образца среди проверенных на достоверность последовательностей кДНК генов встречалось подмножество "новых" тегов, которые не встречались в таблице соответствия между сайтами связывания и тегами транскриптов. Эти теги не учитывали при последующих вычислениях.
2). Суммирование числа тегов, описанное выше, проводили для каждого из описанных выше 8 классов тегов в таблице соответствия между сайтами связывания и тегами транскриптов. Поскольку сайты связывания в библиотеках конструкций часто были "смещенными", чтобы получить последовательности, близкие к центральной последовательности, а последовательности с большим количеством несоответствий встречались редко, то сайты связывания с немногими несоответствиями при суммировании обычно давали большое число тегов, тогда как сайты связывания со многими несоответствиями давали меньшее число тегов. Поэтому, хотя вообще-то было желательно использовать самый надежный класс тегов, однако оценка сайтов связывания с двумя и более несоответствиями могла бы основываться на небольшом числе тегов на 1 сайт связывания, что сделает надежные числа и соотношения менее достоверными статистически, даже если сами теги и были бы более надежными. В таких случаях использовали все теги. Некоторая компенсация за это вытекает из того факта, что количество отдельных суммарных чисел тегов для n позиций с несоответствиями возрастает вместе с количеством комбинаций этих позиций которое резко возрастает с увеличением n; поэтому средние значения суммарного числа тегов для различного количества n несоответствий (приведенные на фиг. 2B, 2Е и на фиг. 9А и 10B) основываются на статистически очень большой совокупности суммарных чисел тегов для n≥2.
3). Наконец, сайт связывания, встроенный в библиотеки конструкций TALE, составлял 18 п.о., и таблица соответствия тегов составлялась на основе этих последовательностей в 18 п.о., но некоторые эксперименты проводились с TALEs, запрограммированными на связывание с центральными участками в 14 п.о. или 10 п.о. в пределах сайта связывания в 18 п.о. у конструкций. При вычислении уровней экспрессии для этих TALEs, теги суммировали по сайтам связывания, исходя из соответствующих участков сайтов связывания в 18 п.о. в таблице соответствия, при этом несоответствия у сайтов связывания за пределами этого участка не учитывали.
Пример V. РНК-направляемая регуляция SOX2 и NANOG с помощью Cas9N-VP64
Описанный здесь подход с пришиванием sодиночная-гидРНК (модифицированная аптамером одиночная направляющая РНК) позволяет рекрутировать различные эффекторные домены при помощи различных sгидРНК, если только каждая одиночная-гидРНК использует другую взаимодействующую пару РНК-белок, что позволяет мультиплексную регуляцию генов с помощью одного и того же белка Cas9N. Для генов SOX2 (фиг. 12А) и NANOG (фиг. 12B) составляли 10 гидРНК, нацеленных на отрезок ДНК в ~ 1 т.п.о. впереди от сайта инициации транскрипции. Гиперчувствительные к ДНКазе сайты выделены зеленым цветом. Определяли активация транскрипции методом кПЦР эндогенных генов. В обоих случаях, в то время как введение отдельных гидРНК умеренно стимулировало транскрипцию, несколько гидРНК действовали синергически, вызывая сильную многократную активацию транскрипции. Данные в виде среднего ± SEM (n=3). Как видно из фиг. 12А-В, два других гена, SOX2 и NANOG, тоже регулировались с помощью sгидPHKs, нацеленных на отрезок ДНК в ~ 1 т.п.о. перед промотором. Нацеленные проксимально к сайту инициации транскрипции одиночные-гидРНК вызывали сильную активацию генов.
Пример VI. Оценка ландшафта нацеливания у комплексов Cas9-гидРНК
Используя подход, представленный на фиг. 2, анализировали ландшафт нацеливания у двух дополнительных комплексов Cas9-гидРНК (фиг. 13А-С и фиг. 13D-F). Эти две гидРНК имеют очень разные профили специфичности, причем гидРНК2 допускает до 2-3 несоответствий, а гидРНК3 - только 1. Эти аспекты отражены на графиках с несоответствием и по одному основанию (фиг. 13B, 13Е), и по двум основаниям (фиг. 13С, 13F). На фиг. 13С и 13F неспаренные пары оснований, для которых было недостаточно данных для расчета нормированного уровня экспрессии, обозначены как серые блоки, содержащие "×", тогда как, чтобы улучшить отображение данных, неспаренные пары, у которых нормированные уровни экспрессии представляют собой выбросы, превышающие верхнюю часть цветовой гаммы, обозначены как желтые блоки, содержащие звездочки "*". Символы статистической значимости: *** для р<0,0005/n, ** для р<0,005/n, * для р<0,05/n, n.s. (не значимо) для р≥0,05/n, где n - количество сравнений (см. табл. 2).
Пример VII. Проверка специфичности в анализе репортеров
Как видно из фиг. 14А-С, данные по специфичности получали с использованием двух разных комплексов sгидPHK:Cas9. Было подтверждено, что анализ является специфичным для исследуемых sгидРНК, поскольку соответствующая мутантная гидРНК была неспособна стимулировать репортерную библиотеку. Фиг. 14А. Профиль специфичности двух гидРНК (дикого типа и мутанта; различия в последовательностях выделены красным цветом) оценивали с помощью репортерной библиотеки, созданной по последовательности мишени гидРНК дикого типа. Фиг. 14B. Было подтверждено, что данный анализ является специфичным для исследуемой гидРНК оценивается (данные взяты из графика на фиг. 13D), поскольку соответствующая мутантная гидРНК была неспособна стимулировать репортерную библиотеку. Символы статистической значимости: *** для р<0,0005/n, ** для р<0,005/n, * для р<0,05/n, n.s. (не значимо) для р≥0,05/n, где n - количество сравнений (см. табл. 2). Различные гидРНК могут иметь разные профили специфичности (фиг. 13А, 13D), в частности, гидРНК2 допускает до 3 несоответствий, а гидРНК3 - только 1. Наибольшая чувствительность к несоответствиям приходится на 3'-конец спейсера, хотя несоответствия в других позициях также оказывали влияние на активность.
Пример VIII. Проверка, несоответствия в гидРНК по одному и двум основаниям
Как видно из фиг. 15A-D, прицельные эксперименты подтверждают, что при несоответствии по одному основанию в пределах 12 п.о. от 3'-конца спейсера в исследуемых sгидРНК сохраняется заметная успешность нацеливания. Однако несоответствия по 2 основаниям в этом участке приводят к значительной потере активности. Используя нуклеазный метод, исследовали 2 независимые гидРНК: гидРНК2 (фиг. 15А-В) и гидРНК3 (фиг. 15C-D), несущие несоответствия по одному или двум основаниям (выделены красным цветом) в последовательности спейсера в отношении мишени. Было подтверждено, что при несоответствии по одному основанию в пределах 12 п.о. от 3'-конца спейсера в исследуемых гидРНК сохраняется заметная успешность нацеливания, однако несоответствия по 2 основаниям в этом участке приводят к быстрой потере активности. Эти результаты также подчеркивают различия в профилях специфичности между различными гидРНК в соответствии с результатами на фиг. 13. Данные в виде среднего ± SEM (n=3).
Пример IX. Проверка, 5'-усечения гидРНК
Как видно из фиг. 16A-D, усечения в 5'-части спейсера позволяют сохранить активность одниночной-гидРНК. Используя нуклеазный метод, исследовали 2 независимые гидРНК: гидРНК 1 (фиг. 16А-В) и гидРНК 3 (фиг. 16C-D), несущие усечения на 5'-конце спейсера. Как оказалось, 5'-усечения в 1-3 п.о. хорошо переносятся, но более крупные делеции приводят к потере активности. Данные в виде среднего ± SEM (n=3).
Пример X. Проверка, РАМ у S. pyogenes
Как видно из фиг. 17А-В, используя метод опосредованной нуклеазой HR, было подтверждено, что РАМ для Cas9 S. pyogenes представлен не только NGG, но и NAG. Данные в виде среднего ± SEM (n=3). Согласно дополнительному исследованию, просканировали созданный набор примерно из 190 тысяч мишеней Cas9 в экзонах человека, у которых не было других NGG-мишеней с общими последними 13 нуклеотидами в целевой последовательности, на наличие альтернативных NAG-сайтов или NGG-сайтов с несоответствием в первых 13 нт. Как оказалось, только 0,4% не имеют таких альтернативных мишеней.
Пример XI. Проверка, мутации TALE
Используя метод опосредованной нуклеазой HR (фиг. 18А-В), подтвердили, что 18-меры TALE допускают множественные мутации в последовательности своей мишени. Как видно из фиг. 18А-В, некоторые мутации посреди мишени приводят к повышению активности TALE, как установлено в прицельных экспериментах нуклеазным методом.
Пример XII. Специфичность мономеров TALE или специфичность белка TALE
Чтобы выяснить роль индивидуальных вариабельных би-остатков из повторов (repeat variable diresidue, RVD), подтвердили, что выбор RVDs вносит вклад в специфичность к основаниям, но специфичность TALE также является функцией энергии связывания всего белка в целом. На фиг. 19А-С представлено сравнение специфичности мономеров TALE со специфичностью всего белка TALE. Фиг. 19А. Используя модификацию подхода, описанного на фиг. 2, анализировали ландшафт нацеливания у двух 14-меров TALE-TF, несущих последовательный набор из 6 NI-повторов или 6 NH-повторов. При таком подходе создается редуцированная библиотека репортеров, несущих вырожденную последовательность 6-мера посредине, которая используется для анализа специфичности TALE-TF. Фиг. 19В-С. В обоих случаях оказалось, что ожидаемая последовательность мишени является обогащенной (т.е. она несет 6 А для NI-повторов и 6 G для NH-повторов). Каждый из этих TALEs все еще допускает 1-2 несоответствия в последовательности центрального 6-мера мишени. Хотя выбор мономеров действительно вносит вклад в специфичность к основаниям, но специфичность TALE также является функцией энергии связывания всего белка в целом. Согласно одному аспекту, короткие сконструированные TALEs или TALEs, несущие сочетания мономеров с высоким и низким сродством, дают большую специфичность в применении к генной инженерии, а димеризация FokI в применении к нуклеазе позволяет еще больше уменьшить эффекты промашки при использовании коротких TALEs.
Пример XIII. Смещенные надрезы, нативный локус
На фиг. 20А-В представлены данные, касающиеся смещенных одноцепочечных разрывов (off-set nicking). В контексте редактирования генома смещенные надрезы создаются для получения двухцепочечных разрывов (DSBs). Большая часть надрезов не вызывает опосредованных негомологичным соединением концов (NHEJ) вставок или делеций (indels), поэтому при образовании смещенных одноцепочечных разрывов отдельные случаи одноцепочечных разрывов вне мишени, скорее всего, будут давать очень низкий уровень вставок или делеций (indels). Образование смещенных одноцепочечных разрывов для получения DSBs эффективно вызывает разрушение генов как во встроенных локусах репортеров, так и в нативном геномном локусе AAVS1. Фиг. 20А. Нативный локус AAVS1, на который нацелены 8 гидРНК, охватывающих отрезок ДНК в 200 п.о.: 4 на смысловую нить (s1-4) и 4 на антисмысловую нить (as1-4). Используя мутанта Cas9D10A, который надрезает комплементарную нить, создавали различные двусторонние комбинации гидРНК, чтобы получить целый ряд запрограммированных свисающих 5'- или 3'-концов. Фиг. 20B. Используя метод на основе секвенирования по Сэнгеру, оказалось, что в то время, как одиночные гидРНК не вызывают заметных случаев NHEJ, создание смещенных одноцепочечных разрывов для получения DSBs очень эффективно вызывает разрушение генов. А именно, смещенные надрезы, дающие свисающие 5'-концы, дают больше случаев NHEJ, чем свисающие 3'-концы. Количество клонов для секвенирования по Сэнгеру приведено над столбиками, а прогнозируемая длина свисающих концов указана под соответствующими надписями на оси х.
Пример XIV. Смещенные надрезы, профили NHEJ
Фиг. 21А-С касается смещенных одноцепочечных разрывов и профилей NHEJ. Представлены репрезентативные результаты секвенирования по Сэнгеру для трех различных комбинаций смещенных одноцепочечных разрывов, а положения таргетинговых гидРНК выделены рамками. Далее, в соответствии со стандартной моделью опосредованной гомологичной рекомбинацией (HR) репарации, создание свисающих 5'-концов посредством смещенных одноцепочечных разрывов вызывает гораздо больше случаев NHEJ, чем у свисающих 3'-концов (фиг. 3B). Наряду со стимуляцией NHEJ, при создании свисающих 5'-концов наблюдалась сильная индукция HR. Создание свисающих 3'-концов не вызывало улучшения степени HR (фиг. 3С).
Пример XV. Мишени гидРНК для регуляции эндогенных генов
Пример XV. Мишени гидРНК для регуляции эндогенных генов
В табл. 1 приведены мишени в промоторах REX1, ОСТ4, SOX2 и NANOG, использовавшиеся в экспериментах по опосредованной Cas9-гидРНК активации.
Пример XVI. Сводка по статистическому анализу данных по специфичности Cas9-гидРНК и TALE
Таблица 2(a). р-значения для сравнения нормированных уровней экспрессии при связывании активаторов TALE и Cas9-VP64 с последовательностями мишеней с определенным количеством мутаций в сайте мишени. Нормированные уровни экспрессии приведены в виде ящичковых диаграмм на фигурах, указанных в столбце "Фигура", где рамочками представлено распределение этих уровней по числу несоответствий у сайта мишени. р-значения рассчитывали по t-критерию для каждой последовательной пары чисел несоответствий в каждой ящичковой диаграмме, причем t-критерии были либо для одной выборки, либо для двух выборок (см. Методы). Статистическую значимость определяли по скорректированным по Бонферрони пороговым p-значениям, причем коррекция основывалась на количестве сравнений в пределах каждой ящичковой диаграммы. Символы статистической значимости: *** для р<0,0005/n, ** для р<0,005/n, * для р<0,05/n, n.s. (не значимо) для р≥0,05/n, где n - количество сравнений. Таблица 2(b). Статистические характеристики области "ядра" на фиг. 2D. Величина log10(значения р) показывает степень разделения между уровнями экспрессии при связывании Cas9N-VP64+гидРНК с последовательностями мишеней с двумя мутациями для тех пар позиций, которые мутированы в пределах предполагаемой области ядра на 3'-конце сайта мишени в 20 п.о. по сравнению со всеми остальными парами позиций. Наибольшее разделение, засвидетельствованное наибольшими величинами - log10(значения р) (выделены выше), приходится на последние 8-9 п.о. сайта мишени. Эти позиции можно интерпретировать как означающие начало области ядра этого сайта мишени. См. раздел "Статистическая характеристика области ядра" в Методах насчет информации о том, как рассчитывали р - значения.
Пример XVII. Последовательности белков и РНК в примерах
А. Последовательности конструкций активаторов Cas9N --VP64 на основе мутанта m4, представленные ниже. Были созданы 3 версии в формате слитых белков Cas9m4 VP64 и Cas9m4 VP64N, проявляющих самую высокую активность. Также были составлены соответствующие векторы для мутантов m3 и m2 (фиг. 4А) (выделены домены NLS и VP64).
В. Последовательности конструкций МS2-активаторов и соответствующего базового вектора для гидРНК с доменами аптамера 2Х MS2, представленные ниже (выделены домены NLS, VP64, спейсер для гидРНК и область стебелек-петля MS2-связывающей РНК). Были созданы 3 версии активаторов в формате слитого белка MS2VP64N, проявляющие самую высокую активность.
С. Последовательности репортеров активации транскрипции по флуоресценции dTomato, представленные ниже (выделены последовательности мишени контрольного TF IScel, мишеней для гидРНК, промотора minCMV и тега FLAG + dTomato).
D. Общий формат библиотек репортеров, используемых для анализа специфичности TALE и Cas9-гидРНК, которые представлены ниже (выделены последовательности мишени для контрольного TF IScel, сайта мишени для гидРНК/TALE (23 п.о. для гидРНК и 18 п.о. для TALE), промотора minCMV, "штрих-кода" РНК и dTomato).
Claims (45)
1. Способ модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько направляющих РНК, комплементарных к ДНК, причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей безнуклеазный белок Cas9, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими направляющими РНК,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен,
причем одна или несколько направляющих РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются,
при этом одна или несколько направляющих РНК, безнуклеазный белок Cas9 и регулирующий транскрипцию белок или домен локализуются совместно на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, при этом вторая чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая данный безнуклеазный белок Cas9, дополнительно кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с безнуклеазным белком Cas9.
3. Способ по п. 1, при этом первая чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько направляющих РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена, а третья чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
4. Способ по п. 1, при этом клетка является эукариотической клеткой.
5. Способ по п. 1, при этом клетка является клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных.
6. Способ по п. 1, при этом направляющая РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов.
7. Способ по п. 1, при этом направляющая РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
8. Способ по п. 1, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции.
9. Способ по п. 1, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 1, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния.
11. Способ по п. 1, при этом целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
12. Способ по п. 1, при этом одна или несколько направляющих РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
13. Способ по п. 1, при этом ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
14. Клетка для экспрессии целевой нуклеиновой кислоты, содержащая
первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько направляющих РНК, комплементарных целевой нуклеиновой кислоте, находящейся в ДНК,
вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую безнуклеазный белок Cas9, который связывается с ДНК и направляется одной или несколькими направляющими РНК, и
третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую регулирующий транскрипцию белок или домен.
15. Способ модулирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более направляющих РНК, комплементарных к ДНК, причем ДНК включает целевую нуклеиновую кислоту,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей регулирующий транскрипцию белок или домен,
причем одна или несколько направляющих РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен экспрессируются,
при этом одна или несколько направляющих РНК, РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок и регулирующий транскрипцию белок или домен совместно локализуются на ДНК, а регулирующий транскрипцию белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
16. Способ по п. 15, при этом вторая чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, дополнительно кодирует регулирующий транскрипцию белок или домен, слитый с РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком.
17. Способ по п. 15, при этом первая чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько направляющих РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена, а третья чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая регулирующий транскрипцию белок или домен, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с регулирующим транскрипцию белком или доменом.
18. Способ по п. 15, при этом клетка является эукариотической клеткой.
19. Способ по п. 15, при этом клетка является клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных.
20. Способ по п. 15, при этом направляющая РНК содержит от 10 до 500 нуклеотидов.
21. Способ по п. 15, при этом направляющая РНК содержит от 20 до 100 нуклеотидов.
22. Способ по п. 15, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен является активатором транскрипции.
23. Способ по п. 15, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
24. Способ по п. 15, при этом регулирующий транскрипцию белок или домен усиливает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или болезненного состояния.
25. Способ по п. 15, при этом целевая нуклеиновая кислота связана с заболеванием или болезненным состоянием.
26. Способ по п. 15, при этом одна или несколько РНК представляют собой слияния tracr-РНК и cr-РНК.
27. Способ по п. 15, при этом ДНК представлена геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК либо экзогенной ДНК.
28. Способ по п. 15, при этом РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок представлен РНК-направляемым безнуклеазным ДНК-связывающим белком системы CRISPR II-го типа.
29. Клетка для экспрессии целевой нуклеиновой кислоты, содержащая
первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько направляющих РНК, комплементарных целевой нуклеиновой кислоте, находящейся в ДНК,
вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК-направляемый безнуклеазный ДНК-связывающий белок, и
третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую регулирующий транскрипцию белок или домен.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361830787P | 2013-06-04 | 2013-06-04 | |
US61/830,787 | 2013-06-04 | ||
PCT/US2014/040868 WO2014197568A2 (en) | 2013-06-04 | 2014-06-04 | Rna-guideded transcriptional regulation |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019114706A Division RU2756865C2 (ru) | 2013-06-04 | 2014-06-04 | Направляемая рнк регуляция транскрипции |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015156198A RU2015156198A (ru) | 2017-07-14 |
RU2015156198A3 RU2015156198A3 (ru) | 2018-05-08 |
RU2690935C2 true RU2690935C2 (ru) | 2019-06-06 |
Family
ID=52008736
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019114706A RU2756865C2 (ru) | 2013-06-04 | 2014-06-04 | Направляемая рнк регуляция транскрипции |
RU2015156198A RU2690935C2 (ru) | 2013-06-04 | 2014-06-04 | Направляемая рнк регуляция транскрипции |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019114706A RU2756865C2 (ru) | 2013-06-04 | 2014-06-04 | Направляемая рнк регуляция транскрипции |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11981917B2 (ru) |
EP (3) | EP3603679B1 (ru) |
JP (5) | JP6621738B2 (ru) |
KR (3) | KR102512979B1 (ru) |
CN (2) | CN105451778B (ru) |
AU (3) | AU2014274939B2 (ru) |
BR (1) | BR112015030491A8 (ru) |
CA (2) | CA2914638A1 (ru) |
ES (1) | ES2930537T3 (ru) |
IL (3) | IL284773B2 (ru) |
MX (2) | MX2015016798A (ru) |
MY (2) | MY177814A (ru) |
RU (2) | RU2756865C2 (ru) |
SG (3) | SG10201710030QA (ru) |
WO (1) | WO2014197568A2 (ru) |
Families Citing this family (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2853829C (en) | 2011-07-22 | 2023-09-26 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
WO2014163886A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
EP3372679A1 (en) * | 2012-10-23 | 2018-09-12 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
EP3434776A1 (en) | 2012-12-12 | 2019-01-30 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
EP2931897B1 (en) | 2012-12-12 | 2017-11-01 | The Broad Institute, Inc. | Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications |
US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
US20140356956A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-04 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Transcriptional Regulation |
EP3603679B1 (en) | 2013-06-04 | 2022-08-10 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guided transcriptional regulation |
CN107995927B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-30 | 布罗德研究所有限公司 | 用于肝靶向和治疗的crispr-cas系统、载体和组合物的递送与用途 |
KR20160056869A (ko) | 2013-06-17 | 2016-05-20 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용 |
CN106062197A (zh) | 2013-06-17 | 2016-10-26 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化 |
AU2014281027A1 (en) * | 2013-06-17 | 2016-01-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
EP3725885A1 (en) | 2013-06-17 | 2020-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
TW201542816A (zh) | 2013-09-18 | 2015-11-16 | Kymab Ltd | 方法、細胞與生物體 |
KR102380245B1 (ko) | 2013-11-07 | 2022-03-30 | 에디타스 메디신, 인코포레이티드 | 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물 |
CA2932478A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing |
WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
EP3080271B1 (en) | 2013-12-12 | 2020-02-12 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
MX2016007325A (es) | 2013-12-12 | 2017-07-19 | Broad Inst Inc | Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos. |
WO2015134812A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa |
US11339437B2 (en) | 2014-03-10 | 2022-05-24 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
US11141493B2 (en) | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
EP3553176A1 (en) | 2014-03-10 | 2019-10-16 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10) |
WO2015139139A1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | UNIVERSITé LAVAL | Crispr-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof |
EP3981876A1 (en) | 2014-03-26 | 2022-04-13 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
EP3186376B1 (en) | 2014-08-27 | 2019-03-20 | Caribou Biosciences, Inc. | Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency |
WO2016073990A2 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
US10900034B2 (en) | 2014-12-03 | 2021-01-26 | Agilent Technologies, Inc. | Guide RNA with chemical modifications |
WO2016094874A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems |
EP3985115A1 (en) | 2014-12-12 | 2022-04-20 | The Broad Institute, Inc. | Protected guide rnas (pgrnas) |
EP3280803B1 (en) | 2015-04-06 | 2021-05-26 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation |
GB201506509D0 (en) | 2015-04-16 | 2015-06-03 | Univ Wageningen | Nuclease-mediated genome editing |
EP3286571B1 (en) | 2015-04-24 | 2021-08-18 | Editas Medicine, Inc. | Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes |
CA2986310A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
JP7396783B2 (ja) | 2015-06-09 | 2023-12-12 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | 移植を改善するためのcrispr/cas関連方法および組成物 |
US10648020B2 (en) | 2015-06-18 | 2020-05-12 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR enzymes and systems |
US9790490B2 (en) * | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
WO2016205759A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
TWI813532B (zh) | 2015-06-18 | 2023-09-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脱靶效應的crispr酶突變 |
CA2999500A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing |
EP4269577A3 (en) | 2015-10-23 | 2024-01-17 | President and Fellows of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
WO2017079406A1 (en) | 2015-11-03 | 2017-05-11 | President And Fellows Of Harvard College | Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
EP3405570A1 (en) * | 2016-01-22 | 2018-11-28 | The Broad Institute, Inc. | Crystal structure of crispr cpf1 |
WO2017165826A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
US11512311B2 (en) | 2016-03-25 | 2022-11-29 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency |
EP4047092A1 (en) | 2016-04-13 | 2022-08-24 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
WO2017189525A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | President And Fellows Of Harvard College | Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection |
GB2552861B (en) * | 2016-06-02 | 2019-05-15 | Sigma Aldrich Co Llc | Using programmable DNA binding proteins to enhance targeted genome modification |
US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
US20190330603A1 (en) * | 2016-06-17 | 2019-10-31 | Genesis Technologies Limited | Crispr-cas system, materials and methods |
EP3494220A1 (en) | 2016-08-02 | 2019-06-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cep290 associated disease |
SG11201900907YA (en) | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
EP3596217A1 (en) | 2017-03-14 | 2020-01-22 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
CN110914426A (zh) | 2017-03-23 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器 |
KR20190134673A (ko) | 2017-03-30 | 2019-12-04 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 게놈 편집에 의한 엑손 스키핑 유도 방법 |
WO2018201086A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide rna molecules |
EP3622070A2 (en) | 2017-05-10 | 2020-03-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/rna-guided nuclease systems and methods |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
CN110997908A (zh) | 2017-06-09 | 2020-04-10 | 爱迪塔斯医药公司 | 工程化的cas9核酸酶 |
CN107266583B (zh) * | 2017-06-27 | 2021-02-09 | 深圳大学 | 一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法 |
EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
JP2021500036A (ja) | 2017-10-16 | 2021-01-07 | ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. | アデノシン塩基編集因子の使用 |
CN111885915B (zh) | 2018-03-19 | 2023-04-28 | 瑞泽恩制药公司 | 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制 |
GB201813011D0 (en) | 2018-08-10 | 2018-09-26 | Vib Vzw | Means and methods for drought tolerance in crops |
BR112021018607A2 (pt) | 2019-03-19 | 2021-11-23 | Massachusetts Inst Technology | Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos |
CN116096873A (zh) | 2020-05-08 | 2023-05-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物 |
AU2022343300A1 (en) | 2021-09-10 | 2024-04-18 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rnas with chemical modification for prime editing |
Family Cites Families (161)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4123610A (en) | 1977-03-09 | 1978-10-31 | The United States Government | Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith |
US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
US4981985A (en) | 1987-10-20 | 1991-01-01 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Synthesis of photolabile chelators for multivalent cations |
US4844617A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-04 | Tencor Instruments | Confocal measuring microscope with automatic focusing |
US5151189A (en) | 1990-09-17 | 1992-09-29 | Gelman Sciences, Inc. | Cationic charge modified microporous membrane |
ATE192487T1 (de) | 1992-02-13 | 2000-05-15 | Surmodics Inc | Immobilisierung eines chemischen spezies in einer vernetzten matrix |
US5594235A (en) | 1993-06-17 | 1997-01-14 | Ultrapointe Corporation | Automated surface acquisition for a confocal microscope |
US5578832A (en) | 1994-09-02 | 1996-11-26 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for imaging a sample on a device |
SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
US5830708A (en) | 1995-06-06 | 1998-11-03 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix |
US6284284B1 (en) | 1995-06-06 | 2001-09-04 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Compositions and methods for production and use of an injectable naturally secreted extracellular matrix |
AU733782B2 (en) | 1996-06-06 | 2001-05-24 | Lynx Therapeutics, Inc. | Sequencing by ligation of encoded adaptors |
US5948617A (en) | 1997-06-13 | 1999-09-07 | Biospeparations, Inc. | Methods of in situ hybridization |
US6083726A (en) | 1998-02-03 | 2000-07-04 | Lucent Technologies, Inc. | Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization |
EP2045334A1 (en) | 1998-06-24 | 2009-04-08 | Illumina, Inc. | Decoding of array sensors with microspheres |
US6613513B1 (en) | 1999-02-23 | 2003-09-02 | Caliper Technologies Corp. | Sequencing by incorporation |
JP2002542793A (ja) | 1999-04-22 | 2002-12-17 | ザ アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イエシバ ユニバーシティ | 多蛍光fishによる遺伝子発現パターンのアッセイ法 |
US20020015952A1 (en) | 1999-07-30 | 2002-02-07 | Anderson Norman G. | Microarrays and their manufacture by slicing |
CA2386151A1 (en) | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Marc Madou | Reactive polymeric valve, dispensing devices and methods using same |
AU1774501A (en) | 1999-11-17 | 2001-05-30 | Research Foundation Of State University Of New York, The | Three dimensional data storage device and method for reading |
CA2402319A1 (en) | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
DE60128908T2 (de) | 2000-06-02 | 2008-02-28 | Bayer Corp. | Verfahren zum Nachweis und zur Lokalisierung von Genen in situ durch Hybridisierung einer verzweigten DNA |
DE60140317D1 (de) | 2000-12-14 | 2009-12-10 | Gen Probe Inc | Verfahren und kits zur verbesserung der hybridisierungsraten von polynukleotiden |
EP2801624B1 (en) | 2001-03-16 | 2019-03-06 | Singular Bio, Inc | Arrays and methods of use |
US7473767B2 (en) | 2001-07-03 | 2009-01-06 | The Institute For Systems Biology | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures |
US20060248349A1 (en) | 2001-09-24 | 2006-11-02 | Rathjen Alicemarie G | Method for preparing and using personal and genetic profiles |
US20030148335A1 (en) | 2001-10-10 | 2003-08-07 | Li Shen | Detecting targets by unique identifier nucleotide tags |
GB2382137A (en) | 2001-11-20 | 2003-05-21 | Mats Gullberg | Nucleic acid enrichment |
US20090246879A1 (en) | 2002-12-20 | 2009-10-01 | Callida Genomics | Materials and Methods Relating to Nano-Tags and Nano-Brands |
JP4480715B2 (ja) | 2003-01-29 | 2010-06-16 | 454 コーポレーション | 二重末端シーケンシング |
CN103289893B (zh) | 2003-02-26 | 2015-11-18 | 凯利达基因组股份有限公司 | 通过杂交进行的随机阵列dna分析 |
EP1636625B1 (en) | 2003-05-20 | 2013-07-10 | Lucid, Inc. | Confocal microscope for imaging of selected locations of the body of a patient |
WO2005047543A2 (en) | 2003-06-10 | 2005-05-26 | Applera Corporation | Ligation assay |
US7193054B2 (en) | 2003-08-26 | 2007-03-20 | University Of Rochester | Nanofabrication using actin filaments |
US20080050718A1 (en) | 2003-11-14 | 2008-02-28 | Gesteland Raymond F | Methods, Articles, and Compositions for Identifying Oligonucleotides |
US7381529B2 (en) | 2003-12-31 | 2008-06-03 | Intel Corporation | Methods and compositions for detecting nucleic acids using scanning probe microscopy and nanocodes |
CA2557841A1 (en) | 2004-02-27 | 2005-09-09 | President And Fellows Of Harvard College | Polony fluorescent in situ sequencing beads |
US20050191687A1 (en) | 2004-02-27 | 2005-09-01 | Tianxin Wang | Method for multiplexed analyte detection |
WO2006076017A2 (en) | 2004-04-30 | 2006-07-20 | Applera Corporation | Methods and kits for identifying target nucleotides in mixed populations |
US20060024711A1 (en) | 2004-07-02 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for nucleic acid amplification and sequence determination |
US7253947B2 (en) | 2004-10-07 | 2007-08-07 | New York University | Portable automated confocal microscope |
DE602005022768D1 (de) * | 2004-11-09 | 2010-09-16 | Santaris Pharma As | Wirksame lna-oligonukleotide zur inhibierung von hif-1a |
US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
ITRM20050068A1 (it) | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine. |
US20060234261A1 (en) | 2005-03-08 | 2006-10-19 | Pierce Niles A | Colorimetric readout of hybridization chain reaction |
US7727721B2 (en) | 2005-03-08 | 2010-06-01 | California Institute Of Technology | Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging |
US20070020650A1 (en) | 2005-04-01 | 2007-01-25 | Avak Kahvejian | Methods for detecting proteins |
AU2006336403A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-08-02 | Mycosol, Inc. | Stilbazium research assays |
US7601499B2 (en) | 2005-06-06 | 2009-10-13 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
US7842793B2 (en) | 2005-06-14 | 2010-11-30 | The California Institute Of Technology | Methods of making nucleic acid nanostructures |
DK1907583T4 (da) | 2005-06-15 | 2020-01-27 | Complete Genomics Inc | Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse |
CN104673903B (zh) | 2005-06-20 | 2018-11-13 | 领先细胞医疗诊断有限公司 | 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法 |
US8486621B2 (en) | 2005-08-11 | 2013-07-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Nucleic acid-based matrixes |
AU2006330830B2 (en) | 2005-12-23 | 2013-01-10 | Institute For Systems Biology | Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof |
US7864996B2 (en) | 2006-02-17 | 2011-01-04 | Lucid, Inc. | System for macroscopic and confocal imaging of tissue |
JP2009529676A (ja) | 2006-03-10 | 2009-08-20 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 近接場照射の方法および装置 |
GB0605584D0 (en) | 2006-03-20 | 2006-04-26 | Olink Ab | Method for analyte detection using proximity probes |
US20070231823A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Mckernan Kevin J | Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing |
US8975216B2 (en) | 2006-03-30 | 2015-03-10 | Pacific Biosciences Of California | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
WO2007123744A2 (en) | 2006-03-31 | 2007-11-01 | Solexa, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
CA2649725A1 (en) | 2006-04-19 | 2007-10-25 | Applera Corporation | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing |
US7964347B2 (en) | 2006-06-15 | 2011-06-21 | Krassen Dimitrov | Labels for electronic detection of individual molecules and methods for their detection |
EP2057435A4 (en) | 2006-06-23 | 2011-04-20 | Life Technologies Corp | SYSTEMS AND METHOD FOR COOLING IN DEVICES FOR BIOLOGICAL ANALYSIS |
US7745129B1 (en) | 2006-07-12 | 2010-06-29 | Kenneth David Schatz | Methods for sequencing of a necleic acid |
US20100009868A1 (en) | 2006-09-11 | 2010-01-14 | The Arizona Board of Regents a body corporate acti ng for and behalf of Arizona State university | Self-Assembled Combinatorial Encoding Nanoarrays for Multiplexed Biosensing |
US20090208965A1 (en) | 2006-10-25 | 2009-08-20 | Ikonisys, Inc. | Automated method for detecting cancers and high grade hyperplasias |
US9201063B2 (en) | 2006-11-16 | 2015-12-01 | General Electric Company | Sequential analysis of biological samples |
WO2008069973A2 (en) | 2006-12-01 | 2008-06-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
US20080269068A1 (en) | 2007-02-06 | 2008-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex decoding of sequence tags in barcodes |
NZ579002A (en) | 2007-03-02 | 2012-03-30 | Danisco | Cultures with improved phage resistance |
US8145677B2 (en) | 2007-03-27 | 2012-03-27 | Faleh Jassem Al-Shameri | Automated generation of metadata for mining image and text data |
WO2008144562A1 (en) | 2007-05-16 | 2008-11-27 | California Institute Of Technology | A versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways |
AU2008265691B2 (en) | 2007-06-19 | 2014-04-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | High throughput nucleic acid sequencing by expansion |
WO2009018576A1 (en) | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Biodesic | Compositions and methods for analyte detection and quantitation |
EP2212434A1 (en) | 2007-10-01 | 2010-08-04 | Applied Biosystems Inc. | Chase ligation sequencing |
MX2010003724A (es) | 2007-10-04 | 2010-09-14 | Halcyon Molecular | Secuenciacion de polimeros de acido nucleico con microscopia electronica. |
US20090139311A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-06-04 | Applied Biosystems Inc. | Biological Analysis Systems, Devices, and Methods |
WO2009065093A2 (en) | 2007-11-17 | 2009-05-22 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Use of stem cells for wound healing |
CN101586150B (zh) | 2008-05-23 | 2016-09-28 | 陕西佰美基因股份有限公司 | 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途 |
US8546553B2 (en) | 2008-07-25 | 2013-10-01 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Prokaryotic RNAi-like system and methods of use |
WO2010017264A2 (en) | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Cornell University | Photo-crosslinked nucleic acid hydrogels |
EP2331704B1 (en) | 2008-08-14 | 2016-11-30 | Nanostring Technologies, Inc | Stable nanoreporters |
US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US20100087325A1 (en) | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
US9404098B2 (en) | 2008-11-06 | 2016-08-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide |
US8309306B2 (en) | 2008-11-12 | 2012-11-13 | Nodality, Inc. | Detection composition |
EP3290531B1 (en) | 2008-12-19 | 2019-07-24 | President and Fellows of Harvard College | Particle-assisted nucleic acid sequencing |
JP4528345B2 (ja) | 2009-01-28 | 2010-08-18 | シャープ株式会社 | 動画再生装置、動画再生方法、動画再生方法をコンピュータで実現するためのプログラム及びそのプログラムを記録した記録媒体 |
FR2948475A1 (fr) | 2009-07-24 | 2011-01-28 | Bionext | Procede de caracterisation d'objets tridimensionnels |
US8431151B2 (en) | 2009-08-06 | 2013-04-30 | Syracuse University | Antimicrobial nanostructured hydrogel web containing silver |
EP2488876B1 (en) | 2009-10-13 | 2017-03-01 | Nanostring Technologies, Inc | Protein detection via nanoreporters |
AU2010315303B2 (en) | 2009-11-03 | 2015-08-06 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Quantitative Nuclease Protection Sequencing (qNPS) |
WO2011075516A2 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery |
US20110257031A1 (en) | 2010-02-12 | 2011-10-20 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid, biomolecule and polymer identifier codes |
WO2011112634A2 (en) | 2010-03-08 | 2011-09-15 | California Institute Of Technology | Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells |
US10087431B2 (en) | 2010-03-10 | 2018-10-02 | The Regents Of The University Of California | Methods of generating nucleic acid fragments |
GB201004292D0 (en) | 2010-03-15 | 2010-04-28 | Olink Ab | Assay for localised detection of analytes |
CA2794522C (en) | 2010-04-05 | 2019-11-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
CA2798703A1 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | The Regents Of The University Of California | Endoribonuclease compositions and methods of use thereof |
US20130059741A1 (en) | 2010-05-13 | 2013-03-07 | Illumina, Inc. | Binding assays for markers |
KR101862756B1 (ko) | 2010-07-09 | 2018-05-30 | 세르겐티스 비.브이. | 관심있는 3-d 게놈 영역 서열화 전략 |
WO2012056440A1 (en) | 2010-10-28 | 2012-05-03 | Nanodoc Ltd. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA |
JP5978220B2 (ja) | 2010-10-29 | 2016-08-24 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸ナノ構造バーコードプローブ |
WO2012067911A1 (en) | 2010-11-16 | 2012-05-24 | Nabsys, Inc. | Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes |
CN113151404A (zh) | 2011-02-15 | 2021-07-23 | 莱卡生物系统纽卡斯尔有限责任公司 | 用于mrna的定位的原位检测的方法 |
JP5687514B2 (ja) | 2011-02-17 | 2015-03-18 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸配列解析装置 |
DK2500436T3 (en) | 2011-03-17 | 2016-08-29 | Pasteur Institut | A method, probe and kit for in situ hybridization of DNA and use thereof |
WO2012150035A1 (de) | 2011-05-04 | 2012-11-08 | Genovoxx Gmbh | Nukleosid-triphosphat-konjugate und methoden zu deren anwendung |
US9617598B2 (en) | 2011-05-27 | 2017-04-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of amplifying whole genome of a single cell |
US20140113376A1 (en) | 2011-06-01 | 2014-04-24 | Rotem Sorek | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
PL222511B1 (pl) | 2011-06-08 | 2016-08-31 | Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie | Endorybonukleazy dsRNA |
EP2766498B1 (en) | 2011-10-14 | 2019-06-19 | President and Fellows of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
WO2014163886A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
BR112014020625A2 (pt) | 2012-02-24 | 2017-07-04 | Hutchinson Fred Cancer Res | polinucleotídeo, polipeptídeo, composição, célula e célula tronco editada por genoma |
ES2904816T3 (es) | 2012-02-27 | 2022-04-06 | Becton Dickinson Co | Composiciones para recuento molecular |
WO2013130824A1 (en) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating huntington's disease |
US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
MX362866B (es) * | 2012-05-25 | 2019-02-20 | Univ California | Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn. |
SG196730A1 (en) | 2012-07-16 | 2014-02-13 | Agency Science Tech & Res | Methods for reading data from a storage medium using a reader and storage devices |
KR102134361B1 (ko) | 2012-07-20 | 2020-08-26 | 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 | 광응답성 핵산류를 포함한 프로브를 이용한 광연결 방법 |
WO2014022702A2 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-06 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing |
WO2014028314A1 (en) | 2012-08-15 | 2014-02-20 | Lucid, Inc. | Systems and methods for imaging tissue |
CN102908119A (zh) | 2012-09-26 | 2013-02-06 | 温州医学院眼视光研究院 | 一种共焦扫描成像系统及其像差控制方法 |
EP3372679A1 (en) | 2012-10-23 | 2018-09-12 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
PT3138910T (pt) * | 2012-12-06 | 2017-10-18 | Sigma Aldrich Co Llc | Modificação e regulação de genoma baseado em crispr |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
EP2931897B1 (en) * | 2012-12-12 | 2017-11-01 | The Broad Institute, Inc. | Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications |
US20140189896A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Feng Zhang | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
CN113528577A (zh) | 2012-12-12 | 2021-10-22 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化 |
US8993233B2 (en) | 2012-12-12 | 2015-03-31 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains |
US20140310830A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-10-16 | Feng Zhang | CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes |
KR20150095861A (ko) | 2012-12-17 | 2015-08-21 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | Rna-가이드된 인간 게놈 조작 |
EP2946015B1 (en) | 2013-01-16 | 2021-05-26 | Emory University | Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto |
US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
JP2016519652A (ja) | 2013-03-14 | 2016-07-07 | カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法 |
US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
US9330295B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-03 | Brown University | Spatial sequencing/gene expression camera |
EP3988667A1 (en) | 2013-03-15 | 2022-04-27 | The General Hospital Corporation | Using truncated guide rnas (tru-grnas) to increase specificity for rna-guided genome editing |
US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
US10510435B2 (en) | 2013-04-30 | 2019-12-17 | California Institute Of Technology | Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization |
US10457980B2 (en) | 2013-04-30 | 2019-10-29 | California Institute Of Technology | Multiplex labeling of molecules by sequential hybridization barcoding |
JP7065564B2 (ja) * | 2013-05-29 | 2022-05-12 | セレクティス | Cas9ニッカーゼ活性を用いて正確なdna切断をもたらすための方法 |
US20140356956A1 (en) * | 2013-06-04 | 2014-12-04 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Transcriptional Regulation |
EP3603679B1 (en) | 2013-06-04 | 2022-08-10 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guided transcriptional regulation |
AU2014281027A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-01-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
US10655173B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-05-19 | The Broad Institute, Inc. | Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing |
EP3080259B1 (en) | 2013-12-12 | 2023-02-01 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
GB201401885D0 (en) | 2014-02-04 | 2014-03-19 | Olink Ab | Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR) |
WO2015127183A2 (en) | 2014-02-21 | 2015-08-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Expansion microscopy |
ES2770055T3 (es) | 2014-11-21 | 2020-06-30 | Nanostring Technologies Inc | Secuenciación sin enzima ni amplificación |
WO2016138496A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Cellular Research, Inc. | Spatially addressable molecular barcoding |
ES2934982T3 (es) | 2015-03-30 | 2023-02-28 | Becton Dickinson Co | Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios |
WO2017079406A1 (en) | 2015-11-03 | 2017-05-11 | President And Fellows Of Harvard College | Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
EP3394579B1 (en) | 2015-12-21 | 2023-09-20 | Verily Life Sciences LLC | Systems and methods for determining an identity of a probe in a target based on colors and locations of two or more fluorophores in the probe and in the target |
US10844426B2 (en) | 2016-03-17 | 2020-11-24 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for detecting and identifying genomic nucleic acids |
ES2908919T3 (es) | 2016-07-05 | 2022-05-04 | California Inst Of Techn | Reacción en cadena de hibridación de iniciador fraccionario |
CN117551741A (zh) | 2017-03-31 | 2024-02-13 | 乌尔蒂维尤股份有限公司 | Dna-抗原交换和扩增 |
-
2014
- 2014-06-04 EP EP19197844.4A patent/EP3603679B1/en active Active
- 2014-06-04 JP JP2016517954A patent/JP6621738B2/ja active Active
- 2014-06-04 KR KR1020217023393A patent/KR102512979B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-04 CN CN201480043971.2A patent/CN105451778B/zh active Active
- 2014-06-04 WO PCT/US2014/040868 patent/WO2014197568A2/en active Application Filing
- 2014-06-04 SG SG10201710030QA patent/SG10201710030QA/en unknown
- 2014-06-04 CA CA2914638A patent/CA2914638A1/en active Pending
- 2014-06-04 EP EP22189419.9A patent/EP4159243A1/en active Pending
- 2014-06-04 BR BR112015030491A patent/BR112015030491A8/pt active Search and Examination
- 2014-06-04 AU AU2014274939A patent/AU2014274939B2/en active Active
- 2014-06-04 RU RU2019114706A patent/RU2756865C2/ru active
- 2014-06-04 KR KR1020237009424A patent/KR20230042154A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-06-04 IL IL284773A patent/IL284773B2/en unknown
- 2014-06-04 ES ES19197844T patent/ES2930537T3/es active Active
- 2014-06-04 RU RU2015156198A patent/RU2690935C2/ru active
- 2014-06-04 KR KR1020157036892A patent/KR102282990B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-04 IL IL302205A patent/IL302205A/en unknown
- 2014-06-04 SG SG11201509962QA patent/SG11201509962QA/en unknown
- 2014-06-04 CA CA3176690A patent/CA3176690A1/en active Pending
- 2014-06-04 MY MYPI2015002877A patent/MY177814A/en unknown
- 2014-06-04 SG SG10201913068PA patent/SG10201913068PA/en unknown
- 2014-06-04 MX MX2015016798A patent/MX2015016798A/es unknown
- 2014-06-04 EP EP14807194.7A patent/EP3003392B1/en active Active
- 2014-06-04 MY MYPI2019003198A patent/MY197877A/en unknown
- 2014-06-04 CN CN202110830978.0A patent/CN113846096A/zh active Pending
-
2015
- 2015-12-04 MX MX2021009672A patent/MX2021009672A/es unknown
- 2015-12-06 IL IL242959A patent/IL242959B/en unknown
-
2019
- 2019-03-04 JP JP2019039027A patent/JP7036511B2/ja active Active
-
2020
- 2020-06-15 AU AU2020203977A patent/AU2020203977B2/en active Active
- 2020-12-02 JP JP2020200649A patent/JP7119055B2/ja active Active
-
2021
- 2021-08-24 AU AU2021221488A patent/AU2021221488B2/en active Active
-
2022
- 2022-08-03 JP JP2022124144A patent/JP7376650B2/ja active Active
- 2022-10-25 US US17/972,885 patent/US11981917B2/en active Active
-
2023
- 2023-10-26 JP JP2023183980A patent/JP2024012387A/ja active Pending
-
2024
- 2024-01-29 US US18/425,219 patent/US20240175057A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Mali, RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9, Science 339, 823-825 (2013). * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2690935C2 (ru) | Направляемая рнк регуляция транскрипции | |
US10767194B2 (en) | RNA-guided transcriptional regulation | |
AU2020200163B2 (en) | Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing | |
NZ753950B2 (en) | Rna-guided transcriptional regulation | |
NZ753951B2 (en) | Rna-guided transcriptional regulation | |
NZ715280B2 (en) | Rna-guided transcriptional regulation |