JP7036511B2 - Ｒｎａ誘導性転写制御 - Google Patents

Description

関連出願データ
本願は２０１３年６月４日に出願された、ここに全ての目的のために全体の参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願番号第６１／８３０７８７号の優先権を主張する。

政府権益の説明
本発明は米国国立衛生研究所助成金番号Ｐ５０ ＨＧ００５５５０と米国エネルギー省の助成金番号ＤＥ－ＦＧ０２－０２ＥＲ６３４４５の国庫補助により行われた。米国政府は本発明について一定の権利を有する。

細菌と古細菌のＣＲＩＳＰＲ‐ＣａｓシステムはＣａｓタンパク質と複合体になっている短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入してきた外来核酸の内に存在する相補配列の分解を導く。Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ， Ｅ．ら著、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅＩＩＩ． Ｎａｔｕｒｅ誌、第４７１巻、６０２～６０７頁（２０１１年）、Ｇａｓｉｕｎａｓ， Ｇ， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ．およびＳｉｋｓｎｙｓ， Ｖ．著、Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ誌、第１０９巻、Ｅ２５７９～２５８６頁（２０１２年）、Ｊｉｎｅｋ， Ｍ．ら著、Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６～８２１頁（２０１２年）；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ， Ｒ．ら著、Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第３９巻、９２７５～９２８２頁（２０１１年）、およびＢｈａｙａ， Ｄ．， Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｍ．およびＢａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．著、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ： ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ誌、第４５巻、２７３～２９７頁（２０１１年）を参照されたい。最近の、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロにおける再構成により、通常トランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）は、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに充分であることが示された。標的部位に相同であるｇＲＮＡの発現によりＣａｓ９の動員と標的ＤＮＡの分解が引き起こされる。Ｈ． Ｄｅｖｅａｕら著、Ｐｈａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＲＩＳＰＲ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ誌、第１９０巻、１３９０頁（２００８年２月）を参照されたい。

本開示の態様は、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡ結合タンパク質と、二本鎖ＤＮＡ標的配列との複合体に関するものである。ある特定の態様によると、本開示の範囲内のＤＮＡ結合タンパク質には、ガイドＲＮＡとの複合体を形成するタンパク質、およびその複合体を二本鎖ＤＮＡ配列にガイドするガイドＲＮＡとの複合体であって、そのＤＮＡ配列に結合する前記複合体を形成するタンパク質が含まれる。本開示のこの態様を前記ＲＮＡとＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの共局在、または二本鎖ＤＮＡとの共局在と呼ぶことができる。このようにＤＮＡ結合タンパク質‐ガイドＲＮＡ複合体を使用して、標的ＤＮＡの発現を制御するために標的ＤＮＡに転写制御因子タンパク質またはドメインを局在させることができる。

ある特定の態様によると、細胞において標的核酸の発現を制御する方法であって、前記標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類以上のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記ＤＮＡに結合し且つ前記１種類以上のＲＮＡによってガイドされるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｎｕｌｌ）ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが発現し、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記ＤＮＡに共局在し、且つ、前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する前記方法が提供される。

一つの態様によると、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸は、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする。一つの態様によると、１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸はＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸は、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

一つの態様によると、前記細胞は真核細胞である。一つの態様によると、前記細胞は酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。一つの態様によると、前記細胞は哺乳類細胞である。

一つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である。一つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である。

一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは転写活性化因子である。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡはスペーサー配列とトレーサーメイト配列（tracer mate sequence）を含む。前記ガイドＲＮＡは、その一部がｔｒａｃｒメイト配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列を含んでもよい。前記ガイドＲＮＡはトレーサーメイト配列とｔｒａｃｒ配列を連結（link）してｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体を作製するリンカー核酸配列を含んでもよい。前記スペーサー配列は、例えばハイブリダイゼーションにより、標的ＤＮＡに結合する。

一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡは短縮型スペーサー配列を含む。一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡは１塩基の５’末端短縮を有する短縮型スペーサー配列を含む。一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡは２塩基の５’ 末端短縮を有する短縮型スペーサー配列を含む。一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡは３塩基の５’末端短縮を有する短縮型スペーサー配列を含む。一つの態様によると、前記ガイドＲＮＡは４塩基の５’末端短縮を有する短縮型スペーサー配列を含む。したがって、前記スペーサー配列は１塩基～４塩基の５’末端短縮をその配列に有し得る。

ある特定の実施形態によると、前記スペーサー配列は前記標的核酸配列にハイブリダイズする約１６個から約２０個の間のヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態によると、前記スペーサー配列は前記標的核酸配列にハイブリダイズする約２０ヌクレオチドを含んでよい。

ある特定の態様によると、前記リンカー核酸配列は約４個から約６個の間の核酸を含んでよい。

ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６０個から約５００個個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６４個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６５個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６６個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６７個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６８個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６９個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約７０個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約８０個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約９０個から約５００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約１００個から約５００個の間の核酸を含んでよい。

ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６０個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６４個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６５個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６６個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６７個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６８個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約６９個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約７０個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約８０個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約９０個から約２００個の間の核酸を含んでよい。ある特定の態様によると、前記ｔｒａｃｒ配列は約１００個から約２００個の間の核酸を含んでよい。

例示的なガイドＲＮＡが図５Ｂに示されている。

一つの態様によると、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある特定の態様によると、細胞において標的核酸の発現を制御する方法であって、前記標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類以上のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記ＤＮＡに結合し且つ前記１種類以上のＲＮＡによってガイドされるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記１種類以上のＲＮＡ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが発現し、前記１種類以上のＲＮＡ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記ＤＮＡに共局在し、且つ、前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する前記方法が提供される。

一つの態様によると、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする。一つの態様によると、１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸はＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸は、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

一つの態様によると、前記細胞は真核細胞である。一つの態様によると、前記細胞は酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。一つの態様によると、前記細胞は哺乳類細胞である。

一つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である。一つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である。

一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは転写活性化因子である。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。

一つの態様によると、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある特定の態様によると、細胞において標的核酸の発現を制御する方法であって、前記標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類以上のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記ＤＮＡに結合し且つ前記１種類以上のＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが発現し、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記ＤＮＡに共局在し、前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する前記方法が提供される。

一つの態様によると、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記外来核酸は、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする。一つの態様によると、１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸はＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸は前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

一つの態様によると、前記細胞は真核細胞である。一つの態様によると、前記細胞は酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。一つの態様によると、前記細胞は哺乳類細胞である。

一つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である。一つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である。

一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは転写活性化因子である。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。

一つの態様によると、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

一つの態様によると、標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２外来核酸、および転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を含む細胞であって、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である前記細胞が提供される。

一つの態様によると、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする。一つの態様によると、１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸はＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸は、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

一つの態様によると、前記細胞は真核細胞である。一つの態様によると、前記細胞は酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。一つの態様によると、前記細胞は哺乳類細胞である。

一つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの間である。一つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの間である。

一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは転写活性化因子である。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記転写制御因子タンパク質またはドメインは疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する。一つの態様によると、前記標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。一つの態様によると、前記１種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。

一つの態様によると、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある特定の態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質である。ある特定の態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼ（nickase）をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニック（nick）を入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせる前記方法が提供される。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせる前記方法が提供される。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し、且つ、前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせる前記方法が提供される。

ＤＮＡ標的核酸を改変させる前記方法によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在する。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在して相同組換えを引き起こす。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在する。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して二本鎖切断を生じさせる。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれて（offset with respect to one another）いる。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせる。一つの態様によると、前記２つ以上の隣接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。一つの態様によると、前記方法はドナー核酸配列をコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記２つ以上のニックにより前記標的核酸の前記ドナー核酸配列との相同組換えが引き起こされる。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせ、前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる前記方法が提供される。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせ、前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる前記方法が提供される。

一つの態様によると、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法であって、それぞれ前記ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を前記細胞に導入すること、１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッケースをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、前記２種類以上のＲＮＡ及び前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせ、前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる前記方法が提供される。

一つの態様によると、それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、および少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を含む細胞であって、前記２種類以上のＲＮＡと前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記ＤＮＡ標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である前記細胞が提供される。

一つの態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼである。一つの態様によると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有するＣａｓ９タンパク質ニッカーゼである。

一つの態様によると、前記細胞は真核細胞である。一つの態様によると、前記細胞は酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。一つの態様によると、前記細胞は哺乳類細胞である。

一つの態様によると、前記ＲＮＡは約１０個から約５００個の間のヌクレオチドを含む。一つの態様によると、前記ＲＮＡは約２０個から約１００個の間のヌクレオチドを含む。

一つの態様によると、前記標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

一つの態様によると、前記２種類以上のＲＮＡはガイドＲＮＡである。一つの態様によると、前記２種類以上のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である。

一つの態様によると、前記ＤＮＡ標的核酸はゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

本発明のある特定の実施形態のその他の特徴および利点は、後続の実施形態とそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲からさらに十分に明らかとなろう。

本特許または特許出願のファイルは彩色図面を含む。彩色図面を有する本特許または特許出願公開の写しは、請求および所要の手数料を納付すれば、特許庁によって提供される。本実施形態の前述その他の特徴および利点は、添付されている図面と併せて、後続の例示的な実施形態の詳細な説明からより十分に理解されよう。

図１ＡはＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。図１ＢはＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。図１Ｃはレポーターコンストラクトのデザインを示す。 図１Ｄは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と免疫蛍光分析（ＩＦ）の両方によってアッセイしたときにＣａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体がＲＮＡ誘導性転写活性化を示すことを表すデータを示す。 図１Ｄは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と免疫蛍光分析（ＩＦ）の両方によってアッセイしたときにＣａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体がＲＮＡ誘導性転写活性化を示すことを表すデータを示す。 図１ＥはＣａｓ９Ｎ、ＭＳ２－ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡの存在下でのレポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化を示すＦＡＣＳとＩＦによるアッセイデータを示す。 図１ＥはＣａｓ９Ｎ、ＭＳ２－ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡの存在下でのレポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化を示すＦＡＣＳとＩＦによるアッセイデータを示す。 図１Ｆは個々のｇＲＮＡと複数のｇＲＮＡによる転写誘導を表すデータを示す。

図２ＡはＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体とＴＡＬＥによるターゲティングのランドスケイプを評価するための方法を示す。 図２ＢはＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体が平均してその標的配列中の１～３個の突然変異に対して許容的であることを表すデータを示す。図２ＣはＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体が、ＰＡＭ配列に局在しているものを除いて点突然変異にほとんど感受性が無いことを表すデータを示す。 図２Ｄは２塩基のミスマッチの導入によってＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体活性が顕著に損なわれることを表すヒートプロットデータを示す。図２Ｅは１８－ｍｅｒのＴＡＬＥが平均してその標的配列中の１～２個の突然変異に対して許容的であることを表すデータを示す。 図２Ｆは１８－ｍｅｒのＴＡＬＥがＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体と同様にその標的中の１塩基のミスマッチにほとんど感受性が無いことを表すデータを示す。図２Ｇは２塩基のミスマッチの導入によって１８－ｍｅｒのＴＡＬＥの活性が顕著に損なわれることを表すヒートプロットデータを示す。

図３ＡはガイドＲＮＡデザインの模式図である。 図３Ｂは５’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックと３’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックについての非相同末端結合のパーセンテージ率を示すデータを表す。 図３Ｃは５’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックと３’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックについてのターゲティングのパーセンテージ率を示すデータを表す。

図４ＡはＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４（青色）のＲｕｖＣの位置Ｄ７にある金属配位性残基の模式図（左）、およびＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７Ｋ（オレンジ色）と４Ｈ９Ｄ（青緑色）のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの模式図であって３Ｍ７Ｋの配位しているＭｇイオン（灰色の四角）とＤＮＡ（紫）を含む模式図（中央）、および分析した突然変異体のリスト（右）である。 図４ＢはＣａｓ９突然変異体ｍ３およびｍ４、およびまた、それらの突然変異体のそれぞれのＶＰ６４との融合体の検出不可能であるヌクレアーゼ活性を示すデータを表す。 図４Ｃは図４Ｂのデータの高感度検査である。

図５ＡはＣａｓ９‐ｇＲＮＡ活性を測定するための相同組換えアッセイの模式図である。 図５Ｂは無作為配列挿入物を有するガイドＲＮＡと相同組換えのパーセンテージ率を示す。 図５Ｂは無作為配列挿入物を有するガイドＲＮＡと相同組換えのパーセンテージ率を示す。

図６ＡはＯＣＴ４遺伝子のガイドＲＮＡの模式図である。図６Ｂはプロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの転写活性化を示す。 図６ＣはｑＰＣＲによって内在性遺伝子の転写活性化を示す。

図７ＡはＲＥＸ１遺伝子のガイドＲＮＡの模式図である。図７Ｂはプロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの転写活性化を示す。 図７ＣはｑＰＣＲによって内在性遺伝子の転写活性化を示す。

図８Ａは正規化された発現レベルの算出のための高レベルの特異性分析処理フローを模式的に示す図である。 図８Ｂはバイアスがかけられたコンストラクトライブラリー内で生じたミスマッチ数毎の結合部位のパーセンテージの分布状態のデータを示す。左：理論的分布状態。右：実際のＴＡＬＥコンストラクトライブラリーから観察された分布状態。図８Ｃはミスマッチ数毎の結合部位に集まったタグの数のパーセンテージの分布状態のデータを示す。左：陽性対照試料から観察された分布状態。右：対照ではないＴＡＬＥがガイドされた試料から観察された分布状態。

図９ＡはＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の標的配列中の１～３個の突然変異に対する許容性を示す、当該複合体のターゲティングランドスケイプの分析データを示す。図９ＢはＰＡＭ配列に局在しているものを除く点突然変異に対する非感受性を示す、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体のターゲティングランドスケイプの分析データを示す。 図９Ｃは２塩基のミスマッチの導入によって活性が顕著に損なわれることを示す、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体のターゲティングランドスケイプの分析のヒートプロットデータを示す。 図９Ｄは化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９の予想されるＰＡＭがＮＧＧであり、またＮＡＧであることを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す。

図１０Ａは１８－ｍｅｒのＴＡＬＥがそれらの標的配列中の複数の突然変異を許容することを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す。 図１０Ａは１８－ｍｅｒのＴＡＬＥがそれらの標的配列中の複数の突然変異を許容することを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す。 図１０Ｂは３つの異なるサイズ（１８－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒおよび１０－ｍｅｒ）のＴＡＬＥのターゲティングランドスケイプの分析データを示す。 図１０Ｃはほぼ１塩基ミスマッチ解像度を示す１０－ｍｅｒのＴＡＬＥのデータを示す。図１０Ｄはほぼ１塩基ミスマッチ解像度を示す１０－ｍｅｒのＴＡＬＥのヒートプロットデータを示す。

図１１ＡはデザインされたガイドＲＮＡを示す。 図１１Ｂは様々なガイドＲＮＡの非相同末端結合のパーセンテージ率を示す。 図１２Ａは、ＳＯＸ２遺伝子についてデザインされた、転写開始部位の上流の約１ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする１０種類のｇＲＮＡを示す。 図１２Ｂは、ＮＡＮＯＧ遺伝子についてされた、転写開始部位の上流の約１ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする１０種類のｇＲＮＡを示す。 図１３Ａは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ２のターゲティングランドスケイプを示し、図１３Ｂは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ２の１塩基ミスマッチプロットを示す。 図１３Ｃは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ２の２塩基ミスマッチプロットを示し、図１３Ｄは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ３のターゲティングランドスケイプを示す。 図１３Ｅは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ３の１塩基ミスマッチプロットを示し、図１３Ｆは、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４＋ｇＲＮＡ３の２塩基ミスマッチプロットを示す。 図１４Ａ～Ｃは、２種類の異なるｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体を使用した特異性データを示す。 図１５Ａは、１塩基または２塩基のミスマッチを担持するｇＲＮＡ２についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１５Ｂ－１は、１塩基または２塩基のミスマッチを担持するｇＲＮＡ２についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１５Ｂ－２は、１塩基または２塩基のミスマッチを担持するｇＲＮＡ２についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１５Ｃ及び図１５Ｄ－１は、１塩基または２塩基のミスマッチを担持するｇＲＮＡ３についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１５Ｄ－２は、１塩基または２塩基のミスマッチを担持するｇＲＮＡ３についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ａは、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ１についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ｂ－１は、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ１についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ｂ－２は、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ１についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ｃ、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ３についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ｄ－１は、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ３についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１６Ｄ－２は、スペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ３についてのヌクレアーゼアッセイを用いた試験を示す。 図１７Ａは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭについての試験を示す。 図１７Ｂは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭについての試験を示す。 図１８Ａは、ＴＡＬＥ突然変異についてのヌクレアーゼアッセイにおける標的化実験を示す。 図１８Ｂは、ＴＡＬＥ突然変異についてのヌクレアーゼアッセイにおける標的化実験を示す。 図１９Ａは、ＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較のための試験アプローチを示す。 図１９Ｂ－１は、ＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較を示す。 図１９Ｂ－２は、ＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較を示す。 図１９Ｃ－１は、ＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較を示す。 図１９Ｃ－２は、ＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較を示す。 図２０Ａは、オフセット・ニック形成に関するＡＡＶＳ１遺伝子座のターゲティングを示す。 図２０Ｂは、オフセット・ニック形成に関するデータを示す。 図２１Ａは、オフセット・ニック形成およびＮＨＥＪプロファイルを示す。 図２１Ｂは、オフセット・ニック形成およびＮＨＥＪプロファイルを示す。 図２１Ｃは、オフセット・ニック形成およびＮＨＥＪプロファイルを示す。

本開示の実施形態は、標的核酸の制御法においてＤＮＡに転写制御因子タンパク質またはドメインを共局在させるためにＤＮＡ結合タンパク質を使用することに基づく。そのようなＤＮＡ結合タンパク質が様々な目的のためにＤＮＡに結合することは当業者に既知である。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然物であり得る。本開示の範囲内に含まれるＤＮＡ結合タンパク質にはここでガイドＲＮＡと称されるＲＮＡによってガイドされ得るものが含まれる。この態様によると、ガイドＲＮＡとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡにおいて共局在複合体を形成する。ある特定の態様によると、ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。この態様によると、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質の改変(alteration)または改造（modification）の結果から生じ得る。そのようなヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質は当業者に知られており、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在する、Ｃａｓ９タンパク質のような、ヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質を含む。そのようなＣａｓ９タンパク質とＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは当技術分野においてよく記述されている。ここにその全体が参照により援用される全ての追加情報を含むＭａｋａｒｏｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌、第９巻、２０１１年６月、４６７～４７７頁を参照されたい。

ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は二本鎖ＤＮＡにニックを入れるかまたは二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性はヌクレアーゼ活性を示す１つ以上のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質はそれぞれのドメインが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを入れることを担っている２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列にはＭｃｒＡ－ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが含まれる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は自然界においてＭｃｒＡ－ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインとＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つ以上を含むタンパク質である。ある特定の態様によると、前記ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ活性を不活化するために改変されるか、あるいは改造される。そのような改変または改造にはヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活化するための１つ以上のアミノ酸の変更が含まれる。そのような改造には、ヌクレアーゼ活性を示す単数または複数のポリペプチド配列、すなわち、ヌクレアーゼドメインが、前記ＤＮＡ結合タンパク質に存在しないように、ヌクレアーゼ活性を示す前記単数または複数のポリペプチド配列、すなわち、ヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。ヌクレアーゼ活性を不活化するための他の改造は、本開示に基づいて当業者にすぐに明らかになろう。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質にはヌクレアーゼ活性を不活化するように改造されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を不活化するための単数または複数のポリペプチド配列の除去が含まれる。そのヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ活性が不活化されていてもＤＮＡ結合能を保持している。したがって、前記ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡ結合に必要な単数または複数のポリペプチド配列を含んでいるが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１つ以上または全てを欠失していてよい。したがって、前記ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡ結合に必要な単数または複数のポリペプチド配列を含んでいるが、不活化ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１つ以上または全てを有していてよい。

一つの態様によると、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼドメインの１つを除いて全てが不活化されているように改造または改変されていてよい。そのような改造型または改変型ＤＮＡ結合タンパク質は、そのＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方のストランドだけを切断する、またはニックを入れるものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡにガイドされるとき、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。

例示的なＤＮＡ結合タンパク質としては、ヌクレアーゼ活性を欠くＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質がある。例示的なＤＮＡ結合タンパク質としてはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質がある。例示的なＤＮＡ結合タンパク質としてはＣａｓ９タンパク質ニッカーゼがある。

化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ではＣａｓ９は、そのタンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわち、ＤＮＡの相補ストランドを切断するＨＮＨドメインと非相補ストランドを切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在する処理を介して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。ここにその全体が参照により援用されるＪｉｎｋｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６～８２１頁（２０１２年）を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｍａｋａｒｏｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌、第９巻、２０１１年６月、４６７～４７７頁の追加情報中に見出される次のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在することが知られている：メタノコッカス・マリパルディスＣ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ；コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ－３１４株；コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサスＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカスＢ４ ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカスＡ６株；クリベラ・フラビダＤＳＭ１７８３６ ｕｉｄ４３４６５株；サーモノスポラ・カーバタＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングムＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンスＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナＥＸ Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリスＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセアＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルムＪＩＰ０２ ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサスＲＳ１株；シネコシスティスＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥムＰｅｉ１９１株；非培養性シロアリ１群細菌系統型Ｒｓ Ｄ１７株；フィブロバクター・サクシノゲネスＳ８５株；バチルス・セレウスＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア；ラクトバチルス・カゼイ；ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエＡ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガラクティアエ亜種エクイシミリスＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカスＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・ガロリティカスＵＣＮ３４ ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイＣｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔ ＣＨ１株；ストレプトコッカス・ミュータンスＮＮ２０２５ ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭ１ ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＳＳＩ－１株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＬＭＤ－９株；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌムＡ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌムＢ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌムＢａ４ ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌムＦ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカムＨ１０株；フィネゴルディア・マグナＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム；マイコプラズマ・モービレ１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス；マイコプラズマ・シノビアエ５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミスＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウムＢＴＡｉ１株；ニトロバクター・ハンブルゲンシスＸ１４株；ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ１８株；ロドシュードモナス・パルストリスＢｉｓＢ５株；バルビバクラム・ラバメンティボランスＤＳ－１株；ディノロセオバクター・シバエＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ ５ ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクスＰａｌ ５ ＪＧＩ株；アゾスピリルムＢ５１０ ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラムＡＴＣＣ１１１７０株；ジアフォロバクターＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエＥＦ０１－２株；ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）０５３４４２株；ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）ａｌｐｈａ１４株；ナイセリア・メニンギティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンスＤＳＭ２６３８株；カンピロバクター・ジェジュニ亜種ドイレイ２６９９７株；カンピロバクター・ジェジュニ８１１１６株；カンピロバクター・ジェジュニ；カンピロバクター・ラリＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス；ウォリネラ・サクシノゲネス；トルモナス・アウエンシスＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカＴ６ｃ株；シュワネラ・ペアレアナＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラＰａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダＵ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ホラルクティカ；フランシセラ・ツラレンシスＦＳＣ１９８株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス；フランシセラ・ツラレンシスＷＹ９６－３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコーラＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに存在するＣａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ欠損になっている、または本明細書に記載されるようなニッカーゼになっているＣａｓ９タンパク質に関する。

Ｃａｓ９タンパク質は文献中では当業者によってＣｓｎ１と呼ばれることがあり得る。本明細書に記載される実験対象である化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質配列を以下に示す。ここにその全体が参照により援用されるＤｅｌｔｃｈｅｖａら著、Ｎａｔｕｒｅ誌、第４７１巻、６０２～６０７頁（２０１１年）を参照されたい。

本明細書に記載されるＲＮＡ誘導性ゲノム制御方法のある特定の態様によると、ヌクレアーゼ活性を低下させるように、実質的に低下させるように、または除去するようにＣａｓ９を改変する。一つの態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインを改変することによってＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を低下させる、実質的に低下させる、または除去する。一つの態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを不活性化する。一つの態様によると、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを不活性化する。一つの態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインとＨＮＨヌクレアーゼドメインを不活性化する。追加の態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインとＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されているＣａｓ９タンパク質が提供される。追加の態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインとＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されている限りにおいてヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。追加の態様によると、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインのどちらかが不活性化され、それによって残りのヌクレアーゼドメインがヌクレアーゼ活性について活性型のままでいる、Ｃａｓ９ニッカーゼが提供される。このように二本鎖ＤＮＡの一方のストランドだけが切断されるか、またはニックを入れられる。

追加の態様によると、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質を提供するためにＣａｓ９中の１つ以上のアミノ酸が改変されているかあるいは除去されているヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。一つの態様によると、それらのアミノ酸にはＤ１０とＨ８４０が含まれる。Ｊｉｎｋｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、第３３７巻、８１６～８２１頁（２０１２年）を参照されたい。追加の態様によると、それらのアミノ酸にはＤ８３９とＮ８６３が含まれる。一つの態様によると、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てがヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に低下させるか、または除去するアミノ酸で置換される。一つの態様によると、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てがアラニンで置換される。一つの態様によると、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てが、アラニンなどの、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に低下させるか、または除去するアミノ酸で置換されたＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ９Ｎと称され、当該タンパク質はヌクレアーゼ活性が低下若しくは削減されているか、またはヌクレアーゼ活性が検出のレベル内に無いか若しくは実質的に無い。この態様によると、Ｃａｓ９Ｎのヌクレアーゼ活性は公知のアッセイを用いて検出できない場合があり得る、すなわち、公知のアッセイの検出レベル未満であり得る。

一つの態様によると、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡによってガイドされる当該タンパク質の能力を保持する、そのホモログおよびオーソログを含む。一つの態様によると、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の天然Ｃａｓ９ついて示されている配列であって、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てがアラニンで置換されている前記配列、および、その配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を有するタンパク質配列であって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である、前記配列を含む。

一つの態様によると、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインとＨＮＨヌクレアーゼドメインのタンパク質配列を除いた化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の天然Ｃａｓ９について示されている配列、およびまた、その配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の相同性を有するタンパク質配列であって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である前記配列を含む。このように本開示の態様はＤＮＡ結合を担う、例えばガイドＲＮＡとの共局在とＤＮＡ結合を担う、タンパク質配列、及び当該タンパク質配列と相同なタンパク質配列を含み、且つ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質を作製するためには、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインとＨＮＨヌクレアーゼドメインは不活化されるかまたは天然のＣａｓ９タンパク質のタンパク質配列から除去されるかのどちらかであり得るので、（ＤＮＡ結合に必要とされない限り）これらのドメインのタンパク質配列を含む必要が無い。

本開示の目的のため、Ｃａｓ９に対する相同性を有する公知のタンパク質構造の中の金属配位性残基を図４Ａに示す。Ｃａｓ９配列中の位置に基づいて残基が標識されている。左はＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４のＲｕｖＣ構造（青色）。Ｃａｓ９配列中のＤ１０に対応する位置Ｄ７は、Ｍｇイオン配位位置の中で強調されている。中央はＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７Ｋ（オレンジ色）と４Ｈ９Ｄ（青緑色）のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの構造であり、３Ｍ７Ｋの配位しているＭｇイオン（灰色の四角）とＤＮＡ（紫）とを含む。３Ｍ７Ｋ中の残基Ｄ９２およびＮ１１３および４Ｈ９Ｄの位置Ｄ５３およびＮ７７はＣａｓ９のアミノ酸Ｄ８３９およびＮ８６３に対する配列相同性を有し、棒で示されている。右は作製されヌクレアーゼ活性について分析された突然変異体のリストである。野生型Ｃａｓ９、Ｄ１０についてアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ１；Ｄ１０とＨ８４０についてアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ２；Ｄ１０、Ｈ８４０、およびＤ８３９についてアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ３；並びに、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＮ８６３についてアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ４。

図４Ｂに示されるように、標的座位についてディープシーケンシングを行うと、Ｃａｓ９突然変異体：ｍ３およびｍ４、および、それらのそれぞれのＶＰ６４との融合体は、検出不可能なヌクレアーゼ活性を示した。ｇＲＮＡ標的を区別する赤色の線と共に、ゲノム上の位置に対する突然変異頻度をプロットで示す。図４Ｃは図４Ｂのデータの高感度検査を示す図であり、突然変異ランドスケイプが未改変座位に類似のプロファイルを示すことが確認される。

一つの態様によると、転写活性化ドメインをヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはガイドＲＮＡのどちらかに連結することによってヒト細胞においてのＲＮＡ誘導性ゲノム制御を可能にする、遺伝子改変されたＣａｓ９‐ｇＲＮＡシステムが提供される。本開示の一つの態様によると、１つ以上の転写制御タンパク質またはドメイン（そのような用語は互換的に使用される）がヌクレアーゼ欠損型Ｃａｓ９または１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結びつけられ、あるいはこれ以外のやり方で接続される。それらの転写制御ドメインは標的座位に対応する。したがって、本開示の態様は、転写制御ドメインをＣａｓ９ＮまたはｇＲＮＡのどちらかに融合し、接続し、または結びつけることによりそのようなドメインを標的座位に局在させるための方法および材料を含む。

一つの態様によると、転写活性化可能なＣａｓ９Ｎ融合タンパク質が提供される。一つの態様によると、ＶＰ６４活性化ドメイン（ここにその全体が参照により援用されるＺｈａｎｇら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第２９巻、１４９～１５３頁（２０１１年）を参照のこと）がＣａｓ９ＮのＣ末端に結びつけられ、融合され、接続され、あるいはこれら以外のやり方で連結（tether）される。一つの方法によると、当該Ｃａｓ９Ｎタンパク質により標的ゲノムＤＮＡ部位に転写制御ドメインが提供される。一つの方法によると、転写制御ドメインに融合したＣａｓ９Ｎが１つ以上のガイドＲＮＡと共に細胞内に提供される。融合した転写制御ドメインを有するＣａｓ９Ｎが、標的ゲノムＤＮＡに、または標的ゲノムＤＮＡ近傍に結合する。１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ゲノムＤＮＡに、または標的ゲノムＤＮＡ近傍に結合する。転写制御ドメインが標的遺伝子の発現を制御する。特定の態様によると、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体は、プロモーター近辺の配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わさった時に、レポーターコンストラクトの転写を活性化し、それによってＲＮＡ誘導性転写を活性化した。

一つの態様によると、転写活性化可能なｇＲＮＡ融合タンパク質が提供される。一つの態様によると、ＶＰ６４活性化ドメインがｇＲＮＡに結びつけられ、融合され、接続され、あるいはこれら以外のやり方で連結（tether）される。一つの方法によると、そのｇＲＮＡによりゲノムＤＮＡ部位を標的とする転写制御ドメインが提供される。一つの方法によると、転写制御ドメインに融合したｇＲＮＡがＣａｓ９Ｎタンパク質と共に細胞内に提供される。当該Ｃａｓ９Ｎは、標的ゲノムＤＮＡに、または標的ゲノムＤＮＡ近傍に結合する。転写制御タンパク質またはドメインと融合した、１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ゲノムＤＮＡに、または標的ゲノムＤＮＡ近傍に結合する。転写制御ドメインが標的遺伝子の発現を制御する。特定の態様によると、Ｃａｓ９Ｎタンパク質と、転写制御ドメインが融合したｇＲＮＡとが、レポーターコンストラクトの転写を活性化し、それによってＲＮＡ誘導性転写を活性化した。

転写制御可能なｇＲＮＡ連結物は、無作為配列をそのｇＲＮＡに挿入し、Ｃａｓ９機能についてアッセイすることによりそのｇＲＮＡのどの領域が改造を許容するか特定することによって作製された。キメラｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の５’末端またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３’末端のどちらかに無作為配列挿入物を有するｇＲＮＡは機能性を保持し、一方でキメラｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡスキャフォルド部分への挿入がなされると機能が喪失する。無作為塩基挿入に対するｇＲＮＡの柔軟性についてまとめた図５Ａ～Ｂを参照されたい。図５ＡはＣａｓ９‐ｇＲＮＡ活性を測定するための相同組換え（ＨＲ）アッセイの模式図である。図５Ｂに示されるように、キメラｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の５’末端またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３’末端のどちらかに無作為配列挿入物を有するｇＲＮＡは機能性を保持し、一方でキメラｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡスキャフォルド部分に挿入がなされると機能が失われる。ｇＲＮＡ配列中の挿入の位置は赤色のヌクレオチドによって示されている。科学的理論に捉われることを望むことなく述べれば、５’末端での無作為塩基挿入による活性の上昇はｇＲＮＡが長くなって半減期が増したことに起因するものであり得る。

ＶＰ６４をｇＲＮＡに結合させるため、２コピーのＭＳ２バクテリオファージ・コートプロテイン結合性ＲＮＡステムループをそのｇＲＮＡの３’末端に取り付けた。ここにその全体が参照により援用されるＦｕｓｃｏら著、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ誌：第ＣＢ１３巻、１６１～１６７頁（２００３年）を参照されたい。これらのキメラｇＲＮＡはＣａｓ９ＮとＭＳ２－ＶＰ６４融合タンパク質と共に発現した。３種類全ての要素の存在下でレポーターコンストラクトの配列特異的転写活性化が観察された。

図１ＡはＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。図１Ａに示されるように、転写活性化可能なＣａｓ９Ｎ融合タンパク質を作製するため、ＶＰ６４活性化ドメインをＣａｓ９ＮのＣ末端に直接連結した。図１Ｂに示されるように、転写活性化可能なｇＲＮＡ連結物を作製するため、２コピーのＭＳ２バクテリオファージ・コートプロテイン結合性ＲＮＡステムループをそのｇＲＮＡの３’末端に取り付けた。これらのキメラｇＲＮＡはＣａｓ９ＮとＭＳ２－ＶＰ６４融合タンパク質と共に発現した。図１Ｃは転写活性化をアッセイするために使用されたレポーターコンストラクトのデザインを示している。それらの２種類のレポーターは別個のｇＲＮＡ標的部位を有し、且つ、対照ＴＡＬＥ－ＴＦ標的部位を共有する。図１Ｄに示されるように、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および免疫蛍光分析（ＩＦ）の両方によってアッセイすると、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体はＲＮＡ誘導性転写活性化を示す。具体的には、対照ＴＡＬＥ－ＴＦが両方のレポーターを活性化した一方で、Ｃａｓ９Ｎ－ＶＰ６４融合体はｇＲＮＡ配列特異的にレポーターを活性化する。図１Ｅに示されるように、３種類全ての要素、すなわち、Ｃａｓ９Ｎ、ＭＳ２－ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡが存在するときにのみ、レポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化がＦＡＣＳおよびＩＦの両方によって観察された。

ある特定の態様によれば、Ｃａｓ９Ｎ、１つ以上のｇＲＮＡおよび転写制御タンパク質またはドメインを使用して内在性遺伝子を制御する方法が提供される。一つの態様によると、内在性遺伝子はあらゆる所望の遺伝子（ここでは標的遺伝子と呼ばれる）であり得る。一つの例示的な態様によると、制御の標的となる遺伝子には、多能性の維持に関与する両方とも厳密に制御されている遺伝子であるＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）およびＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）が含まれた。図１Ｆに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖（ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている）を標的とする１０種類のｇＲＮＡをＲＥＸ１遺伝子用にデザインした。プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ここにその全体が参照により援用されるＴａｋａｈａｓｈｉら著、Ｃｅｌｌ誌、第１３１巻、８６１～８７２頁（２００７年）を参照のこと）を用いて転写活性化をアッセイするか、または内在性遺伝子のｑＰＣＲにより転写活性化を直接的にアッセイした。

図６Ａ～ＣはＣａｓ９Ｎ－ＶＰ６４を使用するＲＮＡ誘導性ＯＣＴ４制御に関する。図６Ａに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする２１種類のｇＲＮＡをＯＣＴ４遺伝子用にデザインした。ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている。図６Ｂはプロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用して転写活性化を示している。図６Ｃは内在性遺伝子のｑＰＣＲにより直接的に転写活性化を示している。個々のｇＲＮＡの導入によって転写が中程度に促進された一方で、複数のｇＲＮＡが相乗的に作用して堅固な複数倍の転写活性化を促進した。

図７Ａ～ＣはＣａｓ９Ｎ、ＭＳ２－ＶＰ６４およびｇＲＮＡ＋２×ＭＳ２アプタマーを使用するＲＮＡ誘導性ＲＥＸ１制御に関する。図７Ａに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする１０種類のｇＲＮＡをＲＥＸ１遺伝子用にデザインした。ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている。図７Ｂはプロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用して転写活性化を示している。図７Ｃは内在性遺伝子のｑＰＣＲにより直接的に転写活性化を示している。個々のｇＲＮＡの導入によって転写が中程度に促進された一方で、複数のｇＲＮＡが相乗的に作用して堅固な複数倍の転写活性化を促進した。一つの態様では、ｇＲＮＡ上に２×ＭＳ２アプタマーが存在しないことで転写活性化が引き起こされない。ここにその全体が参照によりそれぞれ援用されるＭａｅｄｅｒら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１０巻、２４３～２４５頁（２０１３年）およびＰｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１０巻、２３９～２４２頁（２０１３年）を参照されたい。

したがって、方法は、標的遺伝子の発現を制御するためにＣａｓ９Ｎタンパク質および転写制御タンパク質またはドメインと複数のガイドＲＮＡを使用することに関する。

Ｃａｓ９連結アプローチとｇＲＮＡ連結アプローチの両方が効果的であり、前者は約１．５～２倍高い能力を示した。この差異は３要素複合体集合と対照的な２要素複合体集合の必要条件に起因するようである。しかしながら、ｇＲＮＡ連結アプローチは、各ｇＲＮＡが異なるＲＮＡ－タンパク質間相互作用対を利用する限り、別個のｇＲＮＡによって様々なエフェクタードメインを動員することを原理的に可能にする。ここにその全体が参照により援用されるＫａｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓら著、ヨーロッパ細胞生物学会賛助Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ誌、第１００巻、１２５～１３８頁（２００８年）を参照されたい。本開示の一つの態様によると、特異的なガイドＲＮＡおよび包括的な（generic）Ｃａｓ９Ｎタンパク質、すなわち、異なる標的遺伝子に対する同一または類似のＣａｓ９Ｎタンパク質を使用して、異なる標的遺伝子を制御することができる。一つの態様によると、同一または類似のＣａｓ９Ｎを使用する多重遺伝子制御の方法が提供される。

本開示の方法はヒト細胞の多重遺伝子操作およびエピジェネティック操作を提供するために本明細書に記載されるようなＣａｓ９Ｎタンパク質とガイドＲＮＡを使用して標的遺伝子を編集することにも関する。Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡターゲティングが論点であるので（ここにその全体が参照により援用されるＪｉａｎｇら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第３１巻、２３３～２３９頁（２０１３年）を参照のこと）、非常に多種多様な標的配列のバリエーションに対するＣａｓ９親和性を徹底的に調査するための方法を提供する。したがって、本開示の態様は、天然のヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９を使用する特異性試験によってもたらされるｄｓＤＮＡ切断毒性および突然変異修復により生じる厄介な問題を回避しつつヒト細胞におけるＣａｓ９ターゲティングの直接的ハイスループット・リードアウトを提供する。

その他の本開示の態様は概ね標的遺伝子の転写制御のためにＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合システムを使用することに関する。当業者は本開示に基づいて例示的なＤＮＡ結合システムを容易に特定する。そのようなＤＮＡ結合システムは、天然のＣａｓ９タンパク質にあるようないかなるヌクレアーゼ活性も有する必要が無い。したがって、そのようなＤＮＡ結合システムはヌクレアーゼ活性を不活性化する必要が無い。一つの例示的なＤＮＡ結合システムはＴＡＬＥである。ゲノム編集ツールとして通常はＴＡＬＥ－ＦｏｋＩダイマーが使用され、ゲノム制御にはＴＡＥＬ－ＶＰ６４融合体が非常に有効であることが示されている。一つの態様に従い、図２Ａに示されている方法を用いてＴＡＬＥの特異性を評価した。ライブラリーの各要素がｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現するミニマルプロモーターを含むコンストラクトライブラリーを設計する。転写開始部位ｍの下流に２４ｂｐの（Ａ／Ｃ／Ｇ）無作為転写物タグを挿入し、一方で２つのＴＦ結合部位をプロモーターの上流に配置する。一つは全てのライブラリー要素によって共有される一定ＤＮＡ配列であり、二つ目のものは「バイアスがかかった」結合部位ライブラリーを有する可変的特徴であり、それらの結合部位はプログラム可能ＤＮＡターゲティング複合体が結合するように設計された標的配列から離れて多数の突然変異の組合せを提示する配列の大きなコレクションに及ぶように設計されている。これは、標的配列ヌクレオチドが７９％の頻度で現れ、他のそれぞれのヌクレオチドが７％の頻度で現れるようなヌクレオチド出現頻度を各位置で有するように設計された縮重オリゴヌクレオチドを使用して達成される。ここにその全体が参照により援用されるＰａｔｗａｒｄｈａｎら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌、第３０巻、２６５～２７０頁（２０１２年）を参照されたい。次にレポーターライブラリーを配列解析して２４ｂｐのｄＴｏｍａｔｏ転写物タグとライブラリー要素中のそれらの対応する「バイアスがかかった」標的部位との間の関係を明らかにする。異なる標的間でのタグの共有が非常にまれであることがそれらの転写物タグの大きな多様性によって確証され、一方で標的配列のバイアスがかかった構成は、ほとんど突然変異を有しない部位がより多くの突然変異を有する部位よりも多くのタグと結合することを意味する。次に、ｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子の転写が共有ＤＮＡ部位に結合するように設計された対照ＴＦ、または標的部位に結合するように設計された標的ＴＦのどちらかによって促進される。促進を受けた細胞に対してＲＮＡ配列解析を実施することにより発現した各転写物タグの量を各試料で測定し、次に前もって作製された関連表を使用してそれらの対応する結合部位にその転写物タグをマップする。対照ＴＦの結合部位は全てのライブラリー要素にわたって共有されているので対照ＴＦは全てのライブラリー構成要素を等しく刺激することが予期され、一方で標的ＴＦは、その標的ＴＦが優先的に標的とする構成要素に対して、発現構成要素の分布状態をゆがめると予期される。対照ＴＦについて得られたタグ数で標的ＴＦについて得られたタグ数を除算することにより各結合部位について正規化発現レベルを計算するために、ステップ５においてこの仮説を利用する。

図２Ｂに示されるように、Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体は平均してその標的配列中の１～３個の突然変異に対して許容的であることがその複合体のターゲティングランドスケイプより明らかである。図２Ｃに示されるように、Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭ配列に局在しているものを除いて点突然変異にもほとんど感受性が無い。特に、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９の予想されるＰＡＭがＮＧＧばかりでなくＮＡＧでもあることがこのデータより明らかである。しかしながら、図２Ｄに示されるように、これらのミスマッチがさらに８～１０塩基ほどｇＲＮＡ標的配列の３’末端に近くに局在するときにのみ、２塩基のミスマッチの導入によってＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体活性は顕著に損なわれる（ヒートプロットでは標的配列の位置は５’末端より１～２３と標識されている）。

本明細書に記載される転写特異性アッセイを用いて別の広範に使用されるゲノム編集ツールであるＴＡＬＥドメインの突然変異許容性を決定した。図２Ｅに示されるように、１８－ｍｅｒのＴＡＬＥについてのＴＡＬＥオフ・ターゲティングデータより、１８－ｍｅｒのＴＡＬＥは平均してその標的配列中の１～２個の突然変異を許容することができ、且つ、その標的中の３塩基ミスマッチ変異体の大多数を活性化することができないことが明らかである。図２Ｆに示されるように、１８－ｍｅｒのＴＡＬＥは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体と同様に、その標的中の１塩基のミスマッチにほとんど感受性が無い。図２Ｇに示されるように、１８－ｍｅｒのＴＡＬＥの活性は２塩基のミスマッチの導入によって顕著に損なわれる。ＴＡＬＥの活性はミスマッチがその標的配列の５’末端に近くなるほどそれらのミスマッチに対して感受性が高くなる（ヒートプロットでは標的配列の位置は５’末端より１～１８と標識されている）。

様々なサイズのＴＡＬＥによるターゲティングのランドスケイプを評価することに関する図１０Ａ～Ｃの主題であるヌクレアーゼアッセイの標的化実験を用いて結果を確認した。図１０Ａに示されるように、１８－ｍｅｒのＴＡＬＥはそれらの標的配列中の複数の突然変異を許容することがヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイを用いて確認された。図１０Ｂに示されるように、図２に記載されているアプローチを用いて３つの異なるサイズ（１８－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒおよび１０－ｍｅｒ）のＴＡＬＥのターゲティングランドスケイプを分析した。ＴＡＬＥが短くなるほど（１４－ｍｅｒおよび１０－ｍｅｒ）次第にそれらのＴＡＬＥのターゲティングが特異的になり、活性もほぼ一桁低くなる。図１０Ｃおよび１０Ｄに示されるように、１０－ｍｅｒのＴＡＬＥはほぼ１塩基ミスマッチの感度を示し、２つのミスマッチを有する標的に対してほとんど全ての活性を失う（ヒートプロットでは標的配列の位置は５’末端より１～１０と標識されている）。まとめると、ゲノム工学用途においてより短いＴＡＬＥを設計するほどより高い特異性を得ることができ、一方でＴＡＬＥヌクレアーゼ用途において標的外効果を回避するためにＦｏｋＩの二量体化の必要性が重要であることをこれらのデータは示している。それぞれここにその全体が参照により援用されるＫｉｍら著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ誌、第９３巻、１１５６～１１６０頁（１９９６年）およびＰａｔｔａｎａｙａｋら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第８巻、７６５～７７０頁（２０１１年）を参照されたい。

図８Ａ～Ｃは、実験データを例に示されている正規化発現レベルの算出のための高レベルの特異性分析処理フローに関する。図８Ａに示されるように、レポーター遺伝子転写物に組み込まれる分布状態にバイアスがかかっている結合部位配列と無作為配列２４ｂｐタグを有するコンストラクトライブラリーを構築する（上段）。転写されたタグは、縮合性が高いので、多くが１つずつのＣａｓ９結合配列またはＴＡＬＥ結合配列に対応することになるはずである。コンストラクトライブラリーを配列解析して（第３段、左）どのタグがどの結合部位に対応するか確定し、結合部位と転写されたタグの間の関連表を作製する（第４段、左）。様々な結合部位について構築された複数のコンストラクトライブラリーについて、ライブラリーバーコードを使用して配列解析してもよい（ここでは水色および明黄色で表される；第１～４段、左）。次にコンストラクトライブラリーを細胞集団に形質移入し、一組の様々なＣａｓ９／ｇＲＮＡまたはＴＡＬＥ転写因子をそれらの集団の試料中でガイドする（第２段、右）。１つの試料は、コンストラクト内の一定の結合部位配列を標的とする一定のＴＡＬＥ活性化因子によって常にガイドされる（上段、緑色のボックス）。この試料は陽性対照として機能する（緑色の試料、＋記号によっても表される）。次にそれらのガイド試料内のレポーターｍＲＮＡ分子から作られたｃＤＮＡを配列解析し、分析して試料中の各タグのタグ数を得る（第３段および第４段、右）。コンストラクトライブラリーの配列解析と同様に、試料バーコードを付加することにより陽性対照を含む複数の試料を一緒に配列解析し、分析する。ここで明赤色は、配列解析され、陽性対照（緑色）と一緒に分析された、１つの非対照試料を表す。各リードには転写されたタグだけが現れ、コンストラクトの結合部位は現れないので、次にコンストラクトライブラリーの配列解析から得られた結合部位とタグの間の関連表を使用して各試料の中の各結合部位から発現するタグの総数を算出する（第５段）。次に各非陽性対照試料についての総数を陽性対照試料において得られた総数で除算することにより各非陽性対照試料についての総数を各結合部位についての正規化発現レベルに変換する。ミスマッチ数毎の正規化発現レベルのプロットの例が図２Ｂと２Ｅ、および図９Ａと図１０Ｂに提供されている。誤りがちなタグ、コンストラクトライブラリーと結合できないタグ、および明らかに複数の結合部位によって共有されるタグに対する幾つかのレベルのフィルタリングは、この全体的処理フローに含まれていない。図８Ｂはバイアスがかかったコンストラクトライブラリー内で生じたミスマッチ数毎の結合部位のパーセンテージの例示的な分布状態を示している。左：理論的分布状態。右：実際のＴＡＬＥコンストラクトライブラリーから観察された分布状態。図８Ｃはミスマッチ数毎の結合部位に集まったタグの数のパーセンテージの例示的な分布状態を示している。左：陽性対照試料から観察された分布状態。右：対照ではないＴＡＬＥがガイドされた試料から観察された分布状態。陽性対照ＴＡＬＥがコンストラクト内の一定の部位に結合するので、集まったタグ数の分布状態は図８Ｂにおける結合部位の分布状態をよく反映し、一方でミスマッチが少ない部位ほど高い発現レベルをガイドするのでその分布状態は非対照ＴＡＬＥ試料について左方にゆがめられている。下：標的ＴＦについて得られたタグ数を対照ＴＦについて得られたタグ数で除算してこれらの間の相対的濃縮度を計算することによって平均発現レベルと標的部位における突然変異数との間の関係が明らかになる。

これらの結果は異なるＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体を使用して作成された特異性データによってさらに再確認される。図９Ａに示されるように、異なるＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体がその標的配列中の１～３個の突然変異に対して許容的である。図９Ｂに示されるように、そのＣａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭ配列に局在しているものを除いて点突然変異にもほとんど感受性が無い。しかしながら、図９Ｃに示されるように、２塩基のミスマッチの導入によって活性が顕著に損なわれる（ヒートプロットでは標的配列の位置は５’末端より１～２３と標識されている）。図９Ｄに示されるように、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９の予想されるＰＡＭがＮＧＧであり、またＮＡＧであることがヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイを用いて確認された。

ある特定の態様によると、本明細書に記載される方法に従って結合特異性が増加する。複数の複合体の間の相乗作用がＣａｓ９Ｎ‐ＶＰ６４による標的遺伝子の活性化の要因であり、個々の標的外結合事象の効果は最小限であるべきなのでＣａｓ９Ｎの転写制御用途は自然と非常に特異的である。一つの態様によると、ゲノム編集の方法の中でオフセット・ニックを使用する。ニックの大多数がＮＨＥＪ事象を引き起こすことはほとんどないので（ここにその全体が参照により援用されるＣｅｒｔｏら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第８巻、６７１～６７６頁（２０１１年）を参照のこと）、標的外ニック形成の効果が最小になる。対照的に、オフセット・ニックを誘導して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることは遺伝子破壊の誘導において非常に有効である。ある特定の態様によると、５’オーバーハングは３’オーバーハングと比較してより有意なＮＨＥＪ事象を引き起こす。同様に、ＨＲ事象の総数は５’オーバーハングが生じたときよりも著しく少ないが、３’オーバーハングはＮＨＥＪ事象よりもＨＲ事象を好む。以上より、相同組換えのためにニックを用い、二本鎖切断を生じさせるためにオフセット・ニックを用いて標的外Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ活性の効果を最小限にする方法が提供される。

図３Ａ～Ｃは多重オフセット・ニック形成およびガイドＲＮＡとの標的外結合を減少させるための方法に関する。図３Ａに示されるように、トラフィックライトレポーターを使用して標的化ニック導入時または標的化切断導入時のＨＲ事象とＮＨＥＪ事象を同時にアッセイした。ＨＤＲ経路により解消されたＤＮＡ切断事象はＧＦＰ配列を回復し、一方で突然変異誘発性ＮＨＥＪはＧＦＰを読み枠から外し、且つ、下流のｍＣｈｅｒｒｙ配列を読み枠に入れるフレームシフトの原因になる。そのアッセイについて、２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖を範囲とする１４種類のｇＲＮＡ、すなわち、センスストランドを標的とする７種類（Ｕ１～７）とアンチセンスストランドを標的とする７種類（Ｄ１～７）をデザインした。相補ストランドにニックを入れるＣａｓ９Ｄ１０Ａ突然変異体を使用して異なる二通りのｇＲＮＡの組合せを用いて一連の計画的５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを誘導した（それらの１４種類のｇＲＮＡのニック形成部位が示されている）。図３Ｂに示されるように、オフセット・ニックを誘導して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることは遺伝子破壊の誘導にとって非常に有効である。特に、５’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックは３’オーバーハングと比べてより多くのＮＨＥＪ事象を引き起こす。図３Ｃに示されるように、３‘オーバーハングの生成はＮＨＥＪ事象よりもＨＲ事象の比率にとっても好都合であるが、ＨＲ事象の総数は５’オーバーハングが生じたときよりも著しく少ない。

図１１Ａ～ＢはＣａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ介在性ＮＨＥＪに関する。図１１Ａに示されるように、トラフィックライトレポーターを使用して標的化ニック導入時または標的化切断導入時のＮＨＥＪ事象をアッセイした。簡単に説明すると、ＤＮＡ切断事象の導入時にその切断が突然変異誘発性ＮＨＥＪを誘発するとＧＦＰが読み枠から外れ、且つ、下流のｍＣｈｅｒｒｙ配列が読み枠に入って赤色の蛍光が生じる。２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖を範囲とする１４種類のｇＲＮＡ、すなわち、センスストランドを標的とする７種類（Ｕ１～７）とアンチセンスストランドを標的とする７種類（Ｄ１～７）をデザインした。図１１Ｂに示されるように、全ての標的についてＤＳＢと堅固なＮＨＥＪを引き起こす野生型Ｃａｓ９と異なり（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ突然変異体を用いると）大半のニックはほとんどＮＨＥＪ事象を引き起こさないことが観察された。１４か所の部位全てが連続的な２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖の範囲内に位置し、１０倍を超えるターゲティング効率の差が観察された。

ある特定の態様に従い、細胞において標的核酸の発現を制御する方法であって、１つ以上の、２つ以上のまたは複数の外来核酸を前記細胞に導入することを含む前記方法を本明細書に記載する。細胞に導入されるそれらの外来核酸は単数のガイドＲＮＡまたは複数のガイドＲＮＡ、単数のヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質または複数のヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質と転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする。また、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質および転写制御因子タンパク質またはドメインは、当該ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質および転写制御因子タンパク質またはドメインがＤＮＡに結合し、標的核酸の発現を制御する限り、当業者によって理解されるように共局在複合体と呼ばれる。ある特定の追加の態様によると、細胞に導入される前記外来核酸は単数のガイドＲＮＡまたは複数のガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質ニッカーゼとをコードする。また、ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質ニッカーゼは、当該ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質ニッカーゼがＤＮＡに結合し、標的核酸にニックを入れる限り、当業者によって理解されるように共局在複合体と呼ばれる。

本開示による細胞には本明細書に記載されるように外来核酸を導入することができ、発現させることができるあらゆる細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的な考えは細胞種によって限定されないことが理解されるべきである。本開示による細胞には真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。特定の細胞には哺乳類細胞が含まれる。さらに、細胞には標的核酸を制御するのに有益である、または望ましいあらゆる細胞が含まれる。そのような細胞には疾患または有害な健康状態を引き起こす特定のタンパク質の発現に欠損を有する細胞が含まれ得る。当業者にはそのような疾患または有害な健康状態は容易にわかる。本開示によれば、本明細書に記載される方法と、標的核酸の上方制御と特定のタンパク質の対応的な発現を引き起こす転写活性化因子とによって、当該特定のタンパク質の発現を担う核酸が標的とされ得る。この場合、本明細書に記載される方法は治療処置を提供する。

標的核酸には、本明細書に記載される共局在複合体が制御またはニックの形成のどちらかにとって有用であり得るあらゆる核酸配列が含まれる。標的核酸には遺伝子が含まれる。本開示の目的のため、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含むことができ、共局在複合体はその共局在複合体が標的核酸に対する所望の作用を有し得るようにその標的核酸で、またはそれに隣接して、またはその近傍でそのＤＮＡに結合するか、あるいはこれら以外のやり方でそのＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸には内在性の（または天然の）核酸および外来性の（または外来の）核酸が含まれ得る。当業者は標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を本開示に基づいて容易に特定またはデザインすることができる。当業者は標的核酸を含むＤＮＡに同様に共局在する転写制御因子タンパク質またはドメインをさらに特定することができる。ＤＮＡにはゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは外来性ＤＮＡが含まれる。

外来核酸（すなわち、細胞の天然の核酸組成物の一部ではない核酸）を、当業者に知られている導入のためのあらゆる方法を用いて細胞に導入してよい。そのような方法には形質移入、形質導入、ウイルス形質導入、微量注入、リポフェクション、ヌクレオフェクション、ナノ粒子ボンバードメント、遺影室転換、接合などが含まれる。当業者は容易に特定可能な文献を用いてそのような方法を容易に理解し、適用する。

転写活性化因子である転写制御因子タンパク質またはドメインにはＶＰ１６、ＶＰ６４、および本開示に基づいて当業者によって容易に特定可能な他のものが含まれる。

疾患および有害な健康状態は特定のタンパク質の発現の異常な喪失を特徴とするものである。そのような疾患または有害な健康状態は特定のタンパク質の上方制御によって治療され得る。以上より、疾患または有害な健康状態を治療する方法であって、本明細書に記載される共局在複合体が標的核酸を含むＤＮＡに会合その他のやり方で結合し、共局在複合体の転写活性化因子が標的核酸の発現を上方制御する前記方法を提供する。例えば、褐色脂肪分化および代謝取込みの増加を促進するＰＲＤＭ１６と他の遺伝子の上方制御を用いてメタボリックシンドロームまたは肥満を治療することができる。抗炎症性遺伝子の活性化は自己免疫疾患および心血管疾患において有用である。腫瘍抑制遺伝子の活性化は癌の治療に有用である。当業者は本開示に基づいてそのような疾患および有害な健康状態を容易に特定する。

後続の実施例を本開示の代表として示す。これらの実施形態および他の同等の実施形態は本開示、図面および添付されている特許請求の範囲を考慮して明らかであるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されてはならない。

［実施例１］
Ｃａｓ９突然変異体
Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインの天然の活性を除去することができるＣａｓ９の候補突然変異を特定するために、公知の構造を有するＣａｓ９と相同である配列を検索した。ＨＨｐｒｅｄ（ワールド・ワイド・ウェッブサイト・ツールキット、ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｈｈｐｒｅｄ）を使用して全長タンパク質データバンク（２０１３年１月）に対してＣａｓ９の全長配列をクエリ配列とした。この検索によってＣａｓ９のＨＮＨドメインに対する顕著な配列相同性を有する２つの異なるＨＮＨエンドヌクレアーゼであるＰａｄエンドヌクレアーゼと推定エンドヌクレアーゼ（それぞれＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７Ｋと４Ｈ９Ｄ）が返された。これらのタンパク質を調査してマグネシウムイオンの配位に関わる残基を見つけ出した。次に、それらの対応する残基をＣａｓ９に対する配列アラインメントの中で特定した。Ｃａｓ９の中の同じ種類のアミノ酸と整列する各構造中の２つのＭｇ配位性側鎖を特定した。それらは３Ｍ７ＫのＤ９２とＮ１１３、および４Ｈ９ＤのＤ５３とＮ７７であった。これらの残基はＣａｓ９のＤ８３９とＮ８６３に対応した。Ｐａｄ残基Ｄ９２とＮ１１３のアラニンへの突然変異によってそのヌクレアーゼが触媒的に欠損になることも報告された。この分析に基づいてＣａｓ９突然変異Ｄ８３９ＡとＮ８６３Ａを作製した。さらに、ＨＨｐｒｅｄはＣａｓ９とサーマス・サーモフィルスのＲｕｖＣ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４）のＮ末端との間の相同性も予測する。この配列アラインメントはＣａｓ９中のＲｕｖＣドメインの機能を除去する以前に報告された突然変異Ｄ１０Ａを含む。この突然変異を適切な突然変異として確認するため、前述したように金属結合性残基を決定した。４ＥＰ４ではＤ７がマグネシウムイオンを配位するのに機能する。この位置はＣａｓ９ Ｄ１０に対応する配列相同性を有し、この突然変異が金属結合の除去に役立ち、結果としてＣａｓ９のＲｕｖＣドメインからの触媒活性の除去に役立つことを確認する。

［実施例２］
プラスミド構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（アジレントテクノロジーズ社）を使用してＣａｓ９突然変異体を作製した。標的ｇＲＮＡ発現コンストラクトは（１）ＩＤＴから個々のｇＢｌｏｃｋとして直接注文され、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローン化されるか、または（２）Ｇｅｎｅｗｉｚによってカスタム合成されるか、または（３）オリゴヌクレオチドのＧｉｂｓｏｎ構築を用いてｇＲＮＡクローニングベクターに構築された（プラスミド番号４１８２４）。Ａｄｄｇｅｎｅ社のＥＧＩＰレンチベクターに構築される、終止コドンを有するＧＦＰ配列と適切な断片の融合ＰＣＲ構築によって切断型ＧＦＰを伴うＨＲレポーターアッセイ用のベクターを構築した（プラスミド番号２６７７７）。次にこれらのレンチベクターを使用してＧＦＰレポーター安定株を構築した。この研究で使用されたＴＡＬＥＮは標準的なプロトコルを用いて構築された。ここにその全体が参照により援用されるＳａｎｊａｎａら著、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ誌、第７巻、１７１～１９２頁（２０１２年）を参照されたい。標準的ＰＣＲ融合プロトコルの手法を用いてＣａｓ９ＮとＭＳ２ ＶＰ６４の融合を実施した。ＯＣＴ４およびＲＥＸ１用のプロモータールシフェラーゼコンストラクトはＡｄｄｇｅｎｅ社から入手した（プラスミド番号１７２２１およびプラスミド番号１７２２２）。

［実施例３］
細胞培養および形質移入
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、インビトロジェン）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、インビトロジェン）、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、インビトロジェン）を添加した高グルコース・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン）中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。加湿恒温器中に３７℃および５％のＣＯ_２で細胞を維持した。

ヌクレアーゼアッセイを伴う形質移入は次の通りであった。製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミン２０００を使用して０．４×１０^６個の細胞に２μｇのＣａｓ９プラスミド、２μｇのｇＲＮＡおよび／または２μｇのＤＮＡドナープラスミドを形質移入した。形質移入から３日後に細胞を回収し、ＦＡＣＳによって分析するか、またはゲノム切断の直接的アッセイのためにＤＮＡイージー・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して約１×１０^６個の細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。これらのためにＰＣＲを実施して前記細胞に由来するゲノムＤＮＡを用いてターゲティング領域を増幅し、ＭｉＳｅｑパーソナルシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）により２００，０００リードを超える包括度でアンプリコンをディープシークエンスした。シーケンシングデータを分析してＮＨＥＪ効率を推定した。

転写活性化アッセイを伴う形質移入については、０．４×１０^６個の細胞に（１）２μｇのＣａｓ９Ｎ‐ＶＰ６４プラスミド、２μｇのｇＲＮＡおよび／または０．２５μｇのレポーターコンストラクトを形質移入するか、または（２）２μｇのＣａｓ９Ｎプラスミド、２μｇのＭＳ２－ＶＰ６４、２μｇのｇＲＮＡ－２×ＭＳ２アプタマーおよび／または０．２５μｇのレポーターコンストラクトを形質移入した。形質移入から２４～４８時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光方法を用いてアッセイするか、またはそれらの全ＲＮＡを抽出し、その後にこれらのＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲにより分析した。ここで、ＯＣＴ４とＲＥＸ１についてインビトロジェンの標準的ｔａｑｍａｎプローブを使用し、各試料の正規化をＧＡＰＤＨに対して実施した。

Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体とＴＡＬＥの特異性プロファイルについての転写活性化アッセイを伴う形質移入については、０．４×１０^６個の細胞に（１）２μｇのＣａｓ９Ｎ‐ＶＰ６４プラスミド、２μｇのｇＲＮＡおよび０．２５μｇのレポーターライブラリーを形質移入するか、または（２）２μｇのＴＡＬＥ－ＴＦプラスミドおよび０．２５μｇのレポーターライブラリーを形質移入するか、または（３）２μｇの対照ＴＦプラスミドおよび０．２５μｇのレポーターライブラリーを形質移入した。形質移入から２４時間後に（レポーターの促進が飽和モード状態であることを回避するため）細胞を回収した。ＲＮＡイージー・プラス・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡ抽出を実施し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ－ＩＩＩ（インビトロジェン）を使用して標準的ＲＴ－ｐｃｒを実施した。転写物タグの標的化ｐｃｒ増幅により次世代シーケンシング用のライブラリーを作製した。

［実施例４］
Ｃａｓ９－ＴＦおよびＴＡＬＥ－ＴＦレポーターの発現レベルの計算のための数理分析および配列分析
この処理のための高レベルの論理フローが図８Ａに示されており、その他の詳細がここに提供される。コンストラクトライブラリーの組成の詳細については図８Ａ（第１段）および８Ｂを参照されたい。

シーケンシング：Ｃａｓ９実験についてはコンストラクトライブラリー（図８Ａ、第３段、左）とレポーター遺伝子のｃＤＮＡ配列（図８Ａ、第３段、右）をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で１５０ｂｐの重複性ペアエンドリードとして入手し、ＴＡＬＥ実験については対応する配列をＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上で５１ｂｐの非重複性ペアエンドリードとして入手した。

コンストラクトライブラリー配列の処理：アラインメント：Ｃａｓ９実験について、ｎｏｖｏａｌｉｇｎバージョン２．０７．１７（ワールド・ワイド・ウェッブサイトｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ／ｉｎｄｅｘ／ｐｈｐ）を使用して８ｂｐのライブラリーバーコード対によって挟まれる２３４ｂｐのコンストラクトに対応する一組の２５０ｂｐの基準配列に対してリード対を整列させた（図８Ａ、第３段、左を参照のこと）。ｎｏｖｏａｌｉｇｎに提供された基準配列では２３ｂｐの縮合性Ｃａｓ９結合部位領域と２４ｂｐの縮合性転写物タグ領域（図８Ａ、第１段を参照のこと）をＮと指定し、一方でコンストラクトライブラリーバーコードを明確に規定した。ＴＡＬＥ実験については基準配列の長さが２０３ｂｐであり、縮合性結合部位領域の長さが２３ｂｐに対して１８ｂｐであったことを除いて同じ方法を用いた。有効性検査：生成されたファイルについての、各リード対の左のリードと右のリードをそれぞれ基準配列に対して整列させたＮｏｖｏａｌｉｇｎ出力データ。両方とも基準配列に対してユニークに整列しているリード対のみがその他の有効性条件の対象とされ、これらの条件の全てを通過したリード対のみが保持された。有効性条件には以下のものが含まれる。
（ｉ）２つのコンストラクトライブラリーバーコードの各々が少なくとも４か所の位置で基準配列バーコードと整列しなくてはならず、それら２つのバーコードは同じコンストラクトライブラリーのバーコード対について整列しなくてはならない。
（ｉｉ）基準配列のＮ領域に整列する全ての塩基はｎｏｖｏａｌｉｇｎによってＡ、Ｃ、ＧまたはＴと呼ばれなくてはならない。Ｃａｓ９実験についてもＴＡＬＥ実験についても左のリードと右のリードは基準Ｎ領域で重ならず、これらのＮ塩基のあいまいなｎｏｖｏａｌｉｇｎコールの可能性が生じなかったことに留意されたい。（ｉｉｉ）同様に、これらの領域にはｎｏｖｏａｌｉｇｎによってコールされる挿入または欠失が現れてはならない。（ｉｖ）（これらの無作為配列はＡ、Ｃ、およびＧのみから生じるので）転写物タグ領域にＴが現れてはならない。これらの条件のうちのいずれか１つに違反するリード対を拒絶リード対ファイルに収集した。自作のｐｅｒｌスクリプトを使用してこれらの有効性検査を実施した。

ガイドされた試料レポーター遺伝子ｃＤＮＡ配列の処理：アラインメント：まず（ワールド・ワイド・ウェッブサイトｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｔｊｏｈｎ／ＳｅｑＰｒｅｐからダウンロードされた）ＳｅｑＰｒｅｐを使用して重複するリード対を７９ｂｐの共通セグメントにまで合併し、その後でｎｏｖｏａｌｉｇｎ（上記のバージョン）を使用してこれらの７９ｂｐ共通セグメントを非対合性単一リードとして一組の基準配列に整列させて（図８Ａ、第３段、右を参照のこと）、その中で（コンストラクトライブラリーの配列解析については）２４ｂｐの縮合性転写物タグをＮと指定し、一方で試料バーコードを明確に規定した。ＴＡＬＥ配列領域とＣａｓ９ｃＤＮＡ配列領域の両方が８ｂｐ試料バーコード配列対によって挟まれる同一の６３ｂｐのｃＤＮＡ領域に対応した。有効性検査では（ａ）ここで、それまでのＳｅｑＰｒｅｐによるリード対の合併のため、有効性処理はリード対中の両方のリードのユニークなアラインメントについてフィルターをかける必要が無く、合併したリードのユニークなアラインメントについてのみフィルターをかける必要があること、（ｂ）ｃＤＮＡ配列リードには転写物タグだけが現れるので、有効性処理は基準配列のこれらのタグ領域を適用するだけであり、および別個の結合部位領域に適用されることもないこと、を除き、コンストラクトライブラリーの配列解析に適用したのと同じ条件を適用した（上記参照）。

結合部位と転写物タグの間の関連表の構築：自作のｐｅｒｌを使用して有効性検査されたコンストラクトライブラリー配列からこれらの表を作成した（図８Ａ、第４段、左）。Ａ、Ｃ、およびＧの塩基から構成される２４ｂｐのタグ配列は基本的にコンストラクトライブラリーにわたってユニークであるべきではあるが（共有する確率＝約２．８ｅ－１１）、結合部位とタグの関連の早期分析により、おそらくは主に結合配列中の配列エラーの組合せ、またはコンストラクトライブラリーを作製するために使用されたオリゴの中のオリゴ合成エラーの組合せが原因で実際には無視できない割合のタグ配列が複数の結合配列によって共有されることが明らかになった。タグの共有に加えて、有効性検査されたリード対中の結合部位と関連することが分かったタグは、バーコードミスマッチに起因して、どのコンストラクトライブラリーにそれらのタグが由来し得るのか明確ではない場合にコンストラクトライブラリーリード対拒絶ファイルに見出される可能性もあった。最後に、タグ配列自体が配列エラーを含む可能性があった。これらのエラー原因に対処するため、タグを３つの属性に分類した：（ｉ）安全対不安全：不安全はコンストラクトライブラリー拒絶リード対ファイルに見出され得るタグを意味した；共有対非共有：共有は複数の結合部位配列との関連が分かったタグを意味する；および２＋対１のみ：２＋は有効性検査されたコンストラクトライブラリー配列の中で少なくとも２回現れるタグであって、配列エラーを含む可能性が少ないと考えられるタグを意味する。これらの３つの基準を組み合わせて各結合部位と関連するタグの８つのクラスが生じ、最も保証された（しかし、最も少ない）クラスは安定、非共有、２＋タグのみを含み、最も保証されていない（しかし、最も多い）クラスは安全性、共有制、または発生数に関係なく全てのタグを含む。

正規化発現レベルの計算：自作のｐｅｒｌコードを使用して図８Ａの第５～６段に示されているステップを実施した。まず、コンストラクトライブラリーについて前もって計算した結合部位と転写物タグの間の表を用いて各ガイド試料について得られたタグ数を結合部位ごとに集計した（図８Ｃを参照のこと）。次に各試料について集計された各結合部位のタグ数を陽性対照試料について集計されたタグ数で除算して正規化発現レベルを作成した。これらの計算に関係するその他の考慮事項には以下のものが含まれる。
１．各試料について、結合部位と転写物タグの間の関連表の中に見出すことができない有効性検査されたｃＤＮＡ遺伝子配列の中に「新規」タグの組が見出された。その後の計算ではこれらのタグを無視した。
２．結合部位と転写物タグの間の関連表の中の上記のタグの８クラスの各々について上記のタグ数の集計を実施した。コンストラクトライブラリー中の結合部位は、中心となる配列に類似の配列は頻繁に生成されるが、ミスマッチ数が増えた配列はだんだん稀にしか生成されないようにバイアスがかけられるので、ミスマッチがほとんど無い結合部位が一般に大多数のタグになり、ミスマッチが多い結合部位ほど少数のタグにしかならなかった。したがって、最も保証されたタグのクラスを使用することが一般的には望ましいが、２つ以上のミスマッチを有する結合部位の評価は結合部位当たり少数のタグに基づいたものとなり、それらのタグ自体は信頼できるものであってもその保証された数および比率が統計学的にあまり信頼できないものになる可能性があった。そのような場合、全てのタグを使用した。この考慮事項についてのある補償は、ｎか所のミスマッチ位置について別個に集計されたタグ数の数はミスマッチ位置の組合せ数（

に等しい）と共に増加し、ｎと共に劇的に増加するという事実から通用しており、したがって、様々な数ｎのミスマッチについて集計されたタグ数の平均（図２ｂ、２ｅ、および図９Ａおよび１０Ｂに示される）は２以上のｎについて統計学的に非常に大きな集計されたタグ数の集合に基づいている。
３．最後に、ＴＡＬＥコンストラクトライブラリーに構築された結合部位は１８ｂｐであり、タグとの連関はこれらの１８ｂｐ配列に基づいて指定されるが、幾つかの実験は１８ｂｐのコンストラクト結合部位領域内の中央の１４ｂｐまたは１０ｂｐの領域に結合するように計画されているＴＡＬＥを用いて実施された。これらのＴＡＬＥの発現レベルの計算において、タグを関連表中の１８ｂｐの結合部位の対応する領域に基づいて結合部位について集計し、それによりこの領域の外側にある結合部位のミスマッチを無視した。

［実施例５］
Ｃａｓ９_Ｎ‐ＶＰ６４を用いたＲＮＡ誘導性ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧ制御
本明細書に記載されるｓｇＲＮＡ（アプタマー改変短鎖ガイドＲＮＡ）連結アプローチにより、各ｓｇＲＮＡが異なるＲＮＡ－タンパク質間相互作用対を利用する限り、別個のｓｇＲＮＡにより様々なエフェクタードメインを動員することができ、同一のＣａｓ９Ｎタンパク質を用いて多重遺伝子制御を行うことができる。図１２ＡのＳＯＸ２遺伝子と図１２ＢのＮＡＮＯＧ遺伝子について、転写開始部位の上流の約１ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする１０種類のｇＲＮＡをデザインした。ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている。内在性遺伝子のｑＰＣＲにより転写活性化をアッセイした。両方の例において、個々のｇＲＮＡの導入によって転写が中程度に促進された一方で、複数のｇＲＮＡが相乗的に作用して堅固な複数倍の転写活性化を促進した。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。図１２Ａ～Ｂに示されるように、２種類の追加の遺伝子であるＳＯＸ２とＮＡＮＯＧはプロモーターの上流約１ｋｂ長のＤＮＡ鎖内を標的とするｓｇＲＮＡによって制御された。転写開始部位近傍のそれらのｓｇＲＮＡによって堅固な遺伝子活性化が引き起こされた。

［実施例６］
Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体によるターゲティングのランドスケイプの評価
図２に記載されているアプローチを用いて２種類の追加的Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ複合体（図１３Ａ～Ｃ）と（図１３Ｄ～Ｆ）のターゲティングランドスケイプを分析した。それらの２種類のｇＲＮＡは非常に異なる特異性プロファイルを有し、ｇＲＮＡ２は最大で２～３個のミスマッチを許容し、ｇＲＮＡ３は最大でも１個のミスマッチしか許容しない。これらの態様は１塩基ミスマッチプロット（図１３Ｂ、１３Ｅ）と２塩基ミスマッチプロット（図１３Ｃ、１３Ｆ）の両方に反映されている。図１３Ｃおよび１３Ｆでは正規化発現レベルを計算するには入手できるデータが不充分である塩基ミスマッチ対は「×」を含む灰色のボックスで表されており、一方でデータ表示を改善するため、正規化発現レベルが彩色スケールの一番上を超す外れ値であるミスマッチ対は星印「＊」を含む黄色のボックスで表されている。統計学的有意性の記号は、^＊＊＊がＰ＜０．０００５／ｎであり、^＊＊がＰ＜０．００５／ｎであり、^＊がＰ＜０．０５／ｎであり、およびＮ．Ｓ．（有意性無し）はＰ＞＝０．０５／ｎであり、ｎは比較数である（表２を参照のこと）。

［実施例７］
有効性確認、レポーターアッセイの特異性
図１４Ａ～Ｃに示されるように２種類の異なるｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体を使用して特異性データを作成した。対応する突然変異型ｓｇＲＮＡがレポーターライブラリーを刺激することができなかったので、そのアッセイは評価されるｓｇＲＮＡについて特異的であることを確認した。図１４Ａ：野生型ｇＲＮＡ標的配列に対してデザインされたレポーターライブラリーを使用して２種類のｇＲＮＡ（野生型および突然変異体；配列の差異が赤色で強調されている）の特異性プロファイルを評価した。図１４Ｂ：対応する突然変異型ｇＲＮＡがレポーターライブラリーを刺激することができなかったので、このアッセイは評価されるｇＲＮＡについて特異的であることを確認した（データを図１３Ｄから再プロット）。統計学的有意性の記号は、^＊＊＊がＰ＜０．０００５／ｎであり、^＊＊がＰ＜０．００５／ｎであり、^＊がＰ＜０．０５／ｎであり、およびＮ．Ｓ．（有意性無し）はＰ＞＝０．０５／ｎであり、ｎは比較数である（表２を参照のこと）。異なるｓｇＲＮＡは異なる特異性プロファイルを有することができ（図１３Ａ、１３Ｄ）、具体的には、ｓｇＲＮＡ２は最大で３個のミスマッチを許容し、ｓｇＲＮＡ３は最大でも１個のミスマッチしか許容しない。ミスマッチに対する最も高い感受性は、他の位置にあるミスマッチも活性に影響することが観察されてはいたが、スペーサーの３’末端に局在する。

［実施例８］
有効性確認、１塩基および２塩基ｇＲＮＡミスマッチ
図１５Ａ～Ｄに示されるように、アッセイしたｓｇＲＮＡ中のスペーサーの３’末端の１２ｂｐ内に１塩基のミスマッチがあっても検出可能なターゲティングが生じることが標的化実験により確認された。しかしながら、この領域内の２ｂｐのミスマッチは活性の顕著な喪失を引き起こした。ヌクレアーゼアッセイを用いて２種類の独立したｇＲＮＡであるスペーサー配列内に標的に対する１塩基または２塩基のミスマッチ（赤色で強調）を担持するｇＲＮＡ２（図１５Ａ～Ｂ）とｇＲＮＡ３（図１５Ｃ～Ｄ）を試験した。アッセイしたｇＲＮＡ中のスペーサーの３’末端の１２ｂｐ内に１塩基のミスマッチがあっても検出可能なターゲティングが生じるものの、この領域内の２ｂｐのミスマッチは活性の急速な喪失を引き起こすことが確認された。これらの結果は異なるｇＲＮＡ間の特異性プロファイルの差をさらに強調し、図１３の結果と一致する。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

［実施例９］
有効性確認、５’ｇＲＮＡ短縮
図１６Ａ～Ｄに示されるように、スペーサーの５’部分を短縮してもｓｇＲＮＡ活性が維持された。ヌクレアーゼアッセイを用いて２種類の独立したｇＲＮＡであるスペーサーの５’末端の短縮を有するｇＲＮＡ１（図１６Ａ～Ｂ）とｇＲＮＡ３（図１６Ｃ－Ｄ）を試験した。１～３ｂｐの５’末端短縮はよく許容されるが、それよりも大きい欠失は活性の喪失を引き起こすことが観察された。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

［実施例１０］
有効性確認、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭ
図１７Ａ～Ｂに示されるように、化膿レンサ球菌（Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭはＮＧＧであり、およびまた、ＮＡＧであることがヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイを用いて確認された。データは平均値±ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。追加の調査により、ヒトエクソン内の作製された一組の約１９０ＫのＣａｓ９標的であって、ターゲティング配列の最後の１３ｎｔを共有する代替性ＮＧＧ標的を有しないＣａｓ９標的を、前の１３ｎｔ内にミスマッチを有する代替性ＮＡＧ部位の存在について、またはＮＧＧ部位について走査した。わずかに０．４％のみがそのような代替性標的を有しないことがわかった。

［実施例１１］
有効性確認、ＴＡＬＥ突然変異
１８－ｍｅｒのＴＡＬＥは標的配列中の複数の突然変異を許容することがヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイ（図１８Ａ～Ｂ）を用いて確認された。図１８Ａ～Ｂに示されるように、ヌクレアーゼアッセイにおける標的化実験により測定すると、標的の中央におけるある特定の突然変異によってより高いＴＡＬＥの活性が生じる。

［実施例１２］
ＴＡＬＥモノマーの特異性とＴＡＬＥタンパク質の特異性
個々の反復性可変二残基（ＲＶＤ）の役割を切り離すため、ＲＶＤの選択は塩基特異性に寄与しないが、ＴＡＬＥ特異性は全体としてそのタンパク質の結合エネルギーの関数でもあることを確認した。図１９Ａ～ＣはＴＡＬＥモノマー特異性とＴＡＬＥタンパク質特異性の間の比較を示している。図１９Ａ：図２に記載されるアプローチを改変したものを用い、一連の６ＮＩリピートまたは６ＮＨリピートを有する２種類の１４－ｍｅｒのＴＡＬＥ－ＴＦのターゲティングランドスケイプを分析した。このアプローチでは、中央に縮合性６－ｍｅｒ配列を有するレポーターの縮小型ライブラリーを作成および使用して、ＴＡＬＥ－ＴＦの特異性をアッセイした。図１９Ｂ～Ｃ：両方の例において、予期される標的配列（すなわち、ＮＩリピートについては６個のＡを有し、ＮＨリピートについては６個のＧを有するもの）が濃縮されていることが指摘された。これらのＴＡＬＥの各々はなお中央の６－ｍｅｒ標的配列内に１～２個のミスマッチがあることを許容する。モノマーの選択は塩基特異性に寄与しないが、ＴＡＬＥ特異性は全体としてそのタンパク質の結合エネルギーの関数でもある。一つの態様によると、操作して短くしたＴＡＬＥまたは高親和性モノマーと低親和性モノマーの組成を有するＴＡＬＥはゲノム工学用途においてより高い特異性を生じ、短いＴＡＬＥを使用するとヌクレアーゼ用途においてＦｏｋＩの二量体化が標的外効果のさらなる減少を可能にする。

［実施例１３］
オフセット・ニック形成、天然遺伝子座
図２０Ａ～Ｂはオフセット・ニック形成に関するデータを示している。ゲノム編集の背景ではオフセット・ニックを形成してＤＳＢを生じさせる。大多数のニックは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性インデルを生じることがなく、したがってオフセット・ニックがガイドされるときに標的外単一ニック形成事象がインデルを生じる比率は非常に低い可能性がある。オフセット・ニックを誘導してＤＳＢを生成することは、挿入されたレポーター遺伝子座と天然のＡＡＶＳ１ゲノム座位の両方で遺伝子破壊をガイドするのに有効である。図２０Ａ：２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖を範囲とする８種類のｇＲＮＡであるターゲティングセンスストランドを標的とする４種類（ｓ１～４）とアンチセンスストランドを標的とする４種類（ａｓ１～４）でＡＡＶＳ１遺伝子座のターゲティングを行った。相補ストランドにニックを入れるＣａｓ９Ｄ１０Ａ突然変異体を使用して異なる二通りのｇＲＮＡの組合せを用いて一連の計画的５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを誘導した。図２０Ｂ：単一のｇＲＮＡでは検出可能なＮＨＥＪ事象がガイドされなかったが、オフセット・ニックを誘導してＤＳＢを生成することが遺伝子破壊の誘導に非常に有効であることがサンガーシーケンシング・ベースアッセイを用いて観察された。特に、５’オーバーハングを生じさせるオフセット・ニックは３’オーバーハングと比べてより多くのＮＨＥＪ事象を生じさせる。サンガーシーケンシングクローンの数はバーの上で強調されており、予想されるオーバーハングの長さは対応するｘ軸の凡例の下に示されている。

［実施例１４］
オフセット・ニック形成、ＮＨＥＪプロファイル
図２１Ａ～Ｃはオフセット・ニック形成およびＮＨＥＪプロファイルに関する。３種類の異なるオフセット・ニック形成組合せの代表的なサンガーシーケンシングの結果がボックスにより強調されているターゲティングｇＲＮＡの位置と共に示されている。さらに、相同組換え（ＨＲ）介在性修復の標準モデルと一致して、オフセット・ニックによる５’オーバーハングの作製によって３’オーバーハングよりも堅固なＮＨＥＪ事象がもたらされた（図３Ｂ）。５’オーバーハングを形成するとＮＨＥＪの促進に加えてＨＲの堅固な誘導が観察された。３’オーバーハングの形成はＨＲ率の改善を引き起こさなかった（図３Ｃ）。

［実施例１５］
表１
内在性遺伝子制御のためのｇＲＮＡ標的
Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡ介在性活性化実験において使用されたＲＥＸ１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧのプロモーター中の標的を列記する。

［実施例１６］
表２
Ｃａｓ９‐ｇＲＮＡおよびＴＡＬＥの特異性データの統計学的分析の要約
表２（ａ）特定の数の標的部位突然変異を有する標的配列に結合するＴＡＬＥまたはＣａｓ９－ＶＰ６４活性化因子の正規化発現レベルの比較のＰ値。正規化発現レベルが図カラムに示されている図の中の箱ひげ図によって表されており、箱は標的部位のミスマッチ数毎のこれらの発現レベルの分布状態を表す。各箱ひげ図の中のミスマッチ数の各連続対についてｔ検定を用いてＰ値を計算したが、そのｔ検定は一標本ｔ検定または二標本ｔ検定のどちらかであった（方法を参照のこと）。各箱ひげ図内の比較数に基づくボンフェローニ補正Ｐ値閾値を使用して統計学的有意性を評価した。統計学的有意性の記号は、^＊＊＊がＰ＜０．０００５／ｎであり、^＊＊がＰ＜０．００５／ｎであり、^＊がＰ＜０．０５／ｎであり、およびＮ．Ｓ．（有意性無し）はＰ＞＝０．０５／ｎであり、ここでｎは比較数である。表２（ｂ）図２Ｄ中のシード領域の統計学的特徴解析：２つの突然変異が２０ｂｐの標的部位の３’末端の候補シード領域内の突然変異形成位置対にある標的配列と他の全ての位置対にある標的配列にＣａｓ９Ｎ ＶＰ６４＋ｇＲＮＡが結合したときの発現値の間の分離度を表すｌｏｇ１０（Ｐ値）。最大の－ｌｏｇ１０（Ｐ値）（上で強調されている）によって示されている最大の分離度は標的部位の最後の８～９ｂｐの中に見出される。これらの位置はこの標的部位の「シード」領域の始まりを表すものと解釈してよい。Ｐ値の計算方法の情報については方法のなかの「シード領域の統計学的分析」の節を参照されたい。

［実施例１７］
実施例中のタンパク質とＲＮＡの配列
Ａ． ｍ４突然変異体に基づくＣａｓ９_Ｎ‐ＶＰ６４活性化因子コンストラクトの配列が下に表示されている。最大の活性を示すＣａｓ９_ｍ４ ^ＶＰ６４融合タンパク質形式とＣａｓ９_ｍ４ ^ＶＰ６４Ｎ融合タンパク質形式を有する３種類のバージョンを構築した。ｍ３突然変異体およびｍ２突然変異体（図４Ａ）の対応するベクターも構築した（ＮＬＳドメインとＶＰ６４ドメインが強調されている）。

Ｂ． ＭＳ２活性化因子コンストラクトと２×ＭＳ２アプタマードメインを有する対応するｇＲＮＡバックボーンベクターの配列が下に提供されている（ＮＬＳ、ＶＰ６４、ｇＲＮＡスペーサー、およびＭＳ２結合ＲＮＡステムループドメインが強調されている）。最大の活性を示すＭＳ２_ＶＰ６４Ｎ融合タンパク質形式を有する前者の２種類のバージョンを構築した。

Ｃ． ｄＴｏｍａｔｏ蛍光ベース転写活性化レポーター配列が下に記載されている（ＩＳｃｅＩ対照ＴＦ標的配列、ｇＲＮＡ標的配列、最小ＣＭＶプロモーター配列およびＦＬＡＧタグ＋ｄＴｏｍａｔｏ配列が強調されている）。

Ｄ． ＴＡＬＥおよびＣａｓ９－ｇＲＮＡの特異性アッセイに使用されるレポーターライブラリーの全般的形式が下に提供されている（ＩＳｃｅＩ対照ＴＦ標的配列、ｇＲＮＡ／ＴＡＬＥ標的部位配列（ｇＲＮＡについては２３ｂｐ、およびＴＡＬＥについては１８ｂｐ）、最小ＣＭＶプロモーター配列、ＲＮＡバーコード配列、およびｄＴｏｍａｔｏ配列が強調されている）。

本発明の態様は以下を含む。
付記１
標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し且つ前記１種類以上のＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ欠損（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｎｕｌｌ）Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、
転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類以上のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが発現し、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記ＤＮＡに共局在し、前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する、
細胞において標的核酸の発現を制御する方法。
付記２
ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記外来核酸が、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする、付記１に記載の方法。
付記３
１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸が、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、
前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、付記１に記載の方法。
付記４
前記細胞が真核細胞である、付記１に記載の方法。
付記５
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記１に記載の方法。
付記６
前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドである、付記１に記載の方法。
付記７
前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである、付記１に記載の方法。
付記８
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、付記１に記載の方法。
付記９
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を上方制御する、付記１に記載の方法。
付記１０
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する、付記１に記載の方法。
付記１１
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記１に記載の方法。
付記１２
前記１種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記１に記載の方法。
付記１３
前記１種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記１に記載の方法。
付記１４
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記１に記載の方法。
付記１５
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせる、
細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法。
付記１６
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在する、付記１５に記載の方法。
付記１７
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在して相同組換えを引き起こす、付記１５に記載の方法。
付記１８
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在する、付記１５に記載の方法。
付記１９
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して二本鎖切断を生じさせる、付記１５に記載の方法。
付記２０
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす、付記１５に記載の方法。
付記２１
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれている、付記１５に記載の方法。
付記２２
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせる、付記１５に記載の方法。
付記２３
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす、付記１５に記載の方法。
付記２４
ドナー核酸配列をコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記２つ以上のニックにより前記標的核酸の前記ドナー核酸配列との相同組換えが引き起こされる、付記１５に記載の方法。
付記２５
標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、
ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２外来核酸、および
転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を含み、
前記１種類以上のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、前記標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、細胞。
付記２６
ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする前記外来核酸が、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする、付記２５に記載の細胞。
付記２７
１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸がＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、
前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、付記２５に記載の細胞。
付記２８
前記細胞が真核細胞である、付記２５に記載の細胞。
付記２９
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記２５に記載の細胞。
付記３０
前記ＲＮＡが約１０個～約５００個のヌクレオチドを含む、付記２５に記載の細胞。
付記３１
前記ＲＮＡが約２０個～約１００個のヌクレオチドを含む、付記２５に記載の細胞。
付記３２
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、付記２５に記載の細胞。
付記３３
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を上方制御する、付記２５に記載の細胞。
付記３４
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する、付記２５に記載の細胞。
付記３５
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記２５に記載の細胞。
付記３６
前記１種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記２５に記載の細胞。
付記３７
前記１種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記２５に記載の細胞。
付記３８
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記２５に記載の細胞。
付記３９
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、および
１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有する少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが、前記ＤＮＡ標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、細胞。
付記４０
前記細胞が真核細胞である、付記３９に記載の細胞。
付記４１
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記３９に記載の細胞。
付記４２
前記ＲＮＡが約１０個～約５００個のヌクレオチドを含む、付記３９に記載の細胞。
付記４３
前記ＲＮＡが約２０個～約１００個のヌクレオチドを含む、付記３９に記載の細胞。
付記４４
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記３９に記載の細胞。
付記４５
前記２種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記３９に記載の細胞。
付記４６
前記２種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記３９に記載の細胞。
付記４７
前記ＤＮＡ標的核酸がゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記３９に記載の細胞。
付記４８
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
１つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせ、
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法。
付記４９
標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、
転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが発現し、前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記ＤＮＡに共局在し、且つ、前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する、細胞において標的核酸の発現を制御する方法。
付記５０
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸が、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする、付記４９に記載の方法。
付記５１
１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸がＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、
前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、付記４９に記載の方法。
付記５２
前記細胞が真核細胞である、付記４９に記載の方法。
付記５３
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記４９に記載の方法。
付記５４
前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドである、付記４９に記載の方法。
付記５５
前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドである、付記４９に記載の方法。
付記５６
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、付記４９に記載の方法。
付記５７
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を上方制御する、付記４９に記載の方法。
付記５８
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する、付記４９に記載の方法。
付記５９
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記４９に記載の方法。
付記６０
前記１種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記４９に記載の方法。
付記６１
前記１種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記４９に記載の方法。
付記６２
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記４９に記載の方法。
付記６３
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせる、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法。
付記６４
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在する、付記６３に記載の方法。
付記６５
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在して相同組換えを引き起こす、付記６３に記載の方法。
付記６６
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在する、付記６３に記載の方法。
付記６７
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して二本鎖切断を生じさせる、付記６３に記載の方法。
付記６８
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす、付記６３に記載の方法。
付記６９
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれている、付記６３に記載の方法。
付記７０
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせる、付記６３に記載の方法。
付記７１
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ、その位置が互いにずれており、且つ、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす、付記６３に記載の方法。
付記７２
ドナー核酸配列をコードする第３外来核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記２つ以上のニックにより前記標的核酸の前記ドナー核酸配列との相同組換えが引き起こされる、付記６３に記載の方法。
付記７３
標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２外来核酸、および
転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする第３外来核酸を含み、
前記１種類以上のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、前記標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、細胞。
付記７４
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸が、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御因子タンパク質またはドメインをさらにコードする、付記７３に記載の細胞。
付記７５
１種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸がＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、
前記転写制御因子タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御因子タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、付記７３に記載の細胞。
付記７６
前記細胞が真核細胞である、付記７３に記載の細胞。
付記７７
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記７３に記載の細胞。
付記７８
前記ＲＮＡが約１０個～約５００個のヌクレオチドを含む、付記７３に記載の細胞。
付記７９
前記ＲＮＡが約２０個～約１００個のヌクレオチドを含む、付記７３に記載の細胞。
付記８０
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、付記７３に記載の細胞。
付記８１
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を上方制御する、付記７３に記載の細胞。
付記８２
前記転写制御因子タンパク質またはドメインが、疾患または有害な健康状態を治療するために前記標的核酸の発現を上方制御する、付記７３に記載の細胞。
付記８３
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記７３に記載の細胞。
付記８４
前記１種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記７３に記載の細胞。
付記８５
前記１種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記７３に記載の細胞。
付記８６
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記７３に記載の細胞。
付記８７
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸、および
少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが、前記ＤＮＡ標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、細胞。
付記８８
前記細胞が真核細胞である、付記８７に記載の細胞。
付記８９
前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、付記８７に記載の細胞。
付記９０
前記ＲＮＡが約１０個～約５００個のヌクレオチドを含む、付記８７に記載の細胞。
付記９１
前記ＲＮＡが約２０個～約１００個のヌクレオチドを含む、付記８７に記載の細胞。
付記９２
前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、付記８７に記載の細胞。
付記９３
前記２種類以上のＲＮＡがガイドＲＮＡである、付記８７に記載の細胞。
付記９４
前記２種類以上のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ‐ｃｒＲＮＡ融合体である、付記８７に記載の細胞。
付記９５
前記ＤＮＡ標的核酸がゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、付記８７に記載の細胞。
付記９６
それぞれがＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、
少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡ及び前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の隣接するニックを生じさせ、
前記２つ以上の隣接するニックが二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる、細胞内でＤＮＡ標的核酸を改変させる方法。
付記９７
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質である、付記４９に記載の方法。
付記９８
前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼである、付記６３に記載の方法。
付記９９
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質である、付記７３に記載の細胞。
付記１００
前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼである、付記８７に記載の細胞。
付記１０１
前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼである、付記９６に記載の方法。
付記１０２
１塩基～４塩基の５’短縮を有するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ。
付記１０３
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６４個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０４
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６５個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０５
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６６個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０６
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６７個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０７
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６８個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０８
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約６９個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１０９
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約７０個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１１０
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約８０個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１１１
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約９０個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。
付記１１２
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合転写物であって、前記ｔｒａｃｒＲＮＡが約１００個～約５００個の核酸を含むガイドＲＮＡ。

Claims (14)

1. 細胞内で二本鎖ＤＮＡ標的核酸を改変させる方法（ただし、前記改変がヒトの体内で行われる場合を除く）であって、
   ３ペア以上のガイドＲＮＡをコードする第１外来核酸を細胞に導入すること、ここで各ペアにおけるそれぞれのガイドＲＮＡは前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的であり、前記隣り合う部位は、前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸の互いに反対のストランド上に位置する２つの部位であって、その位置が互いにずれているものの二本鎖切断を生じ得る２つの部位を含む、および
   １つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し且つ前記３ペア以上のガイドＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸を前記細胞に導入すること、
   を含み、
   前記３ペア以上のガイドＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、前記３ペア以上のガイドＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて、同一の二本鎖ＤＮＡ標的核酸中に３つ以上の二本鎖切断を生じさせ断片化された二本鎖ＤＮＡ標的核酸の欠失を引き起こす３ペア以上のオフセットニックを生じさせ、それにより前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸の発現が阻害される、
   前記方法。
2. 前記同一の二本鎖ＤＮＡ標的核酸中の前記３つ以上の二本鎖切断が断片化された二本鎖ＤＮＡ標的核酸の欠失および非相同末端結合を引き起こす、請求項１に記載の方法。
3. ドナー核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記３ペア以上のオフセットニックは前記同一の二本鎖ＤＮＡ標的核酸中に３つ以上の二本鎖切断を生じさせ、断片化された二本鎖ＤＮＡ標的核酸の欠失、および相同組換えを用いるオフセットニックでの前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸中への前記ドナー核酸の挿入が引き起こされる、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
7. 前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸がゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
8. 前記ガイドＲＮＡは１００個～５００個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
9. ３ペア以上のガイドＲＮＡをコードする第１外来核酸、ここで各ペアにおけるそれぞれのガイドＲＮＡは二本鎖ＤＮＡ標的核酸中の隣り合う部位に相補的であり、前記隣り合う部位は、前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸の互いに反対のストランド上に位置する２つの部位であって、その位置が互いにずれているものの二本鎖切断を生じ得る２つの部位を含む、および
   １つの不活性型ヌクレアーゼドメインを有し且つ前記３ペア以上のガイドＲＮＡによってガイドされる少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２外来核酸、
   を含み、
   前記各ガイドＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼに含まれるＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが、前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、細胞。
10. 前記細胞が真核細胞である、請求項９に記載の細胞。
11. 前記細胞が酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項９に記載の細胞。
12. 前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である、請求項９に記載の細胞。
13. 前記二本鎖ＤＮＡ標的核酸がゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項９に記載の細胞。
14. 前記ガイドＲＮＡは１００個～５００個のヌクレオチドを含む、請求項９に記載の細胞。

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