KR102523466B1 - 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
지배적인 gRNA 분자가 Cas9 분자 또는 Cas9 분자/gRNA 복합체를 표적화하기 위해, 선택적으로 불활성화하기 위해 사용되는 경우, 표적 핵산에 대해 페이로드를 표적화하거나 또는 표적 핵산을 편집함에 있어서 유용한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2013년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 특허 제61/901,215호의 이익을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 표적 핵산 서열의 편집 또는 표적 핵산 서열에 대한 페이로드(payload)의 전달을 위한 CRISPR-관련 방법 및 구성성분에 관한 것이다.
CRISPR(무리 지어진 규칙적 공간 사이의 짧은 회문구조 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat))는 바이러스 공격을 방어하기 위한 적응성 면역계로서 박테리아에서 진화하였다. 바이러스에 노출 시, 바이러스 DNA의 짧은 세그먼트는 CRISPR 좌위 내로 통합된다. RNA는 바이러스 서열을 포함하는, CRISPR 좌위의 일부로부터 전사된다. 바이러스 게놈에 상보적인 서열을 함유하는 해당 RNA는 바이러스 게놈 내 표적 서열에 대해 Cas9 단백질의 표적화를 매개한다. Cas9 단백질은 절단되고, 이에 의해 바이러스 표적을 침묵시킨다.
최근에, CRISPR/Cas 시스템은 진핵세포 내 게놈 편집에 적합화되었다. 부위-특이적 이중 가닥 파손(double strand break: DSB)의 도입은 두 내인성 DNA 수선 메커니즘 중 하나 - 비-상동성 말단-결합(non-homologous end-joining: NHEJ) 또는 상동성 지향 수선(homology-directed repair: HDR) 중 하나 - 를 통해 표적 서열의 변경을 가능하게 한다. CRISPR/Cas 시스템은 또한 표적 서열을 변경시키는 일 없이 전사 억제 및 활성화를 포함하는 유전자 조절을 위해 사용되었다. CRISPR/Cas 시스템에 기반한 표적화된 유전자 조절은 효소적으로 불활성인 Cas9(촉매적으로 사멸된 Cas9로도 알려짐)를 사용한다.
진핵 세포에서 게놈 편집을 위한 CRISPR/Cas 시스템을 적응시키는 최근의 진보에도 불구하고, 진핵 세포에서 사용하기 위한 이들 시스템의 개선된 조절 및 제어에 대한 필요가 남아있다.
본 명세서에서 표적 DNA 내 특이적 위치를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물, 예를 들어, gRNA 분자와 복합체화된 Cas9 분자가 개시된다. 개시된 방법 및 조성물에서 사용되는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체에 따라서, 표적 핵산의 특이적 편집, 또는 페이로드의 전달이 달성될 수 있다.
Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA를 사용 또는 포함하는 방법 및 조성물은 추가로 "지배적인 gRNA 분자"를 사용 또는 포함할 수 있다. 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 시스템의 구성성분을 불활성화 또는 침묵시키기 위해 Cas9 분자와 복합체화할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 지배적인 gRNA 분자로서 지칭되는 gRNA 분자를 특징으로 하며, Cas9 시스템의 구성성분을 표적화하는 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 (1) Cas9 분자를 암호화하는 핵산(즉, Cas9-표적화 gRNA 분자), (2) gRNA 분자를 암호화하는 핵산(즉, gRNA-표적화 gRNA 분자), 또는 (3) 표적을 벗어난 절단을 최소화하기 위해 세포 내 다른 핵산 서열에 대해 최소 상동성을 지니도록 설계된 Cas9 구성성분 내로 공학처리된 핵산 서열(즉, 공학처리된(engineered) 제어 서열-표적화 gRNA 분자)을 표적화하고, 침묵시킨다.
지배적인 gRNA에 대한 표적화 서열은 Cas9 시스템의 조절 또는 제어를 증가시키도록 그리고/또는 시스템의 표적을 벗어난 효과를 감소 또는 최소화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 지배적인 gRNA는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화(예를 들어, 절단)함으로써 바람직하지 않은 절단, 예를 들어, Cas9의 표적 핵산 또는 표적을 벗어난 절단의 Cas9 매개 변경 후의 "재절단"을 최소화할 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 발현 또는 활성 수준에 대해 일시적 또는 다른 제한(들)을 가한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA는 표적을 벗어난 또는 다른 원치않는 활성을 감소시킨다.
지배적인 gRNA에 대한 표적 서열은 Cas9 암호화 서열의 제어 또는 암호화 영역 내에 배치될 수 있다. 이는 Cas9 서열 또는 비 Cas9 서열, 예를 들어, 감소 또는 최소화된 표적을 벗어난 효과에 대해 선택되거나 또는 감소 또는 최소화된 표적을 벗어난 효과를 초래하는 서열일 수 있다. 침묵 또는 불활성화는 표적화된 핵산 서열을 절단시킴으로써 또는 표적화된 핵산 서열에 Cas9 분자/지배적인 gRNA 분자 복합체를 결합시킴으로써 달성될 수 있다.
양태에서, 본 개시내용은 Cas9 분자를 표적화하고, 선택적으로 불활성화하는 gRNA 분자를 특징으로 한다. 구현예에서, gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열을 표적화한다. 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 서열은, Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 비번역 서열을 포함하는 Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 또는 비전사 서열을 포함하는 Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자는 eaCas9 분자이다. 다른 구현예에서, Cas9 분자는 eiCas9 분자이다.
구현예에서, gRNA는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열을 표적화하고;
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
핵산 서열의 비암호화 서열을 표적화하고;
핵산 서열의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
핵산 서열의 비번역 서열을 표적화하고;
핵산 서열의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
Cas9 분자-아미노산 암호화 영역의 핵산 서열 5'을 표적화하고;
Cas9 분자-암호화 영역의 핵산 서열 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 Cas9 분자-암호화 영역의 Cas9 분자-매개 절단 사건 5'을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
Cas9 분자-암호화 영역의 Cas9 분자 3'를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하고;
Cas9 분자-암호화 영역의 핵산 서열 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 Cas9 분자-암호화 영역의 Cas9 분자-매개 절단 사건 3'을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는:
핵산 서열의 프로모터 영역을 표적화하고,
핵산 서열의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하되,
상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결된다.
구현예에서, gRNA 분자는:
핵산 서열의 Cas9 분자 인트론 서열을 표적화하고;
핵산 서열의 Cas9 분자 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성되거나; 또는
핵산 서열의 Cas9 분자 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자이다. 다른 구현예에서, Cas9 분자는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자이다.
구현예에서, gRNA 분자는 표 E1-E6으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, gRNA 분자는 표 E7-E12로부터 선택된다.
구현예에서, gRNA는 키메라 gRNA이다. 다른 구현예에서, gRNA는 모듈(modular) gRNA이다.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 음성으로 조절될 Cas9 시스템 구성성분에 대해 암호화 서열, 또는 제어 영역, 예를 들어, 프로모터를 표적화한다. 예를 들어, gRNA는 Cas9 암호화 서열의 발현을 조절하는 Cas9에 대한 암호화 서열, 또는 제어 영역, 예를 들어, 프로모터를 표적화할 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자, 또는 그것을 암호화하는 핵산은, 예를 들어, Cas9 분자 또는 그것을 암호화하는 핵산보다 이후에 별도로 도입된다. 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터는 Cas9 및 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있고, 제2 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터는 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 제2 벡터는 제1 벡터 다음에 도입될 수 있다. 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자, 또는 그것을 암호화하는 핵산은, 예를 들어, Cas9 분자 또는 그것을 암호화하는 핵산과 함께, 예를 들어, 동시에 또는 동일한 벡터 내에서, 그러나, 예를 들어, 후기에 활성화되는 전사 제어 구성요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 하에서, 일정 시간 후에 Cas9의 전사가 침묵되도록, 도입될 수 있다. 구현예에서, 전사 제어 구성요소는 본질적으로 활성화된다. 구현예에서, 전사 구성요소는 외부 트리거(trigger)의 도입을 통해 활성화된다.
양태에서, 본 개시내용은 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 특징으로 한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자를 포함한다. 구현예에서, 핵산은 본 명세서에 기재된 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산은 정제된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 AAV 벡터를 특징으로 한다:
a) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9 분자-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA 분자-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
b) Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 gRNA 분자-표적화 gRNA 분자를 포함한다.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자를 포함하고, Cas9 분자-표적화 gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열을 표적화한다.
구현예에서, Cas9 분자는 eaCas9 분자이다. 다른 구현예에서, Cas9 분자는 eiCas9 분자이다.
구현예에서, gRNA 분자는 제2 핵산 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, gRNA 분자는 제2 핵산 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함한다. 구현예에서, gRNA 분자는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자이고, 제2 핵산 서열을 표적화한다.
구현예에서, 핵산은 정제된다.
구현예에서, 구성성분 a)와 구성성분 b)는 동일한 핵산, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, 동일한 AAV 벡터 상에서 제공된다. 다른 구현예에서, 구성성분 a)와 구성성분 b)는 상이한 핵산, 예를 들어, 상이한 벡터, 예를 들어, 상이한 바이러스 벡터, 예를 들어, 상이한 AAV 벡터 상에서 제공된다.
구현예에서, 핵산은 상기 핵산으로부터 전사된 Cas9 분자-표적화 gRNA가 상기 핵산으로부터 생성된 Cas9 분자와 복합체를 형성하도록 구성된다.
구현예에서, 상기 복합체는, 예를 들어, 상기 Cas9 분자 서열을 포함하거나 또는 암호화하는 핵산 서열을 절단함으로써 불활성화 또는 침묵시킬 수 있다. 구현예에서, 불활성화는 절단을 포함한다.
구현예에서, 상기 제1 핵산 서열은 제1 제어 영역, 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 있고, 상기 제2 핵산 서열은 제2 제어 영역, 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 있으며, 상기 제1 제어 영역과 제2 제어 영역, 예를 들어, 프로모터는 상이하고, 예를 들어, 하나는 구성적 프로모터이며, 하나는 유도성 프로모터이다. 구현예에서, 제1 제어 영역 및 제2 제어 영역 중 하나는 구성적 프로모터이고, 하나는 유도성 프로모터이다.
구현예에서, 상기 제1 핵산 서열 및 상기 제2 핵산 서열은 차별적으로 발현되거나(예를 들어, 발현 수준에 관해 차별적으로 발현됨) 또는 일시적으로 발현된다(예를 들어, 제1 서열은 상기 제2 서열보다 이후에 발현되거나, 또는 제1 서열은 상기 제2 서열보다 더 저수준에서 발현됨).
구현예에서, 핵산은:
c) 표적 핵산과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어, 제2 gRNA 분자를 암호화하는 제3 핵산 서열을 더 포함하되, 예를 들어, 상기 제2 gRNA는 b)를 표적화하지 않는다.
구현예에서, 표적 핵산은 본 명세서에, 예를 들어,
본 명세서의, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII, 21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에서, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 서열로 개시되어 있다.
구현예에서, 상기 제1 핵산 서열은 제1 제어 영역, 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 있으며,
상기 제2 핵산 서열은 상기 제2 제어 영역, 예를 들어, 프로모터, 또는 제3 제어 영역, 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 있고,
상기 제3 핵산 서열은 상기 제2 제어 영역, 예를 들어, 프로모터, 또는 상기 제3 제어 영역, 예를 들어, 프로모터의 제어 하에 있으며,
상기 제1 제어 영역, 예를 들어, 프로모터는 상기 제2 제어 영역 및/또는 상기 제3 제어 영역, 예를 들어, 프로모터와 상이하다.
구현예에서, 상기 제1 핵산 서열과 상기 제3 핵산 서열은 차별적으로 발현되거나(예를 들어, 발현 수준에 대해 차별적으로 발현됨) 또는 일시적으로 발현된다(예를 들어, 제1 서열은 상기 제3 서열보다 이후에 발현되거나, 또는 제1 서열은 상기 제3 서열보다 더 저수준에서 발혐됨).
구현예에서, 핵산은, 예를 들어, 하나 이상의 지배적인 gRNA에 의해 인식되는 5' 및 3' 측접 영역 서열을 갖는 주형 핵산(본 명세서에서 스왑(swap) 핵산 서열과 상호호환적으로 지칭됨)을 추가로 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자 서열 또는 gRNA 분자 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 지배적인 gRNA에 의해 표적화됨)을 포함하거나 또는 암호화하는 핵산 서열은, 예를 들어, 상동성 재조합을 위한 도너(donor) DNA로서 Cas9 분자 서열 또는 gRNA 분자 서열을 포함하거나 또는 암호화하는 핵산 서열로부터, 예를 들어, 절단 또는 절제된 후에(예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 의함), 주형 핵산으로서 사용될 수 있는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 구현예에서, 제1 지배적인 gRNA 분자는 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 5' 영역을 표적화하고, 제2 지배적인 gRNA 분자는 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 3' 영역을 표적화한다. 예를 들어, 적어도 2 개의(예를 들어, 2, 3, 4, 5 개 이상의) 지배적인 gRNA는 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4 개 이상의) 주형 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 단일 지배적인 gRNA 분자는 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 5'과 3' 영역을 둘 다 표적화한다. 예를 들어, 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 5' 영역(예를 들어, 지배적인 gRNA 분자에 의해 표적화됨)은 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열의 3' 영역(예를 들어, 지배적인 gRNA 분자에 의해 표적화됨)과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 구현예에서, 주형 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열은 벡터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터 내에 있다. 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터이다.
양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 특징으로 한다. 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
양태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다:
a) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 핵산.
구현예에서, 상기 조성물은 하기 중 하나 이상(예를 들어, 2 또는 모두)을 포함한다:
b) Cas9 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 분자, 또는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 핵산 서열;
c) 제2 gRNA 분자 또는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산; 또는
d) 주형 핵산.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자를 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자-표적화 gRNA는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자를 포함한다.
구현예에서, gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하도록 구성된다.
구현예에서, 조성물은 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자 및 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 Cas9 분자-표적화 gRNA 분자 및 Cas9 분자를 포함한다.
구현예에서, 조성물은,
c) 제2 gRNA 분자 또는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
구현예에서, 제2 gRNA는 표적 핵산에 대해 Cas9 분자를 표적화한다.
구현예에서, 조성물은,
d) 주형 핵산을 추가로 포함한다.
구현예에서, 조성물은 제2 gRNA 또는 제2 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 제2 gRNA에 의해 위치되는 파손의 수선을 매개하도록 구성된다.
구현예에서, 각각의 a), b), c) 및 d)는 핵산으로서 제공되고, 동일한 핵산 분자 상에서 암호화된다. 구현예에서, a), b), c) 및 d)로부터 선택된 제1 서열은 제1 핵산 분자 상에서 암호화되고, a), b), c) 및 d)로부터 선택된 제2 서열은 제2 핵산 분자 상에서 암호화된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 예를 들어, 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 AAV 벡터는 하기를 포함할 수 있다:
a) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
b) Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열.
구현예에서, 상기 핵산은 AAV 벡터를 포함한다.
양태에서, 본 개시내용은 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자, 및
a) Cas9 분자,
b) 제2 Cas9 분자,
c) gRNA 분자, 및
d) 제2 gRNA 분자
중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, DNA를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 존재하는 각각의 a), b), c) 및 d)는 동일한 핵산 분자 상에서 암호화된다. 구현예에서, a, b, c 및 d로부터 선택된 제1 서열은 제1 핵산 분자 상에서 암호화되고, a, b, c 및 d로부터 선택된 제2 서열은 제2 핵산 분자 상에서 암호화된다. 구현예에서, 상기 핵산은 a와 c; a, c와 d; 또는 a, b, c와 d를 암호화한다.
양태에서, 본 개시내용은
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 약제학적 제제(preparation)를 특징으로 한다.
양태에서, 본 개시내용은
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 세포를 특징으로 한다.
구현예에서, 세포는,
Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열(여기서, Cas9 분자를 암호화하는 서열은 Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 비번역 서열을 포함하는 Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 및 비전사 서열을 포함하는 Cas9 분자의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있음); 및
지배적인 gRNA 분자를 포함한다.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열을 표적화하는 gRNA 분자를 포함한다. 구현예에서, gRNA 분자는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자이다.
구현예에서, 세포는 Cas9 분자를 추가로 포함한다..
구현예에서, 세포는 제2 gRNA 분자 또는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 제2 gRNA는 표적 핵산에 대해 Cas9 분자를 표적화한다.
구현예에서, 세포는 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 제2 gRNA 분자에 의해 위치된 표적 핵산 내의 파손의 수선을 매개하도록 구성된다.
구현예에서, 세포는 Cas9 분자의 제2 gRNA 분자 매개 표적화에 의해 절단된 표적 핵산을 포함한다.
구현예에서, 세포는 절단 및 수선된 표적 핵산을 포함한다. 구현예에서, 수선은 주형 핵산 매개 수선을 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열은 절단되지 않았다. 구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열은 Cas9 분자를 발현시킬 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 서열은 Cas9 분자의 gRNA 매개 표적화에 의해 절단되었다. 구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 절단된 핵산 서열은 절단되지 않은 동일한 분자에 비해, Cas9 분자를 발현시키는 능력이 감소되었다. 구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 절단된 핵산 서열은 Cas9 분자를 실질적으로 발현시킬 수 없다.
구현예에서, 세포는,
Cas9 분자를 암호화하는 절단된 핵산 서열; 또는
수선된 Cas9 분자-매개 절단 사건을 갖는 표적 핵산 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
구현예에서, 세포는 척추동물, 포유류, 설치류, 염소, 돼지, 조류, 닭, 칠면조, 소, 말, 양, 어류, 영장류 또는 인간 세포이다.
다른 구현예에서, 세포는 식물 세포이다. 구현예에서, 식물 세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다.
구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포, 또는 태아 세포이다. 구현예에서, 세포는 접합, 배반포 또는 배아 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포이다.
양태에서, 본 개시내용은 상기 세포를 본 명세서에 기재된 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 표적 핵산의 구조, 예를 들어, 서열을, 예를 들어, 변경시키는, 세포의 변경 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 상기 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 AAV 벡터는 하기를 포함할 수 있다:
a) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
b) Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열.
구현예에서, 세포는 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 부문 VIIA에서 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 또는 감수 분열 적격 세포이다. 구현예에서, 표적 핵산은 염색체 핵산이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 세포를 유효량의
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물과
접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 표적 핵산의 구조, 예를 들어, 서열을, 예를 들어, 변경시키는, 세포의 변경 방법을 특징으로 한다.
구현예에서, 세포는 척추동물, 포유류, 설치류, 염소, 돼지, 조류, 닭, 칠면조, 소, 말, 양, 어류, 영장류 또는 인간 세포이다.
다른 구현예에서, 세포는 식물 세포이다. 구현예에서, 식물 세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다.
구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포 또는 태아 세포이다. 구현예에서, 세포는 접합, 배반포 또는 배아 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포이다.
구현예에서, 대상체는 포유류, 영장류 또는 인간이다.
구현예에서, 표적 핵산은 염색체 핵산이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어, 표적 핵산의 구조를 변경시킴으로써, 예를 들어, 서열을 변경시킴으로써, 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 AAV 벡터는 하기를 포함할 수 있다:
a) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 제1 핵산 서열; 및
b) Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 암호화하는 제2 핵산 서열.
구현예에서, 대상체는 포유류, 영장류 또는 인간이다. 구현예에서, 표적 핵산은 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIA에 기재된 세포의 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 또는 감수 분열 적격 세포의 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 염색체 핵산이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 세포 또는 대상체를 유효량의
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물의 핵산과
접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 세포 내에서 표적 핵산의 구조를 변경시킴으로써, 예를 들어, 서열을 변경시킴으로써 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다.
구현예에서, 세포는 척추동물, 포유류, 설치류, 염소, 돼지, 조류, 닭, 칠면조, 소, 말, 양, 어류, 영장류 또는 인간 세포이다.
다른 구현예에서, 세포는 식물 세포이다. 구현예에서, 식물 세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다.
구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포 또는 태아 세포이다. 구현예에서, 세포는 접합, 배반포 또는 배아 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포이다.
구현예에서, 대상체는 포유류, 영장류 또는 인간이다.
구현예에서, 표적 핵산은 염색체 핵산이다.
양태에서, 본 개시내용은 세포 및
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 반응 혼합물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 조성물 및 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포를 포함하는 반응 혼합물을 특징으로 한다.
양태에서, 본 개시내용은
본 명세서에 기재된 gRNA 분자;
본 명세서에 기재된 핵산;
본 명세서에 기재된 벡터; 또는
본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 키트를 특징으로 한다.
구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 방법에서 상기 gRNA 분자, 핵산, 벡터 또는 조성물을 이용하기 위한 설명서를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 지배적인 gRNA 분자를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 조성물은 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 추가로 포함한다. 구현예에서, 상기 Cas9 분자는 eaCas9 분자이다. 구현예에서, 상기 Cas9 분자는 eiCas9 분자이다.
구현예에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 표적 핵산으로부터의 표적 서열, 예를 들어, 본 명세서의, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 서열과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 gRNA 분자를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 조성물은 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자를 추가로 포함한다. 구현예에서, 상기 Cas9 분자는 eaCas9 분자이다. 다른 구현예에서, 상기 Cas9 분자는 eiCas9 분자이다.
구현예에서, 상기 조성물은 페이로드, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VI에서, 예를 들어, 표 VI-1, VI-2, VI-3, VI-4, VI-5 또는 VI-6에 기재된 페이로드를 포함한다.
구현예에서, 상기 페이로드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 후생적 변형유전자(epigenetic modifier), 예를 들어, DNA 또는 염색질을 변형시키는 분자; 구성성분, 예를 들어, 히스톤을 변형시키는 분자, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VI에서 기재된 후생적 변형유전자; 전사 인자, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VI에서 기재된 전사 인자; 전사 활성제 도메인; 전사 인자의 저해제, 예를 들어, 항전사 인자 항체 또는 다른 저해제; 소분자; 항체; 효소; DNA와 상호작용하는 효소, 예를 들어, 헬리카제, 제한 효소, 리가제 또는 중합효소; 및/또는 핵산, 예를 들어, 효소적으로 활성인 핵산, 예를 들어, 리보자임, 또는 mRNA, siRNA를 포함한다. 구현예에서, 조성물은 Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9, 분자를 추가로 포함한다.
구현예에서, 상기 페이로드는 Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자에 대해, 예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 구현예에서, 상기 페이로드는 링커에 의해 상기 Cas9 분자에 결합된다. 구현예에서, 상기 링커는 생리적 조건(예를 들어, 핵) 하에 절단가능한 결합이거나 또는 이를 포함한다. 구현예에서, 상기 링커는 본 명세서에서, 예를 들어, 부문 XI에서 기재된 결합이거나 또는 이를 포함한다. 구현예에서, 상기 링커는 에스테르 결합이거나 또는 에스테르 결합을 포함한다. 구현예에서, 상기 페이로드는 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자에 융합된 융합 파트너를 포함한다.
구현예에서, 상기 페이로드는 gRNA 분자에 대해, 예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 구현예에서, 상기 페이로드는 링커에 의해 상기 gRNA 분자에 결합된다. 구현예에서, 상기 링커는 생리적(예를 들어, 핵) 조건 하에서 절단가능한 결합이거나 또는 이를 포함한다. 구현예에서, 상기 링커는 본 명세서에서, 예를 들어, 부문 XI에서 기재된 결합이거나 또는 이를 포함한다. 구현예에서, 상기 링커는 에스테르 결합이거나, 또는 에스테르 결합을 포함한다.
구현예에서, 조성물은 eaCas9 분자를 포함한다. 구현예에서, 조성물은 표적 핵산 내에서 이중 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자를 포함한다.
구현예에서, 조성물은 표적 핵산 내에서 단일 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자를 포함한다. 구현예에서, 상기 단일 가닥 파손은 표적 핵산의 상보적 가닥 내에서 형성된다. 구현예에서, 상기 단일 가닥 파손은 표적 핵산의 상보적 가닥이 아닌 가닥 내에서 형성된다.
구현예에서, 조성물은 HNH-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, N-말단의 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 갖지 않거나, 또는 상당하게 갖지 않는다. 구현예에서, 조성물은 N-말단의 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, HNH-유사 도메인 절단 활성을 갖지 않거나, 또는 상당하게 갖지 않는다.
구현예에서, 상기 이중 가닥 파손은 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다. 구현예에서, 상기 단일 가닥 파손은 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 경로로부터의 유전자의 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 조성물은 제2 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자를 추가로 포함한다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는, 예를 들어, 표적 위치에 측접하는 표적 핵산 내 상이한 부위에서 파손을 매개한다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 표적의 동일한 가닥에 상보적이다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 표적의 상이한 가닥에 대해 상보적이다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자는 이중 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 Cas9 분자에 의해 만들어진 제1 파손 및 제2 파손이 표적 위치에 측접하도록 구성된다. 구현예에서, 상기 이중 가닥 파손은 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자는 단일 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 핵산 표적의 동일한 가닥 내에서, 예를 들어, 전사된 서열의 경우에, 주형 가닥 또는 비-주형 가닥 내에서 형성되도록 구성된다.
구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 표적 위치에 측접한다.
구현예에서, 상기 제1 단일 가닥 파손 및 제2 단일 가닥 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 표적의 상이한 가닥에서 형성되도록 구성된다. 구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 표적 위치에 측접한다. 구현예에서, 상기 제1 단일 가닥 파손 및 제2 단일 가닥 파손 중 하나 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다..
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 대응하는 서열로부터 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 조성물은 제2 Cas9 분자를 포함한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자 중 하나 또는 둘 다는 eiCas9 분자이다. 구현예에서, 상기 eiCas9 분자는 링커에 의해 페이로드에 결합되고, 상기 제2 eiCas9 분자는 제2 링커에 의해 제2 페이로드에 결합된다.
구현예에서, 상기 페이로드와 상기 제2 페이로드는 동일하다. 구현예에서, 상기 페이로드와 상기 제2 페이로드는 상이하다. 구현예에서, 상기 링커와 상기 제2 링커는 동일하다. 구현예에서, 상기 링커와 상기 제2 링커는 상이하며, 예를 들어, 상이한 방출 특성, 예를 들어, 상이한 방출속도를 가진다.
구현예에서, 상기 페이로드와 상기 제2 페이로드는 본 명세서에서, 예를 들어, 부문 VI에서, 예를 들어, 표 VI-1, VI-2, VI-3, VI-4, VI-5 또는 VI-6에 각각 기재되어 있다. 구현예에서, 상기 페이로드와 상기 제2 페이로드는 상호작용할 수 있으며, 예를 들어, 그들은 단백질의 서브유닛이다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자 중 하나 또는 둘 다는 eaCas9 분자이다.
구현예에서, 상기 eaCas9 분자는 제1 절단 활성을 포함하고, 상기 제2 eaCas9 분자는 제2 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, 상기 절단 활성과 상기 제2 절단 활성은 동일하며, 예를 들어, 둘 다 N-말단의 RuvC-유사 도메인 활성이거나, 또는 둘 다 HNH-유사 도메인 활성이다. 구현예에서, 상기 절단 활성과 상기 제2 절단 활성은 상이하며, 예를 들어, 하나는 N-말단의 RuvC-유사 도메인 활성이고, 하나는 HNH-유사 도메인 활성이다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 대해 특이적이며, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이고, 다른 하나는, 예를 들어, NGGNG, NNAGAAW(W = A 또는 T), 또는 NAAR(R = A 또는 G)에 대해 특이적이다. 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스의 상기 Cas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G)을 인식하고, 해당 서열로부터의 상류에 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자 중 하나는 스타필로코커스 아우레우스 PAM을 인식한다. 구현예에서, 네이세리아 메닌기티디스(N. meningitidis)의 상기 Cas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT를 인식하고, 해당 서열로부터 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개의 염기쌍 상류의 표적 핵산 서열의 절단을 지시한다. 구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자 중 하나는 네이세리아 메닌기티디스 PAM을 인식한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자와 상기 제2 Cas9 분자는 둘 다 이중 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 대해 특이적이며, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이고, 다른 하나는 다른 PAM, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다른 PAM에 대해 특이적이다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 표적 위치에 측접하도록 구성된다. 구현예에서, 상기 제1 이중 가닥 파손 및 제2 이중 가닥 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 단편을 포함한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자 중 하나는 이중 가닥 파손을 매개하고, 다른 하나는 단일 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 대해 특이적이고, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이고, 다른 하나는 다른 PAM, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다른 PAM에 대해 특이적이다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자 및 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 표적 위치에 측접하도록 구성된다. 구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 표적 위치에 측접한다. 구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 대응하는 서열로부터 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자와 상기 제2 Cas9 분자는 둘 다 단일 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자와 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 특이적이고, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이며, 다른 하나는 다른 PAM, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다른 PAM에 대해 특이적이다. 구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 표적 위치에 측접한다.
구현예에서, 상기 제1 단일 가닥 파손 및 제2 단일 가닥 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 대응하는 서열로부터 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자, 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 동일한 가닥 내에 있도록 구성된다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 대해 특이적이고, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이며, 다른 하나는 다른 PAM, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다른 PAM에 대해 특이적이다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자, 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 표적 위치에 측접하도록 구성된다. 구현예에서, 상기 제1 단일 가닥 파손 및 제2 단일 가닥 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 상이한 가닥 상에 있다.
구현예에서, 상기 Cas9 분자 및 상기 제2 Cas9 분자는 상이한 PAM에 대해 특이적이고, 예를 들어, 하나는 NGG에 대해 특이적이고, 다른 하나는 다른 PAM, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다른 PAM에 대해 특이적이다. 구현예에서, 상기 gRNA 분자, 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 상이한 가닥 상에 있도록 구성된다.
구현예에서, 상기 gRNA 분자, 상기 제2 gRNA 분자는 제1 파손 및 제2 파손이 표적 위치에 측접하도록 구성된다. 구현예에서, 상기 제1 파손 및 제2 파손은 표적 위치에 측접한다.
구현예에서, 상기 제1 단일 가닥 파손 및 제2 단일 가닥 파손 중 하나, 또는 둘 다는 독립적으로 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산을 추가로 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터의 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자, 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자를 포함하는, 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA를 추가로 포함한다. 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 제2 Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 추가로 포함한다. 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 주형 핵산을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자, 및 본 명세서에 기재된 하나 이상의 gRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, DNA를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 상기 핵산은 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 포함한다.
구현예에서, 상기 핵산은 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 상이한 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 동일하다.
구현예에서, 핵산은 본 명세서에 기재된 Cas9 분자를 추가로 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 본 명세서에 기재된 제2 Cas9 분자를 추가로 암호화한다.
구현예에서, 상기 핵산은 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 포함한다.
구현예에서, 상기 핵산은 제2 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 포함한다. 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 상이한 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 동일하다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 a) Cas9 분자, b) 제2 Cas9 분자, c) gRNA 분자, d) 제2 gRNA 분자, 및 e) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
구현예에서, 존재하는 각각의 a), b), c) d) 및 e)는 동일한 핵산 분자 상에서 암호화된다.
구현예에서, a), b), c), d) 및 e)로부터 선택된 제1 서열은 제1 핵산 분자 상에서 암호화되고, a), b), c), d) 및 e)로부터 선택된 제2 서열은 제2 핵산 분자 상에서 암호화된다.
구현예에서, 상기 핵산은 a), c) 및 e); a), c), d) 및 e); 또는 a), b), c), d) 및 e)를 암호화한다.
구현예에서, 조성물은 Cas9 분자를 추가로 포함하고, 예를 들어, Cas9 분자 중 하나 이상을 포함하되, 상기 핵산은 Cas9 분자를 암호화하지 않는다.
구현예에서, 조성물은 Cas9 분자를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하고, 예를 들어, Cas9 분자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하되, 상기 핵산은 Cas9 분자를 암호화하지 않는다.
구현예에서, 조성물은 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자와 제2 gRNA 분자의 조합); b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자; 및 제2 eaCas9 분자의 조합); 및 c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산을 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합); b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA; c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및 d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA; b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합); c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및 d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, gRNA-표적화 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또한 다른 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자 또는(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA; b) eaCas9 분자 또는(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA(여기서, gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음); c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및 d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 세포를 하기 1) 내지 4)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포를 변경시키는, 예를 들어, 세포의 표적 핵산의 구조, 예를 들어, 서열을 변경시키는 방법을 특징으로 한다:
1) 하기 a) 내지 c)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자; 및 제2 eaCas9 분자의 조합); 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산;
2) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA; 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자;
3) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합); 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자; 및/또는
4) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA, (gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음); 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자.
구현예에서, gRNA 분자, 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 하나의 투약 형태(dosage form), 전달 방식 또는 제형으로 또는 이들에 의해 전달된다.
구현예에서, a) gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산은 제1 투약 형태, 제1 전달 방식, 또는 제1 제형으로 또는 이들에 의해 전달되고; b) eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 제2 투약 형태, 제2 전달 방식, 또는 제2 제형으로 또는 이들에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공된다.
구현예에서, 세포는 동물 또는 식물 세포이다. 구현예에서, 세포는 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIA에 기재된 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아, 배반포 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포이다. 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, a 암 세포 또는 질환 또는 장애를 특징으로 하는 다른 세포이다.
구현예에서, 표적 핵산은 염색체 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 세포 소 기관 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 미토콘드리아 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 엽록체 핵산이다.
구현예에서, 세포는 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물 또는 기생충의 세포이다.
구현예에서, 표적 핵산은 질환 원인 유기체, 예를 들어, 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 핵산이다.
구현예에서, 상기 방법은 유전자의 발현을 조절하는 단계 또는 질환 유기체를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 세포는 원치않는 증식을 특징으로 하는 세포, 예를 들어, 암 세포이다. 구현예에서, 상기 세포는 원치않는 게놈 구성성분, 예를 들어, 바이러스 게놈 구성성분을 특징으로 하는 세포이다. 구현예에서, 세포는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IIA에 기재된 세포이다. 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 유전자의 제어 또는 구조적 서열이 변경된다.
구현예에서, 표적 핵산은 재배열, 키나제 유전자를 포함하는 재배열, 또는 종양 억제 유전자를 포함하는 재배열이다. 구현예에서, 표적 핵산은 키나제 유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적 핵산을 절단하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 상기 조성물은 주형 핵산을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 경로로부터의 유전자 내의 대응하는 서열과 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나, 또는 이를 포함한다.
구현예에서,
a) 제어 영역, 예를 들어, 유전자의 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 영역은 절단되고;
b) 유전자의 제어 영역, 예를 들어, 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 영역의 서열은 제어 영역의 제어 하에서 유전자를 조절하는, 예를 들어, 증가 또는 감소시키는 변경에 의해, 변경되고, 예를 들어, 제어 서열은 파괴되거나, 또는 새로운 제어 서열이 삽입되며;
c) 유전자의 암호화 서열이 절단되고;
d) 전사된 영역의 서열, 예를 들어, 유전자의 암호화 서열은 변경되거나, 예를 들어, 돌연변이는 수정되거나 또는 도입되고, 유전자 산물의 발현 또는 활성을 증가시키는 변경이 달성되며, 예를 들어, 돌연변이는 수정되고; 및/또는
e) 전사된 영역의 서열, 예를 들어, 유전자의 암호화 서열이 변경되며, 예를 들어, 돌연변이는 수정되거나 또는 도입되고, 유전자 산물의 발현 또는 활성을 감소시키는 변경이 달성되며, 예를 들어, 돌연변이는 삽입되고, 예를 들어, 정지 코돈을 삽입하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 서열이 변경된다.
구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 유전자의 제어 영역 또는 전사된 영역, 예를 들어, 암호화 서열이 변경된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에 유효량의 하기 1) 내지 4)의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어, 표적 핵산의 구조를 변경시킴으로써, 서열을 변경시킴으로써 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다:
1) 하기 a) 내지 c)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자; 및 제2 eaCas9 분자의 조합); 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산;
2) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA; 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자;
3) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합); 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, gRNA-표적화 gRNA 분자;
및/또는
4) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는;
b) eaCas9 분자(또는 eaCas9 분자들, 예를 들어, eaCas9 분자 및 제2 eaCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA(gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음) 또는; 및
c) 선택적으로, 주형 핵산, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 IV에 기재된 주형 핵산; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 하나의 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 또는 이들에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공된다.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산은 제1 투약 형태 내에서 또는 이에 의해, 제1 전달 방식 또는 제1 제형으로 전달되고; eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 제2 투약 형태, 제2 전달 방식, 또는 제2 제형 내에서 또는 이에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공될 수 있다.
구현예에서, 대상체는 동물 또는 식물이다. 구현예에서, 대상체는 포유류, 영장류 또는 인간이다.
구현예에서, 표적 핵산은 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIA에 기재된 세포의 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아, 배반포 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포의 핵산이다.
구현예에서, 표적 핵산은은 염색체 핵산이다. 구현예에서, 표적 핵산은 세포 소 기관 핵산이다. 구현예에서, 핵산은 미토콘드리아 핵산이다. 구현예에서, 핵산은 엽록체 핵산이다.
구현예에서, 표적 핵산은 질환 원인 유기체의, 예를 들어, 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 핵산이다. 구현예에서, 상기 방법은 유전자의 발현을 조절하는 단계 또는 질환 유기체를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 표적 핵산은 원치않는 증식을 특징으로 하는 세포, 예를 들어, 암 세포의 핵산이다. 구현예에서, 상기 표적 핵산은 원치않는 게놈 구성성분, 예를 들어, 바이러스 게놈 구성성분을 포함한다. 구현예에서, 적어도, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 유전자의 제어 또는 구조적 서열은 변경된다. 구현예에서, 표적 핵산은 재배열, 키나제 유전자를 포함하는 재배열, 또는 종양 억제 유전자를 포함하는 재배열이다. 구현예에서, 표적 핵산은 키나제 유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 표적 위치의 뉴클레오타이드의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적 핵산을 절단시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 상기 조성물은 주형 핵산을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 상기 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자의 서열로부터의 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로로부터의 유전자 내 서열로부터 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 대응하는 서열로부터 적어도 1 개의 뉴클레오타이드가 상이한(그러나 그의 뉴클레오타이드의 5, 10, 20 또는 30%를 초과하지 않음) 길이로 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200 개의 뉴클레오타이드의 단편이거나 또는 이를 포함한다.
구현예에서,
a) 유전자의 제어 영역, 예를 들어, 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 영역이 절단되고;
b) 유전자의 제어 영역, 예를 들어, 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 영역의 서열은, 제어 영역의 제어 하에서 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어, 증가 또는 감소시키는 변경에 의해 변경되고, 예를 들어, 제어 서열은 파괴되거나, 또는 새로운 제어 서열이 삽입되며;
c) 유전자의 암호화 서열이 절단되고;
d) 유전자의 전사된 영역, 예를 들어, 암호화 서열은 변경되며, 예를 들어, 돌연변이는 수정 또는 도입되고, 유전자 산물의 발현 또는 활성을 증가시키는 변경이 달성되며, 예를 들어, 돌연변이가 수정되고;
e) 유전자의 비-암호화 서열 또는 유전자 사이의 유전자간 영역은 절단되며; 및/또는
f) 전사된 영역의 서열, 예를 들어, 유전자의 암호화 서열은 변경되고, 예를 들어, 돌연변이는 수정 또는 도입되고, 유전자 산물의 발현 또는 활성을 감소시키는 변경이 달성되며, 예를 들어, 돌연변이는 삽입되고, 예를 들어, 정상 코돈을 삽입하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 서열이 변경된다.
구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 유전자의 제어 영역 또는 전사된 영역, 예를 들어, 암호화 서열이 변경된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합); b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합); 및 c) gRNA 분자 및 Cas9 분자의 복합체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된, 예를 들어, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 결합된 페이로드를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합); b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA; 및 c) gRNA 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 페이로드; 또는 Cas9 분자와의 융합 파트너를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA; b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합); c) Cas9 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 페이로드; 및 d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, gRNA-표적화 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 개시내용은 a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA; b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA(여기서, gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음); c) Cas9 분자와의 융합 파트너인 페이로드; 및 d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 세포를 하기 1) 내지 4)의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 예를 들어, 표적 핵산에 대해 페이로드를 표적화함으로써 세포에 페이로드를 전달하는 방법을 특징으로 한다:
1) 하기 a) 내지 c)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합); 및
c) gRNA 분자 및 Cas9 분자의 복합체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된, 예를 들어, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 결합된 페이로드;
2) 하기 a) 내지 c)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)을 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA;
c) gRNA 분자; 또는 Cas9 분자와의 융합 파트너와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 페이로드;
3) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합);
c) Cas9 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 페이로드; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, gRNA-표적화 gRNA 분자;
및/또는
4) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자 또는(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA(여기서, gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음);
c) Cas9 분자와의 융합 파트너인 페이로드; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 하나의 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형 내에서 또는 이들에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공된다.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산은 제1 투약 형태, 제1 전달 방식 또는 제1 제형으로 또는 이에 의해 전달되고; Cas9 분자, 또는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 제2 투약 형태, 제2 전달 방식, 또는 제2 제형 내에서 또는 이에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공된다.
구현예에서, 세포는 동물 또는 식물 세포이다. 구현예에서, 세포는 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIA에 기재된 인간 세포이다. 구현예에서, 세포는 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아, 배반포 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포이다. 구현예에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어, 암세포, 원치않는 유전자 구성요소, 예를 들어, 바이러스 게놈의 모두 또는 일부를 포함하는 세포이다.
구현예에서, gRNA는 염색체 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 선택된 게놈 서명(genomic signature)의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 세포 소 기관 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 미토콘드리아 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 엽록체 핵산의 표적화를 매개한다.
구현예에서, 세포는 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 세포이다.
구현예에서, gRNA는 질환 원인 유기체, 예를 들어, 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 핵산의 표적화를 매개한다.
구현예에서, 페이로드는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VI에 기재된 페이로드를 포함한다.
구현예에서, 상기 세포는 원치않는 증식을 특징으로 하는 세포, 예를 들어, 암세포이다. 구현예에서, 상기 세포는 원치않는 게놈 구성성분, 예를 들어, 바이러스 게놈 구성성분을 특징으로 한다.
구현예에서, 적어도 2 3, 4, 5 또는 6 개 이상의 유전자의 제어 또는 구조적 서열은 변경된다.
구현예에서, gRNA는 선택된 게놈 서명, 예를 들어, 돌연변이, 예를 들어, 생식계열 또는 후천적 체세포 돌연변이를 표적화한다. 구현예에서, 표적 핵산은 재배열, 키나제 유전자를 포함하는 재배열, 또는 종양 억제 유전자를 포함하는 재배열이다. 구현예에서, 표적 핵산은 키나제 유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함한다. 구현예에서, gRNA는 암세포, 예를 들어, 본 명세서에서, 예를 들어, 부문 VIIA에서 개시된 암세포를 표적화한다. 구현예에서, gRNA는 바이러스로 감염된 세포를 표적화한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의 1) 내지 4)의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어, 표적 핵산에 페이로드를 표적화함으로써 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다:
1) 하기 a) 내지 c)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합); 및
c) gRNA 분자 및 Cas9 분자의 복합체에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는, 예를 들어, Cas9 분자에 결합되는 페이로드;
2) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합);
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)을 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA;
c) gRNA 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되거나; 또는
Cas9 분자와의 융합 파트너인,
페이로드; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자;
3) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합); 및
c) Cas9 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 페이로드; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, a gRNA-표적화 gRNA 분자;
및/또는
4) 하기 a) 내지 d)를 포함하는 조성물:
a) gRNA 분자 또는(또는 gRNA 분자들, 예를 들어, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자의 조합)를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA;
b) Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자(또는 Cas9 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자 및 제2 eiCas9 분자의 조합)을 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA 또는 mRNA(여기서, gRNA 분자 암호화 핵산 및 eaCas9 분자 암호화 핵산은 동일 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있음);
c) Cas9 분자와의 융합 파트너인 페이로드; 및
d) 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 및 eaCas9 분자, 또는 eaCas9 분자를 암호화하는 핵산은 하나의 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형 내에서 또는 이에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공될 수 있다.
구현예에서, gRNA 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산은 제1 투약 형태, 전달 방식 또는 제형 내에서 또는 이에 의해 전달되고; 및 Cas9 분자 또는 Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 제2 투약 형태, 전달방식 또는 제형 내에서 또는 이에 의해 전달된다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자(또는 그것을 암호화하는 핵산), 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자는 그것을 불활성화시키는 구성성분을 함유하는 투약 형태로, 또는 다른 투약 형태, 전달 방식, 또는 제형으로 제공될 수 있다.
구현예에서, 대상체는 동물 또는 식물 세포이다. 구현예에서, 대상체는 포유류, 영장류 또는 인간 세포이다.
구현예에서, gRNA는 인간 세포, 예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIA에 기재된 인간 세포의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 체세포, 생식 세포, 태아 세포, 예를 들어, 접합, 배반포 또는 배아, 배반포 세포, 줄기 세포, 유사 분열 적격 세포, 감수 분열 적격 세포의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 암 세포 또는 원치않는 게놈 구성요소, 예를 들어, 바이러스 게놈의 모두 또는 일부를 포함하는 세포의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 염색체 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 선택된 게놈 서명의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 세포 소 기관 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 미토콘드리아 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 엽록체 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 질환 원인 유기체, 예를 들어, 질환 원인 유기체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 핵산의 표적화를 매개한다. 구현예에서, gRNA는 원치않는 증식을 특징으로 하는 세포, 예를 들어, 암세포, 예를 들어, 부문 VIIA, 예를 들어, 표 VII-11로부터의 암세포를 표적화한다. 구현예에서, gRNA는 원치않는 게놈 구성성분, 예를 들어, 바이러스 게놈 구성성분을 특징으로 하는 세포를 표적화한다.
구현예에서, 제어 구성요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 표적화된다. 구현예에서, 표적 핵산은 재배열, 키나제 유전자를 포함하는 재배열, 또는 종양 억제 유전자를 포함하는 재배열이다. 구현예에서, 표적 핵산은 키나제 유전자 또는 종양 억제 유전자를 포함한다. 구현예에서, gRNA는 선택된 게놈 서명, 예를 들어, 돌연변이, 예를 들어, 생식계열 또는 후천적 체세포 돌연변이를 표적화한다.
구현예에서, gRNA는 암 세포를 표적화한다. 구현예에서, gRNA는 바이러스로 감염된 세포를 표적화한다.
구현예에서, 적어도 하나의 eaCas9 분자 및 페이로드가 투여된다. 구현예에서, 페이로드는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VI에서 기재된 페이로드를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
수치 및 알파벳 표제 및 부표제를 포함하는 표제는 조직화 및 제시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명, 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도면을 함께 구성하는 이하의 도면의 설명은 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 제한을 위한 것이 아니다.
도 1a 내지 도 1g는 몇몇 예시적인 gRNA의 표현이다.
도 1a는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes(S. pyogenes))로부터 부분적으로 유래된(또는 부분적으로 서열 상에서 모델링된) 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 42 및 43);
도 1b는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자(또는 키메라) gRNA 분자를 도시한다(서열번호 44);
도 1c는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 45);
도 1d는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 46);
도 1e는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 47);
도 1f는 이중가닥 구조로서 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus(S. thermophilus))로부터 부분적으로 유래된 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 48 및 49);
도 1g는 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스의 모듈 gRNA 분자의 정렬을 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 50 내지 53).
도 2는 문헌[Chylinski et al., RNA Biol. 2013; 10(5): 726-737]으로부터의 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "Y"로 표시한다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "B"로 표시한다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고 "G"로 표시한다. Sm: 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)(서열번호 1); Sp: 스트렙토코커스 피오게네스(서열번호 2); St: 스트렙토코쿠스 써모필루스(서열번호 3); Li: 리스테리아 이노큐아(L. innocua)(서열번호 4). 모티프: 이는 4 개의 서열에 기반한 모티프이다: 모두 4 개의 서열에서 보존된 잔기는 한 글자 아미노산 약어로 표시되고; "*"는 4 개 서열 중 어떤 것의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하며; 및 "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 임의의 20종의 천연 유래 아미노산을 표시한다.
도 3a는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 54 내지 103). 도 3a의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 3b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 104 내지 177). 도 3b의 마지막 선은 4 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4a는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 178 내지 252). 도 4a의 마지막 선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 NH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 253 내지 302). 도 4b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5는 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis(N. meningitidis))로부터 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "Y"로 표시된다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "B"로 표시된다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "G"로 표시된다. Sp: 스트렙토코커스 피오게네스; Nm: 네이세리아 메닌기티디스. 모티프: 이는 두 서열에 기반한 모티프이고: 두 서열에서 보존된 잔기는 단일 아미노산 표기로 표시되며; "*"는 임의의 두 서열의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하고; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 20종의 천연 유래 아미노산을 표시하며, "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 20종의 천연 유래 아미노산을 표시하거나, 없음을 표시한다.
도 6은 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 303)을 나타낸다. "R"로 표시되는 서열은 SV40 NLS이고; "G"로 표시되는 서열은 HA 태그이며; "O"으로 표시되는 서열은 합성 NLS 서열이다. 남아있는(표시없음) 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이다.
도 7은 형질감염 후 1, 2, 3, 6 및 9일에 각각의 Cas9-표적화된 지배적인 gRNA를 이용하여 형질감염시킨 세포 내 Cas9 단백질 발현 수준을 도시한다.
도 1a 내지 도 1g는 몇몇 예시적인 gRNA의 표현이다.
도 1a는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes(S. pyogenes))로부터 부분적으로 유래된(또는 부분적으로 서열 상에서 모델링된) 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 42 및 43);
도 1b는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자(또는 키메라) gRNA 분자를 도시한다(서열번호 44);
도 1c는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 45);
도 1d는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 46);
도 1e는 이중가닥 구조로서 스트렙토코커스 피오게네스로부터 부분적으로 유래된 단분자 gRNA 분자를 도시한다(서열번호 47);
도 1f는 이중가닥 구조로서 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus(S. thermophilus))로부터 부분적으로 유래된 모듈 gRNA 분자를 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 48 및 49);
도 1g는 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스의 모듈 gRNA 분자의 정렬을 도시한다(나오는 순서대로 각각 서열번호 50 내지 53).
도 2는 문헌[Chylinski et al., RNA Biol. 2013; 10(5): 726-737]으로부터의 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "Y"로 표시한다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있으며, "B"로 표시한다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고 "G"로 표시한다. Sm: 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)(서열번호 1); Sp: 스트렙토코커스 피오게네스(서열번호 2); St: 스트렙토코쿠스 써모필루스(서열번호 3); Li: 리스테리아 이노큐아(L. innocua)(서열번호 4). 모티프: 이는 4 개의 서열에 기반한 모티프이다: 모두 4 개의 서열에서 보존된 잔기는 한 글자 아미노산 약어로 표시되고; "*"는 4 개 서열 중 어떤 것의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하며; 및 "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 임의의 20종의 천연 유래 아미노산을 표시한다.
도 3a는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 54 내지 103). 도 3a의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 3b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 104 내지 177). 도 3b의 마지막 선은 4 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4a는 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 HNH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 178 내지 252). 도 4a의 마지막 선은 보존된 잔기를 나타낸다.
도 4b는 서열 분리물이 제거된 문헌[Chylinski et al.]에 개시된 Cas9 분자로부터의 NH-유사 도메인의 정렬을 나타낸다(나오는 순서대로 각각 서열번호 253 내지 302). 도 4b의 마지막 선은 3 개의 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
도 5는 스트렙토코커스 피오게네스 및 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis(N. meningitidis))로부터 Cas9 서열의 정렬을 도시한다. N-말단의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "Y"로 표시된다. 다른 2 개의 RuvC-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "B"로 표시된다. HNH-유사 도메인은 박스 표시되어 있고, "G"로 표시된다. Sp: 스트렙토코커스 피오게네스; Nm: 네이세리아 메닌기티디스. 모티프: 이는 두 서열에 기반한 모티프이고: 두 서열에서 보존된 잔기는 단일 아미노산 표기로 표시되며; "*"는 임의의 두 서열의 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 표시하고; "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 20종의 천연 유래 아미노산을 표시하며, "-"는 임의의 아미노산, 예를 들어, 20종의 천연 유래 아미노산을 표시하거나, 없음을 표시한다.
도 6은 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9를 암호화하는 핵산 서열(서열번호 303)을 나타낸다. "R"로 표시되는 서열은 SV40 NLS이고; "G"로 표시되는 서열은 HA 태그이며; "O"으로 표시되는 서열은 합성 NLS 서열이다. 남아있는(표시없음) 서열은 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)이다.
도 7은 형질감염 후 1, 2, 3, 6 및 9일에 각각의 Cas9-표적화된 지배적인 gRNA를 이용하여 형질감염시킨 세포 내 Cas9 단백질 발현 수준을 도시한다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "지배적인 gRNA 분자"는 Cas9 시스템의 구성성분을 불활성화 또는 침묵시키기 위해 Cas9 분자와 복합체화할 수 있는 gRNA 분자를 지칭한다. 구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 불활성화 또는 침묵시킨다. 구현예에서, 이는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 불활성화 또는 침묵시킨다. 구현예에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자, 또는 gRNA 표적화 gRNA 분자는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체-매개 유전자 표적화 효과를 제한한다. 구현예에서, 이는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 활성에 대해 일시적 발현 수준 또는 다른 제한을 가한다. 구현예에서, 이는 표적을 벗어난 또는 다른 원치않는 활성을 감소시킨다. 지배적인 gRNA 분자는, 예를 들어, Cas9 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자의 생성을 완전히 또는 실질적으로 저해하도록 작용함으로써, 그의 활성을 제한 또는 지배할 수 있다.
지배적인 gRNA 분자는 구성성분의 생성이 감소되는 한, 구성성분의 전사 또는 번역된 영역 내에서 또는 외부에서 음으로 조절될 구성성분을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산의 임의의 영역을 표적화할 수 있다.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 음으로 조절될 구성성분을 암호화하는 서열이 체류하는 핵산 상의 표적 서열에 상보적인 표적화 핵산을 포함한다.
구현예에서, 지배적인 gRNA 분자는 음으로 조절될 구성성분의 서열과 상보적인 표적화 서열을 포함한다.
구현예에서, Cas9-표적화 gRNA 분자는 Cas9 분자를 암호화하는 서열이 체류하는 핵산을 표적화하는 표적화 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, Cas9-표적화 gRNA 분자는 Cas9 분자 서열을 표적화하는 표적화 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, gRNA-표적화 gRNA 분자는 gRNA 분자를 암호화하는 서열이 체류하는 핵산을 표적화하는 표적화 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, gRNA-표적화 gRNA 분자는 gRNA 분자 서열을 표적화하는 표적화 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "도메인"은 단백질 또는 핵산의 세그먼트를 기재하기 위해 사용된다. 달리 표시되지 않는 한, 도메인은 임의의 특이적 기능적 특성을 가질 필요는 없다.
두 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성"(상기 용어는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다. 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비상동성 서열은 무시될 수 있다). 최적 정렬은 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임 이동 갭 페널티 5로 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하는 최상 스코어로서 결정된다. 이어서, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 상기 분자는 해당 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용하는 바와 같은 구현예에서, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동일하다). 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절자(modulator)"는 독립체, 예를 들어, 대상 분자 또는 유전자 서열의 활성(예를 들어, 효소 활성, 전사 활성 또는 번역 활성), 양, 분포 또는 구조를 변경시킬 수 있는 약물을 지칭한다. 구현예에서, 조절은 절단, 예를 들어, 공유 또는 비공유 결합의 파손, 또는 공유 또는 비공유 결합의 형성, 예를 들어, 대상 분자에 대한 모이어티의 부착을 포함한다. 구현예에서, 조절자는 대상 분자의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조를 변경시킨다. 조절자는 대상 활성을 증가, 감소, 개시 또는 제거할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "거대 분자"는 분자량 적어도 2 kD, 3 kD, 5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD 또는 100 kD인 분자를 지칭한다. 거대 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 생물물질 및 탄수화물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드"는 100 개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 구현예에서, 이는 50 개, 20 개, 또는 10 개 미만의 아미노산 잔기를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "기준 분자(reference molecule)", 예를 들어, 기준 Cas9 분자 또는 기준 gRNA는 대상 분자, 예를 들어, 대상 gRNA 분자의 Cas9 분자, 예를 들어, 변형 또는 후보 Cas9 분자가 비교되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, Cas9 분자는 기준 Cas9 분자의 뉴클레아제 활성의 10% 이하를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 기준 Cas9 분자의 예는 천연 유래 비변형 Cas9 분자들, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 분자를 포함한다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 그것이 비교되는 Cas9 분자와 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 서열, 예를 들어, 변화, 예를 들어, 돌연변이가 만들어지는 모 형태인천연 유래 또는 공지된 서열이다.
분자의 변형과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "대체", 또는 "대체되는"은 처리 제한을 필요로 하지 않지만, 단지 대체 독립체가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "소분자"는 분자량이 약 2kD 미만, 예를 들어, 약 2kD 미만, 약 1.5kD 미만, 약 1 kD, 또는 약 0.75 kD 미만인 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물 중 하나를 의미할 수 있다. 상기 용어는 포유류(예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트 또는 햄스터), 토끼, 기니피그, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구현예에서, 대상체는 인간이다. 구현예에서, 대상체는 가금류이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 (a) 질환을 저해하는 것, 즉 질환의 발생을 저지 또는 예방하는 것; (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 상태의 퇴행을 야기하는 것; 또는 (c) 질환을 치유하는 것을 포함하는, 포유류에서의, 예를 들어, 인간에서의 질환의 치료를 의미한다.
아미노산 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "X"는 달리 구체화되지 않는 한, 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 20종의 천연 아미노산)을 지칭한다.
상세한 설명
I. gRNA 분자
본 명세서에서 사용되는 용어 gRNA 분자는 표적 핵산에 대한 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소(homing)를 촉진시키는 핵산을 지칭한다. gRNA 분자는 본 명세서에서 때때로 "키메라" gRNA 또는 모듈(하나 이상, 그리고 통상적으로 2 개의 별개의 RNA 분자를 포함)로서 지칭되는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있다. gRNA 분자는 다수의 도메인을 포함한다. gRNA 분자 도메인은 이하에서 더 상세하게 기재된다. 통상적으로, gRNA는 crRNA와 tracrRNA 둘 다의 기능 또는 구조, 예를 들어, 가공 또는 성숙 crRNA의 기능 및 가공 또는 성숙 tracrRNA의 기능을 포함할 것이다. 키메라 또는 단분자 gRNA 분자는, 예를 들어, crRNA 기능 또는 구조와 tracrRNA 기능 또는 구조를 둘 다 포함하는, 단일 RNA 분자를 가질 수 있다. 모듈 gRNA 분자는 crRNA 기능 또는 구조를 포함하는 RNA 분자, tracrRNA 기능 또는 구조를 포함하는 다른 RNA 분자를 포함할 수 있다. 몇몇 예시적인 gRNA 구조는 그것에 대해 표시된 도메인을 지니며, 도 1에서 제공된다. gRNA의 3차원 형태, 또는 활성 형태의 가닥내(intra-strand) 또는 가닥간(inter-strand) 상호작용에 대해 이론에 의해 구속되지 않고, 고 상보성 영역은 때때로 도 1의 이중가닥 및 본 명세서에 제공된 다른 도시로서 나타낸다.
구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA는 바람직하게는 5'으로부터 3'으로:
예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드(표적 핵산에 대해 상보적임)를 포함하는, 표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 대해 상보적);
근위 도메인; 및
선택적으로, 꼬리 도메인을 포함한다.
구현예에서, 모듈 gRNA는,
바람직하게는 5'으로부터 3'으로;
표적화 도메인(이는 본 명세서에 개시된 표적 핵산으로부터의 표적 서열, 예를 들어, 유전자, 또는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 경로로부터의 서열과 상보성임); 및
제1 상보성 도메인을 포함하는, 제1 가닥; 및
바람직하게는 5'으로부터 3'으로:
선택적으로, 5' 연장 도메인;
제2 상보성 도메인; 및
근위 도메인; 및
선택적으로, 꼬리 도메인을 포함하는, 제2 가닥을 포함한다.
도메인은 이하에서 간략하게 논의된다:
1) 표적화 도메인 :
도 1a 내지 도 1g는 표적화 도메인의 위치의 예를 제공한다.
표적화 도메인은 표적 핵산 상에서 표적 서열에 상보성인, 예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 상보적인, 예를 들어, 완전하게 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표적화 도메인은 RNA 분자의 부분이며, 따라서 염기 우라실(U)을 포함하는 한면, gRNA 분자를 암호화하는 임의의 DNA는 염기 티민(T)을 포함할 것이다. 이론에 의해 구속되지 않고, 표적 서열을 지니는 표적화 도메인의 상보성은 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 표적 핵산과의 상호작용의 특이성이 기여하는 것으로 믿어진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서, 표적화 도메인 내 우라실 염기는 표적 서열 내 아데닌 염기와 쌍을 이룬다는 것이 이해된다. 구현예에서, 표적 도메인 그 자체는 5'에서 3' 방향으로 선택적 2차 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 구현예에서, 코어 도메인은 표적 서열과 완전히 상보성이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 5 개 내지 50 개, 예를 들어, 10 개 내지 40 개, 예를 들어, 10 개 내지 30 개, 예를 들어, 15 개 내지 30 개, 예를 들어, 15 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다. 표적화 도메인과 상보적인 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 상보적 가닥으로서 지칭된다. 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 15 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 15 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
표적화 도메인은 이하에 더욱 상세하게 논의된다.
2) 제1 상보성 도메인 :
도 1a 내지 도 1g는 제1 상보성 도메인의 예를 제공한다.
제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인과 상보적이고, 구현예에서, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중가닥 영역을 형성하는데 제2 상보성 도메인에 대해 충분한 상보성을 가진다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 30 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 22 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 18 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 7 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제1 상보적 도메인은 길이로 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인, 중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3 개의 서브도메인을 포함한다. 구현예에서, 5' 서브도메인은 길이로 4 개 내지 9 개, 예를 들어, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 9 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 중앙 서브도메인은 길이로 1 개, 2 개 또는 3 개, 예를 들어, 1 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 3' 서브도메인은 길이로 3 개 내지 25 개, 예를 들어, 4 개 내지 22 개, 4 개 내지 18 개, 또는 4 개 내지 10 개, 또는 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
제1 상보성 도메인은 천연 유래 제1 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나, 또는 천연 유래 제1 상보성 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제1 상보성 도메인, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
제1 상보성 도메인은 이하에 더 상세하게 논의된다.
3)
연결 도메인
도 1b 내지 도 1e는 연결 도메인의 예를 제공한다.
연결 도메인은 제1 상보성 도메인을 단분자 gRNA의 제2 상보성 도메인과 연결하는 작용을 한다. 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 또는 비공유적으로 연결할 수 있다. 구현예에서, 연결은 공유적이다. 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인에 공유적으로 결합하며, 예를 들어, 도 1b 내지 도 1e를 참조한다. 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인 내지 제2 상보성 도메인 사이에 개재된 공유 결합이거나 또는 공유 결합을 포함한다. 통상적으로, 연결 도메인은 하나 이상의, 예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 또는 10 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
모듈 gRNA 분자에서, 두 분자는 상보성 도메인의 혼성화 때문에 결합될 수 있으며, 예를 들어, 도 1a를 참조한다.
매우 다양한 연결 도메인은 단분자 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 연결 도메인은 공유 결합으로 이루어질 수 있거나, 또는 하나 또는 소수의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드만큼 짧을 수 있다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 15 개, 20 개 또는 25 개 이상의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 연결 도메인은 길이로 2 개 내지 50 개, 2 개 내지 40 개, 2 개 내지 30 개, 2 개 내지 20 개, 2 개 내지 10 개 또는 2 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 연결 도메인은 천연 유래 서열, 예를 들어, 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 tracrRNA의 서열과 상동성을 공유하거나, 또는 이로부터 유래된다. 구현예에서, 연결 도메인은 본 명세서에 개시된 연결 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
연결 도메인은 이하에서 더 상세하게 논의된다.
4)
5' 연장 도메인
구현예에서, 모듈 gRNA는 본 명세서에서 5' 연장 도메인으로 지칭되는 제2 상보성 도메인에 대해 5'인 추가적인 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 도 1a를 참조한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 9 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 7 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 5 개, 2 개 내지 4 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이상의 뉴클레오타이드이다.
5)
제2 상보성 도메인
:
도 1a 내지 도 1f는 제2 상보성 도메인의 예를 제공한다.
제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보성이고, 구현예에서, 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중가닥 영역을 형성하기 위해 제2 상보성 도메인과 충분한 상보성을 가진다. 구현예에서, 예를 들어, 도 1a 또는 도 1b에 나타낸 바와 같이, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과의 상보성을 결여하는 서열, 예를 들어, 이중가닥 영역으로부터의 고리에서 제외된(loop out) 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 27 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 이는 제1 상보성 영역보다 더 길다.
구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 27 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 제2 상보적 도메인은 길이로 7 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 상보적 도메인은 길이로 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 5'에서 3' 방향으로 5' 서브도메인,중앙 서브도메인, 및 3' 서브도메인인 3 개의 서브도메인을 포함한다. 구현예에서, 5' 서브도메인은 길이로 3 개 내지 25 개, 예를 들어, 4 개 내지 22 개, 4 개 내지 18 개, 또는 4 개 내지 10 개, 또는 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 중앙 서브도메인은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개, 예를 들어, 3 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 3' 서브도메인은 길이로 4 개 내지 9 개, 예를 들어, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 9 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 5' 서브도메인 및 3' 서브도메인은 각각, 제2 상보성 도메인의 3' 서브도메인 및 5' 서브도메인과 상보성, 예를 들어, 완전히 상보성이다.
제2 상보성 도메인은 천연 유래 제2 상보성 도메인과 상동성을 공유할 수 있거나 또는 천연 유래 제2 상보성 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 제2 상보성 도메인, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는, 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
6)
근위 도메인
:
도 1a 내지 도 1f는 근위 도메인의 예를 제공한다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 5 내지 20 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 근위 도메인은 천연 유래 근위 도메인과 상동성을 공유하거나 또는 천연 유래 근위 도메인으로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 근위 도메인, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스 근위 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
7)
꼬리 도메인
:
도 1a 및 도 1c 내지 도 1f는 꼬리 도메인의 예를 제공한다.
도 1a 및 도 1c 내지 도 1f에서 꼬리 도메인의 조사에 의해 알 수 있는 바와 같이, 꼬리 도메인의 넓은 스펙트럼은 gRNA 분자에서 사용하기에 적합하다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 0 개(없음), 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 꼬리 도메인 뉴클레오타이드는 천연 유래 꼬리 도메인의 5' 말단으로부터의 서열로부터 유래되거나 또는 이것과 상동성을 공유하며, 예를 들어, 도 1d 또는 도 1e를 참조한다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 서로에 대해 상보성이고, 적어도 일부 생리적 조건 하에서, 이중가닥 영역을 형성하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 없거나 또는 길이로 1 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 꼬리 도메인은 천연 유래 근위 꼬리 도메인과 상동성을 공유하거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 구현예에서, 이는 본 명세서에 개시된 꼬리 도메인, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스 꼬리 도메인과 적어도 50% 상동성을 가진다.
도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 모두는 변형, 예를 들어, 본 명세서의 부문 X에서 발견되는 변형을 가질 수 있다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 시험관내 또는 생체내 전사 방법과 관련된 3' 말단에서 뉴클레오타이드를 포함한다. T7 프로모터가 gRNA의 시험관내 전사를 위해 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 DNA 주형의 3' 말단 앞에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. U6 프로모터가 생체내 전사를 위해 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 서열 UUUUUU일 수 있다. 대안의 pol-III 프로모터가 사용될 때, 이들 뉴클레오타이드는 다양한 수 또는 우라실 염기일 수 있거나, 또는 대안의 염기를 포함할 수 있다.
gRNA 분자의 도메인은 이하에 더욱 상세하게 기재된다.
표적화 도메인
gRNA의 "표적화 도메인"은 표적 핵산 상의 "표적 도메인"에 대해 상보적이다. gRNA의 코어 도메인에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 본 명세서에서 표적 핵산의 "상보적 가닥"으로서 지칭된다. 표적화 도메인의 선택에 대한 가이드는, 예를 들어, 문헌[Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808) 및 Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011)]에서 발견될 수 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 15 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 15 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 16 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 30+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개, 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
통상적으로 표적화 도메인은 표적 서열과 완전한 상보성을 가진다. 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개의 뉴클레오타이드를 갖거나 또는 포함한다.
구현예에서, 표적 도메인은 그의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적인 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3'말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적인 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적 도메인은 그의 5'말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3'말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 표적화 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, gRNA의 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 대해 Cas9 분자를 표적화시키기에 충분하다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인에 상보적이지 아니한("비상보적 뉴클레오타이드") 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 비상보적 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인에 대해 상보적이지 아니한 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 또는 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 이상의 뉴클레오타이드인 영역 내의 비상보적 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, 표적화 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공되는 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 표적화 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 표적화 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 표적화 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2' 아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적화 도메인은 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있는, 표적화 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 또는 표적화 도메인 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 표적화 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서, 표적화 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 또는 표적화 도메인 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
표적화 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 표적화 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 표적화 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 모든 변형된 뉴클레오타이드는 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성이고 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 구현예에서, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형된 뉴클레오타이드는 표적 도메인 내에 존재하는 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성이 아니거나 또는 혼성화할 수 없다.
구현예에서, 표적화 도메인은 바람직하게는 5'→3' 방향으로 2차 도메인 및 코어 도메인을 포함한다. 이들 도메인은 이하에서 더 상세하게 논의된다.
표적화 도메인의 코어 도메인 및 2차 도메인
표적화 도메인의 "코어 도메인"은 표적 핵산 상에서 "코어 도메인 표적"에 상보성이다. 구현예에서, 코어 도메인은 표적화 도메인의 3' 말단으로부터 약 8 개 내지 약 13 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 표적화 도메인의 가장 3'의 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드)를 포함한다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 15+/-2 개 또는 16+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 10+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 10+/-4 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개 또는 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 8 개 내지 13 개, 예를 들어, 8 개 내지 12 개, 8 개 내지 11 개, 8 개 내지 10 개, 8 개 내지 9 개, 9 개 내지 13 개, 9 개 내지 12 개, 9 개 내지 11 개, 또는 9 개 내지 10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 코어 도메인은 길이로 6 개 내지 16 개, 예를 들어, 6 개 내지 15 개, 6 개 내지 14 개, 6 개 내지 13 개, 7 개 내지 14 개, 7 개 내지 13 개, 7 개 내지 12 개, 7 개 내지 11 개, 7 개 내지 10 개, 8 개 내지 14 개, 8 개 내지 13 개, 8 개 내지 12 개, 8 개 내지 11 개, 8 개 내지 10 개, 또는 8 개 내지 9 개의 뉴클레오타이드이다.
코어 도메인은 코어 도메인 표적과 상보성이다. 통상적으로 코어 도메인은 코어 도메인 표적과 정확한 상보성을 가진다. 구현예에서, 코어 도메인은 코어 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 아니한 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA의 다른 특성과 함께 상보성 정도는 Cas9 분자를 표적 핵산에 대해 표적화시키기에 충분하다.
gRNA의 표적화 도메인의 "2차 도메인"은 표적 핵산의 "2차 도메인 표적"에 대해 상보성이다.
구현예에서, 2차 도메인은 코어 도메인에 대해 5'에 위치된다.
구현예에서, 2차 도메인은 없거나 또는 선택적이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 26 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 12 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 25 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 12 개 내지 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 24 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 11 개 내지 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 23 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 22 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 9 개 내지 14 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 21 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 20 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 7 개 내지 12 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 19 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 6 개 내지 11 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 18 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 5 개 내지 10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 17 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 4 개 내지 9 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인이 길이로 적어도 16 개의 뉴클레오타이드이고 (표적화 도메인의 3' 말단으로부터 계수된) 코어 도메인이 길이로 8 개 내지 13 개의 뉴클레오타이드라면, 2차 도메인은 길이로 3 개 내지 8 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 2차 도메인은 길이로 0 개, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개 또는 15 개의 뉴클레오타이드이다.
2차 도메인은 2차 도메인 표적과 상보성을 가진다. 통상적으로 2차 도메인은 2차 도메인 표적과 정확한 상보성을 가진다. 구현예에서, 2차 도메인은 2차 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보성이 아닌 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA의 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 Cas9 분자를 표적화시키는데 충분하다.
구현예에서, 코어 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 코어 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 코어 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 코어 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다. 통상적으로, 코어 도메인은 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 변형을 함유할 것이다.
코어 도메인 내 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 코어 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 코어 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 2차 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공되는 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 2차 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 2차 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 2차 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다. 통상적으로, 2차 도메인은 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 변형을 함유할 것이다.
2차 도메인 내 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 2차 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III의 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 2차 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, (1) 코어 도메인과 그의 표적 사이의 상보성 정도, 및 (2) 2차 도메인과 그의 표적 사이의 상보성 정도는 상이할 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 클 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 적을 수 있다. 구현예에서, (1)과 (2)는 동일할 수 있고, 예를 들어, 각각은 그의 표적과 완전히 상보성일 수 있다.
구현예에서, (1) 코어 도메인의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 부문 X로부터의 변형)의 수와 (2) 2차 도메인의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 부문 X로부터의 변형)의 수는 상이할 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 적을 수 있다. 구현예에서, (1)은 (2)보다 클 수 있다. 구현예에서, (1)과 (2)는 동일할 수 있고, 예를 들어, 각각은 변형이 없을 수 있다.
제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인
제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인과 상보성이다.
통상적으로 제1 도메인은 제2 상보성 도메인 표적과 정확한 상보성을 갖지 않는다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성이 아닌 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 구현예에서, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어, 3 개의 뉴클레오타이드는 이중가닥에서 짝지어지지 않을 것이며, 예를 들어, 비이중가닥 또는 루프를 벗어난 영역을 형성한다. 구현예에서, 짝지어지지 않거나 또는 루프를 벗어난 영역, 예를 들어, 3 개의 뉴클레오타이드의 루프를 벗어난 영역은 제2 상보성 도메인 상에 존재한다. 구현예에서, 짝지어지지 않은 영역은 제2 상보성 도메인의 5' 말단으로부터 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어, 4 개의 뉴클레오타이드가 시작한다.
구현예에서, gRNA의 다른 특성과 함께 상보성 정도는 표적 핵산에 Cas9 분자를 표적화시키는데 충분하다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은:
독립적으로, 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 15+/-2 개, 16+/-2 개, 17+/-2 개, 18+/-2 개, 19+/-2 개 또는 20+/-2 개, 21+/-2 개, 22+/-2 개, 23+/-2 개 또는 24+/-2 개의 뉴클레오타이드;
독립적으로, 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 14 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드; 또는
독립적으로, 길이로 5 개 내지 24 개, 5 개 내지 23 개, 5 개 내지 22 개, 5 개 내지 21 개, 5 개 내지 20 개, 7 개 내지 18 개, 9 개 내지 16 개, 또는 10 개 내지 14 개이다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인, 예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개, 예를 들어, 6 개의 뉴클레오타이드보다 길다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 이상의 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 구현예에서, 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인은 독립적으로, 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
상보성 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 상보성 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 상보성 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인은 기준 제1 상보성 도메인, 예를 들어, 천연 유래, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스, 제1 상보성 도메인 또는 본 명세서, 예를 들어, 도 1a 내지 도 1f에 기재된 제1 상보성 도메인으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이거나, 또는 상이하다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인은 기준 제2 상보성 도메인, 예를 들어, 천연 유래, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스, 제2 상보성 도메인, 또는 본 명세서, 예를 들어, 도 1a 내지 도 1f에 기재된 제2 상보성 도메인으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이거나, 또는 상이하다.
제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인에 의해 형성된 이중가닥 영역은 통상적으로 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개 또는 22 개의 염기쌍이다(임의의 루프를 벗어난 또는 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드를 제외함).
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어, gRNA 서열에서 11 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어, gRNA 서열에서 15 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인은, 이중가닥일 때, 예를 들어, gRNA 서열 내 16 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
구현예에서, 제1 상보성 도메인 및 제2 상보성 도메인, 이중가닥일 때, 예를 들어, gRNA 서열 내 21 개의 짝지어진 뉴클레오타이드를 포함한다(하나의 짝지어진 가닥은 밑줄 표시 되어 있고, 하나는 볼드체임):
구현예에서, 뉴클레오타이드는, 예를 들어, gRNA 서열에서 폴리-U 지역을 제거하기 위해 교환된다(밑줄 표시된 뉴클레오타이드가 교환됨):
5' 연장 도메인
구현예에서, 모듈 gRNA는 제2 상보성 도메인에 대해 5'에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 9 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 7 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 5 개, 또는 2 개 내지 4 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은 길이로 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이상의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 5' 연장 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 5' 연장 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 5' 연장 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 5' 연장 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은, 예를 들어, 모듈 gRNA 분자에서, 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인은, 예를 들어, 모듈 gRNA 분자에서, 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 5' 연장 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 5' 연장 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 5' 연장 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 5' 연장 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
5' 연장 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 5' 연장 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 5' 연장 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 5' 연장 도메인은 기준 5' 연장 도메인, 예를 들어, 천연 유래, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스, 5' 연장 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어, 도 1a 및 도 1f에 기재된 5' 연장 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
연결 도메인
단분자 gRNA 분자에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인 사이에 배치된다. 모듈 gRNA 분자에서, 두 분자는 상보성 도메인에 의해 서로 결합된다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 연결 도메인은 공유 결합이다.
구현예에서, 연결 도메인은 통상적으로 제1 상보성 도메인의 3' 말단 및/또는 제2 상보성 도메인의 5' 말단의 1 개, 2 개 또는 3 개의 뉴클레오타이드에 인접하거나 또는 1 개, 2 개 또는 3 개의 뉴클레오타이드 내인 이중가닥 영역을 포함한다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개 또는 50+/-10 개의 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 10+/-5 개, 15+/-5 개, 20+/-5 개 또는 30+/-5 개의 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 이중가닥 영역은 길이로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개 또는 15 개의 염기쌍일 수 있다.
통상적으로 이중가닥 영역을 형성하는 서열은 구현예에서 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 뉴클레오타이드가 대응하는 뉴클레오타이드와 상보성이 아님에도 불구하고, 서로 정확한 상보성을 가진다.
구현예에서, 연결 도메인은 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 연결 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 연결 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 연결 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 연결 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다.
연결 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 연결 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 연결 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 연결 도메인은 기준 연결 도메인, 예를 들어, 본 명세서, 예를 들어, 도 1b 내지 도 1e에 기재된 연결 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 갖거나 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
근위 도메인
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 6+/-2 개, 7+/-2 개, 8+/-2 개, 9+/-2 개, 10+/-2 개, 11+/-2 개, 12+/-2 개, 13+/-2 개, 14+/-2 개, 14+/-2 개, 16+/-2 개, 17+/-2 개, 18+/-2 개, 19+/-2 개 또는 20+/-2 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 14 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인은 길이로 5 개 내지 20 개, 7 개 내지 18 개, 9 개 내지 16 개, 또는 10 개 내지 14 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 근위 도메인 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 근위 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 근위 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 근위 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 근위 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 포함할 수 있다. 구현예에서, 근위 도메인은, 예를 들어, 모듈 gRNA 분자에서, 그의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은, 예를 들어, 모듈 gRNA 분자에서, 그의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 근위 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 근위 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 근위 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 근위 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
근위 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 근위 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 근위 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 근위 도메인은 기준 근위 도메인, 예를 들어, 천연 유래, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스, 근위 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어, 도 1a 및 도 1f에 기재된 근위 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
꼬리 도메인
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 10+/-5 개, 20+/-5 개, 30+/-5 개, 40+/-5 개, 50+/-5 개, 60+/-5 개, 70+/-5 개, 80+/-5 개, 90+/-5 개 또는 100+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20+/-5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개 또는 100+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 25+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 10 개 내지 100 개, 10 개 내지 90 개, 10 개 내지 80 개, 10 개 내지 70 개, 10 개 내지 60 개, 10 개 내지 50 개, 10 개 내지 40 개, 10 개 내지 30 개, 10 개 내지 20 개, 또는 10 개 내지 15 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 20 개 내지 100 개, 20 개 내지 90 개, 20 개 내지 80 개, 20 개 내지 70 개, 20 개 내지 60 개, 20 개 내지 50 개, 20 개 내지 40 개, 20 개 내지 30 개, 또는 20 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 길이로 1 개 내지 20 개, 1 개 내지 1 개, 1 개 내지 10 개, 또는 1 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 뉴클레오타이드는 변형, 예를 들어, 부문 X에서 제공된 유형의 변형을 포함하지 않는다. 그러나, 구현예에서, 꼬리 도메인은 하나 이상의 변형, 예를 들어, 분해에 덜 민감하게 또는 더 생체적합성, 예를 들어, 덜 면역원성으로 제공하는 변형을 포함한다. 예로서, 꼬리 도메인의 백본은 포스포로티오에이트에 의해 또는 부문 X로부터의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형(예를 들어, 리보스 상의 2' 위치에서의 변형), 예를 들어, 2'-아세틸화, 예를 들어, 2' 메틸화 또는 부문 X로부터의 다른 변형을 포함할 수 있다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개만큼 많은 변형을 가질 수 있다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 5' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다. 구현예에서, 표적 도메인은 그의 3' 말단의 5 개의 뉴클레오타이드 내에서 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개만큼 많은 변형을 포함한다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 꼬리 이중가닥 영역을 형성할 수 있는 꼬리 이중가닥 도메인을 포함한다. 구현예에서, 꼬리 이중가닥 영역은 길이로 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개 또는 12 개 염기쌍일 수 있다. 구현예에서, 추가 단일 표준 도메인은 꼬리 이중가닥 도메인에 대해 3'에 존재한다. 구현예에서, 이 도메인은 길이로 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 이는 길이로 4 개 내지 6 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 기준 꼬리 도메인, 예를 들어, 천연 유래, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스, 꼬리 도메인, 또는 본 명세서에, 예를 들어, 도 1a 및 도 1c 내지 도 1f에 기재된 꼬리 도메인과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 상동성을 가지거나, 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
구현예에서, 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인은 다음의 서열을 포함한다:
구현예에서, 예를 들어, U6 프로모터가 전사를 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUUUU을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어, H1 프로모터가 전사를 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 3' 서열 UUUU를 포함한다.
구현예에서, 예를 들어, 사용된 pol-III 프로모터의 종결 신호에 따라서 꼬리 도메인은 3' U의 가변 수를 포함한다.
구현예에서, T7 프로모터가 사용된다면 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어, 시험관내 전사가 RNA 분자를 생성하기 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
구현예에서, 예를 들어, pol-II 프로모터가 전사를 구동하기 위해 사용된다면, 꼬리 도메인은 DNA 주형으로부터 유래된 가변 3' 서열을 포함한다.
꼬리 도메인 내의 변형은 부문 III에 기재된 시스템 내 후보 변형을 시험함으로써 평가될 수 있는 표적화 효능을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 선택된 길이, 서열, 상보성 정도 또는 변형 정도를 갖는 후보 꼬리 도메인을 갖는 gRNA는 부문 III에 기재된 시스템에서 평가될 수 있다. 후보 꼬리 도메인은 단독으로, 또는 선택된 표적에 의해 기능성이 되는 것으로 알려진 gRNA 분자/Cas9 분자 시스템 내의 하나 이상의 다른 후보 변화와 함께 위치되고, 평가될 수 있다.
구현예에서, 꼬리 도메인은 2 개의 연속적 뉴클레오타이드, 예를 들어, 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 2 개의 연속적 뉴클레오타이드에서 변형을 포함한다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 2 개의 연속적 뉴클레오타이드는 없다. 구현예에서, 꼬리 도메인의 5' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 꼬리 도메인의 3' 말단의 5 개 뉴클레오타이드 내에 있거나, 또는 꼬리 도메인의 말단 중 하나 또는 둘 다로부터 5 개 초과의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 영역 내에서 변형된 뉴클레오타이드는 없다.
구현예에서, gRNA는 다음의 구조를 가진다:
5' [표적화 도메인]-[제1 상보성 도메인]-[연결 도메인]-[제2 상보성 도메인]-[근위 도메인]-[꼬리 도메인]-3'
여기서,
표적화 도메인은 코어 도메인 및 선택적으로 2차 도메인을 포함하고,
길이로 10 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이며;
제1 상보성 도메인은 길이로 5 개 내지 25 개의 뉴클레오타이드이고, 구현예에서
본 명세서에 개시된 기준 제1 상보성 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 가지고;
연결 도메인은 길이로 1 개 내지 5 개의 뉴클레오타이드이며;
근위 도메인은 길이로 5 개 내지 20 개의 뉴클레오타이드이고, 구현예에서 본 명세서에 개시된 기준 근위 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 가지고;
그리고,
꼬리 도메인은 없거나 또는 뉴클레오타이드 서열은 길이로 1 개 내지 50 개의 뉴클레오타이드이며, 구현예에서 본 명세서에 개시된 기준 꼬리 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성을 가진다.
예시적인 키메라 gRNA
구현예에서, 단분자, 또는 키메라, gRNA는 바람직하게는 5'에서 3'으로:
예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인(이는 표적 핵산에 상보성임);
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인(이는 제1 상보성 도메인에 대해 상보성임);
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하되,
여기서,
(a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함하고;
(b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있으며; 또는
(c) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 천연 유래 gRNA의 대응하는 서열과, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가진다.
구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이고; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
예시적인 모듈 gRNA
구현예에서, 모듈 gRNA는
바람직하게는 5'으로부터 3'으로;
예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인;
제1 상보성 도메인을 포함하는, 제1 가닥; 및
바람직하게는 5'으로부터 3'으로;
선택적으로 5' 연장 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하는 제2 가닥을 포함하되,
여기서:
(a) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함하고;
(b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있거나; 또는
(c) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 대해 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열은 천연 유래 gRNA의 대응하는 서열과, 또는 본 명세서에 기재된 gRNA와 적어도 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가진다.
구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개 또는 26 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인과 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 5 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 16 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 16 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 17 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 17 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 17 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 18 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 18 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 19 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 19 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 20 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 20 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 20 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 21 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 21 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 22 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 22 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 22 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 23 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 23 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 23 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 24 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 24 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 24 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 25 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 25 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 25 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
구현예에서, 표적화 도메인은 표적 도메인와 상보성을 갖는 26 개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 26 개의 연속적 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이루어지고, 예를 들어, 표적화 도메인은 길이로 26 개의 뉴클레오타이드이며; 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상보성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3'이 있다.
gRNA의 설계방법
표적 도메인을 선택, 설계 및 확인하기 위한 gRNA의 설계방법이 본 명세서에 기재된다. 예시적인 표적화 도메인이 또한 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 논의되는 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 확인 방법뿐만 아니라 표적을 벗어난 분석은, 예를 들어, 문헌[Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826; Hsu et al., 2013 Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662]에 기재된다.
예를 들어, 사용자의 표적 서열 내에서 gRNA의 선택을 최적화하기 위해, 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적을 벗어난 활성을 최소화하기 위해 소프트웨어 툴이 사용될 수 있다. 표적을 벗어난 활성은 절단이 아닐 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하는 각각의 가능한 gRNA 선택에 대해, 툴은 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)까지의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐 모든 표적을 벗어난 서열(예를 들어, 상술한 NAG 또는 NGG PAM 중 하나)을 동정할 수 있다. 각각의 표적을 벗어난 서열에서 절단 효능은, 예를 들어, 실험적으로 유도된 가중치 계획을 이용하여 예측될 수 있다. 이어서, 각각의 가능한 gRNA는 그것의 전체 예측된 표적을 벗어난 절단에 따라 랭킹되고; 전체 랭킹된 gRNA는 가장 큰 표적 상의 절단 및 가장 적은 표적을 벗어난 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, CRISPR 구성을 위한 자동화된 시약 설계, 표적 상의 서베이어(Surveyor) 분석을 위한 프라이머 설계 및 고속대량 검출을 위한 프라이머 설계 및 차세대 시퀀싱(next-gen sequencing)을 통한 표적을 벗어난 절단의 정량화가 또한 툴에 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서의 부문 IV에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
II. Cas9 분자
다양한 종의 Cas9 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 분자는 본 명세서에 개시한 상당수 개시내용의 대상이지만, 본 명세서에 열거된 다른 종의 Cas9 단백질의, 또는 이로부터 유래되거나, 또는 이에 기반한 Cas9 분자가 마찬가지로 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서의 상당수의 기재가 스트렙토코커스 피오게네스 및 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 분자를 사용하지만, 다른 종으로부터의 Cas9 분자, 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자는 그들을 대체할 수 있다. 추가적인 Cas9 종은 아시도보락스 아베나에(Acidovorax avenae), 악티노바실러스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 사이클리필러스 데니트리피칸스(Cycliphilus denitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티(Bacillus smithii), 바실러스 트루린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피레룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실러스 라테로스포러스(Brevibacillus laterosporus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 종(Neisseria sp.), 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서 Cas9 분자는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있고, gRNA 분자와 함께 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위에 대해 국소화(예를 들어, 표적 또는 귀소)하는 분자를 지칭한다.
구현예에서, Cas9 분자는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 표적 핵산 분자를 절단할 수 있는 Cas9 분자는 본 명세서에서 eaCas9(효소적으로 활성인 Cas9) 분자로서 지칭된다. 구현예에서, eaCas9 분자는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다:
틈내기효소(nickase) 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어, 비상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력;
이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 구현예에서 2 개의 틈내기효소 활성의 존재인, 이중 가닥 핵산의 가닥을 둘 다 절단하고 이중 가닥 파손을 생성하는 능력;
엔도뉴클레아제 활성;
엑소뉴클레아제 활성; 및
헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
구현예에서, 효소적으로 활성인 Cas9 또는 eaCas9 분자는 DNA 가닥을 둘 다 절단하고 이중 가닥 파손을 초래한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 단지 하나의 가닥, 예를 들어, gRNA가 혼성화하는 가닥, 또는 gRNA와 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥을 절단한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 활성, 또는 절단 적격, HNH-유사 도메인 및 불활성, 또는 절단 부적격, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, eaCas9 분자는 불활성, 또는 절단 부적격, HNH-유사 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
구현예에서, 표적 핵산과 상호작용하고 표적 핵산을 절단하는 eaCas9 분자의 능력은 PAM 서열 의존적이다. PAM 서열은 표적 핵산 내 서열이다. 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열의 상류에서 일어난다. 상이한 박테리아 종으로부터의 EaCas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어, PAM 서열)를 인식할 수 있다. 구현예에서, 스트렙토코커스 피오게네스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG를 인식하고, 표적 핵산 서열 1 내지 10, 예를 들어, 해당 서열로부터 상류의 3 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826] 참조. 구현예에서, 스트렙토코쿠스 써모필루스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGGNG 및 NNAGAAW(W = A 또는 T)를 인식하고, 이들 서열로부터 상류의 코어 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170, 및 Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 구현예에서, 스트렙토코커스 뮤탄스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG 또는 NAAR(R = A 또는 G)을 인식하고, 이 서열 상류의 코어 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참조. 구현예에서, 스타필로코커스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G)을 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 구현예에서, 네이세리아 메닌기티디스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT를 인식하고, 해당 서열로부터 상류의 표적 핵산 서열 1 개 내지 10 개, 예를 들어, 3 개 내지 5 개 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6] 참조. PAM 서열을 인식하는 Cas9 분자의 능력은, 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012, 337:816]에 기재된 형질전환 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 Cas9 분자는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력을 갖고, gRNA 분자와 함께 코어 표적 도메인에 대해 귀소(예를 들어, 표적화 또는 국소화)하지만, 표적 핵산을 절단할 수 없거나 또는 효율적인 속도로 절단할 수 없다. 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 없는 Cas9 분자는 본 명세서에서 eiCas9(효소적 불활성 Cas9) 분자로서 지칭된다. 예를 들어, eiCas9 분자는 절단 활성이 없거나 또는 실질적으로 적을 수 있고, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 기준 Cas9 분자 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만일 수 있다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013; 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과, 클러스터 2 박테리아과, 클러스터 3 박테리아과, 클러스터 4 박테리아과, 클러스터 5 박테리아과, 클러스터 6 박테리아과, 클러스터 7 박테리아과, 클러스터 8 박테리아과, 클러스터 9 박테리아과, 클러스터 10 박테리아과, 클러스터 11 박테리아과, 클러스터 12 박테리아과, 클러스터 13 박테리아과, 클러스터 14 박테리아과, 클러스터 15 박테리아과, 클러스터 16 박테리아과, 클러스터 17 박테리아과, 클러스터 18 박테리아과, 클러스터 19 박테리아과, 클러스터 20 박테리아과, 클러스터 21 박테리아과, 클러스터 22 박테리아과, 클러스터 23 박테리아과, 클러스터 24 박테리아과, 클러스터 25 박테리아과, 클러스터 26 박테리아과, 클러스터 27 박테리아과, 클러스터 28 박테리아과, 클러스터 29 박테리아과, 클러스터 30 박테리아과, 클러스터 31 박테리아과, 클러스터 32 박테리아과, 클러스터 33 박테리아과, 클러스터 34 박테리아과, 클러스터 35 박테리아과, 클러스터 36 박테리아과, 클러스터 37 박테리아과, 클러스터 38 박테리아과, 클러스터 39 박테리아과, 클러스터 40 박테리아과, 클러스터 41 박테리아과, 클러스터 42 박테리아과, 클러스터 43 박테리아과, 클러스터 44 박테리아과, 클러스터 45 박테리아과, 클러스터 46 박테리아과, 클러스터 47 박테리아과, 클러스터 48 박테리아과, 클러스터 49 박테리아과, 클러스터 50 박테리아과, 클러스터 51 박테리아과, 클러스터 52 박테리아과, 클러스터 53 박테리아과, 클러스터 54 박테리아과, 클러스터 55 박테리아과, 클러스터 56 박테리아과, 클러스터 57 박테리아과, 클러스터 58 박테리아과, 클러스터 59 박테리아과, 클러스터 60 박테리아과, 클러스터 61 박테리아과, 클러스터 62 박테리아과, 클러스터 63 박테리아과, 클러스터 64 박테리아과, 클러스터 65 박테리아과, 클러스터 66 박테리아과, 클러스터 67 박테리아과, 클러스터 68 박테리아과, 클러스터 69 박테리아과, 클러스터 70 박테리아과, 클러스터 71 박테리아과, 클러스터 72 박테리아과, 클러스터 73 박테리아과, 클러스터 74 박테리아과, 클러스터 75 박테리아과, 클러스터 76 박테리아과, 클러스터 77 박테리아과, 또는 클러스터 78 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다.
예시적인 천연 유래 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아과의 Cas9 분자를 포함한다. 예는 스트렙토코커스 피오게네스(예를 들어, 균주 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), 스트렙토코쿠스 써모필루스(예를 들어, 균주 LMD-9), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어, 균주 SPIN 20026), 스트렙토코커스 뮤탄스(예를 들어, 균주 UA159, NN2025), 스트렙토코커스 마카카에(S. macacae)(예를 들어, 균주 NCTC11558), 스트렙토코커스 갈로리티쿠스(S. gallolyticus)(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 스트렙토코커스 에쿠이네스(S. equines)(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 스트렙토코커스 디스달락티애(S. dysdalactiae)(예를 들어, 균주 GGS 124), 스트렙토코커스 보비스(S. bovis)(예를 들어, 균주 ATCC 700338), 스트렙토코커스 안기노서스(S. anginosus)(예를 들어, 균주 F0211), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae)(예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(리스테리아 이노큐아, 예를 들어, 균주 Clip11262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어, 균주 DSM 15952) 또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)(예를 들어, 균주 1,231,408)의 Cas9 분자를 포함한다. 추가적인 예시적인 Cas9 분자는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자(Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6) 및 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자이다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는,
본 명세서에 기재된 임의의 Cas9 분자 서열 또는 천연 유래 Cas9 분자 서열, 예를 들어, 본 명세서에 열거되거나 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013, 10:5, 727-737; Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 종으로부터의 Cas9 분자에 대해,
60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고;
비교할 때 아미노산 잔기의 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이하만큼 다르거나;
적어도 1 개, 2 개, 5 개, 10 개 또는 20 개의 아미노산만큼이지만, 100 개, 80 개, 70 개, 60 개, 50 개, 40 개 또는 30 개 이하의 아미노산만큼 다르거나; 또는
동일한 아미노산 서열을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: 틈내기효소 활성; 이중 가닥 절단 활성 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; 또는 gRNA 분자와 함께 표적 핵산을 국소화하는 능력.
구현예에서, Cas9 분자는 도 2의 공통 서열의 아미노산 서열을 포함하되, "*"는 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 및 리스테리아 이노큐아의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내고, "-"는 임의의 아미노산을 나타낸다. 구현예에서, Cas9 분자는 도 2에 개시된 공통 서열의 서열과 적어도 1 개의 (그러나 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하) 아미노산 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, Cas9 분자는 도 5의 서열번호 7의 아미노산을 포함하되, "*"는 스트렙토코커스 피오게네스 또는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에서 발견되는 임의의 아미노산을 나타내며, "-"는 임의의 아미노산을 나타내고, "-"는 임의의 아미노산 또는 없음을 나타낸다. 구현예에서, Cas9 분자는 서열번호 6 또는 7의 서열과 적어도 1 개(그러나 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하)의 아미노산 잔기만큼 상이하다.
다수의 Cas9 분자의 서열 비교는 특정 영역이 보존된다는 것을 나타낸다. 이들은 이하에
영역 1(잔기 1 내지 180, 또는 영역 1'의 경우에 잔기 120 내지 180)
영역 2(잔기 360 내지 480);
영역 3(잔기 660 내지 720);
영역 4(잔기 817 내지 900); 및
영역 5(잔기 900 내지 960)로서 동정한다.
구현예에서, Cas9 분자는 생물학적으로 활성인 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기 위한 충분한 추가적인 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1 내지 5를 포함한다. 구현예에서, 각각의 영역 1 내지 6은 독립적으로 본 명세서에 기재된 Cas9 분자의 대응하는 잔기, 예를 들어, 도 2로부터의 또는 도 5로부터의 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가진다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 1로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180(넘버링은 도 2에서 모티프 서열에 따르며; 도 2의 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%는 보존됨)과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖거나,
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans), 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 180과 적어도 1 개, 2 개, 5 개, 10 개 또는 20 개 아미노산만큼 상이하지만, 90 개, 80 개, 70 개, 60 개, 50 개, 40 개 또는 30 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 1 내지 180과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 1'으로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고(도 2에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120 내지 180과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개의 아미노산만큼 상이하지만, 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 120 내지 180과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 2로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360 내지 480과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고(도 2에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360 내지 480으로부터 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개 아미노산만큼이지만, 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 360 내지 480과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 3으로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 660 내지 720과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고(도 2에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 56%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 660 내지 720과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개 아미노산만큼 상이하지만, 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 660 내지 720과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 4로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 817 내지 900과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고(도 2에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 817 내지 900과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개 아미노산만큼 상이하지만, 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 817 내지 900과 동일하다.
구현예에서, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는 영역 5로서 지칭되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는:
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 900 내지 960과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖고(도 2에서 4 개의 Cas9 서열 내 잔기의 60%가 보존됨);
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스, 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 900 내지 960과 적어도 1 개, 2 개 또는 5 개 아미노산만큼 상이하지만, 35 개, 30 개, 25 개, 20 개 또는 10 개 이하의 아미노산만큼 상이하거나; 또는
스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 리스테리아 이노큐아, 네이세리아 메닌기티디스 또는 스타필로코커스 아우레우스의 Cas9의 아미노산 서열의 900 내지 960과 동일하다.
RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인
구현예에서, Cas9 분자는 HNH-유사 도메인 및 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, 절단 활성은 RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인에 의존적이다. Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 또는 eiCas9 분자는 다음의 도메인: RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자는 eaCas9 분자이고, eaCas9 분자는 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, 이하에 기재하는 RuvC-유사 도메인, 및/또는 HNH-유사 도메인, 예를 들어, 이하에 기재하는 HNH-유사 도메인을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자는 기준 Cas9 분자에 비해 RuvC-유사 도메인에서 및/또는 HNH-유사 도메인에서 하나 이상의 차이를 포함하는 eiCas9 분자이고, eiCas9 분자는 핵산을 절단하지 않거나, 또는, 예를 들어, 본 명세서에 기재한 바와 같은, 예를 들어, 절단 분석에서 야생형과 비교할 때 야생형보다 상당히 더 적은 효율로 절단되며, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정한 바와 같은 기준 Cas9 분자의 50, 25, 10 또는 1% 미만으로 절단된다.
RuvC-유사 도메인
구현예에서, RuvC-유사 도메인은 단일 가닥, 예를 들어, 표적 핵산 분자의 비-상보적 가닥을 절단한다. Cas9 분자는 하나 이상의 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개 이상의 RuvC-유사 도메인)을 포함할 수 있다. 구현예에서, RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5 개, 6 개, 7 개, 8 개의 아미노산이지만 길이로 20 개, 19 개, 18 개, 17 개, 16 개 또는 15 개 이하의 아미노산이다. 구현예에서, cas9 분자는 길이로 약 10 개 내지 20 개의 아미노산, 예를 들어, 약 15 개의 아미노산의 N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다.
N-말단의 RuvC-유사 도메인
일부 천연 유래 Cas9 분자는 하나 이상의 RuvC-유사 도메인을 포함하며, 절단은 N-말단의 RuvC-유사 도메인에 의존한다. 따라서, Cas9 분자는 N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 N-말단의 RuvC-유사 도메인은 이하에 기재한다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 I의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-X9(서열번호 8),
여기서,
X1은 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2는 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F(예를 들어, A 또는 N)으로부터 선택되고;
X4는 S, Y, N 및 F(예를 들어, S)로부터 선택되며;
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되고);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L(예를 들어, W)로부터 선택되며;
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되고(예를 들어, A 및 S로부터 선택되고);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되며(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되며); 및
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나, 또는, 예를 들어, T, V, I, L 및 Δ로부터 선택된다).
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 서열번호 8의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 절단 적격이다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 절단 부적격이다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 II의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다:
D-X1-G-X2-X3-S-X5-G-X6-X7-X8-X9 (서열번호 9),
여기서,
X1은 I, V, M, L 및 T로부터 선택되고(예를 들어, I, V 및 L로부터 선택되고);
X2는 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F(예를 들어, A 또는 N)으로부터 선택되고;
X5는 V, I, L, C, T 및 F로부터 선택되고(예를 들어, V, I 및 L로부터 선택되고);
X6은 W, F, V, Y, S 및 L(예를 들어, W)로부터 선택되며;
X7은 A, S, C, V 및 G로부터 선택되고(예를 들어, A 및 S로부터 선택되고);
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되며(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되며); 및
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나, 또는, 예를 들어, T, V, I, L 및 Δ로부터 선택된다).
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 서열번호 9의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 하기 식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-X2-X3-S-V-G-W-A-X8-X9 (서열번호 10),
여기서
X2는 T, I, V, S, N, Y, E 및 L로부터 선택되며(예를 들어, T, V 및 I로부터 선택되며);
X3은 N, S, G, A, D, T, R, M 및 F(예를 들어, A 또는 N)으로부터 선택되고;
X8은 V, I, L, A, M 및 H로부터 선택되며(예를 들어, V, I, M 및 L로부터 선택되며); 및
X9는 임의의 아미노산으로부터 선택되거나 또는 없다(예를 들어, T, V, I, L, Δ, F, S, A, Y, M 및 R로부터 선택되거나, 또는, 예를 들어, T, V, I, L 및 Δ로부터 선택된다).
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 서열번호 10의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 하기 식 III의 아미노산 서열을 포함한다:
D-I-G-T-N-S-V-G-W-A-V-X (서열번호 11),
여기서
X는 비극성 알킬 아미노산 또는 하이드록실 아미노산이고, 예를 들어, X는 V, I, L 및 T로부터 선택되며(예를 들어, eaCas9 분자는 도 2에 나타낸 N-말단의 RuvC-유사 도메인("Y"로서 도시함)을 포함할 수 있다).
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 서열번호 11의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어, 도 3a 또는 도 5에서 개시된 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 3a 또는 도 5에 나타낸 고도로 보존된 잔기 1 개, 2 개 또는 모두 3 개가 존재한다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어, 도 3b에 개시된 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 3b에 나타낸 고도로 보존된 잔기 1 개, 2 개, 3 개 또는 모두 4 개가 존재한다.
추가적인 RuvC-유사 도메인
N-말단의 RuvC-유사 도메인에 추가로, Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자는 하나 이상의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자는 2 개의 추가적인 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 길이로 적어도 5 개 아미노산이고, 예를 들어, 길이로 15 개 미만의 아미노산, 예를 들어, 길이로 5 개 내지 10 개 아미노산, 예를 들어, 길이로 8 개 아미노산이다.
추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
I-X1-X2-E-X3-A-R-E (서열번호 12), 여기서
X1은 V 또는 H이고,
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이며;
X3은 M 또는 T이다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
I-V-X2-E-M-A-R-E (서열번호 13), 여기서
X2는 I, L 또는 V(예를 들어, I 또는 V)이다(예를 들어, eaCas9 분자는 도 2 또는 도 5에 나타낸 추가적인 RuvC-유사 도메인("B"로서 도시함)을 포함할 수 있다).
추가적인 RuvC-유사 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
H-H-A-X1-D-A-X2-X3 (서열번호 14), 여기서
X1는 H 또는 L이고;
X2는 R 또 V이며;
X3은 E 또는 V이다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 아미노산 서열: H-H-A-H-D-A-Y-L (서열번호 15)을 포함한다.
구현예에서, 추가적인 RuvC-유사 도메인은 서열번호 13, 15, 12 또는 14의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, N-말단의 RuvC-유사 도메인에 측접하는 서열은 하기 식 V의 서열이다:
K-X1'-Y-X2'-X3'-X4'-Z-T-D-X9'-Y (서열번호 16),
여기서,
X1'은 K 및 P로부터 선택되고,
X2'은 V, L, I 및 F(예를 들어, V, I 및 L)로부터 선택되며;
X3'은 G, A 및 S(예를 들어, G)로부터 선택되고,
X4'은 L, I, V 및 F(예를 들어, L)로부터 선택되며;
X9'은 D, E, N 및 Q로부터 선택되고; 및
Z는, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 N-말단의 RuvC-유사 도메인이다.
HNH-유사 도메인
구현예에서, HNH-유사 도메인은 단일 가닥의 상보적 도메인, 예를 들어, 이중 가닥의 상보적 가닥을 절단한다. 구현예에서, HNH-유사 도메인은 길이로 적어도 15 개, 20 개, 25 개의 아미노산이지만, 길이로 40 개, 35 개 또는 30 개 이하의 아미노산, 예를 들어, 길이로 20 개 내지 35 개 아미노산, 예를 들어, 길이로 25 개 내지 30 개의 아미노산이다. 예시적인 HNH-유사 도메인은 이하에 기재한다.
구현예에서, eaCas9 분자는 식 VI의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-N-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-N(서열번호 17), 여기서
X1은 D, E, Q 및 N(예를 들어, D 및 E)로부터 선택되고;
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L(예를 들어, A, I 및 V)로부터 선택되며;
X5는 V, Y, I, L, F 및 W(예를 들어, V, I 및 L)로부터 선택되고;
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X7은 S, A, D, T 및 K (예를 들어, S 및 A)로부터 선택되고;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q(예를 들어, F)로부터 선택되며;
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되고;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되며;
X11은 D, S, N, R, L 및 T(예를 들어, D)로부터 선택되고;
X12는 D, N 및 S로부터 선택되며;
X13은 S, A, T, G 및 R(예를 들어, S)로부터 선택되고;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H(예를 들어, I, L 및 F)로부터 선택되며;
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X16은 K, L, R, M, T 및 F(예를 들어, L, R 및 K)로부터 선택되며;
X17은 V, L, I, A 및 T로부터 선택되고;
X18은 L, I, V 및 A(예를 들어, L 및 I)로부터 선택되며;
X19는 T, V, C, E, S 및 (예를 들어, T 및 V)로부터 선택되고;
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되며;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되고;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되며; 및
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 17의 서열과 적어도 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 적격이다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 절단 부적격이다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-X2-X3-H-X4-X5-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-X19-X20-X21-X22-X23-N (서열번호 18),
여기서,
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X2는 L, I, R, Q, V, M 및 K로부터 선택되며;
X3은 D 및 E로부터 선택되고;
X4는 I, V, T, A 및 L(예를 들어, A, I 및 V)로부터 선택되며;
X5는 V, Y, I, L, F 및 W(예를 들어, V, I 및 L)로부터 선택되고;
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되며;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q(예를 들어, F)로부터 선택되고;
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되며;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되고;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H(예를 들어, I, L 및 F)로부터 선택되며;
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X19는 T, V, C, E, S 및 A(예를 들어, T 및 V)로부터 선택되고;
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되며;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되고;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되며; 및
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 18의 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 VII의 아미노산 서열을 포함하는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
X1-V-X3-H-I-V-P-X6-S-X8-X9-X10-D-D-S-X14-X15-N-K-V-L-T-X20-X21-X22-X23-N(서열번호 19),
여기서
X1은 D 및 E로부터 선택되고;
X3은 D 및 E로부터 선택되며;
X6은 Q, H, R, K, Y, I, L, F 및 W로부터 선택되고;
X8은 F, L, V, K, Y, M, I, R, A, E, D 및 Q(예를 들어, F)로부터 선택되고;
X9는 L, R, T, I, V, S, C, Y, K, F 및 G로부터 선택되며;
X10은 K, Q, Y, T, F, L, W, M, A, E, G 및 S로부터 선택되고;
X14는 I, L, F, S, R, Y, Q, W, D, K 및 H(예를 들어, I, L 및 F)로부터 선택되며;
X15는 D, S, I, N, E, A, H, F, L, Q, M, G, Y 및 V로부터 선택되고;
X20은 R, F, T, W, E, L, N, C, K, V, S, Q, I, Y, H 및 A로부터 선택되며;
X21은 S, P, R, K, N, A, H, Q, G 및 L로부터 선택되고;
X22는 D, G, T, N, S, K, A, I, E, L, Q, R 및 Y로부터 선택되며; 및
X23은 K, V, A, E, Y, I, C, L, S, T, G, K, M, D 및 F로부터 선택된다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 19의 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 VIII의 아미노산 서열을 갖는 HNH-유사 도메인을 포함한다:
D-X2-D-H-I-X5-P-Q-X7-F-X9-X10-D-X12-S-I-D-N-X16-V-L-X19-X20-S-X22-X23-N (서열번호20),
여기서
X2는 I 및 V로부터 선택되고;
X5는 I 및 V로부터 선택되며;
X7은 A 및 S로부터 선택되고;
X9는 I 및 L로부터 선택되며;
X10은 K 및 T로부터 선택되고;
X12는 D 및 N으로부터 선택되며;
X16은 R, K 및 L로부터 선택되고; X19는 T 및 V로부터 선택되며;
X20은 S 및 R로부터 선택되고;
X22는 K, D 및 A로부터 선택되며; 및
X23은 E, K, G 및 N로부터 선택된다(예를 들어, eaCas9 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 HNH-유사 도메인을 포함할 수 있다).
구현예에서, HNH-유사 도메인은 서열번호 20의 서열과 1 개의 (그러나 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하) 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, eaCas9 분자는 하기 식 IX의 아미노산 서열을 포함한다:
L-Y-Y-L-Q-N-G-X1'-D-M-Y-X2'-X3'-X4'-X5'-L-D-I―X6'-X7'-L-S-X8'-Y-Z-N-R-X9'-K-X10'-D-X11'-V-P (서열번호21),
여기서,
X1'는 K 및 R로부터 선택되고;
X2'는 V 및 T로부터 선택되며;
X3'는 G 및 D로부터 선택되고;
X4'는 E, Q 및 D로부터 선택되며;
X5'는 E 및 D로부터 선택되고;
X6'는 D, N 및 H로부터 선택되며;
X7'는 Y, R 및 N으로부터 선택되며;
X8'는 Q, D 및 N으로부터 선택되고; X9'는 G 및 E로부터 선택되며;
X10'는 S 및 G로부터 선택되고;
X11'는 D 및 N으로부터 선택되며;
Z은, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 HNH-유사 도메인이다.
구현예에서, eaCas9 분자는 서열번호 21의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, HNH-유사 도메인은 본 명세서에, 예를 들어, 도 4a 또는 도 5에 개시된 HNH-유사 도메인의 서열과, 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다.
구현예에서, 본 명세서에, 예를 들어, 도 4b에 개시된 HNH-유사 도메인의 서열과 1 개의 잔기만큼 상이하지만, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개 이하의 잔기만큼 상이하다. 구현예에서, 도 4b에 나타낸 고도로 보존된 잔기 1 개, 2 개 또는 모두 3 개가 존재한다.
변경된 Cas9 분자
천연 유래 Cas9 분자는 틈내기효소 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 헬리카제 활성; gRNA 분자와 기능적으로 결합하는 능력; 및 핵산 상의 부위를 표적화하는(예를 들어, 국소화하는) 능력(예를 들어, PAM 인식 및 특이성)을 포함하는 다수의 특성을 가진다. 구현예에서, Cas9 분자는 이들 특성의 모두 또는 서브세트를 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, Cas9 분자는 gRNA 분자와 상호작용하고, gRNA 분자와 협력하여 핵산 내 부위를 국소화하는 능력을 가진다. 다른 활성, 예를 들어, PAM 특이성, 절단 활성 또는 헬리카제 활성은 Cas9 분자에서 매우 광범위하게 변할 수 있다.
목적으로 하는 특성을 지니는 Cas9 분자는 다수의 방법으로, 예를 들어, 목적으로 하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자를 제공하기 위한 모 Cas9 분자, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자의 변경에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 모 Cas9 분자에 대한 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함한다. 구현예에서, Cas9 분자는 하나 이상의 돌연변이 또는 차이를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 기준 Cas9 분자에 비해 적어도 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 40 개 또는 50 개의 돌연변이를 포함하지만 200 개, 100 개 또는 80 개 이하의 돌연변이를 포함할 수 있다.
구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이는 Cas9 활성, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 갖지 않는다. 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 활성에 대해 실질적인 효과를 가진다. 구현예에서, 예시적인 활성은 PAM 특이성, 절단 활성 및 헬리카제 활성 중 하나 이상을 포함한다. 돌연변이(들)는 예를 들어, 하나 이상의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, N-말단의 RuvC-유사 도메인; HNH-유사 도메인; RuvC-유사 도메인 및 HNH-유사 도메인 외부의 영역에 존재할 수 있다. 구현예에서, 돌연변이(들)는 N-말단의 RuvC-유사 도메인에 존재한다. 구현예에서, 돌연변이(들)는 iHNH-유사 도메인에 존재한다. 구현예에서, 돌연변이는 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 HNH-유사 도메인 둘 다에 존재한다.
특정 서열, 예를 들어, 치환이 하나 이상의 활성, 예컨대 표적화 활성, 절단 활성 등에 영향을 미칠 수 있든 아니든, 예를 들어, 돌연변이가 보존적인지의 여부를 평가함으로써 또는 부문 III에 기재된 방법에 의해 평가 또는 예측될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자와 관련하여 사용된 바와 같은 "비필수" 아미노산 잔기는 Cas9 활성(예를 들어, 절단 활성)을 없애는 일 없이 또는 더 바람직하게는 실질적으로 변경시키는 일 없이 Cas9 분자, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기를 바꾸는 것은 활성(예를 들어, 절단 활성)의 실질적인 손실을 초래한다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 피오게네스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자이고, 도 2에 개시한 공통 서열 또는 서열번호 7에서 "-"로 표시한 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)에서 스트렙토코커스 피오게네스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다). 구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 eiCas9 분자이되, 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 피오게네스의 고정된 아미노산 잔기 중 하나 이상(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개 아미노산 잔기)은 돌연변이된다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 서열을 포함하며, 이때:
도 2에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2에 개시된 공통 서열 내 고정 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하만큼 상이하고;
도 2에 개시된 공통 서열에서 "*"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 "*" 잔기와 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하만큼 상이하며;
도 2에 개시된 공통 서열에서 "-"에 의해 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자의 대응하는 서열로부터의 잔기로부터의 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하만큼 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코쿠스 써모필루스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자이고, 도 2에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개 아미노산 잔기)에서 스트렙토코쿠스 써모필루스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다). 구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 eiCas9 분자이되, 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코쿠스 써모필루스의 고정된 아미노산 잔기 중 하나 이상(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)은 돌연변이된다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 서열을 포함하며, 이때:
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하만큼 상이하고;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "*"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하만큼 상이하며;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "-"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하만큼 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 뮤탄스의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자이고, 도 2에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개 아미노산 잔기)에서 스트렙토코커스 뮤탄스의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다). 구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 eiCas9 분자이되, 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 스트렙토코커스 뮤탄스의 고정된 아미노산 잔기 중 하나 이상(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)은 돌연변이된다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 서열을 포함하며, 이때:
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하만큼 상이하고;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "*"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하만큼 상이하며;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "-"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하만큼 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 도 2에 개시된 공통 서열에 나타낸 리스테리아 이노큐아의 고정된 아미노산 잔기를 포함하는 eaCas9 분자이고, 도 2에 개시된 공통 서열에서 "-"로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개 아미노산 잔기)에서 리스테리아 이노큐아의 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다(예를 들어, 치환을 가진다). 구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 eiCas9 분자이되, 도 2에 개시된 공통 서열에서 나타낸 리스테리아 이노큐아의 고정된 아미노산 잔기 중 하나 이상(예를 들어, 2 개, 3 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 30 개, 50 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 200 개의 아미노산 잔기)은 돌연변이된다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 서열을 포함하며, 이때:
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에 대응하는 서열은 도 2에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이하만큼 상이하고;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "*"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 리스테리아 이노큐아 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "*" 잔기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이하만큼 상이하며;
도 2에 개시된 공통 서열에서 고정된 서열에서 "-"로 식별되는 잔기에 대응하는 서열은 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 리스테리아 이노큐아 Cas9 분자의 대응하는 서열과 "-" 잔기의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55% 또는 60% 이하만큼 상이하다.
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자는, 예를 들어, 2 이상의 상이한 Cas9 분자들의, 예를 들어, 상이한 종의 2 이상의 천연 유래 Cas9 분자의 융합일 수 있다. 예를 들어, 하나의 종의 천연 유래 Cas9 분자의 단편은 제2 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다. 예로서, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9의 단편은 HNH-유사 도메인을 포함하는 스트렙토코커스 피오게네스 종이 아닌 종(예를 들어, 스트렙토코쿠스 써모필루스)의 Cas9의 단편에 융합될 수 있다.
변경된 PAM 인식을 지니거나 또는 PAM 인식이 없는 Cas9 분자
천연 유래 Cas9 분자는 구체적 PAM 서열, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 스타필로코커스 아우레우스 및 네이세리아 메닌기티디스에 대해 상기 기재한 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자는 천연 유래 Cas9 분자와 동일한 PAM 특이성을 가진다. 구현예에서, Cas9 분자는 천연 유래 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성, 또는 그것이 가장 가까운 서열 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성을 가진다. 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자는, 예를 들어, PAM 인식을 변경시키도록, 예를 들어, Cas9 분자가 표적을 벗어난 부위를 감소시키고/시키거나 특이성을 개선시키는 것을 인식하는 PMA 서열을 변경시키거나; 또는 PAM 인식 필요를 제거하도록, 변경될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자는, 예를 들어, PAM 인식 서열의 길이를 증가시키고/시키거나 표적을 벗어난 부위를 감소시키고 특이성을 증가시키기 위한 고수준의 동일성으로 Cas9 특이성을 개선시키도록 변경될 수 있다. 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 길이로 적어도 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 또는 15 개의 아미노산이다. 상이한 PAM 서열을 인식하고/하거나 감소된 표적을 벗어난 활성을 갖는 Cas9 분자는 방향 진화(directed evolution)를 이용하여 생성될 수 있다. Cas9 분자의 방향 진화를 위해 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은, 예를 들어, 문헌[Esvelt et al., Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다. 후보 Cas9 분자는, 예를 들어, 부문 III에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
비절단 및 변형-절단 Cas9 분자
구현예에서, Cas9 분자는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어, 가장 가까운 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자는 다음과 같이 천연 유래 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자와 상이할 수 있다: 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해 감소 또는 증가된 이중 가닥 파손의 절단을 조절하는 그의 능력(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자)에 비해, 예를 들어, 감소 또는 증가된, 핵산의 단일 가닥, 예를 들어, 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 상보적 가닥의 절단을 조절하는 그의 능력(틈내기효소 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력이 제거될 수 있다.
변형된 절단 eaCas9 분자
구현예에서, eaCas9 분자는 다음의 활성 중 하나 이상을 포함한다: N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 도메인과 관련된 절단 활성 및 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성.
구현예에서, eaCas9 분자는 활성, 또는 절단 적격, HNH-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 HNH-유사 도메인, 예를 들어, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21) 및 불활성, 또는 절단 부적격, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 예시적인 불활성, 또는 절단 부적격 N-말단의 RuvC-유사 도메인은 N-말단의 RuvC-유사 도메인의 아스파르트산, 예를 들어, N-말단의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 9에서 아스파르트산 또는 서열번호 7의 위치 10에서 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다. 구현예에서, eaCas9는 N-말단의 RuvC-유사 도메인에서 야생형과 상이하며, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 상당히 더 적은 효율로, 예를 들어, 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 분자일 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
구현예에서, eaCas9 분자는 불활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인 및 활성, 또는 절단 적격, N-말단의 RuvC-유사 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 HNH-유사 도메인, 예를 들어, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15)을 포함한다. 예시적인 불활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 HNH-유사 도메인에서 히스티딘, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 856에서 히스티딘 중 하나 이상에서 돌연변이, 예를 들어(알라닌으로 치환될 수 있음); 및 HNH-유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 870에서 및/또는 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 879에서 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음)을 가질 수 있다. 구현예에서, eaCas9는 HNH-유사 도메인에서 야생형과 상이하고, 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 상당히 더 적은 효율, 예를 들어, 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다.
비절단 eiCas9 분자
구현예에서, 변경된 Cas9 분자는 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자 중 하나)를 절단하지 않는 또는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 분석에 의해 측정하여 상당히 더 적은 효율, 예를 들어, 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만으로 핵산 분자를 절단하는 eiCas9 분자이다. 기준 Cas9 분자는 천연 유래 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 천연 유래 Cas9 분자, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자에 의할 수 있다. 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 천연 유래 Cas9 분자이다. 구현예에서, eiCas9 분자는 실질적인 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 결여한다.
구현예에서, eiCas9 분자는 불활성, 또는 절단 부적격, N-말단의 RuvC-유사 도메인을 포함한다. 예시적인 불활성, 또는 절단 부적격 N-말단의 RuvC-유사 도메인은 N-말단의 RuvC-유사 도메인에서 아스파르트산, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 9에서 아스파르트산 또는 서열번호 7의 위치 10에서 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있으며, 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다.
구현예에서, eiCas9 분자는 불활성, 또는 절단 부적격, HNH 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 HNH-유사 도메인, 예를 들어, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15)을 포함한다. 예시적인 불활성, 또는 절단 부적격 HNH-유사 도메인은 HNH-유사 도메인에서 히스티딘, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 856에서 히스티딘 중 하나 이상에서 돌연변이, 예를 들어(알라닌으로 치환될 수 있음); 및 HNH-유사 도메인에서 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 870에서 및/또는 도 2에 개시된 공통 서열의 위치 879에서 아스파라긴(예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있음)을 가질 수 있다.
촉매적 불활성 Cas9 분자는 전사 리프레서와 융합될 수 있다. eiCas9 융합 단백질은 gRNA와 복합체화되고, gRNA의 표적화 도메인에 의해 구체화된 DNA 서열에 국소화되지만, eaCas9와 달리, 이는 표적 DNA를 절단하지 않을 것이다. 효과기 도메인, 전사 억제 도메인의 eiCas9에 대한 융합은 gRNA에 의해 구체화된 임의의 DNA 부위에 대한 효과기의 동원(recruitment)을 가능하게 한다. 유전자의 프로모터 영역에 대한 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질의 부위 특이적 표적화는 전사 활성화를 저해하기 위해 프로모터 영역, 전사 인자(예를 들어, 전사 활성체) 및/또는 전사 인핸서에 대한 RNA 중합효소 결합을 차단할 수 있다. 대안적으로, 유전자의 프로모터 영역에 대해 전사 리프레서에 대한 eiCas9-융합의 부위 특이적 표적화는 전사 활성화를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
eiCas9 분자에 융합될 수 있는 전사 리프레서 또는 전사 리프레서 도메인은 크루펠(kruppel) 관련 박스(KRAB 또는 SKD), Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID) 또는 ERF 리프레서 도메인(ERD)을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, eiCas9 분자는 염색질을 변형시키는 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, eiCas9 분자는 이질염색질 단백질 1(HP1), 히스톤 리신 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, SUV39H1, SUV39H2, G9A, ESET/SETDB1, Pr-SET7/8, SUV4-20H1, RIZ1), 히스톤 리신 데메틸레이트(예를 들어, LSD1/BHC110, SpLsd1/Sw, 1/Saf110, Su(변종)3-3, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, Rph1, JARID1A/RBP2, JAR1D1B/PLU-1, JAR1D1C/SMCX, JARID1D/SMCY, Lid, Jhn2, Jmj2), 히스톤 리신 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, Rpd3, Hos1, Cir6, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, Hda1, Cir3, SIRT1, SIRT2, Sir2, Hst1, Hst2, Hst3, Hst4, HDAC11) 및 DNA 메틸라제(DNMT1, DNMT2a/DMNT3b, MET1)에 융합될 수 있다. eiCas9-염색질 변형 분자 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 염색질 상태를 변형시키는데 사용될 수 있다.
이종성 서열(예를 들어, 전사 리프레서 도메인)은 eiCas9 단백질의 N- 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 대안의 구현예에서, 이종성 서열(예를 들어, 전사 리프레서 도메인)은 eiCas9 단백질의 내부 부분(즉, N-말단 또는 C-말단 이외의 부분)에 융합될 수 있다.
표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은, 예를 들어, 부문 III에서 본 명세서에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다. eaCas9 또는 eiCas9 중 하나인 Cas9 분자의 활성은 단독으로 또는 gRNA 분자와의 복합체에서 또한 유전자 발현 분석 및 염색질-기반 분석, 예를 들어, 염색질 면역침전(ChiP) 및 염색질 생체내 분석(CiA)을 포함하는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
Cas9 분자를 암호화하는 핵산
Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자를 암호화하는 핵산이 본 명세서에 제공된다.
Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821]에 기재되어 있다. 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자를 암호화하는 다른 예시적인 핵산은 도 6에서 나타낸다.
구현예에서, Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는, 예를 들어, 부문 X에 기재된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 구현예에서, Cas9 mRNA는 다음의 특성 중 하나 이상, 예를 들어, 모두를 가지며: 이는 5-메틸시티딘 및/또는 슈도유리딘으로 캡핑, 폴리아데닐화, 치환된다.
추가로 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화, 예를 들어, 적어도 하나의 비공통 코돈일 수 있거나, 또는 덜 공통인 코돈은 공통 코돈에 의해 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 최적화된 메신저 mRNA의 합성을 지시할 수 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 포유류 발현 시스템에서 발현에 대해 최적화된다.
추가로 또는 대안적으로, Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence: NLS)을 포함할 수 있다. 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있다.
이하에서 스트렙토코커스 피오게네스의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 제공된다.
이하에서 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자의 대응하는 아미노산 서열이 제공된다.
이하에서 네이세리아 메닌기티디스의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이 제공된다.
이하에서 네이세리아 메닌기티디스 Cas9 분자의 대응하는 아미노산 서열이 제공된다.
이하에서 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자의 아미노산 서열이 제공된다.
임의의 상기 Cas9 서열이 C-말단에서 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합된다면(예를 들어, C-말단에서 전사 리프레스와 융합된 eiCas9), 정지 코돈이 제거될 것이라는 것이 이해된다.
다른 Cas 분자
다양한 유형의 Cas 분자가 본 명세서에 개시된 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 구현예에서, 유형 II Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, 유형 I 또는 유형 III Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)은, 예를 들어, 문헌[Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60 및 Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기재되어 있으며, 이들 참고문헌 둘 다의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 포함된다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)를 또한 표 II-1에 나타낸다.
III. 후보 분자의 기능성 분석
후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어, Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
결합 및 절단 분석: Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성의 시험
표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 플라스미드 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, 합성 또는 시험관내 전사 gRNA 분자를 95℃로 가열함하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 반응 전에 사전 어닐링한다. 천연 또는 제한 분해-선형화 플라스미드 DNA(300 ng (약 8 nM))를 10 mM MgCl2와 함께 또는 이것 없이 Cas9 플라스미드 절단 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) 중에서 정제된 Cas9 단백질 분자(50 nM 내지 500 nM) 및 gRNA(50 nM 내지 500 nM, 1:1)와 함께 37℃에서 60 분 동안 인큐베이션시킨다. 5X DNA 장입 버퍼(30% 글리세롤, 1.2% SDS, 250 mM EDTA)를 이용하여 반응을 중단시키고 나서, 0.8 또는 1% 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 브롬화에티듐 염색에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 Cas9 분자가 DNA 가닥을 둘 다, 또는 두 가닥 중 단지 하나를 절단하는지의 여부를 나타낸다. 예를 들어, 선형 DNA 산물은 DNA 가닥 둘 다의 절단을 나타낸다. 틈 개방 원형 산물은 두 가닥 중 하나만이 절단된다는 것을 나타낸다.
대안적으로, 표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 능력은 올리고뉴클레오타이드 DNA 절단 분석에서 평가될 수 있다. 이 분석에서, DNA 올리고뉴클레오타이드(10 pmol)를 50 ㎕ 반응물 중에서 37℃에서 30 분 동안 1X T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 반응 버퍼 중의 5 단위 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 약 3 pmol 내지 6 pmol(약 20 mCi 내지 40 mCi)[γ-32P]-ATP와 함께 인큐베이션시킴으로써 방사성 표지한다. 열 불활성화 후에(65℃에서 20 분 동안), 혼입되지 않은 표지를 제거하기 위해 칼럼을 통해 반응물을 정제한다. 95℃에서 3 분 동안 등몰량의 비표지 상보성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표지된 올리고뉴클레오타이드를 어닐링한 후에, 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 이중가닥 기질(100 nM)을 생성한다. 절단 분석을 위해, gRNA 분자는 95℃로 30 분 동안 가열함으로써 어닐링한 후에 실온으로 서서히 냉각시킨다. Cas9(500 nM 최종 농도)는 총 용적 9 ㎕ 중에서 절단 분석 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% 글리세롤) 중에서 어닐링된 gRNA 분자(500 nM)와 함께 사전 인큐베이션시킨다. 1 ㎕ 표적 DNA(10 nM)의 첨가에 의해 반응을 개시하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨다. 20 ㎕의 장입 염료(5 mM EDTA, 0.025% SDS, 포름아미드 중에서 5% 글리세롤)의 첨가에 의해 반응을 퀀칭시키고, 95℃로 5 분 동안 가열하였다. 7 M 유레아를 함유하는 12% 변성 폴리아클릴아미드 겔 상에서 절단 산물을 분해하고, 인광 영상화에 의해 시각화한다. 얻어진 절단 산물은 상보적 가닥, 비상보적 가닥 또는 둘 다가 절단되는지의 여부를 나타낸다.
이들 분석 중 하나 또는 둘 다는 후보 gRNA 분자 또는 후보 Cas9 분자의 적합성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
결합 분석: 표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합 시험
표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합을 평가하는 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기재되어 있다.
예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)에서, 표적 DNA 이중가닥은 탈이온수 중에서 각각의 가닥(10 nmol)을 혼합하고, 95℃로 3 분 동안 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 형성된다. 모든 DNA를 8% 천연 겔 함유 1X TBE 상에서 정제한다. DNA 밴드를 UV 투영법에 의해 시각화한 다음, 절단하고, DEPC-처리 H2O 중에 겔 조각을 침지시킴으로써 용리시킨다. 용리된 DNA는 에탄올 침전되고, DEPC-처리된 H2O 중에 용해된다. DNA 샘플을 37℃에서 30 분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 이용하여 [γ-32P]-ATP로 5' 말단 표지한다. 폴리뉴클레오타이드 키나제를 65℃에서 20 분 동안 열 변성시키고, 칼럼을 이용하여 비혼입 방사성 표지를 제거한다. 총 용적 10 ㎕로 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT 및 10% 글리세롤을 함유하는 버퍼 중에서 결합 분석을 수행한다. Cas9 단백질 분자는 등몰량의 사전 어닐링된 gRNA 분자에 의해 프로그래밍되고, 100 pM 내지 1 μM로 적정된다. 방사성 표지된 DNA를 최종 농도 20 pM로 첨가한다. 샘플을 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 4℃에서 1X TBE 및 5 mM MgCl2를 함유하는 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해한다. 겔은 건조되고, DNA는 인광 영상화에 의해 시각화된다.
IV. 주형 핵산(게놈 편집 접근)
용어 "주형 핵산"과 "스왑 핵산"은 상호 호환적으로 사용되고, 이 문헌 및 그의 선행 문헌에서 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 본 명세서에서 논의되는 접근 중 하나를 이용하여 수정될 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 주형 핵산을 이용하여 상동성 지향 수선(HDR)에 의해 수정된다(부문 IV.1 참조). 구현예에서, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로의 돌연변이는 주형 핵산을 이용하여 비상동성 말단 결합(NHEJ) 수선에 의해 수정된다(부문 IV.2 참조).
IV.1 HDR 수선 및 주형 핵산
본 명세서에 기재된 바와 같은, 뉴클레아제-유도 상동성 지향 수선(HDR)은 표적 서열을 변경시키고 게놈 내 돌연변이를 수정(예를 들어, 수선 또는 편집)하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속되지 않고, 표적 서열의 변경은 도너 주형 또는 주형 핵산에 의한 상동성 지향 수선(HDR)에 의해 일어 난다고 믿어진다. 예를 들어, 도너 주형 또는 주형 핵산은 표적 서열의 변경을 제공한다. 플라스미드 도너는 상동성 재조합을 위한 주형으로서 사용될 수 있다는 것이 상정된다. 추가로, 단일 가닥 도너 주형은 표적 서열과 도너 주형 사이의 상동성 지향 수선(예를 들어, 단일 가닥 어닐링)의 대안의 방법에 의해 표적 서열의 변경을 위한 주형으로서 사용될 수 있다는 것이 추가로 상정된다. 표적 서열의 도너 주형-달성 변경은 Cas9 분자에 의한 절단에 의존한다. Cas9에 의한 절단은 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손을 포함할 수 있다.
구현예에서, 돌연변이는 단일 이중-가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손 중 하나에 의해 수정될 수 있다. 구현예에서, 돌연변이는 (1) 단일 이중-가닥 파손, (2) 2 개의 단일 가닥 파손, (3) 표적 서열의 각각의 측면 상에서 일어나는 파손을 지니는 2 개의 이중 가닥 파손, (4) 표적 서열의 각각의 측면 상에서 일어나는 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손에 의한 하나의 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 (5) 표적 서열의 각각의 측면 상에서 일어나는 단일 가닥 파손 쌍에 의한 4 개의 단일 가닥 파손에 의해 수정될 수 있다.
이중 가닥 매개 수정
구현예에서, 이중 가닥 절단은 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, 야생형 Cas9에 의해 달성된다. 이러한 구현예는 단일 gRNA만을 필요로 한다.
단일 가닥 파손 매개 수정
구현예에서, 2 개의 단일 가닥 파손, 또는 틈내기는 틈내기효소 활성, 예를 들어, HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자에 의해 달성된다. 이러한 구현예는 2 개의 gRNA, 즉, 각각의 단일 가닥 파손의 배치를 위한 것을 필요로 한다. 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA에 혼성화하지만 gRNA에 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥은 아닌 가닥을 절단한다. 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA에 혼성화하는 가닥은 절단하지 않고, 오히려 gRNA에 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥을 절단한다.
구현예에서, 틈내기효소는 HNH 활성, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 가진다. D10A는 RuvC를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 틈내기효소는 (단지) HNH 활성을 가지고, gRNA에 혼성화하는 가닥(예를 들어, 가닥 상 NGG PAM을 갖지 않는 상보적 가닥) 상에서 절단될 것이다. 구현예에서, H840, 예를 들어, H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 틈내기 효소로서 사용될 수 있다. H840A는 HNH를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 틈내기효소는 (단지) RuvC 활성을 가지고, 비-상보적 가닥(예를 들어, NGG PAM을 갖고, 이의 서열이 gRNA와 동일한 가닥) 상에서 절단된다.
구현예에서, 틈내기효소 및 2 개의 gRNA는 2 개의 단일 가닥 틈에 위치되도록 사용되며, 하나의 틈은 표적 핵산의 + 가닥 상에 있고, 하나의 틈은 표적 핵산의 - 가닥 상에 있다. PAM은 표면상으로 접해있다. gRNA는 약 0 개 내지 50 개, 0 개 내지 100 개, 또는 0 개 내지 200 개의 뉴클레오타이드에 의해, 이로부터 분리되도록 gRNA가 선택될 수 있다. 구현예에서, 두 gRNA의 표적화 도메인에 상보성인 표적 서열 간에는 중복이 없다. 구현예에서, gRNA는 중복되지 않으며, 50 개, 100 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드만큼 분리된다. 구현예에서, 두 gRNA의 사용은, 예를 들어, 표적을 벗어난 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수 있다(Ran et al., Cell 2013).
구현예에서, HDR을 유도하기 위해 단일 틈이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 주어진 절단 부위에서 HR 대 NHEJ의 비를 증가시키기 위해 단일 틈이 사용될 수 있다는 것이 상정된다.
표적 위치에 대한 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손의 배치
가닥 중 하나에서 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손은 수정이 일어나도록 표적 위치에 충분히 가까워야 한다. 구현예에서, 거리는 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 350 개 또는 400 개 이하의 뉴클레오타이드이다. 이론에 의해 구속되지 않지만, 파손이 말단 절제 동안 엑소뉴클레아제-매개를 받는 영역 내에 있도록 파손은 표적 위치에 충분히 가까워야 한다고 믿어진다. 표적 위치와 파손 사이의 거리가 너무 크다면, 돌연변이는 말단 절제에 포함되지 않을 수도 있고, 따라서, 도너 서열은 말단 제한 영역 내에서 서열을 수정하기 위해서만 사용될 수 있기 때문에 수정되지 않을 수도 있다.
구현예에서, gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA) 및 Cas9 뉴클레아제가 HDR-매개 수정을 유도할 목적을 위해 이중 가닥 파손을 유도하는 경우, 절단 부위는 표적 위치에서 0 bp 내지 200 bp(예를 들어, 0 bp 내지 175 bp, 0 bp 내지 150 bp, 0 bp 내지 125 bp, 0 bp 내지 100 bp, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 200 bp, 25 bp 내지 175 bp, 25 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 125 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 200 bp, 50 bp 내지 175 bp, 50 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 125 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp, 75 bp 내지 200 bp, 75 bp 내지 175 bp, 75 bp 내지 150 bp, 75 bp 내지 125 bp, 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치에서 0 bp 내지 100 bp(예를 들어, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp 또는 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다.
구현예에서, Cas9 틈내기효소와 복합체화를 이루는 2 개의 gRNA(독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA)가 HDR-매개 수정을 유도할 목적을 위해 2 개의 단일 가닥 파손을 유도하는 경우, 더 가까운 틈은 표적 위치로부터 0 bp 내지 200 bp(예를 들어, 0 bp 내지 175 bp, 0 bp 내지 150 bp, 0 bp 내지 125 bp, 0 bp 내지 100 bp, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 200 bp, 25 bp 내지 175 bp, 25 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 125 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 200 bp, 50 bp 내지 175 bp, 50 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 125 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp, 75 bp 내지 200 bp, 75 bp 내지 175 bp, 75 bp 내지 150 bp, 75 bp 내지 125 bp, 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있고, 2 개의 틈은 이상적으로는 서로 25 bp 내지 55 bp 내에(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 30 bp 내지 45 bp, 30 bp 내지 40 bp, 30 bp 내지 35 bp, 35 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 35 bp 내지 40 bp, 40 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 45 bp) 있고 서로로부터 100 bp 이하만큼 떨어질 것이다(예를 들어, 서로로부터 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 10 bp 또는 5 bp 이하만큼 떨어짐). 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp 내지 100 bp(예를 들어, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp 또는 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다.
일 구현예에서, 2 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측 상에 이중 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 대안의 구현예에서, 3 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, Cas9 뉴클레아제와 하나의 gRNA 복합체) 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 틈내기효소와 2 개의 gRNA 복합체)을 위치시키도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 표적 위치의 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 표적 위치의 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 다른 구현예에서, 4 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 두 쌍(즉, Cas9 틈내기효소와의 2 개의 gRNA 복합체의 두 쌍)을 생성하도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 표적 위치의 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 표적 위치의 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 두 단일 가닥 틈 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하) 내에 있다. 틈내기효소가 사용될 때, 쌍에서 두 틈은 서로의 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
일 구현예에서, 두 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측 상에 이중 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 대안의 구현예에서, 3 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, cas9 뉴클레아제와의 하나의 gRNA 복합체) 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 틈내기효소와의 2 개의 gRNA 복합체의 두 쌍)을 위치시키도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이의 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이의 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 다른 구현예에서, 4 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측명 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 두 쌍(즉, Cas9 틈내기효소와의 두 gRNA 복합체)을 생성하도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 본 명세성 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이의 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이의 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 두 단일 가닥 틈 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp (예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하) 내에 있을 것이다. 틈내기효소가 사용될 때, 쌍에서 두 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
상동성 암(arm)의 길이
상동성 암은 말단 절제가 적어도, 예를 들어, 도너 주형 내에서 절제된 단일 가닥 돌출부가 상동성 영역을 발견하게 하도록 일어날 수 있는 영역만큼 멀게 연장되어야 한다. 전체 길이는 플라스미드 크기 또는 바이러스 패키징 제한과 같은 매개변수에 의해 제한될 수 있었다. 구현예에서, 상동성 암은 반복된 구성요소, 예를 들어, ALU 반복부, LINE 반복부 내로 연장되지 않는다.
예시적인 상동성 암 길이는 적어도 50 개, 100 개, 250 개, 500 개, 750 개 또는 1000 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적 위치는 Cas9 분자-의존적 과정에 의해 변형되는 표적 핵산(예를 들어, 염색체) 상의 부위를 지칭한다. 예를 들어, 표적 위치는 표적 핵산의 변형된 Cas9 분자 절단 및 주형 핵산 지향 변형, 예를 들어, 표적 위치의 수정일 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되는 표적 핵산 상의 두 뉴클레오타이드, 예를 들어, 인접한 뉴클레오타이드 사이의 부위일 수 있다. 표적 위치는 변경된, 예를 들어, 주형 핵산에 의해 보정되는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내이다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열)의 상류 또는 하류이다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서 주형 핵산은 표적 위치 구조를 변경시키는 Cas9 분자 및 gRNA 분자와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 용어 "주형 핵산"은 선행 문헌에서 그리고 본 명세서에서 사용되는 용어 "스왑" 핵산과 동의어이다. 용어 "주형 핵산" 및 "스왑 핵산"은 정확히 동일한 의미를 가지며, 상호호환적으로 사용될 수 있다. 구현예에서, 표적 핵산은 통상적으로 절단 부위(들)에서 또는 근처에서 주형 핵산 서열의 일부 또는 모두를 갖도록 변형된다. 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥이다. 대안의 구현예에서, 주형 핵산은 이중 가닥이다. 구현예에서, 주형 핵산은 DNA, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이다. 대안의 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥 DNA이다.
구현예에서, 주형 핵산은 상동성 지향 수선 사건에 참여함으로써 표적 위치 구조를 변경시킨다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치 서열을 변경시킨다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 핵산 내로 변형된 또는 비천연 유래 뉴클레오타이드의 혼입을 초래한다.
통상적으로, 주형 서열은 표적 서열에 의한 파손 매개 또는 촉매된 재조합을 겪는다. 구현예에서, 주형 핵산은 eaCas9 매개 절단 사건에 의해 절단된 표적 서열 상의 부위에 대응하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 제1 Cas9 매개 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제1 부위와 제2 Cas9 매개 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제2 부위 둘 다에 대응하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 번역된 서열의 암호화 서열에서 변경을 초래하는 서열, 예를 들어, 단백질 산물에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어, 돌연변이체 대립유전자를 야생형 대립유전자로 형질전환하는 것 및/또는 야생형 대립유전자를 돌연변이체 대립유전자로 형질전환하는 것 및/또는 정지 코돈을 도입하는 것, 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실 또는 넌센스 돌연변이를 초래하는 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 주형 핵산은 비암호화 서열의 변경, 예를 들어, 엑손에서 또는 5' 또는 3' 비번역 또는 비-전사된 영역에서의 변경을 초래하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 제어 구성요소에서의 변경, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 구성요소에서의 변경을 포함한다.
본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로에서 표적 위치와 상동성을 갖는 주형 핵산은 표적 핵산의 구조를 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 주형 서열은 원치않는 구조, 예를 들어, 원치않는 또는 돌연변이체 뉴클레오타이드를 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
주형 핵산은, 통합될 때
양성 대조군 구성요소의 활성 감소;
양성 대조군 구성요소의 활성 증가;
음성 대조군 구성요소 활성의 감소;
음성 대조군 구성요소의 활성 증가;
유전자 발현의 감소;
유전자 발현의 증가;
장애 또는 질환에 대한 내성의 증가;
바이러스 유입에 대한 내성 증가;
돌연변이 수정 또는 원치않는 아미노산 잔기의 변경
유전자 산물의 생물학적 특성을 부여하거나, 증가시키거나, 없애거나 또는 감소시키는, 예를 들어, 효소의 효소 활성을 증가시키거나 또는 다른 분자와 상호작용하는 유전자 산물의 능력을 증가시키는 것을 초래하는 서열을 포함할 수 있다.
주형 핵산은 표적 서열의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개 이상의 뉴클레오타이드 서열의 변화를 초래하는 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 주형 핵산은 길이로 20+/-10 개, 30+/-10 개, 40+/-10 개, 50+/-10 개, 60+/-10 개, 70+/-10 개, 80+/-10 개, 90+/-10 개, 100+/-10 개, 110+/-10 개, 120+/-10 개, 130+/-10 개, 140+/-10 개, 150+/-10 개, 160+/-10 개, 170+/-10 개, 180+/-10 개, 190+/-10 개, 200+/-10 개, 210+/-10 개, 220+/-10 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 주형 핵산은 길이로 30+/-20 개, 40+/-20 개, 50+/-20 개, 60+/-20 개, 70+/-20 개, 80+/-20 개, 90+/-20 개, 100+/-20 개, 110+/-20 개, 120+/-20 개, 130+/-20 개, 140+/-20 개, 150+/-20 개, 160+/-20 개, 170+/-20 개, 180+/-20 개, 190+/-20 개, 200+/-20 개, 210+/-20 개, 또는 220+/-20 개의 뉴클레오타이드이다.
구현예에서, 주형 핵산은 길이로 10 개 내지 1,000 개, 20 개 내지 900 개, 30 개 내지 800 개, 40 개 내지 700 개, 50 개 내지 600 개, 50 개 내지 500 개, 50 개 내지 400 개, 50 개 내지 300 개, 50 개 내지 200 개 또는 50 개 내지 100 개의 뉴클레오타이드이다.
주형 핵산은 다음의 구성성분을 포함한다:
[5' 상동성 암]-[대체 서열]-[3' 상동성 암].
상동성 암은 염색체 내로의 재조합을 제공하며, 따라서 목적으로 하지 않는 구성요소를 대체 서열로 대체하는 것, 예를 들어, 돌연변이 또는 서명을 제공한다. 구현예에서, 상동성 암은 가장 원위의 절단 부위에 측접한다.
구현예에서, 5' 상동성 암의 3' 말단은 대체 서열의 5' 말단 옆의 위치이다. 구현예에서, 5' 상동성 암은 대체 서열의 5' 말단으로부터 적어도 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 400 개, 500 개, 600 개, 700 개, 800 개, 900 개, 1000 개, 1500 개 또는 2000 개의 뉴클레오타이드 5'로 연장될 수 있다.
구현예에서, 3' 상동성 암의 5' 말단은 대체 서열의 3' 말단 옆의 위치이다. 구현예에서, 3' 상동성 암은 대체 서열의 3' 말단으로부터 적어도 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 400 개, 500 개, 600 개, 700 개, 800 개, 900 개, 1000 개, 1500 개 또는 2000 개의 뉴클레오타이드 3'으로 연장될 수 있다.
본 명세서에서 하나 또는 둘 다의 상동성 암은 특정 서열 반복부 구성요소, 예를 들어, Alu 반복부, LINE 구성요소를 포함하는 것을 피하도록 단축될 수 있다는 것이 상정된다. 예를 들어, 5' 상동성 암은 서열 반복부 구성요소를 피하도록 단축될 수 있다. 구현예에서, 3' 상동성 암은 서열 반복구 구성요소를 피하도록 단축될 수 있다. 구현예에서, 5'과 3' 상동성 암은 둘 다 특정 서열 반복구 구성요소를 포함하는 것을 피하도록 단축될 수 있다.
본 명세서에서 돌연변이를 수정하기 위한 주형 핵산은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드(ssODN)로서 사용을 위해 설계될 수 있다는 것이 상정된다. ssODN을 이용할 때, 5' 및 3' 상동성 암은 길이로 약 200 개까지의 염기쌍(bp), 예를 들어, 길이로, 예를 들어, 적어도 25 bp, 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp, 150 bp, 175 bp 또는 200 bp의 범위일 수 있다. 더 긴 상동성 암은 또한 올리고뉴클레오타이드 합성의 개선이 계속해서 이루어짐에 따라 ssODN에 대해 상정된다.
구현예에서, ssODN은 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에서 돌연변이를 수정하기 위해 사용될 수 있다.
IV.2 유전자 표적화에 대한 NHEJ 접근
본 명세서에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도 비-상동성 말단-결합 (NHEJ)은 유전자-특이적 넉아웃(knockout)을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제, 유도 NHEJ는 또한 관심 대상의 유전자에서 서열을 제거하기 위해(예를 들어, 결실시키기 위해) 사용될 수 있다.
이론에 의해 구속되지 않고, 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 관련된 게놈 변형은 뉴클레아제-유도 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류 유발 특성에 의존한다고 믿어진다. NHEJ는 2 개의 말단과 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수선하고; 그러나, 일반적으로, 본래의 서열은 두 적합성 말단이 그들이 이중 가닥 파손에 의해 형성됨에 따라 완전히 결찰되어야만 복구된다. 이중-가닥 파손의 DNA 말단은 빈번하게는 효소적 가공 대상이며 말단의 재결합 전에 하나 또는 둘 다의 가닥에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 초래한다. 이는 NHEJ 수선 부위에서 DNA 서열에서 삽입 및/또는 결실(삽입결실)의 존재를 초래한다. 이들 돌연변이 통상적으로 중 2/3는 리딩 프레임을 변경시키며, 따라서, 비기능성 단백질을 생성한다. 추가적으로, 리딩 프레임을 유지하지만, 상당한 양의 서열을 삽입 또는 결실시키는 돌연변이는 단백질의 기능성을 파괴할 수 있다. 이는 중요한 기능적 도메인의 돌연변이가 단백질의 비중요 영역에서의 돌연변이보다 덜 용인될 가능성이 있기 때문에 좌위 의존적이다.
NHEJ에 의해 생성된 삽입결실 돌연변이는 천연에서 예측불가능하지만; 그러나, 주어진 파손 부위에서 특정 삽입결실 서열이 선호되며 집단에서 지나치게 표시되는데, 이는 마이크로상동성의 소 영역에 기인할 가능성이 있다. 결실의 길이는 가장 통상적으로는 1 bp 내지 50 bp 범위에서 크게 다를 수 있지만, 그들은 100 bp 내지 200 bp 초과로 용이하게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧게 되는 경향이 있으며, 종종 파손 부위를 바로 둘러싸는 서열의 짧은 중복을 포함한다. 그러나, 이는 큰 삽입을 얻을 수 있고, 이 경우에 삽입된 서열은 종종 게놈의 다른 영역에 대해 또는 세포 내에 존재하는 플라스미드 DNA에 대해 추적되었다.
NHEJ는 돌연변이유발 과정이기 때문에, 이는 또한 특이적 최종 서열의 생성이 필요하지 않다면, 작은 서열 모티프를 결실시키는데 사용될 수 있다. 이중-가닥 파손이 짧은 표적 서열 근처에서 표적화된다면, NHEJ 수선에 의해 야기되는 결실 돌연변이는 종종 걸쳐서 이어지고, 따라서 원치않는 뉴클레오타이드를 제거한다. 더 큰 DNA 세그먼트의 결실을 위해, 두 이중-가닥 파손을 도입시키는 것은(서열의 각각의 측면 상에서 하나씩) 전체 개재 서열의 제거에 의해 말단들 사이에 NHEJ를 초래할 수 있다. 이들 접근은 둘 다 특이적 DNA 서열을 결실시키기 위해 사용될 수 있고; 그러나, NHEJ의 오류-유발 특성은 여전히 수선 부위에서 삽입결실 돌연변이를 생성할 수 있다.
eaCas9 분자를 절단하는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, eaCas9 분자는 NHEJ-매개 삽입결실을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 유전자에 표적화된 NHEJ-매개 삽입결실, 예를 들어, 암호화 영역, 예를 들어, 관심 대상 유전자의 초기 암호화 영역은 관심 대상의 유전자를 넉아웃시키기 위해(즉, 유전자의 발현을 제거하기 위해) 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 초기 암호화 영역은 암호화 서열의 제1 엑손 내에서, 또는 전사 시작 부위의 500 bp 내에서(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만) 전사 시작 부위 바로 다음에 서열을 포함한다.
표적 위치에 대한 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손의 배치
구현예에서, gRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도하는 목적을 위해 이중 가닥 파손을 생성하는 경우, gRNA, 예를 들어, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA 분자는 표적 위치의 뉴클레오타이드에 대한 근위에 가깝게 하나의 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp 내지 500 bp만큼 떨어져 있다(예를 들어, 표적 위치로부터 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만).
구현예에서, Cas9 틈내기효소와 복합체화된 2 개의 gRNA가 NHEJ-매개 삽입결실을 유도할 목적을 위해 2 개의 단일 가닥 파손을 유도하는 경우, 2 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 NHEJ 수선 표적 위치의 뉴클레오타이드를 제공하기 위한 2 개의 단일-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, gRNA는 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방하는 상이한 가닥 상에서, 동일한 위치에서 또는 서로의 소수의 뉴클레오타이드 내에서 절단을 위치시키도록 구성된다. 구현예에서, 더 가까운 틈은 표적 위치로부터 0 bp 내지 30 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30 bp, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 9 bp, 8 bp, 7 bp, 6 bp, 5 bp, 4 bp, 3 bp, 2 bp 또는 1 bp 미만)만큼 떨어져 있고, 2 개의 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다. 구현예에서, gRNA는 표적 위치의 뉴클레오타이드 중 측면 중 하나 상에 단일 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다.
eaCas9 분자를 절단시키는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, eaCas9 분자는 표적 위치의 측면 둘 다에 파손을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이중 가닥 또는 짝지어진 단일 가닥 파손은 두 절단 사이의 핵산 서열을 제거하기 위해(두 파손 사이의 영역은 결실됨)(예를 들어, 본 명세서에, 예를 들어, 부문 VIIB에서, 예를 들어, 표 VII-13, VII-14, VII-15, VII-16, VII-17, VII-18, VII-19, VII-20, VII-21, VII-22, VII-23, VII-24, IX-1, IX-1A, IX-3 또는 XII-1에, 또는 부문 VIII에 기재된 유전자 또는 경로의) 표적 위치의 양 측면 상에서 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 두 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양 측면 상에서 이중-가닥 파손을 위치시키도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 대안의 구현예에서, 3 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, cas9 뉴클레아제와 하나의 gRNA 복합체) 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 틈내기효소와의 두 gRNA 복합체)을 위치시키도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 하류(즉, 3')를 표적화하기 위해 사용된다). 다른 구현예에서, 4 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 두 쌍(즉, Cas9 틈내기효소와 두 gRNA 복합체의 두 쌍)을 생성하도록 구성된다(예를 들어, 제1 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 상류(즉, 5')를 표적화하기 위해 사용되고, 제2 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 또는 경로에서 돌연변이 하류(즉, 3')을 표적화하기 위해 사용된다). 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 두 단일 가닥 틈 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp 내에 있을 것이다(예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하). 틈내기효소가 사용될 때, 쌍에서 두 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
IV.3 표적화된 넉다운
DNA 수준에서 유전자를 돌연변이시킴으로써 발현을 영구적으로 제거하는 CRISPR/Cas-매개 유전자 넉아웃과 달리, CRISPR/Cas 넉아웃은 인공 전사 인자의 사용을 통해 유전자 발현을 일시적으로 감소시킨다. Cas9 단백질의 DNA 절단 도메인 둘 다에서 중요한 잔기의 돌연변이(예를 들어, D10A 및 H840A 돌연변이)는 촉매적 불활성 Cas9(사멸 Cas9 또는 dCas9로서도 알려진 eiCas9)의 생성을 초래한다. 촉매적 불활성 Cas9는 gRNA와 복합체화하고, gRNA의 표적화 도메인에 의해 구체화되는 DNA 서열을 국소화하지만, 그러나, 이는 표적 DNA를 절단하지 않는다. 효과기(effector) 도메인, 예를 들어, 전사 억제 도메인에 대한 dCas9의 융합은 gRNA에 의해 구체화된 임의의 DNA부위에 대한 효과기의 동원을 가능하게 한다. eiCas9 그 자체는 암호화 서열 내 초기 영역에 동원될 때 전사를 차단할 수 있는 것으로 나타났지만, 더 강한 억제는 전사 억제 도메인(예를 들어, KRAB, SID 또는 ERD)을 Cas9에 융합시킴으로써 그리고 그것을 유전자의 프로모터 영역에 동원함으로써 달성될 수 있다. 프로모터의 표적화 DNAseI 과민감 영역을 표적화하는 것은 이들 영역이 Cas9 단백질에 접근가능하게 될 가능성이 더 많고 또한 내인성 전사 인자에 대한 부위를 보유할 가능성이 더 많기 때문에 더 효율적인 유전자 억제 또는 활성화를 수득할 수 있는 가능성이 있다. 특히 유전자 억제를 위해, 본 명세서에서 내인성 전사 인자의 결합 부위를 차단하는 것은 유전자 발현을 하향조절하는데 도움을 준다는 것이 상정된다. 다른 구현예에서, eiCas9는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상탤르 변경시키는 것은 표적 유전자의 감소된 발현을 초래할 수 있다.
구현예에서, gRNA 분자는 공지된 전사 반응 구성요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 공지된 상류의 활성화 서열(UAS) 및/또는 표적 DNA의 발현을 제어할 수 있는 것으로 의심되는 알려지지 않은 또는 알려진 기능의 서열에 표적화될 수 있다.
CRISPR/Cas-매개 유전자 넉다운은 원치않는 대립유전자 또는 전사체의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 유전자의 영구적인 파괴가 이상적이지 않은 시나리오가 상정된다. 이들 시나리오에서, 부위-특이적 억제는 발현을 일시적으로 감소시키거나 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 명세서에서 Cas-리프레서의 표적을 벗어난 효과는 뉴클레아제가 임의의 DNA 서열을 절단하고 돌연변이를 야기할 수 있기 때문에 Cas-뉴클레아제보다 덜 심각할 수 있는 반면, Cas-리프레서는 단지 그것이 활성적으로 전사된 유전자의 프로모터 영역을 표적화한다면 효과를 발휘할 수 있다고 상정된다. 그러나, 뉴클레아제-매개 넉아웃은 영구적이만, Cas-리프레서가 세포 내에 존재하는 한 억제는 단지 지속될 수 있다. 일단 리프레서가 더 이상 존재하지 않는다면, 내인성 전사 인자 및 유전자 조절 구성요소는 그의 천연 상태에 대한 발현을 회복시킬 가능성이 있다.
IV.4 게놈 편집 방법에서 gRNA의 예
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 분자는 표적 핵산의 서열을 변경시키는 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손, 예를 들어, 표적 위치 또는 표적 유전자 서명을 생성하는 Cas9 분자에 의해 사용될 수 있다. 이들 방법에서 유용한 gRNA 분자는 이하에 기재한다.
구현예에서, gRNA, 예를 들어, 키메라 gRNA는 그것이 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) 이것은, 예를 들어, 이중 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때,이중 가닥 파손을, (i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가까이 위치시킬 수 있고;
b) 이것은 적어도 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 17 개, (ii) 18 개 또는 (iii) 20 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며; 그리고
c)
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스, 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있고;
iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(ii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(iii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 c.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a, b 및 c를 포함하도록 구성된다.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA는, 예를 들어, 키메라 gRNA는 그것이 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) 이것은, 예를 들어, 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, 단일 가닥 파손을 (i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가깝도록 위치시킬 수 있고;
b) 이것은, 적어도 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 17 개, (ii) 18 개 또는 (iii) 20 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며; 그리고
c)
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은, 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있고;
iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(ii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(iii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 c.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a, b 및 c.
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(i).
구현예에서, gRNA는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA는 HNH 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어, 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, H840에서 돌연변이, 예를 들어, H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, 제1 gRNA 및 제2 gRNA를 포함하는 한 쌍의 gRNA, 예를 들어, 한 쌍의 키메라 gRNA는 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다:
a) gRNA 중 하나 또는 둘 다는, 예를 들어, 단일 가닥 파손을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, 단일 가닥 파손을 (i) 표적 위치의 50 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에서 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에서 충분히 가깝게 위치시킬 수 있고;
b) 하나 또는 둘 다는 적어도 17 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 17 개, (ii) 18 개의 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지며;
c) 하나 또는 둘 다는:
(i) 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 취해질 때, 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인 및 근위 도메인으로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드, 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고;
(ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 15 개, 18 개, 20 개, 25 개, 30 개, 31 개, 35 개, 40 개, 45 개, 49 개, 50 개 또는 53 개의 뉴클레오타이드가 있으며;
(iii) 제1 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드에 상동성인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드 3', 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 gRNA의 대응하는 서열 또는 그것으로부터의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열로부터 적어도 16 개, 19 개, 21 개, 26 개, 31 개, 32 개, 36 개, 41 개, 46 개, 50 개, 51 개 또는 54 개의 뉴클레오타이드가 있고;
iv) 꼬리 도메인은 길이로 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인과 적어도 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개 또는 40 개의 뉴클레오타이드; 또는, 그것과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 이하의 뉴클레오타이드만큼 상이한 서열을 포함하고; 또는
(v) 꼬리 도메인은 천연 유래 꼬리 도메인, 예를 들어, 천연 유래 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스타필로코커스 아우레우스 또는 네이세리아 메닌기티디스 꼬리 도메인의 대응하는 부분의 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개의 뉴클레오타이드 또는 모두를 포함한다;
d) gRNA는 표적 핵산에 혼성화될 때, 그들이 0 개 내지 50 개, 0 개 내지 100 개, 0 개 내지 200 개, 적어도 10 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개 또는 적어도 50 개의 뉴클레오타이드만큼 분리되도록 구성되고;
e) 제1 gRNA 및 제2 gRNA에 의해 만들어진 파손은 상이한 가닥 상에 있으며; 그리고
f) PAM은 바깥쪽으로 접한다.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 다음 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(i).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(ii).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 b(iii).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a 및 c.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a, b 및 c.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(i).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i), c 및 d.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i), c 및 e.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(i), c, d 및 e.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(i).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii) 및 c(ii).
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii), c 및 d.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii), c 및 e.
구현예에서, gRNA의 하나 또는 둘 다는 특성을 포함하도록 구성된다: a(i), b(iii), c, d 및 e.
구현예에서, gRNA는 HNH 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 틈내기효소 분자, 예를 들어, 불활성화된 HNH 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, H840에서 돌연변이, 예를 들어, H840A를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
V. 작제물/구성성분
구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 또는 gRNA 분자, 또는 둘 다는, 다양한 형태로 전달, 제형화 또는 투여될 수 있다. 예를 들어, 표 V-1a 및 표 V-1b를 참조 DNA로 암호화된 구성성분이 전달될 때, DNA는 통상적으로 발현을 달성하기 위해, 예를 들어, 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 것이다. Cas9 분자 서열에 대한 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, MSCV, PGK, CAG 제어 프로모터를 포함한다. gRNA에 대한 유용한 프로모터는 H1, EF-1a 및 U6 프로모터를 포함한다. 유사한 또는 다른 강도를 지니는 프로모터는 구성성분의 발현을 조정하도록 선택될 수 있다. Cas9 분자를 암호화하는 서열은 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS), 예를 들어, SV40 NLS를 포함할 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로, 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다.
표 V-1a 및 표 V-1b는 구성성분이 어떻게 제형화, 전달, 또는 투여될 수 있는지에 관한 예를 제공한다.
표 V-1a
표 V-1b
구현예에서, Cas 시스템의 구성성분은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생체내에서 전달된다. 다른 구현예에서, Cas 시스템의 구성성분은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생체외에서 전달된다.
표 V-2는 Cas 시스템의 구성성분의 다양한 전달 방법을 요약하며, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및 gRNA 분자 구성성분은 본 명세서에, 예를 들어, 표 V-2에 기재된다.
표 V-2
Cas9 분자 및 또는 gRNA 분자의 DNA 기반 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자 또는 eiCas9 분자), gRNA 분자 및/또는 주형 핵산을 암호화하는 DNA는 대상체에 투여되거나 당업계에 공지된 방법 또는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 DNA는, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용), 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
구현예에서, DNA는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 지배적인 gRNA 분자는 시스템의 구성성분을 불활성화 또는 침묵시키기 위해 Cas9 분자, 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산과 복합체화될 수 있다. 경우 중 하나에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자, 또는 gRNA 표적화 gRNA 분자는 Cas9/gRNA 복합체 매개된 유전자 표적화의 효과를 제한하며, 활성에 대한 일시적 제한에 놓이거나 또는 표적을 벗어난 활성을 감소시킬 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다.
벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어, Cas9 분자 서열에 융합된 (예를 들어, 핵 국소화, 인 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위해) 단일 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 융합된 (예를 들어, SV40으로부터의) 핵 국소화 서열을 포함할 수 있다.
하나 이상의 조절/제어 구성요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES), 2A 서열, 및 스플라이스 억셉터(acceptor) 또는 도너가 벡터 내에 포함될 수 있다. 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV 프로모터)에 의해 인식된다. 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 프로모터)에 의해 인식된다. 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다.
구현예에서, 벡터는 또는 전달 비히클은 (예를 들어, 재조합 바이러스의 생성에 대해) 바이러스 벡터이다. 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스이다. 구현예에서, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV는 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자 또는 gRNA-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 및/또는 조직 유형 인식 능력을 가진다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안의 바이러스 외피 당단백질를 지니는 위형일 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체로 공학 처리되며(예를 들어, 펩타이드 리간드, 단쇄 항체, 성장인자와 같은 표적화 리간드를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전적 변형); 및/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-바이오틴 및 화학적 컨쥬게이션)를 인식하는 다른 말단을 지니는 분자 브릿지를 갖도록 공학처리된다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 단지 표적 세포에서 이식유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 구성될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 이식유전자 발현의 마이크로RNA 의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 융합-적격 혈구응집소(HA)는 세포 내로의 바이러스 흡수를 증가시키기 위헤 혼입될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 가진다. 예를 들어, (세포 분할 동안) 세포벽의 파괴를 필요로 하는 특정 바이러스는 비분열 세포를 감염시키지 않을 것이다. 바이러스의 기질 단백질 내로 혼입된 핵 국소화 펩타이드는 비증식 세포 내로의 형질도입을 허용한다.
구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 구현예에서, 분열 세포와 비분열 세포를 둘 다 감염시킨다. 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어, 인간에서 감소된 면역을 갖도록 공학처리된다. 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어, 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대해 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다. 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적 발현을 야기한다. 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 장기간 지속, 예를 들어, 적어도 1 주, 2 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 9 개월, 1년, 2년 또는 영구적 발현을 야기한다. 바이러스의 패키징 능력은, 예를 들어, 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어, 적어도 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb로 다를 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는, 예를 들어, 숙주 게놈 내로 통합되게 하는 역전사효소를 포함한다. 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다. 구현예에서, 레트로바이러스는, 예를 들어, 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필수적인 유전자에 대해 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되거나 또는 결실된, 복제-결함이다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 공학처리된다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 세포 내로 그의 게놈을 혼입시킬 수 있다. 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노 연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 가닥 둘 다를 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 AAV 혈청형은, 예를 들어, AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형된 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형된 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh 10, 및 위형 AAV를 포함하고, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 혼성 바이러스, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달된다.
패키징 세포를 사용하여 숙주 또는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생성자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 통상적으로 패키징 및 (적용가능하다면) 숙주 또는 표적 세포 내로의 후속적 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈으로부터의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열만을 가진다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 도중에 공급된다. 이후로, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열은 없는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결실에 기인하여 상단한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 및/또는 조직 유형 인식 능력을 가진다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안의 바이러스 외피 당단백질로 위형을 만들 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체에 의해 공학 처리되며(예를 들어, 표적화 리간드, 예컨대 펩타이드 리간드, 단쇄 항체, 성장인자를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변형); 그리고/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 다른 말단(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-바이오틴 및 화학적 컨쥬게이션)을 지니는 이중 특이성이 있는 분자 브릿지를 갖도록 공학처리 된다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 표적 세포에서만 이식유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 구성될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 이식유전자 발현의 마이크로RNA-의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 융합-적격 혈구응집소(HA)는 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 세포 내로 혼입될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 가진다. 예를 들어, (세포 분할 동안) 세포벽의 파괴를 필요로 하고 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않을 비바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질 내 핵 국소화 펩타이드를 혼입시키도록 변경될 수 있고, 이에 의해 비증식 세포의 형질도입을 가능하게 한다. 구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 비바이러스 벡터 또는 비벡터 기반 방법에 의해(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용하여) 전달된다. 예를 들어, DNA는, 예를 들어, 유기적으로 변형된 실리카 또는 실리케이트(오르모실(Ormosil)), 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 지질-매개 형질감염, 덴드리머, 무기 나노입자, 인산칼슘, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, DNA는 (예를 들어, 나노입자 표면에 대한 페이로드에 부착된) 무기 나노입자에 의해 전달된다. 예시적인 무기 나노입자는, 예를 들어, 자기 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2), 실리카(예를 들어, 다기능성을 통합할 수 있고, 예를 들어, 페이로드 및 내부 자기 구성성분의 부착(예를 들어, 컨쥬게이션 또는 포착)을 가능하게 하는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)를 지니는 나노입자 외면을 컨쥬게이트할 수 있음), 시험관내 비바이러스 벡터의 형질감염을 향상시키기 위해 클로로퀴논과 함께 장입된 양으로 하전된 중합체를 지니는 다공성(mesoporous) 실리카 나노입자, 고밀도 지방단백질 및 금 나노입자, 나노입자가 근적외광에 노출에 의해 증가된 온도에 노출되었을 때 방출된 페이로드로 코팅된 금 나노입자, 폴리리신 또는 핵산 화물(cargo)을 포획하는 다른 하전 중합체에 의해 변형된 표면을 지니는 금, 철 또는 은 나노입자를 포함한다. 구현예에서, DNA는 유기 나노입자에 의해(예를 들어, 나노입자 내부의 페이로드의 포획) 전달된다. 예시적인 유기 나노입자는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 프로타민으로 코팅된 중성 헬퍼 지질 및 지질 코팅으로 코팅된 핵산 복합체와 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포좀을 포함한다.
구현예에서, 전달 비히클은 물리적 비히클이다. 구현예에서, 비히클은 저밀도 초음파이다. 예를 들어, 페이로드를 함유하는 마이크로버블(예를 들어, 단백질, 계면활성제 또는 생체적합 중합체 또는 지질 쉘(lipid shell)과 같은 생체적합 물질로 이루어짐)이 사용될 수 있고, 마이크로버블은 미세혈관 수송 동안 집속 초음파 빔에 의해 파괴될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 전기천공법이다. 예를 들어, 네이키드 핵산 또는 단백질은 전기천공법에 의해, 예를 들어, 세포 현탁액 또는 조직 환경, 예컨대 망막 및 배아 조직 내로 전달될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 바늘 또는 제트 주사이다. 예를 들어, 네이키드 핵산 또는 단백질은, 예를 들어, 근육, 간, 피부, 뇌 또는 심장 조직 내로 주사될 수 있다.
구현예에서, Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 벡터 및 비벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 바이로좀은, 예를 들어, 바이러스 또는 리포좀 방법 중 하나의 단독보다는 호흡기 상피세포에서 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있는 불활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 조합된 리포좀을 포함한다.
구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스 벡터이다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 (예를 들어, 나노입자의 표면에 대한 페이로드에 부착된) 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는, 예를 들어, 자기 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2) 또는 실리카를 포함한다. 나노입자의 외면은 페이로드를 부착(예를 들어, 컨쥬게이션 또는 포착)시키는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)와 컨쥬게이션될 수 있다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 유기 나노입자(예를 들어, 나노입자 내부의 페이로드의 포착)이다. 예시적인 유기 나노입자는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 프로타민으로 코팅된 중성 헬퍼 지질 및 지질 코팅으로 코팅된 핵산 복합체와 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포좀을 포함한다.
유전자 전달을 위한 예시적인 지질을 표 V-3에 나타낸다.
표 V-3
유전자 전달에 대한 예시적인 중합체를 이하의 표 V-4에 나타낸다.
표 V-4
구현예에서, 비히클은 나노입자 및 리포좀의 표적 세포 흡수를 증가시키기 위한 표적화 변형, 예를 들어, 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단쇄 항체, 앱타머, 중합체, 당 및 세포 침투 펩타이드를 가진다. 구현예에서, 비히클은 융합생성 및 엔도좀-탈안정화 펩타이드/중합체를 이용한다. 구현예에서, 비히클은 (예를 들어, 화물의 엔도좀 탈출을 가속화시키기 위해) 산-촉발 입체구조적 변화를 겪는다. 구현예에서, 자극-절단성 중합체는, 예를 들어, 세포의 격막에서의 방출을 위해 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단된 이황화-기반 양이온성 중합체가 사용될 수 있다.
구현예에서, 리포좀은, 예를 들어, 조혈 줄기 세포(HSC) 및 조상세포를 표적화하는 방법으로서, 예를 들어, 혈액 또는 골수에 대한 전달을 위해 사용된다. 예를 들어, HSC를 얻는 것이 어려운(예를 들어, HSC가 안정하지 않거나 또는 HSC가 희귀한) 병태에 대해 장기간 치료는 리포좀을 이용하는 직접 전달에 의해 가능하게 될 수 있다. 이들 병태는, 예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈, 판코니 빈혈, 및 재생 불량성 빈혈을 포함할 수 있다. 구현예에서, 리포좀은 표적 기관 또는 그의 혈류에 정맥내 전달을 통해 또는 국소화된 주사를 통해, 국조화된 특이적 조직에, 예를 들어, 간 또는 폐에 전달을 위해 사용된다. 예를 들어, 장기간 치료는 해당 특이적 기관 또는 조직 유형에서의 효과를 집약시킬 수 있다. 이들 병태는 요소 회로 이상, 알파-1-항-트립신 또는 낭포성 섬유증을 포함할 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스 전달 비히클이다. 구현예에서, 비히클은 약독화된 박테리아(예를 들어, 천연으로 또는 침습성이 되도록 인공적으로 공학 처리되었지만 발병을 예방하고 이식유전자(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스, 특정 살모넬라 균주(Salmonella strains), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 발현시키도록 약독화됨, 표적 특이적 조직에 대해 영양적 및 조직 특이적 향성을 갖는 박테리아, 표적 조직 특이성을 변경시키도록 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아)이다. 구현예에서, 비히클은 유전자 변형된 박테리오파지이다(예를 들어, 거대 패키징 능력을 갖는 공학처리된 파지, 덜 면역원성, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하고 혼입된 표적화 리간드를 가짐). 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 (예를 들어, "빈" 입자의 정제 후에 목적으로 하는 화물을 지니는 바이러스의 생체외 조립체에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 공학 처리될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포좀이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포로부터 유래된 인지질 기반 입자이다(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구체 구조로 분해된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음), 또는 식균 작용 유래의(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고, 따라서 표적화 리간드에 대한 필요없이 세포에 의해 취해질 수 있음) 분비 엑소솜-대상체(즉, 환자) 유래 막-결합 나노소수포(30 nm 내지 100 nm)).
구현예에서, 골수에서 나노입자에 의한 Cas 구성성분의 전달은 혈액 및 면역 질환의 치유에 대한 생체내 접근이다.
구현예에서, Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분은 뉴클레오펙션에 의해 전달된다. 예를 들어, 뉴클레오펙터(Nucleofector)™(Lonza Cologne AG)는 1차 세포 및 형질감염이 어려운 세포주에 대한 전달을 위해 사용될 수 있는 형질감염 기법이다. 이는 전기적 매개변수 및 세포유형 특이적 용액의 조합에 기반한 비바이러스 방법이다. 이는 형질감염된 핵산이 핵 내로 직접 들어가게 해서(예를 들어, 핵 내로 핵산의 전달을 위해 세포 분할에 의존하는 일 없이), 뉴런 및 남아있는 혈액 세포와 같은 비분열 세포를 형질감염시키는 능력을 제공한다. 구현예에서, 뉴클레오펙션은 생체외 전달 방법으로서 사용된다.
구현예에서, Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분은 내인성 수용체 매개 수송체, 예를 들어, 항체 기반 분자 트로이 목마(Trojan Horses)(ArmaGen)를 이용하는 방법에 의해 전달된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 뇌에 (예를 들어, 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러, 예를 들어, 내인성 수용체-매개 수송 과정을 통해) 도달하는 것이 달리 어려운 위치에 치료제를 비침습적으로 전달하게 할 수 있다.
구현예에서, Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자)가 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분 중 하나 이상이 전달됨과 동시에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분이 전달되기 (예를 들어, 약 30 분 미만, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주) 전에 또는 후에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및/또는 본 명세서에 기재된 gRNA 분자 구성성분 중 하나 이상과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어, 통합-결손 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 구성성분 및/또는 gRNA 분자 구성성분은, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA)에 의해 야기되는 독성이 감소될 수 있도록 전기천공법에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 치료적 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질을 암호화한다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 RNA 분자를 암호화한다.
Cas9 분자를 암호화하는 RNA의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질) 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 RNA는, 예를 들어, 미량주사법, 전기천공법, 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
Cas9 분자 단백질의 전달
Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)은 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는, 예를 들어, 미량주사법, 전기천공법, 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA에 의해 또는 gRNA에 의해 달성될 수 있다.
투여경로
전신 투여 방식은 경구 및 비경구 경로를 포함한다. 비경구 경로는, 예로서 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 진피내, 피하, 비강내 및 복막내 경로를 포함한다. 전신으로 투여되는 구성성분은 전신으로 구체적 기관 또는 세포 유형에 구성성분을 표적화하도록 변형 또는 제형화될 수 있다.
국소 투여 방식은, 예로서 척추강내, 뇌실내, 뇌실질내(예를 들어, 선조체에 대한 국소화된 뇌실질내 전달(예를 들어, 미상내로 또는 피곡내로)), 대뇌겉질, 중심전회, 해마(예를 들어, 치상회 또는 CA3 영역 내로), 측두엽, 편도체, 전두엽, 시상, 소뇌, 수질, 시상하부, 시개, 피개 또는 흑질 안구내, 안와내, 결막하, 유리체강, 망막하 또는 경공막 경로를 포함한다. 구현예에서, (전신 접근에 비해) 상당히 더 적은 양의 구성성분은 전신으로(예를 들어, 정맥내로) 투여될 때에 비해 국소로(예를 들어, 뇌실질내 또는 유리체강) 투여될 때에 효과를 달성할 수 있다. 국소 투여 방식은 치료적 유효량의 구성성분이 전신으로 투여될 때 생길 수 있는 잠재적 독성 부작용의 발생을 감소 또는 제거할 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 구성성분은, 예를 들어, 중간 돌기 신경을 포함하는 영역, 또는 피질 뉴런을 포함하는 영역을 포함하는 뇌의 별도의 영역 내로 뇌실질내 주사에 의해 전달된다. 주사는 뇌의 하나 이상의 영역 내로 직접 이루어질 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 구성성분은 망막하로, 예를 들어, 망막하 주사에 의해 전달된다. 망막하 주사는 황반내로, 예를 들어, 황반하에 직접 이루어질 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 구성성분은 유리체강 주사에 의해 전달된다. 유리체강 주사는 상대적으로 낮은 위험의 망막 박리 위험을 가진다. 구현예에서, 나노입자 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV2 벡터, 예를 들어, 변형된 AAV2 벡터는 유리체강에 전달된다.
구현예에서, 나노입자 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터 전달은 뇌실질내 주사를 통한다.
눈에 대한 제제의 투여방법은 의학분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 구성성분을 투여하는데 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 안구내 주사(예를 들어, 안구뒤, 망막하, 황반하, 유리체강 및 맥락막내), 이온도입법, 안 점적 및 안구내 이식(예를 들어, 유리체강, 테논낭하 및 결막하)을 포함한다.
투여는 주기적 볼루스(bolus)로서(예를 들어, 망막하, 정맥내 또는 유리체강) 또는 내부 저장소(예를 들어, 안구내 또는 안구외에 위치된 임플란트(미국 특허 제5,443,505호 및 제5,766,242호 참조))로부터의 또는 외부 저장소(예를 들어, 정맥내 백)로부터의 연속적 주입으로서 제공될 수 있다. 구성성분은 국소로, 예를 들어, 눈의 내벽에 고정된 지속 방출 약물 전달 장치로부터의 연속적 방출에 의해 또는 맥락막 내로 표적화된 경공막 제어 방출을 통해 투여될 수 있다(예를 들어, PCT/US00/00207, PCT/US02/14279, 문헌[Ambati et al., (2000) INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI. 41:1181-1185], 및 문헌[Ambati et al., (2000) INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI. 41:1186-1191] 참조). 구성성분을 눈의 내부에 국소로 투여하기에 적합한 다양한 장치는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,251,090호, 제6,299,895호, 제6,416,777호, 제6,413,540호 및 PCT/US00/28187호 참조.
또한, 구성성분은 장기간의 시간에 걸쳐 방출되도록 제형화될 수 있다. 방출 시스템은 생분해성 물질 또는 혼입 구성성분을 확산에 의해 방출시키는 물질의 매트릭스를 포함할 수 있다. 구성성분은 방출 시스템 내에서 균질하게 또는 이질적으로 분포될 수 있다. 다양한 방출 시스템이 유용할 수 있지만, 그러나, 적절한 시스템의 선택은 특정 적용분야에 의해 필요로 되는 방출 속도에 의존할 것이다. 비분해성 방출 시스템과 분해성 방출 시스템이 둘 다 사용될 수 있다. 적합한 방출 시스템은 중합체 및 중합체 매트릭스, 비중합체 매트릭스 또는 무기 및 유기 부형제 및 희석제, 예컨대 탄산칼슘 및 당(예를 들어, 트레할로스)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방출 시스템은 천연 또는 합성일 수 있다. 그러나, 합성 방출 시스템이 바람직한데, 일반적으로 이것들은 더 믿을 수 있고, 더 재생성이며, 더 한정된 방출 프로파일을 생성하기 때문이다. 방출 시스템 물질은 상이한 분자량을 갖는 구성성분이 물질의 확산에 의해 또는 물질의 분해를 통해 방출되도록 선택될 수 있다.
대표적인 합성, 생분해성 중합체는, 예를 들어, 다음을 포함한다: 폴리아미드, 예컨대 폴리(아미노산) 및 폴리(펩타이드); 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜), 폴리(락틱-코-글리콜산), 및 폴리(카프롤락톤); 폴리(무수물); 폴리오르쏘에스테르; 폴리카보네이트; 및 이들의 화학적 유도체(치환, 화학기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌의 첨가, 하이드록실화, 산화 및 다른 변형은 당업자에 의해 일상적으로 이루어짐), 공중합체 및 이들의 혼합물. 대표적인 합성, 비분해성 중합체는, 예를 들어, 다음을 포함한다: 폴리에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(테트라메틸렌 옥사이드); 비닐 중합체-폴리아크릴레이트 및 폴리메트아크릴레이트, 예컨대 메틸, 에틸, 다른 알킬, 하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 아크릴 및 메트아크릴산 및 기타, 예컨대 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 피롤리돈), 및 폴리(비닐 아세테이트); 폴리(우레탄); 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 알킬, 하이드록시알킬, 에테르, 에스테르, 나이트로셀룰로스, 및 다양한 셀룰로스 아세테이트; 폴리실록산; 및 이들의 임의의 화학적 유도체(치환, 화학기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌의 첨가, 하이드록실화, 산화 및 다른 변형은 당업자에 의해 일상적으로 이루어짐), 공중합체 및 이들의 혼합물.
폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 마이크로스피어가 또한 안구내 주사를 위해 사용될 수 있다. 통상적으로 마이크로스피어는 중공 구체를 형성하도록 구조화된 락트산 및 글리콜산의 중합체로 구성된다. 구체는 직경이 대략 15 마이크론 내지 30 마이크론일 수 있고, 본 명세서에 기재된 구성성분과 함께 장입될 수 있다.
구성성분의 바이모달 또는 차별적 전달
Cas 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 구성성분 및 gRNA 분자 구성성분의 별도의 전달, 및 더 구체적으로, 상이한 방식에 의한 구성성분의 전달은, 예를 들어, 조직 특이성 및 안전성을 개선시킴으로써 성능을 향상시킬 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 상이한 방식에 의해, 또는 차별적 방식으로서 본 명세서에서 때때로 지칭된 바와 같이 전달된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 상이한 또는 차별적 방식은 대상 구성성분 분자, 예를 들어, Cas9 분자, gRNA 분자, 또는 주형 핵산에 대해 상이한 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여하는 전달 방식을 지칭한다. 예를 들어, 전달 방식은, 예를 들어, 선택된 격막, 조직 또는 기관에서 상이한 조직 분포, 상이한 반감기 또는 상이한 시간적 분포를 초래할 수 있다.
일부 전달 방식, 예를 들어, 자동 복제 또는 세포 핵산 내로의 삽입에 의한, 예를 들어, 세포에서 또는 세포의 자손에서 지속되는 핵산 벡터에 의한 전달은 구성성분의 더 지속적인 발현 및 구성성분의 존재를 초래한다. 예는, 바이러스, 예를 들어, 아데노 연관 바이러스 또는 렌티바이러스 전달을 포함한다.
예로서, 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA 분자는 신체에서 또는 특정 격막, 조직 또는 기관에서 전달된 구성성분의 얻어진 반감기 또는 잔류의 측면에서 상이한 방식에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, gRNA 분자는 이러한 방식에 의해 전달될 수 있다. Cas9 분자 구성성분은 신체 또는 특정 격막 또는 조직 또는 기관에 대한 이것의 더 적은 잔류 또는 더 적은 노출을 야기하는 방식으로 전달될 수 있다.
더 일반적으로, 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 구성성분을 전달하기 위해 사용되고, 제2 전달 방식은 제2 구성성분을 전달하기 위해 사용된다. 제1 전달 방식은 제1 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제1 약역학적 특성은 신체, 격막, 조직 또는 기관 내에서 구성성분의 또는 구성성분을 암호화하는 핵산의, 예를 들어, 분포, 잔류성 또는 노출일 수 있다. 제2 전달 방식은 제2 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제2 약역학적 특성은 신체, 격막, 조직 또는 기관 내에서 구성성분의 또는 구성성분을 암호화하는 핵산의, 예를 들어, 분포, 잔류, 또는 노출일 수 있다.
구현예에서, 제1 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류, 또는 노출은 제2 약역학적 또는 약동학적 특성보다 더 제한된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류 또는 노출을 최적화, 예를 들어, 최소화하도록 선택된다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류 또는 노출을 최적화, 예를 들어, 최대화하도록 선택된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 상대적 잔류 구성요소, 예를 들어, 핵산, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스의 사용을 포함한다. 이러한 벡터는 상대적으로 잔류성이고, 그들로부터 전사된 산물도 상대적으로 잔류성일 것이다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 상대적으로 일시적 구성요소, 예를 들어, RNA 또는 단백질을 포함한다.
구현예에서, 제1 구성성분은 gRNA를 포함하고, 전달 방식은 상대적으로 잔류성이며, 예를 들어, gRNA는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스로부터 전사된다. 이들 유전자의 전사는 유전자가 단백질 산물을 암호화하지 않고, gRNA는 단리에서 작용할 수 없기 때문에 생리적 결과를 거의 나타내지 아니할 것이다. 제2 구성성분인 Cas9 분자는 일시적 방식으로, 예를 들어, mRNA로서 또는 단백질로서 전달되어 전체 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 단지 존재하고 단시간 동안 활성이라는 것을 보장한다.
더 나아가, 구성성분은 안전성 및 조직 특이성을 증강시키기 위해 서로를 보완하는 상이한 분자 형태로 또는 상이한 전달 벡터로 전달될 수 있다.
차별적 전달 방식의 사용은 성능, 안전성 및 효능을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 궁국적인 표적을 벗어난 변형의 가능성은 감소될 수 있다. 더 적게 잔류성인 방식에 의한 면역원성 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자의 전달은 면역원성을 감소시킬 수 있는데, 박테리아 유래 Cas 효소로부터의 펩타이드가 MHC 분자에 의해 세포 표면 상에 나타나기 때문이다. 2 부분 전달 시스템은 이들 결점을 완화할 수 있다.
차별적 전달 방식은 구성성분을 상이하지만, 중복된 표적 영역에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 형성 활성 복합체(formation active complex)는 표적 영역의 중복 밖으로 최소화된다. 따라서, 구현예에서, 제1 구성성분, 예를 들어, gRNA 분자는 제1 공간적, 예를 들어, 조직 분포를 초래하는 제1 전달 방식에 의해 전달된다. 제2 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자는 제2 공간적, 예를 들어, 조직 분포를 초래하는 제2 전달 방식에 의해 전달된다. 구현예에서, 제1 방식은 리포좀, 나노입자, 예를 들어, 중합체 나노입자, 및 핵산, 예를 들어, 바이러스 벡터로부터 선택된 제1 구성요소를 포함한다. 제2 방식은 상기 군으로부터 선택된 제2 구성요소를 포함한다. 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 표적화 구성요소, 예를 들어, 세포 특이적 수용체 또는 항체를 포함하고, 제2 전달 방식은 해당 구성요소를 포함하지 않는다. 구현예에서, 제2 전달 방식은 제2 표적화 구성요소, 예를 들어, 제2 세포 특이적 수용체 또는 제2 항체를 포함한다.
Cas9 분자가 바이러스 전달 벡터, 리포좀 또는 중합체 나노입자에서 전달될 때, 단일 조직만을 표적화하는 것이 바람직할 수 있을 때에 다수 조직에 대한 전달에 대한 그리고 다수 조직에서의 치료적 활성에 대한 가능성이 있다. 2-부분 전달 시스템은 이러한 도전을 해결할 수 있으며 조직 특이성을 향상시킬 수 있다. gRNA 분자 및 Cas9 분자가 별도이지만 중복된 조직 향성을 지니는 분리된 전달 비히클에서 패키징된다면, 완전히 기능성인 복합체는 벡터 둘 다에 의해 표적화된 조직에서 단지형성된다.
VI. 페이로드
Cas9 분자, 통상적으로 eiCas9 분자 및 gRNA 분자, 예를 들어, eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 매우 다양한 페이로드를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, 페이로드는 표적 핵산에 또는 염색질에, 또는 표적 핵산 근처의 또는 표적 핵산과 관련된 다른 구성성분에 전달된다.
이론에 의해 구속되지 않고, eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체의 gRNA 분자의 서열 특이성은 표적 서열과의 특이적 상호 작용에 기여함으로써 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 관련된, 예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 페이로드의 전달을 달성하는 것으로 믿어진다.
구현예에서, 페이로드는 Cas9, 예를 들어, eiCas9 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 구현예에서, 페이로드는 gRNA 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 구현예에서, 페이로드는 Cas9 분자, 또는 gRNA 분자에 링커, 예를 들어, 생리적 조건 하에서 절단가능한 결합을 포함하는 링커에 의해 연결된다. 구현예에서, 결합은 절단가능하지 않거나 또는 생리적 조건 하에서 불량하게만 절단가능하다. 구현예에서, "공유적으로 결합된"은 Cas9 분자를 함유하는 융합 단백질의 부분을 의미한다.
다중 페이로드의 전달
구현예에서, 제1 페이로드 분자는 제1 Cas9 분자에 의해 전달되고 제2 페이로드 분자는 제2 Cas9 분자에 의해 전달된다. 구현예에서, 제1 페이로드와 제2 페이로드는 동일하다. 구현예에서, 제1 Cas9 분자와 제2 Cas9 분자는 동일하고, 예를 들어, 동일한 종으로부터 유래되며, 동일한 PAM을 가지고/가지거나 동일한 서열을 가진다. 구현예에서, 제1 Cas9 분자와 제2 Cas9 분자는 상이하고, 예를 들어, 상이한 종으로부터 유래되며, 상이한 PAM을 가지고/가지거나 상이한 서열을 가진다. 입체배치의 예는 표 VI-1에 제공된다. 통상적으로 표 VI-1의 Cas9 분자는 eiCas9 분자이다. 구현예에서, Cas9 분자는 페이로드 전달 및 절단이 둘 다 달성되도록 선택된다. 구현예에서, 다중 페이로드, 예를 들어, 2 개의 페이로드가 단일 Cas9 분자와 함께 전달된다.
표 VI-1
구현예에서, 두 상이한 약물이 전달된다. 구현예에서, 제1 Cas9 분자에 제1 링커에 의해 결합된 제1 페이로드, 예를 들어, 약물 및 제2 Cas9 분자에 제2 링커에 의해 결합된 제2 페이로드, 예를 들어, 약물이 전달된다. 구현예에서, 제1 페이로드와 제2 페이로드는 상이하고, 구현예에서, 예를 들어, 상이한 방출 역학을 갖는 상이한 링커에 의해 각각의 Cas9 분자에 결합된다. 구현예에서, 제1 페이로드와 제2 페이로드는 상이하고, 구현예에서, 동일한 링커에 의해 각각의 Cas9 분자에 결합된다. 구현예에서, 제1 페이로드와 제2 페이로드는 상호작용한다. 예를 들어, 제1 페이로드와 제2 페이로드는 복합체, 예를 들어, 이량체 또는 다량체 복합체, 예를 들어, 이량체 단백질을 형성한다. 구현예에서, 제1 페이로드는 제2 페이로드를 활성화시킬 수 있고, 예를 들어, 제1 페이로드는 제2 페이로드를 변형, 예를 들어, 절단 또는 인산화시킬 수 있다. 구현예에서, 제1 페이로드는 제2 페이로드와 상호작용하여 제2 페이로드의 활성을 변형, 예를 들어, 증가 또는 감소시킨다.
페이로드는 시험관내, 생체외 또는 생체내로 전달될 수 있다.
페이로드의 분류
페이로드는 융합 파트너로서 Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자, 효소, 소분자(예를 들어, HDAC 및 다른 염색질 변형제/저해제, 엑손 스키핑 분자, 전사 저해제), 미소부수체 연장 저해제, 탄수화물, 및 DNA 분해제(예를 들어, 감염성 질환 또는 "외래" DNA 세팅에서), 핵산, 예를 들어, DNA, RNA, mRNA, siRNA, RNAi, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 융합된 거대 분자 또는 생물물질(예를 들어, 항체 분자) 융합 단백질, 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
표 VI-2는 페이로드의 예시적인 분류를 제공한다.
표 VI-2
거대 분자
구현예에서, 페이로드는 중합체, 예를 들어, 생물학적 중합체, 예를 들어, 단백질, 핵산 또는 탄수화물을 포함한다.
구현예에서, 페이로드는 단백질, 생물물질, 또는 다른 거대 분자(즉, 분자량이 적어도 3 kD, 5 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD 또는 100 kD인 분자)를 포함한다. 구현예에서, 페이로드는 중합체, 예를 들어, 생물학적 중합체, 예를 들어, 단백질, 핵산 또는 탄수화물을 포함한다. 중합체는 천연 유래 또는 비천연 유래 중합체일 수 있다. 구현예에서, 페이로드는 천연 산물이다. 예를 들어, 천연 산물은 거대 분자 또는 소분자일 수 있다.
폴리펩타이드, 단백질
구현예에서, 페이로드는 단백질 또는 폴리펩타이드, 예를 들어, Cas9 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
구현예에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 이량체 또는 다량체이며, 각각의 서브유닛은 Cas9 분자에 의해 전달된다. 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 하나 이상의 Cas9 분자들에 의해 전달되며, 예를 들어, 각각은 별도의 Cas9 분자에 의해 또는 둘 다 동일한 Cas9 분자에 의해 전달된다.
구현예에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 링커, 예를 들어, 생리적 조건 하에 절단가능한 결합을 포함하는 링커에 의해 Cas9 분자에 연결된다. 구현예에서, 링커는 본 명세서의 부문 XI로부터의 링커이다. 구현예에서, 결합은 생리적 조건 하에서 절단가능하지 않다.
특이적 결합 리간드, 항체
구현예에서, 페이로드는 상대 리간드에 대해 특이적 친화도를 갖는 리간드, 예를 들어, 단백질을 포함한다. 구현예에서, 리간드는 수용체(또는 수용체에 대한 리간드) 또는 항체일 수 있다.
구현예에서, 페이로드는 항체 분자를 포함한다. 예시적인 항체 분자는, 예를 들어, 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 항체는 중(H)쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로서 약칭됨), 및 경(L)쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로서 약칭됨)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 항체는 2 개의 중(H)쇄 가변 영역 및 2 개의 경(L)쇄 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체"는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 단쇄 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, 및 도메인 항체(dAb) 단편(de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-639))을 포함한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은, 예를 들어, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 기능성을 보유하는 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 더 나아가, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 그들은 재조합 방법을 이용하여 그들이 단일 단백질 쇄로서 이루어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있고, 이때 VL 및 VH 영역은 단쇄 Fv(scFv)로서 알려진 1가 분자를 형성하도록 짝지어진다. 예를 들어, 미국 특허 제5,260,203호, 제4,946,778호 및 제4,881,175호; 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(뿐만 아니라 이들의 아형)의 구조적 특징을 가질 수 있다. 항체는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있지만, 영장류(인간 및 비인간 영장류) 및 영장류화가 바람직하다. 구현예에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
구현예에서, 항체 분자는 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, 예를 들어, 나노바디), 예를 들어, 항체 단편은 단일 일량체 가변 항체 도메인으로 이루어진다. 구현예에서, 단일 도메인 항체의 분자량은 약 12 kDa 내지 15 kDa이다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 카멜리드(예를 들어, VHH 단편)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 공학 처리될 수 있다. 연골어류는 또한 VNAR 단편으로 불리는 단일 도메인 항체로부터 얻을 수 있는 중쇄 항체(IgNAR, '면역글로불린 신항원 수용체')를 가진다. 대안의 접근은 보통의 면역글로불린 G(IgG)로부터, 예를 들어, 인간 또는 마우스로부터 단량체 내로 이량체 가변 도메인을 분할하는 것이다. 중쇄 또는 경쇄 중 하나로부터 유래된 단일 도메인 항체는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하도록 얻어질 수 있다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는 중쇄 항체의 또는 보통의 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)를 포함하는 약 110 개 아미노산 길이의 펩타이드 쇄일 수 있다.
단일-도메인 항체는 전체 항체로서 항원과 유사한 친화도를 가질 수 있다. 그들은 또한 보다 내열성이고/내열성이거나 세정제 및 고농도의 요소에 대해 안정할 수 있다. 예를 들어, 카멜리드 및 어류 항체로부터 유래된 것은 경쇄에 정상적으로 결합하는 친유성 부위를 뒤덮는 연장된 루프를 형성하는 그들의 상보성 결정 영역 3(CDR3)에 기인하여 덜 친유성이고 수 중에서 더 가용성일 수 있다. 구현예에서, 단일 도메인 항체는 상보체 시스템 촉발 세포독성을 나타내지 않는다, 예를 들어, 그들은 Fc 영역이 없기 때문이다. 단일-도메인 항체, 예를 들어, 카멜리드 및 어류 유래 sdAb는 전제 항체에 접근할 수 없을 수도 있는 숨겨진 항원에, 예를 들어, 효소의 활성 부위에 결합할 수 있다. 이 특성은 이러한 부위에 침투할 수 있는 그들의 연장된 CDR3 루프로부터 생길 수 있다.
단일 도메인 항체는, 예를 들어, 단봉 낙타, 낙타, 라마, 알파카 또는 상어의 목적으로 하는 항원에 의한 면역화 및 중쇄 항체를 암호화하는 mRNA의 후속적 단리에 의해 얻어질 수 있다. 역전사 및 중합효소 연쇄 반응에 의해, 수백만개 클론을 함유하는 단일 도메인의 유전자 라이브러리가 생성된다. 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 선별 기법은 항원과 결합하는 클론을 동정하게 한다.
상이한 방법은 이전에 면역화되지 않은 동물로부터의 유전자 라이브러리를 이용한다. 이러한 나이브 라이브러리는 보통 목적으로 하는 항원에 대해 낮은 친화도를 지니는 항체만을 함유하여, 추가적인 단계로서 무작위 돌연변이유발에 의한 친화도 성숙을 적용하는 것을 필요하게 만든다.
대부분의 강력한 클론을 동정하였을 때, 예를 들어, 효소에 대한 그들의 안정성을 개선시키기 위해 그들의 DNA 서열이 최적화될 수 있다. 다른 목표는 항체에 대한 인간 유기체의 면역 반응을 예방하기 위한 인간화이다. 최종 단계는 이콜라이(E. coli), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 다른 적합한 유기체에서 최적화된 단일 도메인 항체의 번역이다.
대안적으로, 단일 도메인 항체는 4 개의 쇄를 지니는 보통의 뮤린 또는 인간 IgG로부터 이루어질 수 있다. 면역화 또는 나이브 도너로부터의 유전자 라이브러리를 포함하는 상기 과정은 유사하고, 대부분의 특이적 항원의 식별을 위한 기법을 나타낸다. 단량체화는 보통 친유성 아미노산을 친수성 아미노산으로 대체함으로써 수행된다. 친화도가 달성되리 수 있다면, 단일 도메인 항체는 마찬가지로 이콜라이, 사카로마이세스 세레비시애 또는 다른 유기체에서 생성될 수 있다.
구현예에서, 페이로드는 전사 활성체 단백질 또는 도메인, 예를 들어, VP16 단백질 또는 도메인, 또는 전사 리프레서 단백질 또는 도메인을 포함한다.
융합 단백질 및 융합 파트너
구현예에서, 페이로드는 융합 단백질을 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 상이한 기능적 특성을 가질 수 있거나, 또는 상이한 단백질로부터 유래될 수 있는 제1 융합 파트너 및 제2 융합 파트너를 포함한다. 구현예에서, 융합 단백질은 핵산에 결합하는 제1 융합 파트너 및 효소적 활성을 포함하거나 유전자 발현을 촉진 또는 저해하는 제2 융합 파트너를 포함할 수 있다. 구현예에서, 페이로드 그 자체는 융합 단백질이다. 구현예에서, 페이로드는 Cas9 분자에 융합된다.
예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질에 안정성 및/또는 전달 능력을 더하는 세그먼트를 함유할 수 있다. 구현예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 단편(예를 들어, Fc 단편), 전달 또는 혈장 단백질, 예를 들어, 알부민에 융합된 본 명세서에 기재된 단백질(예를 들어, 수용체)일 수 있다. 융합 단백질은 또한 융합 단백질(예를 들어, 독소, 효소 또는 사이토카인에 의해 전달됨)에 독성을 더하는 세그먼트를 함유할 수 있다. 융합 단백질은 또한 (예를 들어, HIV-1 TAT 단백질에 의한) 전달 및/또는 표적화 경로를 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예는, 예를 들어, 다가를 허용하는 융합, 예컨대 스트렙타비딘 융합 또는 두 활성 구성성분의 융합(예를 들어, 그 사이에 절단성 링커를 지니거나 또는 절단성 링커가 없음)을 포함한다.
구현예에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자와의 융합 파트너이다.
구현예에서, 페이로드는 전사 활성체 단백질 또는 도메인, 예를 들어, VP16 단백질 또는 도메인, 또는 전사 리프레서 단백질 또는 도메인을 포함하는 Cas9 분자와의 융합 파트너를 포함한다.
효소
구현예에서, 페이로드는 효소를 포함한다. 예시적인 효소는, 예를 들어, 산화환원효소(예를 들어, 산화/환원 반응을 촉매), 트랜스퍼라제(예를 들어, 작용기를 전달(예를 들어, 메틸 또는 포스페이트기)), 가수분해효소(예를 들어, 다양한 결합의 가수분해를 촉매), 리아제(예를 들어, 가수분해 및 산화가 아닌 수단에 의해 다양한 결합을 절단), 이성질화효소(단일 분자 내에서 이성질화 변화를 촉매), 및 리가제(예를 들어, 공유 결합에 의해 두 분자를 결합)를 포함한다. 구현예에서, 효소는 세포핵에서의 하나 이상의 기능, 예를 들어, DNA 합성, 전사, DNA 및 히스톤의 후성적 변형, RNA 번역후 변형, 세포 주기 제어, DNA 손상 수선 또는 게놈 불안정을 매개하거나 또는 이와 관련된다.
소분자
구현예에서, 페이로드는 소분자 화합물을 포함한다.
구현예에서, 소분자는 생물학적 과정의 조절자이다. 예를 들어, 소분자는 제2 분자, 예를 들어, 바이오중합체, 예를 들어, 탄수화물, 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 결합할 수 있고, 구현예에서, 제2 분자의 구조, 분포, 활성 또는 기능 중 하나 이상을 변경시킨다. 구현예에서, 소분자의 크기는 약 10-9 m 단위이다. 구현예에서, 소분자의 분자량은, 예를 들어, 200 amu 내지 500 amu, 300 amu 내지 700 amu, 500 amu 내지 700 amu, 700 amu 내지 900 amu, 또는 500 amu 내지 900 amu이다.
예시적인 소분자는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 저해제(예를 들어, 수베로일아닐리드 하이드록삼산(SAHA), 또는 로미뎁신), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 저해제(, DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제(예를 들어, 아자시티딘(또는 5-아자시티딘), 데시타빈(또는 5-아자-2'-데옥시시티딘) 또는 DNA 복제 저해제를 포함한다. 소분자는 또한, 예를 들어, 작은 핵산 분자(예를 들어, 2 kD 하에 있는 염기에 따라서 1 개 내지 4 개의 염기) 및 펩타이드를 포함할 수 있다.
미소부수체 연장 저해제
구현예에서, 페이로드는 미소부수체 연장 저해제를 포함한다. 구현예에서, 미소부수체 연장 저해제는 DNA 미스매치 수선 단백질이다. 분자에 의해 전달될 수 있는 예시적인 DNA 미스매치 수선 단백질 및 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, MLH3, PMS1, PMS2를 포함한다.
신호 생성기, 방사성핵종, 리포터 분자, 진단 프로브
구현예에서, 페이로드는 신호를 생성하는 분자를 포함한다. 이러한 페이로드는, 예를 들어, 연구, 치료(예를 들어, 암치료) 및 진단 적용분야에서 유용하다. 구현예에서, 신호는 전자기 방출, 예를 들어, 적외선, 가시광선 또는 자외선 범위; 입자, 예를 들어, 방사성 붕괴, 예를 들어, 알파, 베타 또는 감마 입자의 생성물; 검출가능한 기질, 예를 들어, 착색 기질; 반응 생성물, 예를 들어, 효소 반응의 생성물; 또는 특이적 결합제에 의해 검출가능한 리간드, 예를 들어, 항체; 또는 염료를 포함한다. 구현예에서, 신호는 형광 방출, 예를 들어, 형광 단백질에 의한 형광 방출을 포함한다. 예시적인 형광 단백질은 청색/UV 단백질(예를 들어, 태그BFP, 엠태그BFP, 남동석, EBFP2, 엠칼라마1(mKalama1), 시리우스, 사파이어, T-사파이어), 청록색 단백질(예를 들어, ECFP, 셀룰리언, SCFP3A, 엠터키오이즈(mTurquoise), 엠터키오이즈2, 단량체 미도리이시-시안, 태그CFP, mTFP1), 녹색 단백질(예를 들어, EGFP, 에메랄드, 수퍼폴더 GFP, 단량체 아자미 그린, TagGFP2, mUKG, 엠와사비(mWasabi), 클로버, 엠네온그린(mNeonGreen)), 황색 단백질(예를 들어, EYFP, 시트린, 비너스(Venus), SYFP2, 태그YFP), 오렌지색 단백질(예를 들어, 단량체 쿠사비라 오렌지(Kusabira-Orange), mKOκ, mKO2, 엠오렌지(mOrange), 엠오렌지2), 적색 단백질(엠라즈베리(mRaspberry), 엠체리(mCherry), 엠스트로우베리(mStrawberry), 엠탠저린(mTangerine), td토마토, 태그RFP, 태그RFP-T, 엠애플(mApple), 엠루비(mRuby), 엠루비2), 근적외광 단백질(예를 들어, 엠플럼(mPlum), Hc레드-탠덤, 엠케이트2(mKate2), 엠넵튠(mNeptune), NirFP, 태그RFP657, IFP1.4, iRFP), 긴 스토크스 이동 단백질(예를 들어, 엠케이마 레드(mKeima Red), LSS-엠케이트1, LSS-엠케이트2, mBeRFP), 광활성화 단백질(예를 들어, PA-GFP, PAm체리1, PA태그RFP), 광전환 단백질(예를 들어, 카에데(Kaede)(녹색), 카에데(적색), KikGR1(녹색), KikGR1(적색), PS-CFP2, mEos2(녹색), mEos2(적색), mEos3.2(녹색), mEos3.2(적색), PSm오렌지), 광전환 단백질(예를 들어, 드론파(Dronpa))를 포함한다.
구현예에서, 신호 생성 모이어티는 Cas9 분자, 예를 들어, eiCas9 분자의 융합 파트너로서 제공된다.
예를 들어, 표지 폴리펩타이드에 대해 유용한 신호 생성기 또는 리포터는 다음의: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예를 들어, 인듐(111In), 요오드(131I 또는 125I), 이트륨(90Y), 루테튬(177Lu), 악티늄(225Ac), 비스무트(212Bi 또는 213Bi), 황(35S), 탄소(14C), 트리티움(3H), 로듐(188Rh), 테크네튬(99mTc), 프라세오디뮴 또는 인(32P) 또는 양전자-방출 방사성핵종, 예를 들어, 탄소-11(11C), 칼륨-40(40K), 질소-13(13N), 산소-15(15O), 플루오린-18(18F) 및 요오드-121(121I)), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 포스포르), 효소 표지(예를 들어, 호스래디쉬 페록시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제), 화학발광, 바이오틴일 기(표식 아비딘, 예를 들어, 광학적 또는 열량 측정 방법에 의해 검출될 수 있는 스트렙타비딘 모이어티 및 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 분자에 의해 검출될 수 있음) 및 2차 리포터에 의해 인식된 사전결정 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구현예에서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착된다.
구현예에서, 페이로드는 방사성핵종을 포함한다. 방사성핵종은 gRNA 분자, Cas9 분자 내로 또는 페이로드 분자 내로 혼입될 수 있다. 예시적인 방사성핵종은, 예를 들어, 베타 방출체, 알파 방출체 또는 감마 방출체를 포함한다. 구현예에서, 방사성핵종은 요오드, 예를 들어, 131I 또는 125I, 이트륨, 예를 들어, 90Y, 루테늄, 예를 들어, 177Lu, 악티늄, 예를 들어, 225Ac, 비스무트, 예를 들어, 212Bi 또는 213Bi), 황, 예를 들어, 35S), 탄소, 예를 들어, 14C, 트리튬, 3H), 로듐, 예를 들어, 188Rh, 테크네튬, 예를 들어, 99Tc, 프라세오디뮴 또는 인, 예를 들어, 32P이다.
DNA 및 염색질 구조의 조절자
구현예에서, 페이로드는 DNA 구조의 내인성 또는 외인성 조절자를 포함한다. 페이로드의 전형으로서 조절자는 시험관내, 생체외 또는 생체내로 전달될 수 있다.
구현예에서, 페이로드는 DNA의 후성적 상태 또는 특징의 조절자를 포함한다. 구현예에서, 후성적 상태 또는 특징은 장애를 치료하기 위해 또는 세포의 발생 또는 다른 상태에 영향을 미치기 위해 변경될 수 있다.
구현예에서, 후성적 상태 또는 특징은 DNA 메틸화를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 페이로드는, 예를 들어, CpG 부위에서 예를 들어, 사이토신을 5-메틸사이토신으로 전환시키기 위해 DNA에 대한 메틸기의 첨가를 조절할 수 있다.
비정상 DNA 메틸화 패턴(예를 들어, 정상 조직에 비해 과메틸화 및 저메틸화)은 다양한 질환 및 병태, 예를 들어, 암과 관련된다. 본 명세서에 기재된 조절자는 전사적 침묵 유전자를 재활성화시키기 위해 또는 전사적 과활성 유전자를 저해하기 위해, 예를 들어, 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
DNA 메틸화는 유전자 전사에 영향을 미칠 수 있다. 고수준의 5-메틸사이토신을 지니는 유전자는, 예를 들어, 그들의 프로모터 영역에서, 전사적으로 덜 활성이거나 침묵일 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자의 전사 활성을 표적화 및 억제하기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, 조절자는 DNA 메틸화의 유지를 촉진한다. 예를 들어, 조절자는,예를 들어, DNA 복제 후에 DNA 메틸화를 유지하거나 또는 수동적 DNA 탈메틸화를 감소시키기 위해 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 활성을 갖거나 또는 DNMT 활성을 조절할 수 있다.
구현예에서, 조절자는 드노보(de novo) DNA 메틸화를 촉진시킨다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절자는, 예를 들어, 발생 초기에, 예를 들어, DNA 메틸화 패턴을 생성하기 위해 드노보 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)(예를 들어, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L) 활성을 갖거나 또는 드노보 DNMT(예를 들어, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L) 활성을 조절할 수 있다.
DNA의 후성적 변화(예를 들어, 메틸화)는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. DNA 메틸화를 검출하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 메틸화-특이적 PCR(MSP), 전체 게놈 아황산 시퀀싱(BS-Seq), HELP(결찰-매개 PCR에 의한 HpaII 작은 단편 풍부) 분석, 칩(ChIP)-온-칩 분석, 제한 기준점 게놈 스캐닝, 메틸화된 DNA 면역침전(MeDIP), 아황산 처리된 DNA의 파이로시퀀싱(pyrosequencing), DNA 아데닌 메틸트랜스퍼라제 활성에 대한 분자 파괴 광분석, 메틸 민감성 사우던 블롯팅, 메틸CpG 결합 단백질(MBP)를 이용하는 천연 DNA의 메틸화된 분획 및 비메틸화된 분획으로의 분리 및 단지 메틸 결합 도메인(MBD)을 함유하는 융합 단백질을 포함한다.
구현예에서, 조절자는 DNA를 절단한다. 예를 들어, 조절자는 DNA 백본에서 포스포디에스테르 결합의 가수분해절 절단을 촉매할 수 있다. 구현예에서, 조절자(예를 들어, DNase I)는 피리미딘 뉴클레오타이드에 인접한 포스포디에스테르 결합에서 DNA를 우선적으로 절단하여 3' 위치 상에서 유리 하이드록실기를 지니는 5'-포스페이트-말단 폴리뉴클레오타이드를 수득한다. 구현예에서, 조절자(예를 들어, DNase II)는 DNA에서 데옥시리보뉴클레오타이드 결합을 가수분해하여 3'-포스페이트를 지니는 산물을 수득한다. 구현예에서, 조절자는 엔도데옥시리보뉴클레아제 활성을 포함한다. 구현예에서, 조절자는 엑소데옥시리보뉴클레아제 활성을 포함한다(예를 들어, 3'에서 5'으로의 또는 5'에서 3'으로의 엑소데옥시리보뉴클레아제 활성을 가짐). 구현예에서, 조절자는 특이적 DNA 서열(예를 들어, 제한 효소)을 인식한다. 구현예에서, 조절자는 서열 특이적 방식으로 DNA를 절단하지 않는다. 조절자는 단일 가닥 DNA(예를 들어, 틈내기효소 활성을 가짐), 이중 가닥 DNA, 또는 둘 다를 절단할 수 있다.
구현예에서, 조절자는 3차 또는 4차 DNA 구조에 영향을 미치고, 예를 들어, 변경 또는 보존한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절자는 3차 구조, 예를 들어, 선성(handedness)(우 또는 좌), 나선 회전의 길이, 회전 당 염기 쌍의 수 및/또는 큰 홈(major groove)과 작은 홈(minor groove) 사이의 크기 차이를 조절할 수 있다. 구현예에서, 조절자는 B-DNA, A-DNA 및/또는 Z-DNA의 형성을 매개한다. 본 명세서에 기재된 조절자는 4차 구조, 예를 들어, 염색질의 형태로, 예를 들어, DNA와 다른 다른 분자(DNA 또는 비-DNA 분자, 예를 들어, 히스톤)의 상호작용을 조절할 수 있다. 구현예에서, 3차 또는 4차 DNA 구조를 매개 또는 변형하는 조절자는 DNA 헬리카제 활성을 포함하거나 또는 DNA 헬리카제 활성을 조절한다.
구현예에서, 조절자는 DNA 손상 반응 및/또는 수선을 촉진 또는 저해한다. 예를 들어, 조절자는 하나 이상의 DNA 손상 반응 및 수선 메커니즘, 예를 들어, 직접 반전, 염기 절단 수선(BER), 뉴클레오타이드 절단 수선(NER)(예를 들어, 전체적인 게놈 수선(GG-NER), 전사 결합 수선(TC-NER)), 미스매치 수선(MMR), 비상동성 말단 결합(NHEJ), 마이크로상동성-매개 말단 결합(MMEJ), 상동성 재조합 및/또는 트랜스레전(translesion) 합성(TLS)을 촉진시킬 수 있다. 구현예에서, 조절자는 손상 인식 단계를 촉진시킨다. 구현예에서, 조절자는 DNA 수선 단계를 촉진시킨다.
비정상 DNA 손상 수선은 다양한 질환 및 병태, 예를 들어, 노화, 유전성 DNA 수선 장애 및 암과 관련된다. 예를 들어, 암 위험을 증가시킬 수 있는 DNA 수선 유전자 돌연변이는, 예를 들어, BRCA1 및 BRCA2(예를 들어, 유방암 및 난소암에서, 예를 들어, 이중-가닥 파손의 상동성 재조합 수선(HRR) 및 딸 가닥 갭에 수반됨); ATM (예를 들어, 상이한 돌연변이는, 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 유방암에서 HRR, 단일 가닥 어닐링(SSA), NHEJ 또는 상동성-관련 DSBR(HDR)을 감소시킴), NBS(예를 들어, NHEJ에서, 예를 들어, 림프 악성종양에서 수반됨); MRE11(예를 들어, HRR에서, 예를 들어, 유방암에서 수반됨); BLM(예를 들어, HRR에서, 예를 들어, 백혈병, 림프종, 결장암, 유방암, 피부암, 이도암, 혀암, 식도암, 위암, 편도암, 후두암, 폐암 및 자궁암에 수반됨); WRN(예를 들어, HRR, NHEJ, 롱패치(long-patch) BER에서, 예를 들어, 연조직 육종, 결장직장암, 피부암, 갑상선암 및 췌장암에서 수반됨); RECQ4(RECQL4)(예를 들어, HRR에서 수반됨, 예를 들어, 로트문드 톰슨 증후군(RTS), RAPADILINO 증후군 또는 밸라 제롤드 증후군, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 보웬병을 포함하는 피부 암종을 야기함); FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM 및 FANCN(예를 들어, HRR 및 TLS에서, 예를 들어, 백혈병, 간 종양, 다수 위치의 고형 종양에 수반됨), XPC 및 XPE(DDB2)(예를 들어, NER(GGR 유형)에서, 예를 들어, 피부암(흑색종 및 비흑색종)에 수반됨); XPA, XPB, XPD, XPF 및 XPG(예를 들어, NER(GGR 유형과 TCR 유형 둘 다)에서, 예를 들어, 피부암(흑색종 및 비흑색종) 및 중추 신경계에 수반됨); XPV(POLH)(예를 들어, TLS에서, 예를 들어, 피부암(흑색종 및 비흑색종)에 수반됨); hMSH2, hMSH6, hMLH1 및 hPMS2(MMR에, 예를 들어, 결장직장암, 자궁내막암 및 난소암에 수반됨); MUTYH(예를 들어, 결장암에서, 예를 들어, 8OH-dG와 잘못 짝지어졌을 뿐만 아니라 G, FapydG 및 C와 잘못 짝지어진 BER에 수반됨)를 포함한다.
조절자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 DNA 손상 수선 메커니즘을 조절함으로써 비정상 DNA 손상 수선과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
구현예에서, 조절자는 직접 반전에 수반된 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 메틸 구아닌 메틸 트랜스퍼라제(MGMT)로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 BER, 예를 들어, DNA 글리코실라제, AP 엔도뉴클레아제, DNA 중합효소, DNA 리가제에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 GG-NER, 예를 들어, XPC, HR23b, CAK, TFIIH, XPA, RPA, XPG, XPF, ERCC1, TFIIH, PCNA, RFC, ADN Pol, 및 리가제 I에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 TC-NER, 예를 들어, CSB, XPA, RPA, XPG, XPF, ERCC1, CSA-CNS, TFIIH, CAK, PCNA, RFC, 리가제 I 및 RNA 중합효소 II에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 하나 이상의 DNA 미스매치 수선 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 NHEJ, 예를 들어, Ku70/80, DNA-PKcs, DNA 리가제 IV, XRCC4, XLF, 아르테미스(Artemis), DNA 중합효소 뮤, DNA 중합효소 람다, PNKP, 아파라탁신 및 APLF에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 상동성 재조합에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 TLS, 예를 들어, DNA 중합효소 에타, 이오타, 카파, 제타 및 PCNA에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 DNA 손상에 대한 전체적 반응, 예를 들어, DNA 손상 검사점 및/또는 DNA 손상에 대한 전사 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, DNA 손상 검사점은 G1/S 및 G2/M 경계에서 생길 수 있다. S 내의 검사점이 또한 존재할 수 있다. 검사점 활성화는 두 마스터 키나제, 즉, ATM 및 ATR에 의해 조절될 수 있다. ATM은 DNA 이중-가닥 파손 및 염색질 구조의 파괴에 반응할 수 있고, ATR은 정지된 복제 분기점에 반응할 수 있다. 이들 키나제는 신호 형질도입 캐스케이드에서 하류의 표적을 인산화시켜, 예를 들어, 세포 주기 차단을 야기할 수 있다. 하류의 단백질에 검사점 활성화 신호를 전송하는 검사점 매개체 단백질(예를 들어, BRCA1, MDC1 및 53BP1)의 부류는 조절될 수 있다. 조절될 수 있는 예시적인 하류의 단백질은, 예를 들어, p53, p21 및 사이클린/사이클린-의존적 키나제 복합체를 포함한다.
구현예에서, 조절자는 핵 DNA 손상 반응 및 수선을 조절한다. 구현예에서, 조절자는 미토콘드리아 DNA 손상 반응 및 수선을 조절한다.
구현예에서, 조절자는 DNA 복제를 촉진시키거나 또는 저해한다. 예를 들어, 조절자는 DNA 복제의 하나 이상의 단계, 예를 들어, 개시(예를 들어, 복제전 복합체 및/또는 개시 복합체의 조립체), 신장(예를 들어, 복제 분기점의 형성) 및 종결(예를 들어, 복제 분기점 장벽의 형성)을 촉진 또는 저해할 수 있다. 구현예에서, 조절자는 개시에 수반된 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 복제 개시점 인식 복합체(origin recognition complex: ORC), CDC6, CDT1, 꼬마염색체 유지 단백질(예를 들어, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7 및 MCM10), CDC45, CDK, DDK, CDC101, CDC102, CDC103 및 CDC105로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 조절자는 신장, 예를 들어, DNA 헬리카제, DNA 중합효소, PCNA, CDC45-MCM-GINS 헬리카제 복합체, 및 복제 인자 C 복합체에 수반된 하나 이상의 단백질로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 조절자는 종결에 수반된 하나 이상의 단백질, 예를 들어, II형 토포이소머라제 및 텔로머라제로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 조절자는 하나 이상의 복제 검사점 단백질, 예를 들어, ATM, ATR, ATRIP, TOPBP1, RAD9, HUS1, Rad1 및 CHK1로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
구현예에서, 페이로드는 핵 DNA 복제의 조절자를 포함한다. 구현예에서, 조절자는 미토콘드리아 DNA 복제를 촉진시키거나 또는 저해한다.
DNA 복제의 결함은 다양한 질환 및 병태, 예를 들어, 암 및 신경학적 질환(예를 들어, 알츠하이머병)과 관련될 수 있다. 미토콘드리아 DNA 복제의 결함은 또한 질환 및 병태, 예를 들어, mtDNA 고갈 증후군(예를 들어, 알퍼스 또는 조기 유아 간뇌 증후군) 및 mtDNA 결실 장애(예를 들어, 진행성 외안근 마비(PEO), 운동실조-신경병증 또는 미토콘드리아 신경위장 뇌병증(MNGIE))과 관련될 수 있다. 조절자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 DNA 복제를 조절함으로써 비정상 DNA 복제와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
DNA 구조의의 예시적인 내인성 또는 외인성 조절자는 본 명세서에, 예를 들어, 표 VI-3에 기재되어 있다.
표 VI-3
구현예에서, 페이로드는, 예를 들어, 단백질, 예를 들어, 히스톤과 관련된 염색질의 구성성분의 후성적 상태 또는 특징의 조절자를 포함한다. 예를 들어, 후성적 상태 또는 특징은 히스톤 아세틸화, 탈아세틸화, 메틸화(예를 들어, 모노, 디 또는 트리-메틸화), 탈메틸화, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화(예를 들어, 모노 또는 폴리유비퀴틴화), 탈유비퀴틴화, 수모화(sumoylation), ADP-리보실화, 탈이민화 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
구현예에서, 조절자는 하나 이상의 히스톤 변형 효소로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT)이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 히스톤 탈메틸트랜스퍼라제(HDMT)이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT)이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC)이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 키나제이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 포스파타제이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 유비퀴틴-활성화 효소(E1)이다, 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소(E2), 또는 유비퀴틴 리가제(E3)이다. 구현예에서, 히스톤 변형 효소는 탈유비퀴틴화(DUB) 효소이다.
구현예에서, 유전자 전사의 조절에 수반된 히스톤 변형은 조절된다. 예를 들어, H3K4, H3K9, H3K27, H3K79, H4K20, H2BK5의 모노 메틸화, H3K79의 디-메틸화, H3K4, H3K79, H3K36의 트리-메틸화, 및 H3K9, H3K14, H3K27의 아세틸화는 전사 활성화와 관련된다. 다른 예로서, H3K9, H3K27의 디메틸화, 및 H3K9, H3K27, H3K79, H2BK5의 트리메틸화는 전사 억제와 관련될 수 있다. 구현예에서, 조절자는, 예를 들어, 활성 유전자에서 H3 리신 4의 트리메틸화(H3K4Me3) 및/또는 H3 리신 36의 트리메틸화(H3K36Me3)를 조절한다. 구현예에서, 조절자는, 예를 들어, 억제 유전자에서 H3 리신 27의 트리메틸화(H3K27Me3), H3 리신 9의 디- 및 트리메틸화(H3K9Me2/3), 및/또는 H4 리신 20의 트리메틸화(H4K20Me3)를 조절한다. 구현예에서, 조절자는, 예를 들어, 줄기 세포에서 활성화(예를 들어, H3K4Me3)와 억제(예를 들어, H3K27Me3) 마크를 둘 다 조절한다.
구현예에서, DNA 손상 반응 및 수선에 수반된 히스톤 변형은 조절된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절자는 세린 139에서 H2AX의 인산화 및/또는 H3 리신 56의 아세틸화(H3K56Ac)를 조절할 수 있다.
비정상 히스톤 변형은 다양한 질환 및 병태, 예를 들어, 암, 심혈관계 질환 및 신경퇴행성 장애와 관련된다. 본 명세서에 기재된 조절자는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 하나 이상의 히스톤 변형을 조절함으로써 본 명세서에 기재된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
히스톤에서 후성적 변화는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 히스톤 변형을 검출하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들어, 변형된 히스톤에 대해 항체를 이용하는 염색질 면역침전법(ChIP) 다음에, 예를 들어, 정량적 PCR을 포함한다.
염색질 구조의 예시적인 내인성 또는 외인성 조절자는 본 명세서에, 예를 들어, 표 VI-4에 기재되어 있다.
표 VI-4
유전자 발현의 조절자
구현예에서, 페이로드는 유전자 발현의 조절자를 포함한다. 유전자 발현의 조절자는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 전달될 수 있다.
구현예에서, 페이로드는 전사 인자를 포함한다. 전사 인자는 그들이 조절하는 유전자에 인접한 특이적 DNA 서열(예를 들어, 인핸서 또는 프로모터 영역)에 결합할 수 있다. 예를 들어, 전사 인자는 DNA에 대한 RNA 중합효소의 결합을 안정화 또는 저해할 수 있거나, (예를 들어, 직접적으로 또는 이러한 촉매적 활성을 지니는 다른 단백질을 동원함으로써) 히스톤 단백질의 아세틸화 또는 탈아세틸화를 촉매하거나 또는 전사 인자/DNA 복합체에 대한 공활성체 또는 코리프레서 단백질을 동원한다. 유전자 발현의 조절자는 또한, 예를 들어, 전사 인자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 임의의 단백질을 포함한다.
구현예에서, 전사 인자는 일반적 전사 인자이며, 예를 들어, 아주 흔하고, 다수의, 대부분의 또는 모든 클래스 II 유전자의 전사 시작 부위(들)를 둘러싸는 코어 프로모터 영역과 상호작용한다. 예시적인 일반적 전사 인자는, 예를 들어, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF 및 TFIIH를 포함한다. 구현예에서, 전사 인자는 상류의 전사 인자이며, 예를 들어, 전사를 자극 또는 억제하기 위해 개시 부위의 상류에 결합한다. 구현예에서, 전사 인자는 특이적 전사 인자, 예를 들어, 유전자의 근위에 존재하는 인식 서열에 의존하는 전사 인자이다. 예시적인 특이적 전사 인자는, 예를 들어, SP1, AP-1, C/EBP, 열 충격 인자, ATF/CREB, -Myc, OCT-1 및 NF-1를 포함한다.
구현예에서, 전사 인자는 구성적으로 활성인, 예를 들어, 일반적 전사 인자, SP1, NF-1 또는 CCAAT이다. 구현예에서, 전사 인자는 조건적으로 활성이며, 예를 들어, 이는 활성화, 예를 들어, 발생적(예를 들어, GATA, HNF, PIT-1, MyoD, Myf5, Hox, 익상 나선), 신호 의존적(예를 들어, 세포외 리간드 (내분비 또는 파라크린)-의존적, 세포내 리간드(자가분비)-의존적(예를 들어, SREBP, p53, 고아 핵 수용체), 세포막 수용체-의존적(예를 들어, 거주 핵 인자(예를 들어, CREB, AP-1, Mef2) 또는 잠복성 세포질 인자(예를 들어, STAT, R-SMAD, NF-κB, 노치(Notch), TUBBY, NFAT)를 필요로 한다.
다른 예시적인 전사 인자는 본 명세서에, 예를 들어, 표 VI-5에 기재되어 있다.
표 VI-5
대안적 스플라이싱의 조절자
구현예에서, 유전자 발현의 조절자는 스플라이싱을 조절한다. 예를 들어, 조절자는 엑손 스키핑 또는 카세트 엑손, 상호 배타적 엑손, 대안적 도너 부위, 대안의 억셉터 부위, 인트론 체류 또는 이들의 조합을 조절할 수 있다. 구현예에서, 조절자는 하나 이상의 일반적 또는 대안적 스플라이싱 인자, 예를 들어, ASF1로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 조절자는 농도 의존적 방식으로 대안적 스플라이싱을 조절한다(예를 들어, 스플라이스 부위 선택에 영향을 미친다).
전사후 변형의 조절자
구현예에서, 유전자 발현의 조절자는 전사후 변형을 조절한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절자는 5' 캡핑, 3' 폴리아데닐화 및 RNA 스플라이싱을 촉진시키거나 또는 저해할 수 있다. 구현예에서, 조절자는 5' 캡핑에 관여하는 하나 이상의 인자(예를 들어, 포스파타제 및 구아노실 트랜스퍼라제)로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 조절자는 3' 폴리아데닐화에 관여하는 하나 이상의 인자(예를 들어, 폴리아데닐레이트 중합효소, 절단 및 폴리아데닐화 특이성 인자(CPSF) 및 폴리(A) 결합 단백질)로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다. 구현예에서, 조절자는 RNA 스플라이싱에 관여하는 하나 이상의 인자, 예를 들어, 일반적 또는 대안적 스플라이싱 인자로부터 선택되거나 또는 이를 조절한다.
전사후 변형의 예시적인 내인성 또는 외인성 조절자는 본 명세서에, 예를 들어, 표 VI-6에 기재되어 있다.
표 VI-6
저해제
구현예에서, 페이로드는 상기 기재한 페이로드의 저해제, 예를 들어, 효소 전사 인자의 저해제를 포함한다. 구현예에서, 페이로드는 앞서 언급한 임의의 페이로드 분자, 과정, 활성 또는 메커니즘의 저해제를 포함한다. 구현예에서, 저해제는 본 명세서에 기재된 페이로드 분자 중 하나에 특이적인 항체 분자(예를 들어, 전체 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이다. 구현예에서, 저해제는 소분자 화합물이다. 구현예에서, 저해제는 핵산(예를 들어, siRNA, shRNA, 리보자임, 안티센스-올리고뉴클레오타이드 및 앱타머)이다. 예를 들어, 페이로드는 표적, 예를 들어, 전사 인자, 번역후 변형 효소, 전사후 변형 효소 등 또는 앞서 언급한 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열의 저해제이다.
오솔로그
비인간 유전자 또는 단백질이 본 명세서에 인용된다면, 본 발명은 또한 인간 상대 또는 이의 오솔로그 및 용도를 포함하는 것으로 이해된다.
VIIA. 표적: 세포
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포(예를 들어, 동물 세포 또는 식물 세포)를 조작하기 위해, 예를 들어, 매우 다양한 세포에서, 페이로드를 전달하기 위해 또는 표적 핵산을 편집하기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고 eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다. 전달 또는 편집은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
구현예에서, 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 유전자를 편집(예를 들어, 돌연변이 도입 또는 수정)함으로써 조작된다. 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 세포의 게놈 내 표적 서열에 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은) 하나 이상의 조절자를 포함하는 페이로드를 세포에 전달함으로써 조작된다. 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 표적 유전자)의 발현은, 예를 들어, 생체내에서 조절된다. 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 표적 유전자)의 발현은, 예를 들어, 생체외에서 조절된다.
구현예에서, 세포는 하나의 세포로부터 다른 세포로 조작된다(예를 들어, 전환 또는 분화된다). 구현예에서, 췌장 세포는 베타섬 세포로 조작된다. 구현예에서, 섬유아세포는 iPS 세포로 조작된다. 구현예에서, 전지방세포는 갈색 지방 세포로 조작된다. 다른 예시적인 세포는, 예를 들어, 근육 세포, 신경 세포, 백혈구 및 림프구를 포함한다.
구현예에서, 세포는 병에 걸린 세포 또는 돌연변이체 보유 세포이다. 이러한 세포는 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, 세포의 돌연변이를 수정하기 위해 또는 세포의 표현형을 변경시키기 위해, 예를 들어, 암세포의 성장을 저해하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 질환 또는 병태와 관련된다. 구현예에서, 세포는 암 줄기 세포이다. 예를 들어, 암 줄기 세포는 TWIST(TF), HIF-1α, HER2/neu, 스네일(Snail)(TF) 또는 Wnt로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절함으로써 조작될 수 있다.
구현예에서, 조작된 세포는 정상 세포이다.
구현예에서, 조작된 세포는 줄기 세포 또는 조상 세포(예를 들어, iPS, 배아, 조혈, 지방, 생식계열, 폐 또는 신경 줄기 또는 조상 세포)이다.
구현예에서, 조작된 세포는 재조합 생물학적 산물을 생성하는데 적합하다. 예를 들어, 세포는 CHO 세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 구현예에서, 조작된 세포는 단백질을 발현시키도록 공학처리된 세포이다.
구현예에서, 조작 중인 세포는 섬유아세포, 단핵구성 전구체, B 세포, 외분비 세포, 췌장 조상 세포, 내분비 조상 세포, 간모세포, 근원세포 또는 지방전세포로부터 선택된다. 구현예에서, 세포는 근세포, 적혈구-거대핵생성 세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타-세포, 뉴런, 심근세포, 혈액 세포, 내분비 조상 세포, 외분비 조상 세포, 유관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포, 또는 갈색 지방세포로 조작된다(예를 들어, 전환 또는 분화된다).
구현예에서, 세포는 근세포, 적혈구-거대핵생성 세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타-세포, 뉴런, 심근세포, 혈액 세포, 내분비 조상 세포, 외분비 조상 세포, 유관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포 또는 백색 또는 갈색 지방세포이다.
본 명세서에 기재된 Cas9 및 gRNA 분자는 표적 세포에 전달될 수 있다. 구현예에서, 표적 세포는 정상 세포이다.
구현예에서, 표적 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포(예를 들어, iPS, 배아, 조혈, 지방, 생식계열, 폐 또는 신경 줄기 또는 전구체 세포)이다.
구현예에서, 표적 세포는 CHO 세포이다.
구현예에서, 표적 세포는 섬유아세포, 단핵구성 전구체, B 세포 외분비 세포, 췌장 조상 세포, 내분비 조상 세포, 간모세포, 근원세포 또는 지방전세포이다.
구현예에서, 표적 세포는 근세포, 적혈구-거대핵생성 세포, 호산구, iPS 세포, 대식세포, T 세포, 섬 베타-세포, 뉴런(예를 들어, 뇌의 뉴런, 예를 들어, 선조체의 뉴런(예를 들어, 중형 돌기 뉴런), 대뇌겉질, 중심전회, 해마(예를 들어, 해마의 치상회 또는 CA3 영역의 뉴런), 측두엽, 편도체, 전두엽, 시상, 소뇌, 수질, 피곡, 시상하부, 시개, 피개 또는 흑질), 심근세포, 혈액 세포, 내분비 조상 세포, 외분비 조상 세포, 유관 세포, 선포 세포, 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포, PP 세포, 간세포, 담관세포 또는 갈색 지방세포이다.
구현예에서, 표적 세포는 하나 이상의 표적 유전자를 편집(예를 들어, 돌연변이 도입 또는 수정) 및/또는 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 조절함으로써 생체외에서 조작되고, 대상체에게 투여된다.
조작될 수 있는 예시적인 세포 및 조절될 수 있는 예시적인 유전자는 표 VII-8에 기재되어 있다.
표 VII-8
표 VII-9
표 VII-10
표 VII-11
표 VII-12
암 줄기세포(CSC)의 예시적인 내인성 또는 외인성 조절자는 본 명세서에, 예를 들어, 표 VII-13에 기재되어 있다.
표 VII-13
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 예를 들어, 세포 생착을 증가시키기 위해, 예를 들어, 천연 미세환경에 세포의 안정한 생착을 달성하기 위해 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포)를 조작하는데, 예를 들어, 페이로드를 전달하는데 또는 표적 핵산을 편집하는데 사용될 수 있다. 생착 세포, 천연 미세환경의 세포 또는 둘 다는 조작될 수 있다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고, eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다.
예를 들어, 세포 생착의 증가된 효율은 다음의 것에 의해 달성될 수 있다: 본 명세서에 기재된 유전자, 예를 들어, 귀소 유전자, 부착 유전자, 생존 유전자, 증식 유전자, 면역 회피 유전자 및/또는 세포 보호 유전자 중 하나 이상의 발현의 증가 및/또는 본 명세서에 기재된 유전자, 예를 들어, 휴지 유전자, 사멸/세포자멸사 유전자 및/또는 면역 인식 유전자 중 하나 이상의 발현의 감소.
구현예에서, 유전자는, 예를 들어, 조직-발현 리간드와 관련된 조직 또는 가용성 사이토카인에서 풍부한 영역에 대한 세포 이동을 지향하는데 수반된 귀소 수용체 또는 부착 분자를 암호화한다. 구현예에서, 귀소 수용체 또는 부착 분자는 백혈구, 예를 들어, 림프구 또는 조혈 줄기 세포 상에서 발현된다. 구현예에서, 조직은 골수, 예를 들어, 세포외 매트릭스 또는 기질 세포이다. 구현예에서, 귀소 수용체 또는 부착 분자는 C-X-C 케모카인 수용체 4형(CXCR4, 또한 퓨신 또는 CD184로서 공지됨)이다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포 상에서 CXCR4의 발현은 상향조절된다. 구현예에서, 리간드는 기질 유래 인자-1(SDF-1, 또한 CXCL12로서 알려짐)이다. 구현예에서, 귀소 수용체 또는 부착 분자는 CD34이다. 구현예에서, 리간드는 어드레신(또한 점막 혈관 어드레신 세포 부착 분자 1(MAdCAM-1))이다.
구현예에서, 유전자는 리간드, 예를 들어, 케모카인 또는 사이토카인에 결합한, 예를 들어, 줄기 세포 또는 조상 세포 상에서 발현되는 수용체를 암호화한다. 예를 들어, 수용체는 세포의 줄기성(stemness) 및/또는 지향하는 미세환경에 대한 세포의 유인과 관련될 수 있다. 구현예에서, 수용체는 조혈 줄기 세포 상에서 발현된다. 구현예에서, 수용체는 신경 줄기 세포 상에서 발현된다. 구현예에서, 수용체는 비만/줄기 세포 성장 인자 수용체(SCFR, 또한 광발암유전자 c-키트 또는 티로신-단백질 키나제 키트 또는 CD117로서 알려짐)이다. 구현예에서, 리간드는 줄기 세포 인자(SCF, 또한 스틸 인자(steel factor) 또는 c-키트 리간드로서 알려짐)이다. 구현예에서, 수용체는 골수증식성 백혈병 바이러스 발암유전자(MPL, 또한 CD110으로서 알려짐)이다. 구현예에서, 리간드는 트롬보포이에틴(TPO)이다.
구현예에서, 유전자는, 예를 들어, 마커를 발현시키는 세포의 생존 또는 증식을 촉진시키는 마커를 암호화하거나, 또는 면역 반응을 회피하도록 또는 예를 들어, 세포사를 야기하는 유해 환경으로부터 보호하도록 해당 마커를 발현시키는 세포를 허용한다. 예를 들어, CD47(또한 인테그린 관련 단백질(IAP)로서 알려짐)을 발현시키는 세포는, 예를 들어, 세포 이동 동안 식세포작용을 회피할 수 있다. 다른 예로서, BCL2를 발현시키는 세포는 세포자멸사로부터 보호될 수 있다. 구현예에서, 세포는 혈액 세포, 예를 들어, 적혈구 또는 백혈구이다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조상 세포 세포이다.
구현예에서, 줄기 세포 또는 조상 세포 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 조상 세포 세포에서 CXCR4, SDF1, CD117, MPL, CD47 또는 BCL2 중 하나 이상의 발현은 상향조절된다.
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포)를 조작하기 위해, 예를 들어, 페이로드를 전달하기 위해 또는 표적 핵산을 편집하기 위해, 예를 들어, 표적화된 세포의 운명을 조작(예를 들어, 지시)하기 위해, 예를 들어, 관심 대상인 표적 특이적 세포 유형을 및/또는 자살 메커니즘으로서 더 양호하게 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고/되거나 eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다. 조절될 수 있는 예시적인 유전자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 화학요법 내성 유전자, 화학요법 민감성 유전자, 항생제 내성 유전자, 항생제 민감성 유전자, 및 세포 표면 수용체 유전자 중 하나 이상을 포함한다.
구현예에서, 화학요법 내성 유전자, 화학요법 민감성 유전자, 항생제 내성 유전자 및/또는 항생제 민감성 유전자는, 예를 들어, 변형된 또는 바람직하지 않은 세포(예를 들어, 골수에서의, 예를 들어, 변형된 또는 바람직하지 않은 조혈 줄기 세포(HSC))가, 예를 들어, 화학치료 또는 항생제 치료에 의해 감소 또는 제거될 수 있도록 조절된다.
예를 들어, 화학요법 내성 또는 항생제 내성을 조절하는(예를 들어, 증가시키는) 유전자 또는 유전자 산물은 세포 내로 전달될 수 있다. 화학요법 또는 항생제 내성 유전자 또는 유전자 산물에 의해 변형된 세포는 화학치료 또는 항생제 치료 후에 이러한 변형이 없는 세포보다 생존률이 더 높을 수 있다(예를 들어, 적어도 약 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 25 배, 50 배, 75 배 또는 100 배 더 높음). 구현예에서, 화학치료 또는 항생제 치료는 생체내에서 수행된다. 구현예에서, 화학치료 또는 항생제 치료는 시험관내 또는 생체외에서 수행된다. 구현예에서, 화학요법 내성 유전자는 O6-알킬구아닌 DNA 알킬트랜스퍼라제(MGMT)를 암호화하는 유전자이다. 구현예에서, 화학요법은 테모졸로마이드를 포함한다.
다른 예로서, 화학요법 민감성 또는 항생제 민감성을 조절하는(예를 들어, 증가시키는) 유전자 또는 유전자 산물은 세포에 전달될 수 있다. 화학요법 민감성 또는 항생제 민감성을 부여하는 유전자 또는 유전자 산물은, 예를 들어, 세포의 세포자멸사를 야기하는 자살 신호로서 사용될 수 있다. 화학요법 민감성 또는 항생제 민감성 유전자 또는 유전자 산물에 의해 변형되는 세포는 화학치료 또는 항생제 치료가 없는 세포보다 생존률이 더 낮을 수 있다(예를 들어, 적어도 약 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 25 배, 50 배, 75 배 또는 100배 더 낮음). 구현예에서, 화학치료 또는 항생제 치료는 생체내에서 수행된다. 구현예에서, 화학치료 또는 항생제 치료는 시험관내 또는 생체외에서 수행된다.
본 명세서에 기재된 방법은 변형된 또는 목적으로 하는 표현형, 예를 들어, 화학요법 내성 및/또는 항생제 내성을 갖는 세포를 선택하기 위해 또는 풍부화하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 또한 변형된 또는 바람직하지 않은 표현형, 예를 들어, 화학요법 민감성 및/또는 항생제 민감성을 갖는 세포 수를 제거하거나 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 원치않는 게놈 위치 또는 세포 유형에서 핵산의 편집에 의해 야기된, 예를 들어, 원치않는 효과, 예를 들어, 표적을 벗어난 효과 또는 암 표현형을 나타내는 세포는 제거될 수 있다.
구현예에서, 세포 표면 수용체 유전자는, 치료제(예를 들어, 치료적 항체)가 세포 표면 수용체의 증가된 또는 감소된 발현을 갖는 세포를 표적화하기 위해(예를 들어, 세포를 사멸시키기 위해) 사용될 수 있도록 조절된다(예를 들어, 세포 표면 수용체의 발현이 증가 또는 감소됨). 구현예에서, 세포는 표면 수용체는 CD20이다. 구현예에서, 치료적 항체는 리툭시맙이다.
구현예에서, 세포 표면 수용체는, 예를 들어, CD52, VEGFR, CD30, EGFR, CD33 또는 ErbB2로부터 선택된다. 구현예에서, 치료적 항체는, 예를 들어, 알렘투주맙, 리툭시맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 겐투자우맙 및 트라스투주맙으로부터 선택된다. 구현예에서, 세포 표면 수용체는 CD52이고, 치료적 항체는 알렘투주맙이다. 구현예에서, 유전자는 VEGF를 암호화하고, 치료적 항체는 리툭시맙이다. 구현예에서, 세포 표면 수용체는 EGFR이고, 치료적 항체는 세툭시맙 또는 파니투무맙이다. 구현예에서, 세포 표면 수용체는 CD33이고, 치료적 항체는 겐투자우맙이다. 구현예에서, 세포 표면 수용체는 ErbB2이고, 치료적 항체는 트라스투주맙이다.
구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 발현 또는 활성은, 예를 들어, 세포가 약물, 예를 들어, 항생제로, 예를 들어, 생체내에서 치료될 때 유도 또는 억제된다. 예를 들어, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 발현 또는 활성의 유도 또는 억제는, 예를 들어, 특정 조직에서 독성 및/또는 표적을 벗어난 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 구현예에서, Cas9 분자, gRNA 분자, 또는 둘 다의 발현은 유도성 프로모터에 의해 유도된다. 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자에 대한 약물(예를 들어, 항생제)의 결합은 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 활성을 활성화 또는 저해한다. 구현예에서, 약물(예를 들어, 항생제)은 국소로 투여된다. 구현예에서, 세포는 약물(예를 들어, 항생제)로 치료된 세포는 눈, 귀, 코, 입 또는 피부에 위치된다.
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포)를 조작하기 위해, 예를 들어, 페이로드를 전달하기 위해, 또는 표적 핵산을 편집하기 위해, 예를 들어, 지향 효소 프로드러그 요법(directed enzyme prodrug therapy: DEPT)에서 사용될 수 있다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고, eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다.
지향 효소 프로드러그 요법(DEPT)은 생물학적 활성이 없거나 또는 불량한 프로드러그를 신체 내의 목적으로 하는 위치에서 활성 형태로 전환시키기 위해 신체 내에 인공적으로 도입된 효소를 사용한다. 예를 들어, 지향 효소 프로드러그 요법은 목적으로 하는 부위에서만 고수준의 활성 약물을 달성함으로써 약물의 전신 독성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
구현예에서, 프로드러그 전환에 필요한 효소 또는 이러한 효소를 암호화하는 유전자는 표적 세포, 예를 들어, 암세포에 전달된다. 예를 들어, 효소 또는 유전자는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, 프로드러그 전환에 필요한 효소를 암호화하는 유전자는 바이러스 벡터에 의해 전달된다.
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 세포)를 조작하기 위해, 예를 들어, 페이로드를 전달하기 위해 또는 표적 핵산을 편집하기 위해, 예를 들어, 면역요법, 예를 들어, 암 면역요법을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고, eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다. 조절될 수 있는 예시적인 유전자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 유전자, 예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2 유전자를 포함한다.
VIIB. 표적: 경로 및 유전자
Cas9 분자 및 gRNA 분자들, 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 예를 들어, 경로의 RNA 또는 단백질을 암호화하는 서열, 또는 경로의 RNA 또는 단백질의 발현을 제어하는 서열을 표적화함으로써 1 개, 2 개, 3 개 이상의 구성요소 또는 경로를 조작하는데 사용될 수 있다. 구현예에서, 제1 경로의 구성요소 및 제2 경로의 구성요소는 조작된다. 구현예에서, 조작은 표적 핵산에 대한 페이로드의 전달 또는 편집을 포함한다. 통상적으로 eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 페이로드를 전달하기 위해 사용되고 eaCas9 분자/gRNA 복합체는 표적 핵산의 구조를 편집 또는 변경시키기 위해 사용된다. 전달 또는 편집은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
경로의 구성요소는 상향 또는 하향조절될 수 있고, 예를 들어, 경로의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현은 증가 또는 감소될 수 있다. 증가 또는 감소는 페이로드(예를 들어, 전사 인자 또는 전사 인자의 저해제)의 전달에 의해 또는 표적 핵산(예를 들어, 제어 또는 암호화 영역에서 서열을 변경시키기 위한, 예를 들어, 돌연변이를 수정 또는 도입하기 위한, 예를 들어, 주형 핵산의 사용)의 편집에 의해 달성될 수 있다.
예시적인 경로는 세포 증식; 세포 주기; 탄소 대사; 에너지 대사; 해당과정, 혐기성 호흡, 호기성 호흡; 막관통 신호 형질도입, 신생혈관생성, DNA 복제 또는 수선 또는 통증과 관련된 경로를 포함한다.
예시적인 경로 및 유전자는 본 명세서에서 논의된다. 경로 또는 유전자는 세포 또는 유기체 기능의 하나 이상의 양태와 관련될 수 있고, 예를 들어, 경로 또는 유전자는 암과 에너지 대사 둘 다에 수반될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 경로 또는 유전자의 조작은 이하에 열거되는 예시적인 세포 또는 유기체 기능이지만, 이들로 제한되지 않는다. 구현예에서, 경로는 하나 이상의 질환 또는 병태와 관련된다.
구현예에서, 경로는 암과 관련되고, 예를 들어, 증식(예를 들어, RAF 경로), 성장 리프레서의 회피, 세포사 저항, 복제 불멸/노화의 가능, 신생혈관생성 유도, 침습 및 전이의 활성화, 에너지 대사 및 암 줄기세포의 회피, 사이토카인-수용체 상호작용 또는 종양 억제유전자와 관련된다. 구현예에서, 경로는 세포 주기 제어와 관련된다. 구현예에서, 경로는 신생혈관생성과 관련된다.
암과 관련된 경로 및 유전자는 본 명세서에 기재되어 있으며, 예를 들어, 다음을 포함한다:
표 VII-14
표 VII-15
표 VII-16에 제공된 유전자와 관련된 임의의 다음의 암이 표적화될 수 있다.
표 VII-16
에너지 대사와 관련된 예시적인 경로 및 유전자는 표 VII-17에 제공된다. 본 명세서에 개시된 예시적인 대사 표적은 본 명세서에 기재된 CRISPR/Cas9를 이용하여 조절될 수 있다. 조절은 관심 대상 유전자의 넉다운, 유전자에서의 결함 또는 돌연변이 수정 또는 관심 대상 유전자의 활성화를 위해 사용될 수 있다.
표 VII-17
구현예에서, 본 명세서에, 예를 들어, 표 VII-17에 기재된 경로 및 유전자는 또한 당뇨병, 비만 및/또는 콜레스테롤 및 지질과 관련된다.
세포 주기와 관련된 예시적인 경로 및 유전자를 표 VII-18에 제공한다.
표 VII-18
기능에 따라 특성 규명한 예시적인 세포 주기 유전자를 표 VII-19에 제공한다.
표 VII-19
신생혈관생성과 관련된 예시적인 경로 및 유전자를 표 VII-20에 제공한다.
표 VII-20
미토콘드리아 기능과 관련된 예시적인 경로 및 유전자를 표 VII-24에 제공한다.
표 VII-24
DNA 손상 및 게놈 불안정과 관련된 경로 및 유전자는 표 VII-21에 제공하는 다음의 메틸 트랜스퍼라제, 히스톤 메틸화, 헬리카제 활성, 뉴클레오타이드 절제 수선, 재조합 수선, 또는 미스매치수선을 포함한다. 또한 표 VI-22 참조.
표 VII-21
표 VII-22
이 표에서 통증에 적절한 수용체 및 이온통로구를 포함하는 유전자는 편집 또는 페이로드 전달에 의해 표적화될 수 있다. 통증과 관련된 경로 및 유전자는 본 명세서에 기재되며, 예를 들어, 다음 표 VII-23의 유전자를 포함한다.
표 VII-23
VIII. 표적: 질환 유발 유기체와 연관된 장애
Cas9 분자, 전형적으로 eiCas9 분자 또는 eaCas9 분자, 및 gRNA 분자들, 예를 들어, eiCas9 분자/gRNA 분자 복합체, 예를 들어, eaCas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 질환 유발 유기체와 연관된 질환을 치료 또는 제어하는 데, 예를 들어, 감염 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 감염 질환은, 예를 들어, 유기체 또는 대상체의, 하나 이상의 표적 유전자를 편집(예를 들어, 수정)함으로써 치료된다. 구현예에서, 감염 질환은 하나 이상의 페이로드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 질환 유발 유기체의 세포 또는 대상체의 감염된 세포로, 예를 들어, 표적 유전자로 전달함으로써 치료된다. 구현예에서, 표적 유전자는 감염 병원체에 존재한다. 예시적인 감염 병원체는, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생 동물 또는 다세포 기생충을 포함한다.
구현예에서, 표적 유전자는 숙주 세포에 존재한다. 예를 들어, 숙주 세포 중 표적 유전자의 조절은 감염 병원체에 대한 내성을 야기할 수 있다. 감염 병원체의 생활사의 임의의 단계(예를 들어, 유입, 복제, 잠복)에서 수반되는 숙주 유전자는 조절될 수 있다. 구현예에서, 표적 유전자는 감염 병원체에 대한 세포 수용체 또는 공동 수용체를 암호화한다. 구현예에서, 감염 병원체는 바이러스, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스, 예를 들어, HIV이다. 구현예에서, 표적 유전자는 HIV에 대한 공동 수용체, 예를 들어, CCR5 또는 CXCR4를 암호화한다.
본 명세서에 기재된 분자 및 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 감염 질환은, 예를 들어, AIDS, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 단순포진, HPV 감염, 또는 인플루엔자를 포함한다.
예시적인 표적이 표 VIII-1에 제공되어 있다. 질환 및 원인균이 제공되어 있다.
표 VIII-1
AIDS/HIV
HIV 게놈 구조 구성요소
긴 말단 반복순서(LTR)는 통합된 프로바이러스의 게놈을 측접하는 DNA 서열을 지칭한다. 이는 중요한 조절 영역, 특히 전사 개시 및 폴리아데닐화를 위한 조절 영역을 포함한다.
바이러스의 전사 촉진을 위한 표적 서역(TAR), 즉 Tat 단백질 및 세포 단백질에 대한 결합 부위는, HIV-1 중 바이러스 mRNA의 처음 약 45 개(또는 HIV-2 및 SIV 중 처음 100 개의 뉴클레오타이드)로 이루어진다. TAR RNA는 측면 벌지(bulge)를 지니는 헤어핀 줄기-루프 구조를 형성하며; 상기 벌지는 Tat 결합 및 기능에 필요하다.
Rev 반응 구성요소(RPE)는 HIV-1의 env 영역 내에서 암호화되는 RNA 구성요소를 지칭한다. 이는 약 200 개의 뉴클레오타이드(HIV-1 중 전사 시작으로부터 위치 7327 내지 7530, gp120과 gp41의 경계에 걸쳐 이어짐)로 이루어진다. RRE는 Rev 기능에 필요하며; 이는 Rev에 대한 고친화도 부위를 포함하고; 모두 합쳐, Rev에 대한 약 7 개의 결합 부위가 RRE RNA 내에 존재한다. 다른 렌티바이러스(HIV-2, SIV, 비스나, CAEV)는 env 내 유사한 위치에 유사한 RRE 구성요소를 가지지만, HTLV는 이의 LTR 내에 동일한 목적을 제공하는 유사한 RNA 구성요소(RXRE)를 가지며; RRE는 Rev 단백질에 대한 결합 부위인 반면, RXRE는 Rex 단백질에 대한 결합 부위이다. RRE(및 RXRE)는, 특이적인 단백질 결합에 필요한 복잡한 2차 구조를 형성한다.
Psi 구성요소(PE)는, Gag p7 MC 단백질에 존재하는 정규 서열CysX2CysX4HisX4Cys(서열번호 41)에 의해 인식되는 부위인 Gag 개시 코돈에 선행하고 상기 개시 코돈과 중첩되는 4 개의 스템-루프 구조의 세트이다. Psi 구성요소는 스플라이싱되지 않은 게놈 전사체에 존재하지만, 스플라이싱된 바이러스 mRNA에는 존재하지 않는다.
스템-루프 구조 다음에 존재하는 TTTTTT 슬리퍼리 부위인 SLIP는 Gag 리딩 프레임에서 벗어나 Pol 리딩 프레임으로 -1 리보솜 프레임시프트를 조절하는 역할을 담당한다.
Cis-작용 억압 서열(CRS)은 Rev의 부재 하에서 구조적 단백질 발현을 저해하는 것으로 상정된다. 이러한 하나의 부위는 HIV-1의 pol 영역 내에서 매핑되었다. 정확한 기능은 정의되지 않았으며; 스플라이스 부위는 CRS 서열로서 작용하는 것으로 상정되었다.
저해/불안정 RNA 서열(INS)은 HIV-1 및 다른 복잡한 레트로바이러스의 구조적 유전자 내에서 발견된다. 다수의 INS 구성요소가 게놈 내에 존재하며 독립적으로 작용할 수 있고; 가장 잘 특징지어진 구성요소 중 하나는 HIV-1의 gag 영역에서 뉴클레오타이드 414 내지 631에 걸쳐있다. INS 구성요소는 전사후 발현을 저해하는 구성요소로서 기능 분석에 의해 정의되었다. RNA 구성요소의 돌연변이는 INS 불활성화 및 유전자 발현의 상향 조절을 초래하는 것으로 나타났다.
복제를 위한 필수 유전자 및 유전자 산물
캡시드 단백질(그룹 특이적 항원)을 암호화하는 게놈 영역(GAG). 전구체는 p55 미리스틸화 단백질이며, 이는 바이러스 프로테아제에 의해 p17(매트릭스), p24(캡시드), p7(뉴클레오캡시드), 및 p6 단백질로 가공된다. Gag는 바이러스 조립체가 발생하는 원형질막과 회합된다. 55 kDa의 Gag 전구체는 바이러스 조립체에서 역할을 나타내는 어셈블린(assemblin)으로 불린다.
바이러스 효소 프로테아제, 역전사효소, RNAse, 및 인테그라제를 암호화하는 게놈 영역인 POL. 이들 효소는 Gag-Pol 전구체 폴리단백질로서 생성되고, 이는 바이러스 프로테아제에 의해 가공되며; Gag-Pol 전구체는 gag의 말단 근처에서 리보솜 프레임시프팅에 의해 생성된다.
외부 당단백질 gp120과 막관통 당-단백질 gp41의 비공유 복합체를 제공하도록 가공되는, 전구체(gp160)로서 생성되는 바이러스 당단백질(예를 들어, ENV). 성숙 gp120-gp41 단백질은 비공유 상호작용에 의해 결합되고, 세포 표면 상에서 삼량체로서 회합된다. gp120의 상당한 양이 배지에서 방출된 것으로 발견될 수 있다. gp120은 CD4 수용체, 및 HIV-1에 대한 공동 수용체로서 작용하는 7 개의 막관통 도메인 케모카인 수용체에 대한 결합 부위를 포함한다.
HIV 유전자 발현의 트랜스작용인자(TAT)는 HIV 유전자 발현에 대한 2종의 필수적인 바이러스 조절 인자(Tat 및 Rev) 중 하나이다. 2가지 형태, 즉 72 개 아미노산의 Tat-1 엑손(소수형) 및 86 개 아미노산의 Tat-2 엑손(다수형)이 공지되어 있다. 낮은 수준의 2가지 단백질이 지속적으로 감염된 세포에서 발견된다. Tat는 면역형광법에 의해 핵소체/핵에 주로 위치되었다. 이는 TAR RNA 구성요소에의 결합 및 LTR 프로모터로부터의 전사 개시 및 신장 활성화, LTR AATAAA 폴리아데닐화 신호가 전사 및 폴리아데닐화의 조숙한 종결을 유발하는 것의 방지에 의해 작용한다. 이는 DNA보다 RNA와 상호작용하는 것으로 공지된 첫번째 진핵 생물 전사 인자이며, 원핵 생물의 항종결 인자와 유사성을 가질 수 있다. 세포외 Tat가 발견될 수 있으며, 배양물 중 세포에 의해 차지될 수 있다.
HIV 발현을 위한 두번째 필요한 조절 인자는 REV이다. 주로 핵소체/핵에 위치한 19 kDa의 인단백질인 Rev는 RRE에의 결합, 및 스플리이싱되지 않은 바이러스 mRNA 포함 RRE의 핵외 수송, 안정화 및 이용에 의해 작용한다. Rev는 렌티바이러스의 가장 기능적으로 보존된 조절 단백질로서 고려된다. Rev는 핵과 세포질을 빠르게 순환한다.
기타
바이러스 감염 인자(VIF)는 전형적으로 23 kDa의 염기성 단백질이다. 감염력을 촉진시키지만, 바이러스 입자의 생성은 촉진시키지 않는다. Vif의 부재 하에서 생성된 바이러스 입자는 결함이 있지만, 바이러스의 세포-대-세포 전달은 크게 영향을 받지 않는다. 거의 모든 렌티바이러스에서 발견된, Vif는 세포질 단백질이며, 이는 가용성 세포질 형태 및 막-회합 형태 둘 다로 존재한다. Vif의 막-회합 형태는 세포막의 원형질 쪽과 단단히 회합된 말초 막 단백질이다. 2003년에, 원형질에서 DNA:RNA 이형 이중 가닥을 탈아미노화하는 세포 APOBEC-3G 단백질의 작용을 Vif가 방지한다는 것이 발견되었다.
바이러스 단백질 R(VPR)은 96-아미노산(14 kDa) 단백질이며, 이는 비리온 내로 포함된다. 이는 Pr55 Gag 전구체의 p6 Gag 부분과 상호작용한다. 세포에서 검출된 Vpr은 핵으로 국한된다. Vpr에 대하여 제안된 기능은 사전 통합 복합체의 핵 이동, 세포 성장 저지, 세포 유전자의 전사촉진, 및 세포 분화의 유도를 표적화하는 것을 포함한다. HIV-2, SIV-SMM, SIV- RCM, SIV-MND-2 및 SIV-DRL에서, Vpx 유전자는 명백하게, 가능하게는 재조합에 의한 Vpr 유전자 중복 사건의 결과이다.
바이러스 단백질 U(VPU)는 HIV-1, SIVcpz(HIV-1의 가장 근접한 SIV 동족), SIV-GSN, SIV-MUS, SIV- MON 및 SIV-DEN에 고유한 것이다. HIV-2, SIV-SMM 또는 다른 SIV에는 유사한 유전자가 없다. Vpu는 적어도 다음 2 가지의 상이한 생물학적 기능을 갖는 16 kDa (81 개-아미노산) 유형 I 내재막 단백질이다: (a) 소포체에서 CD4의 분해, 및 (b) HIV-1-감염 세포의 원형질막으로부터 비리온 방출의 향상. Env 및 Vpu는 바이시스트론 mRNA로부터 발현된다. Vpu는 아마도 N-말단의 소수성 막 앵커 및 친수성 모이어티를 가진다. 이는 카세인 키나아제 II에 의해 위치 Ser52 및 Ser56에서 인산화된다. Vpu는 Env 성숙에 관여하며, 비리온에서 발견되지 않는다. Vpu는 HIV-1 감염 세포의 감수성을 Fas 사멸까지 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
NEF는 영장류 렌티바이러스의 3 0 말단에 위치한 ORF에 의해 생성된 다기능성의 27-kDa 미리스틸화 단백질이다. 미리스틸화되지 않은 변이체를 포함하여, Nef의 다른 형태가 공지되어 있다. Nef는 대부분 세포질이며, 보존된 제2 아미노산(Gly)에 연결된 미리스틸 잔기를 통해 원형질막과 회합된다. Nef는 또한 핵에서 동정되었으며, 일부 실험에서 세포골격과 회합된 것으로 발견되었다. 감염 세포에서 생성되는 제1 HIV 단백질 중 하나는, 부속 단백질 중 가장 면역원성인 것이다. HIV 및 SIV의 nef 유전자는 시험관내에서 불필요하지만, 생체내에서 효율적인 바이러스 확산 및 질환 진행에 필수적이다. Nef는 고 바이러스 부하의 유지 및 마카크에서 AIDS의 발달에 필요하며, 결함이 있는 Nef를 지니는 바이러스는 일부 HIV-1로 감염된 장기간 생존자에서 검출되었다. Nef는 주요한 바이러스 수용체인 CD4, 및 MHC 클래스 I 분자를 하향 조절하고, 이들의 기능은 단백질의 상이한 부분으로 매핑하는 것이다. Nef는 숙주 세포 신호 전달 및 클라트린-의존적 단백질 분류 경로의 구성성분과 상호작용한다. 이는 바이러스 감염성을 증가시킨다. Nef는 Src 키나제의 서브세트의 SH3 도메인에 결합하는 PxxP 모티프를 포함하고, HIV의 향상된 성장에는 필요하지만 CD4의 하향 조절에는 필요하지 않다.
VPX는 HIV-2, SIV-SMM, SIV-RCM, SIV-MND-2 및 SIV-DRL에서 발견되지만, HIV-1 또는 다른 SIV에서는 발견되지 않는 12 kDa의 비리온 단백질이다. 이러한 부속 유전자는 HIV-1 vpr의 동족체이며, Vpx를 지니는 바이러스는 vpr과 vpx를 둘 다 지닌다. Vpr과 비교하여 Vpx 기능은 완전히 밝혀져 있지는 않으며; 둘 다 Gag p6과의 상호작용을 통해 Gag 단백질과 비슷한 수준으로 비리온 내로 포함된다. Vpx는 PBMC에서 SIV-SMM의 효율적인 복제에 필요하다. SIV-감염 동물에서 AIDS로의 진행 및 사망은 Vpr 또는 Vpx의 부재 하에서 일어날 수 있다. vpr 및 vpx 둘 다 없는 이중돌연변이 바이러스는 약화된 반면, 단일 돌연변이체는 약화되지 않았으며, 이는 바이러스 병원성과 관련된 Vpr 및 Vpx의 기능에서의 중복성(redundancy)을 시사하는 것이다.
A형 간염 바이러스의 표적 서열
5' 비번역 영역은 IRES(internal ribosome entry site: 내부 리보솜 유입 부위)를 포함한다.
게놈의 P1 영역 - 캡시드 단백질
VP1
VP2
VP3
VP4
게놈의 P2 영역
2A
2B
2C
게놈의 P3 영역
3A
3B
3C - 바이러스 프로테아제
3D - RNA 중합효소
B형 간염 바이러스의 표적 서열
모든 HCV 단백질을 암호화하는 전구체 폴리펩타이드는 생성된 후, 기능성 단백질로 스플라이싱된다. 하기는 암호화된 단백질(암호화 영역)이다:
C - 코어 단백질 - 암호화 영역은 Pre-C 및 코어 암호화 영역으로 이루어짐
X - 기능은 불명확하지만, 바이러스 전사 과정의 활성화에서 역할을 하는 것으로 추측됨
P - RNA 중합효소
S - 표면 항원 - 암호화 영역은 Pre-S1, Pre-S2 및 표면 항원 암호화 영역으로 이루어짐
C형 간염 바이러스의 표적 서열
모든 HCV 단백질을 암호화하는 전구체 폴리펩타이드는 생성된 후, 기능성 단백질로 스플라이싱된다. 하기는 암호화된 단백질(암호화 영역)이다:
RES - 비암호화 내부 리보솜 유입점(폴리단백질 암호화 서열에 대하여 5')
3' 비암호화 서열 -
C 영역 - 뉴클레오캡시드 단백질인 p22를 암호화함
E1 영역 - 외피 당단백질인 gp35를 암호화함 - 세포 유입에서 중요함
E2 영역 - 외피 당단백질인 gp70을 암호화함 - 세포 유입에서 중요함
NS1 - p7을 암호화함 - 복제에 필요하지 않지만, 바이러스 형태발생에는 중요함
NS2 - 프로테아제 활성을 지니는 막관통 단백질인 p23을 암호화함
NS3 - 세린 프로테아제와 RNA 헬리카제 활성을 ㄷ둘 다 가지는 p70을 암호화함
NS4A - 공동 인자인 p8을 암호화함
NS4B - 공동 인자인 p27을 암호화함 - 다른 바이러스 단백질의 보충에 중요함
NS5A - 인터페론 내성 단백질인 p56/58을 암호화함 - 바이러스 복제에 중요함
NS5B - RNA 중합효소를 암호화함
단순포진 바이러스 표적 서열
HPV 표적 서열
인플루엔자 A 표적 서열
인플루엔자 A는 인간을 감염시키는 가장 일반적인 독감 바이러스이다. 인플루엔자 A 비리온은 11-14 개의 단백질을 암호화하는 8 개의 상이한 단일 가닥 RNA 세그먼트로 구성된다. 이들 세그먼트는 그 서열이 다양할 수 있으며, 대부분의 변이가 혈구응집소(H 또는 HA) 표면 단백질 및 뉴라미니다제(NA 또는 N)에서 일어난다. 8 개의 RNA 세그먼트(및 이들이 암호화하는 단백질)는 다음과 같다:
HA - 혈구응집소를 암호화함(혈구응집소 약 500 개의 분자가 비리온 1 개를 만드는 데 필요함).
NA - 뉴라미니다제를 암호화함(뉴라미니다제 약 100 개의 분자가 비리온 1 개를 만드는 데 필요함).
NP는 핵단백질을 암호화함.
M은 동일한 RNA 세그먼트와 상이한 리딩프레임을 사용함으로써 2 가지의 기질 단백질(M1 및 M2)을 암호화함(약 3000 개의 기질 단백질 분자가 비리온 1 개를 만드는 데 필요함). M42는 선택적 스플라이싱에 의해 생성되고, 부분적으로 M2를 대체할 수 있음.
NS는 동일한 RNA 세그먼트와 상이한 리딩프레임을 사용함으로써 2 가지의 별개의 비구조적 단백질(NS1 및 NEP)을 암호화함.
PA는 RNA 중합효소를 암호화하며; 대체 형태가 때때로 +1 프레임시프트와 함께 다음 정지 코돈까지 읽는 리보솜 스킵을 통해 만들어짐.
PB1은 RNA 중합효소와, 동일한 RNA 세그먼트와 상이한 리딩프레임을 사용함으로써 번갈아 나오는 개시 부위로부터 판독되는 2 가지의 다른 전사체(PB1-N40 및 PB1-F2 단백질로 명명됨(세포자멸사를 유도함))를 암호화함.
PB2는 RNA 중합효소를 암호화함.
마이코박테리움 튜베르쿨로시스 표적 서열
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 마이코박테리움 튜베르쿨로시스를 표적화하고, 마이코박테리움 튜베르쿨로시스에 의한 감염을 겪고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
기타
구현예에서, 표적 유전자는, 예를 들어, 박테리아 감염에서 다수의 약물 내성(MDR)과 연관된다. 감염 병원체는 다제 내성을 달성함에 있어서 다수의 메커니즘을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 더 이상 당단백질 세포벽, 항생제의 효소 불활성화, 항생제에 대한 감소된 세포벽 투과성, 항생제의 변경된 표적 부위, 항생제를 제거하는 유출 펌프, 스트레스 반응으로서 증가된 돌연변이 속도, 또는 이의 조합에 의존하지 않는다.
IX. 표적: 유전자 편집/수정
후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 및/또는 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 질병의 원인이 되는 유전자(예를 들어, 돌연변이된 유전자)를 조절하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 유전자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 표적 유전자를 편집 또는 수정함으로써 조절된다. 구현예에서, 인간 유전자는 세포 내부의 하나 이상의 조절자/효과기(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 표적 유전자로의 전달에 의해 조절된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자는 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 조절될 수 있다.
표 IX-1. 유전자가 치료상 표적화될 수 있는 선택된 질환
3염기 반복병(또한 트리플렛 반복병, 3염기 반복부 확장 장애, 트리플렛 반복부 확장 장애, 또는 코돈 반복 장애라고도 공지됨)은 3염기 반복부 확장에 의해 유발되는 유전자 장애의 세트, 예를 들어, 특정 유전자에서 3염기 반복부가 정상 및/또는 안정적인 역치를 초과하는 돌연변이의 유형이다. 돌연변이는 다수 또는 모든 게놈 서열에서 일어나는 불안정적인 미소부수체 반복부의 서브세트일 수 있다. 돌연변이는 반복부 수를 증가시킬 수 있고(예를 들어, 추가 또는 확장된 반복부를 초래함), 결함이 있는 유전자를 초래할 수 있다(예를 들어, 비정상적인 단백질을 생성함). 3염기 반복부는 삽입 돌연변이 또는 돌연변이의 별개 부류로서 분류될 수 있다. 후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 및/또는 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 예를 들어, 정상 또는 야생형 유전자 산물(예를 들어, 단백질)이 생성될 수 있도록 추가 또는 확장된 반복부의 수를 감소시킴(예를 들어, 제거함)으로써, 3염기 반복병과 연관된 하나 이상의 유전자(예를 들어, 돌연변이된 유전자)를 조절하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 3염기 반복병 및 3염기 반복병에 관여하는 표적 유전자는 표 IX-1A에 나타내어져 있다.
표 IX-1A. 예시적인 3염기 반복병 및 3염기 반복병에 관여하는 표적 유전자
다양한 질환 또는 병태, 예를 들어, 암(예를 들어, 키나제), 에너지 대사, 낭포성 섬유증(예를 들어, CFTR), 색각이상, 혈색소증, 혈우병, 페닐케톤뇨증, 다낭포성 신장 질환, 겸상 적혈구 질환, 테이-삭스병, 시데리우스 X 염색체 연관 정신지체 증후군, 리소좀 저장 장애(예를 들어, 알파-갈락토시다제 A 결핍), 앤더슨-파브리 질환, 미만성 구간 혈관각화증, CADASIL 증후군, 카르복실라제 결핍(복합, 후발성), 소뇌망막 혈관종(가족성), 피질화 경색과 백질뇌증을 동반하는 뇌동맥질환, 피질화 경색과 백질뇌증을 동반하는 상염색체우성 뇌동맥질환, 세레브로시드성 지질증 증후군, 무도성무정위운동 자해 고뇨산혈증 증후군, 전형적인 갈락토스혈증, 크론병, 섬유협착성, 페닐알라닌 수산화효소 결핍증, 파브리병, 유전성 코프로포르피린증, 색소실조증, 소두증, 다낭포성 신장 질환, 레트 장애, 알파-1 항트립신 결핍증, 윌슨병, 타이로신혈증, 프레임시프트 관련 질환, 및 트리플렛 반복병에 관여하는 유전자를 포함한다.
추가적인 예시적인 표적 유전자는 크리글러-나자르 증후군, 당원병 IV형(GSD 타입 IV), 가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증(FHL-퍼포린 결핍증), 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증(OTC 결핍증) 또는 다른 요소 회로 이상, 원발성 과수산뇨증, 레베르 선천성 흑암시(LCA), 바텐병, 만성 육아종증, 비스코트-알드리히 증후군, 어셔 증후군, 및 이상 혈색소증을 포함하는 질환과 연관된 유전자를 포함한다.
크리글러-나자르 증후군. 크리글러-나자르 증후군은 혈액 중 빌리루빈의 고수준을 특징으로 하는 심각한 병태이다(고빌리루빈혈). 빌리루빈은 적혈구 세포가 파괴될 때 생성된다. 이 물질은 간에서 화학 반응을 겪고, 빌리루빈의 독성 형태(비포합 빌리루빈)가 비독성 형태(포합 빌리루빈)으로 전환된 후에만 체내에서 제거된다. 크리글러-나자르 증후군이 있는 사람은 혈액에 비포합 빌리루빈의 축적이 있다(비포합 빌리루빈과잉혈증). 크리글러-나자르 증후군은 2 가지 유형으로 나뉜다. 1형(CN1)은 매우 심각하고, 2형(CN2)은 덜 심각하다.
UGT1A1 유전자의 돌연변이는 크리글러-나자르 증후군을 유발할 수 있다. 이 유전자는 빌리루빈 우리딘 디포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제(빌리루빈-UGT) 효소를 제조하기 위한 지침을 제공하며, 상기 효소는 주로 간 세포에서 발현되고 체내에서 빌리루빈을 제거하기 위해 필요하다. 빌리루빈-UGT 효소는 글루크론산화에 관여하며, 여기서 효소는 클루쿠론산을 비포합 빌리루빈으로 운반하고, 비포합 빌리루빈을 포합 빌리루빈으로 전환시킨다. 글루크론산화는 빌리루빈이 물에 용해될 수 있게 하여 체내에서 빌리루빈이 제거될 수 있게 한다.
크리글러-나자르 증후군을 유발하는 UGT1A1 유전자의 돌연변이는 빌리루빈-UGT 효소의 기능을 감소시키거나 이 효소의 기능을 없앤다. CN1이 있는 사람은 효소의 기능을 가지지 않는 반면, CN2가 있는 사람은 정상 기능의 20% 미만을 가진다. 빌리루빈-UGT 기능의 손실은 비포합 빌리루빈의 글루쿠론산화를 감소시킨다. 그 다음, 이러한 독성 물질이 체내에 축적되고, 비포합 빌리루빈과잉혈증 및 황달을 유발한다.
당원병 IV형. 당원병 IV형(또한 GSD 타입 IV, 글리코겐증 타입 IV, 글리코겐 분지 효소 결핍증(GBED), 폴리글루코산체병, 또는 아밀로펙틴증으로도 공지됨) 은 체내 세포에 글리코겐이라 불리는 복합당의 축적에 의해 야기되는 유전 장애이다. 축적된 글리코겐은 구조적으로 비정상적이며, 특정 기관 및 조직, 특히 간 및 근육의 기능을 손상시킨다.
GBE1 유전자의 돌연변이는 GSD IV를 유발한다. GBE1 유전자는 글리코겐 분지 효소를 만들기 위한 지침을 제공한다. 이 효소는 글리코겐의 생성에 관여하며, 상기 글리코겐은 체내에서 저장된 에너지의 주요 공급원이다. GSD IV를 유발하는 GBE1 유전자 돌연변이는 글리코겐 분지 효소의 부족(결핍)을 야기한다. 결과적으로, 글리코겐이 적절하게 형성되지 않는다. 폴리글루코산체라고 불리는 비정상적인 글리코겐 분자는 세포에 축적되어, 손상 및 세포 사멸을 야기한다. 폴리글루코산체는 신체 전체의 세포에 축적되지만, 간 세포 및 근육 세포는 GSD IV에서 가장 심각하게 영향을 받는다. 간에서의 글리코겐 축적은 간비대를 야기하고 간 기능을 방해한다. 근육 세포가 에너지를 내기 위해 글리코겐을 분해하지 못하는 것은 근력 저하 및 근육 소모를 야기한다.
일반적으로, 상기 장애의 중증도는 생성되는 기능성 글리코겐 분지 효소의 양과 관련이 있다. 치명적인 주산기 신경근육성 유형이 있는 개체는 5% 미만의 사용가능한 효소를 생성하는 경향이 있는 반면, 소아기 신경근육성 유형이 있는 개체는 약 20%의 효소 기능을 가질 수 있다. GSD IV의 다른 유형은 보통 작동하는 효소의 5% 내지 20%와 연관된다. 그러나 이들 추산치는 상이한 유형마다 다르다.
가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증. 가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증(FHL)은, 면역계가 너무 많은 활성화된 면역 세포(림프구), 예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 및 대식세포(조직구)를 생성하는 장애이다. 과도한 양의 사이토카인이 또한 생성된다. 면역계의 이러한 과활성화는 열을 유발하고, 간 및 비장을 손상시키며, 이들 기관의 비대를 초래한다.
가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증은 또한 골수에서 혈액-생성 세포를 파괴한다(이 과정은 혈구탐식이라 불림). 뇌도 또한 가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증에서 영향을 받을 수 있다. 신경학적 문제 이외에, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증은 심장, 신장, 및 다른 기관 및 조직의 기형을 유발할 수 있다. 발병한 개체는 또한 혈액-형성 세포의 암(백혈병 및 림프종)으로의 발생 위험이 증가된다.
가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증은 여러 가지 유전자 중 임의의 것에서의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 이러한 유전자는 더 이상 필요하지 않는 림프구를 파괴하거나 불활성화시키는 것을 돕는 단백질을 만들기 위한 지침을 제공한다. 활성화된 림프구의 수를 제어함으로써, 이들 유전자는 면역계 기능을 조절하는 것을 돕는다.
가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증 경우의 약 40% 내지 60%는 PRF1 또는 UNC13D 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 더 적은 수의 경우는 다른 공지된 유전자, 예컨대 STX11 또는 STXBP2의 돌연변이에 의해 유발된다. 가족성 혈구탐식성 림프조직구증식증을 유발하는 유전자 돌연변이는 면역계를 조절하는 신체 능력에 손상을 미칠 수 있다. 이러한 변화는 이 병태의 특징인 과도한 면역 반응을 초래한다.
오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증. 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증(OTC)은 혈액에 암모니아의 축적을 유발하는 유전 장애이다.
OTC 유전자의 돌연변이는 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증을 유발한다.
오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증은 요소 회로 이상으로 불리는 유전자 질환의 한 부류에 속한다. 요소 회로는 간 세포에서 일어나는 일련의 반응이다. 이는 단백질이 신체에 의해 사용될 때 생성되는 과도한 질소를 처리하여, 신장에 의해 배설되는 우레아로 불리는 화합물을 만든다.
오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증에서는, 요소 회로 내에서 특이적인 반응을 시작하는 효소가 손상되거나 상실되어 있다. 요소 회로는 정상적으로 진행할 수 없으며, 질소는 암모니아의 형태로 혈류에 축적된다.
암모니아는 특히 신경계에 손상을 입히고, 따라서 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증은 신경학적 문제뿐만 아니라 간에 궁극적인 손상을 유발한다.
다른 요소 회로 이상 및 연관 유전자는, 예를 들어, N-아세틸글루타메이트 신타제 결핍증(NAGS), 카바모일 포스페이트 합성효소 I 결핍증(CPS1), "AS 결핍증" 또는 시트룰린혈증(ASS), "AL 결핍증" 또는 아르기니노숙산산뇨증(ASL), 및 "아르기나제 결핍증" 또는 아르기닌혈증(ARG)을 포함한다.
원발성 과수산뇨증. 원발성 과수산뇨증, 예를 들어, 원발성 과수산뇨증 1형(PH1)은, 간에서 글리옥실레이트 대사 경로에서의 오류가 옥살레이트의 과생성을 야기하고, 옥살레이트가 신장, 골수, 및 눈을 포함한 연부 조직에서 결정화하는, 드문 상염색체 열성 유전되는 유전적 병태이다. 이 질환은 신장의 점진적인 악화로 나타나며, 치료는 신장(손상된 장기) 및 간(발병된 장기)의 복잡한 이중 장기 이식이다.
원발성 과수산뇨증은 옥살레이트의 축적을 정상적으로 방지하는 효소의 결핍에 의해 유발된다. 결핍되는 효소에 의해 구별되는, 2 가지 유형의 원발성 과수산뇨증이 있다. 1형 원발성 과수산뇨증이 있는 사람은 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(AGXT)라 불리는 간 효소가 부족하다. 2형 원발성 과수산뇨증은 글리옥실레이트 환원효소/하이드록시피루베이트 환원효소(GRHPR)라 불리는 효소의 부족을 특징으로 한다.
AGXT 및 GRHPR 유전자의 돌연변이는 원발성 과수산뇨증을 유발한다. 특정 당 및 아미노산의 분해 및 가공이 글리옥실레이트를 생성한다. 보통, 글리옥실레이트는 2 가지 효소, 즉 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 글리옥실레이트 환원효소/하이드록시피루베이트 환원효소의 작용을 통해 각각 아미노산인 글리신 또는 글리콜레이트로 전환된다. AGXT 또는 GRHPR 유잔자의 돌연변이는 이들 효소의 부족을 유발하며, 이는 옥실레이트의 글리신 또는 글리콜레이트로의 전환을 방지한다. 글리옥실레이트의 수준이 높아지면서, 글리옥실레이트는 옥살레이트로 전환된다. 옥살레이트는 칼슘과 결합하여 칼슘 옥살레이트 침전물을 형성하고, 상기 침전물은 신장 및 다른 기관에 손상을 줄 수 있다.
구현예에서, AGXT의 유전적 결함은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자를 사용하여 상동성 재조합에 의해 수정된다. 예를 들어, 수정된 AGXT 유전자에 의해 암호화된 기능성 효소는 적절한 세포내 소기관으로 다시 보내질 수 있다. 이 유전자에서 50 개를 초과하는 돌연변이가 확인되었지만, 가장 일반적인 것(백인의 40%)은 미스센스 G170R 돌연변이이다. 이 돌연변이는 AGT 효소가, 이 효소의 기능을 수행하기 위해 존재하여야 하는 퍼옥시좀보다 미토콘드리아로 국소화되게 한다. 다른 일반적인 돌연변이는, 예를 들어, I244T(카나리아 제도), F152I, G41R, G630A(이탈리아), 및 G588A(이탈리아)를 포함한다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자를 사용하여, 글리옥실레이트 대사 경로에서 상류 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자가 표적화된다. 예시적인 효적은, 예를 들어, 글리콜레이트 산화효소(유전자 HAO1, OMIM ID 605023)를 포함한다. 글리콜레이트 산화효소는 글리콜레이트를, AGT에 대한 기질인 글리옥실레이트로 전환시킨다. 글리콜레이트 산화효소는 간에서만 발현되고, 퍼옥시좀 정위로 인하여 이 대사 경로에서 글리콜레이트 산화효소를 적절한 표적으로 만든다. 구현예에서, HAO1 유전자의 이중-가닥 파손이 도입되고, NHEJ에 의한 수선시 프레임-시프트는 절두 단백질을 초래한다. 구현예에서, 전사 리프레서(예를 들어, 본 명세서에 기재된 전사 리프레서)는 페이로드로서 HAO1 유전자로 전달되어 HAO1의 발현을 감소시킨다.
레베르 선천성 흑암시. 레베르 선천성 흑암시(LCA)는 주로 망막에 영향을 미치는 눈 장애이다. 이 질환이 있는 사람은 전형적으로 유아기에 시작하는 심각한 시각 손상을 갖는다. 시각 손상은 시간 경과에 따라 매우 서서히 악화될 수 있지만, 이 시각 손상은 안정적인 경향이 있다. 적어도 13 가지 유형의 레베르 선천성 흑암시가 보고되었다. 유형은 유전적 원인, 시력 상실 패턴, 및 관련 눈 이상에 의해 구별된다.
레베르 선천성 흑암시는 적어도 14 개의 유전자의 돌연변이에 의해 생길 수 있으며, 상기 유전자 모두 정상 시력에 필요하다. 이들 유전자는 망막의 발달 및 기능에서 다양한 역할을 한다. 예를 들어, 이 장애와 연관된 유전자의 일부는 광수용체의 정상적인 발달에 필요하다. 다른 유전자는 광변조에 관여한다. 또 다른 유전자는 섬모의 기능에서 역할을 하며, 상기 섬모는 시각을 포함하여 여러 가지 유형의 감각 입력의 인식에 필요하다.
레베르 선천성 흑암시에 연관된 유전자의 임의의 것(예를 들어, AIPL1, CEP290, CRB1, CRX, GUCY2D, IMPDH1, LCA5, LRAT, RD3, RDH12, RPE65, RPGRIP1, SPATA7, TULP1)의 돌연변이는 망막의 발달 및 기능을 방해하여, 조기 시력 상실을 초래한다. CEP290, CRB1, GUCY2D, 및 RPE65 유전자의 돌연변이는 상기 장애의 가장 일반적인 원인이지만, 다른 유전자의 돌연변이는 일반적으로 더 작은 비율의 케이스를 차지한다.
바텐병. 바텐병 또는 청소년 바텐병은 주로 신경계에 영향을 미치는 유전 장애이다. 정상적인 발달 몇 년 후, 이 병태를 지닌 어린이에서는 점진적인 시력 상실, 지적 및 운동 장애, 및 발작이 생긴다.
청소년 바텐병은 신경 세로이드 리포푸신증(NCL)으로 공지된 장애의 그룹 중 하나이다. 이들 장애는 모두 신경계에 영향을 미치며, 전형적으로 시력, 운동, 및 사고 능력에 점진적인 문제를 유발한다. 일부 사람은 NCL의 전체 그룹을 바텐병으로서 말하지만, 다른 사람은 상기 장애의 청소년 형태로 지정하는 것으로 제한한다. 상이한 유형의 NCL은 징후와 증상이 처음 나타나는 연령에 의해 구별된다.
청소년 바텐병의 대부분의 경우는 CLN3 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 이들 돌연변이는 리소좀이라 불리는 세포 구조의 기능을 방해할 수 있다. 리소좀 기능 장애는 세포 구조 내에 지질 색소의 축적을 초래한다. 이러한 축적은 신체 전체에 걸쳐 세포에서 일어나지만, 뇌의 뉴런은 지질 색소에 의해 유발되는 손상에 특히 취약한 것으로 보인다. 특히 뇌에서, 세포의 점진적인 사멸은 청소년 바텐병이 있는 사람에서 시력 상실, 발작, 및 지적 감소를 초래한다.
청소년 바텐병의 경우의 작은 비율은 다른 유전자(예를 들어, ATP13A2, CLN5, PPT1, TPP1)의 돌연변이에 의해 유발된다. 이들 유전자의 다수는 리소좀 기능에 관여하며, 돌연변이될 때 NCL의 이러한 형태 또는 다른 형태를 유발할 수 있다.
만성 육아종증. 만성 육아종증은 면역계의 기능 이상을 가져와, 면역결핍의 형태를 초래하는 장애이다. 만성 육아종증이 있는 개체는 재발되는 박테리아 및 진균 감염을 가진다. 이 병태가 있는 사람은 종종 다양한 조직에 손상을 미칠 수 있는, 다양한 조직에서 염증의 영역(육아종)이 있다. 일부 개체는 만년까지 증상을 나타내지 않지만, 만성 육아종증의 특성은 보통 소아기때 처음 나타난다.
CYBA, CYBB, NCF1, NCF2, 또는 NCF4 유전자의 돌연변이는 만성 육아종증을 유발할 수 있다. 이 병태는 관여하는 유전자에 의해 구별되는 5 가지 유형이 있다. 영향을 받는 유전자로부터 생성된 단백질은 NADPH 산화효소의 서브유닛이며, 상기 NADPH 산화효소는 면역계에서 중요한 역할을 한다. 구체적으로, NADPH 산화효소는 주로 식세포에서 활성적이다. 식세포 내에서, NADPH 산화효소는 초과산화물의 생성에 관여하며, 초과산화물은 외부 침입자를 죽이고 외부 침입자가 체내에서 번식하고 질병을 유발하는 것을 방지하는 역할을 한다. NADPH 산화효소는 또한 호중구의 활성을 조절하며, 호중구는 염증 반응을 조절하여, 신체에의 손상을 감소시키고 치유를 최적화하는 역할을 한다.
CYBA, CYBB, NCF1, NCF2, 및 NCF4 유전자의 돌연변이는 기능이 거의 없거나 전혀 없는 단백질의 생성을 야기하거나, 단백질을 전혀 생성하지 않는다. 이의 서브유닛 단백질 중 임의의 하나가 없으면, NADPH 산화효소는 적절하게 조립하거나 기능할 수 없다. 결과적으로, 식세포는 외부 침입자를 죽일 수 없고, 호중구 활성은 조절되지 않는다. NADPH 산화효소의 결핍은 발병한 개체가 많은 유형의 감염 및 과도한 염증에 취약하게 한다.
비스코트-알드리히 증후군. 비스코트-알드리히 증후군은 비정상적인 면역계 기능(면역 결핍증) 및 혈전을 형성하는 능력의 감소를 특징으로 한다. 이 병태는 주로 남성에 영향을 미친다. 비스코트-알드리히 증후군이 있는 개체는 미세혈소판감소증을 가지고 있으며, 미세혈소판감소증은 응고에 관여하는 혈액 세포(혈소판)의 수 및 크기가 감소하여, 경미한 외상 후, 가벼운 타박상 또는 장기간 출혈 사건을 초래할 수 있다. 비스코트-알드리히 증후군은 많은 유형의 백혈구 세포를 비정상적 또는 비기능성이 되게 하여, 여러 가지 면역 및 염증 장애의 위험을 증가시킨다. 이 병태가 있는 많은 사람에게서 습진, 붉게 염증이 생긴 피부의 비정상적인 부분을 특징으로 하는 염증성 피부 장애가 발병한다. 발병된 개체는 또한 감염에 대한 감수성이 증가한다. 비스코트-알드리히 증후군이 있는 사람은 자가면역 장애가 생길 위험이 더 크다. 일부 유형의 암, 예컨대 면역계 세포의 암(림프종)이 생길 가능성이 또한 비스코트-알드리히 증후군이 있는 사람에서 더 크다.
WAS 유전자의 돌연변이는 비스코트-알드리히 증후군을 유발한다. WAS 유전자는 WASP 단백질을 만들기 위한 지침을 제공하며, WASP 단백질은 모든 혈액 세포에서 발견된다. WASP는 혈액 세포의 표면에서 액틴 세포골격으로 신호를 전달하는 데 관여한다. WASP 신호전달은 필요할 때 세포를 활성화시키며, 세포의 이동 및 다른 세포 및 조직에의 부착(접착)을 촉발한다. 백혈구 세포에서, 이러한 신호전달은 액틴 세포골격이 세포와 표적화하는 외부 침입자 사이의 상호작용을 확립할 수 있게 한다(면역 시냅스).
비스코트-알드리히 증후군을 유발하는 WAS 유전자 돌연변이는 임의의 기능성 WASP의 결핍을 초래한다. WASP 신호전달의 상실은 발달중인 혈액 세포에서 액틴 세포골격의 기능을 방해한다. WASP가 결핍된 백혈구 세포는 이의 환경에 대하여 반응하고 면역 시냅스를 형성하는 능력이 감소된다. 결과적으로, 백혈구 세포는 외부 침입자에 대하여 덜 반응할 수 있고, 이는 비스코트-알드리히 증후군과 관련된 다수의 면역 문제를 유발한다. 유사하게, 혈소판 중 기능성 WASP의 결핍은 혈소판의 발달에 손상을 입혀서, 크기의 감소 및 조기 세포 사멸을 초래한다.
어셔 증후군. 어셔 증후군은 청각 상실 또는 난청 및 점진적인 시력 상실을 특징으로 하는 병태이다. 시력 상실은 망막색소변성증(RP)에 의해 유발되며, 망막색소변성증은 눈의 뒷면에서 빛에 민감한 조직의 층(망막)에 영향을 미친다. 망막의 광-감지 세포가 점진적으로 악화되면서 시력 상실이 생긴다.
I형(서브타입 IA 내지 IG), II형(서브타입 IIA, IIB, 및 IIC), 및 III형으로 지정되는 3 가지 주요 유형의 어셔 증후군이 확인되었다. 이들 유형은 징후와 증상이 나타날 때 중증도 및 연령에 의해 구별된다.
CDH23, CLRN1, GPR98, MYO7A, PCDH15, USH1C, USH1G, 및 USH2A의 돌연변이는 어셔 증후군을 유발할 수 있다. 어셔 증후군과 관련된 유전자는 정상적인 청력, 균형, 및 시력에 중요한 역할을 하는 단백질을 만들기 위한 지침을 제공한다. 이들은 육모 세포의 발달 및 유지 기능을 수행하며, 상기 육모 세포는 소리 및 움직인 신호를 뇌로 전송하는 것을 돕는 내이에 있는 감각 세포이다. 망막에서, 이들 유전자는 또한 추상체와 간상체로 불리는 광-감지 세포의 구조 및 기능을 결정하는 데 관여한다. 일부 경우에서, 청력 및 시력에서 이들 유전자의 정확한 역할은 공지되어 있지 않다. 어셔 증후군의 원인이 되는 돌연변이의 대부분은 내이 중 육모 세포의 상실 및 망막의 추상체와 간상체의 점진적인 상실을 초래한다. 이들 감각 세포의 변성은 상기 병태의 특징인 청력 상실, 균형 문제, 및 시력 상실을 유발한다.
어셔 증후군 I형은 CDH23, MYO7A, PCDH15, USH1C, 또는 USH1G 유전자의 돌연변이에 기인할 수 있다. 어셔 증후군 II형은, 예를 들어, USH2A 또는 GPR98(또한 VLGR1이라고도 불림) 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 어셔 증후군 III형은, 예를 들어, CLRN1의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
이상 혈색소증. 이상 혈색소증은 헤모글로빈 분자의 글로빈 사슬 중 하나의 비정상적인 구조를 초래하는 유전적 결함의 한 그룹이다. 예시적인 이상 혈색소증은, 예를 들어, 겸상 적혈구 질환, 알파 탈라세미아, 및 베타 탈라세미아를 포함한다.
구현예에서, 알파 글로불린 또는 베타 글로불린 중 유전적 결함은 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자를 사용하여 상동성 재조합에 의해 수정된다.
구현예에서, 이상 혈색소증-연관 유전자는 본 명세서에 기재된 Cas9 분자 및 gRNA 분자를 사용하여 표적화된다. 예시적인 표적은, 예를 들어, 감마-글로빈 유전자의 제어와 연관된 유전자를 포함한다. 구현예에서, 표적은 BCL11A이다.
태아성 헤모글로빈(또한 헤모글로빈 F 또는 HbF 또는 α2γ2)은 2 개의 성인 알파-글로빈 폴리펩타이드 및 2 개의 태아성 베타-유사 감마-글로빈 폴리펩타이드로 구성된 사량체이다. HbF는 자궁에서의 마지막 7 개월의 발달 기간 동안의 인간 태아에서 그리고 대략 6 개월까지의 신생아에서 주요 산소 수송 단백질이다. 기능적으로, 태아성 헤모글로빈은 성인 형태보다 더 큰 친화도로 산소와 결합할 수 있어, 모체의 혈류로부터의 산소에 대하여 태아가 더 양호한 접근을 하는 것을 제공할 수 있다는 점에서, 태아성 헤모글로빈은 성인 헤모글로빈과 대부분 다르다.
신생아에서, 태아성 헤모글로빈은 출생 후 약 6 개월째에 성인 헤모글로빈으로 거의 완전히 대체된다. 성인에서, 태아성 헤모글로빈 생성은 약리학적으로 다시 활성화될 수 있으며, 이는 이상 혈색소증과 같은 질환의 치료에서 유용하다. 예를 들어, 이상 혈색소증이 있는 특정 환자에서, 더 높은 수준의 감마-글로빈 발현은 결함이 있거나 손상된 베타-글로빈 유전자 생성을 부분적으로 보상할 수 있으며, 이는 이들 질환의 임상적 중증도를 개선할 수 있다. 증가된 HbF 수준 또는 F-세포(HbF 포함 적혈구) 수는 이상 혈색소증, 예를 들어, 주요 베타-탈라세미아 및 겸상 적혈구 빈혈의 질환 중증도를 개선시킬 수 있다.
증가된 HbF 수준 또는 F-세포는 세포에서 BCL11A 발현의 감소와 연관될 수 있다. BCL11A 유전자는 다중-징크 핑거 전사 인자를 암호화한다. 구현예에서, BCL11A의 발현은 조절, 예를 들어, 하향 조절된다. 구현예에서, BCL11A 유전자는 편집된다. 구현예에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 조상세포이다.
겸상 적혈구 질환
겸상 적혈구 질환은 헤모글로빈에 영향을 미치는 장애의 한 그룹이다. 이 장애가 있는 사람은 비전형적인 헤모글로빈 분자(헤모글로빈 S)를 가지는데, 상기 헤모글로빈 분자는 적혈구 세포를 낫, 또는 초승달 형상으로 왜곡시킬 수 있다. 이 장애의 특징적인 특성은 적은 수의 적혈구 세포(빈혈), 반복된 감염, 및 주기적인 통증 사건을 포함한다.
HBB 유전자의 돌연변이는 겸상 적혈구 질환을 유발한다. HBB 유전자는 베타-글로빈을 만들기 위한 지침을 제공한다. 베타-글로빈의 다양한 형태는 HBB 유전자의 상이한 돌연변이로부터 생긴다. 하나의 특정 HBB 유전자 돌연변이는 헤모글로빈 S(HbS)로 공지된 베타-글로빈의 비정상적인 형태를 생성한다. HBB 유전자의 다른 돌연변이는 베타-글로빈의 추가적인 비정상적 형태, 예컨대 헤모글로빈 C(HbC) 및 헤로글로빈 E(HbE)를 초래한다. HBB 유전자 돌연변이는 또한 특이하게 낮은 수준의 베타-글로빈, 즉 베타 탈라세미아를 초래할 수 있다.
겸상 적혈구 질환이 있는 사람에서, 헤모글로빈 중 베타-글로빈 서브유닛의 적어도 하나는 헤모글로빈 S로 대체된다. 겸상 적혈구 질환의 일반적인 형태인 겸상 적혈구 빈혈에서, 헤모글로빈 S는 헤모글로빈 중 베타-글로빈 서브유닛 둘 다를 대체한다. 겸상 적혈구 질환의 다른 유형에서, 헤모글로빈 중 단지 하나의 베타-글로빈 서브유닛이 헤모글로빈 S로 대체된다. 나머지 베타-글로빈 서브유닛은 상이한 비정상적인 변이체, 예컨대 헤모글로빈 C로 대체된다. 예를 들어, 겸상-헤모글로빈 C(HbSC) 질환은 베타-글로빈 대신에 헤모글로빈 S와 헤모글로빈 C를 지니는 헤모글로빈 분자를 가진다. 헤모글로빈 S와 베타 탈라세미아를 생성하는 돌연변이가 함께 일어나면, 개체는 헤모글로빈 S-베타 탈라세미아(HbSBetaThal) 질환을 가진다.
알파 탈라세미아
알파 탈라세미아는 헤모글로빈의 생성을 감소시키는 혈액 장애이다. 알파 탈라세미아의 특징적인 특성이 있는 사람에서, 헤모글로빈 양의 감소는 충분한 산소가 체내의 조직에 도달하는 것을 막는다. 발병된 개체는 또한 적혈구 세포가 부족하며(빈혈), 이는 창백한 피부, 나약함, 피로, 및 더 심각한 합병증을 유발할 수 있다.
2 가지 유형의 알파 탈라세미아가 건강 문제를 유발할 수 있다. 더 심각한 유형은 헤모글로빈 바트(Bart) 태아수종 증후군, 즉 Hb 바트 증후군이다. 더 경미한 형태는 HbH 질환이다. Hb 바트 증후군은, 예를 들어, 과도한 유체가 출생 전 신체에 축적되는 병태인 태아수종을 특징으로 한다. HbH 질환은, 예를 들어, 경미한 정도 내지 중간 정도의 빈혈, 간비종대, 및 눈과 피부의 황색화(황달)을 유발할 수 있다.
알파 탈라세미아는 전형적으로 HBA1 및 HBA2 유전자를 포함하는 결실에 의해 생긴다. 이들 유전자 둘 다 알파-글로빈을 만들기 위한 지침을 제공하며, 상기 알파-글로빈은 헤모글로빈의 서브유닛이다. 알파 탈라세미아의 상이한 유형이 이들 대립유전자의 일부 또는 전부의 상실에 의해 생긴다.
Hb 바트 증후군은 4 개의 알파-글로빈 대립유전자 전부의 상실에 의해 생길 수 있다. HbH 질환은 4 개의 알파-글로빈 대립유전자 중 3 개의 상실에 의해 유발될 수 있다. 이들 2 가지 병태에서, 알파-글로빈의 부족은 세포가 정상적인 헤모글로빈을 만드는 것을 막는다. 대신에, 세포는 비정상적인 형태의 헤로글로빈, 즉 헤모글로빈 바트(Hb 바트) 또는 헤모글로빈 H(HbH)를 생성하며, 이들 헤모글로빈은 신체의 조직으로 산소를 효과적으로 나르지 못한다. 정상적인 헤모글로빈을 위한 Hb 바트 또는 HbH의 치환은 빈혈 및 알파 탈라세미아와 연관된 다른 심각한 건강상의 문제를 유발할 수 있다.
알파 탈라세미아의 2 가지 추가적인 변이는 알파-글로빈의 감소된 양과 관련된다. 4 개의 알파-글로빈 대립유전자 중 2 개의 상실은 알파 탈라세미아 특성을 초래할 수 있다. 알파 탈라세미아 특성이 있는 사람은 특이하게 작고, 창백한 적혈구 세포 및 경미한 빈혈을 가질 수 있다. 1 개의 알파-글로빈 대립유전자의 상실은 알파 탈라세미아 보인자에서 발견될 수 있다.
베타 탈라세미아
베타 탈라세미아는 헤모글로빈의 생성을 감소시키는 혈액 장애이다. 베타 탈라세미아가 있는 사람에서, 낮은 수준의 헤모글로빈은 신체의 많은 부분에서 산소 결핍을 초래한다. 발병된 개체는 또한 적혈구 세포가 부족하며(빈혈), 이는 창백한 피부, 나약함, 피로, 및 더 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 베타 탈라세미아가 있는 사람은 비정상적인 혈전이 생길 위험이 증가한다.
베타 탈라세미아는 증상의 중증도에 따라 2 가지 유형, 즉 주요 탈라세미아(또한 쿨리 빈혈로 공지됨) 및 중간 탈라세미아으로 분류된다. 2 가지 유형 중 주요 탈라세미아가 더 심각하다.
HBB 유전자의 돌연변이는 베타 탈라세미아를 유발한다. HBB 유전자는 베타-글로빈을 만들기 위한 지침을 제공한다. HBB 유전자의 일부 돌연변이는 임의의 베타-글로빈의 생성을 막는다. 베타-글로빈의 부재는 베타-제로(B0) 탈라세미아로 지칭된다. 다른 HBB 유전자 돌연변이는 일부 베타-글로빈이 생성될 수 있게 하지만, 감소된 양으로, 즉 베타-플러스(B+) 탈라세미아를 생성할 수 있게 한다. 2 가지 유형이 있는 사람은 탈라세미아 메이저 및 탈라세미아 인터미디아로 진단되었다.
구현예에서, 제1 유전자를 표적화하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 제2 유전자를 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 제2 유전자이 돌연변이를 치료하는 데 사용된다. 예로서, 예를 들어, 편집 또는 페이로드 전달에 의한 제1 유전자의 표적화는 제2 유전자의 영향, 예를 들어, 돌연변이 제2 유전자를 보상, 또는 제2 유전자의 영향으로부터 추가의 손상을 저해할 수 있다. 구현예에서, 대상체에 의해 보유되는 제1 유전자의 대립유전자(들)는 장애의 원인이 아니다.
표 IX-3. 보상 표적화를 위하여 선택된 장애 및 표적
구현예에서, Cas9 분자, gRNA 분자, 및/또는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 성장 인자를 조절, 예컨대 RBC 생성을 구동하는 Epo를 상향 조절하는 유전자를 활성화시키는 데 사용될 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자, gRNA 분자, 및/또는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 태아성 헤모글로빈의 상향 조절을 위한, 예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈 및 탈라세미아에 대한 치료를 위한 핵심적인 전사, 예컨대 BCL11A 및 KLF1의 프로모터의 표적화, 예를 들어, 이의 억제 초래, 이의 넉아웃, 또는 이의 변경에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 및/또는 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다양한 세포하 위치에서, 표적 유전자를 편집/수정하는 데, 또는 세포 내부로 조절자/효과기를 전달하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 위치는 소립자 도메인, 예를 들어, 염색체 영역, 핵소체, 핵스펙클, 카잘 바디, 젬(Gem)(카잘 바디의 2가 염색체), 또는 전골수구성백혈병(PML) 핵체에 존재한다. 구현예에서, 위치는 미토콘트리아에 존재한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 후보 Cas9 분자, 후보 gRNA 분자, 및/또는 후보 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 다양한 시점에, 표적 유전자를 편집/수정하는 데, 또는 세포 내부로 조절자/효과기를 전달하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 편집/수정 또는 전달은 세포 주기의 상이한 단계, 예를 들어, G0기, 간기(예를 들어, G1기, S기 G2기), 또는 M기에서 일어날 수 있다. 다른 예로서, 편집/수정 또는 전달은 질환 진행의 상이한 단계에서, 예를 들어, 장애의 잠복기 또는 활성기(예를 들어, 바이러스 감염), 또는 장애의 임의의 단계 또는 하위분류(예를 들어, 암)에서 일어날 수 있다.
본 발명의 방법은 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 암의 치료를 가능하게 한다. 구현예에서, 암 세포는 치료 또는 내인성 면역 감시에 더 감수성이 되도록 조작된다. 구현예에서, 암 세포는 치료에 더 감수성이 되도록 조절된다. 구현예에서, 암 세포는 암 세포를 인식하거나 죽이는 면역계의 능력을 증가시키는 유전자의 발현을 증가시키도록 조작된다. 예를 들어, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 예를 들어, 암 세포가 항원의 발현을 하향조절하는 경우에, 항원의 발현을 증가시키도록 페이로드를 전달하거나, 표적 핵산을 편집하는 데 사용될 수 있다. 구현예에서, 페이로드, 예를 들어, 발현의 전사 인자 또는 다른 활성제를 포함하는 페이로드가 암 세포로 전달된다. 구현예에서, 발현의 증가는 표적 핵산의 절단, 예를 들어, 주형 핵산에 의한 표적 핵산의 절단 및 수정 또는 변경에 의해 영향을 받는다. 구현예에서, 후성적 스플라이싱을 무시하는 페이로드, 예를 들어, 메틸화의 조절자가 전달된다.
구현예에서, 치료는 제2 항암 치료, 예를 들어, 면역 치료, 예를 들어, 상향조절된 항원에 결합하는 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법, 예를 들어, 게놈 서명, 예를 들어, 체세포 전좌의 표적화는 암 세포에 대하여 Cas9 분자/gRNA 분자를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항원에 대하여 대상체를 면역화시키는 방법을 특징으로 한다. 방법은, 항원이 면역 반응을 촉진시키도록, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 세포, 예를 들어, 혈액 세포로부터 항원의 발현을 촉진시키는 것을 포함한다. 구현예에서, 세포는 생체외에서 조작된 후, 대상체로 돌려보내거나 도입된다.
X.변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵산, 예를 들어, 특히 gRNA뿐만 아니라 RNA의 다른 형태, 예를 들어, mRNA, RNAi, 또는 siRNA에 존재할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 5탄당 분자(펜토즈 또는 리보스) 또는 이의 유도체, 및 유기 염기, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 이의 유도체를 포함하는 화합물로서 정의된다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드로서 정의된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 포스포디에스테르 백본 연결에서 비결합 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 결합 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체;
(ii) 리보스 당, 예를 들어, 리보스 당에서 2' 하이드록실의 구성성분의 변경, 예를 들어, 대체;
(iii) "데포스포" 링커를 지니는 포스페이트 모이어티의 대량 대체;
(iv) 천연 유래 핵염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형;
(vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티의 컨쥬게이션; 및
(vii) 당의 변형.
상기 열거된 변형은 조합되어 2 개, 3 개, 4 개 이상의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 구현예에서, gRNA 또는 주형 핵산의 모든 뉴클레오타이드는 변형되어 있으며, 예를 들어, 모든 뉴클레오타이드는 변형된 포스페이트기를 가지고, 예를 들어, 모든 변형된 포스페이트기는 포스포로티오에이트기이다. 구현예에서, 단분자 또는 모듈 gRNA 분자 또는 주형 핵산의 포스페이트기의 전부, 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트기로 대체된다.
구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형을 가지는 뉴클레오타이드는, 핵산, 예를 들어, "변형된 핵산"으로 포함된다. 구현예에서, 변형된 핵산은 1 개 , 2 개, 3 개 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 변형된 핵산에서 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%)가 변형된 뉴클레오타이드이다.
변형되지 않은 핵산은, 예를 들어, 세포 뉴클레아제에 의해 분해되는 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 핵산은 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하여, 예를 들어, 뉴클레아제에 대하여 안정성을 도입할 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은, 생체내 및 생체외 둘 다에서, 세포의 집단으로 도입될 때, 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 “선천성 면역 반응”은, 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하여 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론의 도입, 및 세포 사멸을 수반한다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은 파트너와 핵산이 상호작용하는 주홈의 결합을 방해할 수 있다. 구현예에서, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및 변형된 핵산은, 생체내 및 생체외 둘 다에서, 세포의 집단으로 도입될 때, 감소된 선천성 면역 반응을 나타낼 수 있으며, 또한 파트너와 핵산이 상호작용하는 주홈의 결합을 방해할 수 있다.
구현예에서, 지배적인 gRNA는 변형, 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드, 백본에 대한 변형, 및 본 명세서에 기재된 다른 변형을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 변형, 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드, 백본에 대한 변형, 및 본 명세서에 기재된 다른 변형을 포함한다. 구현예에서, 변형은, 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제에 대한 내성을 증가시킴으로써, 주형 핵산의 안정성을 개선시킨다.
구현예에서, 변형을 포함하는 주형 핵산은 이중 가닥이며, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이다. 이러한 구현예에서, 모든 변형은 하나의 가닥으로 국한된다. 구현예에서, 변형은 가닥 둘 다에 존재한다. 변형은 5' 상동성 암, 3' 상동성 암, 또는 대체 서열, 또는 이의 임의의 조합에 존재할 수 있다. 구현예에서, 변형은 하나 또는 둘 다의 상동성 암에 존재하지만, 대체 서열에는 존재하지 않는다.
구현예에서, 변형을 포함하는 주형 핵산은 단일 가닥이고, 예를 들어, 단일 가닥 DNA이다.
화학적 기의 정의
본 명세서에서 사용되는 "알킬"은 직쇄 또는 분지형인 포화 탄화수소기를 말하는 것으로 의미된다. 알킬기의 예는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예를 들어, n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예를 들어, n-부틸, 이소부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등을 포함한다. 알킬기는 1 개 내지 약 20 개, 2 개 내지 약 20 개, 1 개 내지 약 12 개, 1 개 내지 약 8 개, 1 개 내지 약 6 개, 1 개 내지 약 4 개, 또는 1 개 내지 약 3 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "아릴"은 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어, 2 개, 3 개 또는 4 개의 융합된 고리를 가짐) 방향족 탄화수소, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐, 인다닐, 인데닐 등을 말한다. 구현예에서, 아릴기는 6 개 내지 약 20 개의 탄소 원자를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 "알케닐"은 적어도 1 개의 이중 결합을 포함하는 지방족 기를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "알키닐"은 2 개 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 삼중 결합을 가지는 것을 특징으로 하는 직선 또는 분지형 탄화수소 사슬을 말한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 프로파르길, 및 3-헥시닐을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 알킬 수소 원자가 아릴기로 대체된 알킬 모이어티를 말한다. 아랄킬은 하나 초과의 수소 원자가 아릴기로 대체된 기를 포함한다. "아릴알킬" 또는 "아랄킬"의 예는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 9-플루오레닐, 벤즈하이드릴, 및 트리틸기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "사이클로알킬"은 2 개 내지 12 개의 탄소를 가지는 사이클릭, 비사이클릭, 트리사이클릭, 또는 폴리사이클릭 비방향족 탄화수소기를 말한다. 사이클로알킬 모이어티의 예는 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 "헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 고리계의 1가 라디칼을 말한다. 대표적인 헤테로사이클릴은 제한없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티에닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 및 모르폴리닐을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "헤테로아릴"은 헤테로방향족 고리계의 1가 라디칼을 말한다. 헤테로아릴 모이어티의 예는 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티아졸릴, 피롤릴, 푸라닐, 인돌릴, 티오페닐 피라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐, 퀴놀릴, 및 프테리디닐을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
포스페이트 백본 변형
포스페이트기
구현예에서, 변형된 뉴클레오티드의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트로 비변형 포스페이트 모이어티를 대량 대체하는 것을 포함할 수 있다. 구현예에서, 포스페이트 백본의 변형은 비하전된 링커 또는 하전된 링커 중 어느 하나가 비대칭 전하 분포를 갖도록 하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 구현예에서, 포스페이트 백본 모이어티에서 비가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 다음의 기 중 임의의 것으로 대체될 수 있다: 황(S), 셀레늄(Se), BR3(여기서, R은 예를 들어, 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), C(예를 들어, 알킬기, 아릴기 등), H, NR2(여기서, R은 예를 들어, 수소, 알킬, 또는 아릴일 수 있음), 또는 OR(여기서, R은 예를 들어, 알킬 또는 아릴일 수 있음). 비변형 포스페이트기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 상기 원자 또는 원자 그룹 중 하나로 비가교 산소 중 하나를 대체하는 것은 인 원자를 키랄로 만들 수 있으며; 다시 말하면 이러한 방식으로 변형된 포스페이트기에서 인 원자가 입체 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배열(본 명세서에서는 Rp) 또는 "S" 배열(본 명세서에서는 Sp)을 가질 수 있다.
포스포로디티오에이트는 비가교 산소 둘 다 황으로 대체된다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고리보뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 불가능하게 하는 아키랄이다. 구현예에서, 비가교 산소 하나 또는 둘 다의 변형은 또한 S, Se, B, C, H, N, 및 OR(R은 예를 들어, 알킬 또는 아릴일 수 있음)로부터 독립적으로 선택되는 기로 비가교 산소를 대체하는 것을 포함할 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 질소(가교 포스포로아미데이트), 황(가교 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교 메틸렌포스포네이트)로 가교 산소(즉, 뉴클레오사이드에 포스페이트를 연결하는 산소)를 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 어느 하나 또는 연결 산소의 둘 다에서 일어날 수 있다.
포스페이트기의 대체
포스페이트기는 비-인 함유 커넥터(non-phosphrous containing connector)에 의해 대체될 수 있다. 구현예에서, 하전 포스페이트기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다.
포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸렌하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
리보포스페이트 백본의 대체
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체되는, 핵산을 모사할 수 있는 스캐폴드가 또한 구현될 수 있다. 구현예에서, 핵염기는 대용물 백본에 의해 테터링될 수 있다. 예는, 제한없이, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대용물을 포함할 수 있다.
당 변형
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당기에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체되거나 변형될 수 있다. 구현예에서, 하이드록실은 더 이상 탈양자화되지 않아 2'-알콕사이드 이온을 형성할 수 있으므로, 2' 하이드록실기에의 변형은 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다. 2'-알콕사이드는 링커 인 원자 상에서 분자내 친핵성 공격에 의한 분해를 촉진시킬 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기서, R은 예를 들어, H 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있음)을 포함할 수 있다. 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 "잠금(locked)" 핵산(LAN)을 포함할 수 있으며, 여기서 2' 하이드록실은, 예를 들어, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있으며, 여기서 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노)를 포함할 수 있다. 구현예에서, "옥시"-2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE)(OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 예를 들어, 부분적으로 ds RNA의 돌출된 부분에서); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디아킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아미노(여기서, 아미노는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 아미노로 선택적으로 치환될 수 있다.
당기는 또한 리보스 중 상응하는 탄소와 반대의 위치화학 배열을 가지는 하나 이상의 탄소를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은, 당으로서 예를 들어, 아라비노스를 포함하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 "단량체"는 당의 1' 위치에서 알파 연결, 예를 들어, 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 변형된 핵산은 또한 "비염기성" 당을 포함할 수 있으며, 상기 비염기성 당은 C-1'에서 핵염기가 없다. 이러한 비염기성 당은 또한 구성하는 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어, L-뉴클레오사이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, RNA는 당기 리보스를 포함하며, 당기 리보스는 산소를 가지는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오사이드는 제한없이 리보스 중 산소의 (예를 들어, 황(S), 셀레늄(Se), 또는 알킬렌, 예를 들어, 메틸렌 또는 에틸렌으로의) 대체;이중 결합의 첨가(예를 들어, 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체); 리보스의 고리 축소(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가적인 탄소 또는 헤테로원자를 가지는 6원- 또는 7-원 고리, 예를 들어, 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 모르폴리노(이는 또한 포스포르아미데이트 백본을 가짐) 형성)을 포함할 수 있다. 구현예에서, 변형된 뉴클레오타이드는 멀티사이클릭 형태(예를 들어, 트리사이클로); 및 "비잠금(unlocked)" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위에 의해 대체됨), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸르노실-(3'→2')로 대체됨)을 포함할 수 있다.
핵염기 상의 변형
변형된 핵산으로 포함될 수 있는, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는, 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데신(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 및 우라실(U)을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들 핵염기는 변형되거나 완전히 대체되어 변형된 핵산에 포함될 수 있는 변형된 뉴클로오타이드 및 변형된 뉴클레오사이드를 제공할 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 구현예에서, 핵염기는, 예를들어 자연-생성되고 합성된 염기의 유도체를 포함할 수 있다.
우라실
구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 변형된 우라실을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 슈도우리딘(ψ), 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카르복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카르바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm 5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(τcm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-우리딘(m5U, 즉 핵염기 데옥시티민을 가짐), 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘(D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘(acp3ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘(inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm 5Um), 5-카르바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm 5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm 5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm 5Um), 1-티오-우리딘, 디옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐) 우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 잔틴, 및 하이포잔틴을 포함한다.
사이토신
구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 사이토신이다. 변형된 사이토신을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 5-아자-사이티딘, 6-아자-사이티딘, 슈도이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘(m3C), N4-아세틸-사이티딘(act), 5-포르밀-사이티딘(f5C), N4-메틸-사이티딘(m4C), 5-메틸-사이티딘(m5C), 5-할로-사이티딘(예를 들어, 5-요오도-사이티딘), 5-하이드록시메틸-사이티딘(hm5C), 1-메틸-슈도이소사이티딘, 피롤로-사이티딘, 피롤로-슈도이소사이티딘, 2-티오-사이티딘(s2C), 2-티오-5-메틸-사이티딘, 4-티오-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소사이티딘, 제부라린, 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-사이티딘, 2-메톡시-5-메틸-사이티딘, 4-메톡시-슈도이소사이티딘, 4-메톡시-1-메틸-슈도이소사이티딘, 라이시딘(k2C), α-티오-사이티딘, 2'-O-메틸-사이티딘(Cm), 5,2'-O-디메틸-사이티딘(m5Cm), N4-아세틸-2'-O-메틸-사이티딘(ac4Cm), N4,2'-O-디메틸-사이티딘(m4Cm), 5-포르밀-2'-O-메틸-사이티딘(f 5Cm), N4,N4,2'-O-트리메틸-사이티딘(m4 2Cm), 1-티오-사이티딘, 2'-F-아라-사이티딘, 2'-F-사이티딘, 및 2'-OH-아라-사이티딘을 포함한다.
아데닌
구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 아데닌이다. 변형된 아데닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는, 제한없이, 2-아미노-퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-할로-퓨린(예를 들어, 2-아미노-6-클로로-퓨린), 6-할로-퓨린(예를 들어, 6-클로로-퓨린), 2-아미노-6-메틸-퓨린, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노-퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-아데노신(m1A), 2-메틸-아데닌(m2A), N6-메틸-아데노신(m6A), 2-메틸티오-N6-메틸-아데노신(ms2m6A), N6-이소펜테닐-아데노신(i6A), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐-아데노신(ms2i6A), N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(io6A), 2-메틸티오-N6-(cis-하이드록시이소펜테닐)아데노신(ms2io6A), N6-글리시닐카바모일-아데노신(g6A), N6-트레오닐카바모일-아데노신(t6A), N6-메틸-N6-트레오닐카바모일-아데노신(m6t6A), 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일-아데노신(ms2g6A), N6,N6-디메틸-아데노신(m6 2A), N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(hn6A), 2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴카바모일-아데노신(ms2hn6A), N6-아세틸-아데노신(ac6A), 7-메틸-아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, α-티오-아데노신, 2'-O-메틸-아데노신(Am), N6,2'-O-디메틸-아데노신(m6Am), N6-메틸-2'-데옥시아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸-아데노신(m6 2Am), 1,2'-O-디메틸-아데노신(m1Am), 2'-O-리보실아데노신(포스페이트)(Ar(p)), 2-아미노-N6-메틸-퓨린, 1-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 2'-F-아라-아데노신, 2'-F-아데노신, 2'-OH-아라-아데노신, 및 N6-(19-아미노-펜타옥사논아데실)-아데노신을 포함한다.
구아닌
구현예에서, 변형된 핵염기는 변형된 구아닌이다. 변형된 구아닌을 가지는 예시적인 뉴클레오사이드 및 핵염기는 제한없이, 이노신(I), 1-메틸-이노신(m1I), 와이오신(imG), 메틸와이오신(mimG), 4-데메틸-와이오신(imG-14), 이소와이오신(imG2), 와이부토신(yW), per옥시와이부토신(o2yW), 하이드록시와이부토신(OHyW), 저변형 하이드록시와이부토신(OHyW*), 7-데아자-구아노신, 케오신 (Q), 에폭케오신(oQ), 갈락토실-케오신(galQ), 만노실-케오신(manQ), 7-시아노-7-데아자-구아노신(preQ0), 7-아미노메틸-7-데아자-구아노신(preQ1), 아케오신(G+), 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신(m7G), 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸-이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸-구아노신(m'G), N2-메틸-구아노신(m2G), N2,N2-디메틸-구아노신(m2 2G), N2,7-디메틸-구아노신(m2,7G), N2, N2,7-디메틸-구아노신(m2,2,7G), 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메트 티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, α-티오-구아노신, 2'-O-메틸-구아노신(Gm), N2-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2Gm), N2,N2-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2 2Gm), 1-메틸-2'-O-메틸-구아노신(m'Gm), N2,7-디메틸-2'-O-메틸-구아노신(m2,7Gm), 2'-O-메틸-이노신(Im), 1,2'-O-디메틸-이노신(m'Im), O6-페닐-2'-디옥시이노신, 2'-O-리보실구아노신(포스페이트)(Gr(p)), 1-티오-구아노신, O6-메틸-구아노신, O6-메틸-2'-데옥시구아노신, 2'-F-아라-구아노신, 및 2'-F-구아노신을 포함한다.
변형된 gRNA
구현예에서, 변형된 핵산은 변형된 gRNA일 수 있다. 구현예에서, gRNA는 3' 말단에서 변형될 수 있다. 이 구현예에서, gRNA는 3' 말단 U 리보스에서 변형될 수 있다. 예를 들어, U 리보스의 2 개의 말단 하이드록실기는 알데하이드기로 산화되고 리보스 고리의 부수적인 개구가 일어나 하기에 나타낸 바와 같은 변형된 뉴클레오사이드를 제공할 수 있다:
여기서, "U"는 비변형 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
다른 구현예에서, 3' 말단 U는 하기에 나타낸 바와 같은 2'3' 사이클릭 포스페이트로 변형될 수 있다:
여기서, "U"는 비변형 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
구현예에서, gRNA 분자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함함으로써, 분해에 대하여 안정화될 수 있는 3' 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이 구현예에서, 예를 들어, 우리딘은 변형된 우리딘, 예를 들어, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 및 5-브로모 우리딘으로, 또는 본 명세서에 기재된 변형된 우리딘 중 임의의 것으로 대체될 수 있으며; 아데노신 및 구아노신은 변형된 아데노신 및 구아노신으로, 예를 들어, 8-위치에서 변형이 있는 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어, 8-브로모 구아노신으로, 또는 본 명세서에 기재된 변형된 아데노신 또는 구아노신으로 대체되 수 있다. 구현예에서, 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어, 7-데아자-아데노신은 gRNA로 포함될 수 있다. 구현예에서, O- 및 N-알킬화 뉴클레오타이드, 예를 들어, N6-메틸 안데노신은 gRNA로 포함될 수 있다. 구현예에서, 예를 들어, 2' OH-기가 H, -OR, -R(여기서, R은 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 할로, -SH, -SR(여기서, R은 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 아미노(여기서, 아미노는 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); 또는 시아노(-CN)로부터 선택되는 기로 대체되는, 당-변형 리보뉴클레오타이드가 포함될 수 있다. 구현예에서, 포스페이트 백본은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 포스포티오에이트기로 변형될 수 있다. 구현예에서, gRNA의 돌출부 영역의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 변형된 2'-당, 예컨대 2-F 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸사이티딘(m5Ceo), 및 이의 임의의 조합을 포함하는 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드일 수 있다.
구현예에서, RNA 분자, 예를 들어, gRNA 분자의 단일 가닥 돌출부 중 뉴클레오타이드의 하나 이상 또는 전부는 데옥시뉴클레오타이드이다.
XI. 링커
구현예에서, 페이로드는, 예를 들어, 공유 링커에 의해 Cas9 분자 또는 gRNA에 연결될 수 있다. 이 링커는 절단성이거나 비절단성일 수 있다. 구현예에서, 절단성 링커는 원하는 표적으로 수송 후 페이로드를 방출하는 데 사용될 수 있다.
링커는 직접 결합 또는 원자, 예를 들어, 산소(O) 또는 황(S), -NR-(여기서, R은 수소 또는 알킬임), -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, SO, SO2, -SO2NH-과 같은 단위, 또는 원자 사슬, 예컨대 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬을 포함할 수 있다. 구현예에서, 원자 사슬 중 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, -SO2NH-, -NR-, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, 절단성 연결기, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클릭 중 하나 이상으로 대체될 수 있다.
비절단성 연결
구현예에서, 페이로드는 그 자체가 생리적 조건 하에서 안정적인 링커, 예컨대 알킬렌 사슬을 통해 Cas9 분자 또는 gRNA에 부착되며, 대상체에 투여될 때 적어도 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 10 시간, 15 시간, 24 시간 또는 48 시간 동안 또는 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 10 일 동안 Cas9 분자 및/또는 gRNA로부터 페이로드의 방출을 초래하지 않는다. 구현예에서, 페이로드 및 Cas9 분자 및/또는 gRNA는 작용기의 잔기를 포함하는데, 이를 통해 Cas9 분자 또는 gRNA에 페이로드의 연결 및 반응이 달성되었다. 구현예에서, 동일 또는 상이하거나, 말단 또는 내부에 있을 수 있는 페이로드 또는 Cas9 분자 및/또는 gRNA의 작용기는 아미노, 산, 이미다졸, 하이드록실, 티오, 아실 할라이드, -HC=CH-, 기, 또는 이의 유도체를 포함한다. 구현예에서, 링커는 하나 이상의 메틸렌기가 Y기(단, Y기 중 어떤 것도 서로 인접하지 않음)로 선택적으로 대체되는 하이드로카르빌렌기를 포함하며, 여기서 각각의 Y는 각각의 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 또는 -O-, -C(=X)-(여기서, X는 NR1, O 또는 S임), -NR1-, -NR1C(O)-, -C(O)NR1-, -S(O)n-, -NR1S(O)n-, -S(O)nNR1-, -NR1C(O)-NR1-; 및 R1(각각의 경우에 독립적으로, H 또는 저급 알킬을 나타냄)로부터 선택되고, 여기서 n은 0, 1, 또는 2이다.
구현예에서, 링커는 알킬렌 모이어티 또는 헤테로알킬렌 모이어티(예를 들어, 알킬렌 글리콜 모이어티, 예컨대 에틸렌 글리콜)를 포함한다. 구현예에서, 링커는 폴리-L-글루탐산, 폴리락트산, 폴리(에틸렌이민), 올리고당, 아미노산(예를 들어, 글리신), 아미노산 사슬, 또는 임의의 다른 적합한 연결을 포함한다. 링커기, 예컨대 PEG, 폴리글리콜산, 또는 폴리락트산 사슬은 생물학적으로 불활성일 수 있다. 구현예에서, 링커기는 유도체화 또는 비유도체화 아미노산(예를 들어, 글리신)을 나타낸다.
절단성 연결
절단성 연결기는 세포 외부에서 충분히 안정적이지만, 표적 세포 내로의 유입시, 절단되어 링커가 붙잡고 있는 2개 부분을 방출시키는 연결기이다. 일 구현예에서, 절단성 연결기는, 대상체의 혈액에서, 또는 제2 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모사하거나 상기 조건을 나타내도록 선택될 수 있음)에서보다, 표적 세포에서 또는 제1 기준 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모사하거나 세포 내 조건을 나태내도록 선택될 수 있음) 하에서 적어도 10 배 이상, 또는 적어도 100 배 더 빨리 절단된다.
분해성 연결기는 절단제에, 예를 들어, pH, 산화환원 전위, 분해 분자의 존재에 영향을 받기 쉽다. 이러한 분해제의 예는, 산화환원제(특정 기질에 대하여 선택되거나, 환원에 의해 산화환원 절단성 연결기를 분해할 수 있는, 예를 들어, 세포 내에 존재하는 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예컨대 메르캅탄을 포함하여 기질 특이성을 가지지 않음); 에스테라제; 산성 환경을 형성할 수 있는 효소 또는 엔도좀, 예를 들어, pH를 5로 초래할 수 있는 것; 일반 산, 펩티다제(기질 특이성일 수 있음), 및 포스파테제로서 작용함으로써 산 절단성 연결기를 가수분해 또는 분해할 수 있는 효소를 포함한다.
절단성 연결기, 예컨대 이황화 결합(-S-S-)은 pH에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면, 평균적인 세포내 pH는 약 7.1 내지 7.3의 범위로 약간 더 낮다. 엔도좀은 5.5 내지 6.0의 범위로 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 훨씬 더 산성인 pH를 가진다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단성 연결기를 가질 것이다. 링커는 특정 효소에 의해 절단가능한 절단성 연결기를 포함할 수 있다.
일반적으로, 후보 절단성 연결기의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 후보 절단성 연결기는 또한 혈액에서 절단에 저항하는 능력에 대하여 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 시험될 수 있다. 따라서 제1 및 제2 조건 사이에서 절단에 대한 상대적인 감수성이 결정될 수 있으며, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단의 지표가 되는 것으로 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 절단의 지표가 되는 것으로 선택된다. 평가는 무세포계, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물, 또는 동물 전체에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양물 조건에서 초기 평가를 하고 동물 전체에서 추가 평가에 의해 확인하는 것이 유용할 수 있다.
구현예에서, 절단성 링커는 산화환원 절단성 링커, 예컨대 이황화기(-S-S-) 및 포스페이트 절단성 링커, 예를 들어, -O-P(O)(OR)-O-, -O-P(S)(OR)-O-, -O-P(S)(SR)-O-, -S-P(O)(OR)-O-, -O-P(O)(OR)-S-, -S-P(O)(OR)-S-, -O-P(S)(OR)-S-, -S-P(S)(OR)-O-, -O-P(O)(R)-O-, -O-P(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-O-, -S-P(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-S-, -OP(S)(R)-S-를 포함하며, 여기서 R은 수소 또는 알킬이다.
산 절단성 연결기
산 절단성 연결기는 산성 조건 하에서 절단되는 연결기이다. 구현예에서, 산 절단성 연결기는 pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 또는 그 이하)인 산성 조건에서, 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 절단된다. 산 절단성 연결기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 산 절단성 기는 일반식 -C(=N-)N-, -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가질 수 있다.
에스테르계 연결기
에스테르계 절단성 연결기는 세포 내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르계 절단성 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 아키닐렌기의 에스테르를 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 에스테르 절단성 연결기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가진다.
XII. 게놈 서명의 표적화
Cas9 분자, gRNA 분자, 특히 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 선택된 게놈 서명을 포함하는 표적 핵산과 서열 특이적 상호작용 덕분에 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 이는 선택된 게놈 서명을 가지는 세포의 표적화된 파괴를 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 선택된 게놈 서명, 예를 들어, 생식계열에 존재하는 게놈 서명 또는 게놈에서 산발적 또는 체세포 변화의 결과로서 생기는 게놈 서명, 예를 들어, 암세포에서 생식계열 또는 획득된 돌연변이, 바이러스 감염, 또는 게놈에 대한 다른 생식계열 또는 획득된 변화를 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
이론에 의해 구속되지 않고, gRNA 분자의 표적화 도메인과 표적 핵산의 표적 서열 사이의 상보성은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 표적 서열의 표적 서열-특이적 상호작용을 매개하는 것으로 여겨진다. 이는 특이적 서열 또는 게놈 서명의 표적화, 예를 들어, 재배열, 예를 들어, 전좌, 삽입, 결실, 및 역위, 및 다른 돌연변이를 가능하게 한다. Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는, 생식계열, 미토콘드리아, 또는 체세포인 특이적 서열을 표적화, 예를 들어, 돌연변이하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체에 따라서, 특이적 편집, 페이로드의 전달, 또는 이 둘 다가 이행될 수 있다. 구현예에서, 페이로드의 절단 및 전달은 둘 다 이행된다.
구현예에서, 표적 게놈 서열의 인식시 세포 사멸을 촉진하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체. 구현예에서, eaCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 표적 핵산을 절단한다. 구현예에서, 복합체는 페이로드를 전달하지 않는다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 내인성 세포 구성요소, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소는 이들 구현예에서 세포자멸사를 촉진한다.
구현예에서, eaCas9 분자/gRNA 분자 복합체는 표적 핵산을 절단하고 페이로드를 전달한다. 페이로드는 성장 또는 세포 분열을 저해하거나, 세포자멸사를 촉진하는 화합물, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소를 포함할 수 있다. 구현예에서, 제2 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 성장 또는 세포 분열을 저해하거나, 세포자멸사를 촉진하는 제2 화합물, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소를 포함할 수 있다. 제2 페이로드를 전달하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 eiCas9 분자 또는 eaCas9 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가적인 제3 또는 제4 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 추가적인 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 성장 또는 세포 분열을 저해하거나, 세포자멸사를 촉진하는 추가적인 화합물, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 추가적인 구성요소가 촉진한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 성장 또는 세포 분열을 저해하거나, 세포자멸사를 촉진하는 화합물, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소를 포함하는 페이로드를 전달하지만, 표적 핵산을 절단하지는 않는다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 내인성 세포 구성요소, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소가 이들 구현예에서 세포자멸사를 촉진하는 것으로 여겨진다.
성장 또는 세포 분열을 저해하거나, 세포자멸사를 촉진하는 예시적인 화합물, 예를 들어, DNA 손상 세포자멸사 신호전달 캐스케이드의 구성요소가 본 명세서, 예를 들어, 표 XII-1에 기재되어 있다.
표 XII-1
구현예에서, Cas9 분자는/gRNA 분자 복합체는 재배열, 예를 들어, 전좌, 역위, 삽입, 또는 결실의 중단점을 포함하거나 상기 중단점 근처에 있는 서열을 표적화한다. 구현예에서, 재배열은 세포에 원치 않는 특성, 예를 들어, 원치않는 증식을 가져온다. 구현예에서, 재배열을 품고 있는 세포는 암 세포이다. 구현예에서, 재배열은 키나제 유전자를 포함하며, 키나제 활성의 원치 않고, 증가되거나 구성적인 발현을 초래한다. 구현예에서, 재배열은 종양 억제자의 발현을 방해한다
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는,
예를 들어, 돌연변이, 예를 들어, 재배열의 중단점 또는 접합점을 표적화함으로써, 재배열을 포함하는 세포의 게놈을 특이적으로 표적화, 예를 들어, 절단하거나; 또는
예를 들어, 절단 또는 페이로드 전달을 위해, 돌연변이, 예를 들어, 재배열 중단점의 200 개, 100 개, 150 개, 100 개, 50 개, 25 개, 10 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드 서열을 표적화한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하여, 게놈 서명을 포함하는 세포를 조작하는 방법을 포함한다:
상기 게놈 서명을 표적화하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 투여함으로써, 상기 세포를 조작하는 단계.
구현예에서, 조작은 상기 세포의 성장 또는 분열, 또는 사멸을 저해하는 것을 포함한다.
구현예에서, 상기 세포는 암 세포 또는 바이러스 감염을 가지는 세포이다.
구현예에서, 방법은 상기 게놈 서명을 가지는 세포를 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 암 또는 바이러스 감염에 대하여 대상체, 예를 들어, 인간 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자는/gRNA 분자 복합체는, 예를 들어, 주형 핵산으로부터 정지 코돈의 도입에 의해 재배열을 방해하며, 예를 들어, 정지 코돈은 융합 단백질, 예를 들어, 키나제 활성을 포함하는 융합 단백질로 삽입된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하여, 비-키나제 유전자 제어 영역의 제어 하에 키나제 도메인을 위치시키는, 키나제 유전자의 비-키나제 유전자로의 전좌를 가지는 암을 치료하는 방법을 포함한다:
상기 전좌를 표적화하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 투여하는 단계. 구현예에서, 키나제 전좌의 제어 영역, 예를 들어, 프로모터, 또는 암호화 서열은 편집되어 발현을 감소시킨다.
XIII. 병용 요법
Cas9 분자, gRNA 분자, 특히 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 제2 치료제, 예를 들어, 암 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 구현예에서, 제2 치료제(예를 들어, 암 약물) 및 Cas9 분자, gRNA 분자, 특히 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 상이한(예를 들어, 비중첩) 경로를 표저화한다. 구현예에서, 제2 치료제(예를 들어, 암 약물) 및 Cas9 분자, gRNA 분자, 특히 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 동일하거나 중첩된 경로를 표적화한다.
예시적인 병용 요법은, 예를 들어, 하기를 포함한다:
- AKT-특이적 Cas9/gRNA 분자와 함께, mTOR 저해제(예를 들어, 템시롤리무스(토리셀®) 또는 에베로리무스(아피니토르®));
- HDAC-특이적 Cas9/gRNA 분자와 함께, 타이로신 키나제 저해제, 예컨
대 이마티닙 메실레이트(글리벡®); 아사티닙(스프라이셀®); 보수티닙(보술리프®); 트라스투주맙(헤르셉틴®); 페르투주맙(페르제타™); 라파티닙(타이커브®); 제피티닙(이레사®); 에를로티닙(타세바®); 및
- MDR1 유전자와 같은 다중 약물 내성 유전자에 대하여 하나 이상의 Cas9/gRNA와 함께, 임의의 화학 치료제.
XIV. 유전자 장애, 예를 들어, 듀켄씨 근이영양증(DMD)의 치료
다른 양태에서, 본 발명은 세포를 변경, 예를 들어, 유전자 서명, 예를 들어, 정지 코돈, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈의 효과를 감소 또는 제거하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 세포를 하기의 것:
유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈에서 또는 이의 상류에서 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체
와 접촉시키고 이에 의하여 세포를 변경시키는 단계를 포함한다.
이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 구현예에서 절단 및 후속 엑소뉴클레아제 활성, 및 비상동성 말단 결합은, 예를 들어, 상이한 프레임에 위치시킴으로써, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈이 제거되는 변경된 서열을 초래하는 것으로 여겨진다. 구현예에서, 사건의 동일한 시리즈는, 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈 이후의 서명에 대한 적절한 리딩 프레임을 복원한다.
방법이 프레임시프트 돌연변이를 수정하기 위하여 수행되어 미성숙 정지 코돈을 제거할 때, DNA의 다양한 부위에서 수선이 수행될 수 있다. 돌연변이에서 절단이 지시되고, 이에 의하여 전체적인 프레임시프트를 수정하고 단백질을 야생형(또는 야생형 근처) 서열로 되돌릴 수 있다. 또한 미성숙 정지 코돈에서 또는 근처에서 절단이 지시되어 수선이 이행된 코돈의 단백질 C-말단의 아미노산의 전부(또는 거의 전부)가 야생형이 되게 한다. 후자의 경우에, 생성된 단백질은 돌연변이와 수선 부위 사이에서 하나 이상의 프레임시프트된 아미노산을 가질 수 있지만; 단백질은 여전히 기능성일 수 있는데, 그 이유는 단백질이 전장이고, 길이의 대부분에 걸쳐서 야생형 서열을 가지기 때문이다.
유전자 서명은, 표현형(예컨대, 유전자 질환 또는 이의 증상)을 유발하는 게놈의 특정 부분에서의 특정 DNA 서열이다. 예를 들어, 유전자 서명은 단백질의 발현을 방지하는 미성숙 정지 코돈일 수 있다. 이러한 시나리오에서, 미성숙 정지 코돈은 정지 코돈을 직접 형성하는 돌연변이, 또는 하류에 형성되는 미성숙 정지 코돈을 야기하는 프레임시프트를 유발하는 돌연변이로부터 생길 수 있다. 유전자 서명은 또한 단백질에서 중요한 아미노산의 아이덴티티를 변경하하여 단백질의 기능을 방해하는 점 돌연변이일 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 상기 표적 핵산 중 이중 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈은 점 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 재배열로부터 생긴다. 구현예에서, 돌연변이는 프레임시프트를 유발하며, 이는 유전자 서명, 예를 들어, 돌연변이 하류의 미성숙 정지 코돈을 초래한다.
구현예에서, 미성숙 정지 코돈은 표적 핵산 내에 존재한다. 구현예에서, 표적 핵산은 미성숙 정지 코돈의 상류에 존재한다. 돌연변이는 표적 핵산의 상류, 표적 핵산 내, 또는 표적 핵산의 하류에 존재할 수 있다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 돌연변이의 500 개, 200 개, 100 개, 50 개, 30 개, 20 개, 10 개, 5 개, 또는 2 개 뉴클레오타이드 내에 있다. 구현예에서, 이중 가닥 파손은 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈의 500 개, 200 개, 100 개, 50 개, 30 개, 20 개, 10 개, 5 개, 또는 2 개 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 표적 핵산의 엑소뉴클레아제 분해를 매개한다. 구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 이중 가닥 파손에서 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 제거한다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 비상동성 말단 연결에 의해 해결된다.
구현예에서, 돌연변이 및/또는 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈은 디스트로핀 유전자, 예를 들어, 엑손 51, 또는 엑손 51의 선행 또는 후행 인트론에 존재한다. 미성숙 정지 코돈은 또한 코돈 54, 645, 773, 3335, 및 3340 중 하나 이상에서 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 구현예에서, 디스트로핀 유전자의 미성숙 정지 코돈은 코돈 2305 내지 2366의 결실에 의해 생긴다.
구현예에서, 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시키는 것은 세포를 Cas9 분자를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예에서, 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시키는 것은 세포를 핵산, 예를 들어, 플라스미드로, 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하여 형질감염시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈이 앞서 위치한 단백질의 수준을 증가시킨다. 예를 들어, 단백질 수준(예를 들어, 디스트로핀 수준)은 세포 또는 조직에서 적어도 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%만큼 증가될 수 있다. 구현예에서, 방법은, 예를 들어, mRNA가 논센스-매개 mRNA 붕괴를 겪지 않게 함으로써 미성숙 정지 코돈이 앞서 위치한 mRNA의 수준을 증가시킨다.
구현예에서, 표적 핵산, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈, 및 돌연변이 중 하나 이상은 디스트로핀 유전자(DMD에서 돌연변이됨)에 위치한다. 표적 핵산, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈, 및 돌연변이 중 하나 이상은 또한 COL7A1 유전자(VII형-연관 이영양성 수포성 표피 박리증에서 돌연변이됨), FKTN 유전자(후쿠야마형 선천성 근이영양증에서 돌연변이됨), 다이스페린 유전자(지대근이영양증 2B형에서 돌연변이됨), CFTR 유전자(낭포성 섬유증에서 돌연변이됨), HEXA(테이-삭스병에서 돌연변이됨), IDS 유전자(헌터 증후군에서 돌연변이됨), FVIII 유전자(혈우병에서 돌연변이됨), IDUA 유전자(후를러 증후군에서 돌연변이됨), PPT1 유전자(유아의 신경원성 세로이드 리포푸신증에서 돌연변이됨), 종양 억제자, 예컨대 ATM 유전자(암 유사 신경교종 및 B-세포 만성 림프루성 백혈병에서 돌연변이됨), RP2(X-연관 망막 색소 변성증에서 돌연변이됨), CTNS 유전자(신증 시스틴증에서 돌연변이됨), 및 AVPR2 유전자(선천적 신성요붕증에서 돌연변이됨)에 위치할 수 있다.
구현예에서, 방법은 배양된 세포에서 수행된다. 구현예에서, 방법은 세포를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 세포는, 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포, 골수 유래 조상세포, 골격근 조상세포, CD133+ 세포, 메소혈관모세포, 또는 MyoD-형질도입 진피 섬유아세포일 수 있다.
구현예에서, 방법은 표적 핵산과 주형 핵산 사이에 상동성-지시 수선을 가능하게 하는 조건 하에서 세포를 주형 핵산과 접촉시켜 돌연변이 또는 미성숙 정지 코돈을 수정하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈과 연관된 장애, 예를 들어, DMD를 가지는 인간 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 인간 대상체에 하기의 것:
1) 미성숙 정지 코돈에서 또는 이의 상류에서 절단하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 또는
2) 이러한 복합체와 접촉된 세포
를 제공함으로써, 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 상기 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 매개한다.
구현예에서, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈은 점 돌연변이, 삽입, 결실, 또는 재배열로부터 생긴다. 구현예에서, 돌연변이는 프레임시프트를 유발하며, 이는 돌연변이 하류의 미성숙 정지 코돈을 초래한다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 돌연변이의 500 개, 200 개, 100 개, 50 개, 30 개, 20 개, 10 개, 5 개, 또는 2 개 뉴클레오타이드 내에 있다. 구현예에서, 이중 가닥 파손은 미성숙 정지 코돈의 500 개, 200 개, 100 개, 50 개, 30 개, 20 개, 10 개, 5 개, 또는 2 개 뉴클레오타이드 내에 있다.
구현예에서, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체의 표적 핵산 내에 존재한다. 구현예에서, 표적 핵산은 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈의 상류에 존재한다. 돌연변이는 표적 핵산의 상류, 표적 핵산 내, 또는 표적 핵산의 하류에 존재할 수 있다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 표적 핵산의 엑소뉴클레아제 분해를 매개한다. 구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 이중 가닥 파손에서 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 뉴클레오타이드를 제거한다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 비상동성 말단 연결에 의해 해결된다.
구현예에서, 돌연변이 및/또는 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈은 디스트로핀 유전자, 예를 들어, 엑손 51, 또는 엑손 51의 선행 또는 후행 인트론에 존재한다. 미성숙 정지 코돈은 또한 코돈 54, 645, 773, 3335, 및 3340 중 하나 이상에서 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 구현예에서, 디스트로핀 유전자의 미성숙 정지 코돈은 코돈 2305 내지 2366의 결실에 의해 생긴다.
구현예에서, 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시키는 것은 세포를 Cas9 분자를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 구현예에서, 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시키는 것은 세포를 핵산, 예를 들어, 플라스미드로, 또는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하여 형질감염시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈이 앞서 위치한 단백질의 수준을 증가시킨다. 예를 들어, 단백질 수준(예를 들어, 디스트로핀 수준)은 세포 또는 조직에서 적어도 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30%만큼 증가될 수 있다. 구현예에서, 방법은, 예를 들어, mRNA가 논센스-매개 mRNA 붕괴를 겪지 않게 함으로써 미성숙 정지 코돈이 앞서 위치한 mRNA의 수준을 증가시킨다.
구현예에서, 표적 핵산, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈, 및 돌연변이 중 하나 이상은 디스트로핀 유전자(DMD에서 돌연변이됨)에 위치한다. 표적 핵산, 유전자 서명, 예를 들어, 미성숙 정지 코돈, 및 돌연변이 중 하나 이상은 또한 COL7A1 유전자(VII형-연관 이영양성 수포성 표피 박리증에서 돌연변이됨), FKTN 유전자(후쿠야마형 선천성 근이영양증에서 돌연변이됨), 다이스페린 유전자(지대근이영양증 2B형에서 돌연변이됨), CFTR 유전자(낭포성 섬유증에서 돌연변이됨), HEXA(테이-삭스병에서 돌연변이됨), IDS 유전자(헌터 증후군에서 돌연변이됨), FVIII 유전자(혈우병에서 돌연변이됨), IDUA 유전자(후를러 증후군에서 돌연변이됨), PPT1 유전자(유아의 신경원성 세로이드 리포푸신증에서 돌연변이됨), 종양 억제자, 예컨대 ATM 유전자(암 유사 신경교종 및 B-세포 만성 림프루성 백혈병에서 돌연변이됨), RP2(X-연관 망막 색소 변성증에서 돌연변이됨), CTNS 유전자(신증 시스틴증에서 돌연변이됨), 및 AVPR2 유전자(선천적 신성요붕증에서 돌연변이됨)에 위치할 수 있다.
구현예에서, 방법은 배양된 세포에서 수행된다. 구현예에서, 방법은 세포를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 세포는, 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 세포, 골수 유래 조상세포, 골격근 조상세포, CD133+ 세포, 메소혈관모세포, 또는 MyoD-형질도입 진피 섬유아세포일 수 있다.
구현예에서, 방법은 표적 핵산과 주형 핵산 사이에 상동성-지시 수선을 가능하게 하는 조건 하에서 세포를 주형 핵산과 접촉시켜 돌연변이 또는 미성숙 정지 코돈을 수정하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 대상체는 듀켄씨 근이영양증(DMD), 콜라겐 VII형-연관 이영양성 수포성 표피 박리증, 후쿠야마형 선천성 근이영양증, 지대근이영양증 2B형, 낭포성 섬유증, 리소좀 축적 질환(예컨대, 테이-삭스병, 헌터 증후군 및 신증 시스틴증), 혈우병, 후를러 증후군, 유아의 신경원성 세로이드 리포푸신증, X-연관 망막 색소 변성증(RP2), 암(예컨대, 신경교종 및 B-세포 만성 림프루성 백혈병), 및 선천적 신성요붕증으로부터 선택되는 장애를 가진다.
XV. 성숙한 특수화된 세포의 결핍을 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 육모 세포, 지지 세포, 또는 나선상 신경절 뉴런의 상실이 있는 손상된 청각; 또는 베타섬 세포의 상실이 있는 당뇨병의 치료
다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 재생 요법에서 세포를 변경, 예를 들어, 다른 성숙한 특수화된 세포의 발달을 촉진시키는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 증식 유전자는 상향조절되고/되거나 체크포인트 저해제는 억제되어, 예를 들어, 하나 이상의 분화 경로를 억제할 수 있다.
구현예에서, 방법은 증식 및 특수화된 계통 돌연변이의 유도를 포함한다.
구현예에서, 방법은, 예를 들어, 청력을 회복 또는 개선하기 위하여, 상기 세포를 하기의 것:
육모(hair) 세포의 발달을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하거나, 육모 세포의 발달을 저해하여 세포를 변경시키는 유전자를 하향 조절하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체
와 접촉시키는 단계를 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는 육모 세포 발달을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하는 페이로드를 전달한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는 모발 성장을 저해하는 유전자를 하향 조절하는 페이로드를 전달한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포의 게놈을 편집하여 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절한다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 변경을 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하는 게놈으로 이행하는 데 사용된다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포의 게놈을 편집하여 모발 성장을 저해하는 유전자를 하향 조절한다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 변경을 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 하향 조절하는 게놈으로 이행하는 데 사용된다.
구현예에서, 상기 세포는 iPS 세포, 고유한 육모 세포 조상세포, 또는 성숙한 육모 세포이다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는, 예를 들어, 유전자의 구조를 변형함으로써(예를 들어, 게놈을 편집함으로써) 또는 유전자를 조절하는 페이로드의 전달에 의해, 유전자의 발현을 변형한다. 구현예에서, 유전자는 전사 인자 또는 다른 조절 유전자이다.
구현예에서, 육모 세포 또는 다른 성숙한 세포의 재생을 위하여, 방법은 하기 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다:
상기 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시켜 세포 증식에 관한 다음의 것들 중 하나 이상의 상향 조절을 야기시키는 단계: c-Myc, GATA3, Oct4, Sox2, Wnt, TCF3;
상기 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시켜 체크포인트에 관한 다음의 것들 중 하나 이상의 하향 조절을 야기시키는 단계: BCL2, BMP, Hes1, Hes5, Notch, p27, Prox1, TGFβ; 및
상기 세포를 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체와 접촉시켜 성숙화 경로의 시작을 야기시키는 단계. 육모 세포에 있어서, 이는 Atoh1 (Math1), Barhl1, Gfi1, Myo7a, p63, PAX2, PAX8, Pou4f3 중 하나 이상을 포함할 것이고, 뉴런에 있어서는 NEFH, Neurod1, Neurog1, POU4F1 중 하나 이상을 포함할 것이다.
구현예에서, 방법은 내이 육모 세포, 외이 육모 세포, 나선상 신경절 뉴런, 및 귀 지지 세포의 생성을 포함한다.
구현예에서, 하나 이상의 성장 인자가 조절, 예를 들어, 상향 조절될 수 있으며, 예를 들어, TPO는 혈소판의 생성을 위해 상향 조절될 수 있고 GCSF는 호중구의 생성을 위해 상향 조절될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서, 예를 들어, 부문 XV에 기재된 변경된 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 손상된 청력을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 상기 대상체에, 본 명세서, 예를 들어, 부문 XV에 기재된 변경된 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 세포는 자가조직이다. 구현예에서, 세포는 동종이계이다. 구현예에서, 세포는 이종이다.
다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 손상된 청력에 대하여 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 방법은 상기 대상체에 하기의 것:
모발의 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하거나, 모발의 성장을 저해하여 세포를 변경시키는 유전자를 하향 조절하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체
를 투여하는 단계를 포함한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하는 페이로드를 전달한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는 모발 성장을 저해하는 유전자를 하향 조절하는 페이로드를 전달한다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포의 게놈을 편집하여 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절한다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 변경을 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 상향 조절하는 게놈으로 이행하는 데 사용된다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체는 세포의 게놈을 편집하여 모발 성장을 저해하는 유전자를 하향 조절한다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 변경을 모발 성장을 촉진시키는 유전자를 하향 조절하는 게놈으로 이행하는 데 사용된다.
구현예에서, Cas9 분자/gRNA 분자는, 예를 들어, 유전자의 구조를 변형함으로써(예를 들어, 게놈을 편집함으로써) 또는 유전자를 조절하는 페이로드의 전달에 의해, 유전자의 발현을 변형한다. 구현예에서, 유전자는 전사 인자 또는 다른 조절 유전자이다.
구현예에서, 방법은 하기 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다:
c-Myc, GATA3, Oct4, Sox2, Wnt, TCF3 중 하나 이상의 상향 조절을 야기하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 투여하는 단계;
성숙화 경로의 시작을 야기하는 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 투여하는 단계. 육모 세포에 있어서, 이는 Atoh1(Math1), Barhl1, Gfi1, Myo7a, p63, PAX2, PAX8, 또는 Pou4f3 중 하나 이상을 포함할 것이고, 뉴런에 있어서는 NEFH, Neurod1, Neurog1, 또는 POU4F1 중 하나 이상을 포함할 것이다.
XVI. Cas9 시스템의 활성을 제한하기 위한 지배적인 gRNA 분자 및 이의 용도
본 명세서에서 논의된 바와 같이, Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어, DNA를 사용 또는 포함하는 조성물 및 방법은, 추가적으로 지배적인 gRNA 분자를 사용 또는 포함할 수 있다. 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 분자와 복합화되어 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화 또는 침묵시킬 수 있다. 두 가지 중 어느 경우에서, 지배적인 gRNA, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자, 또는 gRNA 표적화 gRNA 분자는 Cas9/gRNA 복합체 매개 유전자 표적화의 효과를 제한하고, 활성에 대한 일시적인 제한을 두거나 표적을 벗어난 활성을 감소시킬 수 있다. 지배적인 gRNA 분자는 Cas9 시스템의 구성성분의 생성을 저해, 예를 들어, 전적 또는 실질적으로 저해하는 작용을 함으로써 Cas9 시스템의 활성을 제한 또는 통제할 수 있다.
전형적으로 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열은 상이한 제어 영역, 예를 들어, 부정적으로 조절하는 구성성분과 상이한 제어 영역, 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 제어 하에 있다. 구현예에서, 상이한 것은 단순히 하나의 제어 영역, 예를 들어, 제어된 서열 둘 다와 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있지 않음을 말한다. 구현예에서, 상이한 것은 종류 또는 유형이 상이한 것을 말한다. 예를 들어, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 서열은 제어 영역, 예를 들어, 부정적으로 조절되는 구성성분을 암호화하는 서열, 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 핵산보다 더 낮은 수준으로 발현되거나, 상기 서열보다 이후에 발현되는 제어영역의 제어 하에 있다.
예로서, 지배적인 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9-표적화 gRNA 분자를 암호화하는 서열은, 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어, 인간U6 소형 핵 프로모터, 또는 인간 H1 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 구현예에서, 부정적으로 조절하는 구성성분을 암호화하는 서열, 예를 들어, Cas9 분자를 암호화하는 핵산은 본 명세서에 기재된 제어 영역(예를 들어, 프로모터), 예를 들어, 인간 U6 소 핵성 프로모터, 인간 H1 프로모터, 또는 PolII 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터, CAGGS 프로모터, 또는 CB 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 단지 설명하는 것이고, 어떠한 방법으로 본 발명의범주 또는 내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 스트렙토코커스 피오게네스 및 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 표적화하는 지배적인 gRNA 서열의 인실리코 설계
스트렙토코커스 피오게네스 및 스타필로코커스 아우레우스 Cas9s를 표적화하는 지배적인 가이드 RNA(gRNA)를 DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여 확인하였다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 gRNA 부위를 확인하는 것에 추가하여, 소프트웨어는 또한 인간 게놈에서 선택된 gRNA 부위와 1 개, 2 개, 3 개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이한 모든 PAM 인접 서열을 확인한다. 각각의 Cas9 유전자에 대한 게놈 DNA 서열은 UCSC 게놈 브라우저로부터 입수하였으며, 서열은 대중이 이용가능한 리피트마커(RepeatMasker) 프로그램을 사용하여 반복 구성요소에 대하여 스크리닝하였다. 리피트마커는 반복된 구성요소에 대한 유입 DNA 서열 및 복잡성이 낮은 영역을 검색한다. 산출물은 주어진 미상(query) 서열에 존재하는 반복부의 상세한 주석이다.
확인 후, 지배적인 gRNA는 Cas9 암호화 서열 내 절단 위치, 직교성 및 5' G의 존재(PAM을 포함하는 인간 게놈에서 밀접한 매치의 확인을 기반으로 함)를 기반으로 하여 티어로 순위를 매겼다. 직교성은 표적 서열과 미스매치되는 최소의 수를 포함하는 인간 게놈 중 서열의 수를 말한다. "높은 수준의 직교성" 또는 "양호한 직교성"은, 예를 들어, 의도된 표적 이외의 인간 게놈에서 동일성이 있는 서열도, 또는 표적 서열에서 1 개 또는 2 개의 미스매치를 포함하는 임의의 서열도 가지지 않는 20-mer의 gRNA를 말한다. 양호한 직교성을 지니는 표적화 도메인이 표적을 벗어난 DNA 절단을 최소화하기 위해 선택된다.
티어(Tier) 1은 Cas9의 암호화 서열의 처음 500 개의 뉴클레오타이드를 표적화하고, 양호한 직교성을 가지며, 5' G로 시작하는 모든 gRNA를 포함한다. 티어 2는 Cas9의 암호화 서열의 처음 500 개의 뉴클레오타이드를 표적화하고, 양호한 직교성을 가지지만, 5' G로 시작하지 않는 모든 gRNA를 포함한다. 티어 3은 Cas9의 암호화 서열의 처음 500 개의 뉴클레오타이드를 표적화하고, 불량한 직교성을 가지며, 5' G로 시작하는 모든 gRNA를 포함한다. 티어 4는 Cas9의 암호화 서열의 처음 500 개의 뉴클레오타이드를 표적화하고, 불량한 직교성을 가지지만, 5' G로 시작하지 않는 모든 gRNA를 포함한다. 티어 5는 나머지 암호화 서열을 표적화하는 모든 gRNA를 포함한다. 스타필로코커스 아우레우스의 경우에, 표적이 NNGRRV의 최적이 아닌 PAM을 가지는 모든 gRNA를 포함하는 6번째 티어가 있다.
모든 스트렙토코커스 피오게네스 표적에 있어서, 17-mer, 또는 20-mer gRNA를 설계하였다. 모든 스타필로코커스 아우레우스 표적에 있어서, 20-mer gRNA를 설계하였다. gRNA를 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 둘 다에 대하여, 그리고 이중-gRNA와 쌍을 이루는 "틈내기효소" 전략에 대하여 확인하였다. 설계한 지배적인 gRNA는 표 E-1 내지 E-12에 열거되어 있다.
표 E-1
표 E-2
표 E-3
표 E-4
표 E-5
표 E-6
표 E-7
표 E-8
표 E-9
표 E-10
표 E-11
표 E-12
실시예 2: 293T 세포에서 VEGF 를 표적화하는 gRNA로 공동 형질감염된 Cas9를 표적화하는 지배적인 gRNA의 효능
본 연구에서, 293T 세포(24 웰 플레이트에서 웰 당 120,000 개의 세포)를, VEGF 유전자를 표적화하는 gRNA(gRNA 서열 GGTGAGUGAGUGUGUGCGUG(서열번호 1510), 문헌[Fu et al, Improving CIRSPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)]의 도 1d로부터 VEGFA 부위 3(표적 부위 3)의 20mer를 참조)를 발현하는 작제물 125 ng과 함께 에피토프-태그(3X Flag-태그)된 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 발현하는 플라스미드 750 ng으로 형질감염시켰다. 동시에, 세포를 3 가지 gRNA 발현 작제물, 즉 CCR5 유전자를 표적화하는 gRNA를 발현하는 작제물(대조군으로서 작용함), 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 표적화하는 지배적인 gRNA 항-SPCas9-175를 발현하는 작제물(실시예 1을 참조), 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 표적화하는 지배적인 gRNA 항-SPCas9-1(실시예 1을 참조)을 발현하는 작제물 중 하나 125 ng으로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 1 일, 2 일, 3 일, 6 일 및 9 일째에 분석을 위하여 수확하였다.
내인성 VEGF 및 플리스미드-매개 Cas9 유전자의 돌연변이 비율을 정량화하기 위하여, 전체 게놈 DNA를 각 시점에 분리하였고, VEGF gRNA와 Cas9 지배적인 gRNA 표적화 서열을 포함하는 영역을 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 변성시키고 재어닐링시킨 다음, T7E1 뉴클레아제로 처리하였다. 돌연변이율(삽입-결실 빈도)을 문헌[Reyon, D. et al, FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)]에 기재된 바와 같은 모세관 전기이동 기기를 사용하여 측정하였다. 3 가지 처리 군에 있어서 VEGF 및 Cas9의 돌연변이 빈도(삽입-결실률 ± 표준 편차)는 표 E-13에 나타내어져 있다. 이들 결과는 Cas9-표적화 지배적인 gRNA는 둘 다 Cas9 유전자에서 돌연변이를 유도하고, 내인성 VEGF 유전자좌는 공동-형질감염된 Cas9-표적화 지배적인 gRNA의 존재 또는 부재 하에서 유사한 정도로 돌연변이됨을 확정한다.
실험 기간 동안 Cas9 단백질의 수준을 평가하기 위하여, 전체 단백질 용해물을 각 시점에 각 처리군으로부터 준비하였다. 단백질 샘플(15 ug)을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막에 블럿팅하였으며, 3XFlag 에피토프 태그에 특이적인 항체를 이용하여 조사하였다. 세포골격 액틴에 특이적인 항체는 로딩 대조군으로서 사용하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, Cas9-표적화 지배적인 gRNA 각각과의 공동-형질감염은, 특히 형질감염 후 6 일 및 9 일째에 Cas9 단백질의 수준을 감소시켰다.
표 E-13.
VEGF
및 Cas9 돌연변이율
실시예 3: 다양한 길이의 스타필로코커스 아우레우스 gRNA의 활성 비교
본 연구에서, GFP를 안정적으로 발현하는 HEK-293T 세포를, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9를 발현하는 작제물과 함께 다양한 길이(15 내지 20 뉴클레오타이드)의 표적화 도메인을 지니는 gRNA 발현 작제물로 공동-형질감염시켰다. gRNA는 여러 가지 상이한 유전자를 표적화하였다: VEGF(22 종의 gRNA 전체), CCR5(15 종의 gRNA 전체) 및 GFP(10 종의 gRNA 전체). G 뉴클레오타이드로 개시된 모든 시험된 gRNA의 표적화 도메인, 및 gRNA 표적 부위의 전부는 NNGRRT PAM 서열과 회합하였다.
VEGF 및 CCR5 표적화 gRNA의 활성을 정량화하기 위하여, 전체 게놈 DNA를 형질감염 후 2 일 째에 세포로부터 분리하였고, VEGF 및 CCR5 gRNA 표적 부위를 포함하는 영역을 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 변성시키고 재어닐링시킨 다음, T7E1 뉴클레아제로 처리하였다. 돌연변이율(삽입-결실 빈도)을 문헌[Reyon, D. et al., FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)]에 기재된 바와 같은 모세관 전기이동 기기를 사용하여 측정하였다. GFP 표적화 gRNA의 활성을 정량화하기 위하여, 세포를 형질감염 후 3 일 째에 수확하였고, GFP-음성 세포(GFP 유전자의 돌연변이를 나타냄)의 백분율을 유세포분석기로 측정하였다. 모든 gRNA의 각각의 표적화 도메인 길이의 평균 활성을 계산하고 20 뉴클레오타이드 표적화 도메인을 가지는 gRNA의 평균 활성과 비교하였다. 표 E-14에 나타낸 바와 같이, 더 짧은 표적화 도메인을 지니는 gRNA는 20 뉴클레오타이드 표적화 도메인을 지니는 것보다 더 낮은 평균 활성을 가진다.
표 E-14. 20 뉴클레오타이드 표적화 도메인을 지니는 gRNA와 비교한, 다양한 길이의 표적화 도메인을 지니는 스타필로코커스 아우레우스 gRNA의 평균 활성
참고문헌의 포함
본 명세서에서 언금된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되어 있는 것처럼 전체가 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 충돌하는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하여, 본 출원이 우선할 것이다.
균등물
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 본 발명이 구체적 양태를 참조하여 개시되어 있지만, 본 발명의 다른 양태 및 변형이 본 발명의 진실한 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 고안될 수 있다. 첨부된 특허청구범위는 이러한 모든 양태 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
다른 구현예는 하기 특허청구범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING
<110> EDITAS MEDICINE,Inc.
THE BROAD INSTITUTE Inc.
THE UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION
MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY
<120> CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
<130> IPA160493-US-D1
<140> PCT/US2014/064663
<141> 2014-11-07
<150> US 61/901,215
<151> 2013-11-07
<160> 1510
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1344
<212> PRT
<213> Streptococcus mutans
<400> 1
Lys Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Val Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ala Lys Lys Met Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Lys Ser His Ile Glu Lys Asn Leu Leu Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Asn Thr Ala Glu Asp Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Arg Asn Arg Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Glu Glu Met Gly Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Asp Ser Phe Leu Val Thr Glu Asp Lys Arg Gly
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Leu Glu Glu Glu Val Lys Tyr His
115 120 125
Glu Asn Phe Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Gln Tyr Leu Ala Asp Asn
130 135 140
Pro Glu Lys Val Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His Ile
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Lys Phe Asp Thr Arg
165 170 175
Asn Asn Asp Val Gln Arg Leu Phe Gln Glu Phe Leu Ala Val Tyr Asp
180 185 190
Asn Thr Phe Glu Asn Ser Ser Leu Gln Glu Gln Asn Val Gln Val Glu
195 200 205
Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ile Ser Lys Ser Ala Lys Lys Asp Arg Val
210 215 220
Leu Lys Leu Phe Pro Asn Glu Lys Ser Asn Gly Arg Phe Ala Glu Phe
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Lys Lys His Phe Glu
245 250 255
Leu Glu Glu Lys Ala Pro Leu Gln Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Glu Glu
260 265 270
Glu Leu Glu Val Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Asn Tyr Ala Glu Leu
275 280 285
Phe Leu Ser Ala Lys Lys Leu Tyr Asp Ser Ile Leu Leu Ser Gly Ile
290 295 300
Leu Thr Val Thr Asp Val Gly Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Gln Arg Tyr Asn Glu His Gln Met Asp Leu Ala Gln Leu Lys Gln
325 330 335
Phe Ile Arg Gln Lys Leu Ser Asp Lys Tyr Asn Glu Val Phe Ser Asp
340 345 350
Val Ser Lys Asp Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Asn Gln
355 360 365
Glu Ala Phe Tyr Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Leu Asn Lys Ile Glu Gly
370 375 380
Ser Gly Tyr Phe Leu Asp Lys Ile Glu Arg Glu Asp Phe Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gln
405 410 415
Glu Met Arg Ala Ile Ile Arg Arg Gln Ala Glu Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Ala Asp Asn Gln Asp Arg Ile Glu Lys Leu Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Lys Ser Asp Phe Ala Trp Leu
450 455 460
Ser Arg Lys Ser Ala Asp Lys Ile Thr Pro Trp Asn Phe Asp Glu Ile
465 470 475 480
Val Asp Lys Glu Ser Ser Ala Glu Ala Phe Ile Asn Arg Met Thr Asn
485 490 495
Tyr Asp Leu Tyr Leu Pro Asn Gln Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
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Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
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Lys Thr Glu Gln Gly Lys Thr Ala Phe Phe Asp Ala Asn Met Lys Gln
530 535 540
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Lys Leu Met Asp Phe Leu Glu Lys Glu Phe Asp Glu Phe Arg Ile Val
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Asp Leu Thr Gly Leu Asp Lys Glu Asn Lys Val Phe Asn Ala Ser Tyr
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Gly Thr Tyr His Asp Leu Cys Lys Ile Leu Asp Lys Asp Phe Leu Asp
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Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
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Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Arg Lys Arg Leu Glu Asn Tyr Ser
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Ser Gln Tyr Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Ile Lys Asp
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Asn Ser Ile Asp Asn Arg Val Leu Thr Ser Ser Lys Glu Asn Arg Gly
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<212> PRT
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Lys Asn Ser Gly Ile Phe Ser Glu Phe
225 230 235 240
Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Arg Lys Cys Phe Asn
245 250 255
Leu Asp Glu Lys Ala Ser Leu His Phe Ser Lys Glu Ser Tyr Asp Glu
260 265 270
Asp Leu Glu Thr Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Asp Asp Tyr Ser Asp Val
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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980 985 990
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Gln Gly Ile Ser Ile Leu Asp Arg Ile Asn Tyr Arg Lys Asp Lys
1175 1180 1185
Leu Asn Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Leu Ile
1190 1195 1200
Ile Glu Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Ser Asp Gly Ser
1205 1210 1215
Arg Arg Met Leu Ala Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Lys Arg Gly
1220 1225 1230
Glu Ile His Lys Gly Asn Gln Ile Phe Leu Ser Gln Lys Phe Val
1235 1240 1245
Lys Leu Leu Tyr His Ala Lys Arg Ile Ser Asn Thr Ile Asn Glu
1250 1255 1260
Asn His Arg Lys Tyr Val Glu Asn His Lys Lys Glu Phe Glu Glu
1265 1270 1275
Leu Phe Tyr Tyr Ile Leu Glu Phe Asn Glu Asn Tyr Val Gly Ala
1280 1285 1290
Lys Lys Asn Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ala Phe Gln Ser Trp Gln
1295 1300 1305
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1310 1315 1320
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1340 1345 1350
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1355 1360 1365
Gln Ser Val Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ala Lys
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<211> 1333
<212> PRT
<213> Listeria innocua
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Ile Lys Tyr Arg Gly Asn Phe Leu Ile Glu Gly Ala Leu Asp Thr Gln
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Asp Asn Lys Asp Val Ala Lys Ile Leu Val Glu Lys Val Thr Arg Lys
210 215 220
Glu Lys Leu Glu Arg Ile Leu Lys Leu Tyr Pro Gly Glu Lys Ser Ala
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Gly Met Phe Ala Gln Phe Ile Ser Leu Ile Val Gly Ser Lys Gly Asn
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450 455 460
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<211> 96
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
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<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 5
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<212> PRT
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<400> 6
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500 505 510
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Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp
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1 5 10 15
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Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
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Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
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Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
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Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
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Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
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Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
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Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
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Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
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Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
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1070 1075 1080
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1355 1360 1365
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Val, Ile, Leu, Cys, Thr or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Trp, Phe, Val, Tyr, Ser or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ala, Ser, Cys, Val or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Val, Ile, Leu, Ala, Met or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Any amino acid or is absent
<400> 8
Asp Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile, Val, Met, Leu or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr, Ile, Val, Ser, Asn, Tyr, Glu or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asn, Ser, Gly, Ala, Asp, Thr, Arg, Met or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Val, Ile, Leu, Cys, Thr or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Trp, Phe, Val, Tyr, Ser or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Ala, Ser, Cys, Val or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Val, Ile, Leu, Ala, Met or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Any amino acid or is absent
<400> 9
Asp Xaa Gly Xaa Xaa Ser Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr, Ile, Val, Ser, Asn, Tyr, Glu or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Asn, Ser, Gly, Ala, Asp, Thr, Arg, Met or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Val, Ile, Leu, Ala, Met or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Any amino acid or is absent
<400> 10
Asp Ile Gly Xaa Xaa Ser Val Gly Trp Ala Xaa Xaa
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Any non-polar alkyl amino acid or a hydroxyl amino acid
<400> 11
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Xaa
1 5 10
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Val or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ile, Leu or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Met or Thr
<400> 12
Ile Xaa Xaa Glu Xaa Ala Arg Glu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ile, Leu or Val
<400> 13
Ile Val Xaa Glu Met Ala Arg Glu
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> His or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Arg or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu or Val
<400> 14
His His Ala Xaa Asp Ala Xaa Xaa
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
His His Ala His Asp Ala Tyr Leu
1 5
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Lys or Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Val, Leu, Ile or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Gly, Ala or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Leu, Ile, Val or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(26)
<223> Any amino acid and this region may encompass 5-20 residues
wherein some positions may be absent
<220>
<221> MOD_RES
<222> (29)..(29)
<223> Asp, Glu, Asn or Gln
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 16
Lys Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asp Xaa Tyr
20 25 30
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp, Glu, Gln or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu, Ile, Arg, Gln, Val, Met or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ile, Val, Thr, Ala or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val, Tyr, Ile, Leu, Phe or Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Ile, Leu, Phe or Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ser, Ala, Asp, Thr or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Phe, Leu, Val, Lys, Tyr, Met, Ile, Arg, Ala, Glu, Asp or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Leu, Arg, Thr, Ile, Val, Ser, Cys, Tyr, Lys, Phe or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Lys, Gln, Tyr, Thr, Phe, Leu, Trp, Met, Ala, Glu, Gly or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Asp, Ser, Asn, Arg, Leu or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Asp, Asn or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Ser, Ala, Thr, Gly or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Ile, Leu, Phe, Ser, Arg, Tyr, Gln, Trp, Asp, Lys or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Asp, Ser, Ile, Asn, Glu, Ala, His, Phe, Leu, Gln, Met,
Gly, Tyr or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Lys, Leu, Arg, Met, Thr or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Val, Leu, Ile, Ala or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Leu, Ile, Val or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Thr, Val, Cys, Glu, Ser or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Arg, Phe, Thr, Trp, Glu, Leu, Asn, Cys, Lys, Val, Ser,
Gln, Ile, Tyr, His or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Ser, Pro, Arg, Lys, Asn, Ala, His, Gln, Gly or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Asp, Gly, Thr, Asn, Ser, Lys, Ala, Ile, Glu, Leu, Gln,
Arg or Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Lys, Val, Ala, Glu, Tyr, Ile, Cys, Leu, Ser, Thr, Gly,
Lys, Met, Asp or Phe
<400> 17
Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn
20 25
<210> 18
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Leu, Ile, Arg, Gln, Val, Met or Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ile, Val, Thr, Ala or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val, Tyr, Ile, Leu, Phe or Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Ile, Leu, Phe or Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Phe, Leu, Val, Lys, Tyr, Met, Ile, Arg, Ala, Glu, Asp or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Leu, Arg, Thr, Ile, Val, Ser, Cys, Tyr, Lys, Phe or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Lys, Gln, Tyr, Thr, Phe, Leu, Trp, Met, Ala, Glu, Gly or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Ile, Leu, Phe, Ser, Arg, Tyr, Gln, Trp, Asp, Lys or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Asp, Ser, Ile, Asn, Glu, Ala, His, Phe, Leu, Gln, Met, Gly,
Tyr or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Thr, Val, Cys, Glu, Ser or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Arg, Phe, Thr, Trp, Glu, Leu, Asn, Cys, Lys, Val, Ser, Gln,
Ile, Tyr, His or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Ser, Pro, Arg, Lys, Asn, Ala, His, Gln, Gly or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Asp, Gly, Thr, Asn, Ser, Lys, Ala, Ile, Glu, Leu, Gln, Arg
or Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Lys, Val, Ala, Glu, Tyr, Ile, Cys, Leu, Ser, Thr, Gly, Lys,
Met, Asp or Phe
<400> 18
Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Pro Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asp Asp Ser Xaa
1 5 10 15
Xaa Asn Lys Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn
20 25
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asp or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Asp or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Gln, His, Arg, Lys, Tyr, Ile, Leu or Trp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Phe, Leu, Val, Lys, Tyr, Met, Ile, Arg, Ala, Glu, Asp or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Leu, Arg, Thr, Ile, Val, Ser, Cys, Tyr, Lys, Phe or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Lys, Gln, Tyr, Thr, Phe, Leu, Trp, Met, Ala, Glu, Gly or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Ile, Leu, Phe, Ser, Arg, Tyr, Gln, Trp, Asp, Lys or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Asp, Ser, Ile, Asn, Glu, Ala, His, Phe, Leu, Gln, Met, Gly, Tyr
or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Arg, Phe, Thr, Trp, Glu, Leu, Asn, Cys, Lys, Val, Ser, Gln, Ile,
Tyr, His or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (24)..(24)
<223> Ser, Pro, Arg, Lys, Asn, Ala, His, Gln, Gly or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Asp, Gly, Thr, Asn, Ser, Lys, Ala, Ile, Glu, Leu, Gln, Arg
or Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Lys, Val, Ala, Glu, Tyr, Ile, Cys, Leu, Ser, Thr, Gly, Lys,
Met, Asp or Phe
<400> 19
Xaa Val Xaa His Ile Val Pro Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asp Asp Ser Xaa
1 5 10 15
Xaa Asn Lys Val Leu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Asn
20 25
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Ile or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ile or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Ala or Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Lys or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Asp or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Arg, Lys or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Thr or Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Ser or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(25)
<223> Lys, Asp or Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> Glu, Lys, Gly or Asn
<400> 20
Asp Xaa Asp His Ile Xaa Pro Gln Xaa Phe Xaa Xaa Asp Xaa Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Xaa Val Leu Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Asn
20 25
<210> 21
<211> 73
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Lys or Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Val or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Gly or Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Glu, Gln or Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Glu or Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Asp, Asn or His
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Tyr, Arg or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Gln, Asp or Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (25)..(64)
<223> Any amino acid and this region may encompass 15-40 residues
wherein some positions may be absent
<220>
<221> MOD_RES
<222> (67)..(67)
<223> Gly or Glu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (69)..(69)
<223> Ser or Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (71)..(71)
<223> Asp or Asn
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 21
Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Xaa Asp Met Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
1 5 10 15
Asp Ile Xaa Xaa Leu Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
50 55 60
Asn Arg Xaa Lys Xaa Asp Xaa Val Pro
65 70
<210> 22
<211> 4107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
atggataaaa agtacagcat cgggctggac atcggtacaa actcagtggg gtgggccgtg 60
attacggacg agtacaaggt accctccaaa aaatttaaag tgctgggtaa cacggacaga 120
cactctataa agaaaaatct tattggagcc ttgctgttcg actcaggcga gacagccgaa 180
gccacaaggt tgaagcggac cgccaggagg cggtatacca ggagaaagaa ccgcatatgc 240
tacctgcaag aaatcttcag taacgagatg gcaaaggttg acgatagctt tttccatcgc 300
ctggaagaat cctttcttgt tgaggaagac aagaagcacg aacggcaccc catctttggc 360
aatattgtcg acgaagtggc atatcacgaa aagtacccga ctatctacca cctcaggaag 420
aagctggtgg actctaccga taaggcggac ctcagactta tttatttggc actcgcccac 480
atgattaaat ttagaggaca tttcttgatc gagggcgacc tgaacccgga caacagtgac 540
gtcgataagc tgttcatcca acttgtgcag acctacaatc aactgttcga agaaaaccct 600
ataaatgctt caggagtcga cgctaaagca atcctgtccg cgcgcctctc aaaatctaga 660
agacttgaga atctgattgc tcagttgccc ggggaaaaga aaaatggatt gtttggcaac 720
ctgatcgccc tcagtctcgg actgacccca aatttcaaaa gtaacttcga cctggccgaa 780
gacgctaagc tccagctgtc caaggacaca tacgatgacg acctcgacaa tctgctggcc 840
cagattgggg atcagtacgc cgatctcttt ttggcagcaa agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgttgagcg atatcttgag agtgaacacc gaaattacta aagcacccct tagcgcatct 960
atgatcaagc ggtacgacga gcatcatcag gatctgaccc tgctgaaggc tcttgtgagg 1020
caacagctcc ccgaaaaata caaggaaatc ttctttgacc agagcaaaaa cggctacgct 1080
ggctatatag atggtggggc cagtcaggag gaattctata aattcatcaa gcccattctc 1140
gagaaaatgg acggcacaga ggagttgctg gtcaaactta acagggagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga cctttgacaa cgggtctatc ccccaccaga ttcatctggg cgaactgcac 1260
gcaatcctga ggaggcagga ggatttttat ccttttctta aagataaccg cgagaaaata 1320
gaaaagattc ttacattcag gatcccgtac tacgtgggac ctctcgcccg gggcaattca 1380
cggtttgcct ggatgacaag gaagtcagag gagactatta caccttggaa cttcgaagaa 1440
gtggtggaca agggtgcatc tgcccagtct ttcatcgagc ggatgacaaa ttttgacaag 1500
aacctcccta atgagaaggt gctgcccaaa cattctctgc tctacgagta ctttaccgtc 1560
tacaatgaac tgactaaagt caagtacgtc accgagggaa tgaggaagcc ggcattcctt 1620
agtggagaac agaagaaggc gattgtagac ctgttgttca agaccaacag gaaggtgact 1680
gtgaagcaac ttaaagaaga ctactttaag aagatcgaat gttttgacag tgtggaaatt 1740
tcaggggttg aagaccgctt caatgcgtca ttggggactt accatgatct tctcaagatc 1800
ataaaggaca aagacttcct ggacaacgaa gaaaatgagg atattctcga agacatcgtc 1860
ctcaccctga ccctgttcga agacagggaa atgatagaag agcgcttgaa aacctatgcc 1920
cacctcttcg acgataaagt tatgaagcag ctgaagcgca ggagatacac aggatgggga 1980
agattgtcaa ggaagctgat caatggaatt agggataaac agagtggcaa gaccatactg 2040
gatttcctca aatctgatgg cttcgccaat aggaacttca tgcaactgat tcacgatgac 2100
tctcttacct tcaaggagga cattcaaaag gctcaggtga gcgggcaggg agactccctt 2160
catgaacaca tcgcgaattt ggcaggttcc cccgctatta aaaagggcat ccttcaaact 2220
gtcaaggtgg tggatgaatt ggtcaaggta atgggcagac ataagccaga aaatattgtg 2280
atcgagatgg cccgcgaaaa ccagaccaca cagaagggcc agaaaaatag tagagagcgg 2340
atgaagagga tcgaggaggg catcaaagag ctgggatctc agattctcaa agaacacccc 2400
gtagaaaaca cacagctgca gaacgaaaaa ttgtacttgt actatctgca gaacggcaga 2460
gacatgtacg tcgaccaaga acttgatatt aatagactgt ccgactatga cgtagaccat 2520
atcgtgcccc agtccttcct gaaggacgac tccattgata acaaagtctt gacaagaagc 2580
gacaagaaca ggggtaaaag tgataatgtg cctagcgagg aggtggtgaa aaaaatgaag 2640
aactactggc gacagctgct taatgcaaag ctcattacac aacggaagtt cgataatctg 2700
acgaaagcag agagaggtgg cttgtctgag ttggacaagg cagggtttat taagcggcag 2760
ctggtggaaa ctaggcagat cacaaagcac gtggcgcaga ttttggacag ccggatgaac 2820
acaaaatacg acgaaaatga taaactgata cgagaggtca aagttatcac gctgaaaagc 2880
aagctggtgt ccgattttcg gaaagacttc cagttctaca aagttcgcga gattaataac 2940
taccatcatg ctcacgatgc gtacctgaac gctgttgtcg ggaccgcctt gataaagaag 3000
tacccaaagc tggaatccga gttcgtatac ggggattaca aagtgtacga tgtgaggaaa 3060
atgatagcca agtccgagca ggagattgga aaggccacag ctaagtactt cttttattct 3120
aacatcatga atttttttaa gacggaaatt accctggcca acggagagat cagaaagcgg 3180
ccccttatag agacaaatgg tgaaacaggt gaaatcgtct gggataaggg cagggatttc 3240
gctactgtga ggaaggtgct gagtatgcca caggtaaata tcgtgaaaaa aaccgaagta 3300
cagaccggag gattttccaa ggaaagcatt ttgcctaaaa gaaactcaga caagctcatc 3360
gcccgcaaga aagattggga ccctaagaaa tacgggggat ttgactcacc caccgtagcc 3420
tattctgtgc tggtggtagc taaggtggaa aaaggaaagt ctaagaagct gaagtccgtg 3480
aaggaactct tgggaatcac tatcatggaa agatcatcct ttgaaaagaa ccctatcgat 3540
ttcctggagg ctaagggtta caaggaggtc aagaaagacc tcatcattaa actgccaaaa 3600
tactctctct tcgagctgga aaatggcagg aagagaatgt tggccagcgc cggagagctg 3660
caaaagggaa acgagcttgc tctgccctcc aaatatgtta attttctcta tctcgcttcc 3720
cactatgaaa agctgaaagg gtctcccgaa gataacgagc agaagcagct gttcgtcgaa 3780
cagcacaagc actatctgga tgaaataatc gaacaaataa gcgagttcag caaaagggtt 3840
atcctggcgg atgctaattt ggacaaagta ctgtctgctt ataacaagca ccgggataag 3900
cctattaggg aacaagccga gaatataatt cacctcttta cactcacgaa tctcggagcc 3960
cccgccgcct tcaaatactt tgatacgact atcgaccgga aacggtatac cagtaccaaa 4020
gaggtcctcg atgccaccct catccaccag tcaattactg gcctgtacga aacacggatc 4080
gacctctctc aactgggcgg cgactag 4107
<210> 23
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 23
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
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Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 24
<211> 3249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 24
atggccgcct tcaagcccaa ccccatcaac tacatcctgg gcctggacat cggcatcgcc 60
agcgtgggct gggccatggt ggagatcgac gaggacgaga accccatctg cctgatcgac 120
ctgggtgtgc gcgtgttcga gcgcgctgag gtgcccaaga ctggtgacag tctggctatg 180
gctcgccggc ttgctcgctc tgttcggcgc cttactcgcc ggcgcgctca ccgccttctg 240
cgcgctcgcc gcctgctgaa gcgcgagggt gtgctgcagg ctgccgactt cgacgagaac 300
ggcctgatca agagcctgcc caacactcct tggcagctgc gcgctgccgc tctggaccgc 360
aagctgactc ctctggagtg gagcgccgtg ctgctgcacc tgatcaagca ccgcggctac 420
ctgagccagc gcaagaacga gggcgagacc gccgacaagg agctgggtgc tctgctgaag 480
ggcgtggccg acaacgccca cgccctgcag actggtgact tccgcactcc tgctgagctg 540
gccctgaaca agttcgagaa ggagagcggc cacatccgca accagcgcgg cgactacagc 600
cacaccttca gccgcaagga cctgcaggcc gagctgatcc tgctgttcga gaagcagaag 660
gagttcggca acccccacgt gagcggcggc ctgaaggagg gcatcgagac cctgctgatg 720
acccagcgcc ccgccctgag cggcgacgcc gtgcagaaga tgctgggcca ctgcaccttc 780
gagccagccg agcccaaggc cgccaagaac acctacaccg ccgagcgctt catctggctg 840
accaagctga acaacctgcg catcctggag cagggcagcg agcgccccct gaccgacacc 900
gagcgcgcca ccctgatgga cgagccctac cgcaagagca agctgaccta cgcccaggcc 960
cgcaagctgc tgggtctgga ggacaccgcc ttcttcaagg gcctgcgcta cggcaaggac 1020
aacgccgagg ccagcaccct gatggagatg aaggcctacc acgccatcag ccgcgccctg 1080
gagaaggagg gcctgaagga caagaagagt cctctgaacc tgagccccga gctgcaggac 1140
gagatcggca ccgccttcag cctgttcaag accgacgagg acatcaccgg ccgcctgaag 1200
gaccgcatcc agcccgagat cctggaggcc ctgctgaagc acatcagctt cgacaagttc 1260
gtgcagatca gcctgaaggc cctgcgccgc atcgtgcccc tgatggagca gggcaagcgc 1320
tacgacgagg cctgcgccga gatctacggc gaccactacg gcaagaagaa caccgaggag 1380
aagatctacc tgcctcctat ccccgccgac gagatccgca accccgtggt gctgcgcgcc 1440
ctgagccagg cccgcaaggt gatcaacggc gtggtgcgcc gctacggcag ccccgcccgc 1500
atccacatcg agaccgcccg cgaggtgggc aagagcttca aggaccgcaa ggagatcgag 1560
aagcgccagg aggagaaccg caaggaccgc gagaaggccg ccgccaagtt ccgcgagtac 1620
ttccccaact tcgtgggcga gcccaagagc aaggacatcc tgaagctgcg cctgtacgag 1680
cagcagcacg gcaagtgcct gtacagcggc aaggagatca acctgggccg cctgaacgag 1740
aagggctacg tggagatcga ccacgccctg cccttcagcc gcacctggga cgacagcttc 1800
aacaacaagg tgctggtgct gggcagcgag aaccagaaca agggcaacca gaccccctac 1860
gagtacttca acggcaagga caacagccgc gagtggcagg agttcaaggc ccgcgtggag 1920
accagccgct tcccccgcag caagaagcag cgcatcctgc tgcagaagtt cgacgaggac 1980
ggcttcaagg agcgcaacct gaacgacacc cgctacgtga accgcttcct gtgccagttc 2040
gtggccgacc gcatgcgcct gaccggcaag ggcaagaagc gcgtgttcgc cagcaacggc 2100
cagatcacca acctgctgcg cggcttctgg ggcctgcgca aggtgcgcgc cgagaacgac 2160
cgccaccacg ccctggacgc cgtggtggtg gcctgcagca ccgtggccat gcagcagaag 2220
atcacccgct tcgtgcgcta caaggagatg aacgccttcg acggtaaaac catcgacaag 2280
gagaccggcg aggtgctgca ccagaagacc cacttccccc agccctggga gttcttcgcc 2340
caggaggtga tgatccgcgt gttcggcaag cccgacggca agcccgagtt cgaggaggcc 2400
gacacccccg agaagctgcg caccctgctg gccgagaagc tgagcagccg ccctgaggcc 2460
gtgcacgagt acgtgactcc tctgttcgtg agccgcgccc ccaaccgcaa gatgagcggt 2520
cagggtcaca tggagaccgt gaagagcgcc aagcgcctgg acgagggcgt gagcgtgctg 2580
cgcgtgcccc tgacccagct gaagctgaag gacctggaga agatggtgaa ccgcgagcgc 2640
gagcccaagc tgtacgaggc cctgaaggcc cgcctggagg cccacaagga cgaccccgcc 2700
aaggccttcg ccgagccctt ctacaagtac gacaaggccg gcaaccgcac ccagcaggtg 2760
aaggccgtgc gcgtggagca ggtgcagaag accggcgtgt gggtgcgcaa ccacaacggc 2820
atcgccgaca acgccaccat ggtgcgcgtg gacgtgttcg agaagggcga caagtactac 2880
ctggtgccca tctacagctg gcaggtggcc aagggcatcc tgcccgaccg cgccgtggtg 2940
cagggcaagg acgaggagga ctggcagctg atcgacgaca gcttcaactt caagttcagc 3000
ctgcacccca acgacctggt ggaggtgatc accaagaagg cccgcatgtt cggctacttc 3060
gccagctgcc accgcggcac cggcaacatc aacatccgca tccacgacct ggaccacaag 3120
atcggcaaga acggcatcct ggagggcatc ggcgtgaaga ccgccctgag cttccagaag 3180
taccagatcg acgagctggg caaggagatc cgcccctgcc gcctgaagaa gcgccctcct 3240
gtgcgctaa 3249
<210> 25
<211> 1082
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 25
Met Ala Ala Phe Lys Pro Asn Pro Ile Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val Glu Ile Asp Glu Asp
20 25 30
Glu Asn Pro Ile Cys Leu Ile Asp Leu Gly Val Arg Val Phe Glu Arg
35 40 45
Ala Glu Val Pro Lys Thr Gly Asp Ser Leu Ala Met Ala Arg Arg Leu
50 55 60
Ala Arg Ser Val Arg Arg Leu Thr Arg Arg Arg Ala His Arg Leu Leu
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Leu Leu Lys Arg Glu Gly Val Leu Gln Ala Ala Asp
85 90 95
Phe Asp Glu Asn Gly Leu Ile Lys Ser Leu Pro Asn Thr Pro Trp Gln
100 105 110
Leu Arg Ala Ala Ala Leu Asp Arg Lys Leu Thr Pro Leu Glu Trp Ser
115 120 125
Ala Val Leu Leu His Leu Ile Lys His Arg Gly Tyr Leu Ser Gln Arg
130 135 140
Lys Asn Glu Gly Glu Thr Ala Asp Lys Glu Leu Gly Ala Leu Leu Lys
145 150 155 160
Gly Val Ala Asp Asn Ala His Ala Leu Gln Thr Gly Asp Phe Arg Thr
165 170 175
Pro Ala Glu Leu Ala Leu Asn Lys Phe Glu Lys Glu Ser Gly His Ile
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Gly Asp Tyr Ser His Thr Phe Ser Arg Lys Asp Leu
195 200 205
Gln Ala Glu Leu Ile Leu Leu Phe Glu Lys Gln Lys Glu Phe Gly Asn
210 215 220
Pro His Val Ser Gly Gly Leu Lys Glu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Met
225 230 235 240
Thr Gln Arg Pro Ala Leu Ser Gly Asp Ala Val Gln Lys Met Leu Gly
245 250 255
His Cys Thr Phe Glu Pro Ala Glu Pro Lys Ala Ala Lys Asn Thr Tyr
260 265 270
Thr Ala Glu Arg Phe Ile Trp Leu Thr Lys Leu Asn Asn Leu Arg Ile
275 280 285
Leu Glu Gln Gly Ser Glu Arg Pro Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Thr
290 295 300
Leu Met Asp Glu Pro Tyr Arg Lys Ser Lys Leu Thr Tyr Ala Gln Ala
305 310 315 320
Arg Lys Leu Leu Gly Leu Glu Asp Thr Ala Phe Phe Lys Gly Leu Arg
325 330 335
Tyr Gly Lys Asp Asn Ala Glu Ala Ser Thr Leu Met Glu Met Lys Ala
340 345 350
Tyr His Ala Ile Ser Arg Ala Leu Glu Lys Glu Gly Leu Lys Asp Lys
355 360 365
Lys Ser Pro Leu Asn Leu Ser Pro Glu Leu Gln Asp Glu Ile Gly Thr
370 375 380
Ala Phe Ser Leu Phe Lys Thr Asp Glu Asp Ile Thr Gly Arg Leu Lys
385 390 395 400
Asp Arg Ile Gln Pro Glu Ile Leu Glu Ala Leu Leu Lys His Ile Ser
405 410 415
Phe Asp Lys Phe Val Gln Ile Ser Leu Lys Ala Leu Arg Arg Ile Val
420 425 430
Pro Leu Met Glu Gln Gly Lys Arg Tyr Asp Glu Ala Cys Ala Glu Ile
435 440 445
Tyr Gly Asp His Tyr Gly Lys Lys Asn Thr Glu Glu Lys Ile Tyr Leu
450 455 460
Pro Pro Ile Pro Ala Asp Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu Arg Ala
465 470 475 480
Leu Ser Gln Ala Arg Lys Val Ile Asn Gly Val Val Arg Arg Tyr Gly
485 490 495
Ser Pro Ala Arg Ile His Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly Lys Ser
500 505 510
Phe Lys Asp Arg Lys Glu Ile Glu Lys Arg Gln Glu Glu Asn Arg Lys
515 520 525
Asp Arg Glu Lys Ala Ala Ala Lys Phe Arg Glu Tyr Phe Pro Asn Phe
530 535 540
Val Gly Glu Pro Lys Ser Lys Asp Ile Leu Lys Leu Arg Leu Tyr Glu
545 550 555 560
Gln Gln His Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Gly Lys Glu Ile Asn Leu Gly
565 570 575
Arg Leu Asn Glu Lys Gly Tyr Val Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe
580 585 590
Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Gly
595 600 605
Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Asn Gln Thr Pro Tyr Glu Tyr Phe Asn
610 615 620
Gly Lys Asp Asn Ser Arg Glu Trp Gln Glu Phe Lys Ala Arg Val Glu
625 630 635 640
Thr Ser Arg Phe Pro Arg Ser Lys Lys Gln Arg Ile Leu Leu Gln Lys
645 650 655
Phe Asp Glu Asp Gly Phe Lys Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr
660 665 670
Val Asn Arg Phe Leu Cys Gln Phe Val Ala Asp Arg Met Arg Leu Thr
675 680 685
Gly Lys Gly Lys Lys Arg Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Asn
690 695 700
Leu Leu Arg Gly Phe Trp Gly Leu Arg Lys Val Arg Ala Glu Asn Asp
705 710 715 720
Arg His His Ala Leu Asp Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala
725 730 735
Met Gln Gln Lys Ile Thr Arg Phe Val Arg Tyr Lys Glu Met Asn Ala
740 745 750
Phe Asp Gly Lys Thr Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Val Leu His Gln
755 760 765
Lys Thr His Phe Pro Gln Pro Trp Glu Phe Phe Ala Gln Glu Val Met
770 775 780
Ile Arg Val Phe Gly Lys Pro Asp Gly Lys Pro Glu Phe Glu Glu Ala
785 790 795 800
Asp Thr Pro Glu Lys Leu Arg Thr Leu Leu Ala Glu Lys Leu Ser Ser
805 810 815
Arg Pro Glu Ala Val His Glu Tyr Val Thr Pro Leu Phe Val Ser Arg
820 825 830
Ala Pro Asn Arg Lys Met Ser Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys
835 840 845
Ser Ala Lys Arg Leu Asp Glu Gly Val Ser Val Leu Arg Val Pro Leu
850 855 860
Thr Gln Leu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Lys Met Val Asn Arg Glu Arg
865 870 875 880
Glu Pro Lys Leu Tyr Glu Ala Leu Lys Ala Arg Leu Glu Ala His Lys
885 890 895
Asp Asp Pro Ala Lys Ala Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Tyr Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Asn Arg Thr Gln Gln Val Lys Ala Val Arg Val Glu Gln Val
915 920 925
Gln Lys Thr Gly Val Trp Val Arg Asn His Asn Gly Ile Ala Asp Asn
930 935 940
Ala Thr Met Val Arg Val Asp Val Phe Glu Lys Gly Asp Lys Tyr Tyr
945 950 955 960
Leu Val Pro Ile Tyr Ser Trp Gln Val Ala Lys Gly Ile Leu Pro Asp
965 970 975
Arg Ala Val Val Gln Gly Lys Asp Glu Glu Asp Trp Gln Leu Ile Asp
980 985 990
Asp Ser Phe Asn Phe Lys Phe Ser Leu His Pro Asn Asp Leu Val Glu
995 1000 1005
Val Ile Thr Lys Lys Ala Arg Met Phe Gly Tyr Phe Ala Ser Cys
1010 1015 1020
His Arg Gly Thr Gly Asn Ile Asn Ile Arg Ile His Asp Leu Asp
1025 1030 1035
His Lys Ile Gly Lys Asn Gly Ile Leu Glu Gly Ile Gly Val Lys
1040 1045 1050
Thr Ala Leu Ser Phe Gln Lys Tyr Gln Ile Asp Glu Leu Gly Lys
1055 1060 1065
Glu Ile Arg Pro Cys Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Val Arg
1070 1075 1080
<210> 26
<211> 1053
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 26
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val
915 920 925
Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser
930 935 940
Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala
945 950 955 960
Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly
965 970 975
Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile
980 985 990
Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met
995 1000 1005
Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys
1010 1015 1020
Thr Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu
1025 1030 1035
Tyr Glu Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly
1040 1045 1050
<210> 27
<211> 104
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 27
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcugaaa agcauagcaa guuaaaauaa 60
ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugc 104
<210> 28
<211> 106
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 28
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau 60
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 106
<210> 29
<211> 116
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 29
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcauagc 60
aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 116
<210> 30
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 30
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guauuagagc uagaaauagc aaguuaauau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 31
<211> 96
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 31
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uagaaauagc aaguuuaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
<210> 32
<211> 116
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 32
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guauuagagc uaugcuguau uggaaacaau acagcauagc 60
aaguuaauau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 116
<210> 33
<211> 47
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 33
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcu 47
<210> 34
<211> 49
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 34
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cgguggugc 49
<210> 35
<211> 51
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 35
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcggau c 51
<210> 36
<211> 31
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 36
aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu g 31
<210> 37
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 37
aaggcuaguc cguuauca 18
<210> 38
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 38
aaggcuaguc cg 12
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
"DEAH" motif peptide
<400> 39
Asp Glu Ala His
1
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
"DEAD" motif peptide
<400> 40
Asp Glu Ala Asp
1
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(8)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(13)
<223> Any amino acid
<400> 41
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10
<210> 42
<211> 42
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 42
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 43
<211> 85
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 43
ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60
aguggcaccg agucggugcu uuuuu 85
<210> 44
<211> 62
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 44
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cg 62
<210> 45
<211> 102
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 45
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102
<210> 46
<211> 75
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 46
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcugaaa agcauagcaa guuaaaauaa 60
ggcuaguccg uuauc 75
<210> 47
<211> 87
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 47
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcauagc 60
aaguuaaaau aaggcuaguc cguuauc 87
<210> 48
<211> 42
<212> RNA
<213> Streptococcus thermophilus
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 48
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uguguuguuu cg 42
<210> 49
<211> 78
<212> RNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 49
gggcgaaaca acacagcgag uuaaaauaag gcuuaguccg uacucaacuu gaaaaggugg 60
caccgauucg guguuuuu 78
<210> 50
<211> 42
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 50
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 51
<211> 42
<212> RNA
<213> Streptococcus thermophilus
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 51
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uguguuguuu cg 42
<210> 52
<211> 85
<212> RNA
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 52
gaaccauuca aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa 60
guggcaccga gucggugcuu uuuuu 85
<210> 53
<211> 78
<212> RNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 53
gggcgaaaca acacagcgag uuaaaauaag gcuuaguccg uacucaacuu gaaaaggugg 60
caccgauucg guguuuuu 78
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 54
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Asp Val Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Asp Val Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Asp Met Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Asp Val Gly Thr Ser Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Asp Ile Gly Thr Ala Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Asp Val Gly Thr Gly Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Val
1 5 10
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 64
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Leu
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 65
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Val Val
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 66
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Ile
1 5 10
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 67
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Leu Val
1 5 10
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 68
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Cys Val Thr
1 5 10
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 69
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Tyr Ala Val Thr
1 5 10
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 70
Asp Met Gly Thr Gly Ser Leu Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 71
Asp Ile Gly Thr Ser Ser Val Gly Trp Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 72
Asp Leu Gly Thr Gly Ser Val Gly Trp Ala Val Val
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 73
Asp Leu Gly Val Gly Ser Val Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 74
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Ile Gly Trp Ala Ile Ile
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 75
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Asp Leu Gly Val Ala Ser Val Gly Trp Ser Ile Val
1 5 10
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Ile Leu
1 5 10
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 78
Asp Leu Gly Ile Ser Ser Val Gly Trp Ser Val Ile
1 5 10
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 79
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ser Val Ile
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Asp Val Gly Ile Gly Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Asp Leu Gly Val Gly Ser Ile Gly Phe Ala Ile Val
1 5 10
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Asp Ile Gly Tyr Ala Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Asp Thr Gly Thr Asn Ser Leu Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Cys Leu Leu
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Asp Ile Gly Thr Asp Ser Leu Gly Trp Ala Val Phe
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Asp Ile Gly Ser Asn Ser Ile Gly Phe Ala Val Val
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Asp Leu Gly Val Gly Ser Ile Gly Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Cys Gly Trp Gly Val Val
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 89
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Cys Leu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 90
Asp Ile Gly Ile Gly Ser Val Gly Val Gly Ile Leu
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<210> 91
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Tyr Gly Leu Ile
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Phe Gly Ile Ile
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 93
Asp Val Gly Ile Thr Ser Thr Gly Tyr Ala Val Leu
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<210> 94
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Asp Leu Gly Ile Thr Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Leu
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<210> 95
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 95
Asp Ile Gly Asn Ala Ser Val Gly Trp Ser Ala Phe
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<210> 96
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 96
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<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Asp Val Gly Glu Arg Ser Ile Gly Leu Ala Ala Val
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<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 99
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<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 100
Asp Val Gly Thr Phe Ser Val Gly Leu Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Asp Ile Gly Thr Gly Ser Val Gly Tyr Ala Cys Met
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 102
Asp Leu Gly Thr Thr Ser Ile Gly Phe Ala His Ile
1 5 10
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 103
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Ser Ser Val Arg
1 5 10
<210> 104
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 104
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 105
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 106
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 107
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 108
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 109
Asp Val Gly Thr Ser Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 110
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<210> 111
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 111
Asp Val Gly Thr Gly Ser Val Gly Trp Ala Val Thr
1 5 10
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 112
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Val
1 5 10
<210> 113
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 113
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile
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<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 114
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 115
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 115
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<210> 116
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 116
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<210> 117
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 117
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Ile
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 118
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Ala Leu Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 119
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Cys Val Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 121
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 122
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1 5 10
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 123
Asp Leu Gly Thr Gly Ser Val Gly Trp Ala Val Val
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<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 124
Asp Leu Gly Val Gly Ser Val Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 125
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Ile Gly Trp Ala Ile Ile
1 5 10
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 126
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Val Val
1 5 10
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Asp Leu Gly Val Ala Ser Val Gly Trp Ser Ile Val
1 5 10
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Ile Leu
1 5 10
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Val Leu
1 5 10
<210> 131
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 132
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Ile Ile
1 5 10
<210> 133
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Asp Val Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Leu
1 5 10
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 135
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ala Met Val
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Asp Ile Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Ser Val Ile
1 5 10
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Asp Leu Gly Ile Ser Ser Val Gly Trp Ser Val Ile
1 5 10
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Asp Val Gly Ile Gly Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Asp Leu Gly Ile Ser Ser Leu Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Asp Leu Gly Val Gly Ser Ile Gly Phe Ala Ile Val
1 5 10
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
Asp Ile Gly Tyr Ala Ser Ile Gly Trp Ala Val Ile
1 5 10
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Cys Leu Leu
1 5 10
<210> 144
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Trp Gly Leu Leu
1 5 10
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 145
Asp Thr Gly Thr Asn Ser Leu Gly Trp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 146
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 146
Asp Ile Gly Thr Asp Ser Leu Gly Trp Ala Val Phe
1 5 10
<210> 147
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 147
Asp Leu Gly Ser Thr Ser Leu Gly Trp Ala Ile Phe
1 5 10
<210> 148
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
Asp Ile Gly Ile Ser Ser Ile Gly Trp Ala Phe Ser
1 5 10
<210> 149
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 149
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Val Gly Trp Cys Leu Thr
1 5 10
<210> 150
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 150
Asp Leu Gly Ile Ala Ser Cys Gly Trp Gly Val Val
1 5 10
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 151
Asp Ile Gly Ser Asn Ser Ile Gly Phe Ala Val Val
1 5 10
<210> 152
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 152
Asp Ile Gly Thr Thr Ser Ile Gly Phe Ser Val Ile
1 5 10
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 153
Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Tyr Gly Leu Ile
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 154
Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Phe Gly Ile Ile
1 5 10
<210> 155
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 155
Asp Leu Gly Thr Thr Ser Ile Gly Phe Ala His Ile
1 5 10
<210> 156
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 156
Asp Ile Gly Ile Gly Ser Val Gly Val Gly Ile Leu
1 5 10
<210> 157
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Asp Leu Gly Val Gly Ser Ile Gly Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Asp Val Gly Ile Thr Ser Thr Gly Tyr Ala Val Leu
1 5 10
<210> 159
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 159
Asp Leu Gly Ile Thr Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Leu
1 5 10
<210> 160
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Asp Ile Gly Thr Ser Ser Ile Gly Trp Trp Leu Tyr
1 5 10
<210> 161
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Asp Leu Gly Ser Asn Ser Leu Gly Trp Phe Val Thr
1 5 10
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Asp Leu Gly Ala Asn Ser Leu Gly Trp Phe Val Val
1 5 10
<210> 163
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 163
Asp Ile Gly Asn Ala Ser Val Gly Trp Ser Ala Phe
1 5 10
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Asp Val Gly Thr Asn Ser Cys Gly Trp Val Ala Met
1 5 10
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 165
Asp Val Gly Glu Arg Ser Ile Gly Leu Ala Ala Val
1 5 10
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 166
Asp Val Gly Leu Asn Ser Val Gly Leu Ala Ala Val
1 5 10
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 167
Asp Val Gly Leu Met Ser Val Gly Leu Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Asp Val Gly Thr Phe Ser Val Gly Leu Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 169
Asp Ile Gly Thr Gly Ser Val Gly Tyr Ala Cys Met
1 5 10
<210> 170
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Asp Leu Gly Thr Asn Ser Ile Gly Ser Ser Val Arg
1 5 10
<210> 171
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 171
Asp Ile Gly Leu Arg Ile Gly Ile Thr Ser Cys Gly Trp Ser Ile
1 5 10 15
<210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Asp Met Gly Ala Lys Tyr Thr Gly Val Phe Tyr Ala
1 5 10
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 173
Asp Leu Gly Gly Lys Asn Thr Gly Phe Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 174
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Asp Leu Gly Val Lys Asn Thr Gly Val Phe Ser Ala
1 5 10
<210> 175
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Asp Leu Gly Ala Lys Phe Thr Gly Val Ala Leu Tyr
1 5 10
<210> 176
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Asp Leu Gly Gly Lys Phe Thr Gly Val Cys Leu Ser
1 5 10
<210> 177
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Asp Leu Gly Gly Thr Tyr Thr Gly Thr Phe Ile Thr
1 5 10
<210> 178
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 178
Tyr Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Leu Thr Lys Asp Asp Ser
1 5 10 15
Phe Asp Asn Leu Val Leu Cys Glu Arg Thr Ala Asn
20 25
<210> 179
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Lys Val Ile Lys Asp Asp Ser
1 5 10 15
Phe Asp Asn Leu Val Leu Val Leu Lys Asn Glu Asn
20 25
<210> 180
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Asp Arg Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Leu Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Asn
20 25
<210> 181
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Thr Asn Arg Val Leu Val Glu Lys Asp Ile Asn
20 25
<210> 182
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Asn Arg Val Leu Val Cys Ser Ser Cys Asn
20 25
<210> 183
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 183
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Thr Met Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asn Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Asn Tyr Asn
20 25
<210> 184
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 184
Asp Gln Asp His Ile Tyr Pro Lys Ser Lys Ile Tyr Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Glu Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Asn Leu Asn
20 25
<210> 185
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 185
Gln Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser Leu Val Lys Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Val Pro Ser Glu Asn
20 25
<210> 186
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 186
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Ile Lys Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Thr Ser Ser Lys Glu Asn
20 25
<210> 187
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 187
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Leu Lys Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Ser Ser Ala Ser Asn
20 25
<210> 188
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 188
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Tyr Thr Lys Asp Asn Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Ser Asn Ile Thr Asn
20 25
<210> 189
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 189
Asp Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Thr Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Leu Val Leu Thr Ser Ser Ala Gly Asn
20 25
<210> 190
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 190
Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn
20 25
<210> 191
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 191
Asn Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Met Val Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Gln Ser Glu Ile Asn
20 25
<210> 192
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 192
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Gln Ser Leu Ile Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Asn Ala Thr Ile Asn
20 25
<210> 193
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 193
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Glu Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Ala Val Asn
20 25
<210> 194
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 194
Glu Val Asp His Ile Phe Pro Arg Ser Phe Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Ile Lys Lys Met Asn
20 25
<210> 195
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 195
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Tyr Ile Lys Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Glu Asn Lys Val Leu Val Tyr Arg Glu Glu Asn
20 25
<210> 196
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 196
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Val Thr Gln Asn Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Ala Arg Ala Glu Asn
20 25
<210> 197
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 197
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Lys Leu Leu Val Leu Ala Glu Ser Asn
20 25
<210> 198
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 198
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Leu Cys Phe Asp Asp Ser Ser
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Val His Lys Gln Ser Asn
20 25
<210> 199
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 199
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Arg Ser Met Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Leu Val Leu Ser Gly Glu Asn
20 25
<210> 200
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 200
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Lys Ser Met Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Cys Leu Ala Glu Glu Asn
20 25
<210> 201
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 201
Glu Ile Asp His Ile Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Met Asn Lys Val Leu Val Phe Thr Lys Gln Asn
20 25
<210> 202
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 202
Gln Ile Asp His Ile Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Met Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Met Asn Lys Val Leu Val Leu Thr Asp Glu Asn
20 25
<210> 203
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 203
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Phe Ser Arg Ser Phe Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Asn Lys Ile Leu Val Leu Gly Ser Glu Asn
20 25
<210> 204
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 204
Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Gly Ser Glu Asn
20 25
<210> 205
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 205
Glu Ile Asp His Ala Leu Pro Phe Ser Arg Thr Trp Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Ala Ser Glu Asn
20 25
<210> 206
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 206
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Ile Ser Ile Ser Leu Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Ser Lys Ala Asn
20 25
<210> 207
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 207
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Ile Ser Ile Ser Leu Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Leu Val Thr His Arg Glu Asn
20 25
<210> 208
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 208
Gln Val Asp His Ala Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Tyr Asp Asp Ser Lys
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Thr His Glu Asn
20 25
<210> 209
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 209
Glu Val Asp His Ile Leu Pro Leu Ser Ile Thr Phe Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Val Tyr Ala Thr Ala Asn
20 25
<210> 210
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 210
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ala Arg
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Leu Val Tyr Arg Ser Glu Asn
20 25
<210> 211
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 211
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr
1 5 10 15
His Asn Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn
20 25
<210> 212
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 212
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Tyr Ser Ile Thr Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Arg Asn Lys Val Leu Val Thr Ser Gln Glu Asn
20 25
<210> 213
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 213
Glu Ile Asp His Ile Leu Pro Arg Ser Arg Ser Ala Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Cys Leu Ala Arg Ala Asn
20 25
<210> 214
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 214
Glu Ile Glu His Leu Leu Pro Phe Ser Leu Thr Leu Asp Asp Ser Met
1 5 10 15
Ala Asn Lys Thr Val Cys Phe Arg Gln Ala Asn
20 25
<210> 215
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 215
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Phe Ser Val Ser Leu Asp Asp Ser Ala
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Val Cys Leu Arg Glu Ala Asn
20 25
<210> 216
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 216
Asp Ile Asp His Leu Ile Pro Phe Ser Ile Ser Trp Asp Asp Ser Ala
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Val Cys Met Arg Tyr Ala Asn
20 25
<210> 217
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 217
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Val Ala Met Thr Leu Asp Asp Ser Pro
1 5 10 15
Ala Asn Lys Ile Ile Cys Met Arg Tyr Ala Asn
20 25
<210> 218
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 218
Asp Val Asp His Ile Leu Pro Tyr Ser Arg Thr Leu Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Pro Asn Arg Thr Leu Cys Leu Arg Glu Ala Asn
20 25
<210> 219
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 219
Glu Ile Glu His Ile Leu Pro Phe Ser Arg Thr Leu Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asn Asn Arg Thr Val Ala Met Arg Arg Ala Asn
20 25
<210> 220
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 220
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Ile Ser Trp Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Leu Thr Ser Ala Lys Cys Asn
20 25
<210> 221
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 221
Gln Val Asp His Ile Leu Pro Trp Ser Arg Phe Gly Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Lys Thr Leu Cys Thr Ala Arg Ser Asn
20 25
<210> 222
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 222
Gln Val Asp His Ile Leu Pro Phe Ser Lys Thr Leu Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Ala Gln His Asp Ala Asn
20 25
<210> 223
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 223
Gln Ile Asp His Ala Phe Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp Ser Gln
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Leu Cys Leu Thr Ser Ser Asn
20 25
<210> 224
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 224
Asp Ile Asp His Ile Val Pro Arg Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ile Val Asn Lys Leu Asp Asn
20 25
<210> 225
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 225
Glu Ile Glu His Ile Ile Pro Tyr Ser Met Ser Tyr Asp Asn Ser Gln
1 5 10 15
Ala Asn Lys Ile Leu Thr Glu Lys Ala Glu Asn
20 25
<210> 226
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 226
Glu Ile Asp His Val Ile Pro Tyr Ser Lys Ser Ala Asp Asp Ser Trp
1 5 10 15
Phe Asn Lys Leu Leu Val Lys Lys Ser Thr Asn
20 25
<210> 227
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 227
Glu Met Asp His Ile Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Asn Gly Trp
1 5 10 15
His Asn Arg Val Leu Val His Gly Lys Asp Asn
20 25
<210> 228
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 228
Glu Val Asp His Ile Val Pro Tyr Ser Leu Ile Leu Asp Asn Thr Ile
1 5 10 15
Asn Asn Lys Ala Leu Val Tyr Ala Glu Glu Asn
20 25
<210> 229
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 229
Glu Ile Glu His Val Ile Pro Gln Ser Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Ile Cys Glu Ala Glu Val Asn
20 25
<210> 230
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 230
Asp Ile Glu His Ile Ile Pro Gln Ala Arg Leu Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Thr Leu Glu Ala Arg Ser Val Asn
20 25
<210> 231
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 231
Glu Ile Glu His Ile Val Pro Lys Ala Arg Val Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Thr Leu Thr Phe His Arg Ile Asn
20 25
<210> 232
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 232
Asp Lys Asp His Ile Ile Pro Gln Ser Met Lys Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Val Leu Val Asn Lys Asn Ala Asn
20 25
<210> 233
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 233
Glu Val Glu His Ile Trp Pro Arg Ser Arg Ser Phe Asp Asn Ser Pro
1 5 10 15
Arg Asn Lys Thr Leu Cys Arg Lys Asp Val Asn
20 25
<210> 234
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 234
Ile Val Asn His Ile Ile Pro Tyr Asn Arg Ser Phe Asp Asp Thr Tyr
1 5 10 15
His Asn Arg Val Leu Thr Leu Thr Glu Thr Lys
20 25
<210> 235
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 235
Asp Met Glu His Thr Ile Pro Lys Ser Ile Ser Phe Asp Asn Ser Asp
1 5 10 15
Gln Asn Leu Thr Leu Cys Glu Ser Tyr Tyr Asn
20 25
<210> 236
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 236
Asp Ile Glu His Thr Ile Pro Arg Ser Ala Gly Gly Asp Ser Thr Lys
1 5 10 15
Met Asn Leu Thr Leu Cys Ser Ser Arg Phe Asn
20 25
<210> 237
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 237
Asp Ile Glu His Thr Ile Pro Arg Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Gln
1 5 10 15
Met Asn Lys Thr Leu Cys Ser Leu Lys Phe Asn
20 25
<210> 238
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 238
Asp Ile Asp His Val Ile Pro Leu Ala Arg Gly Gly Arg Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Met Val Leu Cys Gln Ser Asp Ala Asn
20 25
<210> 239
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 239
Asp Ile Glu His Leu Phe Pro Ile Ala Glu Ser Glu Asp Asn Gly Arg
1 5 10 15
Asn Asn Leu Val Ile Ser His Ser Ala Cys Asn
20 25
<210> 240
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 240
Asp Val Asp His Ile Phe Pro Arg Asp Asp Thr Ala Asp Asn Ser Tyr
1 5 10 15
Gly Asn Lys Val Val Ala His Arg Gln Cys Asn
20 25
<210> 241
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 241
Asp Ile Glu His Ile Val Pro Gln Ser Leu Gly Gly Leu Ser Thr Asp
1 5 10 15
Tyr Asn Thr Ile Val Thr Leu Lys Ser Val Asn
20 25
<210> 242
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 242
Glu Leu Asp His Ile Val Pro Arg Thr Asp Gly Gly Ser Asn Arg His
1 5 10 15
Glu Asn Leu Ala Ile Thr Cys Gly Ala Cys Asn
20 25
<210> 243
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 243
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Lys Gly Val Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Thr Asn Phe Ala Ala Val Cys Ala Glu Cys Asn
20 25
<210> 244
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 244
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Lys Gly Val Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Val Asn Leu Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Asn
20 25
<210> 245
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 245
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Ala Gly Gln Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Glu Asn Leu Val Ala Val Cys His Arg Cys Asn
20 25
<210> 246
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 246
Glu Ile Asp His Ile Leu Pro Arg Ser Leu Ile Lys Asp Ala Arg Gly
1 5 10 15
Ile Val Phe Asn Ala Glu Pro Asn Leu Ile Tyr Ala Ser Ser Arg Gly
20 25 30
Asn
<210> 247
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 247
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Leu Thr Gly Arg Thr Lys Lys
1 5 10 15
Thr Val Phe Asn Ser Glu Ala Asn Leu Ile Tyr Cys Ser Ser Lys Gly
20 25 30
Asn
<210> 248
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 248
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Leu Thr Leu Lys Lys Ser Glu
1 5 10 15
Ser Ile Tyr Asn Ser Glu Val Asn Leu Ile Phe Val Ser Ala Gln Gly
20 25 30
Asn
<210> 249
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 249
Glu Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Leu Ser Lys Lys His Phe Gly
1 5 10 15
Val Ile Phe Asn Ser Glu Val Asn Leu Ile Tyr Cys Ser Ser Gln Gly
20 25 30
Asn
<210> 250
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 250
Glu Ile Asp His Ile Leu Pro Arg Ser His Thr Leu Lys Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Val Phe Asn Pro Glu Gly Asn Leu Ile Tyr Val His Gln Lys Cys
20 25 30
Asn
<210> 251
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 251
Glu Leu Asp His Ile Ile Pro Arg Ser His Lys Lys Tyr Gly Thr Leu
1 5 10 15
Asn Asp Glu Ala Asn Leu Ile Cys Val Thr Arg Gly Asp Asn
20 25 30
<210> 252
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 252
Glu Leu Glu His Ile Val Pro His Ser Phe Arg Gln Ser Asn Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Leu Thr Trp Pro Gly Val Asn
20 25
<210> 253
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 253
Tyr Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Leu Thr Lys Asp Asp Ser
1 5 10 15
Phe Asp Asn Leu Val Leu Cys Glu Arg Thr Ala Asn
20 25
<210> 254
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 254
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Lys Val Ile Lys Asp Asp Ser
1 5 10 15
Phe Asp Asn Leu Val Leu Val Leu Lys Asn Glu Asn
20 25
<210> 255
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 255
Asp Arg Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Leu Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Asn
20 25
<210> 256
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 256
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Arg Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Thr Asn Arg Val Leu Val Glu Lys Asp Ile Asn
20 25
<210> 257
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 257
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Asn Arg Val Leu Val Cys Ser Ser Cys Asn
20 25
<210> 258
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 258
Asp Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Lys Thr Met Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asn Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Asn Tyr Asn
20 25
<210> 259
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 259
Asp Gln Asp His Ile Tyr Pro Lys Ser Lys Ile Tyr Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Glu Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Asn Leu Asn
20 25
<210> 260
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 260
Gln Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser Leu Val Lys Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Val Pro Ser Glu Asn
20 25
<210> 261
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 261
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Ile Lys Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Thr Ser Ser Lys Glu Asn
20 25
<210> 262
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 262
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Phe Leu Lys Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Ser Ser Ala Ser Asn
20 25
<210> 263
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 263
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Tyr Thr Lys Asp Asn Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Ser Asn Ile Thr Asn
20 25
<210> 264
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 264
Asp Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Thr Asp Asn Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Leu Val Leu Thr Ser Ser Ala Gly Asn
20 25
<210> 265
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 265
Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn
20 25
<210> 266
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 266
Asn Ile Asp His Ile Tyr Pro Gln Ser Met Val Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Gln Ser Glu Ile Asn
20 25
<210> 267
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 267
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Gln Ser Leu Ile Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Asn Ala Thr Ile Asn
20 25
<210> 268
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 268
Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Glu Asn Arg Val Leu Val Lys Lys Ala Val Asn
20 25
<210> 269
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 269
Glu Val Asp His Ile Phe Pro Arg Ser Phe Ile Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Lys Val Leu Val Ile Lys Lys Met Asn
20 25
<210> 270
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 270
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Tyr Ile Lys Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Glu Asn Lys Val Leu Val Tyr Arg Glu Glu Asn
20 25
<210> 271
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 271
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Gln Ala Val Thr Gln Asn Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Arg Val Leu Val Ala Arg Ala Glu Asn
20 25
<210> 272
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 272
Asp Ile Asp His Ile Val Pro Arg Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Leu Val Ile Val Asn Lys Leu Asp Asn
20 25
<210> 273
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 273
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asn Lys Leu Leu Val Leu Ala Glu Ser Asn
20 25
<210> 274
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 274
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Leu Cys Phe Asp Asp Ser Ser
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Val His Lys Gln Ser Asn
20 25
<210> 275
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 275
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Ile Ser Ile Ser Leu Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Ser Lys Ala Asn
20 25
<210> 276
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 276
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Ile Ser Ile Ser Leu Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Leu Val Thr His Arg Glu Asn
20 25
<210> 277
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 277
Glu Val Asp His Ile Leu Pro Leu Ser Ile Thr Phe Asp Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ala Asn Lys Val Leu Val Tyr Ala Thr Ala Asn
20 25
<210> 278
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 278
Glu Ile Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Ile Ser Phe Asp Asp Ala Arg
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Leu Val Tyr Arg Ser Glu Asn
20 25
<210> 279
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 279
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr
1 5 10 15
His Asn Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn
20 25
<210> 280
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 280
Glu Val Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Ile Ser Trp Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Lys Val Leu Thr Ser Ala Lys Cys Asn
20 25
<210> 281
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 281
Asp Ile Asp His Ile Ile Pro Tyr Ser Arg Ser Met Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Leu Val Leu Ser Gly Glu Asn
20 25
<210> 282
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 282
Glu Ile Glu His Ile Ile Pro Tyr Ser Met Ser Tyr Asp Asn Ser Gln
1 5 10 15
Ala Asn Lys Ile Leu Thr Glu Lys Ala Glu Asn
20 25
<210> 283
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 283
Glu Val Asp His Ile Val Pro Tyr Ser Leu Ile Leu Asp Asn Thr Ile
1 5 10 15
Asn Asn Lys Ala Leu Val Tyr Ala Glu Glu Asn
20 25
<210> 284
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 284
Glu Ile Asp His Val Ile Pro Tyr Ser Lys Ser Ala Asp Asp Ser Trp
1 5 10 15
Phe Asn Lys Leu Leu Val Lys Lys Ser Thr Asn
20 25
<210> 285
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 285
Glu Met Asp His Ile Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Asn Gly Trp
1 5 10 15
His Asn Arg Val Leu Val His Gly Lys Asp Asn
20 25
<210> 286
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 286
Glu Ile Glu His Val Ile Pro Gln Ser Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Val Ile Cys Glu Ala Glu Val Asn
20 25
<210> 287
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 287
Asp Ile Glu His Ile Ile Pro Gln Ala Arg Leu Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Thr Leu Glu Ala Arg Ser Val Asn
20 25
<210> 288
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 288
Glu Ile Glu His Ile Val Pro Lys Ala Arg Val Phe Asp Asp Ser Phe
1 5 10 15
Ser Asn Lys Thr Leu Thr Phe His Arg Ile Asn
20 25
<210> 289
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 289
Asp Lys Asp His Ile Ile Pro Gln Ser Met Lys Lys Asp Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Val Leu Val Asn Lys Asn Ala Asn
20 25
<210> 290
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 290
Gln Val Asp His Ile Leu Pro Trp Ser Arg Phe Gly Asp Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Lys Thr Leu Cys Thr Ala Arg Ser Asn
20 25
<210> 291
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 291
Asp Ile Asp His Val Ile Pro Leu Ala Arg Gly Gly Arg Asp Ser Leu
1 5 10 15
Asp Asn Met Val Leu Cys Gln Ser Asp Ala Asn
20 25
<210> 292
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 292
Asp Met Glu His Thr Ile Pro Lys Ser Ile Ser Phe Asp Asn Ser Asp
1 5 10 15
Gln Asn Leu Thr Leu Cys Glu Ser Tyr Tyr Asn
20 25
<210> 293
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 293
Asp Ile Glu His Thr Ile Pro Arg Ser Ala Gly Gly Asp Ser Thr Lys
1 5 10 15
Met Asn Leu Thr Leu Cys Ser Ser Arg Phe Asn
20 25
<210> 294
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 294
Asp Ile Glu His Thr Ile Pro Arg Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Gln
1 5 10 15
Met Asn Lys Thr Leu Cys Ser Leu Lys Phe Asn
20 25
<210> 295
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 295
Asp Ile Glu His Leu Phe Pro Ile Ala Glu Ser Glu Asp Asn Gly Arg
1 5 10 15
Asn Asn Leu Val Ile Ser His Ser Ala Cys Asn
20 25
<210> 296
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 296
Asp Val Asp His Ile Phe Pro Arg Asp Asp Thr Ala Asp Asn Ser Tyr
1 5 10 15
Gly Asn Lys Val Val Ala His Arg Gln Cys Asn
20 25
<210> 297
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 297
Asp Ile Glu His Ile Val Pro Gln Ser Leu Gly Gly Leu Ser Thr Asp
1 5 10 15
Tyr Asn Thr Ile Val Thr Leu Lys Ser Val Asn
20 25
<210> 298
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 298
Glu Leu Asp His Ile Val Pro Arg Thr Asp Gly Gly Ser Asn Arg His
1 5 10 15
Glu Asn Leu Ala Ile Thr Cys Gly Ala Cys Asn
20 25
<210> 299
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 299
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Lys Gly Val Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Thr Asn Phe Ala Ala Val Cys Ala Glu Cys Asn
20 25
<210> 300
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 300
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Lys Gly Val Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Val Asn Leu Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Asn
20 25
<210> 301
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 301
Glu Met Asp His Ile Val Pro Arg Ala Gly Gln Gly Ser Thr Asn Thr
1 5 10 15
Arg Glu Asn Leu Val Ala Val Cys His Arg Cys Asn
20 25
<210> 302
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 302
Glu Leu Glu His Ile Val Pro His Ser Phe Arg Gln Ser Asn Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ser Leu Val Leu Thr Trp Pro Gly Val Asn
20 25
<210> 303
<211> 3333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 303
atggtgccta agaagaagag aaaggtggct gccttcaaac ctaattcaat caactacatc 60
ctcggcctcg atatcggcat cgcatccgtc ggctgggcga tggtagaaat tgacgaagaa 120
gaaaacccca tccgcctgat tgatttgggc gtgcgcgtat ttgagcgtgc cgaagtaccg 180
aaaacaggcg actcccttgc catggcaagg cgtttggcgc gcagtgttcg ccgcctgacc 240
cgccgtcgcg cccaccgcct gcttcggacc cgccgcctat tgaaacgcga aggcgtatta 300
caagccgcca attttgacga aaacggcttg attaaatcct taccgaatac accatggcaa 360
cttcgcgcag ccgcattaga ccgcaaactg acgcctttag agtggtcggc agtcttgttg 420
catttaatca aacatcgcgg ctatttatcg caacggaaaa acgagggcga aactgccgat 480
aaggagcttg gcgctttgct taaaggcgta gccggcaatg cccatgcctt acagacaggc 540
gatttccgca caccggccga attggcttta aataaatttg agaaagaaag cggccatatc 600
cgcaatcagc gcagcgatta ttcgcatacg ttcagccgca aagatttaca ggcggagctg 660
attttgctgt ttgaaaaaca aaaagaattt ggcaatccgc atgtttcagg cggccttaaa 720
gaaggtattg aaaccctact gatgacgcaa cgccctgccc tgtccggcga tgccgttcaa 780
aaaatgttgg ggcattgcac cttcgaaccg gcagagccga aagccgctaa aaacacctac 840
acagccgaac gtttcatctg gctgaccaag ctgaacaacc tgcgtatttt agagcaaggc 900
agcgagcggc cattgaccga taccgaacgc gccacgctta tggacgagcc atacagaaaa 960
tccaaactga cttacgcaca agcccgtaag ctgctgggtt tagaagatac cgcctttttc 1020
aaaggcttgc gctatggtaa agacaatgcc gaagcctcaa cattgatgga aatgaaggcc 1080
taccatgcca tcagccgtgc actggaaaaa gaaggattga aagacaaaaa atccccatta 1140
aacctttctc ccgaattaca agacgaaatc ggcacggcat tctccctgtt caaaaccgat 1200
gaagacatta caggccgtct gaaagaccgt atacagcccg aaatcttaga agcgctgttg 1260
aaacacatca gcttcgataa gttcgtccaa atttccttga aagcattgcg ccgaattgtg 1320
cctctaatgg aacaaggcaa acgttacgat gaagcctgcg ccgaaatcta cggagaccat 1380
tacggcaaga agaatacgga agaaaagatt tatctgccgc cgattcccgc cgacgaaatc 1440
cgcaaccccg tcgtcttgcg cgccttatct caagcacgta aggtcattaa cggcgtggta 1500
cgccgttacg gctccccagc tcgtatccat attgaaactg caagggaagt aggtaaatcg 1560
tttaaagacc gcaaagaaat tgagaaacgc caagaagaaa accgcaaaga ccgggaaaaa 1620
gccgccgcca aattccgaga gtatttcccc aattttgtcg gagaacccaa atccaaagat 1680
attctgaaac tgcgcctgta cgagcaacaa cacggcaaat gcctgtattc gggcaaagaa 1740
atcaacttag gccgtctgaa cgaaaaaggc tatgtcgaaa tcgaccatgc cctgccgttc 1800
tcgcgcacat gggacgacag tttcaacaat aaagtactgg tattgggcag cgaaaaccaa 1860
aacaaaggca atcaaacccc ttacgaatac ttcaacggca aagacaacag ccgcgaatgg 1920
caggaattta aagcgcgtgt cgaaaccagc cgtttcccgc gcagtaaaaa acaacggatt 1980
ctgctgcaaa aattcgatga agacggcttt aaagaacgca atctgaacga cacgcgctac 2040
gtcaaccgtt tcctgtgtca atttgttgcc gaccgtatgc ggctgacagg taaaggcaag 2100
aaacgtgtct ttgcatccaa cggacaaatt accaatctgt tgcgcggctt ttggggattg 2160
cgcaaagtgc gtgcggaaaa cgaccgccat cacgccttgg acgccgtcgt cgttgcctgc 2220
tcgaccgttg ccatgcagca gaaaattacc cgttttgtac gctataaaga gatgaacgcg 2280
tttgacggta aaaccataga caaagaaaca ggagaagtgc tgcatcaaaa aacacacttc 2340
ccacaacctt gggaattttt cgcacaagaa gtcatgattc gcgtcttcgg caaaccggac 2400
ggcaaacccg aattcgaaga agccgatacc ctagaaaaac tgcgcacgtt gcttgccgaa 2460
aaattatcat ctcgccccga agccgtacac gaatacgtta cgccactgtt tgtttcacgc 2520
gcgcccaatc ggaagatgag cgggcaaggg catatggaga ccgtcaaatc cgccaaacga 2580
ctggacgaag gcgtcagcgt gttgcgcgta ccgctgacac agttaaaact gaaagacttg 2640
gaaaaaatgg tcaatcggga gcgcgaacct aagctatacg aagcactgaa agcacggctg 2700
gaagcacata aagacgatcc tgccaaagcc tttgccgagc cgttttacaa atacgataaa 2760
gcaggcaacc gcacccaaca ggtaaaagcc gtacgcgtag agcaagtaca gaaaaccggc 2820
gtatgggtgc gcaaccataa cggtattgcc gacaacgcaa ccatggtgcg cgtagatgtg 2880
tttgagaaag gcgacaagta ttatctggta ccgatttaca gttggcaggt agcgaaaggg 2940
attttgccgg atagggctgt tgtacaagga aaagatgaag aagattggca acttattgat 3000
gatagtttca actttaaatt ctcattacac cctaatgatt tagtcgaggt tataacaaaa 3060
aaagctagaa tgtttggtta ctttgccagc tgccatcgag gcacaggtaa tatcaatata 3120
cgcattcatg atcttgatca taaaattggc aaaaatggaa tactggaagg tatcggcgtc 3180
aaaaccgccc tttcattcca aaaataccaa attgacgaac tgggcaaaga aatcagacca 3240
tgccgtctga aaaaacgccc gcctgtccgt tacccatacg atgttccaga ttacgctgca 3300
gctccagcag cgaagaaaaa gaagctggat taa 3333
<210> 304
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 304
gcccuccuau ucgauag 17
<210> 305
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 305
gccugaaacg aaccgcu 17
<210> 306
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 306
gccacuaucg aauagga 17
<210> 307
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 307
gcacuaauuc cguugga 17
<210> 308
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 308
gaacggcacc ccaucuu 17
<210> 309
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 309
ggugcccucc uauucgauag 20
<210> 310
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 310
gcccauauga uaaaguuccg 20
<210> 311
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 311
gcccacggaa cuuuaucaua 20
<210> 312
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 312
uccgagcggu ucguuuc 17
<210> 313
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 313
aacgaaccgc ucggaga 17
<210> 314
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 314
cgccacuauc gaauagg 17
<210> 315
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 315
aucggcacua auuccgu 17
<210> 316
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 316
uuucgccacu aucgaau 17
<210> 317
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 317
auucgauagu ggcgaaa 17
<210> 318
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 318
uaguggcgaa acggcag 17
<210> 319
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 319
ccguuucgcc acuaucgaau 20
<210> 320
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 320
gacaucggca cuaauuccgu 20
<210> 321
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 321
cucgccugaa acgaaccgcu 20
<210> 322
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 322
uucuccgagc gguucguuuc 20
<210> 323
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 323
ugaaacgaac cgcucggaga 20
<210> 324
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 324
uuucgccacu aucgaauagg 20
<210> 325
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 325
ucggcacuaa uuccguugga 20
<210> 326
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 326
cgauaguggc gaaacggcag 20
<210> 327
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 327
uucgccacua ucgaauagga 20
<210> 328
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 328
acguguauac cuucuccgag 20
<210> 329
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 329
cggcacuaau uccguuggau 20
<210> 330
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 330
ccuauucgau aguggcgaaa 20
<210> 331
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 331
cccauaugau aaaguuccgu 20
<210> 332
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 332
gaaagaaucg ucaacuu 17
<210> 333
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 333
gagccaagua gauuaaccuc 20
<210> 334
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 334
gauaaaaagu auucuau 17
<210> 335
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 335
gauucuuuuu aaucgaauga 20
<210> 336
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 336
ggaaggacuc uuccaaa 17
<210> 337
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 337
ggaccugagg uuaaucuacu 20
<210> 338
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 338
gggcacuuuc ucauuga 17
<210> 339
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 339
gguuaugaca gcccauccaa 20
<210> 340
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 340
guccucuucg acaagga 17
<210> 341
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 341
guccuuccuu gucgaag 17
<210> 342
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 342
guuucuuguc cucuucgaca 20
<210> 343
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 343
aaacauagua gaugagg 17
<210> 344
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 344
aaagaaagaa ucgucaacuu 20
<210> 345
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 345
aaagaaauuu aaggugu 17
<210> 346
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 346
aacaccuuaa auuucuuuga 20
<210> 347
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 347
aagaaauuua agguguu 17
<210> 348
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 348
aagaggacaa gaaacaugaa 20
<210> 349
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 349
aauuuuuagc aaugaga 17
<210> 350
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 350
accuuaaauu ucuuuga 17
<210> 351
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 351
accuucaaag aaauuua 17
<210> 352
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 352
acggaacuuu aucauau 17
<210> 353
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 353
acuauguuuc caaagau 17
<210> 354
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 354
agaaauuuaa gguguug 17
<210> 355
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 355
agaaauuuuu agcaaugaga 20
<210> 356
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 356
agaguccuuc cuugucgaag 20
<210> 357
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 357
aggacaagaa acaugaa 17
<210> 358
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 358
agguacuuug uauucau 17
<210> 359
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 359
aguaccuuca aagaaauuua 20
<210> 360
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 360
agucaacuag cuuuuuucug 20
<210> 361
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 361
aguugacuca acugauaaag 20
<210> 362
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 362
auaugauaaa guuccgu 17
<210> 363
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 363
aucuacuaug uuuccaaaga 20
<210> 364
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 364
auggauaaaa aguauucuau 20
<210> 365
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 365
auuaaaaaga aucuuau 17
<210> 366
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 366
caaagaaauu uaagguguug 20
<210> 367
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 367
caacuagcuu uuuucug 17
<210> 368
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 368
caacugauaa agcggaccug 20
<210> 369
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 369
caaggaagga cucuuccaaa 20
<210> 370
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 370
caaugagaaa gugccca 17
<210> 371
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 371
cacggaacuu uaucaua 17
<210> 372
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 372
cacuaauucc guuggau 17
<210> 373
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 373
cauaugauaa aguuccg 17
<210> 374
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 374
caugaacggc accccaucuu 20
<210> 375
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 375
ccaaguagau uaaccuc 17
<210> 376
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 376
cccacggaac uuuaucauau 20
<210> 377
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 377
ccgugggcac uuucucauug 20
<210> 378
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 378
ccucaaugag aaagugccca 20
<210> 379
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 379
ccugagguua aucuacu 17
<210> 380
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 380
cgauucuuuc uuucaccguu 20
<210> 381
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 381
cgugggcacu uucucauuga 20
<210> 382
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 382
cuacuauguu uccaaagaug 20
<210> 383
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 383
cuauguuucc aaagaug 17
<210> 384
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 384
cugaggugau aaaucgu 17
<210> 385
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 385
cugauaaagc ggaccug 17
<210> 386
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 386
cuuguaagua acauauu 17
<210> 387
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 387
cuuguccucu ucgacaagga 20
<210> 388
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 388
cuuuggaaac auaguagaug 20
<210> 389
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 389
uacuauguuu ccaaaga 17
<210> 390
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 390
uaugacagcc cauccaa 17
<210> 391
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 391
uauucuauug guuuagacau 20
<210> 392
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 392
ucaaagaaau uuaagguguu 20
<210> 393
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 393
ucgauuaaaa agaaucuuau 20
<210> 394
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 394
ucuacuaugu uuccaaagau 20
<210> 395
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 395
ucuauugguu uagacau 17
<210> 396
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 396
ucuuguccuc uucgaca 17
<210> 397
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 397
ucuuuuuaau cgaauga 17
<210> 398
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 398
ugaagguacu uuguauucau 20
<210> 399
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 399
ugacucaacu gauaaag 17
<210> 400
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 400
ugaggugaua aaucguu 17
<210> 401
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 401
uggaaacaua guagaug 17
<210> 402
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 402
uggaaacaua guagaugagg 20
<210> 403
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 403
ugggcacuuu cucauug 17
<210> 404
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 404
uguauaccuu cuccgag 17
<210> 405
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 405
uucaaagaaa uuuaaggugu 20
<210> 406
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 406
uucugaggug auaaaucguu 20
<210> 407
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 407
uucuuucuuu caccguu 17
<210> 408
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 408
uuucugaggu gauaaaucgu 20
<210> 409
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 409
uuucuuguaa guaacauauu 20
<210> 410
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 410
gcgucgcuau acgggcu 17
<210> 411
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 411
ggcgucgcua uacgggc 17
<210> 412
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 412
ucgaaaaacg gguacgc 17
<210> 413
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 413
cgcucggaua agaaccg 17
<210> 414
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 414
cgucgcuaua cgggcug 17
<210> 415
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 415
gauaagcguc gugcgca 17
<210> 416
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 416
cggguaauug ugcgauc 17
<210> 417
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 417
gaucgcgaaa agcgaac 17
<210> 418
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 418
gcgacggcuu cgccaau 17
<210> 419
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 419
uaaccuuauc gucgaac 17
<210> 420
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 420
agcggauaac ggcgccu 17
<210> 421
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 421
aagaggcguc gcuauac 17
<210> 422
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 422
aagcgucgug cgcaugg 17
<210> 423
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 423
cggauguugg cuagcgc 17
<210> 424
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 424
cgaucucgac aaucuac 17
<210> 425
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 425
ucgacauccg aguuguc 17
<210> 426
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 426
gagugcgguc ccuacga 17
<210> 427
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 427
cgcggaaacu uaucaac 17
<210> 428
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 428
aucuuaaugc cgucgua 17
<210> 429
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 429
cucaaucguu caucgag 17
<210> 430
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 430
uccgccugcu cacguau 17
<210> 431
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 431
ucaccuguuc gacgaua 17
<210> 432
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 432
gcucaucgcu cguaaaa 17
<210> 433
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 433
gcucggauaa gaaccga 17
<210> 434
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 434
uaucuuaaug ccgucgu 17
<210> 435
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 435
cggcggagcg agucaag 17
<210> 436
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 436
ucgcggaaac uuaucaa 17
<210> 437
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 437
cgauuuaaug cgucacu 17
<210> 438
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 438
ucgcucguaa aaaggac 17
<210> 439
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 439
gacccgaaaa aguacgg 17
<210> 440
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 440
gccgucggga uuuagag 17
<210> 441
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 441
aaagaggcgu cgcuaua 17
<210> 442
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 442
cgcauaccuu acuaugu 17
<210> 443
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 443
cgaaccgaga guucccu 17
<210> 444
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 444
ggaacucucg guucgca 17
<210> 445
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 445
uggccgaaaa cggaugu 17
<210> 446
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 446
cgcgucuagc accuccu 17
<210> 447
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 447
ucaccgucgc gaagucc 17
<210> 448
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 448
uauuaaacgu cagcucg 17
<210> 449
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 449
cgcucguaaa aaggacu 17
<210> 450
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 450
uuccgccugc ucacgua 17
<210> 451
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 451
cuagugagag cgcuaua 17
<210> 452
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 452
cgucguaauc agauaaa 17
<210> 453
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 453
cugaucgcac aauuacc 17
<210> 454
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 454
ucgcauaccu uacuaug 17
<210> 455
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 455
cgccggagag cuucaaa 17
<210> 456
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 456
gcuggggacg auugucg 17
<210> 457
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 457
cgccucaagg aagucga 17
<210> 458
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 458
cuuauagcgc ucucacu 17
<210> 459
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 459
uucugucgag aucuccg 17
<210> 460
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 460
cauauugcga aucuugc 17
<210> 461
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 461
gggccgggac uucgcga 17
<210> 462
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 462
uaaacccaua cgugagc 17
<210> 463
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 463
uuuacgacuu ccucgcu 17
<210> 464
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 464
gcgcauacaa caagcac 17
<210> 465
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 465
gcagguuaua uugacgg 17
<210> 466
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 466
uuuucgcgau caucuua 17
<210> 467
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 467
ucguauggga uaagggc 17
<210> 468
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 468
auaaucccgu gauggau 17
<210> 469
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 469
acgauacacu ucuacca 17
<210> 470
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 470
caguugcuga cggacua 17
<210> 471
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 471
gaacgauaag cugauuc 17
<210> 472
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 472
ucuaaauccg gacaacu 17
<210> 473
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 473
cagcggacuu ucgacaa 17
<210> 474
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 474
caugggacgu cacaaac 17
<210> 475
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 475
cagguuuucu agccguc 17
<210> 476
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 476
ccgcuucaau gaucaaa 17
<210> 477
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 477
uagccaacau ccguuuu 17
<210> 478
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 478
ggaggauugc aucgcua 17
<210> 479
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 479
caugcaauuc gccuaag 17
<210> 480
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 480
aaguggcgug gaugcga 17
<210> 481
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 481
cguaugggau aagggcc 17
<210> 482
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 482
gacaggugaa aucguau 17
<210> 483
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 483
gaaccgagag uucccuc 17
<210> 484
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 484
aaaucgaucu ucuaccc 17
<210> 485
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 485
aaugggacgc uaaauac 17
<210> 486
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 486
uaaagugcuu acacgcu 17
<210> 487
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 487
uacgcagguu auauuga 17
<210> 488
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 488
auucugucga gaucucc 17
<210> 489
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 489
gauucugucg agaucuc 17
<210> 490
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 490
gccucucuaa aucccga 17
<210> 491
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 491
ugcaucgcua agguuuu 17
<210> 492
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 492
gcaguugcug acggacu 17
<210> 493
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 493
cgggauuaua ugaaacu 17
<210> 494
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 494
acccauacgu gagcagg 17
<210> 495
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 495
agggguccca cauagua 17
<210> 496
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 496
agccaccgua cuuuuuc 17
<210> 497
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 497
auuggggaua acgauua 17
<210> 498
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 498
ugacaauguu ccaagcg 17
<210> 499
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 499
ggugucggac uucagaa 17
<210> 500
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 500
ucuccgcuua gaaaggc 17
<210> 501
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 501
uguaaccuuu cgccuca 17
<210> 502
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 502
acagguuucc ggacaag 17
<210> 503
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 503
ugggacccga aaaagua 17
<210> 504
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 504
uucauauaau cccguga 17
<210> 505
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 505
cacagguuuc cggacaa 17
<210> 506
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 506
auaguaaggu augcgaa 17
<210> 507
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 507
aacugucacu uugcggu 17
<210> 508
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 508
uuacuaugug ggacccc 17
<210> 509
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 509
augcggcugg agcgccg 17
<210> 510
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 510
uaagacggaa aucacuc 17
<210> 511
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 511
cgccacuugc auuuaua 17
<210> 512
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 512
ccccaucgac uuccuug 17
<210> 513
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 513
gccucaagga agucgau 17
<210> 514
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 514
uugaucaguc gaaaaac 17
<210> 515
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 515
ucgggauuua gagaggc 17
<210> 516
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 516
caaugagucc ccuuguc 17
<210> 517
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 517
ucagguuuuc uagccgu 17
<210> 518
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 518
gaccggaggg uuuucaa 17
<210> 519
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 519
aagccaccgu acuuuuu 17
<210> 520
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 520
cuguucuccg cuuagaa 17
<210> 521
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 521
aucauugaag cggauaa 17
<210> 522
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 522
uucgccagcc aucaaaa 17
<210> 523
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 523
gccggagagc uucaaaa 17
<210> 524
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 524
agaacgauaa gcugauu 17
<210> 525
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 525
gcacagguuu ccggaca 17
<210> 526
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 526
ucgccagcca ucaaaaa 17
<210> 527
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 527
aagguaugcg aaagguu 17
<210> 528
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 528
ggcaauacuu uuucguu 17
<210> 529
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 529
gaggaaguug ucgauaa 17
<210> 530
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 530
cugacguuua auaaauc 17
<210> 531
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 531
aaacccgccu uucuaag 17
<210> 532
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 532
uauaaaugca aguggcg 17
<210> 533
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 533
ccacuacuuu gacuguc 17
<210> 534
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 534
gagaguuccc ucgggcc 17
<210> 535
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 535
uauagguuug uacuaac 17
<210> 536
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 536
cauuacgaga aguugaa 17
<210> 537
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 537
guauguugau caggaac 17
<210> 538
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 538
cguauuucgu auucauu 17
<210> 539
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 539
ugagggugau cuaaauc 17
<210> 540
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 540
ccucaaggaa gucgaug 17
<210> 541
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 541
gaaaucguau gggauaa 17
<210> 542
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 542
uggaguaauc guuucuu 17
<210> 543
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 543
ugcuauacuu agaaggc 17
<210> 544
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 544
ccggagagcu ucaaaag 17
<210> 545
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 545
agacagguga aaucgua 17
<210> 546
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 546
gagcuaguua aggucau 17
<210> 547
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 547
gaguucccuc gggccag 17
<210> 548
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 548
cuuucaacuu cucguaa 17
<210> 549
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 549
agaguucccu cgggcca 17
<210> 550
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 550
agaucgggaa augauug 17
<210> 551
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 551
ugaggcgaaa gguuaca 17
<210> 552
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 552
uggcccgagg gaacucu 17
<210> 553
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 553
guuucucguu cugcaau 17
<210> 554
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 554
acgccacuug cauuuau 17
<210> 555
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 555
cacuacuagg acagaau 17
<210> 556
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 556
aucuacugcg aaagcag 17
<210> 557
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 557
gucgggauuu agagagg 17
<210> 558
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 558
ccuagcugau gccaauc 17
<210> 559
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 559
uucuccgcuu agaaagg 17
<210> 560
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 560
acugaggugc agaccgg 17
<210> 561
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 561
ugcaugcuau acuuaga 17
<210> 562
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 562
cugaggugca gaccgga 17
<210> 563
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 563
augcccuuuu ugauggc 17
<210> 564
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 564
auucaccaau ccaucac 17
<210> 565
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 565
ugggaccccu ggcccga 17
<210> 566
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 566
uuucaacuuc ucguaau 17
<210> 567
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 567
guauuucgua uucauuc 17
<210> 568
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 568
aguggaugag cuaguua 17
<210> 569
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 569
gaguaugccc uuuuuga 17
<210> 570
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 570
aucaaacgac ucagaag 17
<210> 571
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 571
cauucucuuc guuaucc 17
<210> 572
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 572
auacacuucu accaagg 17
<210> 573
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 573
gacuuccuug aggcgaa 17
<210> 574
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 574
accccaaucc uuuuuga 17
<210> 575
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 575
ugaaucgucc uucaaaa 17
<210> 576
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 576
uacccucuuu gaagauc 17
<210> 577
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 577
ucugaacuug acaaggc 17
<210> 578
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 578
cgauugucuu ugaggaa 17
<210> 579
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 579
ggacauguau guugauc 17
<210> 580
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 580
cgcauacaac aagcaca 17
<210> 581
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 581
ucgauuacaa uguuuuc 17
<210> 582
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 582
cguccuucaa aaaggau 17
<210> 583
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 583
cuuacuaagc ugcaauu 17
<210> 584
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 584
aagaaacgau uacucca 17
<210> 585
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 585
caacuuuugc cacuacu 17
<210> 586
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 586
cuauucuguc cuaguag 17
<210> 587
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 587
cugcauaaag uuccuau 17
<210> 588
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 588
gugggacccc uggcccg 17
<210> 589
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 589
guaugcggac uuauuuu 17
<210> 590
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 590
ccuaagugga uuugaug 17
<210> 591
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 591
gauuuucuaa agagcga 17
<210> 592
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 592
gggcagccag aucuuaa 17
<210> 593
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 593
caaauugcag cuuagua 17
<210> 594
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 594
ugaaaucgua ugggaua 17
<210> 595
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 595
uuuacucuua ccaaccu 17
<210> 596
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 596
gaugcuccuu uaagauc 17
<210> 597
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 597
cucucaguau gucagau 17
<210> 598
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 598
aaauacuuga augcggc 17
<210> 599
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 599
acuuaacuaa agcugag 17
<210> 600
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 600
cgaacaggag auaggca 17
<210> 601
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 601
gauucaccaa uccauca 17
<210> 602
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 602
uuugaucagu cgaaaaa 17
<210> 603
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 603
cuuaaaggag cauccug 17
<210> 604
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 604
ccuuuugauc auugaag 17
<210> 605
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 605
ugagcuaguu aagguca 17
<210> 606
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 606
aaacauugua aucgaga 17
<210> 607
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 607
ccagauuggc aucagcu 17
<210> 608
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 608
aauuggguau uuuccac 17
<210> 609
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 609
ucaaacagac uauacuu 17
<210> 610
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 610
ccacaucaaa uccacuu 17
<210> 611
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 611
ggauauacaa aaggcac 17
<210> 612
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 612
aaucuacugg cacaaau 17
<210> 613
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 613
ucaguauguc agauagg 17
<210> 614
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 614
aguuaaguau gucacug 17
<210> 615
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 615
aaguucgacu uaaaauu 17
<210> 616
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 616
uucuguucgu uaucuuc 17
<210> 617
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 617
gaggguauua aagaacu 17
<210> 618
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 618
guuaaguaug ucacuga 17
<210> 619
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 619
gcuuaacugu cacuuug 17
<210> 620
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 620
agauuuguca cagcuug 17
<210> 621
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 621
agacuugaca cuucuca 17
<210> 622
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 622
ccagacaguc aaaguag 17
<210> 623
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 623
ccccuuuuga agcucuc 17
<210> 624
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 624
uuaucaguuu cgcauuu 17
<210> 625
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 625
aaaucaaacg acucaga 17
<210> 626
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 626
aaucgauucu uccaaaa 17
<210> 627
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 627
uucccgaucu ucaaaga 17
<210> 628
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 628
gucagucaaa gaauuau 17
<210> 629
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 629
gauuugucac agcuugg 17
<210> 630
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 630
gaaaccaaug gggagac 17
<210> 631
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 631
agguuaaaga gucauca 17
<210> 632
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 632
agaggguauu aaagaac 17
<210> 633
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 633
acagaauagg caacugu 17
<210> 634
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 634
uuucacgauu gucuuug 17
<210> 635
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 635
guccuucaaa aaggauu 17
<210> 636
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 636
augcuuugug auuuggc 17
<210> 637
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 637
ugagaagugu caagucu 17
<210> 638
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 638
uaaagauaag gacuucc 17
<210> 639
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 639
uuucucguuc ugcaauu 17
<210> 640
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 640
ccauugguuu caauuaa 17
<210> 641
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 641
auccaucuuc ucuaaua 17
<210> 642
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 642
uaauacugag auuacca 17
<210> 643
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 643
uucaccuguc uccccau 17
<210> 644
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 644
auagauuugu cacagcu 17
<210> 645
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 645
cuugucugaa cuugaca 17
<210> 646
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 646
cuuaacuaaa gcugaga 17
<210> 647
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 647
cagucaaaga auuauug 17
<210> 648
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 648
aaauucacgu auuuaga 17
<210> 649
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 649
uagauuuguc acagcuu 17
<210> 650
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 650
uaauacuuug uccagau 17
<210> 651
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 651
acucacuuuc uagcuuc 17
<210> 652
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 652
ccuuuaauug aaaccaa 17
<210> 653
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 653
uacuccaugg aauuuug 17
<210> 654
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 654
gucaaaauac uugaaug 17
<210> 655
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 655
acuuaaaauu ugguguc 17
<210> 656
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 656
cucuauuacc uacaaaa 17
<210> 657
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 657
cucuuuaacc uucaaag 17
<210> 658
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 658
cuuuacuaug uugacuu 17
<210> 659
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 659
caacaugcuu ugugauu 17
<210> 660
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 660
aauuggagau caguaug 17
<210> 661
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 661
cauuuuguag guaauag 17
<210> 662
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 662
gacugacuuc aguuucu 17
<210> 663
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 663
acuaaagcug agagggg 17
<210> 664
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 664
aaaagcgaac aggagau 17
<210> 665
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 665
aacccuauaa augcaag 17
<210> 666
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 666
acccauauua gagaaga 17
<210> 667
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 667
guauuucuua augagug 17
<210> 668
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 668
uauguugacu uggggca 17
<210> 669
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 669
caaaaggcac agguuuc 17
<210> 670
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 670
uuucccgauc uucaaag 17
<210> 671
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 671
uuacccucuu ugaagau 17
<210> 672
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 672
uauuagagaa gauggau 17
<210> 673
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 673
uuaacuaaag cugagag 17
<210> 674
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 674
aguuaagcaa uugaaag 17
<210> 675
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 675
aaagucaaaa uuggugu 17
<210> 676
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 676
uucaaacaac ugauuau 17
<210> 677
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 677
guggcaaaag uugagaa 17
<210> 678
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 678
uaaaguaaac ugugcuu 17
<210> 679
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 679
cauugucacu uuucccu 17
<210> 680
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 680
uuccuuugaa aacccuc 17
<210> 681
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 681
aacucacuuu cuagcuu 17
<210> 682
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 682
acugccugag aaauaua 17
<210> 683
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 683
caugcuuugu gauuugg 17
<210> 684
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 684
aguggcaaaa guugaga 17
<210> 685
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 685
cuguuugagu uagaaaa 17
<210> 686
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 686
uagaaaaugg ccgaaaa 17
<210> 687
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 687
uuuacuaugu ugacuug 17
<210> 688
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 688
auuaccuaca aaaugga 17
<210> 689
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 689
gaaagugagu uugugua 17
<210> 690
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 690
uccaucuucu cuaauau 17
<210> 691
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 691
cuuuaauuga aaccaau 17
<210> 692
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 692
ucagucaaag aauuauu 17
<210> 693
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 693
aaucaaacga cucagaa 17
<210> 694
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 694
ugucccuucc auuuugu 17
<210> 695
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 695
uuuaauugaa accaaug 17
<210> 696
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 696
uaaauucuug ucaaagu 17
<210> 697
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 697
uuguauaucc ucuuuga 17
<210> 698
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 698
cuuuaauuau cuuuagg 17
<210> 699
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 699
aaaugaagaa cuauugg 17
<210> 700
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 700
ucuuuacuau guugacu 17
<210> 701
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 701
ccggagagaa gaaaaau 17
<210> 702
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 702
aaucauagag caaauuu 17
<210> 703
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 703
cccggagaga agaaaaa 17
<210> 704
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 704
uuaccuacaa aauggaa 17
<210> 705
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 705
ucucaggcag uugcuga 17
<210> 706
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 706
uccuucaaaa aggauug 17
<210> 707
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 707
uucaauucua uaaaguu 17
<210> 708
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 708
ugguaagagu aaacaaa 17
<210> 709
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 709
ucaauucuau aaaguua 17
<210> 710
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 710
gaaaucacuc uggcaaa 17
<210> 711
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 711
acuuccucaa aauucca 17
<210> 712
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 712
uuaucacuau uccuuuu 17
<210> 713
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 713
cacuuuaaag ucaaaau 17
<210> 714
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 714
auauuagaga agaugga 17
<210> 715
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 715
cccauuuuuc uucucuc 17
<210> 716
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 716
aaaaaaacag ucgagag 17
<210> 717
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 717
uuaugaaaca guuaaag 17
<210> 718
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 718
aagaaaaaug gguuguu 17
<210> 719
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 719
ccauuuuucu ucucucc 17
<210> 720
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 720
cauaguaaag aaaacug 17
<210> 721
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 721
auaagagaca agcaaag 17
<210> 722
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 722
gaugaagaga auagaag 17
<210> 723
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 723
ggcuggagcg ccgaggu 17
<210> 724
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 724
auuuccuuau auuucuc 17
<210> 725
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 725
cagaauaggc aacugua 17
<210> 726
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 726
uaugaauuuc uuuaaga 17
<210> 727
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 727
agaaaaugaa gaacuau 17
<210> 728
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 728
uuacaaggaa guaaaaa 17
<210> 729
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 729
agagaagaug gauggga 17
<210> 730
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 730
aaaacugagg ugcagac 17
<210> 731
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 731
uaucuuuaau uaucuuu 17
<210> 732
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 732
agaauaaaag aaguauu 17
<210> 733
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 733
augaagagaa uagaaga 17
<210> 734
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 734
aaagauaauu aaagaua 17
<210> 735
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 735
uauacuuaga aggcagg 17
<210> 736
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 736
caaagaggau auacaaa 17
<210> 737
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 737
cagucgaaaa acggguacgc 20
<210> 738
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 738
cacgcucgga uaagaaccga 20
<210> 739
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 739
uaagauaagc gucgugcgca 20
<210> 740
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 740
cgcucaccug uucgacgaua 20
<210> 741
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 741
gauaagcguc gugcgcaugg 20
<210> 742
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 742
cgauucuguc gagaucuccg 20
<210> 743
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 743
agaggcgucg cuauacgggc 20
<210> 744
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 744
uuaaagaggc gucgcuauac 20
<210> 745
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 745
aggcgucgcu auacgggcug 20
<210> 746
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 746
cgcuuuucgc gaucaucuua 20
<210> 747
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 747
agagcgacgg cuucgccaau 20
<210> 748
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 748
ugaagcggau aacggcgccu 20
<210> 749
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 749
acacgcucgg auaagaaccg 20
<210> 750
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 750
gaggcgucgc uauacgggcu 20
<210> 751
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 751
gaugaucgcg aaaagcgaac 20
<210> 752
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 752
uaagggccgg gacuucgcga 20
<210> 753
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 753
cguaauggga cgcuaaauac 20
<210> 754
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 754
cuccggguaa uugugcgauc 20
<210> 755
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 755
ugucgcggaa acuuaucaac 20
<210> 756
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 756
cgcuagccaa cauccguuuu 20
<210> 757
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 757
aaugagugcg gucccuacga 20
<210> 758
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 758
uacgcagguu auauugacgg 20
<210> 759
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 759
ugacgaucuc gacaaucuac 20
<210> 760
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 760
guuaaagagg cgucgcuaua 20
<210> 761
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 761
cgacgucgua aucagauaaa 20
<210> 762
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 762
ucauaaccuu aucgucgaac 20
<210> 763
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 763
gcuuaucuua augccgucgu 20
<210> 764
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 764
aaacggaugu uggcuagcgc 20
<210> 765
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 765
uugucgacau ccgaguuguc 20
<210> 766
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 766
cagcucaauc guucaucgag 20
<210> 767
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 767
gaucgauuua augcgucacu 20
<210> 768
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 768
cuuaucuuaa ugccgucgua 20
<210> 769
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 769
ugacggcgga gcgagucaag 20
<210> 770
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 770
cuagccgucg ggauuuagag 20
<210> 771
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 771
ucaucgcucg uaaaaaggac 20
<210> 772
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 772
cgagaacgau aagcugauuc 20
<210> 773
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 773
augcgaaccg agaguucccu 20
<210> 774
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 774
uaagcucauc gcucguaaaa 20
<210> 775
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 775
uugucgcgga aacuuaucaa 20
<210> 776
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 776
ucgauucugu cgagaucucc 20
<210> 777
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 777
ugucgcgucu agcaccuccu 20
<210> 778
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 778
ugggacccga aaaaguacgg 20
<210> 779
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 779
ggccuaguga gagcgcuaua 20
<210> 780
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 780
ggauaaaccc auacgugagc 20
<210> 781
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 781
ccgucgggau uuagagaggc 20
<210> 782
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 782
uuuuccgccu gcucacguau 20
<210> 783
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 783
caucgcucgu aaaaaggacu 20
<210> 784
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 784
aaccuuauag cgcucucacu 20
<210> 785
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 785
aucgacuucc uugaggcgaa 20
<210> 786
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 786
cgaucagguu uucuagccgu 20
<210> 787
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 787
cgucguauuu cguauucauu 20
<210> 788
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 788
ucgaagccac cguacuuuuu 20
<210> 789
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 789
ugcgaaccga gaguucccuc 20
<210> 790
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 790
uagcgccgga gagcuucaaa 20
<210> 791
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 791
aaccugaucg cacaauuacc 20
<210> 792
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 792
ggguacgcag guuauauuga 20
<210> 793
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 793
gagggaacuc ucgguucgca 20
<210> 794
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 794
acgagaacga uaagcugauu 20
<210> 795
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 795
cccgccucuc uaaaucccga 20
<210> 796
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 796
cgggcugggg acgauugucg 20
<210> 797
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 797
cguaaacccg ccuuucuaag 20
<210> 798
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 798
cauauaaucc cgugauggau 20
<210> 799
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 799
uucgauucug ucgagaucuc 20
<210> 800
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 800
cgaagccacc guacuuuuuc 20
<210> 801
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 801
ccgaagaaac gauuacucca 20
<210> 802
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 802
gucguauuuc guauucauuc 20
<210> 803
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 803
agcgccggag agcuucaaaa 20
<210> 804
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 804
uucucaccgu cgcgaagucc 20
<210> 805
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 805
ugaucuaaau ccggacaacu 20
<210> 806
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 806
gaucagguuu ucuagccguc 20
<210> 807
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 807
gguucgccag ccaucaaaaa 20
<210> 808
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 808
uucgccucaa ggaagucgau 20
<210> 809
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 809
ucgccuaagu ggauuugaug 20
<210> 810
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 810
ugguucgcca gccaucaaaa 20
<210> 811
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 811
ucgccucaag gaagucgaug 20
<210> 812
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 812
accgagaguu cccucgggcc 20
<210> 813
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 813
auaggaggau ugcaucgcua 20
<210> 814
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 814
gccgucggga uuuagagagg 20
<210> 815
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 815
caauaaagug cuuacacgcu 20
<210> 816
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 816
auuuuccgcc ugcucacgua 20
<210> 817
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 817
gaaccccauc gacuuccuug 20
<210> 818
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 818
gcgccggaga gcuucaaaag 20
<210> 819
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 819
acgauacacu ucuaccaagg 20
<210> 820
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 820
aaauggccga aaacggaugu 20
<210> 821
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 821
uagcaugcaa uucgccuaag 20
<210> 822
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 822
uaagcgcaua caacaagcac 20
<210> 823
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 823
uuucgccuca aggaagucga 20
<210> 824
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 824
ugaaugcggc uggagcgccg 20
<210> 825
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 825
gugcaaugag uccccuuguc 20
<210> 826
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 826
ugcaaguggc guggaugcga 20
<210> 827
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 827
aagcagcgga cuuucgacaa 20
<210> 828
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 828
uaaacccaua cgugagcagg 20
<210> 829
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 829
cccuauaaau gcaaguggcg 20
<210> 830
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 830
uuucgcauac cuuacuaugu 20
<210> 831
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 831
gcguuaucag uuucgcauuu 20
<210> 832
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 832
ggucauggga cgucacaaac 20
<210> 833
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 833
cgagaguucc cucgggccag 20
<210> 834
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 834
uucuuuacga cuuccucgcu 20
<210> 835
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 835
caaacgauac acuucuacca 20
<210> 836
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 836
accuuacuau gugggacccc 20
<210> 837
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 837
gauugcaucg cuaagguuuu 20
<210> 838
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 838
cuuucgcaua ccuuacuaug 20
<210> 839
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 839
uugaucauug aagcggauaa 20
<210> 840
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 840
cucgauuuuc uaaagagcga 20
<210> 841
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 841
ucgaaguucg acuuaaaauu 20
<210> 842
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 842
aggcaguugc ugacggacua 20
<210> 843
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 843
uauccgcuuc aaugaucaaa 20
<210> 844
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 844
gacugggacc cgaaaaagua 20
<210> 845
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 845
ccgagaguuc ccucgggcca 20
<210> 846
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 846
gcaugcuaua cuuagaaggc 20
<210> 847
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 847
aaucguaugg gauaagggcc 20
<210> 848
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 848
guccuuacua agcugcaauu 20
<210> 849
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 849
uguucuccgc uuagaaaggc 20
<210> 850
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 850
cgaccuuuaa uugaaaccaa 20
<210> 851
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 851
aaaucguaug ggauaagggc 20
<210> 852
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 852
gaacauauug cgaaucuugc 20
<210> 853
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 853
gagcugacgu uuaauaaauc 20
<210> 854
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 854
cuuaacuguc acuuugcggu 20
<210> 855
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 855
auuaaaucga ucuucuaccc 20
<210> 856
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 856
ggcacagguu uccggacaag 20
<210> 857
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 857
cacauaguaa gguaugcgaa 20
<210> 858
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 858
aguaagguau gcgaaagguu 20
<210> 859
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 859
ccauggagua aucguuucuu 20
<210> 860
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 860
cggguauuuc uuaaugagug 20
<210> 861
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 861
uaugugggac cccuggcccg 20
<210> 862
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 862
ccuuguaacc uuucgccuca 20
<210> 863
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 863
uccacgccac uugcauuuau 20
<210> 864
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 864
ucccauuacg agaaguugaa 20
<210> 865
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 865
auuggugucg gacuucagaa 20
<210> 866
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 866
aguuucauau aaucccguga 20
<210> 867
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 867
ggugaaaucg uaugggauaa 20
<210> 868
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 868
auuauugggg auaacgauua 20
<210> 869
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 869
ucacgggauu auaugaaacu 20
<210> 870
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 870
aagugacaau guuccaagcg 20
<210> 871
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 871
gcgaaaagcg aacaggagau 20
<210> 872
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 872
ggagacaggu gaaaucguau 20
<210> 873
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 873
accuuucaac uucucguaau 20
<210> 874
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 874
gcagaccgga ggguuuucaa 20
<210> 875
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 875
ugccacuacu aggacagaau 20
<210> 876
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 876
ccacgccacu ugcauuuaua 20
<210> 877
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 877
auuuauuaaa cgucagcucg 20
<210> 878
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 878
aaccuuucaa cuucucguaa 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 879
cgaaaaucaa acgacucaga 20
<210> 880
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 880
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<210> 881
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 881
cgguaaauuc uugucaaagu 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 882
augugggacc ccuggcccga 20
<210> 883
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 883
cggauagauu ugucacagcu 20
<210> 884
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 884
ucgacuuaaa auuugguguc 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 885
cauccuagcu gaugccaauc 20
<210> 886
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 886
cauccacuac uuugacuguc 20
<210> 887
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 887
aggcacaggu uuccggacaa 20
<210> 888
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 888
gccagggguc ccacauagua 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 889
ucguaaagua aacugugcuu 20
<210> 890
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 890
caggcaguug cugacggacu 20
<210> 891
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 891
cugauucacc aauccaucac 20
<210> 892
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 892
ugccuauucu guccuaguag 20
<210> 893
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 893
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<210> 894
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 894
aguaugcccu uuuugauggc 20
<210> 895
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 895
gggagacagg ugaaaucgua 20
<210> 896
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 896
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<210> 897
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 897
cuguucuccg cuuagaaagg 20
<210> 898
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 898
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<210> 899
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 899
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<210> 900
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 900
ugcggcugga gcgccgaggu 20
<210> 901
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 901
cauguauguu gaucaggaac 20
<210> 902
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 902
gacaaucuac uggcacaaau 20
<210> 903
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 903
ccuugaggcg aaagguuaca 20
<210> 904
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 904
gcuuaauacu uuguccagau 20
<210> 905
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 905
aggugaaauc guaugggaua 20
<210> 906
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 906
aaggcacagg uuuccggaca 20
<210> 907
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 907
aucguccuuc aaaaaggauu 20
<210> 908
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 908
cagcugcaua aaguuccuau 20
<210> 909
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 909
gaucuuaaag gagcauccug 20
<210> 910
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 910
guaccuuuug aucauugaag 20
<210> 911
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 911
ugaagaucgg gaaaugauug 20
<210> 912
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 912
ugccaaauug cagcuuagua 20
<210> 913
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 913
ggaugagcua guuaagguca 20
<210> 914
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 914
cgauuccuuu gaaaacccuc 20
<210> 915
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 915
cuucuguucu ccgcuuagaa 20
<210> 916
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 916
uuugaggaag uugucgauaa 20
<210> 917
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 917
ucaaaauacu ugaaugcggc 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 918
acugggcagc cagaucuuaa 20
<210> 919
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 919
gauagauuug ucacagcuug 20
<210> 920
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 920
ccuugagaag ugucaagucu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 921
aucucgauua caauguuuuc 20
<210> 922
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 922
ucacgauugu cuuugaggaa 20
<210> 923
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 923
cuggaguaug cccuuuuuga 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 924
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 925
uuguuuacuc uuaccaaccu 20
<210> 926
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 926
aagcgcauac aacaagcaca 20
<210> 927
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 927
aaucguccuu caaaaaggau 20
<210> 928
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 928
ugcaauuggg uauuuuccac 20
<210> 929
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 929
cucucaguau gucagauagg 20
<210> 930
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 930
ugcuucuguu cguuaucuuc 20
<210> 931
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 931
ggauagauuu gucacagcuu 20
<210> 932
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 932
uguaccccaa uccuuuuuga 20
<210> 933
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 933
uggcuugucu gaacuugaca 20
<210> 934
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 934
aagggacaug uauguugauc 20
<210> 935
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 935
gauuucaccu gucuccccau 20
<210> 936
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 936
uuaggcaaua cuuuuucguu 20
<210> 937
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 937
uaacucucag uaugucagau 20
<210> 938
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 938
guuccccuuu ugaagcucuc 20
<210> 939
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 939
ucaguaugcg gacuuauuuu 20
<210> 940
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 940
ucucaacuuu ugccacuacu 20
<210> 941
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 941
gauuauaggu uuguacuaac 20
<210> 942
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 942
gaccuuuaau ugaaaccaau 20
<210> 943
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 943
aggaaucgau ucuuccaaaa 20
<210> 944
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 944
cuuuaagacg gaaaucacuc 20
<210> 945
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 945
aaguuucucg uucugcaauu 20
<210> 946
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 946
gugcaacaug cuuugugauu 20
<210> 947
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 947
auugaaacca auggggagac 20
<210> 948
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 948
acuccagaca gucaaaguag 20
<210> 949
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 949
aauugcaugc uauacuuaga 20
<210> 950
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 950
aacucaaaca gacuauacuu 20
<210> 951
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 951
gauuacucca uggaauuuug 20
<210> 952
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 952
ggaaaacauu guaaucgaga 20
<210> 953
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 953
aguaguggau gagcuaguua 20
<210> 954
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 954
caggaugcuc cuuuaagauc 20
<210> 955
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 955
cauugagggu gaucuaaauc 20
<210> 956
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 956
ccaagacuug acacuucuca 20
<210> 957
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 957
uccccauugg uuucaauuaa 20
<210> 958
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 958
auaacuuaac uaaagcugag 20
<210> 959
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 959
cccauccauc uucucuaaua 20
<210> 960
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 960
gagaacccua uaaaugcaag 20
<210> 961
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 961
aaaacugagg ugcagaccgg 20
<210> 962
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 962
ggcaaaaaaa cagucgagag 20
<210> 963
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 963
aggaaauuca cguauuuaga 20
<210> 964
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 964
aagcgaacag gagauaggca 20
<210> 965
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 965
ucuuacccuc uuugaagauc 20
<210> 966
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 966
cccuggcccg agggaacucu 20
<210> 967
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 967
cgaaaucaua gagcaaauuu 20
<210> 968
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 968
uucuuugauc agucgaaaaa 20
<210> 969
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 969
ugacucuuua accuucaaag 20
<210> 970
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 970
aggacagaau aggcaacugu 20
<210> 971
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 971
aguuaauacu gagauuacca 20
<210> 972
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 972
accuuuaauu gaaaccaaug 20
<210> 973
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 973
auuccacauc aaauccacuu 20
<210> 974
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 974
agcuuaucac uauuccuuuu 20
<210> 975
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 975
uguccagauu ggcaucagcu 20
<210> 976
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 976
gaaaguuaag uaugucacug 20
<210> 977
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 977
aacaugcuuu gugauuuggc 20
<210> 978
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 978
cauuucccga ucuucaaaga 20
<210> 979
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 979
ccauauuaga gaagauggau 20
<210> 980
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 980
uaccucuauu accuacaaaa 20
<210> 981
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 981
auagauuugu cacagcuugg 20
<210> 982
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 982
gguugguaag aguaaacaaa 20
<210> 983
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 983
ucauuucccg aucuucaaag 20
<210> 984
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 984
acggaaauca cucuggcaaa 20
<210> 985
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 985
ugaagguuaa agagucauca 20
<210> 986
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 986
cucuucaaac aacugauuau 20
<210> 987
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 987
cuucauucuc uucguuaucc 20
<210> 988
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 988
auacaaaagg cacagguuuc 20
<210> 989
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 989
guaguggcaa aaguugagaa 20
<210> 990
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 990
agucagucaa agaauuauug 20
<210> 991
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 991
gcaacugccu gagaaauaua 20
<210> 992
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 992
cuagaaagug aguuugugua 20
<210> 993
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 993
gaacauuguc acuuuucccu 20
<210> 994
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 994
cccauauuag agaagaugga 20
<210> 995
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 995
caacaugcuu ugugauuugg 20
<210> 996
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 996
acaugucccu uccauuuugu 20
<210> 997
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 997
cucuuacccu cuuugaagau 20
<210> 998
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 998
acaaauugga gaucaguaug 20
<210> 999
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 999
aaacugaggu gcagaccgga 20
<210> 1000
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1000
uacccggaga gaagaaaaau 20
<210> 1001
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1001
uuaacuaaag cugagagggg 20
<210> 1002
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1002
gaagucaguc aaagaauuau 20
<210> 1003
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1003
aaaguuaagu augucacuga 20
<210> 1004
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1004
ucuauuaccu acaaaaugga 20
<210> 1005
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1005
aacuuaacua aagcugagag 20
<210> 1006
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1006
aauuaaagau aaggacuucc 20
<210> 1007
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1007
aguaguggca aaaguugaga 20
<210> 1008
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1008
agaggauaua caaaaggcac 20
<210> 1009
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1009
ucuuuucacg auugucuuug 20
<210> 1010
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1010
caaacccaua uuagagaaga 20
<210> 1011
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1011
ugugucaaaa uacuugaaug 20
<210> 1012
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1012
gacaguuaag caauugaaag 20
<210> 1013
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1013
gaagagggua uuaaagaacu 20
<210> 1014
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1014
uuccauuuug uagguaauag 20
<210> 1015
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1015
gcggaugaag agaauagaag 20
<210> 1016
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1016
cuauuaccua caaaauggaa 20
<210> 1017
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1017
auugcuuaac ugucacuuug 20
<210> 1018
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1018
agucuguuug aguuagaaaa 20
<210> 1019
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1019
acaaacucac uuucuagcuu 20
<210> 1020
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1020
aaaaucaaac gacucagaag 20
<210> 1021
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1021
agaagagggu auuaaagaac 20
<210> 1022
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1022
caaacucacu uucuagcuuc 20
<210> 1023
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1023
uuacccggag agaagaaaaa 20
<210> 1024
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1024
auuucucagg caguugcuga 20
<210> 1025
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1025
aguuagaaaa uggccgaaaa 20
<210> 1026
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1026
uaacuuaacu aaagcugaga 20
<210> 1027
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1027
ggacagaaua ggcaacugua 20
<210> 1028
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1028
aagucaguca aagaauuauu 20
<210> 1029
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1029
agguuaugaa acaguuaaag 20
<210> 1030
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1030
uuugacugac uucaguuucu 20
<210> 1031
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1031
caacccauuu uucuucucuc 20
<210> 1032
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1032
ucguccuuca aaaaggauug 20
<210> 1033
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1033
uacuauguug acuuggggca 20
<210> 1034
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1034
ugcuauacuu agaaggcagg 20
<210> 1035
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1035
acaacuuccu caaaauucca 20
<210> 1036
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1036
uuuaaaguca aaauuggugu 20
<210> 1037
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1037
cggaugaaga gaauagaaga 20
<210> 1038
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1038
cuuuuguaua uccucuuuga 20
<210> 1039
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1039
aacccauuuu ucuucucucc 20
<210> 1040
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1040
ccauccaucu ucucuaauau 20
<210> 1041
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1041
auuagagaag auggauggga 20
<210> 1042
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1042
acugauucac caauccauca 20
<210> 1043
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1043
ccuaaagaua auuaaagaua 20
<210> 1044
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1044
gggauaagag acaagcaaag 20
<210> 1045
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1045
uucuuuacua uguugacuug 20
<210> 1046
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1046
gaaaaucaaa cgacucagaa 20
<210> 1047
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1047
uuucuuuacu auguugacuu 20
<210> 1048
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1048
ccuuaucuuu aauuaucuuu 20
<210> 1049
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1049
aaucacuuua aagucaaaau 20
<210> 1050
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1050
agaaaaugaa gaacuauugg 20
<210> 1051
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1051
guuagaauaa aagaaguauu 20
<210> 1052
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1052
caacauagua aagaaaacug 20
<210> 1053
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1053
agguuacaag gaaguaaaaa 20
<210> 1054
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1054
uaucuuuaau uaucuuuagg 20
<210> 1055
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1055
gagaagaaaa auggguuguu 20
<210> 1056
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1056
cauuaugaau uucuuuaaga 20
<210> 1057
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1057
uuuucuuuac uauguugacu 20
<210> 1058
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1058
auuuucaauu cuauaaaguu 20
<210> 1059
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1059
aauauuuccu uauauuucuc 20
<210> 1060
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1060
uuuucaauuc uauaaaguua 20
<210> 1061
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1061
uaaagaaaau gaagaacuau 20
<210> 1062
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1062
aagaaaacug aggugcagac 20
<210> 1063
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1063
cuucaaagag gauauacaaa 20
<210> 1064
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1064
ggacaucggg auuacaagcg 20
<210> 1065
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1065
guaaucccga uguccagccc 20
<210> 1066
<400> 1066
000
<210> 1067
<400> 1067
000
<210> 1068
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1068
ggaauuaauc cuuaugaagc 20
<210> 1069
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1069
gccuuucacc cuggcuucau 20
<210> 1070
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1070
cugcaccugg cuaagcgccg 20
<210> 1071
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1071
accgaccauu cugagcugag 20
<210> 1072
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1072
ugcugaccga ccauucugag 20
<210> 1073
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1073
aacagcaguu ucuucacccu 20
<210> 1074
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1074
aggauuaauu ccacucagcu 20
<210> 1075
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1075
uacauucugg ggcuggacau 20
<210> 1076
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1076
augaagccag ggugaaaggc 20
<210> 1077
<400> 1077
000
<210> 1078
<400> 1078
000
<210> 1079
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1079
cugaaacgac ggagaaggca 20
<210> 1080
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1080
cggagaaggc acagaaucca 20
<210> 1081
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1081
gagucagaag cugucagagg 20
<210> 1082
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1082
gaagaaagau ggcgagguga 20
<210> 1083
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1083
gggauuacaa gcguggggua 20
<210> 1084
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1084
gauacgcuac ucgcggccug 20
<210> 1085
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1085
augaucgacc ucguaguuga 20
<210> 1086
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1086
augaaugaua agcgcccccc 20
<210> 1087
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1087
acgcagaucu guacaacgcc 20
<210> 1088
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1088
acuacaagua cucucaccgg 20
<210> 1089
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1089
cgccguuguc cagauagaca 20
<210> 1090
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1090
ucauugagaa cgccgaacug 20
<210> 1091
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1091
uaauaugauc gaccucguag 20
<210> 1092
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1092
gcguucucuu ucccgguagu 20
<210> 1093
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1093
ggcgaacugu auagggucau 20
<210> 1094
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1094
gcccgaaauc gagacagaac 20
<210> 1095
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1095
aucugcugaa ccgcauugaa 20
<210> 1096
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1096
ccguucagau uguucacaau 20
<210> 1097
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1097
ucggagcucu gguagauagu 20
<210> 1098
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1098
gaccaccuug uugcgacugu 20
<210> 1099
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1099
uuuguaugcc acagcucauc 20
<210> 1100
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1100
gggcuuuuua uccacccggu 20
<210> 1101
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1101
guugaguacu uuuugauacu 20
<210> 1102
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1102
aagaucaaug gcgaacugua 20
<210> 1103
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1103
gaaagucaag uccaucaacg 20
<210> 1104
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1104
ggucccucau aguagguucu 20
<210> 1105
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1105
ccuauuuccg ggugaacaau 20
<210> 1106
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1106
cgcagcagau ucaucaggcc 20
<210> 1107
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1107
cagguuuccc agaaugucgg 20
<210> 1108
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1108
cgaacagauu aguaaucuga 20
<210> 1109
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1109
ccagauuguu cacccggaaa 20
<210> 1110
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1110
aaaucgucca ccaguguggu 20
<210> 1111
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1111
cuucggaugg aaagacauca 20
<210> 1112
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1112
aaaugccgac uucaucuuua 20
<210> 1113
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1113
ucaacagauu cuccguccag 20
<210> 1114
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1114
gcguugauca cuuugaugcu 20
<210> 1115
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1115
aaggacuaca aguacucuca 20
<210> 1116
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1116
cuccgcuuga ccacggguga 20
<210> 1117
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1117
ggugacaagc acuggaaaac 20
<210> 1118
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1118
accugaccaa guauagcaaa 20
<210> 1119
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1119
ggaugaagcu ccgcuugacc 20
<210> 1120
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1120
ccgcaucagc aagaccaaaa 20
<210> 1121
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1121
uccagaagga uuuuauuaac 20
<210> 1122
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1122
uugauaugcu ugaucuggug 20
<210> 1123
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1123
uguauaaauu ugugacuguc 20
<210> 1124
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1124
cucaccagau caagcauauc 20
<210> 1125
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1125
ugcagaaggc uuaccaccag 20
<210> 1126
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1126
uugauguccu cuucguugac 20
<210> 1127
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1127
cuaaucuguu cgaucucuuc 20
<210> 1128
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1128
gaccagcacc uuguuguuaa 20
<210> 1129
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1129
gaagaggaca ucaagggcua 20
<210> 1130
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1130
uaauaaaauc cuucuggacg 20
<210> 1131
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1131
uggucccaaa aaagguggac 20
<210> 1132
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1132
cucuucauag uacuuauaca 20
<210> 1133
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1133
aaucugcugc gauccuauuu 20
<210> 1134
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1134
gaacuagaca gguacuggaa 20
<210> 1135
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1135
aaagguuucg uaagagaucu 20
<210> 1136
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1136
cccuuuccuu uggccagauu 20
<210> 1137
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1137
ucgucuuuuc uuguacuaua 20
<210> 1138
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1138
aggaguccua uugcccuuuu 20
<210> 1139
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1139
uaugauugac aucacuuacc 20
<210> 1140
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1140
uucaccucau acagguuucc 20
<210> 1141
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1141
cuccaggggg auggccucca 20
<210> 1142
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1142
ugaaagcuau caaucugauu 20
<210> 1143
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1143
ucaaguacua ugggaacaag 20
<210> 1144
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1144
ugaacaaccu ggucaucacc 20
<210> 1145
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1145
uuguucagca gguccuccag 20
<210> 1146
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1146
accgagagua ucuggaaaac 20
<210> 1147
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1147
guuuaaaaag gagcgcaaca 20
<210> 1148
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1148
cuucaguuuc ugauaugucu 20
<210> 1149
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1149
aaacaauugc cucuaagacu 20
<210> 1150
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1150
gaaaaagauu agcaaccagg 20
<210> 1151
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1151
cagggaugaa aacgagaaac 20
<210> 1152
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1152
uucagguuag ucagcucuuc 20
<210> 1153
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1153
uugucgaagg acacgcuucu 20
<210> 1154
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1154
aaaccuuuaa aaagcacauu 20
<210> 1155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1155
accaggagaa gggagccccu 20
<210> 1156
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1156
guacaagaaa agacgauaag 20
<210> 1157
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1157
gauguucgaa gagaagcagg 20
<210> 1158
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1158
aaaaggagaa cuacuaugaa 20
<210> 1159
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1159
aauuugugac ugucaagaau 20
<210> 1160
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1160
gaagcaggcc gaaucuaugc 20
<210> 1161
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1161
aggaauggua cgagaugcug 20
<210> 1162
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1162
uccgggugaa caaucuggau 20
<210> 1163
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1163
agacucggag aaccuacuau 20
<210> 1164
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1164
ggacgcacag aagaugauca 20
<210> 1165
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1165
ucacauccag auuguucacc 20
<210> 1166
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1166
ggagaaggga gccccuucgg 20
<210> 1167
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1167
ccggcaacga gcugucuaca 20
<210> 1168
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1168
aaguacucaa ccgacauucu 20
<210> 1169
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1169
aaugacaccc uguauaguac 20
<210> 1170
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1170
acuguucaag gaggccaacg 20
<210> 1171
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1171
ccgacuucau cuuuaaggag 20
<210> 1172
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1172
gaaucugaac uagacaggua 20
<210> 1173
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1173
cggguggaua aaaagcccaa 20
<210> 1174
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1174
accagagcuc cgaggacauc 20
<210> 1175
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1175
ggugguacau cagcagcuuc 20
<210> 1176
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1176
ccggaacaca caaccugucc 20
<210> 1177
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1177
gugcuuuuua aagguuucgu 20
<210> 1178
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1178
uucacaucca gauuguucac 20
<210> 1179
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1179
uuccagagcu uugcuauugc 20
<210> 1180
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1180
acaucuuuuc ugaggcgcaa 20
<210> 1181
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1181
aaagcugauc aacaaaaguc 20
<210> 1182
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1182
gaaucuggau gucaucaaaa 20
<210> 1183
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1183
uauaaguacu augaagagac 20
<210> 1184
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1184
caucacuuac cgagaguauc 20
<210> 1185
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1185
uaucauuauc gagcuggcua 20
<210> 1186
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1186
caaggugcug gucaagcagg 20
<210> 1187
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1187
aaaguacuca accgacauuc 20
<210> 1188
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1188
auugucgaag gacacgcuuc 20
<210> 1189
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1189
gagugcauaa cgucaaugag 20
<210> 1190
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1190
aguaugucgc agagcugcag 20
<210> 1191
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1191
gaaaucgucc accagugugg 20
<210> 1192
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1192
accaugaucc ucagacauau 20
<210> 1193
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1193
cuugacgcuu cucagcucuu 20
<210> 1194
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1194
guauaaguac uaugaagaga 20
<210> 1195
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1195
gggguauggg auuauugacu 20
<210> 1196
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1196
cccacuguau aaguacuaug 20
<210> 1197
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1197
ucgaaaacgu guuuaagcag 20
<210> 1198
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1198
agaccaaaaa ggaguaccug 20
<210> 1199
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1199
uuaaacacgu uuucgaugau 20
<210> 1200
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1200
gcuugaccac gggugacaga 20
<210> 1201
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1201
uuaaacuucc auuugcgccu 20
<210> 1202
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1202
augagggacg gagaagcaag 20
<210> 1203
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1203
cugacucagg uccaccuuuu 20
<210> 1204
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1204
gaaagacauc aaggaauggu 20
<210> 1205
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1205
uaaggacauc acagcacgga 20
<210> 1206
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1206
aaaaggugga ccugagucag 20
<210> 1207
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1207
aauaugauug acaucacuua 20
<210> 1208
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1208
gagaagggag ccccuucgga 20
<210> 1209
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1209
gauuauccga acuaccggga 20
<210> 1210
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1210
ucaaagaagc caagcagcug 20
<210> 1211
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1211
ggugagagua cuuguagucc 20
<210> 1212
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1212
accugaacag cgagcugacc 20
<210> 1213
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1213
gaccgaccau ucugagcuga 20
<210> 1214
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1214
gcuugaucug gugaggagug 20
<210> 1215
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1215
ugaccagcac cuuguuguua 20
<210> 1216
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1216
caagcugcac gauaugcagg 20
<210> 1217
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1217
uaaagguuuc guaagagauc 20
<210> 1218
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1218
gcaccuauuu uccagaagag 20
<210> 1219
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1219
aaacgagaaa cuggaauacu 20
<210> 1220
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1220
ugaagagauu auccgaacua 20
<210> 1221
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1221
ggcugaagaa agauggcgag 20
<210> 1222
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1222
guccagaagg auuuuauuaa 20
<210> 1223
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1223
gaacagcgag cugacccagg 20
<210> 1224
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1224
agaaccuacu augagggacc 20
<210> 1225
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1225
agccaggugc agcagagcug 20
<210> 1226
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1226
cuacuaugag ggaccaggag 20
<210> 1227
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1227
gaaaaccaga guucaccaau 20
<210> 1228
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1228
acaacaaggu gcuggucaag 20
<210> 1229
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1229
gcagaccaau gaacgcauug 20
<210> 1230
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1230
ggaaaaagcu ggacaaagcc 20
<210> 1231
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1231
uucagauucc aagaucucuu 20
<210> 1232
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1232
agcugcagcu ggaacggcug 20
<210> 1233
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1233
gauuauggag caguacggcg 20
<210> 1234
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1234
agaaucagau ugauagcuuu 20
<210> 1235
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1235
uccuccaggg ggauggccuc 20
<210> 1236
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1236
gggauuauug acuaugaaac 20
<210> 1237
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1237
ucucacgcaa uagcaaagcu 20
<210> 1238
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1238
acguggaaaa caaugaggga 20
<210> 1239
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1239
uugacgcuuc ucagcucuuc 20
<210> 1240
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1240
gauaucauua ucgagcuggc 20
<210> 1241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1241
guuaauaaaa uccuucugga 20
<210> 1242
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1242
caaccugguc aucaccaggg 20
<210> 1243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1243
gcacauucug aaucuggcca 20
<210> 1244
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1244
gguggaccug agucagcaga 20
<210> 1245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1245
auauuaagga caucacagca 20
<210> 1246
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1246
cuacauucug gggcuggaca 20
<210> 1247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1247
gcaagagggg agccaggcgc 20
<210> 1248
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1248
ccagggauga aaacgagaaa 20
<210> 1249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1249
uagccaggug cagcagagcu 20
<210> 1250
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1250
gggcuaccgg gugacaagca 20
<210> 1251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1251
ggucaucacc agggaugaaa 20
<210> 1252
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1252
gagccaggcg ccugaaacga 20
<210> 1253
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1253
gcuacgaaga ggcuaaaaag 20
<210> 1254
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1254
ggacaaagcc aagaaaguga 20
<210> 1255
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1255
uugggcuuuu uauccacccg 20
<210> 1256
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1256
gacuguucaa ggaggccaac 20
<210> 1257
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1257
aaaaguacuc aaccgacauu 20
<210> 1258
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1258
uaguaaucug aagggguaca 20
<210> 1259
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1259
ggccgaaucu augcccgaaa 20
<210> 1260
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1260
ucaagcugca cgauaugcag 20
<210> 1261
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1261
cugaacaacc uggucaucac 20
<210> 1262
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1262
ggcacagaau ccagagggug 20
<210> 1263
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1263
acgcaauagc aaagcucugg 20
<210> 1264
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1264
agagaacgca aaguaccuga 20
<210> 1265
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1265
ucaucaccag ggaugaaaac 20
<210> 1266
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1266
aaggaguacc ugcuggaaga 20
<210> 1267
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1267
agcagaagaa aaagccuaca 20
<210> 1268
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1268
acaucacuua ccgagaguau 20
<210> 1269
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1269
cacagcacgg aaagaaauca 20
<210> 1270
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1270
agaagaugau caaugagaug 20
<210> 1271
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1271
aagcugcacg auaugcagga 20
<210> 1272
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1272
auuguucagc agguccucca 20
<210> 1273
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1273
gauauuaagg acaucacagc 20
<210> 1274
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1274
cuaugagaag uuccagauca 20
<210> 1275
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1275
gaagagauua uccgaacuac 20
<210> 1276
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1276
uacacugaaa cagauugcua 20
<210> 1277
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1277
aguacaagaa aagacgauaa 20
<210> 1278
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1278
cgggauuaca agcguggggu 20
<210> 1279
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1279
ggcuaccggg ugacaagcac 20
<210> 1280
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1280
auaucgaccu gcuggagacu 20
<210> 1281
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1281
uuaauccuua ugaagccagg 20
<210> 1282
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1282
cgagacagaa caggaguaca 20
<210> 1283
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1283
gaucaagaag aucaaguacu 20
<210> 1284
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1284
gccgacuuca ucuuuaagga 20
<210> 1285
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1285
aagagauuau ccgaacuacc 20
<210> 1286
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1286
augaucaaug agaugcagaa 20
<210> 1287
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1287
aggccaacgu ggaaaacaau 20
<210> 1288
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1288
aucaagaaga ucaaguacua 20
<210> 1289
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1289
cacauucuga aucuggccaa 20
<210> 1290
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1290
acgacaaaga uaaugacaag 20
<210> 1291
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1291
aaucugaacu agacagguac 20
<210> 1292
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1292
gccugaguca gaagcuguca 20
<210> 1293
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1293
cgauacuuau aucgaccugc 20
<210> 1294
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1294
uaguacaaga aaagacgaua 20
<210> 1295
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1295
ccuucggaug gaaagacauc 20
<210> 1296
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1296
gauggagaac cagauguucg 20
<210> 1297
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1297
cggcgcuuag ccaggugcag 20
<210> 1298
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1298
aguaaucuga agggguacac 20
<210> 1299
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1299
cgaccugauu aagaucaaug 20
<210> 1300
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1300
agcuaucaau cugauucugg 20
<210> 1301
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1301
aaaggaacua cauucugggg 20
<210> 1302
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1302
ggccaacgug gaaaacaaug 20
<210> 1303
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1303
ucuuuaagga guggaaaaag 20
<210> 1304
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1304
aggaguaccu gcuggaagag 20
<210> 1305
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1305
ugacuaucua ccagagcucc 20
<210> 1306
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1306
gugguacauc agcagcuucu 20
<210> 1307
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1307
aggagauccu ggucaacgaa 20
<210> 1308
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1308
uguuguuaaa ggaauugucg 20
<210> 1309
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1309
acauugcacc uauuuuccag 20
<210> 1310
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1310
gagaacucua aaaagggcaa 20
<210> 1311
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1311
agagcugacu aaccugaaca 20
<210> 1312
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1312
cauacagauu cgaugucuau 20
<210> 1313
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1313
uucugaaucu ggccaaagga 20
<210> 1314
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1314
ugacucaggu ccaccuuuuu 20
<210> 1315
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1315
aacuguauag ggucaucggg 20
<210> 1316
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1316
gaaucagauu gauagcuuuc 20
<210> 1317
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1317
uggcuaggga gaagaacagc 20
<210> 1318
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1318
uccaggaaga gcugacuaac 20
<210> 1319
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1319
cuuugacgua gucgcuuguc 20
<210> 1320
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1320
auaaguacua ugaagagacu 20
<210> 1321
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1321
uuccgguuaa uaaaauccuu 20
<210> 1322
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1322
ugaagcuggu cccaaaaaag 20
<210> 1323
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1323
uagauucggc cugcuucucu 20
<210> 1324
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1324
ucaagaagau caaguacuau 20
<210> 1325
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1325
auuuuauuaa ccggaaucug 20
<210> 1326
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1326
ugggaaaccu guaugaggug 20
<210> 1327
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1327
ucagaaacug aagcugauua 20
<210> 1328
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1328
aggcuuacca ccagcuggau 20
<210> 1329
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1329
ugcugcgauc cuauuuccgg 20
<210> 1330
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1330
auaacgucaa ugagguggaa 20
<210> 1331
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1331
gaacgcauug aagagauuau 20
<210> 1332
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1332
uucugucacc cguggucaag 20
<210> 1333
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1333
gcgcaaaugg aaguuuaaaa 20
<210> 1334
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1334
uaaacacguu uucgaugauc 20
<210> 1335
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1335
guacuugauc uucuugauca 20
<210> 1336
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1336
aagucggcau uugcgauaau 20
<210> 1337
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1337
cgagcugacc caggaagaga 20
<210> 1338
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1338
ucaagcauau caaggauuuc 20
<210> 1339
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1339
aggugcuggu caagcaggaa 20
<210> 1340
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1340
cucuggaggc caucccccug 20
<210> 1341
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1341
acuaugaggg accaggagaa 20
<210> 1342
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1342
gagcuccgag gacauccagg 20
<210> 1343
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1343
caaaaaggag uaccugcugg 20
<210> 1344
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1344
auacccugau ugugaacaau 20
<210> 1345
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1345
ucuggaagag aaguaugucg 20
<210> 1346
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1346
auaaggggaa uacccugauu 20
<210> 1347
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1347
ccagcucgau aaugauauca 20
<210> 1348
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1348
ggauuauuga cuaugaaaca 20
<210> 1349
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1349
gagggacgga gaagcaagag 20
<210> 1350
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1350
cagcucuucc uggauguccu 20
<210> 1351
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1351
gaaagaaauc auugagaacg 20
<210> 1352
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1352
cagcacggaa agaaaucauu 20
<210> 1353
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1353
gacucggaga accuacuaug 20
<210> 1354
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1354
aagaugugaa cccgccguug 20
<210> 1355
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1355
gguggauaaa aagcccaaca 20
<210> 1356
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1356
ucggggugaa caaugaucug 20
<210> 1357
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1357
uguacaacgc ccugaaugac 20
<210> 1358
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1358
acuccuguuc ugucucgauu 20
<210> 1359
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1359
aucuaugccc gaaaucgaga 20
<210> 1360
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1360
ggaacaagcu gaaugcccau 20
<210> 1361
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1361
accagguugu ucaggucauu 20
<210> 1362
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1362
acaaagccaa gaaagugaug 20
<210> 1363
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1363
caaccugcug accgaccauu 20
<210> 1364
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1364
aucuggaugu caucaaaaag 20
<210> 1365
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1365
ccaucccccu ggaggaccug 20
<210> 1366
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1366
ggucggucag cagguuguaa 20
<210> 1367
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1367
ugaaagugua ucacgauauu 20
<210> 1368
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1368
cuaagauccu gacuaucuac 20
<210> 1369
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1369
uggucaagcg gagcuucauc 20
<210> 1370
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1370
cggcaacgag cugucuacaa 20
<210> 1371
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1371
agcaggaaga gaacucuaaa 20
<210> 1372
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1372
gaaacgaaac cggcagacca 20
<210> 1373
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1373
cuugaugucu uuccauccga 20
<210> 1374
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1374
ccugauugug aacaaucuga 20
<210> 1375
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1375
uuaucgagcu ggcuagggag 20
<210> 1376
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1376
cgugauacac uuucagauug 20
<210> 1377
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1377
aagagauccc aaccacacug 20
<210> 1378
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1378
uucguaagag aucuuggaau 20
<210> 1379
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1379
ccugcccaau gauaucauua 20
<210> 1380
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1380
aucgaccugc uggagacucg 20
<210> 1381
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1381
ugucauugau cagcucucug 20
<210> 1382
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1382
uggagcagua cggcgacgag 20
<210> 1383
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1383
auuugcgccu cagaaaagau 20
<210> 1384
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1384
uguuuuccac guuggccucc 20
<210> 1385
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1385
cguuguugua aaaggaggcg 20
<210> 1386
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1386
agcacccuca gauuaucaaa 20
<210> 1387
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1387
ucugcgacau acuucucuuc 20
<210> 1388
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1388
ggaaugguac gagaugcuga 20
<210> 1389
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1389
guaugucgca gagcugcagc 20
<210> 1390
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1390
uggucaacga agaggacauc 20
<210> 1391
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1391
gguggaagag gacaccggca 20
<210> 1392
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1392
uaaucgucug ugauguccag 20
<210> 1393
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1393
uuauccgaac uaccgggaaa 20
<210> 1394
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1394
aauuguuuug auaauucgag 20
<210> 1395
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1395
gaccaaaaag gaguaccugc 20
<210> 1396
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1396
caucaaaaag gagaacuacu 20
<210> 1397
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1397
agugaauagc aagugcuacg 20
<210> 1398
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1398
cgacauucug ggaaaccugu 20
<210> 1399
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1399
ccgaggagug cauaacguca 20
<210> 1400
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1400
aggccugagu cagaagcugu 20
<210> 1401
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1401
gcaauagcaa agcucuggaa 20
<210> 1402
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1402
accuauuuuc cagaagagcu 20
<210> 1403
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1403
ucagcucuuc cuggaugucc 20
<210> 1404
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1404
gcaggucgau auaaguaucg 20
<210> 1405
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1405
cuugauaugc uugaucuggu 20
<210> 1406
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1406
agugcauaac gucaaugagg 20
<210> 1407
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1407
agcuucaguu ucugauaugu 20
<210> 1408
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1408
ggcaauuguu uugauaauuc 20
<210> 1409
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1409
caacaaggug cuggucaagc 20
<210> 1410
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1410
agugauggag aaccagaugu 20
<210> 1411
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1411
gggaaagugu cuguauucuc 20
<210> 1412
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1412
agggaaagug ucuguauucu 20
<210> 1413
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1413
agaucgaaca gauuaguaau 20
<210> 1414
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1414
gauuguucag cagguccucc 20
<210> 1415
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1415
aaucaagcug cacgauaugc 20
<210> 1416
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1416
guggaaaaca augagggacg 20
<210> 1417
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1417
gccaggcgcc ugaaacgacg 20
<210> 1418
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1418
ucgauacuua uaucgaccug 20
<210> 1419
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1419
aggauaaugg ccccgugauc 20
<210> 1420
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1420
ucauuaucga gcuggcuagg 20
<210> 1421
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1421
aaccuacuau gagggaccag 20
<210> 1422
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1422
acaaugaggg acggagaagc 20
<210> 1423
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1423
ugaagugaau agcaagugcu 20
<210> 1424
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1424
auucucugga ggccaucccc 20
<210> 1425
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1425
cugaagaaag auggcgaggu 20
<210> 1426
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1426
uggcgaacug uauaggguca 20
<210> 1427
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1427
uacuaugagg gaccaggaga 20
<210> 1428
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1428
caauuguuuu gauaauucga 20
<210> 1429
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1429
gcugagugga auuaauccuu 20
<210> 1430
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1430
cugcugcacc uggcuaagcg 20
<210> 1431
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1431
ccagagcucc gaggacaucc 20
<210> 1432
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1432
aauugucgaa ggacacgcuu 20
<210> 1433
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1433
uauaucgacc ugcuggagac 20
<210> 1434
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1434
agcugaucaa caaaaguccc 20
<210> 1435
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1435
agaagaacag caaggacgca 20
<210> 1436
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1436
uggagaacca gauguucgaa 20
<210> 1437
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1437
agauugcaau cuuuaaccgg 20
<210> 1438
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1438
uucucuggag gccauccccc 20
<210> 1439
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1439
aaugagggac ggagaagcaa 20
<210> 1440
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1440
uccuugauau gcuugaucug 20
<210> 1441
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1441
gggacauugc accuauuuuc 20
<210> 1442
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1442
aagugaucaa cgccaucauc 20
<210> 1443
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1443
gcugcaccug gcuaagcgcc 20
<210> 1444
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1444
ggaacggcug aagaaagaug 20
<210> 1445
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1445
ccuugauguc uuuccauccg 20
<210> 1446
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1446
ggaggccaac guggaaaaca 20
<210> 1447
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1447
acggcggguu cacaucuuuu 20
<210> 1448
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1448
gaggucgauc auauuauccc 20
<210> 1449
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1449
ucgaacagau uaguaaucug 20
<210> 1450
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1450
caaugaucug cugaaccgca 20
<210> 1451
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1451
ccugacuauc uaccagagcu 20
<210> 1452
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1452
acgagaaacu ggaauacuau 20
<210> 1453
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1453
cgcaggcguc agacuguuca 20
<210> 1454
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1454
auuccuugau gucuuuccau 20
<210> 1455
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1455
ccggcagacc aaugaacgca 20
<210> 1456
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1456
agaaucugga ugucaucaaa 20
<210> 1457
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1457
ugcuaaggag auccugguca 20
<210> 1458
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1458
aguacuugau cuucuugauc 20
<210> 1459
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1459
auaucauuau cgagcuggcu 20
<210> 1460
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1460
aaaucaagcu gcacgauaug 20
<210> 1461
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1461
cagagcugca gcuggaacgg 20
<210> 1462
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1462
gaacccacug uauaaguacu 20
<210> 1463
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1463
ugaucacuuu gaugcucugg 20
<210> 1464
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1464
gcugaacaau ccauucaacu 20
<210> 1465
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1465
caucuuuucu gaggcgcaaa 20
<210> 1466
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1466
gccgcaucag caagaccaaa 20
<210> 1467
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1467
aucagaaacu gaagcugauu 20
<210> 1468
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1468
auccucagac auaucagaaa 20
<210> 1469
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1469
acgcaggcgu cagacuguuc 20
<210> 1470
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1470
ccuuguuguu aaaggaauug 20
<210> 1471
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1471
cucacgcaau agcaaagcuc 20
<210> 1472
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1472
caaaugccga cuucaucuuu 20
<210> 1473
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1473
uuauggagca guacggcgac 20
<210> 1474
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1474
gcuuuuucca cuccuuaaag 20
<210> 1475
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1475
ucaucgaaaa cguguuuaag 20
<210> 1476
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1476
ccagggugaa aggccugagu 20
<210> 1477
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1477
gguuaauaaa auccuucugg 20
<210> 1478
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1478
acaagguggu caagcuguca 20
<210> 1479
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1479
gagaaccuac uaugagggac 20
<210> 1480
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1480
caaaggguac aagcaccaug 20
<210> 1481
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1481
aacguggaaa acaaugaggg 20
<210> 1482
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1482
uucugggaaa ccuguaugag 20
<210> 1483
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1483
ugagggacgg agaagcaaga 20
<210> 1484
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1484
caagacaagc gacuacguca 20
<210> 1485
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1485
ggagccaggc gccugaaacg 20
<210> 1486
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1486
acaucaacag auucuccguc 20
<210> 1487
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1487
ugaacuagac agguacugga 20
<210> 1488
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1488
cuacacugaa acagauugcu 20
<210> 1489
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1489
gacggagaag gcacagaauc 20
<210> 1490
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1490
cuuuuugaua cucugagucu 20
<210> 1491
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1491
uggacaaagc caagaaagug 20
<210> 1492
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1492
auucugucac ccguggucaa 20
<210> 1493
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1493
auaguacaag aaaagacgau 20
<210> 1494
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1494
ccugaacagc gagcugaccc 20
<210> 1495
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1495
gaggcaauug uuuugauaau 20
<210> 1496
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1496
aaucaggucg uuguuguaaa 20
<210> 1497
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1497
gcaauuguuu ugauaauucg 20
<210> 1498
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1498
ggcgcaaaug gaaguuuaaa 20
<210> 1499
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1499
ucgagacaga acaggaguac 20
<210> 1500
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1500
ccaagcagcu gcugaaagug 20
<210> 1501
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1501
uggacaucgg gauuacaagc 20
<210> 1502
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1502
gaaggcacag aauccagagg 20
<210> 1503
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1503
uaaggagauc cuggucaacg 20
<210> 1504
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1504
uaaucagguc guuguuguaa 20
<210> 1505
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1505
ggauuguuca gcagguccuc 20
<210> 1506
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1506
gcauaacguc aaugaggugg 20
<210> 1507
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1507
ggagacucgg agaaccuacu 20
<210> 1508
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1508
ccugagucag aagcugucag 20
<210> 1509
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1509
ugcccgaaau cgagacagaa 20
<210> 1510
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1510
ggtgagugag ugugugcgug 20
Claims (102)
- (a) Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및 제1 가이드 RNA(gRNA) 분자를 암호화하는 핵산; 및
(b) 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하는 지배적인 (governing) gRNA 분자를 포함하는,
CRISPR/Cas 시스템의 구성요소를 침묵시키기 위한 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA 분자는, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시켜 CRISPR/Cas 시스템의 구성요소를 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
(i) Cas9 분자 및 제1 gRNA 분자는 표적 핵산을 절단하는 복합체를 형성하고,
(ii) Cas9 분자 및 지배적인 gRNA 분자는, Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및/또는 제1 gRNA를 암호화하는 핵산을 절단하여 침묵시키는 복합체를 형성하고,
(iii) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은,
제1 gRNA를 암호화하는 핵산에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인; 및
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물. - 제1항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는, 조성물:
(a) Cas9 분자가 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자 또는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자임; 및
(b) 제1 gRNA가 키메라 gRNA 또는 모듈(modular) gRNA임. - 제1항에 있어서, 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제4항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는, 조성물:
(a) 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산이 제2 벡터에 의해 운반됨; 및
(b) 제1 벡터가 바이러스 벡터 또는 AAV 벡터임. - 제1항에 있어서, 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자 및 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
- Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산 및 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템; 및
상기 Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하는 지배적인 gRNA 분자를 포함하는,
표적 핵산을 변경시키기 위한 조성물로서, 여기서 CRISPR/Cas 시스템은 표적 핵산과 접촉되고, 상기 지배적인 gRNA 분자는, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하고, CRISPR/Cas 시스템은 상기 지배적인 gRNA 분자에 의해 침묵되는, 조성물. - 제7항에 있어서, 상기 Cas9 분자 및 지배적인 gRNA가 Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 절단하여 표적 핵산의 변경을 침묵시키는 복합체를 형성하는 것인 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은,
제1 gRNA를 암호화하는 핵산에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인; 및
Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물. - 제7항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는, 조성물:
(a) Cas9 분자가 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자 또는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자임; 및
(b) 제1 gRNA가 키메라 gRNA 또는 모듈(modular) gRNA임. - 제7항에 있어서, 상기 Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산이 제2 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제7항에 있어서, 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자 및 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
- Cas9을 암호화하는 제1 핵산;
진핵 세포의 게놈 내의 서열을 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 제2 핵산; 및
Cas9을 암호화하는 핵산을 표적화하는 지배적인 gRNA를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는,
진핵 세포에서 CRISPR/Cas 시스템의 Cas9를 불활성화하기 위한 조성물로서,
상기 제1, 제2 및 제3 핵산은 진핵 세포와 접촉되고, 상기 접촉은 Cas9, 제1 gRNA 및 지배적인 gRNA의 발현을 유도하고,
상기 Cas9 및 지배적인 gRNA는 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 제1 핵산을 절단하여 제1 핵산을 불활성화시키고 CRISPR/Cas 시스템의 Cas9 성분을 불활성화시킬 수 있는, 조성물. - 제14항에 있어서, 제1 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제15항에 있어서, 제2 핵산이 제2 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제14항에 있어서, Cas9을 암호화하는 핵산 및 지배적인 gRNA를 암호화하는 핵산이 동일한 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- (a) 진핵 세포의 핵산을 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 핵산;
(b) Cas9 분자를 암호화하는 핵산; 및
(c) 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는,
진핵 세포에서 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 침묵시키기 위한 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA 분자는
(i) Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 또는
(ii) 제1 gRNA를 암호화하는 핵산
을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고,
상기 (a), (b), 및 (c)에 기재된 핵산은 진핵 세포와 접촉되고, 상기 Cas9 분자 및 지배적인 gRNA는 (i) 또는 (ii)를 절단하는 복합체를 형성하여 진핵 세포에서 CRISPR/Cas 시스템의 성분을 침묵시키는, 조성물. - 제18항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은 (i) 또는 (ii)로 조작된 핵산 서열을 표적화하는 것인, 조성물.
- 제18항에 있어서,
(a) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(b) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(c) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(d) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(e) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(f) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(g) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(h) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 제1 gRNA를 암호화하는 핵산에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인인, 조성물. - 제18항에 있어서, 지배적인 gRNA가 Cas9 및/또는 제1 gRNA을 암호화하는 핵산에서 자연 발생 서열을 표적화하는, 조성물.
- Cas9 분자를 암호화하고 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산으로서,
상기 Cas9 분자는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자이고,
상기 지배적인 gRNA 분자는 (i) 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 (ii) 제1 gRNA를 암호화하는 핵산을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고,
상기 지배적인 gRNA는 Cas9 분자와 복합체화하여 (i) 또는 (ii)를 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하고, 상기 지배적인 gRNA는 절단을 위해 (i) 또는 (ii)를 표적화하는 서열을 갖고,
상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드인, 핵산. - 제22항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 (i) 또는 (ii)로 조작된 핵산 서열을 표적화하는, 핵산.
- (a) 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자인 Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 및 제1 가이드 RNA(gRNA) 분자를 암호화하는 핵산; 및
(b) 상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 상기 핵산을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하는 지배적인 gRNA 분자를 포함하는, 조성물로서,
(i) 제1 gRNA 분자는 표적 핵산을 표적화하는 서열을 포함하고,
(ii) 지배적인 gRNA 분자는 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA를 암호화하는 핵산을 표적화하는 서열을 포함하고,
(iii) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열 또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산의 gRNA 분자-암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인; 및
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
상기 지배적인 gRNA 분자가, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하는, 조성물. - 제24항에 있어서,
(a) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열 또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산의 gRNA 분자-암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(b) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(c) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(d) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(e) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(f) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(g) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인인, 조성물. - 제24항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는, 조성물:
(a) 지배적인 gRNA가 Cas9 및/또는 제1 gRNA를 암호화하는 핵산에서 자연 발생 서열을 표적화함,
(b) 제1 gRNA가 키메라 gRNA 또는 모듈(modular) gRNA임,
(c) 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인의 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 또는 20 내지 30개의 뉴클레오타이드임. - 제24항에 있어서, 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제27항에 있어서, 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산이 제2 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산으로서, 상기 Cas9 분자가 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자인 제1 핵산; 및
지배적인 gRNA 분자 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 조성물로서,
지배적인 gRNA 분자가, 상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산 및/또는 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인의 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드이며,
지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열 또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산의 gRNA 분자-암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인; 및
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
상기 지배적인 gRNA 분자가, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및/또는 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하는, 조성물. - 제29항에 있어서, 제1 gRNA가 키메라 gRNA 또는 모듈 gRNA인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 상기 Cas9 분자를 암호화하는 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제31항에 있어서, 상기 제1 gRNA 분자를 암호화하는 핵산이 제2 벡터에 의해 운반되는 것인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 세포 또는 대상체의 게놈 내의 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자 및 세포의 게놈 내의 서열을 표적화하는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 핵산 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제29항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산, 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 제2 핵산으로 조작된 핵산 서열을 표적화하는, 조성물.
- Cas9 분자를 암호화하는 제1 핵산으로서, 상기 Cas9 분자가 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자인, 제1 핵산;
게놈 내의 서열을 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 제2 핵산; 및
상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산을 표적화하는 지배적인 gRNA를 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA는, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA를 의미하고, 상기 지배적인 gRNA는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하는, 조성물. - 제35항에 있어서, 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 조성물:
(a) 제1 핵산이 제1 벡터에 의해 운반되거나,
(b) 제2 핵산이 제2 벡터에 의해 운반되거나,
(c) Cas9 분자를 암호화하는 핵산 및 지배적인 gRNA를 암호화하는 핵산이 동일한 벡터에 운반됨. - (a) 진핵 세포의 핵산을 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 핵산; 및
(b) 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자인 Cas9 분자를 암호화하고, 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA 분자가
(i) 상기 Cas9 분자를 암호화하는 상기 핵산, 또는
(ii) 상기 제1 gRNA를 암호화하는 상기 핵산
을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고,
상기 지배적인 gRNA는, Cas9 분자와 복합체화하여 (i) 또는 (ii)를 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하고,
상기 지배적인 gRNA가 절단을 위해 (i) 또는 (ii)를 표적화하는 서열을 갖는, 조성물. - 제37항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인은 (i) 또는 (ii)로 조작된 핵산 서열을 표적화하는 것인, 조성물.
- 지배적인 gRNA 분자를 포함하는 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA 분자가, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9 분자 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자를 암호화하는 핵산; 및/또는 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산;을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고,
상기 지배적인 gRNA 분자는, Cas9 분자와 복합체화하여 상기 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 또는 상기 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하는, 조성물. - 제39항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인의 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드인, 조성물.
- 제40항에 있어서, 상기 지배적인 gRNA의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:
스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인; 및
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인. - 제40항에 있어서,
(a) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(b) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(c) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(d) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(e) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 3'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(f) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 프로모터 영역에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인으로서, 상기 프로모터 영역은 Cas9 분자 아미노산 암호화 영역에 기능적으로 연결되는, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이거나,
(g) 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인인, 조성물. - 제40항에 있어서, 지배적인 gRNA가 Cas9을 암호화하는 핵산에서 자연 발생 서열을 표적화하는, 조성물.
- 지배적인 gRNA 분자 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 조성물로서,
상기 지배적인 gRNA는, 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 분자를 암호화하는 핵산; 및/또는 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산;을 표적화하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인을 포함하고,
상기 지배적인 gRNA 분자는, Cas9 분자와 복합체화하여 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산 또는 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산을 불활성화하거나 침묵시킬 수 있는 gRNA 분자를 의미하는, 조성물. - 제44항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인의 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오타이드인 조성물.
- 제44항에 있어서, 지배적인 gRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:
스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산을 표적화하는 gRNA 분자를 암호화하는 핵산에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
핵산 서열의 Cas9 분자-아미노산 암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비암호화 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 비번역 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 Cas9 분자-암호화 영역의 5'에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인;
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Cas9 분자를 암호화하는 핵산의 인트론 서열에서 Cas9 분자-매개 절단 사건을 제공하는 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인. - 제44항에 있어서, (a) 지배적인 gRNA가 Cas9 분자를 암호화하는 핵산에서 자연 발생 서열을 표적화하거나, (b) 뉴클레오타이드 서열 표적화 도메인이 스타필로코커스 아우레우스 또는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 분자를 암호화하는 핵산, 지배적인 gRNA 분자, 또는 지배적인 gRNA 분자를 암호화하는 제2 핵산으로 조작된 핵산 서열을 표적화하는, 조성물.
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