UA123532C2 - Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву - Google Patents

Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву Download PDF

Info

Publication number
UA123532C2
UA123532C2 UAA201509935A UAA201509935A UA123532C2 UA 123532 C2 UA123532 C2 UA 123532C2 UA A201509935 A UAA201509935 A UA A201509935A UA A201509935 A UAA201509935 A UA A201509935A UA 123532 C2 UA123532 C2 UA 123532C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
double
recognition site
dna
strand break
nucleotide
Prior art date
Application number
UAA201509935A
Other languages
English (en)
Inventor
Стефан Дешамп
Стэфан Дэшамп
Джеймс Інгліш
Джэймс Инглиш
Жонгсен Лі
Жонгсен Ли
Віктор Ллака
Виктор ЛЛАКА
Джошуа К. Янг
Original Assignee
Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані
Э. И. Дю Пон Де Немур Энд Компани
Пайанір Хай-Бред Інтернешнл, Інк.
Пайанир Хай-Брэд Интэрнэшнл, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані, Э. И. Дю Пон Де Немур Энд Компани, Пайанір Хай-Бред Інтернешнл, Інк., Пайанир Хай-Брэд Интэрнэшнл, Инк. filed Critical Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані
Publication of UA123532C2 publication Critical patent/UA123532C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Abstract

Винахід стосується способу ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання, причому зазначений спосіб включає (a) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення двониткового розриву в розпізнавання зазначену геному ДНК, де двонитковий розрив приводить у результаті до утворення нуклеотидного липкого кінця; (b) лігування першого адаптера із зазначеним нуклеотидним липким кінцем; (c) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (b), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; (d) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (с), з еталонною геномною послідовністю ДНК, та (e) ідентифікацію варіантного сайта розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву. Винахід також стосується способу ідентифікації варіантного сайта розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання.

Description

також стосується способу ідентифікації варіантного сайта розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання.
Дана заявка заявляє пріоритет на підставі заявки на патент США із серійним номером 61/777238, поданої 12 березня 2013 року, яка включена в даний документ як посилання у всій своїй повноті.
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. Більш конкретно, даний винахід відноситься до способів ідентифікації й застосування варіантних сайтів розпізнавання для сконструйованих засобів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву.
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
Технологія рекомбінантних ДНК уможливила вбудовування чужорідних послідовностей ДНК у геном організму, таким чином, змінюючи фенотип організму. Найбільше широко використовувані способи трансформації рослин являють собою інфікування за допомогою
Адгобасієтіит і бомбардування частинками в ході балістичної трансформації, при якій трансгени інтегруються в геном рослини випадковим чином і з непрогнозованим числом копій. Таким чином, мають місце спроби контролю інтеграції трансгенів у рослини.
Були розроблені способи введення або модифікації послідовності ДНК у геномі ряду організмів, і вони можуть включати методики сайт-специфічної інтеграції, які грунтуються на гомологічній рекомбінації (патент США Мо 7102055, виданий 05 вересня 2006 року) або сконструйованих ендонуклеазах, таких як мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці" або ТА ЕМ (публікація патенту США 2009-0133152 АТ, опублікованого 21 травня 2009 року).
Хоча ці системи забезпечили корисні методики для цілеспрямованої вставки послідовностей, які представляють інтерес, залишається потреба в ідентифікації більшої кількості сайтів розпізнавання для засобів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву та в ідентифікації сайтів розпізнавання з підвищеною активністю щодо засобів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Передбачаються композиції та способи, у яких використовуються варіантні сайти розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання.
Зо Передбачаються способи ідентифікації варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання. Один спосіб включає: а) контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення двониткового розриву у вказану геномну
ДНК, де двонитковий розрив у результаті призводить до утворення нуклеотидного липкого кінця, р) лігування першого адаптера із вказаним нуклеотидним липким кінцем, с) розрізання лігованої
ДНК, отриманої на стадії (Б), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації і секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив, 4) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів
ДНК, отриманих в (с), з еталонною послідовністю геномної ДНК; та є) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить заміну щонайменше по одному нуклеотиду (або нуклеотидній основі) в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання вказаного сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву. Інший спосіб включає спосіб ідентифікації варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому вищезазначений спосіб включає: а) контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення двониткового розриву у вказану геномну ДНК, де двонитковий розрив у результаті призводить до утворення тупого кінця; б) створення нуклеотидного липкого кінця з тупого кінця з (а); с) лігування першого адаптера з нуклеотидним липким кінцем з (Б); 4) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (с) і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації й секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; е) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (4), з еталонною геномною послідовністю ДНК і Її) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить заміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання вказаного сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву.
Сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву можна вибрати із групи, що складається з мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці", ТАЇ -ефекторної бо нуклеази, транспозази, ендонуклеази Саз і сайт-специфічної рекомбінази. Нуклеотидний липкий кінець може являти собою 3'- або 5'--чуклеотидний липкий кінець.
Крім того, передбачаються способи ідентифікації варіантного сайту розпізнавання з підвищеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання. Про підвищену активність сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву свідчать а) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на геномній ДНК; Б) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на плазмідній ДНК; с) вища оцінка в аналізі на дріжджах для варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання; або 4) будь-яка комбінація з (а), (Б) і (с).
Також передбачаються способи націлювання вставки полінуклеотиду, який представляє інтерес, на конкретний хромосомний сайт у геномі рослини, причому зазначений спосіб включає: а) трансформацію рослинної клітини або рослини фрагментом ДНК, що містить полінуклеотид, який представляє інтерес, де зазначений геном зазначених рослинної клітини або рослини містить щонайменше один варіантний сайт розпізнавання, вибраний із групи, що складається з 5БЕО ІЮ МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20 ї 21 або 5ЕО ІО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35; і 5) забезпечення наявності мегануклеази, здатної забезпечити двонитковий розрив у варіабельному сайті розпізнавання з (а); і с) відбір зазначеної рослинної клітини або рослини, що містять зазначений полінуклеотид, який представляє інтерес, інтегрований у зазначений варіантний сайт розпізнавання.
Різні композиції включають рослину, насіння або рослинну клітину, що містить у своєму геномі варіантний сайт розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ І ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Даний винахід може бути зрозумілим повною мірою з наступного детального опису й доданих графічних матеріалів і переліку послідовностей, які утворюють частину даної заявки.
Описи послідовностей і перелік послідовностей включені в якості додатка в даний документ, відповідають правилам, які регулюють розкриття нуклеотидних і амінокислотних послідовностей у патентних заявках, як викладено в 51.821-1.825 розділу 37 С.Е.К. Описи послідовностей містять трьохбуквені коди амінокислот, як визначено в 551.821-1.825 розділу 37 С.Р.К., які включені в даний документ як посилання.
Фігура 1. (А) Сигнатура піка для геномного сайту розпізнавання у зразку, обробленому мегануклеазою. Нанесені на карту дані послідовності починаються із сайту розщеплення й повертаються до нього. Напрямок нанесених на карту зчитувань вказується у вигляді накопичень і показане стрілками. (В) Порожній контроль не містить сигнатури, яка відповідає збагаченню або піку, як спостерігалося для обробленого зразка.
Фігура 2. Перекриття 4 основ у сигнатурі піка сайту розпізнавання відповідає липкому кінцю, створеному мегануклеазою, і визначає послідовність геномного варіантного сайту розпізнавання. Пунктирна лінія визначає липкі кінці, отримані при розщепленні сайту розпізнавання.
Фігура 3. Відсотковий склад основ у ДНК орієнтованих геномних варіантів сайтів розпізнавання. Переважно сторонні нуклеотиди обведені, тоді як основи припустимого сайту розпізнавання заштриховані. (А) Склад основ ДНК 30 геномних варіантних сайтів розпізнавання мегануклеазою І ід3-4. Припустимий сайт розпізнавання 1 І(53-4 (5ЕО ІЮ МО:13) показаний внизу фігури ЗА. (В) Склад основ ДНК 254 геномних варіантних сайтів розпізнавання мегануклеазою
МНРІ45. Припустимий сайт розпізнавання МНР14-- (ЗЕО ІЮО МО:14) показаний знизу фігури ЗВ.
Фігура 4. А) Вирівнювання припустимого сайту розпізнавання для мегануклеази І 1І(53-4 і варіантних сайтів розпізнавання 1 І(53-4. Переважно сторонні нуклеотиди (підкреслені) вводили в припустимий сайт розпізнавання І І53-4 окремо (що призводило до створення варіантних сайтів розпізнавання -11С, -7С, -20, -1Т, «8Т, що відповідають 5ЕО ІЮО МО: 15-19) і в комбінації (що призводило до створення варіантних сайтів розпізнавання, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:20- 22). В) Вирівнювання припустимого сайту розпізнавання для мегануклеази МНР14»-- і варіантних сайтів розпізнавання МНРІ14ж-. Переважно сторонні нуклеотиди (підкреслені) вводили в припустимий сайт розпізнавання МНР14- окремо (що призводило до створення варіантних сайтів розпізнавання -ЗА, -20, -1Т, 2А, 4-7Т, -80, 4112, 411А, що відповідають 5ЕО ІЮ МО: 23- 30) ї в комбінації (що призводило до створення варіантних сайтів розпізнавання, що 60 відповідають 5ЕО ІЮО МО: 31-35).
Фігура 5. Порівняння активності розщеплення плазмідної ДНК між припустимим сайтом розпізнавання та припустимими сторонніми нуклеотидами, поміщеними окремо в припустимий сайт розпізнавання для (А) мегануклеази І ідЗ3-4 і (В) мегануклеази МНР 14... Відсоток активності розщеплення припустимого сайту розпізнавання позначений пунктирною лінією. У якості контролю також аналізували щонайменше дві основи, відмінні від відсоткового складу основ
ДНК у геномних варіантних сайтах розпізнавання.
Фігура 6. Порівняння активності розщеплення плазмідної ДНК між припустимим сайтом розпізнавання й переважно сторонніми нуклеотидами, поміщеними в комбінації в припустимий розпізнавання для (А) мегануклеази І ідз3-4 і (В) мегануклеази МНР 14 .к.
Фігура 7. Порівняння графіків ампліфікації ПЛР у реальному часі з бібліотек геномних варіантних сайтів розпізнавання для мегануклеази, створених або з фосфорильованими, або з нефосфорильованими біотинильованими адаптерами, що містять повністю вироджений 4- нуклеотидний 3'-липкий кінець.
На фігурі 8 показана діаграма, яка представляє систему скринінгу дріжджів, і яка застосовується для визначення мегануклеазної активності дріжджів. Фрагменти гена, що відповідають першим 1000 нуклеотидам кодуючої послідовності Аде2 дріжджів (5'-ррагмент
Адег) і останнім 1011 нуклеотидам кодуючої послідовності Аде2 дріжджів (3'-ррагмент Адег), роз'єднували за допомогою фрагмента, що містить ген дріжджів игаз (Огаз) та сайти розпізнавання мегануклеазою для 1І-5с61.
На фігурі 9 показана числова шкала й відповідне утворення білих секторів у колоніях дріжджів, які застосовуються для кількісного визначення мегануклеазної активності. Оскільки фенотип утворення секторів є якісним показником мегануклеазної активності, було задіяно числову систему кількісних показників 0-4. Кількісний показник 0 означає, що білі сектори не спостерігалися (було відсутнє розрізання мегануклеазами); кількісний показник 4 означає повністю білі колонії (повне розрізання сайту розпізнавання); кількісні показники 1-3 означають проміжні фенотипи утворення білих секторів (і проміжні ступені розрізання сайту розпізнавання).
Фігура 10. (А) Порівняння активності розщеплення плазмідної ДНК між припустимим сайтом розпізнавання МНР14-- (ЗЕО ІЮ МО: 14), варіантним сайтом розпізнавання МНР 14. (ЗЕО ІЮ МО: 11), який зустрічається в природних умовах у геномі маїсу (мічений варіантний сайт
Зо розпізнавання маїсу), та варіантними сайтами розпізнавання МНР14-- (ЗЕО ІЮ МО: 31-35), які не є ендогенними для генома маїсу. (В) Порівняння відносного числа копій варіантного сайту розпізнавання МНР14-- з 5ЕО ІО МО:11 і припустимого сайту розпізнавання МНР14-- (5ЕО ІЮ
МО: 14) у зрілих зародках маїсу.
Фігура 11. (А) являє собою карту плазміди РНР57712, (В) являє собою карту плазміди
РНРб2552.
ПОСЛІДОВНОСТІ
ЗБО ІЮ МО: 1 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує одноланцюговий поліпептид злиття на основі мегануклеази І /53-4.
ЗБЕО ІЮ МО: 2 являє собою амінокислотну послідовність поліпептиду злиття на основі мегануклеази І І(53-4.
ЗБО ІО МО: 3 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує одноланцюгову мегануклеазу МНР14 к.
ЗЕО ІЮ МО: 4 являє собою амінокислотну послідовність мегануклеази МНР'14 Кк.
ЗБО 10 МО: 5 являє собою онуклеотидну послідовність біотинільованого дефосфорильованого адаптера, сконструйованого з повністю виродженим 4-п.о. 3'-липким кінцем.
ЗЕО ІЮ МО: 6 являє собою нуклеотидну послідовність відновлюючого праймера А.
ЗЕО ІЮ МО: 7 являє собою нуклеотидну послідовність відновлюючого праймера В.
ЗЕО ІЮ МО: 8 являє собою нуклеотидну послідовність Шиптіпа-сумісного адаптера.
ЗЕО ІЮ МО: 9 являє собою нуклеотидну послідовність маркерної послідовності.
ЗБО ІО МО: 10 являє собою комплементарну нуклеотидну послідовність маркерної послідовності з ФЕО ІЮ МО: 9.
ЗЕО ІЮО МО: 11 являє собою нуклеотидну послідовність 5-3" послідовності, показаної на фігурі 2.
ЗЕО ІЮО МО: 12 являє собою нуклеотидну послідовність 3-5" послідовності, показаної на фігурі 2.
ЗЕО ІЮ МО: 13 являє собою нуклеотидну послідовність припустимого сайту розпізнавання для мегануклеази 1 (3-4 (також показано на фігурі ЗА і фігурі 4).
ЗЕО ІЮ МО: 14 являє собою нуклеотидну послідовність припустимого сайту розпізнавання бо для мегануклеази МНР14-- (також показано на фігурі ЗВ і фігурі 4).
ЗЕО І МО:15-22 являють собою нуклеотидні послідовності варіантних сайтів розпізнавання для мегануклеази І (3-4.
ЗЕО Ір МО:23-36 являють собою нуклеотидні послідовності варіантних сайтів розпізнавання для мегануклеази МНР14 к.
ЗЕО ІЮ МО: 36 являє собою нуклеотидну послідовність гена Адег2 дріжджів.
ЗЕО ІЮ МО: 37 являє собою нуклеотидну послідовність припустимого сайту розпізнавання для мегануклеази М526.
ЗЕО ІЮ МО: 38 являє собою нуклеотидну послідовність плазміди РНР57712.
ЗЕО ІЮ МО: 39 являє собою нуклеотидну послідовність плазміди РНРб2552
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід тепер буде більш докладно описаний нижче в даному документі з посиланням на додані графічні матеріали, на яких показані деякі, але не всі варіанти здійснення даного винаходу. У дійсності, даний винахід можна здійснювати в багатьох різних формах і його не слід розглядати як обмежене варіантами здійснення, викладеними в даному документі; скоріше дані варіанти здійснення представлені для того, щоб дане розкриття відповідало вимогам чинного законодавства. Однакові числа відносяться до однакових елементів по всьому документу.
Фахівцю в даній області, до якої відноситься даний винахід, спаде на думку безліч модифікацій та інших варіантів здійснення даного винаходу, викладеного в даному документі, при використанні ідей, представлених у вищенаведеному описі та супутніх графічних матеріалах. Таким чином, слід розуміти, що даний винахід не повинен обмежуватися конкретними розкритими варіантами здійснення, і мається на увазі, що в прикладену формулу винаходу включені модифікації та інші варіанти здійснення. Хоча в даному документі використовуються спеціальні вирази, вони використовуються тільки в загальному та описовому сенсі, а не з метою обмеження.
Всі публікації та заявки на патент, згадані в даному описі, орієнтовані на рівень фахівця в даній області, до якої відноситься даний винахід. Всі публікації та заявки на патент включені в даний документ у вигляді посилання тією самою мірою, як якби кожна окрема публікація або заявка на патент конкретно й окремо була включена у вигляді посилання.
Зо Форми однини, які використовуються в даному документі та у докладеній формулі винаходу, включають посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше. Таким чином, наприклад, посилання на "рослину" містить у собі безліч таких рослин; посилання на "клітину" містить у собі одну або кілька клітин та їх еквіваленти, відомі фахівцям у даній області техніки, і так далі.
Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, які застосовуються в даному документі, мають таке ж значення, яке звичайно розуміється середнім фахівцем в області техніки, до якої належить даний винахід. Хоча будь-які способи й матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даному документі, можна застосовувати на практиці для тестування даного винаходу, у даному документі описані конкретні приклади придатних матеріалів і способів.
У контексті даного розкриття використовується ряд термінів і скорочень. Пропонуються наступні визначення.
Як використовується в даному документі, терміни "цільовий сайт", "цільова послідовність", "еномний цільовий сайт" і "геномна цільова послідовність" використовуються в даному документі взаємозамінно й відносяться до послідовності полінуклеотиду в геномі рослинної клітини або дріжджової клітини, яка містить сайт розпізнавання для засобу для індукції двониткового розриву. "Штучний цільовий сайт" являє собою цільову послідовність, яка була введена в геном організму, такого як рослина або дріжджі. Така штучна цільова послідовність може бути ідентичною за послідовністю до ендогенної або нативної цільової послідовності в геномі організму, але може розташовуватися в іншому положенні (тобто неендогенному або ненативному положенні) у геномі організму.
Терміни "ендогенна цільова послідовність" і "нативна цільова послідовність" використовуються взаємозамінно в даному документі для позначення цільової послідовності, яка є ендогенною або нативною стосовно геному хазяїна (такого як рослина або дріжджі) і перебуває в ендогенному або нативному положенні цієї цільової послідовності в геномі хазяїна (такого як рослина або дріжджі).
Термін "засіб для індукції двониткового розриву", який використовується у даному документі, відноситься до будь-якої нуклеази, яка робить двонитковий розрив у цільовій послідовності. бо Одержання двониткового розриву в цільовій послідовності або інший ДНК можна назвати в даному документі "розрізанням" або "розщепленням" цільової послідовності або іншої ДНК.
Термін "засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву", який використовується у даному документі, відноситься до будь-якої нуклеази, яка робить двонитковий розрив у цільовій послідовності, але в рідких випадках ріже (на відміну від рестрикційних ферментів, наприклад) у геномі організму. Засоби, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву, включають без обмеження ендонуклеази, такі як мегануклеази (заявка на патент США 2332 і ВВ1990), нуклеази "цинкові пальці" (Кіт, У. (5., У. Спа, еї аї. (1996). "Нубгіа гезігісіоп епгутев: 7іпс Ппдег тТивіоп5 о Рок І сієаладе), ендонуклеази Са5 (заявка МО 2007/025097, опублікована 1 березня 2007 року) і ТАГЕМ (СнНгізійап, М., Т. Септак, сеї аї. 2010.
Тагдейпд ОМА доцбріе-5ігапа бБгеаке м/йй ТА ейесіог писівазе5. Степеїйсв 186(2): 757-61).
Розщеплення ендонуклеазами, що рідко розщеплюють, звичайно призводить до утворення "липких" кінців з З''липкими кінцями для мегануклеаз ГАС ІВАра (Спемаїіег, В. 5. апа В. Її. зіоддага. 2001. Нотіпуд епдописієавзев: вігисіига! апа їТпсіопа! іпвідні іпіо Ше саїаїувів ої іпікоп/іпієїп тобріїйу. Мисівїс Асід5 Не5 29(18): 3757-74) і 5'-"липкими кінцями для нуклеаз "цинкові пальці" (тій, у., М. Вірікома, єї аІ. 2000, Ведцігетепів ог дошбієе-5ігтапа сіваладе Бу спітетіс гезійсйоп епгутев5 п 2іпс їпдег ЮОпа-гесодпійоп дотаїіп5. Мисівєїс Асіа5 Не5 28(17): 3361-9).
ТАЇ Е-нуклеази на основі ЕокКіІ (ТАГЕМ) характеризуються функціональною схемою, подібної до нуклеаз "цинкові пальці", причому ДНК-зв'язуючий домен "цинкові пальці" замінений на домен
ТАГЕ (Ії, Т., 5. Ниапо, єї а). 2011. ТАЇ писівазе5 (ТАЇМв5): пубгід ргоїєїп5 сотрозей ої ТА. еМесіогз апа Роккі Опа-сієамаде дотаїп. Мисієвїс Асідз Нез 39(1): 359-72; Спгівзіап, М., Т. Септак, еї аІ. 2010). Розщеплення ендонуклеазами Савз, такими як ендонуклеази Са59, може призводити до тупих кінців. "Ендонуклеаза" відноситься до ферменту, який розщеплює фосфодіефірний зв'язок у полінуклеотидному ланцюзі.
Ендонуклеази включають рестрикційні ендонуклеази, які розщеплюють ДНК у конкретних сайтах без ушкодження основ. Рестрикційні ендонуклеази включають ендонуклеази типу І, типу
ІЇ, типу ПІ ї типу ІМ, які додатково включають підтипи. У системах типу І ї типу І ферментативні активності як метилази, так і рестриктази об'єднані в єдиний комплекс.
Рестрикційні ендонуклеази типу І і типу ІП розпізнають специфічні сайти розпізнавання, але,
Зо як правило, розщеплюють у положенні, відмінному від сайту розпізнавання, яке може бути розташованим на відстані сотень пар основ від сайту розпізнавання. У системах типу ЇЇ рестрикційна активність не залежить від будь-якої метилазної активності, і розщеплення зазвичай відбувається в конкретних сайтах (або точках) у межах сайту розпізнавання або біля нього. Більшість ферментів типу ІЇ розрізають паліндромні послідовності, однак ферменти типу
Па розпізнають непаліндромні сайти розпізнавання й роблять розщеплення за межами сайту розпізнавання; ферменти типу ІБ роблять розрізання послідовностей двічі, причому обидва сайти перебувають за межами сайту розпізнавання; і ферменти типу 5 розпізнають асиметричний сайт розпізнавання й роблять розщеплення з одного боку і на певній відстані від сайту розпізнавання, яка становить приблизно 1-20 нуклеотидів. Ферменти рестрикції типу ЇМ цілеспрямовано діють на метильовану ДНК. Ферменти рестрикції додатково описані й класифіковані, наприклад, у базі даних КЕВАЗЕ (веб-сторінка на геразе.пер.сот; Кобегів еї аї., (2003) Мисівїс Асід5 Нез 31:418-20), Нобретіз сеї аї., (2003) Мисівїс Асіаз Нез 31:1805-12; і Вемогі еї а!., (2002) в Мобріїе ОМА Ії, рр. 761-783, Едв. Стгаїдіє еї а!., (АЗ5М Ргезз, УМазпіпдіоп, ОС). "Сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву" відноситься до будь-якого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, який є сконструйованим (модифікованим або похідним) у порівнянні з його нативною формою для специфічного розпізнавання необхідного сайту розпізнавання та індукції двониткового розриву в ньому. Таким чином, сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, можна одержати з нативної, що зустрічається в природних умовах, нуклеази, або його можна штучно створити або синтезувати. Нуклеаза може модифікуватись всього лише по одному нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву індукує двонитковий розрив у сайті розпізнавання, при цьому сайт розпізнавання не являвся послідовністю, яка повинна була бути розпізнаною нативним (несконструйованим або немодифікованим) засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву. Одержання двониткового розриву в сайті розпізнавання або інший ДНК можна назвати в даному документі "розрізанням" або "розщепленням" сайту розпізнавання або іншої ДНК. "Мегануклеаза" відноситься до хомінг-ендонуклеази, яка, подібно до рестрикційних ендонуклеаз, зв'язується з конкретним сайтом розпізнавання й розрізає його, однак сайти 60 розпізнавання для мегануклеаз звичайно є більшими, маючи розмір приблизно 18 п.о. або більше. У деяких варіантах здійснення даного винаходу мегануклеаза була сконструйована (або модифікована) для розрізання конкретної ендогенної послідовності розпізнавання, де ендогенна цільова послідовність перед розрізанням за допомогою сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву, не була послідовністю, яка повинна була бути розпізнаною нативною (несконструйованою або немодифікованою) ендонуклеазою. "Поліпептид с мегануклеазною активністю" відноситься до поліпептиду, що характеризується мегануклеазною активністю і, отже, здатний робити двонитковий розрив у розпізнаваній послідовності.
Мегануклеази були розподілені на чотири сімейства на основі консервативних мотивів послідовностей, при цьому сімейства являють собою сімейства ГАСГІСАЮС, сІМ-МІС, Н-М-Н і
Ніз-Суз-бокс. Ці мотиви залучені у координацію іонів металів і гідроліз фосфодіефірних зв'язків.
НЕеази прикметні своїми довгими сайтами розпізнавання й тим, що допускають деякі поліморфізми послідовностей у їх ДНК-субстратах. Правила номенклатури мегануклеаз схожі на правила для інших рестрикційних ендонуклеаз. Мегануклеази також характеризують за префіксом Е-, І- або РіІ- для ферментів, які кодуються автономними відкритими рамками зчитування, інтронами та інтеїнами, відповідно. Наприклад, мегануклеази від Засспаготусев сегемівіає, які кодуються інтронами, інтеїнами та автономними генами, позначаються І-5сеї, РіІ- зсеї! ії Е-5сеїІ, відповідно. Домени, структура та функції мегануклеаз відомі; див., наприклад,
Синап апа Мипіуарра (2003) Стї Вем Віоспет Мої Віо! 38:199-248; І исаз евї а!., (2001) Мисівїс
Асіаз Ве 29:960-9; дУиїса апа сіодаага, (1999) СеїЇ Мої Ге Зсі 55:1304-26; єодаага, (2006) ОО
Вем Віорпузх 38:49-95; і Моиге еї аїЇ., (2002) Маї Бігисі Віо! 9:764. У деяких прикладах застосовують, варіант, який зустрічається в природі та/або сконструйовану мегануклеазу- похідне. Відомі способи модифікації кінетичних характеристик, взаємодій з кофакторами, експресії, оптимальних умов і/або специфічності відносно сайту розпізнавання та скринінгу відносно активності, див., наприклад, Еріпаї еї аї., (2003) Мисівїс Асіа5 Ке5 31:2952-62; СНемаїїєг еї аї., (2002) Мої! Сеї! 10:895-905; Сиітрбріє еї аї!., (2003) Мої! Віо! 334:993-1008; бЗеїЇдтап еї аї., (2002) Мисівіс Асід5 НКез 30:3870-9; бив5тап еї аї., (2004) ) Мої Віо! 342:31-41; Возеп еї аї., (2006) Мисівіс Асід5 Не 34:4791-800; Спатез еї аї., (2005) Мисівїс Асіає Не5 33:е178; Зтій еї а!., (2006) Мисієїс Асідх Вез 34:е149; Степ еї аї., (2002) Мисієїс Асідв Не5 З0:є29; Спеп апа
Зо 7пао, (2005) Мисієїс Асідх Вез 33'є!154; М/О 2005105989; МО 2003078619; М/О 2006097854; МО 2006097853; УМО 2006097 784 і УМО 2004031346.
У даному документі можна застосовувати будь-яку мегануклеазу, у тому числі, без обмежень, І-5сеї, І-5сеїІ, І-осеїп, І-5сеІМ, І-5сем, І-5семі, І-бсемі!І, І-Сеці, І-СейАПР, І-Стеї, І-
СтерзріР, І-СтервріІР, І-СтеребІПР, І-СтервзріІМР, І-ТІЇ, І-Ррої, РІ-Рері, Е-5сеї, Е-5сеїІ, Б-Бимі, Б-
Темі, Е-Темії, І-Атаї, І-Алії, І-Спиї, І-Стовеї, І-Сраї, І-Сраї!, І-Свті, І-Смиї, І-СмиАЇ!Р, І-раї, І-бай, 1- бі, І1-Отої, І-Нтиї, І-Нтиї, І-Н5МІР, 1-Цаї, І-М5ої, І-Мааї, І-Мапі, І-МеПР, І-МОпР, І-МИ, 1-Цаї, 1-
МераЗбіР, І-РакіІ, І-РБОІР, І-РецР, І-РсиАЇї, І-РсиМміІ, І-РдпР, І-РоОбБІР, І-Ропї, І-РОПІР, І-РБРІР, 1- зрВеїа!ІР, І-зсаї, І-ЗехіІР, І-зпе!ІР, І-5роті, І-зротЕР, І-5ротівР, І-5ротііР, І-ЗДиІР, І-55рбвозІ, 1-
ЗІРНЇР, І-ЄТАРПЇЗТЗР, І-СРНЇЗТезрР, І-Тае!Р, І-Темі, І-Темії, І-ТемП, І-ОагАР, І-ОагНаРАЇР, 1-
ОагаРАТЗР, І-МіпіІР, І-2БІР, РІ-МИШЇ, РІ-МИШНІР, РІ-МІЧНІЇІР, РІ-РІШІ, РІ-РІШІ, РІ-РКої, РІ-РКОЇЇ, РІ-
Ата43812ІР, РІ-5рВеїа!ІР, РІ-5сеї, РІ-ТТШІ, РІ-ТТШІІ, РІ-ТНУЇї, РІ-ТІЇЙ, РІ-ТІЙ, або будь-які їхні активні варіанти або фрагменти. У конкретному варіанті здійснення сконструйована ендонуклеаза походить від І-Сте-Ї, що має послідовність, наведену під ЗЕО ІЮ МО: 15, 21 або 26, або її активного варіанта або фрагмента.
ТАЇ -ефекторні нуклеази являють собою новий клас нуклеаз, специфічних для послідовностей, які можна застосовувати для одержання двониткових розривів у конкретних цільових послідовностях у геномі рослини або іншого організму. ТаІ-ефекторні нуклеази створюють шляхом злиття нативного або сконструйованого ефектора, подібного активатора транскрипції (ТА), або функціональної частини такого, з каталітичним доменом ендонуклеази, такої як, наприклад, РОКІ. Унікальний модульний ДНК-зв'язуючий домен ТА -ефектора створює можливість розробки білків з потенційною специфічністю розпізнавання будь-якої заданої ДНК.
Таким чином, ДНК-зв'язуючі домени ТАЇ -ефекторних нуклеаз можна конструювати для розпізнавання конкретних цільових сайтів ДНК їі, таким чином, застосовувати для отримання двониткових розривів в необхідних цільових послідовностях. Див. УМО 2010/079430; Могбіїгег єї а!І. (2010) РМАБ 10.1073/рпаз.1013133107; 5спої2е в Восі (2010) Мігшепсе 1:428-432; СНгівііап еї а! Сепеїййсв (2010) 186:757-761; 1 ї еї аї. (2010) Мис. Асід5 Невз. (2010) доїі:10.1093/па/дка704; і
МіПегк еї аї. (2011) Маїшге Віоїесппоіоду 29:143-148; всі з яких включені в даний документ як посилання.
Як використовується в даному документі, вираз "ген Са5" відноситься до гена, який, як 60 правило, з'єднаний, зв'язаний або розташований поблизу або поруч із фланкуючими локусами
СВІБРА.
СВІ5РА-локуси (короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами) (також відомі як ЗРІОК - дисперговані повтори) складають сімейство нещодавно описаних локусів ДНК.
СВІ5РА-локуси складаються з коротких та висококонсервативних повторів ДНК (зазвичай від 24 до 40 п.о., що повторюються від 1 до 140 разів, також позначуваних як СКІЗРК-повтори), які є частково паліндромними. Повторювані послідовності (зазвичай специфічні стосовно виду) відділені варіабельними послідовностями постійної довжини (зазвичай від 20 до 58, залежно від
СВІЗРА-локусу (МО 2007/024097, опублікована 1 березня 2007 р.).
СВІЗРА-локуси вперше були ідентифіковані в Е. соїї (Ієпіпо єї аї. (1987) 9. Васівпіа). 169:5429-5433; МаКаїа єї аЇ. (1989) 9. Васієтіаї 171:3553-3556). Подібні розсіяні короткі повторювані послідовності були ідентифіковані в Наіоїегах тедіетапвї, Зігеріососсив5 руодепев,
Апараєпа і Мусобасієгішт шрегсиціовів (Стоепеп єї аї. (1993) Мої. Місгобіо!. 10:1057-1065; Ное єї а!ї. (1999) Єтега. Іптесі. Орів. 5:254-263; Мазеропі еї аї. (1996) Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1307:26-30;
Моїїса єї аІ. (1995) Мої. МістобіоІ. 17:85-93). СВІЗРА-локуси відрізняються від інших 55К структурою повторів, які були названі короткими рівномірно розділеними повторами (5Е5К) (Чапвзеп еї аї. (2002) ОМІСЗ У. Іпієд. Віої. 6:23-33; Моїіса еї аї. (2000) Мої. Містобіо!. 36:244-246).
Повтори являють собою короткі елементи, які зустрічаються в кластерах, які завжди рівномірно розділені варіабельними послідовностями постійної довжини (Моїіса еї а!. (2000) Мої. Місгобіо!. 36:244-246).
Терміни "ген Сав5", "СВІЗБРА-асоційований (Сав) ген" використовуються в даному документі взаємозамінно. Вичерпний огляд щодо сімейства білків Са5 представлений в Наї еї аї. (2005)
Сотршиайопаї! Віоіоду, Ріо5 Сотриї Віо! 1(6): еб0О. дої:10.1371/Лоиптаї. робі.0010060. Як описано в даному документі, описано 41 сімейство СКІЗРК-асоційованих (Са5) генів, крім чотирьох сімейств генів, відомих раніше. Показано, що СКІЗРК-системи належать до різних класів, з різними патернами повторів, наборами генів і сукупностями видів. Число генів Са5 у певному
СВІ5РА-локусі може різнитися між видами.
Термін "ендонуклеаза Сав", який використовується в даному документі, відноситься до білка
Сав5, що кодується геном Сав5, причому зазначений білок Са5 здатний до введення двониткового розриву в цільову послідовність ДНК. Ендонуклеаза Са5 розмотує ДНК-дуплекс поблизу
Зо геномного цільового сайту й розщеплює обидві нитки ДНК після розпізнавання цільової послідовності направляючою РНК, але тільки якщо правильний прилягаючий до протоспейсера мотив (РАМ) приблизно орієнтований на 3'-кінці цільової послідовності.
Термін "направляюча РНК", який використовується у даному документі відноситься до синтетичного злиття двох молекул РНК, сгРНК (РНК СКІЗРЕ), що містить варіабельний направляючий домен, і їасгтРНК. В одному варіанті здійснення направляюча РНК містить варіабельний направляючий домен з послідовностей від 12 до 30 нуклеотидів і фрагмент РНК, який може взаємодіяти з ендонуклеазою Сав.
Вираз "варіабельний направляючий домен" відноситься до нуклеотидної послідовності 5- прим мотиву послідовності ЗОШШОЮО в направляючій РНК, яка є комплементарною одному ланцюгу двониткового цільового сайту ДНК у геномі рослинної клітини, рослини або насіння. В одному варіанті здійснення варіабельний направляючий домен має довжину від 12 до 30 нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення направляюча РНК та ендонуклеаза Саз5 здатні утворювати комплекс, який дозволяє ендонуклеазі Са5 вводити двонитковий розрив у цільовий сайт ДНК.
Термін "сайт розпізнавання", який використовується у даному документі, відноситься до послідовності ДНК, у якій індукується двонитковий розрив у геномі клітини за допомогою засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву. Терміни "сайт розпізнавання", "послідовність розпізнавання" використовуються в даному документі взаємозамінно. Сайт розпізнавання може бути ендогенним сайтом у геномі хазяїна (такого як дріжджі або рослина), або в якості альтернативи, сайт розпізнавання може бути гетерологічним відносно хазяїна (дріжджів або рослини), і, таким чином, не зустрічатися в природі в геномі, або сайт розпізнавання може перебувати в гетерологічному положенні в геномі у порівнянні 3 тим положенням, у якому він перебуває в природі.
Термін "ендогенний сайт розпізнавання", який застосовується у даному документі, відноситься до сайту розпізнавання засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, який є ендогенним або нативним стосовно генома хазяїна (такого як рослина або дріжджі) і розташований в ендогенному або нативному положенні для такого сайту розпізнавання в геномі хазяїна (такого як рослина або дріжджі). Довжина сайту розпізнавання може варіювати, при цьому включені, наприклад, сайти розпізнавання, що мають довжину, що 60 складає щонайменше 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
З2, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, А1, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 або більше нуклеотидів. Крім того, є можливість того, що сайт розпізнавання може бути паліндромним, тобто послідовність однієї нитки читається так само у зворотному напрямку на комплементарній нитці Сайт однониткового розриву/розщеплення може знаходитись в межах послідовності розпізнавання, або сайт однониткового розриву/розщеплення може знаходитись за межами послідовності розпізнавання. В іншому варіанті розщеплення може відбуватися в положеннях нуклеотидів безпосередньо навпроти один одного з одержанням розрізу з тупими кінцями, або, в інших випадках, розрізи можуть бути несиметрично розташованими з одержанням однониткових виступаючих кінців, також названих "липкими кінцями", які можуть бути 5'-липкими кінцями або
З'-липкими кінцями.
Термін "припустимий сайт розпізнавання", який використовується у даному документі, відноситься до послідовності розпізнавання, на яку було спрямовано сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, такий як сконструйована мегануклеаза, для специфічного розпізнавання та індукції двониткового розриву. В одному варіанті здійснення засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву являє собою сконструйовану мегануклеазу ГІ53-4 (ЗЕО ІЮ МО: 2), яка була розроблена для розпізнавання припустимої послідовності розпізнавання ЗЕО ІЮ МО: 13 (публікація заявки на патент США 2009-0133152 АТ, опублікована 21 травня 2009 року). В іншому варіанті здійснення засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву являє собою сконструйовану мегануклеазу МНР14- (5ЕО І
МО: 4), яка була розроблена для розпізнавання припустимої послідовності розпізнавання 5ЕО
ІО МО: 14 (у заявці на патент США 13/427138, поданої 22 березня 2012 року).
Термін "варіантний сайт розпізнавання", який використовується у даному документі, відноситься до варіантної нуклеотидної послідовності, яка містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі у порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання, на який було спрямовано сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, такий як мегануклеаза, для специфічного розпізнавання та індукції двониткового розриву. Така "зміна" включає, наприклад: (І) заміщення щонайменше одного нуклеотиду, (Ії) делецію щонайменше одного нуклеотиду, (ІІ) вставку щонайменше одного нуклеотиду або (ІМ) будь-яку
Зо комбінацію з (1)-(). Активні варіанти й фрагменти сайту розпізнавання можуть характеризуватися щонайменше 65 905, 70 905, 75 90, 80 90, 81 90, 82 90, 83 905, 84 95, 85 90, 86 905, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або більшою ідентичністю послідовності стосовно даної послідовності розпізнавання, при цьому активні варіанти зберігають біологічну активність і, отже, здатні розпізнаватись та розщеплюватись ендонуклеазою. Варіантні сайти розпізнавання можуть містити щонайменше один (1) їі аж до 2, 3, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 переважно сторонніх нуклеотидів. В одному варіанті здійснення варіантні сайти розпізнавання є неендогенними стосовно генома хазяїна, такі варіантні сайти розпізнавання включають без обмеження варіантні сайти розпізнавання маїсу, показані на фігурі 4 (ЗЕО ІО МО: 15-22 ії 5БО ІО МО: 23-35). В іншому варіанті здійснення варіантні сайти розпізнавання присутні в геномі хазяїна (називаються геномними варіантними сайтами розпізнавання) або є ендогенними стосовно генома хазяїна, як наприклад, геноми рослин або дріжджів. У деяких варіантах здійснення варіантні сайти розпізнавання можна ввести в геном рослини за допомогою мутагенезу ендогенної геномної послідовності. Способи сайт-специфічного мутагенезу геномної ДНК відомі на технічному рівні та включають способи, описані, наприклад, у патенті США Мо 5565350, патенті США Мо 5731181 і патенті США Мо 6870075. Інші способи включають застосування нуклеаз "цинкові пальці", як наприклад, ті способи, які описані в публікації патентного документа США 20050208489. "Геномний варіантний сайт розпізнавання" відноситься до варіантного сайту розпізнавання засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, такого як мегануклеаза, який є ендогенним стосовно генома організму (такого як рослина або дріжджі). Одним прикладом варіантного сайту розпізнавання, який є ендогенним стосовно генома маїсу, є зЕО ІЮ МО: 11.
Терміни "переважно сторонні нуклеотиди" або "перевага сторонніх нуклеотидів" можна використовувати взаємозамінно, і вони відносяться до нуклеотидів, які розташовані в тому ж положенні відносно нуклеотидів припустимого сайту розпізнавання, але є більш розповсюдженими в ідентифікованих геномних варіантних сайтах розпізнавання (див., наприклад, поширеність для 81 (80 95) у порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання ї8С (13 95) на фігурі ЗА). У більшості випадків переважно сторонній нуклеотид, коли його поміщають у припустимий сайт розпізнавання, розщеплюється в більшому відсотку випадків, ніж припустимий сайт розпізнавання (див., наприклад, 48 (96 95 розщеплення) у порівнянні з 8 бо (80 95 розщеплення на фігурі 5А).
В одному варіанті здійснення припустима послідовність розпізнавання сконструйованою мегануклеазою 11053-4 містить 5ЕБО ІО МО: 13, тоді як варіантний сайт розпізнавання сконструйованою мегануклеазою 1 І(53-4 містить 5ХЕО ІЮ МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22. В іншому варіанті здійснення припустима послідовність розпізнавання сконструйованою мегануклеазою МНРІ4- містить ЗЕО ІЮ МО: 14, тоді як варіантний сайт розпізнавання сконструйованою мегануклеазою МНР14- містить 5ЕО ІЮО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 або 35. "Локус варіантного сайту розпізнавання" являє собою положення на хромосомі, яка містить варіабельний сайт розпізнавання. Переважно, локус варіантного сайту розпізнавання перебуває в межах 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 або 1000 пар основ від варіантного сайту розпізнавання.
Термін "мегануклеазна активність", який використовується у даному документі, відноситься до здатності мегануклеази робити двонитковий розрив у бажаній послідовності розпізнавання і, таким чином, до збереження активності відносно індукції двониткового розриву. Одержання двониткового розриву в послідовності розпізнавання або іншій ДНК може називатися в даному документі "розрізанням" або "розщепленням" послідовності розпізнавання або іншої ДНК.
Є відомі аналізи мегануклеазної активності, і в них, як правило, вимірюють загальну активність і специфічність мегануклеази на ДНК-субстратах що містять сайти розпізнавання. Ці
ДНК-субстрати включають без обмеження геномну ДНК і плазмідну ДНК. Наприклад, мегануклеазну активність можна виміряти іп міїгто, як описано в даному документі в прикладі З і прикладі 9. Коротко, процедури розщеплення в динаміці можна виконувати при 37 "С, 287С і 23 "С (або будь-якій температурі в діапазоні між 37 "С, 36 "С, 35 "С, 34 "С, 33 С, 32 С, 31 "С, 30 "б,29С,287С,27 С, 26 С, 25 С, 24 70 з 23 "С) іа плазмідній або геномній ДНК, що містить сайт розпізнавання мегануклеазою, і 96 розщеплення в кожному зразку (який також називають до розщеплення або 95 втрати сайтів розпізнавання мегануклеазою, що є показником мегануклеазної активності) можна визначити за допомогою ПЛР у реальному часі.
Мегануклеазну активність також можна виміряти з використанням скринінг-аналізу на дріжджах, який описаний у даному документі (фігури 8 і 9 і приклад 16). Коротко, клітини дріжджів з функціональним геном Адезг2 є білими, тоді як такі, у яких відсутнє функціонування
Зо Аде2, проявляють червоне забарвлення у зв'язку з накопиченням метаболіту на більш ранньому етапі біосинтезу аденіну, що в результаті призводить до утворення червоних колоній з білими секторами. Ступінь утворення білих секторів, що інколи поширюється на цілі колонії, вказує на величину активності розрізання, властивої мегануклеазам. Оскільки фенотип утворення секторів є якісним показником мегануклеазної активності, було задіяно числову систему кількісних показників 0-4. Як показано на фігурі 3, кількісний показник 0 означає, що білі сектори не спостерігалися (було відсутнє розрізання мегануклеазами); кількісний показник 4 означає повністю білі колонії (повне розрізання сайту розпізнавання); кількісні показники 1-3 означають проміжні фенотипи утворення білих секторів (та проміжні ступені розрізання сайту розпізнавання).
Додатково мегануклеазну активність можна вимірювати іп ріапїіа шляхом визначення частоти мутацій у цільовому сайті (Т5). Частота мутацій у цільовому сайті визначається в такий спосіб: (кількість трансгенних об'єктів із модифікацією в цільовому сайті/загальну кількість трансгенних об'єктів)"100 95.
Терміни "підвищена" або "збільшена" активність застосовуються в даному документі взаємозамінно. "Підвищена" або "збільшена" мегануклеазна активність включає будь-яке статистично значиме підвищення активності вихідного поліпептиду з мегануклеазною активністю, обумовлене за допомогою кожного з аналізів активності, описаних у даному документі.
Мегануклеаза може бути надана полінуклеотидом, що кодує ендонуклеазу. Такий полінуклеотид, що кодує ендонуклеазу, можна модифікувати для заміни кодонів, які мають вищу частоту використання в рослині в порівнянні з послідовністю полінуклеотида, який зустрічається в природі. Наприклад, полінуклеотид, що кодує мегануклеазу, можна модифікувати для заміни кодонів з вищою частотою використання в рослині маїсу або сої в порівнянні з послідовністю полінуклеотида, що зустрічається в природі.
Терміни "контрольна мегануклеаза" або "еталонна мегануклеаза" можна використовувати взаємозамінно, і вони відносяться до будь-якої мегануклеази, з якою порівнюють варіантну мегануклеазу. Контрольні мегануклеази можуть включати, без обмежень, вихідні або відповідні мегануклеази або будь-які мегануклеази дикого типу типу І-стгеї.
Нумерація полімеру на основі амінокислот або нуклеотидів, такого як будь-яка мегануклеаза бо по даному винаходу, відповідає нумерації обраного полімеру на основі амінокислот або нуклеїнової кислоти, якщо положення даного мономерного компонента (амінокислотного залишку, включеного нуклеотида і т. д.) полімеру відповідає положенню того ж залишку в обраному еталонному поліпептиді або полінуклеотиді.
Як використовується в даному документі, "ділянка генома, що представляє інтерес" являє собою сегмент хромосоми в геномі рослини, введення полінуклеотиду, що представляє інтерес, або ознаки, що представляє інтерес. Ділянка генома, що представляє інтерес, може включати, наприклад, один або декілька полінуклеотидів, що представляють інтерес. Як правило, ділянка генома, що представляє інтерес, по даному винаходу містить сегмент хромосоми, розмір якого становить 0-15 сантиморганід (СМ).
Термін "полінуклеотид, що представляє інтерес", який використовується в даному документі, "у ділянці генома, що представляє інтерес", являє собою будь-яку, кодуючу та/або некодуючу частину ділянки генома, що представляє інтерес, в тому числі, без обмеження трансгена, нативного гена, мутованого гена і генетичного маркера, такого як, наприклад, маркер однонуклеотидного поліморфізму (ЗМР) і маркер простої повторюваної послідовності (ЗЗК).
Як використовується в даному документі, "фізично зчеплений", "у фізичному зчепленні" і "генетично зчеплений", використовуються для позначення будь-яких двох або більше генів, трансгенів, нативних генів, мутованих генів, змін, цільових сайтів, маркерів і подібного, які є частиною однієї молекули ДНК або хромосоми.
Як застосовується в даному документі, "виділений" полінуклеотид або поліпептид або його біологічно активна частина є по суті або практично вільними від компонентів, що звичайно супроводжують полінуклеотид або поліпептид, або взаємодіючих з ними, які існують в його природному середовищі. Таким чином, виділений або очищений полінуклеотид або поліпептид є по суті вільним від іншого клітинного матеріалу або культурального середовища при одержанні за допомогою методик рекомбінантних молекул або по суті вільними від хімічних попередників або інших хімічних речовин при хімічному синтезі. В оптимальному випадку "виділений" полінуклеотид не містить послідовностей (в оптимальному випадку послідовностей, що кодують білок), які в природних умовах фланкують полінуклеотид (тобто послідовностей, розташованих на 5'"- і 3'-кінцях полінуклеотида) у геномній ДНК організму, з якого отриманий полінуклеотид. Наприклад, у різних варіантах здійснення виділений полінуклеотид може містити нуклеотидну послідовність розміром менш ніж приблизно 5 т.о., 4 т.0о., 3т.0.,2 т.0.,1 т.0.,0,5 т.о. або 0,1 т.о., яка в природних умовах фланкує полінуклеотид у геномній ДНК клітини, з якої отриманий полінуклеотид. Поліпептид, який по суті вільний від клітинного матеріалу, включає препарати поліпептидів, які мають менш ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 95, 5 95 або 1 95 (по сухій вазі) забруднюючого білка. Якщо поліпептид по даному винаходу або його біологічно активна частина отримані рекомбінантним шляхом, то, в оптимальному випадку, у культуральному середовищі представлено менш ніж приблизно 30 95, 20 95, 10 95, 5 95 або 1 95 (по сухій вазі) хімічних попередників або хімічних речовин, які не є білком, який представляє інтерес.
Як застосовується в даному документі, полінуклеотид або поліпептид є "рекомбінантними", якщо вони є штучними або сконструйованими або отримані зі штучних або сконструйованих білка або нуклеїнової кислоти. Наприклад, полінуклеотид, що вставляється у вектор або будь- яке інше гетерологічне положення, наприклад, у геном рекомбінантного організму, так, що він не пов'язаний із нуклеотидними послідовностями, які в природних умовах фланкують полінуклеотид, як це виявляється в природі, є рекомбінантним полінуклеотидом. Поліпептид, що утворився в результаті іп мімо або іп міо експресії рекомбінантного полінуклеотида, є прикладом рекомбінантного поліпептиду. Аналогічно, послідовність полінуклеотида, яка не зустрічається в природі, наприклад, варіант гена, що зустрічається в природі, є рекомбінантною. "Підпослідовність" або "фрагмент" означає будь-яку частину повної послідовності.
Порівняння послідовностей
Для опису взаємостосунків послідовностей двох або більше полінуклеотидів або поліпептидів використовують наступні терміни: (а) "еталонна послідовність", (Б) "вікно порівняння", (с) "іюидентичність послідовностей" і (4) "відсоткова ідентичність послідовностей". (а) Як застосовується в даному документі, "еталонна послідовність" є заданою послідовністю, яка застосовується в якості основи для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може бути частиною певної послідовності або всією такою; наприклад, у вигляді сегмента кКДНК повної довжини або послідовності гена або всієї кДНК, або послідовності гена, або білкової послідовності. (Б) Як застосовується в даному документі, "вікно порівняння" відноситься до суміжного й певного сегмента послідовності поліпептиду, де послідовність поліпептиду у вікні порівняння може включати додавання або делеції (тобто гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка 60 не містить додавань або делецій) для оптимального вирівнювання двох поліпептидів. Зазвичай довжина вікна порівняння становить щонайменше 5, 10, 15 або 20 суміжних амінокислот, або вона може становити 30, 40, 50, 100 або більше. Фахівці в даній області розуміють, що для того, щоб уникнути високого ступеня подібності відносно до еталонної послідовності внаслідок включення гепів у послідовність поліпептиду, як правило, вводиться штраф за відкриття гепа, і його вираховують із кількості збігів.
Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі на технічному рівні.
Таким чином, визначення відсоткової ідентичності послідовності між будь-якими двома послідовностями можна виконати з використанням математичного алгоритму.
Необмежувальними прикладами таких математичних алгоритмів є алгоритм по Муег5 апа мМінег (1988) САВІО5 4:11-17; алгоритм локального вирівнювання по Зтійй еї а!. (1981) Адм. Аррі. мМаїн. 2:482; алгоритм глобального вирівнювання по Меедієтап апа Умипзсй (1970) У). Мої. Віої. 48:443- 453; спосіб пошуку локального вирівнювання по Реагзоп апа Гіртап (1988) Ргос. Маї). Асай. сі. 85:2444-2448; алгоритм по Капіп апа АЙйбсни! (1990) Рос. Май. Асад. Осі. ОБА 872264; модифікований по Капіп апа Айвспи! (1993) Рос. МаїЇ. Асай. сі. ОБА 90:5873-5877. Для порівняння послідовностей можна використовувати комп'ютерні реалізації даних математичних алгоритмів, щоб визначити ідентичність послідовностей. Такі реалізації включають без обмежень СІ О5ТАЇ у програмі РС/СсСепе (доступна від ІпіеІдепеїйс5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія); програму АГСМ (версія 2.0) і АР, ВЕЗТРЇІТ, ВІ А5Т, ЕА5ТА і ТЕА5ТА в абс М/ізсопвзіп Сепеїйсв
Зопймаге РасКкаде, версія 10 (доступні від АссеЇгуз Іпс., 9685 бЗсгапіоп ВНоай, Сан-Дієго,
Каліфорнія, США). Вирівнювання за допомогою цих програм можуть бути виконані з використанням параметрів за замовчуванням. Програма СІ О5ЗТАЇ добре описана в Ніддіп5 єї аІ. (1988) Сепе 73:237-244 (1988); Нідадіпв єї аІ. (1989) САВІО5 5:151-153; Согреї єї аї. (1988)
Мисівєїс Асіаз Рез. 16:10881-90; Ниапо єї а!. (1992) САВІОБ5 8:155-65; і Реагзоп єї а. (1994) Меїй.
Мої. ВіоІ. 24:307-331. Програма АГІШМ заснована на алгоритмі з Муєт5 апа МіШег (1988), згаданому вище. При порівнянні амінокислотних послідовностей у програмі АГІСМ можна застосовувати таблицю ваги замін залишків РАМ120, штраф за продовження гепа 12 і штраф за відкриття гепа 4. Програми ВІ А5Т по АїЇївспиі єї а! (1990) У. Мої. Віої. 215:403; засновані на алгоритмі Капіп апа Айзспи! (1990), згадані вище. Пошуки нуклеотидних послідовностей в
ВІ АТ можна виконувати за допомогою програми ВІ А5ТМ при параметрах вага вирівнювання - 100, довжина слова - 12 з одержанням нуклеотидних послідовностей, гомологічних нуклеотидній послідовності, що кодує білок згідно із даним винаходом. Пошуки білкових послідовностей в ВГ А5Т можна виконувати за допомогою програми ВІ АЗТХ при параметрах вага вирівнювання - 50, довжина слова - З з одержанням амінокислотних послідовностей, гомологічних білку або поліпептиду згідно із даним винаходом. Пошуки білкових послідовностей в ВГАБЗТР можна виконувати з використанням параметрів за замовчуванням. Див.
Біаві.пебі.піт.пій.дом/Віаві. сді.
Вирівнювання послідовностей і розрахунки відсоткової подібності можна виконувати за допомогою програми Медаїдп з комплекту біоінформаційних обчислювальних програм /А5БАКСЕМЕ (ОМАБЗТАК Іпс., Медісон, Вісконсин) або за допомогою програми АЇдпхХ з комплекту біоінформаційних обчислювальних програм Месіог МТ! (Іпмйгодеп, Карлсбад,
Каліфорнія). Множинне вирівнювання послідовностей виконують із використанням способу вирівнювання Сіиеїаі! (Ніддіп5 апа Зпагр, САВІО5Б. 5:151-153 (1989)) з параметрами за замовчуванням (ШТРАФ ЗА ВІДКРИТТЯ ГЕПА-10, ШТРАФ ЗА ПРОДОВЖЕННЯ ГЕПА-10).
Параметри за замовчуванням для парного вирівнювання й розрахунків відсотку ідентичності білкових послідовностей за допомогою програми СіцвіаІ є наступними: РОЗМІР ІДЕНТИЧНОЇ
ДІЛЯНКИ-1, ШТРАФ НА ВНЕСЕННЯ ДЕЛЕЦІЇ-3, ДОВЖИНА СЕГМЕНТА-5 і ЧИСЛО
БЕЗПЕРЕРВНО СПІВПАДАЮЧИХ ДІЛЯНОК-5. Для нуклеїнових кислот ці параметри є наступними: ШТРАФ ЗА ВІДКРИТТЯ ГЕПА-10, ШТРАФ ЗА ПРОДОВЖЕННЯ ГЕПА-10,
КТОРІЕ-2, ШТРАФ ЗА ВІДКРИТТЯ ГЕПА-5, ВІКНО-4 і ЗБЕРЕЖЕНІ ДІАГОНАЛІ-4. "Значна частина" амінокислотної або нуклеотидної послідовності включає достатню частину амінокислотної послідовності поліпептиду або нуклеотидної послідовності гена для забезпечення припустимої ідентифікації цього поліпептиду або гена шляхом оцінки послідовності фахівцем у даній області техніки вручну або шляхом автоматизованого за допомогою комп'ютера порівняння та ідентифікації послідовностей за допомогою алгоритмів, таких як ВІ А5Т (АїЇБспиї, 5. Р. еї аї., у. Мої. Вісі. 215:403-410 (1993)) і ВГ А5Т з гепами (АїЇї5спиї,
З. Е. ег а)., Мисівїс Асіаз ВКев. 25:3389-3402 (1997)). ВІ АЗТМ відноситься до програми ВІГА5Т, що порівнює запитувану нуклеотидну послідовність із нуклеотидними послідовностями з бази даних. "Ген" відноситься до фрагменту нуклеїнової кислоти, який експресує специфічний білок, бо включаючи регуляторні послідовності, що передують (5'-нсекодуючі послідовності) та ідуть після
(3і-ч-екодуючі послідовності) кодуючої послідовності. Термін "нативний ген" означає ген, який існує в природі, зі своїми власними регуляторними послідовностями. "Химерний ген" або "рекомбінантна експресуюча конструкція", застосовуються взаємозамінно, відносяться до будь- якого гена, який не є нативним геном, що включає регуляторні та кодуючі послідовності, які разом не зустрічаються в природі. Відповідно, химерний ген може містити регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які отримані з різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які отримані з одного джерела, але розташовані в порядку, відмінному від такого, що зустрічається в природі. "Ендогенний ген" відноситься до нативного гена в його природному розташуванні в геномі організму. "Чужорідний" ген відноситься до гена, що не виявляється в нормі в організмі хазяїна, але який введений в організм хазяїна за допомогою переносу гена. Чужорідні гени можуть включати нативні гени, введені в організм, який не є нативним, або химерні гени. "Трансген" є геном, який ввели в геном за допомогою способу трансформації. "Кодуюча послідовність " відноситься до послідовності ДНК, яка кодує конкретну амінокислотну послідовність. "Регуляторні послідовності" відносяться до нуклеотидних послідовністей, розташованих вище (5'-г-екодуючі послідовності), в межах або нижче (3'-некодуючі послідовності) кодуючої послідовності, і таких, що впливають на транскрипцію, процесинг або стабільність РНК або трансляцію пов'язаної кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати без обмеження промотори, лідерні послідовності трансляції, інтрони та послідовності розпізнавання поліаденілювання. "Виродженість кодонів" відноситься до відхилення в генетичному коді, що дозволяє робити зміну нуклеотидної послідовності без впливу на амінокислотну послідовність поліпептиду, який кодується. Відповідно, даний винахід відноситься до будь-якого фрагмента нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує всі амінокислотні послідовності, викладені в даному документі, або їх значну частину. Фахівцеві в даній області техніки добре відомо про "зсув частоти використання кодонів", що проявляється конкретною клітиною-хазяїном відносно використання нуклеотидних кодонів, що визначають дану амінокислоту. Таким чином, при синтезі фрагменту нуклеїнової кислоти для підвищеної експресії в клітині-хазяїні бажано
Зо розробити такий фрагмент нуклеїнової кислоти, щоб його частота використання кодонів була близькою до частоти використання переважних кодонів клітини-хазяїна.
Як використовується в даному документі, "ідентичність послідовності" або "ідентичність" по відношенню до двох послідовностей полінуклеотидів або поліпептидів відноситься до залишків двох послідовностей, які є однаковими при вирівнюванні зі знаходженням максимальної відповідності в зазначеному вікні порівняння. Якщо відсоток ідентичності послідовностей застосовують відносно білків, то враховують, що положення залишків, які не є ідентичними, часто відрізняються по консервативних амінокислотних замінах, де амінокислотні залишки замінені на інші амінокислотні залишки з подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю). Якщо послідовності відрізняються консервативними замінами, то відсоток ідентичності послідовності можна підвищити для того, щоб внести поправку на консервативну природу заміни. Кажуть, що послідовності, які відрізняються такими консервативними замінами, характеризуються "подібністю послідовностей" або "подібністю".
Засоби для здійснення такого коректування добре відомі фахівцям у даній області. Як правило, це передбачає оцінку в балах консервативної заміни скоріше в якості часткової, ніж повної розбіжності, що, таким чином, збільшує відсоток ідентичності послідовностей. Таким чином, наприклад, якщо ідентичній амінокислоті присвоюється бал 1, а неконсервативній заміні присвоюється бал нуль, то консервативній заміні присвоюється бал від нуля до 1. Оцінку в балах консервативних замін розраховують, наприклад, як реалізовано в програмі РС/ЗЕМЕ (ІпіеПдепеїіс5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія).
Як застосовується в даному документі, "відсоток ідентичності послідовностей" означає значення, визначене шляхом порівняння двох вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина послідовності полінуклеотиду у вікні порівняння може включати додавання або делеції (тобто, гепи) у порівнянні з еталонною послідовністю (яка не включає додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоткове значення розраховують шляхом визначення кількості положень, у яких ідентичний залишок нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок зустрічається в обох послідовностях, з одержанням кількості положень, що співпали, ділення кількості положень, що співпали, на загальну кількість положень у вікні порівняння та множення результату на 100 з одержанням відсоткової ідентичності послідовностей. бо Полінуклеотидні конструкції
У даному документі передбачаються молекули полінуклеотидів або нуклеїнових кислот, які містять варіантні сайти розпізнавання для засобів, що рідко розщеплюютьрозщеплюють, для індукції двониткового розриву або будь-яких їхніх активних варіантів або фрагментів. Терміни "полінуклеотид", "послідовність полінуклеотида", "послідовність нуклеїнової кислоти" і "фрагмент нуклеїнової кислоти" застосовуються в даному документі взаємозамінно. Ці вирази охоплюють нуклеотидні послідовності і т. п. Використання терміна "полінуклеотид" не має на увазі обмеження даного винаходу полінуклеотидами, що містять ДНК. Фахівці в даній області зрозуміють, що полінуклеотиди можуть містити рибонуклеотиди та комбінації рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Такі дезоксирибонуклеотиди та рибонуклеотиди містять у собі як молекули, що зустрічаються в природі, так і їх синтетичні аналоги. Полінуклеотиди по даному винаходу також охоплюють усі форми послідовностей, у тому числі без обмежень однониткові форми, двониткові форми, шпильки, структури типу "стебло-петля" і т. п.
Крім того, передбачаються рекомбінантні полінуклеотиди, що містять різні засоби, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву, такі як сконструйовані мегануклеази. Терміни "рекомбінантний полінуклеотид", "рекомбінантний нуклеотид", "рекомбінантна ДНК" і "рекомбінантна ДНК-конструкція" використовуються в даному документі взаємозамінно.
Рекомбінантна конструкція містить комбінацію штучних або гетерологічних послідовностей нуклеїнових кислот, наприклад, регуляторних і кодуючих послідовностей, які не зустрічаються разом у природі. Наприклад, касета для переносу може містити сайти рестрикції та гетерологічний полінуклеотид, що представляє інтерес. В інших варіантах здійснення рекомбінантна конструкція може містити регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які отримані з різних джерел, або регуляторні послідовності, та кодуючі послідовності, які отримані з одного джерела, але розташовані в порядку, відмінному від такого, що зустрічається в природі. Таку конструкцію можна застосовувати саму по собі або можна застосовувати в комбінації з вектором. Якщо використовують вектор, тоді вибір вектора залежить від способу, який будуть використовувати для трансформації клітин-хазяїв, що добре відомо фахівцям у даній області. Наприклад, можна застосовувати плазмідний вектор. Фахівцеві в даній області добре відомі генетичні елементи, які повинні бути присутніми у векторі для успішної трансформації, відбору та розмноження клітин-хазяїв, що містять який-небудь із виділених
Зо фрагментів нуклеїнових кислот, які забезпечуються у даному документі. Фахівцеві в даній області також буде зрозуміло, що у різних незалежних трансформантів будуть проявлятися різні рівні та патерни експресії (опе еї аЇ., ЕМВО 3. 4:2411-2418 (1985); Ое АІтеіда єї аї., Мої. Сеп.
Сепеїїйсв 218:78-86 (1989)), і таким чином, для того, щоб одержати лінії, що проявляють бажаний рівень і патерн експресії, слід провести скринінг декількох трансгенних об'єктів. Такий скринінг, окрім іншого, можна виконувати за допомогою Саузерн-аналізу ДНК, Нозерн-аналізу експресії
МРНК, аналізу експресії білка за допомогою імуноблотингу або фенотипового аналізу.
Полінуклеотиди, що кодують мегануклеази, які розкриті в даному документі, можуть бути представлені в касетах експресії для експресії в рослині, що представляє інтерес. Касета може містити в собі 5'- і 3'-регуляторні послідовності, функціонально пов'язані з полінуклеотидом, що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент. Мається на увазі, що термін "функціонально зв'язаний" означає функціональний зв'язок між двома або більше елементами.
Наприклад, функціональний зв'язок між полінуклеотидом, що представляє інтерес, і регуляторною послідовністю (тобто промотором) являє собою функціональний зв'язок, який забезпечує експресію полінуклеотида, що представляє інтерес. Функціонально зв'язані елементи можуть бути суміжними або несуміжними. При використанні для позначення з'єднання двох ділянок, що кодують білок, під функціонально зв'язаним мається на увазі, що кодуючі ділянки знаходяться в одній рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, який підлягає введенню в організм шляхом котрансформації.
Альтернативно, додатковий (додаткові) ген(и) можуть бути представлені в декількох касетах експресії. Така касета експресії забезпечується безліччю сайтів рестрикції та/або сайтів рекомбінації для того, щоб вставка полінуклеотиду, який кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, зазнала регуляції транскрипції з боку регуляторних ділянок. Касета експресії може додатково містити гени маркерів, які селектуються.
У напрямку транскрипції 5-3" касета експресії може містити ділянку ініціації транскрипції й трансляції (тобто промотор), полінуклеотид, що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, і ділянку термінації транскрипції й трансляції (тобто ділянка термінації), які є функціональними у рослин. Регуляторні ділянки (тобто промотори, ділянки регуляції транскрипції та ділянки термінації трансляції) та/або полінуклеотид, що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, можуть бути нативними/аналогічними по відношенню до 60 клітини-хазяїна або один до одного. Альтернативно, регуляторні ділянки та/або полінуклеотид,
що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, можуть бути гетерологічними по відношенню до клітини-хазяїна або один до одного.
Використовувана в даному документі "гетерологічна" стосовно послідовності означає, що послідовність походить із чужорідного виду або, якщо вона походить із того ж виду, то істотно модифікована по складу та/"або положенню в геномі у порівнянні з її нативною формою в результаті навмисного втручання людини. Наприклад, промотор, функціонально пов'язаний з гетерологічним полінуклеотидом, походить із виду, відмінного від виду, з якого отриманий полінуклеотид, або, якщо він походить із того ж/аналогічного виду, то один або обидва з них є значною мірою модифікованими в порівнянні з їхньою вихідною формою та/або положенням в геномі, або промотор не є нативним промотором для функціонально зв'язаного полінуклеотиду.
Незважаючи на те, що експресія послідовностей за допомогою гетерологічних промоторів може бути оптимальною, можна застосовувати нативні промоторні послідовності. Такі конструкції можуть змінювати рівні експресії полінуклеотиду, що кодує мегануклеазу, у рослині або рослинній клітині. Таким чином, фенотип рослини або рослинної клітини можна змінювати.
Ділянка термінації може бути нативною відносно ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною відносно функціонально зв'язаного полінуклеотиду, що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, може бути нативною відносно рослини-хазяїна, або може бути отримана з іншого джерела (тобто чужорідного або гетерологічного відносно промотора, полінуклеотида, що кодує мегануклеазу або її активний варіант або фрагмент, рослини-хазяїна або будь-якої їхньої комбінації). Підходящі ділянки термінації доступні з Ті-плазміди А.
ТШштеїасієп5, наприклад, ділянки термінації генів октопінсинтази й нопалінсинтази. Див. також
Сиегіпеаи еї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Ззапіасоп еї аІ. (1991) Сепе5 Ювєум. 5:141-149; Модеп вї а). (1990) Ріапі Сеї!І 2:1261-1272; Мипговє вї аї. (1990)
Сепе 91:151-158; ВаїІаз єї а!. (1989) Мисієїс Асіаз Нев. 17:7891-7903; і дові єї аї. (1987) Мисівїс
Асід5 Нез. 15:9627-9639.
За необхідності полінуклеотиди можна оптимізувати для підвищення експресії в трансформованій рослині. Тобто полінуклеотиди можна синтезувати з використанням кодонів, кращих для рослини, для поліпшення експресії. Див., наприклад, СатрбреїЇ апа Сомлті (1990)
Ріапі Рпувзіої. 92:1-11; відносно розгляду використання кодонів, кращих для хазяїна. З технічного
Зо рівня доступні способи синтезу генів, кращих для рослин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 і 5436391; і Митау еї аї. (1989) Мисієїс Асій5 Нев. 17:477-498, включеної в даний документ як посилання.
Відомі додаткові модифікації послідовності для посилення експресії гена в клітинного хазяїна. Вони включають виключення послідовностей, що кодують фальшиві сигнали поліаденілювання, сигнали сайту сплайсингу екзонів та інтронів, транспозоноподібні повтори та інші подібні добре вивчені послідовності, які можуть згубно впливати на експресію гена. Вміст -
С у послідовності можна коректувати до рівнів, середніх для даного клітинного хазяїна, що розраховується з урахуванням відомих генів, які експресуються у клітині-хазяїні. Якщо можливо, послідовність модифікують для того, щоб уникнути утворення прогнозованих шпилькових вторинних структур мРНК.
Касети експресії можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності. Такі лідерні послідовності можуть сприяти посиленню трансляції. Трансляційні лідерні послідовністі відомі в даній області та включають лідерні послідовністі пікорнавірусів, наприклад, лідерну послідовність ЕМСМ (5'- некодуюча ділянка геному вірусу енцефаломіокардиту) (ЕІкгоу-5івіп (1989) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 86:6126-6130); лідерні послідовності потівірусів, наприклад, лідерну послідовність ТЕМ (вірусу гравіювання тютюну) (Саїе сеї аї!. (1995) Сепе 165(2):233-238), лідерну послідовність МОММ (вірусу карликової мозаїки кукурудзи) (Мігоіоду 154:9-20) і мРНК білка, що зв'язує важкий ланцюг імуноглобуліну людини (ВіР) (Масе)зак еї аїЇ. (1991) Маїшге 353:90-94); нетрансльовану лідерну послідовність мРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (РНК-4 АМУ) (Чобіїпу еї аї. (1987) Маїште 325:622-625); лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки (ТМУ) (СЗаїе єї а. (1989) в МоіІесшаг Віоіоду ої ВМА, єд. Сесі (гів, Мем мок), рр. 237- 256) і лідерну послідовність вірусу хлоротичної плямистості маїсу (МСММ) (СГоттеї еї аї. (1991)
Мігоіоду 81:382-385. Див. також ОеПа-Сіорра еї а). (1987) Ріапі РНузіої. 84:965-968.
При отриманні касети експресії з різними фрагментами ДНК можна проводити маніпуляції так, щоб одержати послідовності ДНК у належній орієнтації та, при необхідності, у належній рамці зчитування. Із цією метою для з'єднання фрагментів ДНК можна використовувати адаптери або лінкери, або можна задіяти інші маніпуляції для забезпечення підходящих сайтів рестрикції, видалення надлишкової ДНК, видалення сайтів рестрикції і т. п. З цією метою можна задіяти мутагенез іп міо, репарацію за допомогою праймерів, рестрикцію, відпал, повторні бо заміни, наприклад, транзиції і трансверсії.
Для експресії різних послідовностей мегануклеаз, розкритих у даному документі, можна застосовувати ряд промоторів, у тому числі нативний промотор послідовності полінуклеотиду, що представляє інтерес. Промотори можна вибирати, виходячи з необхідного результату. Такі промотори включають, наприклад, конститутивні, кращі для тканин або інші промотори для експресії в рослинах.
Конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор промотору К5уп?7 та інші конститутивні промотори, розкриті в УМО 99/43838 і патенті США Мо 6072050; коровий промотор 355 Саму (оаві! єї а. (1985) Майте 313:810-812); актиновий промотор рису (Мсеїгоу еї а!. (1990)
Ріапі Сеї! 2:163-171); убіквітиновий промотор (Спгістепзеп еї аї. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619-632; і Снгівіеєпзеп еї аї. (1992) Ріапі Мо). Віої. 18:675-689); РЕМИ (І аві сеї а!. (1991) Тнеог. Аррі. Сепеї. 81:581-588); МА5 (Мейеп еї а. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730); промотор А! 5 (патент США Мо 5659026) і т. п. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, описані в патентах США
МоМо 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 і 6177611.
Націлюючись на підвищену експресію мегануклеаз у конкретній тканині рослини можна використовувати кращі для тканин промотори. Кращі для тканини промотори включають описані в Хататоїо еї аї. (1997) Ріапі 9. 12(2):255-265; Каматаїа єї аї. (1997) Ріапі Сеї! Рпувіо|. 38(7):792-803; Напбзеп еї аї. (1997) МоїЇ. Сбеп Сепеї. 254(3):337-343; НивзеїЇ еї аї. (1997)
Ткгапздепіс Вев. 6(2):157-168; Віпенап еї аї. (1996) Ріапі РНузіої. 112(3):1331-1341; Мап Сатр єї а!. (1996) Ріапі РНузіої. 112(2):525-535; Сапемазсіпі еї аї. (1996) Ріапі РНувіої. 112(2):513-524;
Мататою еї аї. (1994) Ріапі СеїЇ Рпувіої. 35(5):773-778; ат (1994) Везиїйв Ргобрі. Сеї! Ойег. 20:181-196; Ого2со 6ї аї. (1993) Ріапі Мої Віої. 23(6):1129-1138; МаїзцокКа евї аї!. (1993) Ргос Маї!.
Асад. Зсі. ОБА 90(20):9586-9590; і С(хцемага-Сагсіа еї аї. (1993) Ріапі У. 4(3):495-505. За потребою, такі промотори можна модифікувати з одержанням слабкої експресії.
Промотори, які активні переважно в листках, відомі з технічного рівня. Див., наприклад,
Уататоїю еї аї. (1997) Ріапі У. 12(2):255-265; Кмоп еї аї. (1994) Ріапі Рпузіої. 105:357-67;
Мататою єї аї. (1994) Ріапі СеїЇ РНузіо!ї. 35(5):773-778; Сб:оюг еї аі. (1993) Ріапі У. 3:509-18;
Ого2со вї а. (1993) Ріапі Мої. Віої!. 23(6):1129-1138; і МаїзцокКа евї а!. (1993) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі.
БА 90(20):9586-9590.
Для експресії послідовностей, що кодують мегануклеази, або їх біологічно активні варіанти і
Зо фрагменти, можна застосовувати синтетичні промотори.
Касета експресії може також містити ген маркера який селектується для відбору трансформованих клітин. Гени маркерів, які селектуються, використовуються для відбору трансформованих клітин або тканин. Маркерні гени включають гени, що кодують стійкість до антибіотиків, як, наприклад, такі що кодують неоміцинфосфотрансферазу | (МЕО) і гігроміцинфосфотрансферазу (НРТ), а також гени, що надають стійкість до гербіцидних сполук, таких як гліфосат, глюфосинат амонію, бромоксиніл, сульфонілсечовини, дикамба й 2, 4- дихлорфеноксиацетат (2,4-О0). Додаткові маркери, які селектуються, включають фенотипові маркери, такі як ВД-галактозидаза і флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок (СЕР) (5и єї аї. (2004) Віоїеснпо! Віоєпуд 85:610-9; і Рецег еї а. (2004) Ріапі Сеї! 16:215-28), блакитний флуоресцентний білок (СУР) (Воке еї аї. (2004) 9. СеїЇ Зсіепсе 117:943-54; і Каф вї а. (2002) Ріапі РНузіо! 129:913-42) і жовтий флуоресцентний білок (Рпіутр"" від Емгодеп, див. Вопе еї а. (2004) 9). Сеї! Зсіепсе 11 7:943-54). Про додаткові маркери, які селектуються, див., у цілому, в Матапюоп (1992) Ситт. Оріп. Віоїесн. 3:506-511; Сп/іворпегзоп еї аї. (1992) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі.
БА 89:6314-6318; Мао еї аї!. (1992) Сеї! 71:63-72; Вегпікої (1992) Мої. Містобіо!. 6:2419-2422;
Ватківєу єї а!. (1980) в Тне Орегоп, рр. 177-220; Ни вї аї. (1987) СеїІ 48:555-566; Втгомп вії а!. (1987)
Сеї! 49:603-612; Рідде еї аї. (1988) Сеї! 52:713-722; Юеизспіє еї аї. (1989) Ргос. Маї). Асад. Асі.
ИБА 86:5400-5404; Риегві єї аІ. (1989) Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 86:2549-2553; ЮОеизсеніє еї аї. (1990) бсієпсе 248:480-483; Соб5бзеп (1993) РИ.О. Тневів, Опімегейу ої НеїдеїІрега; Веїіпез еї аї. (1993) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 90:1917-1921; І аром/ єї аї. (1990) Мої. Сеї!. Вісі. 10:3343-3356; 7атргені еї а!. (1992) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 89:3952-3956; Ваїіт еї аї. (1991) Ргос. Маї). Асаай. зЗсі. ОБА 88:5072-5076; УУуротгекі еї а!. (1991) Мисієїс Асіаз Ве. 19:4647-4653; НіПепапа-м/ізвтап (1989) Торісв Мої. Бігис. ВіоІ. 10:143-162; Оедепко!ї еї аї. (1991) Апіїтістор. Адепі5 СпетоїНег. 35:1591-1595; КіІвєїп5сНпідї еї аї. (1988) Віоспетівігу 27:1094-1104; Вопіп (1993) Р.О. ТНевів,
Опімегзйу ої НеїдеІрего; Сов55еп еї аї. (1992) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 89:5547-5551; ОїЇма еї а. (1992) Апіїтістор. Адепі5 СпетоїНег. 36:913-919; НіамКа єї а!. (1985) Напароок ої Ехрегітепіаї!
Рпапгтасоїоду, Мої. 78 (Зргіпдег-Мепад, Вепіп); С еї а. (1988) Маїште 334:721-724. Такі розширення включені в даний документ як посилання. Наведений вище перелік генів маркерів, які селектуються, не призначений для обмеження. У даному винаході можна застосовувати будь-який ген маркера, який селектується. 60 Спосіб введення
Засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, таке як мегануклеаза, можна вводити за допомогою будь-яких засобів, відомих з технічного рівня. Наприклад, передбачаються клітина, дріжджі або рослина, що мають припустимий або варіантний сайт розпізнавання у своєму геномі. Можна забезпечувати транзієнтну експресію мегануклеази, або поліпептид сам по собі можна безпосередньо доставляти в клітину. Альтернативно, нуклеотидна послідовність, здатна до експресії мегануклеази, може бути стабільно інтегрована в геном рослини. При наявності відповідного припустимого або варіантного сайту розпізнавання і мегануклеази, донорну ДНК можна вводити в геном трансформованої рослини.
Альтернативно, різні компоненти можна поєднувати шляхом статевого схрещування трансформованих рослин. Таким чином, послідовність, що кодує мегануклеазу, і/або припустимий або варіантний сайт розпізнавання можна поєднувати один з одним у ході статевого схрещування із забезпеченням присутності кожного компонента системи в одній рослині. Мегануклеаза може перебувати під контролем конститутивного промотору або промотору, що індукується. Такі промотори, які представляють інтерес, обговорюються докладніше в іншому місці в даному документі.
Для введення послідовності, яка представляє інтерес, такої як кожен із засобів, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, у рослину або частину рослини, можна застосовувати різні способи. Мається на увазі, що "введення" означає надання рослині, рослинній клітині або частині рослини полінуклеотиду або поліпептиду таким чином, що послідовність потрапляє всередину клітини рослини. Способи по даному винаходу не залежать від конкретного способу введення послідовності в рослину або частину рослини, за винятком того, що полінуклеотид або поліпептиди потрапляють всередину щонайменше однієї клітини рослини. З технічного рівня відомі способи введення полінуклеотиду та/або поліпептидів у рослини, у тому числі без обмежень способи стабільної трансформації, способи транзієнтної трансформації та способи трансформації, опосередкованої вірусами.
Мається на увазі, що "стабільна трансформація" означає, що нуклеотидна конструкція, яка вводиться в рослину, інтегрується в геном рослини й може бути успадкована його нащадками.
Мається на увазі, що "транзієнтна трансформація" означає, що полінуклеотид вводиться в рослину й не інтегрується в геном рослини або в рослину вводиться поліпептид.
Зо Протоколи трансформації, а також протоколи введення поліпептидів або послідовностей полінуклеотидів у рослини можуть змінюватися залежно від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольної або дводольної рослини, яку цілеспрямовано трансформують.
Підходящі способи введення поліпептидів і полінуклеотидів у рослинні клітини включають мікроін'єкцію (Стоз5улау єї аї. (1986) Віотеснпіднев 4:320-334), електропорацію (Відоз еї а!. (1986)
Ргос. Маїй!. Асад. 5сі. ОБА 83:5602-5606, Адгобасіегпцт-опосередковану трансформацію (патент
США Мо 5563055 і патент США Мо 5981840), прямий перенос генів (Рабз2Комувкі еї аї. (1984)
ЕМВО 3. 3:2717-2722) і балістичне прискорення частинок (див., наприклад, патент США Мо 4945050; патент США Мо 5879918; патент США Мо 5886244 і Мо 5932782; Тотез вї аї. (1995) в
Ріапі Сеїї, Тіввие апа Огдап Сийиге: Еипдатепіа! Меїпод5, єда. Сатбогд апа Рніїїїре (Зргіпдег-
Мепад, Вепіп); Мосаре еї аї. (1988) Віоїесппоіоду 6:923-926); а також трансформацію за допомогою І есі (М/О 00/28058). Також див. МУ/єїззіпдег еї аї. (1988) Апп. Нем. Сепеї. 22:421-477; зЗапіога еї аї. (1987) Рапісшаїє бсієпсе апа Тесппоіоду 5:27-37 (цибуля); Спгізіои еї аї. (1988)
Ріапі РНузіої. 87:671-674 (соя); Месабе еї аї. (1988) Віо/ТесппоЇоду 6:923-926 (соєві боби); Ріпег апа МстийПеп (1991) Іп Міо Сеїї Оєм. ВіоІ. 27Р:175-182 (соя); 5іпуоднп еї а. (1998) Тнеог. Аррі.
Сепеї. 96:319-324 (соя); Оаца єї а!. (1990) Віоїесппоіоду 8:736-740 (рис); Ківіп еї аї. (1988) Ргос.
Май. Асад. осі. ОБА 85:4305-4309 (маїс); КіІвїп єї аіІ. (1988) ВіотесппоІоду 6:559-563 (маїс); патенти США МеМе 5240855, 5322783 і 5324646; КіІвєїп єї аї. (1988) Ріапі Рпузіої. 91:440-444 (маїс); Еготт сеї аї. (1990) Віоїеснпоіоду 8:833-839 (маїс); Нооукааз-Мап 5іодієтеп еї аї. (1984)
Маїшцге (Гопдоп) 311:763-764; патент США Мо 5736369 (злаки); Вуїебієг єї аї. (1987) Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 84:5345-5349 (І Насеає); Оє МУ/еї єї а. (1985) в Те Ехрегітепіа! Мапіршіайоп ої
Омше Тіззцез, ед. Снартанп вї а!. (Гопдтап, Мем МогКк), рр. 197-209 (пилок); Каерріег єї аї. (1990)
Ріапі СеїЇ Веропв 9:415-418 і Каеєеррієї єї аїЇ. (1992) Тиеог. Аррі. Сепеї. 84:560-566 (опосередкована ниткоподібними кристалами трансформація); О'Наїніп еї а!ї. (1992) Ріапі СеїЇ 4:1495-1505 (електропорація); Гі еї а!. (1993) Ріапі СеїЇ Верогів 12:250-255; і Спгівїои апа Рога (1995) Аппаї5 ої Воїапу 75:407-413 (рис); Озіода єї аї. (1996) Маште Віоїеснппоіоду 14:745-750 (маїс, за допомогою Адгобрасієгішт Іштеїасієп5); всі включені в даний документ у якості посилання.
У конкретних варіантах здійснення послідовність засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, таку як послідовність мегануклеази, або її активний варіант або бо фрагменти можна доставляти в дріжджову клітину або рослину за допомогою різних способів транзієнтної трансформації. Такі способи транзієнтної трансформації включають, без обмежень, введення білка мегануклеази або його активних варіантів і фрагментів безпосередньо в дріжджову клітину або рослину. Такі способи включають, наприклад, мікроін'єкцію або бомбардування частинками. Див., наприклад, Сто55мау еї аІ. (1986) Мої Сеп. Сепеї. 202:179- 185; Мотига еї аї. (1986) Ріапі 5сі. 44:53-58; Нерієг єї аї. (1994) Ргос. Маї). Асад. осі. 91: 2176- 2180; ії Нивн еї аї. (1994) Тне Чдоштпаї ої СеїЇ Зсієпсе 107:775-784, всі включені в даний документ як посилання.
Як правило, такі способи включають вбудовування нуклеотидної конструкції по даному винаходу в молекулу ДНК або РНК. Зрозуміло, що послідовність мегануклеази можна початково синтезувати як частину вірусного поліпротеїну, який потім можна піддавати процесингу шляхом протеолізу іп мімо або іп міо з одержанням необхідного рекомбінантного білка. Крім того, мається на увазі що промотори по даному винаходу також охоплюють промотори, які використовуються для транскрипції вірусними РНК-полімеразами. Способи введення в рослини полінуклеотидів, у тому числі молекул вірусної ДНК або РНК, та способи експресії білка, що ними кодується, відомі з технічного рівня. Див., наприклад, патенти США МоМо 5889191, 5889190, 5866785, 5589367, 5316931; і Ропа еї аї. (1996) МоїІесшаг Віоїесппоіоду 5:209-221; включені в даний документ як посилання.
З технічного рівня відомі способи цілеспрямованої вставки полінуклеотиду в конкретне положення в геномі рослини. В одному варіанті здійснення вставку полінуклеотиду в необхідне положення в геномі виконують із використанням системи сайт-специфічної рекомбінації. Див., наприклад, УМО 99/25821, УМО 99/25854, МО 99/25840, УМО 99/25855 і УМО 99/25853, всі включені в даний документ як посилання. Коротко, полінуклеотид по даному винаходу може знаходитись в касеті для переносу, фланкованої двома нерекомбіногенними сайтами рекомбінації. Касету для переносу вводять у рослину, що має у своєму геномі стабільно вбудований цільовий сайт, фланкований двома нерекомбіногенними сайтами рекомбінації, які відповідають сайтам касети для переносу. Забезпечують підходящу рекомбіназу, і касета для переносу інтегрується в цільовий сайт. Полінуклеотид, який представляє інтерес, таким чином, інтегрується в конкретне хромосомне положення в геномі рослини. Інші способи націлювання полінуклеотидів викладені в УМО 2009/114321 (включеної в даний документ як посилання), у якому описані "оригінальні"
Зо мегануклеази, які одержуються для модифікації геномів рослин, зокрема, геному маїсу. Див. також Сао еї аї. (2010) РіІапі Уошигпаї 1:176-187.
Із клітин, які були трансформовані, можна виростити рослини відповідно до традиційних способів. Див., наприклад, МесогтіскК еї аї!. (1986) Ріапі Сеї! Рерогів 5:81-84. Ці рослини можна потім вирощувати та запилювати за допомогою або тієї ж самої трансформованої лінії, або інших ліній, та ідентифікувати отриманих в результаті нащадків, які характеризуються конститутивним проявом вказаної необхідної фенотипової характеристики. Можна виростити два або більше поколінь, щоб переконатися в тому, що експресія необхідної фенотипової характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім зібрати насіння, щоб переконатися в тому, що була досягнута експресія необхідної фенотипової характеристики.
Таким чином, у даному винаході передбачене трансформоване насіння (яке також називають "трансгенним насінням"), що має полінуклеотид по даному винаходу, наприклад, касету експресії по даному винаходу, стабільно вбудовану в його геном.
Як використовується в даному документі, "праймери" являють собою виділені полінуклеотиди, які гібридизуються з комплементарною ниткою цільової ДНК шляхом гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду праймера та цільової нитки ДНК, які потім подовжують вздовж нитки цільової ДНК за допомогою полімерази, наприклад, ДНК-полімерази.
Пари праймерів по даному винаходу відносять до їхнього використання в ампліфікації цільового полінуклеотиду, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших традиційних способів ампліфікації нуклеїнових кислот. "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" являє собою методику, застосовувану для ампліфікації конкретних сегментів ДНК (див. патенти США МоМо 4683195 і 4800159; включені в даний документ як посилання).
Зонди і праймери мають достатню довжину в нуклеотидах, щоб зв'язуватися із цільовою послідовністю ДНК і забезпечувати специфічне виявлення та/або ідентифікацію полінуклеотиду, що кодує поліпептид з мегануклеазною активністю або його активний варіант або фрагмент, описані в іншому місці в даному документі. Зрозуміло, що умови гібридизації або умови реакції для досягнення даного результату можуть визначатися оператором. Ця довжина може бути будь-якою довжиною, яка є достатньою довжиною для того, щоб бути застосованою в бажаному способі виявлення. Такі зонди і праймери можуть здійснювати специфічну гібридизацію із цільовою послідовністю в умовах гібридизації високої жорсткості. Зонди і праймери, згідно з бо варіантами здійснення даного винаходу, можуть мати повну ідентичність суміжних нуклеотидів у послідовності ДНК відносно цільової послідовності, хоча за допомогою традиційних способів можна розробити зонди, що відрізняються від цільової послідовності ДНК, та зберігають здатність до забезпечення специфічного виявлення та/або ідентифікації цільової послідовності
ДНК. Відповідно, зонди і праймери можуть мати приблизно 80 95, 85 905, 90 95, 91 90, 92 905, 93 90, 94 95, 95 965, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більшу ідентичність послідовностей або комплементарність стосовно цільового полінуклеотиду.
Способи одержання й застосування зондів і праймерів описані, наприклад, в Мо!іесшіаг
Сіопіпда: А ІГарогаюгту Мапиаї, 2.5ир.па єй, мої. 1-3, ей. ЗатбргооК еї аї., Со бргіпд Нагброг
І арогаїогу Ргез5, Соїд бргіпа Натог, М.У. 1989 (далі, "Затьгоок еї аї!., 19897); Ситепі Ргоїосої!в іп
Моїесшіаг Віоіоду, єд. А!,зибеї! єї аї., Стеєпе Рибіїзпіпуд апа УМіеу-Іпіегвзсіепсе, Мем Могк, 1992 (з періодичними оновленнями) (далі, "Айвибеї еї а!., 19927); і Іппіз еї аіІ., РСВ Ргоїосоїв: А Сиіде
Меїнподз апа Арріїсайопе, Асадетіс Ргезв: Зап Оієдо, 1990. Пари праймерів для ПЛР можна одержувати з відомої послідовності, наприклад, шляхом застосування комп'ютерних програм, призначених для цієї мети, таких як засіб аналізу праймерів для ПЛР у Месіог МТІ версії 10 (Іпийгодеп); РгітегзеІєсї (ОМАБЗТАВ Іпс., Медісон, Вісконсин) і Ргітег (версія 0.5.СОРУВИТ., 1991, інститут біомедицинських досліджень Уайтхеда, Кембрідж, Масачусетс). Додатково, послідовності можна піддавати зоровому скануванню, а праймери ідентифікувати вручну із застосуванням керівництва, відомого фахівцеві в даній області.
Дріжджі та рослини
Передбачаються дріжджі, рослини, рослинні клітини, частини та насіння рослин, а також зерно що мають варіантні послідовності розпізнавання для засобів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву, таких як мегануклеази, які розкриті в даному документі. У конкретних варіантах здійснення дріжджі, рослини та/"або частини рослин мають стабільно вбудовану щонайменше одну гетерологічну варіантну послідовність розпізнавання, розкриту в даному документі, або її активний варіант або фрагмент. Таким чином, забезпечуються дріжджі, рослини, рослинні клітини, частини та насіння рослин, що містять щонайменше одну варіантну послідовність розпізнавання з кожним з БЕО ІО МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 або будь-якою їх комбінацією, або їх біологічно активний фрагмент та/або варіант. У конкретних варіантах здійснення варіантні послідовності
Зо розпізнавання проявляють підвищену активність розщеплення по відношенню до засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву.
Використовуваний в даному документі вираз "рослина" включає рослинні клітини, протопласти рослинних клітин, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослини, рослинні калюси, скупчення рослинних клітин і рослинні клітини, які є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, сім'ябруньки, насіння, листки, квітки, гілки, плоди, зерна, колоски, качани, листкові обгортки, стебла, коріння, кінчики корінь, пильовики й т. п. Припускається, що зерно означає зріле насіння, отримане комерційними рослинниками для цілей, відмінних від вирощування або відтворення виду. Нащадки, варіанти та мутанти регенерованих рослин також включені в обсяг даного винаходу, за умови, що ці частини містять введені полінуклеотиди.
Трансформована рослина або трансформована рослинна клітина, які забезпечуються в даному документі, являють собою такі, у яких генетична зміна, така як трансформація, торкнулася гена, який представляє інтерес, або являють собою рослину або рослинну клітину, які походять від рослини або клітини, змінених таким чином, і які містять зміну. "Трансген" є геном, який ввели в геном за допомогою способу трансформації. Відповідно до цього, "трансгенна рослина" являє собою рослину, яка містить трансген, незалежно від того, чи ввели трансген у дану конкретну рослину шляхом трансформації або схрещування; таким чином, нащадки початково трансформованої рослини охоплені визначенням. "Контроль", або "контрольна рослина", або "контрольна рослинна клітина" забезпечують точку відліку для вимірювання змін фенотипу досліджуваної рослини або рослинної клітини. Контрольна рослина або рослинна клітина можуть включати, наприклад, (а) рослину або клітину дикого типу, тобто, з тим же генотипом, що і у вихідного матеріалу для генетичної зміни, з якого в результаті одержали досліджувану рослину або клітину; (б) рослину або рослинну клітину з тим же генотипом, що і у вихідного матеріалу, але які трансформували за допомогою нульової конструкції (тобто за допомогою конструкції, яка не експресує трансген, такий як конструкція, що містить маркерний ген); (с) рослину або рослинну клітину, які являють собою нетрансформовані сегреганти серед нащадків досліджуваної рослини або рослинної клітини; (4) рослину або рослинну клітину, які є генетично ідентичними досліджуваним рослині або рослинній клітині, але які не зазнають впливу умов або подразників, які будуть індукувати експресію трансгена; або (є) бо досліджувану рослину або рослинну клітину як такі в умовах, в яких конструкція не експресується.
З рослинних клітин, які трансформували для експресії мегануклеази, забезпечуваної в даної документі, можна виростити цілі рослини. Регенерація, розвиток і культивування рослин із трансформованих протопластів з однієї рослини або з різних трансформованих експлантів добре відомі в даному технічному рівні. Див., наприклад, Меосоптіск єї а!. (1986) Ріапі СеїЇ
Верогі5 5:81-84; М/вієврбаси апа МУевіз5баси, в Меїпоа5 їог Ріапі Моїесшіаг Віоіоду, (Еа5.),
Асадетіс Ргевзв, Іпс. Зап Оієдо, Саїї., (1988). Даний спосіб регенерації та вирощування, як правило, включає етапи відбору трансформованих клітин, культивування /- цих індивідуалізованих клітин протягом звичайних стадій розвитку зародка до стадії вкоріненого саджанця. Трансгенні зародки та насіння регенерують подібним чином. Отримані в результаті вкорінені трансгенні пагони згодом висаджують у відповідне середовище для вирощування рослин, таке як грунт. Бажано, щоб регенеровані рослини були самозапильними для одержання гомозиготних трансгенних рослин. В інших випадках пилком, отриманим із регенерованих рослин, перехресно запилюють вирощені з насіння рослини агрономічно важливих ліній. У свою чергу, пилок від рослин даних важливих ліній використовують для запилення регенерованих рослин. Можна виростити два або більше поколінь, щоб переконатися в тому, що експресія необхідної фенотипової характеристики стабільно підтримується та успадковується, а потім зібрати насіння, щоб переконатися в тому, що була досягнута експресія необхідної фенотипової характеристики. Таким чином, композиції, представлені в даному документі, забезпечують трансформоване насіння (яке також називають "трансгенним насінням"), що має полінуклеотид, забезпечуваний у даному документі, наприклад, цільовий сайт, стабільно вбудований у його геном.
Варіантні послідовності розпізнавання та їх активні варіанти і фрагменти, розкриті в даному документі, можна використовувати для трансформації будь-яких видів рослин, у тому числі, без обмежень, однодольних і дводольних. Приклади видів рослин, що представляють інтерес, включають без обмежень кукурудзу (7еа таувз), Вгазвіса 5р. (наприклад, В. парив, В. гара, В. нпсеа), зокрема, ті види Вгазвзіса, які є придатними в якості джерел рослинної олії, люцерну (Медісадо заїїма), рис (Огула заїїма), жито (ЗесаІє сегеаіє), сорго (бБогайит бБісоїог, огдпит муціІдаге), просо (наприклад, пенісетум рогозовидний (Реппізеїшт діанисит), просо культурне
Зо (Рапісит тіїїасейт), щетинник італійський (5еїагіа йаїїса), просо пальчасте (ЕІеизіпе согасапа)), соняшник (Неїїапіпи5 аппии5), сафлор (Сапнатив іпсіопйцив), пшеницю (Т/йісит аевімит), сою (СіІусіпе тах), тютюн (Місойапа їарасит), картоплю (Боїапит Шбего5зит), різновиди арахісу (Агаспіх пуродаєа), бавовник (Со55урійт Брагбадепзе, Совзвзурійит Пітшит), солодку картоплю (Іротоєа Баїайш5), маніок (Мапінйої езсцієепіа), кавове дерево (Сойєа 5рр.), кокосову пальму (Сосов5 писіїега), ананас (Апапаб5 сотовзив), цитрусові дерева (Сіїги5 5рр.), шоколадне дерево (Тиеоргота сасао), чайний кущ (Сатеїїйа віпепвзів), банан (Миза 5рр.), авокадо (Регзєеа атетгісапа), інжир (Рісив сазіса), гуаву (Рзідіит диадзама), манго (Маподіїега іпаіса), маслину (ОїІєа епйгораєа), папайю (Сагіса рарауа), кешю (Апасагаіїшт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа іптеатітоїїа), мигдаль (Ргипи5 атудаа|шв5), різновиди цукрового буряка (Веїа упцідаїгів5), цукровий очерет (Засспагит 5рр.), різновиди вівса, ячмінь, овочі, декоративні рослини та хвойні рослини.
Овочі включають різновиди томату (ІГусорегзісоп езсцепіит), латук (наприклад, І асіиса ваїма), різновиди зеленої квасолі (Рпазеоїи5 миїдагі5), різновиди лімської квасолі (Рпазеоїи5
Ітепвів), різновиди гороху (Іаїйугив в5рр.) і представників роду Сиситів, таких як огірок (С. займив), канталупа (С. сапіаІйрепвів) і диня мускусна (С. теї/о). Декоративні рослини включають азалію (Апододепагоп 5рр.), гортензію (Масторнуїа Нуагапаоєа), гібіскус (Нірізсив гозазапепзвів), троянди (Ноза 5рр.), тюльпани (Тиїїра 5рр.), нарциси (Магсіззив 5рр.), петунії (Решпіа пубгіаа), гвоздику (Оіапіпих сагуорпуїІ5), пуансетію (Еирпогбіа риісПетіта) і хризантему.
Хвойні рослини, які можна використовувати при практичному здійсненні даного винаходу, включають, наприклад, види сосни, такі як сосна ладанна (Ріпи5 їаєда), сосна Еліота (Ріпиб5 еїПоїй), сосна жовта (Ріпи5 ропдегобза), сосна скручена широкохвойна (Ріпиє сопіопа) і сосна промениста (Ріпиз гадіага); псевдотсугу Мензіса (Рзейдоївида тепгієвії); тсугу канадську (Т5!ида сападепвів); ялину білу (Рісєа діайса); секвойю вічнозелену (бЗедиоіїа зетрегмігепв); справжнії ялиці, такі як ялиця миловидна (Абієз атабіїв) і ялиця бальзамічна (Абієз раізатеа), і туї, такі як туя гігантська (ТНціа ріісайа) і каллітропсис нутканский (Спатаесурагі5 пооїКаїепвів), а також тополю та евкаліпт. У конкретних варіантах здійснення рослини по даному винаходу є культурними рослинами (наприклад, кукурудза, люцерна, соняшник, Вгаззіса, соя, бавовник, сафлор, арахіс, сорго, пшениця, просо, тютюн і т. д.). В інших варіантах здійснення рослини кукурудзи й сої є оптимальними, а ще в декількох інших варіантах здійснення оптимальними є рослини кукурудзи. бо Інші рослини, що представляють інтерес, включають зернові рослини, які забезпечують насіння, яке представляє інтерес, олійні рослини й бобові рослини. Насіння, яке представляє інтерес, включає насіння зернових культур, таких як кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, жито і т. д. Олійні рослини включають бавовник, сою, сафлор, соняшник, Вгазвзіса, маїс, люцерну, пальму, кокосову пальму і т. д. Бобові рослини включають боби й різновиду гороху.
Боби включають гуар, ріжкове дерево, пажитнік, сою, різновиди звичайної квасолі, вігну китайську, золотаву квасолю, лімську квасолю, стручкову квасолю, різновиди сочевиці, турецький горох і т. д.
Необмежувані приклади композицій і способів, розкритих у даному документі, є наступними. 1) Спосіб ідентифікації варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому зазначений спосіб включає: а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання в зазначену геномну ДНК, де двонитковий розрив призводить у результаті до утворення нуклеотидного липкого кінця; р) лігування першого адаптера із зазначеним нуклеотидним липким кінцем; с) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (Б), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; а) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (с), з еталонною геномною послідовністю ДНК; і е) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву. 2) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, вибирають із групи, що складається з мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці", ТаіІ-ефекторної нуклеази, транспозази та сайт-специфічної рекомбінази. 3) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де нуклеотидний липкий кінець являє собою 3'-
Зо нуклеотидний липкий кінець. 4) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де нуклеотидний липкий кінець являє собою 5'- нуклеотидний липкий кінець. 5) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де перший адаптер, лігований з нуклеотидним липким кінцем, являє собою нефосфорильований по 5' адаптер. 6) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де геномну ДНК вибирають із групи, що складається із прокаріотичної ДНК, еукаріотичної ДНК і синтетичної ДНК. 7) Спосіб згідно з варіантом здійснення б, де еукаріотичну ДНК виділяють із рослини, дріжджів або тварини. 8) Спосіб згідно з варіантом здійснення 7, де рослину вибирають із групи, що складається із сої, соняшника, бавовнику, люцерни, каноли, тютюну, картоплі, Агарідорзі5, сафлору, маїсу, рису, сорго, ячменю, пшениці, проса, вівса, цукрової тростини, газонної трави й проса прутоподібного. 9) Спосіб згідно з варіантом здійснення 1, де засіб для індукції двониткового розриву одержують із І-Стеї. 10) Спосіб ідентифікації варіантного сайту розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому зазначений спосіб включає: а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, де двонитковий розрив призводить у результаті до утворення нуклеотидного липкого кінця; р) лігування першого адаптера із зазначеним нуклеотидним липким кінцем; с) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (Б), і лігування другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив;
Я) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (с), з еталонною геномною послідовністю ДНК; і е) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній бо нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву;
ТУ аналіз активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, у варіантних сайтах розпізнавання з а); 9) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, який призводить у результаті до підвищеної активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, в порівнянні з активністю в припустимому сайті розпізнавання. 11) Спосіб згідно з варіантом здійснення 10, де про підвищену активність сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, свідчить: а) вищий відсоток (96) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (706) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на геномній ДНК;
Б) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на плазмідній ДНК; с) вища оцінка в аналізі на дріжджах для варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання; або а) будь-яка комбінація (а), (Б) і (с). 12) Спосіб введення в геном клітини варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому зазначений спосіб включає: а) забезпечення наявності донорної ДНК, що містить варіантний сайт розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, де зазначений сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, також здатний до введення двониткового розриву в зазначений варіантний сайт розпізнавання; р) забезпечення наявності рослинної клітини; с) приведення в контакт рослинної клітини з донорною ДНК; і а) ідентифікацію щонайменше однієї рослинної клітини з (с), що містить у своєму геномі зазначений варіантний сайт розпізнавання.
Зо 13) Спосіб згідно з варіантом здійснення 12, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, вибирають із групи, що складається з мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці", ТаІ-ефекторної нуклеази, транспозази, ендонуклеази Са і сайт- специфічної рекомбінази. 14) Виділений полінуклеотид що містить варіантний сайт, розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованої мегануклеази, здатної до введення двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить нуклеотидну послідовність із заміною щонайменше 1 нуклеотидної основи в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання ЗЕО ІЮ МО: 14. 15) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 1, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить послідовність зі змінами щонайменше 2, 3, 4, 5, 6 або 7 пар основ у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 14. 16) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 14, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить: а) аденін (А) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 9 в 5ЕО ІЮ МО: 14;
БЮ) гуанін (С) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 10 в 5ЕО ІЮ МО: 14; с) тимін (Т) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 11 в 5ЕО ІЮО МО: 14;
Я) аденін (А) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 13 в ЗЕО ІЮО МО: 14; е) тимін (Т) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню18 в 5ЕО ІЮ МО: 14;
У) гуанін (С) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 19 в ЗЕО ІЮ МО: 14; 9) гуанін (С) або аденін (А) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 22 в ЗЕО
ІО МО: 14; або
І) будь-яку комбінацію з а)-9). 17) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 14, де зазначена варіантна послідовність розпізнавання обрана із групи, що складається з 5ЕО ІЮО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35. 18) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 14, де про покращену активність розщеплення свідчить: а) вищий відсоток (96) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайту розпізнавання 5ЕО ІО МО:14, де сайти бо розпізнавання розташовані на геномній ДНК;
Б) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на плазмідній ДНК; с) вища оцінка в аналізі на дріжджах для варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання; або а) будь-яка комбінація (а), (Б) і (с). 19) Рекомбінантний фрагмент ДНК, що містить виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 14. 20) Клітина, що містить рекомбінантний фрагмент ДНК згідно з варіантом здійснення 19. 21) Клітина згідно з варіантом здійснення 20, де клітина являє собою клітину дріжджів або рослинну клітину. 22) Трансгенна рослина або насіння, що містить рослинну клітину згідно з варіантом здійснення 21. 23) Трансгенна рослина згідно з варіантом здійснення 22, де зазначена рослина обрана із групи, що складається з маїсу, пшениці, рису, ячменю, цукрової тростини, сорго, жита, проса прутовидного, сої, Вгаззіса, соняшника, бавовнику або люцерни. 24) Виділений полінуклеотид що містить варіантний сайт, розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованої мегануклеази, здатної до введення двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить нуклеотидну послідовність із заміною щонайменше 1 нуклеотидної основи в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання ЗЕО ІЮО МО: 13. 25) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 24, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить послідовність зі змінами щонайменше 2, 3, 4 або 5 пар основ у порівнянні з БЕО ІЮ МО: 13. 26) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 24, де зазначений варіантний сайт розпізнавання містить: а) цитозин (С) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 1 в ЗЕО ІЮ МО: 13 р) цитозин (С) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 5 в ЗЕО ІЮО МО: 13; с) гуанін (С) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 10 в 5ЕО ІЮО МО: 13;
Зо Я) тимін (Т) аденін (А) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 11 в 5ЕО ІЮ
МО: 13; е) тимін (Т) у положенні, що відповідає нуклеотидному положенню 19 в БЕО ІЮО МО: 13; 7) будь-яку комбінацію з а)-є). 27) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 24, де зазначена варіантна послідовність розпізнавання обрана із групи, що складається з ЗЕЕО ІЮ МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20 і 21. 28) Виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 24, де про покращену активність розщеплення свідчить: а) вищий відсоток (96) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (96) розщеплення припустимого сайту розпізнавання 5ЕО ІО МО:13, де сайти розпізнавання розташовані на геномній ДНК;
Б) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з відсотком (96) розщеплення припустимого сайту розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на плазіидній ДНК; с) вища оцінка в аналізі на дріжджах для варіантного сайту розпізнавання в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання; або а) будь-яка комбінація (а), (Б) і (с). 29) Рекомбінантний фрагмент ДНК, що містить виділений полінуклеотид згідно з варіантом здійснення 24. 30) Клітина, що містить рекомбінантний фрагмент ДНК згідно з варіантом здійснення 29. 31) Клітина згідно з варіантом здійснення 30, де клітина являє собою клітину дріжджів або рослинну клітину. 32) Трансгенна рослина або насіння, що містить рослинну клітину згідно з варіантом здійснення 31. 33) Трансгенна рослина згідно з варіантом здійснення 32, де зазначена рослина обрана із групи, що складається з маїсу, пшениці, рису, ячменю, цукрової тростини, сорго, жита, проса прутовидного, сої, Вгаззіса, соняшника, бавовнику або люцерни. 34) Спосіб націлювання вставки полінуклеотиду, що представляє інтерес, у специфічний хромосомний сайт у геномі рослини, причому зазначений спосіб включає: бо а) трансформацію рослинної клітини або рослини фрагментом ДНК, що містять полінуклеотид, що представляє інтерес, де зазначений геном зазначених рослинної клітини або рослини містить щонайменше один варіантний сайт розпізнавання, обраний із групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 15, 16, 17, 18,19,20121; 1
Б) забезпечення наявності мегануклеази, здатної робити двонитковий розрив у варіабельному сайті розпізнавання з (а); і с) відбір зазначених рослинної клітини або рослини, що містять зазначений полінуклеотид, що представляє інтерес, інтегрований у зазначений варіантний сайт розпізнавання. 35) Спосіб згідно з варіантом здійснення 34, де забезпечення наявності зазначеної мегануклеази включає інтеграцію в геном зазначених рослинної клітини або рослини нуклеотидної послідовності, що кодує мегануклеазу 5ЕО ІЮ МО: 1. 36) Рослина або рослинна клітина, отримані за допомогою способу згідно з варіантом здійснення 34. 37) Спосіб націлювання вставки полінуклеотиду, що представляє інтерес, у специфічний хромосомний сайт у геномі рослини, причому зазначений спосіб включає: а) трансформацію рослинної клітини або рослини фрагментом ДНК, що містить полінуклеотид, що представляє інтерес, де зазначений геном зазначених рослинної клітини або рослини містить щонайменше один варіантний сайт розпізнавання, обраний із групи, що полягає з БЕО ІЮ МО: 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35;
Б) забезпечення наявності мегануклеази, здатної робити двонитковий розрив у варіабельному сайті розпізнавання з (а); і с) відбір зазначених рослинної клітини або рослини, що містять зазначений полінуклеотид ,»що представляє інтерес, інтегрований у зазначений варіантний сайт розпізнавання. 38) Спосіб згідно з варіантом здійснення 37, де забезпечення наявності зазначеної мегануклеази включає інтеграцію в геном зазначених рослинних клітин нуклеотидної послідовності, що кодує мегануклеазу 5ЕО ІО МО: З 39) Рослина або рослинна клітина, отримані за допомогою способу згідно з варіантом здійснення 37. 40) Спосіб ідентифікації варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового
Зо розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому зазначений спосіб включає: а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, де двонитковий розрив призводить у результаті до утворення тупого кінця; р) створення нуклеотидного липкого кінця з тупого кінця з (а); с) лігування першого адаптера з нуклеотидним липким кінцем з (б); а) розрізування легованої ДНК, отриманої на стадії (с), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування Фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; е) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (а), з еталонною геномною послідовністю ДНК; й
У ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву. 41) Спосіб згідно з варіантом здійснення 40, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, являє собою ендонуклеазу Сав. 42) Спосіб згідно з варіантом здійснення 41, де ендонуклеаза Са5 здатна до утворення комплексу з направляючою РНК, де зазначений комплекс дозволяє ендонуклеазі Са5 вводити двонитковий розрив у зазначену геномну ДНК. 43) Спосіб згідно з варіантом здійснення 40, де геномну ДНК вибирають із групи, що складається із прокаріотичної ДНК, еукаріотичної ДНК і синтетичної ДНК. 44) Спосіб згідно з варіантом здійснення 43, де еукаріотичну ДНК виділяють із рослини, дріжджів або тварини. 45) Спосіб ідентифікації варіантного сайту розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимому сайті розпізнавання, причому зазначений спосіб включає: а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення двониткового розриву в зазначену геномну ДНК, де двонитковий розрив призводить у результаті до утворення тупого кінця; бо р) створення нуклеотидного липкого кінця з тупого кінця з (а);
с) лігування першого адаптера з нуклеотидним липким кінцем з (Б); а) розрізання легованої ДНК, отриманої на стадії (с), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; е) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (а), з еталонною геномною послідовністю ДНК; й
У ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву; 9) аналіз активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву у варіантних сайтах розпізнавання з б); й
Р) ідентифікацію варіантного сайту розпізнавання, який призводить у результаті до підвищеної активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву в порівнянні з активністю в припустимому сайті розпізнавання. 46) Спосіб згідно з варіантом здійснення 45, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву являє собою ендонуклеазу Сав. 47) Спосіб згідно з варіантом здійснення 46, де ендонуклеаза Са5 здатна до утворення комплексу з направляючою РНК, де зазначений комплекс дозволяє ендонуклеазі Са5 вводити двонитковий розрив у зазначену геномну ДНК.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
ПРИКЛАД 1
Створення сконструйованих мегануклеаз, що рідко розщеплюють
А. Мегануклеаза 1 (3-4 і припустима послідовність розпізнавання для 1 (3-4
Ендогенний геномний цільовий сайт маїсу, що містить припустиму послідовність розпізнавання для І І(53-4 (ЗЕО ІЮ МО: 13), вибирали для розробки засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву (ЗЕО ІО МО: 1), як описано в публікації заявки на патент США 2009-0133152 А1 (опублікованої 21 травня 2009 року). Припустима послідовність розпізнавання для І І053-4 являє собою полінуклеотид розміром 22 п.о., що має наступну послідовність:
АТАТАССТСАСАССИатТАСаИсатА (5ЕО ІО МО: 13).
Зо В. Мегануклеази МНР14ч-.- і сайт розпізнавання для МНР14
Ендогенний геномний цільовий сайт омаїсу, що містить припустиму послідовність розпізнавання для МНРІ4- (ЗЕО ІЮ МО: 14), вибирали для розробки засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву (ЕС ІЮ МО: 3), як описано в заявці на патент
США 13/427138, поданої 22 березня 2012 року). Припустимий сайт розпізнавання для МНР14-- являє собою полінуклеотид розміром 22 п.о., розташований і, що має наступну послідовність: (ЗЕО ІЮО МО: 14) САААСАСАТТСАСИаТСАСАТТТ.
ПРИКЛАД 2
Продукування білка мегануклеази в Е. соїї
З метою одержання очищеного білка для іп мйго аналізів активності розщеплення мегануклеазою геномної і плазмідної ДНК, фрагменти ДНК, відповідні до відкритих рамок зчитування мегануклеази /ідЗ-4 (ЗЕО ІО МО: 2) і мегануклеази МНРІ4- (5ЕБЕО ІЮО МО: 4), поміщали у вектор експресії рОЕ8О (Оіадеп), трансформували в клітини Е. соїї ВІ 21-Сюоїй (Адіїеп! Тесппоіодієз) і вирощували протягом ночі на твердому середовищі ІВ, що містить 100 ррт (частин на мільйон) карбеніциліну. Колонії ресуспендували в 2 мл середовища 2ХУТ і 250 мкл клітинної суспензії використовували для інокуляції в 50 мл культури 2ХУТ, доповненої 100 ррт карбеніцилину. Культури вирощували при 37 "С протягом 1-1,5 години або до досягнення 00600 0,8, а потім експресію білка індукували додаванням 0,5 мл 100 мМ ІРТО. Культури охолоджували до кімнатної температури та забезпечували можливість експресії білка протягом 2 годин. Клітини осаджували центрифугуванням протягом 10 хвилин при 5000 гсї (одиниць відцентрового прискорення). Супернатант зливали, осад ресуспендували в 1 мл буфера 1 (50
ММ Тті5- НСІ (ра 8,0), 500 мМ Масі, 10 мМ імідазол) і переносили в 1,5 мл мікроцентрифужну пробірку. Клітини руйнували шляхом ультразвукової обробки у два етапи 1/8" мікронаконечником з 20 імпульсами (робочий цикл 50, потужність 4) на аналоговому обладнанні для ультразвукової обробки Вгапхоп 450 Апаіюд бопітег і центрифугували при 20000 гсї протягом 15 хвилин при 4 "С. Супернатант роз розводили в 4 мл буфера 1 і завантажували на одноразову колонку, що містить 0,3 мл нікель-вмісної смоли МіскеІ- МТА БЗирепіом/ гевіп (Оіадеп). Колонку промивали 5 мл буфера 2 (50 мМ Ттгі5- НСІ (ри 8,0), 500 мМ Масі, 60 мм імідазол) і білок елюювали 0,6 мл буфера 4 (50 мМ Ттгі5- НСІ (ри 8,0), 500 мМ Масі, 250 мм імідазол) у колонку Мімазріп (СЕ). Для концентрування зразків колонки мімазріп центрифугували 60 при 14800 гсї протягом приблизно 6 хвилин або до того, як меніск перебував між 75 і 50. Заміну буфера здійснювали з використанням колонки для знесолення ера бріп Юезайіпд СоЇштп (Ріегсе), попередньо врівноваженої буфером для зберігання (25 мМ Тті5- НСІ (рі 8,0), 100 мМ
Масі, 10 мМ Маосі», 5 мМ ЕОТА, 50 95 гліцерин). Після заміни буфера бичачий сироватковий альбумін додавали до кінцевої концентрації 100 нг/мкл й очищений білок зберігали при -20 70 до застосування.
ПРИКЛАД З
Іп міго аналізи розщеплення геномної ДНК
Для створення матеріалу для захоплення геномних варіантних сайтів розпізнавання іп міїго аналізи проводили з 114 нМ очищеного білка мегануклеази, виділеного, як описано в прикладі 2, і 6,07 мкг очищеної геномної ДНК маїсу при 32 "С протягом 80 хвилин у кінцевому обсязі 80 мкл при наявності буфера для розщеплення (50 мМ Тті5- НСІ (ри 7,9), 100 мМ Масі, 10 мМ
Масіг, 1 мм ОТТ, 5 мМ ЕОТА). Через 80 хвилин усю реакцію зупиняли рівним об'ємом стоп- буфера (100 мМ Ттгів- НСІ (рі 8,0), 600 мМ Меасі, 2 96 505, 100 мМ ЕОТА, 1 мг протеїнази К на мл) та інкубували при 50 "С протягом 30-45 хвилин. Реакційну суміш із зупиненою реакцією очищали за допомогою екстракції фенолом/хлороформом й осаджували етанолом при наявності 0,2 М масі. Осаджену геномну ДНК двічі промивали 70 95 етанолом, висушували та ресуспендували в 34 мкл води.
Концентрацію білка мегануклеази визначали візуально в гелях Ми- РАСЕ (І їТе Тесппоіодієв) шляхом розрахунку інтенсивності смуги та наступного її порівняння з такою для зразків відомої концентрації в серійному розведенні, й концентрацію геномної ДНК визначали з використанням флуориметричного аналізу з барвником Хехста.
Для підтвердження розщеплення (що представляє собою 95 втрати сайтів розпізнавання мегануклеазою) у передбачуваному геномному сайті розпізнавання проводили ПЛР у реальному часі на 1 мкл очищеної геномної ДНК із аналізом ТадМап, що охоплює сайт розпізнавання мегануклеазою. 95 розщеплення або втрати сайтів розпізнавання мегануклеазою розраховували за допомогою способу ЛАСІ щодо внутрішнього контролю в аналізі ТадмМап з використанням порожнього контролю як каліброваного стандарту.
ПРИКЛАД 4
Уловлювання геномних варіантних сайтів розпізнавання та одержання бібліотек для
Зо глибокого секвенування Шитіпа
У даному способі використовується підхід з новим адаптером, спеціально підібраним для уловлювання розщеплених хомінг-ендонуклеазою І-СтеІ або сконструйованою І-Сте! геномних варіантних сайтів розпізнавання, послідовність яких невідома й відрізняється за складом від припустимого сайту розпізнавання, який відрізняється від способів з використанням рестрикційних ферментів для здійснення секвенування зі зменшеним представленням, глибоке секвенування ДНК, пов'язане з рестрикцією (КАО-їад або КАОзед), повногеномне секвенування (МУС5) або генотипування за допомогою секвенування (585).
Оскільки хомінг-нуклеаза І- Сте!І утворює 4-нуклеотидний З'-липкий кінець в центрі свого сайту розпізнавання довжиною 22 п.о. (2, -1, -1, -2) при розщепленні (Потрзоп еї аї. (1992)
Сепе 119:247-51; і ЮОштепрегдег еї а). (1993) МоїЇ. Сеп. Сепеї 236:409-14), і, як було продемонстровано, розщеплює свій сайт розпізнавання в контексті різних комбінацій центральних 4 пар основ (2, я-1, -1, -2) (Моїїпа єї аї. (2012) Мисієїс Асіає Нев5. 40:6936-45), створювали адаптери, що містять 4-нуклеотидний З'-липкий кінець, що містить усі можливі комбінації нуклеотидів ДНК (С, Т, А або С) липкого кінця в еквімолярному розподілі. Таким чином, забезпечення ефективного лігування і повної комплементарності всім можливим липким кінцям, створеним при розщепленні сайту розпізнавання в геномі, який піддавався розщепленню хомінг-ендонуклеазою І-Сте! або сконструйованою 1-Стеї.
Подібні стратегії можна використовувати для інших засобів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву, таких як нуклеази "цинкові пальці" і нуклеази ТАГЕМ, які розщеплюють ДНК неспецифічним каталітичним доменом РоКІ, створюючи липкі кінці з варіабельними довжиною та нуклеотидним складом у спейсерній ділянці між ними (тій еї аї. (2000) Мисієїс Асій5 Не5. 28:3361-69; і її еї аїЇ. (2011) МисіІвїс Асід5 Кев5. 39:359-72). Для вловлювання геномних варіантних сайтів розпізнавання нефосфорильовані біотинільовані адаптери синтезували та очищали за допомогою НРІ С (ІпіедгаФеай ОМА Тесппоїодіев, Іпс.), що містить повністю вироджений 4-нуклеотидний 3'-нуклеотидний липкий кінець, комплементарний 4-нуклеотидному 3--липкому кінцю, створеному при розщепленні сайту розпізнавання мегануклеазою (5ЕО ІЮ МО: 5), і лігували приблизно з 2 мкг розщепленої мегануклеазою геномної ДНК (отриманої, як описано в прикладі 3) в 100 мкл реакційної суміші з лігазою Т4 (МЕВ) (представляючи перший адаптер у способі для ідентифікації варіантного сайту бо розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву). Зразки, що містять ліговану ДНК, потім завантажували в мікропробірки для ультразвукової обробки та довільним чином розрізали до середнього розміру піка 300 п.о. шляхом ультразвукової обробки в системі Сомагі5 Е220. Налаштування були наступними: 10905 робочий цикл, 140 пікова потужність падаючої хвилі й 200 циклів на розрив. Фрагменти з довжиною в діапазоні від 200 до 500 п.о. фракціонували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі з подальшою екстракцією з гелю з використанням набору для екстракції з гелю
Оіадеп Сеї Ехігасійп Кії відповідно до рекомендацій виробника.
Небіотинільовані кінці піддавали репарації з використанням набору для репарації Епа-й Епа гераїг Кії (Ерісепіге) в 75 мкл реакційної суміші та очищали на колонці (Оіадеп). Подовження 3'- липкого кінця на один А здійснювали шляхом інкубування репарованої ДНК при 37 "С протягом 30 хвилин в 50 мкл реакційної суміші, що містить АТР, їх буфер Кленова (МЕВпеход) і 15 одиниць фрагменту Кленова (без екзонуклеазної активності). Зразки потім очищували за допомогою колонки (Оіадеп) і лігували в індексовані Тгизед-сумісні адаптери Питіпа (які представляють собою другий набір адаптерів у способі для ідентифікації варіантного сайту розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву) в 50 мкл реакційної суміші, що містить 0,3 мМ індексований адаптер, їх буфер для лігування ОпісК
Ідакноп риїег і 5 одиниць ДНК лігази Т4 (МЕВ) при кімнатній температурі. Після лігування зразки інкубували при 65 "С протягом 15 хвилин і об'єм доводили до 100 мкл. Магнітне уловлювання за допомогою стрептавідину здійснювали з використанням стрептавідинових гранул бСупабеааз М- 280 (Іпмігодеп). Усього 100 мкл ресуспендованих 5ігеріамідіп-Оупабеаде (М-280) двічі промивали в ТЕ і ресуспендували в 100 мкл 2Х ВЩЗУМ буфера (10 мМ Ттгі5-НСІ, 1 мМ ЕОТА, 100 мкл 0,5 М ЕОТА, 2 М Масі). Зразки інкубували при 30 "С протягом 30 хвилин, супернатант видаляли і гранули промивали 4 рази 1 мл 1Х ВУМ/ буфера. Кінцевий збагачений зразок ресуспендували в 30 мкл буфера ЕВ.
Фрагменти вилучали із гранул за допомогою 12-циклової ПЛР із використанням майстер- міксу Рпизіоп (МЕВ) в 50 мкл реакційної суміші при наявності 0,4 пмоль праймера А для вилучення (ОТ ОАСАТОСТОСАТТОАСАСТТС; 5ЕБЕО ІЮ МО: 6) і праймера В для вилучення (Б'СААССАСААСАСОССАТАСОА; 5БО ІО МО: 7) відповідно до інструкцій виробника, за винятком того, що використовували температуру відпалу 66 "С і час подовження 30 секунд.
Зо Вилучену ДНК розщеплювали 5БІЇ (МЕВ) і очищували двічі з гранулами Адепсошгі АМРиге ХР
Веадз (5РКІ) відповідно до інструкцій виробника. Зразок лігували з Шитіпа-сумісним адаптером з ЗБИП-сумісним липким кінцем (ЗЕСО ІЮО МО: 8). Супернатант очищували двічі з використанням гранул Адепсошгі АМРиге ХР Веад5, спочатку з використанням співвідношення зразка до гранул 1:1,8, а потім 1:11. Кінцеві зразки ресуспендували в 50 мкл буфера ЕВ. Проводили другу ампліфікацію зі стандартним коктейлем ПЛР праймерів Тгизед РОК (Питіпа) з використанням температури відпалу 60 "С, з наступним дворазовим очищенням з використанням гранул
Адепсоцгі АМРиге ХР Веаадз5 при співвідношенні зразка до гранул 1:1,8, а потім 1:1. Кінцевий зразок ресуспендували в 20 мкл. Зразки оцінювали на біоаналізаторі, піддавали відносному кількісному аналізу з використанням ДРСК із праймерами для ЧФРСК Шитіпа і збирали в пул.
Перед секвенуванням пули піддавали селекції по розміру з використанням лабораторного чіпа для кристалографії Хепір (Саїїрег) відповідно до інструкцій виробника.
ПРИКЛАД 5
Нефосфорильовані адаптери підсилюють збагачення розщепленими мегануклеазою геномними сайтами розпізнавання
Для оцінки ефекту, який фосфорилювання здійснює на здатність першого адаптера (який описано в прикладі 4) до вловлювання та збагачення відносно розщеплених мегануклеазою геномних сайтів розпізнавання, були отримані бібліотеки як з фосфорильованими, так і нефосфорильованими адаптерами. Після нормалізації концентрації ДНК бібліотек їх оцінювали відносно збагачення розщепленим припустимим сайтом розпізнавання за допомогою ПЛР у реальному часі з аналізом ТадМап, що безпосередньо межує з припустимим сайтом розпізнавання. Як показано на фігурі 7, обидві бібліотеки демонстрували збагачення в порівнянні з порожнім контролем, але на графіках ампліфікації з бібліотеки, отриманої з нефосфорильованим адаптером, логарифмічна ампліфікація досягалася на набагато більш ранньому циклі ампліфікації, ніж з бібліотеки, отриманої з фосфорильованим адаптером. При використанні стандартних кривих, отриманих з геномної ДНК маїсу, бібліотеку, отриману з нефосфорильованим адаптером, оцінювали як приблизно в 900 разів більш збагачену відносно лівої половини припустимого сайту розпізнавання, ніж бібліотеку, отриману з фосфорильованим адаптером.
ПРИКЛАД 6 60 Глибоке секвенування ПШитіпа і підрізання після обробки
Після вловлювання й збагачення відносно геномних варіантних сайтів розпізнавання та одержання ДНК, як описано в прикладі 4, створення кластерів і секвенування ріда спареного кінця здійснювали на приладі Шитіпа сВої і геномному аналізаторі бСепоте Апаїулег Пх відповідно, згідно з інструкціями виробника. Приблизно 30 95 ( про./про.) контролю рпїхХ ДНК (Шитіпа) додавали до розчину бібліотеки ДНК перед виділенням кластерів. Очікувалося, що довільний склад основ фрагментів рпіХ ДНК компенсує будь-яке відхилення в складі основ поблизу сайту для мегануклеази. Набори команд на 100 циклів для спарених кінців використовували на геномному аналізаторі Шитіпа бепоте Апаїуег. Послідовності та оцінки якості одержували за допомогою програмного забезпечення ІПитіпа ріреїїпе версії 2.9 для аналізу зображення та розпізнавання основ. У ході розпізнавання основ дані контролю рпїх використовували для одержання оцінок погрішності та повторного калібрування неопрацьованих оцінок якості для інших зразків. Після первинного розпізнавання основ здійснювали додаткову фільтрацію за допомогою програмного забезпечення Шитіпа, при якій ріди виключали, якщо оцінка шуму перевищує граничні значення, визначені при розпізнаванні основ за допомогою Питіпа ріреїпе. За перетворенням результатів розпізнавання основ у формат БГАБТО (з використанням програмного забезпечення Шитіпа САЗЗАМА) слідувала додаткова фільтрація, при якій ріди підрізали та фільтрували відповідно до відповідної оцінки якості для кожної основи (де основи з якісною оцінкою нижче 10 підрізали з 3'-кінця ріда).
ПРИКЛАД 7
Іп 5ййсо збагачення та нанесення на фізичну карту даних про послідовність відносно геномного стандарту
Для додаткового збагачення стосовно розщеплених мегануклеазою і легованих з адаптером фрагментів геномної ДНК набір рідів з експерименту по секвенуванню фільтрували з використанням оригінального сценарію, який шукає пари рідів або одиночні об'єкти, де щонайменше один член з пари (або одиночний об'єкт) містить маркерну послідовність,
ССАССАССТ (ЗБО ІЮ МО: 9), на початку ріда або її комплементарну послідовність,
АССТССТОС (5ЕО ІО МО: 10), в кінці ріда. Пари або одиночні об'єкти рідів, що збігаються із цією послідовністю, записували в новий файл для використання на фазі нанесення на карту, тоді як інші відкидали.
Зо Для возз'єднання обох половин розщепленого геномного сайту розпізнавання набір збагачених рідів наносили на фізичну карту відносно цільового стандартного геному з використанням програми Боуліє версії 0.12.7 (І апдтеай В, ТгарпеїЇ С, Рор М, ЗаІ2бега 51.
Шгагазі апа тетогу-ейісіепі аїдптепі ої зпо ОМА 5едиепсев о Ше питап депоте. Сепоте
Віо! 10:К25.) для ідентифікації положень у геномі, гомологічних рідам. Налаштування вирівнювання для специфічності коректували індивідуально в кожному конкретному випадку залежно від характеристик цільового геному та від подібності цього геному з даними вихідного генотипу. Отримані в результаті вирівнювання потім використовували для виявлення піка та ідентифікації варіантних послідовностей розпізнавання, які присутні в геномі.
ПРИКЛАД 8
Виявлення піка та ідентифікація геномного варіантного сайту розпізнавання та композиція
З використанням геномних вирівнювань, отриманих у прикладі 7, виявлення піка виконували з використанням алгоритму МАС (модельний аналіз Спір-зед) для виявлення піка в Сепедаїа
Ехргезвіопівії Кеїїпег 7.5 (Сепедаїйа) з параметрами, перерахованими в таблиці 1.
Таблиця 1
Налаштування в алгоритмі МАС (модельний аналіз Спір- 5ед) для виявлення піка в Сепедаїйа Ехргеззіопіві Веїїпег 7.5 (бепедаїа)
Хромосомні ділянки зі значним збагаченням у порівнянні з порожнім контролем експортували в ехсеі. Ділянкам з найбільшою відмінністю між обробленими зразками та порожнім контролем віддавали перевагу, і їх підтверджували як збагачені в порівнянні з порожнім контролем, і такі, що мають сигнатуру піка, яка є результатом розщеплення геномної
ДНК, у функціональному компоненті Зепоте Вгом/узег в Сепедайїа Ехргеззіопібї Кеїїпег 7.5. Як показано на фігурі 1, сигнатури піка для сайту розпізнавання містять дані про послідовність, що походять і розходяться із сайтом розщеплення, причому центр, що перекривається, відповідає липкому кінцю, створеному засобом для індукції двониткового розриву. Виходячи з липкого кінця, визначеного за сигнатурою піка, можна ідентифікувати точну послідовність варіантного сайту розпізнавання, який присутній в геномній ДНК, як показано на фігурі 2. Для визначення правильної орієнтації послідовностей геномного варіантного сайту розпізнавання, їх вирівнювали з припустимим цільовим сайтом як у змістовій, так і в антизмістовій орієнтації, при цьому найбільш відповідну орієнтацію використовували як послідовність сайту розпізнавання.
Невелика частка геномних варіантних сайтів розпізнавання, що однаково добре відповідають обом орієнтаціям. Їх залишали в змістовій орієнтації. Орієнтовані геномні варіантні сайти розпізнавання вирівнювали та відсотковий склад нуклеотидів ДНК розраховували для кожного окремого положення сайту розпізнавання та порівнювали з припустимим сайтом розпізнавання.
Як показано на фігурі З, деякі положення в сайтах розпізнавання проявляли перевагу до сторонніх нуклеотидів; перевага по відношенню до нуклеотиду, відмінного від того, на який відбувається націлювання в припустимому сайті розпізнавання.
ПРИКЛАД 9
Іп міго аналізи розщеплення плазмідної ДНК
Активність розщеплення мегануклеазою іп міго також можна аналізувати з використанням плазмідної ДНК. Для порівняння активності розщеплення мегануклеазою у припустимих і варіантних сайтах розпізнавання гібридизовані олігонуклеотиди (синтезовані Іпіедгаїєд ОМА
Тесппоіодіеє5, Іпс.), які містять припустимий або варіантний сайт розпізнавання з липкими кінцями ЕсокКІ Ніпан, клонували в сайти рестрикційних ендонуклеаз Ніпа ії ЕсоКІ у плазміді рВінезсгірі ЗК. (Зігаїадепе, зараз компанія Адіїепі Тесппо!одіє5) і аналізували іп міго активність розщеплення ДНК, як описано в прикладі 3, з наступними модифікаціями. Хронометровані розщеплення здійснювали з 0,25 нМ субстрату-лінеаризованою плазмідою, що містить один припустимий або варіантний сайт розпізнавання, з 25 нМ очищеного білка мегануклеази. Іп міго аналізи проводили при 37 "С, 28 "С і 23 "С для найкращої оцінки активності розщеплення в заданому варіантному сайті розпізнавання. Реакційні суміші після зупинки реакцій очищали за допомогою колонки для очищення ПЛР продуктів Оіадеп РСК ригітісайоп соїштп відповідно до інструкцій виробника та очищену ДНК розводили в 200 разів перед кількісним визначенням активності розщеплення або 95 втрати сайтів розпізнавання за допомогою ДРОК.
ПРИКЛАД 10
Ідентифікація варіантних сайтів розпізнавання та вплив переваг до сторонніх нуклеотидів на активність розщеплення мегануклеазою
Для оцінки впливу, який переваги до сторонніх нуклеотидів здійснюють на активність розщеплення мегануклеазою, переваги до сторонніх нуклеотидів вводили в припустимий сайт розпізнавання окремо та у комбінації (див. фігуру 4), у такий спосіб створюючи варіантні сайти розпізнавання. Приклади таких варіантних сайтів розпізнавання показано в таблиці 2 для мегануклеази І І3-4 і в таблиці З для мегануклеази МНР'14к.
г Сг тилом Е г луки няні 3). наван рацію вЕОЮ МО с . птн модифікаціх ( сететттетеккюкю зі гантних показують на моди вик що - елік о заливкою, мому са пря вн й іно літині уванням і Етно пет ШИ г | | | | є відповідним розташ петенекн вою ще | | шт відповід ности 5 ва пкклрннннннннрентесс ! | ! щі о " 2345 . щі | ЗОВ о. . о. песня | | | | ех з . . що ОО о
Я ш б
С. трон а нал я ушеотиной КІ сайтів сть на модифікацію в порі Ше шин ік зарано мому сайті розиине СМЗ вбо МЕНЮ М) за з. відповідним розташува Ріо ат тт | ши
ЕТ п шо о Що п т с щ с - сло я - п стру р шин. с ї о. ХУ Б Ко с . ЗІ вич тт, тая с ЩІ й Є 1 ше ши о. сив п ЗК . с і - в!
Ще ше що. і й ше й ЖИТ, ВО, ща о. о ці яр о о й | й Ш !
АЛ в о "7 шо Щі -
Ще кто ЩЕ. тиклад) ши . о. о. віх о сяк описано в пр у шо п пікнік спе» ши розпія вали в сайти Поднат и
У ротінаютня Вік метнутетну з плонавсння одн реку «о ; сайти торі обімевотіі БК сайтів р сайти лення ппазнідної ДНК рі аг до ен мини Ш шо 10 як описано в рошірьнвов В тидів пенавання (див. ру БА і в). -), як с ендонуклоаз і Оіде еї як здисано в пом тніх нуклеот розпеанане (див. ту (2, т, ння хомінг - 39:6124 активність
При о сторон имий сайт ися добр их 4 осно озщепле Асідв мова слабка переважні би ньк пек мис цього се якщо пізнавання - більшу, ніж п сотидів У | з підвищеною ак ві кеш али якщо чоА переважа нукле зовні З, 7394380 9). для мегануклевзи на ТА ння Також, якщо сто едньо МОЇ. 39433 і 2 для М. показа в, 1 ння. Т безлосер а!. сісіс Асі у в положенні 22 Для УА, "сайті розпізнаса зон ста оцнснолт вро прігуєтнох ай " дим хЕЕТя розщеплення, Зо видаляли, як у сайті розпізнавання -ЗА, -22, -1Т, 7, 806, 110, було присутнє невелике підвищення активності розщеплення (див. фігуру 68), вказуючи на те, що розщеплення по аденіну в положенні 2 є контекст-специфічним і залежить від розпізнавання або конформації нуклеотидних основ, що прилягають до нього.
У комбінації, переваги до сторонніх нуклеотидів виявляють адитивний вплив на ефективність розщеплення, причому найкращі комбінації розщеплюються приблизно в 5-6 разів ефективніше, ніж припустимий сайт розпізнавання (фігура 6). Багато з варіантних сайтів розпізнавання можна навіть розщеплювати при температурах до 23 "С у випадку, коли тільки невелика активність розщеплення спостерігалася в припустимому сайті розпізнавання (фігура бА і В). Деякі комбінації переважних сторонніх нуклеотидів в 4 центральних основах (ж2,1,-1,-2) і в безпосередньо прилягаючих положеннях (ї3,-3) впливали на величину набутої активності розщеплення в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання.
Узяті в сукупності, дані авторів даного винаходу вказують на те, що способи, описані в даному документі, можна застосовувати для виведення переважних контактів основ ДНК, утворених мегануклеазою в окремих положеннях уздовж її ДНК-зв'язувальної поверхні контакту, забезпечуючи ретельну оцінку специфічності розщеплення, забезпечуючи новий підхід до вивчення специфічності мегануклеази в контексті геномної ДНК. Способи авторів даного винаходу також дозволяють ідентифікацію варіантних сайтів розпізнавання, які розщеплюються більш ефективно, ніж припустимий сайт розпізнавання.
ПРИКЛАД 11
Застосування варіантних сайтів розпізнавання у рослини або тварин
Варіантні сайти розпізнавання, ідентифіковані в прикладі 10, з покращеною активністю розщеплення в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання (-7С, 81 (1 ід3-4);-110, -70,-2а, -1Т, 481 (93-43; -11С, -70, -1Т, 481 (1 ід3-4)3; -ЗА, -20, -1Т, ї2А, 47Т, 480, -1120 (МНРІ14-); -ЗА, - 20, -1Т, 2А, 47Т, 480, 411А (МНРІ14-к); -ЗА, -20, -1Т, 4-7Т, 4680, -114: (МНР'14-); -205, -1Т, А, 7, --80, -110 (МНР14-к); -2а, -1Т, ї7тТ, «в, 41165 (МНР145), що відповідають ЗЕО ІЮО МО: 13- 35), або будь-який інший варіантний сайт розпізнавання, ідентифіковані за допомогою способу, описаного в даному документі, можна трансформувати в геном будь-якої рослини або тварини та піддати цілеспрямованому впливу для мутагенезу або вставки гена. Оскільки активність
Зо розщеплення в цих сайтах розпізнавання є підвищеною в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання, також можна підвищити і частоти модифікації сайту, в тому числі делеції, вставки або будь-якої комбінації цих двох модифікацій. Варіантні сайти розпізнавання також можна розташувати окремо або в комбінації на трансгенних касетах експресії, забезпечуючи можливість зміни, вирізання або вставки трансгенних частин.
ПРИКЛАД 12
Застосування до інших реактивів, що рідко розщеплюють, для індукції двониткового розриву
Оскільки олігонуклеотиди як з 5-, так і з 3-виродженими кінцями можна синтезувати в широкому діапазоні специфічних для користувача конфігурацій і значень довжини (Іпіедгаїтей
ДНК Тесппоїодіев, Іпс) і гібридизувати з утворенням двониткових ДНК адаптерів з 5'-, або з 3- виродженим липким кінцем, встановлені в даному документі способи можуть бути застосовні до будь-якого реактиву, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, який створює липкий кінець із основ ДНК при розщепленні. Вони будуть включати, але не обмежуються іншими хомінг-ендонуклеазами, нуклеазами "цинкові пальці" і ТАГЕМ.
ПРИКЛАД 13
Трансформація незрілих зародків маїсу
Трансформація може бути здійснена за допомогою різних способів, про які відомо, що вони є ефективними в рослинах, включаючи опосередковану частинками доставку, опосередковану
Адгорасієегічт трансформацію, опосередковану РЕС доставку та електропорацію. а. Опосередкована частинками доставка
Трансформацію незрілих зародків маїсу за допомогою опосередкованої частинками доставки проводили в такий спосіб. Склади середовищ представлені нижче.
Качани очищували від листкової обгортки та піддавали поверхневій стерилізації в 30 95 відбілювачі Сіогох разом з 0,5 956 миючого засобу Місго протягом 20 хвилин, та ополіскували двічі стерильною водою. Незрілі зародки виділяли й поміщали рубчиком униз (щитком нагору), 25 зародків на планшет, у середовище 560У на 4 години і потім вирівнювали в межах 2,5-см зони-мішені в препараті для бомбардування. Альтернативно, виділені зародки поміщали в 5601. (середовище для ініціювання) і поміщали в темряву при температурах, що варіюють у діапазоні від 26 "С до 37 "С, на 8-24 години перед поміщенням в 560 на 4 години при 26 "С перед бомбардуванням, як описано вище. бо Плазміди, що містять ген засобу, що індукує двонитковий розрив, і донорну ДНК,
конструювали за допомогою стандартних методик молекулярної біології та піддавали спільному бомбардуванню із плазмідами, що містять контролюючі розвиток гени ООР2 (фактор транскрипції ОЮР2 з доменами АР2 ( відповідальний за розвиток сім'язародку білок 2); 0520090328252 АТ) і Муизпеї! (052011/0167516).
Плазміди і ДНК, що представляє інтерес, осаджували на гранулах золота розміром 0,6 мкм (середній діаметр) за допомогою водорозчинного катіонного ліпіду ТїХ7М-50 (Мо по кат. Е1811,
Рготеда, Медісон, Вісконсин, США) у такий спосіб. Розчин ДНК готували на льоду із застосуванням 1 мкг плазмідної ДНК і необов'язкових інших конструкцій для спільного бомбардування, таких як 50 нг (0,5 мкл) кожної плазміди, що містить контролюючі розвиток гени
ООРа (фактор транскрипції ООР2 з доменами АРІ ( відповідальний за розвиток сім'язародку білок 2); 0520090328252 Ат) і М/и5пеям До попередньо змішаної ДНК додавали 20 мкл підготовлених часток золота (15 мг/мл) і 5 мкл ТЕХ-50 у воді та обережно перемішували. Частки золота осаджували в мікроцентрифузі при 10000 об./хв. протягом 1 хв. і супернатант видаляли.
Отриманий у результаті осад обережно ополіскували за допомогою 100 мл 100 95 ЕЮН без ресуспендування осаду й промивний ЕН обережно видаляли. Додавали 105 мкл 100 95 ЕЮНІі частки ресуспендували шляхом нетривалої ультразвукової обробки. Потім 10 мкл наносили на центральну частину кожного макроносія і їм дозволяли висохнути приблизно за 2 хвилини до бомбардування.
Альтернативно, плазміди і ДНК, що представляє інтерес, осаджували на гранулах вольфраму розміром 1,1 мкм (середній діаметр) за допомогою процедури осадження хлоридом кальцію (Сасіг) шляхом змішування 100 мкл підготовлених часток вольфраму у воді, 10 мкл (1 мкг) ДНК у буфері Тгіє- ЕОТА (1 мкг загальної ДНК), 100 мкл 2,5 М Сасі» і 10 мкл 01 М спермідину. Кожен реактив додавали послідовно до суспензії часток вольфраму з перемішуванням. Кінцеву суміш піддавали нетривалій ультразвуковій обробці та забезпечували інкубацію при постійному перемішуванні на вихровій мішалці протягом 10 хвилин. Після періоду осадження пробірки центрифугували протягом нетривалого часу, рідину видаляли, а частки промивали 500 мл 100 95 етанолу з наступним центрифугуванням протягом 30 секунд. Рідину знову видаляли і до кінцевого осаду часток вольфраму додавали 105 мкл 100 95 етанолу. Для бомбардування генною гарматою частки вольфраму із ДНК піддавали нетривалій
Зо ультразвуковій обробці. 10 мкл часток вольфраму із ДНК наносили на центральну частину кожного макроносія, після чого нанесеним часткам дозволяли висохнути приблизно за 2 хвилини до бомбардування.
Планшети зі зразками бомбардували на рівні Мо 4 за допомогою гелієвої генної гармати
Віогад. Усі зразки одержували однократний постріл при 450 фунт/кв. дюйм, при цьому загальна кількість аліквот, взятих з кожної пробірки з підготовленими частками із ДНК, становила десять.
Після бомбардування зародки інкубували в 560Р (підтримуючому середовищі) протягом 12- 48 годин при температурах, що варіюють у діапазоні від 26 "С до 37 "С, а потім поміщали в умови температури 26 "С. Через 5-7 днів зародки переносили в селективне середовище 560К, що містить З мг/літр біалафосу, і субкультивували кожні 2 тижні при 26 "С. Через приблизно 10 тижнів відбору калюсні клони, стійкість яких була виявлена в результаті відбору, переносили на середовище 288. для ініціювання регенерації рослин. Після дозрівання соматичних зародків (2- 4 тижні) добре розвинені соматичні зародки переносили в середовище для проростання та переносили в освітлювану кімнату для культивування. Через приблизно 7-10 днів саджанці, що розвиваються, переносили в безгормональне середовище 272М у пробірки на 7-10 днів, поки саджанці добре вкореняться. Рослини потім переносили у вставки в лотках (еквівалентні горщику на 2,5 дюйма), що містять грунтову горщикову суміш, і вирощували протягом 1 тижня у вегетаційній камері, згодом вирощуючи протягом додаткових 1-2 тижнів у теплиці, переносячи потім у горщики Сіаззіс 600 (1,6 галона) і вирощуючи до зрілості. За рослинами стежили та оцінювали в балах по ефективності трансформації та/або модифікації регенеративних
БО здібностей.
Середовище для ініціювання (5601) містить 4,0 г/л основних солей Мб (БІОМА С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (1000Х 5БІСМА-1511), 0,5 мг/л тіаміну-НСІ, 20,0 г/л сахарози, 1,0 мг/л 2,4-0 і 2,88 г/л І-проліну (доведених до об'єму за допомогою 0-І Н2О після доведення рн до 5,8 за допомогою КОН); 2,0 г/л Ссеїге (доданого після доведення до об'єму за допомогою О-
НгО) ії 8,5 мг/л нітрату срібла (доданого після стерилізації середовища та охолодження до кімнатної температури).
Підтримуюче середовище (560Р) містить 4,0 г/л основних солей Мб (БІОМА С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (1000Х 5БІСМА-1511), 0,5 мг/л тіаміну-НСІ, 30,0 г/л сахарози, 2,0 мг/л 2,4-О і 0,69 г/л І -проліну (доведених до об'єму за допомогою 0-І Н2О після доведення рн 60 до 5,8 за допомогою КОН); 3,0 г/л Ссеїгйе (доданого після доведення до об'єму за допомогою Ю-
НгО) і 0,85 мг/л нітрату срібла (доданого після стерилізації середовища та охолодження до кімнатної температури).
Середовище для бомбардування (560) містить 4,0 г/л основних солей Мб (БІСМА С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (1000Х 5БІСМА-1511), 0,5 мг/л тіаміну-НСЇІ, 120,0 г/л сахарози, 1,0 мг/л 2,4-О і 2,88 г/л І - проліну (доведених до об'єму за допомогою 0-І Н2О після доведення рН до 5,8 за допомогою КОН); 2,0 г/л Сеїпе (доданого після доведення до об'єму за допомогою р-І НгО) і 8,5 мг/л нітрату срібла (доданого після стерилізації середовища та охолодження до кімнатної температури).
Селективне середовище (560К) містить 4,0 г/л основних солей Мб (БІЗСМА С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (1000Х 5ІСМА-1511), 0,5 мг/л тіаміну-НСІ, 30,0 г/л сахарози й 2,0 мг/л 2,4-0 (доведених до об'єму за допомогою 0-І НгО після доведення рН до 5,8 за допомогою
КОН); 3,0 г/л Сеїгйе (доданого після доведення до об'єму за допомогою О-Ї Н2О) і 0,85 мг/л нітрату срібла та 3,0 мг/л біалафосу (обидва з яких додані після стерилізації середовища та охолодження до кімнатної температури).
Середовище для регенерації рослин (288.)) містить 4,3 г/л солей по М5 (СІВСО 11117-074), 5,0 мл/л вихідного розчину вітамінів по М5 (0,100 г нікотинової кислоти, 0,02 г/л тіаміну-НОСЇ, 0,10 г/л піридоксину-НСЇ і 0,40 г/л гліцину, доведених до об'єму за допомогою очищеної Ю-Ї
НгО) (Мигазпіде апа 5Коод (1962) Рпузіої. Ріапі. 15:473), 100 мг/л міоінозиту, 0,5 мг/л зеатину, 60 г/л сахарози й 1,0 мл/л 0,1 мМ абсцизової кислоти (доведених до об'єму очищеною 0-Ї НгО після доведення рн до 5,6); 3,0 г/л Сеїгйе (доданого після доведення до об'єму за допомогою О-
І Н2О), а також 1,0 мг/л індолілоцтової кислоти й 3,0 мг/л біалафосу (доданих після стерилізації середовища та охолодження до 60 "С).
Безгормональне середовище (272М) містить 4,3 г/л солей по М5 (СІВСО 11117-074), 5,0 мл/л вихідного розчину вітамінів по М5 (0,100 г/л нікотинової кислоти, 0,02 г/л тіаміну-НСІ, 0,10 г/л піридоксину-НСІ і 0,40 г/л гліцину, доведених до об'єму за допомогою очищеної 0-І Н2 ПРО), 0,1 г/л міоінозит і 40,0 г/л сахарози (доведених до об'єму за допомогою очищеної 0-І Н2 після доведення рН до 5,6); і 6 г/л бактоагару (доданого після доведення до об'єму за допомогою очищеної 0-І Н2О), її стерилізували та охолоджували до 60 "С. р. Опосередкована Адгобрасіегішт трансформація
Зо Опосередковану Адгобасіегічшт трансформацію проводили по суті відповідно до описаного в
БіиКапоміс еї аї. (2006) Ріапі Віоїєспй У 4:345-57. Коротко, незрілі зародки у віці 10-12 днів (розміром 0,8-2,5 мм) вирізали зі стерилізованих зерен і поміщали в рідке середовище (4,0 г/л основних солей Мб (Зідта С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (Зідта Е-1511), 1,0 мг/л тіаміну-НСЇ, 1,5 мг/л 2,4-0, 0,690 г/л І -проліну, 68,5 г/л сахарози, 36,0 г/л глюкози, рН 5,2). Після збору зародків середовище заміняли на 1 мл Адгобасіегішт у концентрації 0,35-0,45 00550.
Зародки маїсу інкубували з Адгобасіегішт протягом 5 хв. при кімнатній температурі, потім суміш виливали на планшет із середовищем, що містить 4,0 г/л основних солей Мб (5ідта С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (Зідта Е-1511), 1,0 мг/л тіаміну-НСІ, 1,5 мг/л 2,4-О0, 0,690 г/л І - проліну, 30,0 г/л сахарози, 0,85 мг/л нітрату срібла, 0,1 нМ ацетосірингону і 3,0 г/л Сеїйе, рН 5,8.
Зародки інкубували рубчиком униз у темряві протягом З днів при 20 "С, потім інкубували протягом 4 днів у темряві при 28 "С, потім переносили на нові планшети із середовищем, що містить 4,0 г/л основних солей Мб (Зідта С-1416), 1,0 мл/л вітамінної суміші Еріксона (Зідта Е- 1511), 1,0 мг/л тіаміну-НСЇ, 1,5 мг/л 2,4-0, 0,69 г/л І -проліну, 30,0 г/л сахарози, 0,5 г/л буфера
МЕЗ5, 0,85 мг/л нітрату срібла, 3,0 мг/л біалафосу, 100 мг/л карбеніциліну й 6,0 г/л агару, рН 5,8.
Зародки піддавали субкультивуванню кожні три тижні до ідентифікації трансгенних об'єктів.
Соматичний ембріогенез індукували шляхом переносу невеликої кількості тканини в середовище для регенерації (4,3 г/л солей по М5 (сірсо 11117), 5,0 мл/л вихідного розчину вітамінів по М5, 100 мг/л міоінозиту, 0,1 мкМ АВА, 1 мг/л ІАА, 0,5 мг/л зеатину, 60,0 г/л сахарози, 1,5 мг/л біалафосу, 100 мг/л карбеніцилину, 3,0 г/л Сеїгйе, рН 5,6) та інкубації в темряві протягом двох тижнів при 28 "С. Весь матеріал з видимими пагонами та коріннями переносили в середовище, що містить 4,3 г/л солей по М5 (ірсо 11117), 5,0 мл/л вихідного розчину вітамінів по М5, 100 мг/л міоінозиту, 40,0 г/л сахарози, 1,5 г/л Сеїгйе, рН 5,6, та інкубували під штучним освітленням при 28 "С. Через тиждень сіянці переміщали в скляні пробірки, що містили те ж саме середовище, і вирощували до відбору зразків з них та/або пересадження їх у грунт.
ПРИКЛАД 14
Транзієнтна експресія ВВМ підсилює трансформацію
Параметри протоколу трансформації можуть бути модифіковані для підтвердження того, що активність ВВМ є транзієнтною. Один такий спосіб включає осадження плазміди, що містить
ВВМ, способом, який дозволяє проходити транскрипції та експресії, але запобігає наступному 60 вивільненню ДНК, наприклад, за допомогою застосування хімічної сполуки РЕЇ.
В одному прикладі плазміду з ВВМ осаджували на частках золота за допомогою РЕЇ, тоді як трансгенну касету експресії (ОВІлпоРАТ-СЕРт:РІпії; тоРАТ являє собою оптимізований для експресії в маїсі ген РАТ), яка підлягає інтеграції осаджували на частинках золота за допомогою стандартного способу із застосуванням хлориду кальцію.
Коротко, частинкки золота покривали за допомогою РЕЇ у такий спосіб. Спочатку частинки золота промивали. Тридцять п'ять мг частинок золота із середнім діаметром 1,0 (А.5.І. Мо 162- 0010) відважували в мікроцентрифужну пробірку, і додавали 1,2 мл абсолютного ЕН, і перемішували вихровою мішалкою протягом однієї хвилини. Пробірку інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температуріа потім центрифугували з високою швидкістю, використовуючи мікроцентрифугу, протягом 15 хвилин при 4 "С. Надосадову рідину зливали, і додавали свіжу аліквоту етанолу (ЕН) на 1,2 мл, перемішували вихровою мішалкою протягом однієї хвилини, центрифугували протягом однієї хвилини, і надосадову рідину знову зливали (це повторювали двічі). Додавали свіжу аліквоту ЕН на 1,2 мл, і цю суспензію (частинки золота в
ЕЮН) зберігали при -20 "С протягом декількох тижнів. Для покриття частинок полиетиленіміном (РЕЇ!; Бідта МеР3143) 250 мкл суміші промитих частинок золота/ЕЮН центрифугували, і ЕН зливали. Частинки промивали один раз в 100 мкл ааН5» О для видалення залишкового етанолу, додавали 250 мкл 0,25 мМ РЕ! з наступною імпульсною ультразвуковою обробкою для суспендувания частинок, і потім пробірку занурювали у ванну із сухим льодом/ЕБН для миттєвої заморозки суспензії, яку потім ліофилізували протягом ночі. На даній стадії сухі покриті частинки можуть зберігатися при -80 "С протягом щонайменше З тижнів. Перед використанням частинки ополіскували З рази за допомогою аліквот 2,5 мМ буфера НЕРЕЗ на 250 мкл, рН 71, з 1х імпульсною ультразвуковою обробкою та наступним швидким перемішуванням вихровою мішалкою перед кожним центрифугуванням. Потім частки суспендували в кінцевому об'ємі 250 мкл буфера НЕРЕЗ5. Аліквоту частинок на 25 мкл додавали в невикористані пробірки перед прикріпленням ДНК. Для прикріплення непокритої ДНК частинки піддавали імпульсній ультразвуковій обробці, потім додавали 1 мкг ДНК (в 5 мкл води) з наступним перемішуванням шляхом втягування й випуску піпеткою кілька разів за допомогою Рірецетап та інкубували протягом 10 хвилин. Частки центрифугували протягом нетривалого часу (тобто 10 секунд), надосадову рідину видаляли, і додавали 60 мкл ЕН. Частки осадженої за допомогою РЕЇ ДНК-
Зо 1 промивали двічі в 60 мкл ЕН. Частинки центрифугували, надосадову рідину зливали й частки ресуспендували в 45 мкл води. Для прикріплення другої ДНК (ДНК-2) застосовували осадження за допомогою ТЕХ-50. 45 мкл суспензії частинки/ДНК-1 піддавали нетривалій ультразвуковій обробці, і потім додавали 5 мкл 100 нг/мкл ДНК-2 і 2,5 мкл ТЕХ-50. Розчин поміщали на ротаційний струшувач на 10 хвилин, центрифугували при 10000 д протягом 1 хвилини. Супернатант видаляли й частинки ресуспендували в 60 мкл ЕЮН. Розчин наносили на макроносії, і частинки золота, до яких були послідовно прикріплені ДНК-1 і ДНК-2, доставляли в клітини щитка незрілих зародків Ні-ІІЇ на стадії 10 САР, використовуючи стандартний протокол для РОБЗ-1000. У цьому експерименті плазміда із ДНК-1 містила касету експресії ОВІ:КЕР:ріпії, а плазміда із ДНК-2 містила касету експресії ОВІ:СЕР:ріпії. Через два дні після бомбардування спостерігали транзієнтну експресію флуоресцентних маркерів як СЕР, так і КЕР у вигляді чисельних червоних і синіх клітин на поверхні незрілого зародка. Зародки потім поміщали в неселективне культуральне середовище, і їм дозволяли рости протягом З тижнів перед оцінюванням у балах стабільних колоній. Після цього З-тижневого періоду спостерігали 10 багатоклітинних, стабільно експресуючих синіх колоній у порівнянні з лише однією червоною колонією. Це показало, що осадження за допомогою РЕЇ можна застосовувати для ефективного введення ДНК для транзієнтної експресії, при цьому суттєво знижуючи ступінь інтеграції, осадженої за допомогою РЕ! ДНК , що вводиться і, таким чином, ослаблюючи регенерацію трансгенних об'єктів, експресуючих КЕР. Таким чином, осадження за допомогою РЕЇ можна застосовувати для забезпечення транзієнтної експресії ВВМ і/або УМО52.
Наприклад, частинки спочатку покривали ОВІ:ВВМ:ріпі! за допомогою РЕЇ, потім покривали
ВІ: тоРАТ УТЕР за допомогою ТЕХ-50, а потім вводили в клітини щитка на поверхні незрілих зародків за допомогою бомбардування. Осадження, опосередковане РЕЇ, обумовлює високу частоту зустрічі клітин із транзієнтною експресією на поверхні незрілого зародка та надзвичайно низькі частоти регенерації стабільних трансформантів (у порівнянні зі способом з використанням ТЕХ-50). Таким чином, припускається, що осаджена за допомогою РЕЇ касета з
ВВМ експресується транзієнтно й стимулює сплеск ембріогенного росту на поверхні тканини, яка бомбардується (тобто поверхні щитка), але ця плазміда не буде інтегруватися.
Припускається, що плазміда з РАТ-УСЕР, звільнена від частинок золота, на яких вона була осаджена за допомогою Сажвж, інтегрується та експресує маркер, який селектується, із бо частотою, яка обумовлює суттєво покращену регенерацію трансгенних об'єктів. У якості контрольної обробки осаджені за допомогою РЕЇ частки, що містять ОВІ:ЗИ5:ріпі! (замість
ВВМ), змішували із частками з РАТ-ОЕР, осадженими за допомогою Сажв. Незрілі зародки після обох обробок переміщали в культуральне середовище, що містить З мг/л біалафосу.
Припускають, що СЕР. калюси, стійкі до біалафосу, будуть спостерігатися через 6-8 тижнів з набагато вищою частотою у випадку обробки РЕІ/ВВМ у порівнянні з контрольною обробкою (РЕМОШБ).
У якості альтернативного способу плазміду з ВВМ осаджували на частинках золота за допомогою РЕЇ і потім вводили в клітини щитка на поверхні незрілих зародків, і наступна транзієнтна експресія гена ВВМ викликала швидку проліферацію в ході росту ембріогенного калюсу. Протягом даного періоду індукованого росту експланти обробляли Аадгобасіегішт, використовуючи стандартні способи для маїсу (див. приклад 1), з доставкою Т-ДНК у клітину за допомогою введення трансгенної касети експресії, такої як ОВІ: тоРАТ УОЕРт:ріпі!. Після спільного культивування експлантам дозволяли регенерувати в нормальному культуральному середовищі, і їх потім переміщали в культуральне середовище, що містить З мг/л біалафосу.
Припускають, що СЕР калюси, стійкі до біалафосу, будуть спостерігатися через 6-8 тижнів з набагато вищою частотою у випадку обробки РЕІ/ВВМ у порівнянні з контрольною обробкою (РЕМОШБ).
Може бути необхідним "активізувати" ріст калюсу шляхом транзієнтної експресії ВВМ і/або полінуклеотидних продуктів М/ЛО52. Це може бути виконано шляхом доставки 5'-ксепованої поліаденільованої РНК ВВМ ії МЛО52, касет експресії, що містять ДНК ВВМ і УМО52, або білків
ВВМ і/або УМО52. Всі ці молекули можуть бути доставлені за допомогою біолістичної генної гармати. Наприклад, 5'і-кепована поліаденільована ВВМ і/або УУЛО52 РНК може бути легко створена іп міго, застосовуючи набір Атбріоп'є тМеззаде тМаспіпе. РНК піддавали спільній доставці разом із ДНК, що містить полінуклеотид, який представляє інтерес, і маркер, який використовується для відбору/скринінгу, як наприклад, Обі: тоРАТ «ЗЕРт:Ріпії. Припускається, що клітини, які отримують РНК, негайно почнуть ділитися швидше, і більша частина цих клітин буде мати інтегрований агрономічно важливий ген. Може бути додатково підтверджено, що ці трансгенні об'єкти являють собою трансгенні клональні колонії, тому що вони будуть також експресувати білок злиття РАТ-СЕР (і, таким чином, будуть проявляти зелену флуоресценцію
Зо при відповідному освітленні). Рослини, регенеровані з даних зародків, можуть потім зазнати скринінгу щодо наявності полінуклеотиду, який представляє інтерес.
ПРИКЛАД 15
Одержання та трансформація в модельній системі культур соматичних зародків сої векторами експресії в сої і регенерація рослин
Умови культивування
Ембріогенні суспензійні культури сої (сорт даск) підтримували в 35 мл рідкого середовища 58196 (нижче) на ротаційному струшувачі при 150 об./хв. і 26 "С з люмінесцентними лампами холодного білого світла з фотоперіодом 16:8 годин день/ніч при інтенсивності світла 60-85 мМкКЕрг/м2/с. Культури пересівали від одного разу на 7 днів до одного разу на два тижні шляхом інокуляції приблизно 35 мг тканини в 35 мл свіжого рідкого 58196 (кращий інтервал між пересіваннями становив 7 днів).
Ембріогенні суспензійні культури сої трансформували за допомогою плазмід експресії для сої за допомогою способу бомбардування частинками (Кієїп еї аї., Маїшге, 327:70 (1987)) із застосуванням обладнання ЮиРопі Віоїїстіє РОБ1000/НЕ (гелієва модифікована установка) для всіх трансформацій.
Ініціація ембріогенних суспензійних культур сої
Здійснювали ініціацію культур сої двічі на місяць із інтервалом 5-7 днів між кожною ініціацією. Стручки з незрілими насіннями від доступних рослин сої збирали через 45-55 днів після посадки. Насіння видаляли зі стручків і поміщали в стерилізований контейнер Мадепіа.
Насіння сої стерилізували шляхом струшування протягом 15 хв. в 5 905 розчині Сіогох з 1 краплею мила "Імогу" (тобто 95 мл автоклавованої дистильованої води плюс 5 мл Сіогох і 1 краплею мила, ретельно змішане). Насіння промивали з використанням 2 1-літрових флаконів зі стерильною дистильованою водою і насіння розміром менше 4 мм поміщали на окремі предметні скельця мікроскопу. Зрізали гострий кінець насіння та видавлювали сім'ядолі з насінної оболонки. Коли культури були підготовлені для проведення трансформації, сім'ядолі переносили на плашки, що містять середовище 5В1 (25-30 сім'ядоль на плашку). Планшети обертали волокнистою стрічкою й підтримували при 26 "С з освітленням флуоресцентними лампами холодного білого з фотоперіодом день/ніч 16:8 годин при інтенсивності світла 60-80 мкКЕрг/м2/с протягом восьми тижнів із заміною середовища кожні 4 тижні. Коли культури були 60 підготовлені для експериментів у модельній системі, сім'ядолі переносили на плашки, що містять середовище 58199 (25-30 сім'ядоль на плашку), на 2 тижні, а потім переносили на 5В1 на 2-4 тижні. Умови освітлення і температури були такими ж, як описано вище. Після інкубування на середовищі 5В1 вторинні зародки вирізали й поміщали в рідке середовище
ЗВ196 на 7 днів.
Одержання ДНК для бомбардування
Для бомбардування використовували або інтактну плазміду, або фрагмент ДНК плазміди, що містить гени, які представляють інтерес, і маркерний ген, що селектується. Фрагменти з плазмід експресії в сої одержували шляхом виділення розщеплених плазмід у гелі. У кожному випадку 100 мкг плазмідної ДНК використовували в 0,5 мл специфічної суміші ферментів, описаної нижче. Плазміди розщеплювали Авзсі (100 одиниць) у буфері МЕВийнег 4 (20 мМ Ттгів- ацетат, 10 мМ ацетат магнію, 50 мМ ацетат калію, 1 мМ дітіотриетол, рН 7,9), 100 мкг/мл В5А і 5
ММ бета-меркаптоетанолі при 37 "С протягом 1,5 години. Отримані фрагменти ДНК розділяли за допомогою електрофорезу в гелі на 1 95 агарозі ЗеаРіадое ТО (ВіомУпнакег Моїесшаг
Арріїсайноп5) і фрагменти ДНК, що містять касети з генами, вирізали з агарозного гелю. ДНК очищали від агарози з використанням ферменту СЕ азе, який розщеплює, згідно із протоколом виробника. 50 мкл аліквоту, що містить З мг золотих частинок (З мг золота), стерильної дистильованої води додавали до 30 мкл розчину ДНК у концентрації 10 нг/мкл (або інтактної плазміди, або фрагменту ДНК, отриманого, як описано в даному документі), 25 мкл 5 М СасіІг2і20 мклО1 М спермідину. Суміш струшували З хвилини на струшувачі Могіех при рівні З ії центрифугували протягом 10 секунд на настільній мікроцентрифузі. Супернатант видаляли з наступним промиванням 400 мкл 100 95 етанолу та ще одного короткого центрифугування. 400 мкл етанолу видаляли і осад ресуспендували в 40 мкл 100 95 етанолу. П'ять мкл суспензії ДНК розподіляли на кожен диск-носій в обладнанні для біолістичного бомбардування Віоїїсіс
РОБЗІ1000/НЕ. Кожна 5 мкл аліквота містила приблизно 0,375 мг золота на бомбардування (наприклад, на диск).
Для трансформацій у модельній системі протокол був ідентичним за винятком декількох незначних змін (тобто 1 мг золотих частинок додавали до 5 мкл 1 мкг/мкл розчину ДНК, використовували 50 мкл 2,5 М Сасі» і осад в остаточному підсумку ресуспендували в 85 мкл 100
Зо до етанолу, у такий спосіб забезпечуючи 0,058 мг золотих частинок на бомбардування).
Одержання тканин і бомбардування ДНК
Приблизно 150-200 мг семиденних ембріогенних суспензійних культур поміщали в порожню стерильну 60 х 15 мм чашку Петрі, чашку накривали пластмасовою сіткою. Забезпечували розрідження в камері до зниженого тиску 27-28 дюймів ртутного стовпа й тканину бомбардували одним або двома пострілами на плашку, причому тиск розривам мембрани встановлювали на 1100 фунт/дюйм. Тканину поміщали приблизно в 3,5 дюймах від затримуючого/обмежувального екрану. Умови трансформації в модельній системі були ідентичними за винятком використання 100-150 мг ембріогенної тканини, тиск розриву встановлювали на 650 фунт/дюйм" і тканину поміщали приблизно в 2,5 дюймах від затримуючого екрану.
Відбір трансформованих зародків
Відбір трансформованих зародків проводили або з використанням гігроміцину (коли ген гігроміцин-В-фосфотрансферази (НРТ) використовували в якості маркера, який селектується) або хлорсульфурона (коли ген ацетолактат-синтази (АЇ 5) використовували в якості маркера, який селектується).
Після бомбардування тканину поміщали у свіже середовище 58196 і культивували, як описано вище. Через шість-вісім днів після бомбардування 58196 заміняли свіжим 58196, що містить або 30 мг/л гігромицину, або 100 нг/мл хлорсульфурону залежно від використовуваного маркера, який селектується. Селективне середовище оновлювали щотижня. Через чотири- шість тижнів після відбору спостерігали ріст зеленої трансформованої тканини з нетрансформованих некротичних ембріогенних кластерів.
Дозрівання зародків
Для отримання трансформантів виділену зелену тканину видаляли та інокулювали в багатолункові планшети для утворення за допомогою клонального розмноження нових трансформованих ембріогенних суспензійних культур. Трансформовані ембріогенні кластери культивували протягом чотирьох-шести тижнів у багатолункових планшетах при 26 "С в 58196 під флуоресцентними лампами холодного білого світла (РИйірб5 соо! м/йе Есопожай
Е40/СМИКЗ/ЕММ) і лампами Адго (РПййре 40 Адго) (40 Вт) з фотоперіодом 16:88 год. при інтенсивності освітлення 90-120 мкЕрг/мес. Після цього періоду часу зародкові кластери 60 видаляли у твердому агаровому середовищі, 58166, протягом одного-двох тижнів, а потім субкультивували в середовище 5В103 на 3-4 тижні для дозрівання зародків. Після дозрівання на планшетах в 58103 окремі зародки видаляли із кластерів, сушили та піддавали скринінгу відносно змін у складі їх жирних кислот, як описано в прикладі 7.
Для трансформацій у модельній системі дозрівання зародків забезпечували в рідкому середовищі для тканинного диференціювання та дозрівання сої (рідке середовище 5Нам;
Ззсптіаї еї а!І., Се!Ї Віоїоду апа Могрподепевзів 24:393 (2005)) з використанням модифікованої процедури. Коротко, після 4 тижнів відбору в 5В196, як описано вище, зародкові кластери видаляли в 35 мл 58228 (рідкого середовища 5Нам) в 250 мл колбу Ерленмеєра. Тканину підтримували в рідкому середовищі ЗНам на ротаційному струшувачі при 130 об./хв. і при 26 С з освітленням флуоресцентними лампами холодного білого з фотоперіодом день/ніч 16:8 годин при інтенсивності світла 60-85 мкЕрг/м-е/с протягом 2 тижнів до дозрівання зародків. Зародки вирощували протягом 2 тижнів у рідкому середовищі З5Нам були еквівалентними за розміром та вмістом жирних кислот зародкам, культив
Прописи середовищ
ЗВ 196 - рідке середовище для проліферації ЕМ І йе (на літр)
М5 ГеєгОТА - 100х матковий розчин 1 10 мл
М5 сульфат - 100х матковий розчин 2 10 мл
Галогеніди ЕМ І Це - 100х матковий розчин З 10 мл
Р, В, Мо ЕМ Це - 100х матковий розчин 4 10 мл
Вітаміни В5 (1 мл/л) 1,0 мл 2,А-О (кінцева концентрація 10 мг/л) 1,0 мл
КМОз 2,83 г (МНаА)2504 0,463 г
Аспарагін 1,0 г
Сахароза (1 95) 10 г рн 5,8
Маткові розчини ЕМ І йе
Номер маткового розчину 1000 мл 500 мл 1 М5 Ге ЕОТА, 100х матковий розчин
Коо) Маг ЕОТА" 3,724 г 1,862 г
Ее5О4-7НгО 2,184 г 1,392 г "Додають у першу чергу, потім розчиняють у флаконі з темного скла при перемішуванні 2 М5 сульфат, 100х матковий розчин 35 М49БоО» -7нН20 37,0 г 18,5 г
Ми5О»-НгО 1,69 г 0,845 г 7п502-7Н20 0,86 г 0,43 г бизОї-5НгО 0,0025г ю 0,00125г
З Галогеніди ЕМ Ще, 100х матковий розчин 40 Сась-гНг2Оо 30,0 г 15,0 г
КІ 0,083 г 0,0715 г
Сосі; - бБНгО 0,0025г 0,00125г 4 Р, В, Мо ЕМ Це, 100х матковий розчин
КНегРО»Х 18,5 г 9,25 г 45 НзВОз 0,62 г 0,31 г
Маг2?МоО.-2Н2О 0,025 г 0,0125 г
Щільне середовище 5ВІ (на літр) 1 упаковка солей М5 (бібсо/ ВЕ. - Мо у каталозі 11117-066) 1 мл вітамінів В5, 1000Х матковий розчин 50 31,5 г глюкози 2 мл 2,4-О (кінцева концентрація 20 мг/л) рН 5,7 8 гагару ТС
Щільне середовище 58199 (на літр) 55 1 упаковка солей М5 (бібсо/ ВЕ. - Мо у каталозі 11117-066) 1 мл вітамінів В5, 1000Х матковий розчин г сахарози 4 мл 2,4-О (кінцева концентрація 40 мг/л) рн 7,0 бо 2 г Сеїше
Щільне середовище ЗВ 166 (на літр) 1 упаковка солей М5 (бібсо/ ВЕ. - Мо у каталозі 11117-066) 1 мл вітамінів В5, 1000Х матковий розчин 60 г мальтози 750 мг гексагідрату МоСІ» 5 гактивованого вугілля рН 5,7 2 г деіе
Щільне середовище 5В 103 (на літр) 1 упаковка солей М5 (бібсо/ ВЕ. - Мо у каталозі 11117-066) 1 мл вітамінів В5, 1000Х матковий розчин 60 г мальтози 750 мг гексагідрату МоСІ» рН 5,7 2 г деїйе
Щільне середовище 5В 71-4 (на літр) 1 флакон солей Сатрогод'5 В5 із сахарозою (Сібсо/ВКІ. - Мо у каталозі 21153-036) рН 5,7 5 гагару ТС
Матковий розчин 2,4-0
Одержують попередньо приготованим від РПпуїоїесп Мо у каталозі О 295 - концентрація 1 мг/мл.
Матковий розчин вітамінів В5 (на 100 мл)
Аліквоти зберігають при -20 С 10 г міоінозиту 100 мг нікотинової кислоти 100 мг піридоксину-НСІ 1 г тіаміну
Якщо розчин не розчиняється досить швидко, застосовують низький рівень нагрівання за допомогою гарячої плити для нагрівання.
ЗВ 228 - середовище для тканинної диференціації та дозрівання сої (ЗНам) (на літр) ро но 600 мл
Макросолі ЕМ-І пе для ЗНам, тох 100 мл
Мікросолі М5, 1000х 1 мл
М5 РеєгОТА, 100х 10 мл
Сасі, 1ооОх 6,82 мл
Вітаміни В5, 1000х 1 мл -метіонін 0,149 г
Сахароза ЗО г
Сорбіт ЗО г
Доводять об'єм до 900 мл рн 5,68
Автоклавують
Додають в охолоджене середовище («30 "С): "глутамін (кінцева концентрація 30 нМ) 4 9о 110 мл "Примітка: Кінцевий об'єм буде становити 1010 мл після додавання глутаміну.
Оскільки глутамін розкладається відносно швидко, його краще додавати безпосередньо перед застосуванням середовища. Закінчення строку придатності відбувається через 2 тижні після додавання глутаміну; базове середовище можна зберігати довше без глутаміну.
Макросолі ЕМ-І пе для ЗНАМ, 10Х - матковий розчин Мо 1 (на літр) (МНа)2505 (сульфат амонію) 4,63 г
КМО: (нітрат калію) 28,3 г
Ма5о-477НгО (гептагідрат сульфату магнію) З г
КНеРоОх (фосфат калію, одноосновний) 1,85 г
Доводять до об'єму
Автоклавують
Мікросолі М5, 1000Х - матковий розчин Мо 2 (на 1 літр)
НзВоОз (борна кислота) б2 г
Ми5О НО (моногідрат сульфату марганцю) 16,9 г 60 7пЗОК7НгО (гептагідрат сульфату цинку) 8,бг
Маг?МоО"2НнегО (дигідрат молібдату натрію) 0,25 г би5О5НгО (пентагідрат сульфату міді) 0,025 г
Сосіь"бНноО (гексагідрат хлориду кобальту) 0,025 г
КІ (йодид калію) 0,8300 г
Доводять до об'єму
Автоклавують
Ее ЕОТА, 100Х - матковий розчин Ме З (на літр)
МагЕОТА" (ЕОТА натрію) 3,73 г
Еєе 50 47Н2О (гептагідрат сульфату заліза) 2,18 г "ЕОТА повинен повністю розчинитися перед додаванням заліза.
Доводять до об'єму
Розчин є світлочутливим. Флакон(и) повинні бути загорнуті у фольгу щоб уникнути світла.
Автоклавують
Са, 100Х - матковий розчин Ме 4 (на літр)
Сасі»2н2о (дигідрат хлориду кальцію) 44 г
Доводять до об'єму
Автоклавують
Вітаміни В5, 1000Х - матковий розчин Мо 5 (на літр)
Тіамін"НеСІ 10 г
Нікотинова кислота 1г
Піридоксин" НСІ 1г
Міоінозит 100 г
Доводять до об'єму
Зберігають замороженим 4 до Глутамін - матковий розчин Ме 6 (на літр) рої вода, підігріта до 30 С 900 мл
І -глутамін 40 г
Поступово додають при перемішуванні та застосуванні слабкого нагрівання.
Не перевищують температуру 35 "С.
Ко) Доводять до об'єму
Стерилізують фільтруванням
Зберігають замороженим" "Примітка: підігрівають розморожений матковий розчин на бані температурою 31 "С для повного розчинення кристалів.
Регенерація соматичних зародків сої в рослини
Для отримання цілих рослин з ембріогенних суспензійних культур тканину потрібно регенерувати. Забезпечували дозрівання зародків, як описано вище. Після субкультивування на середовищі 5В103 протягом З тижнів окремі зародки можна вилучити з кластерів і піддати скринінгу щодо змін у складі їх жирних кислот, як описано в прикладі 7. Слід зазначити, що на цій стадії можна піддати скринінгу будь-який фенотип, який виявляється, і який є результатом експресії генів, які представляють інтерес. Він включає без обмеження зміни в профілі жирних кислот, профіль білків і їх склад, склад вуглеводів, швидкість росту, життєздатність або здатність до нормального розвитку в рослину сої.
Зрілі окремі зародки висушували шляхом поміщення їх у порожню невелику чашку Петрі (35 х 10 мм) приблизно на 4-7 днів. Планшети обертали волокнистою стрічкою (створюючи невелику камеру з регульованою вологістю). Висушені зародки висаджували в середовище
ЗВ71-4, де їх залишили проростати за тих самих умов культивування, що описані вище.
Пророщені саджанці видаляли із середовища для проростання та ретельно промивали водою, а потім висаджували в середовище Кеді-Еагій в 24-лунковий пакувальний підніс, накривали прозорим пластиковим куполом. Через 2 тижні купол видаляли і рослини піддавали загартовуванню протягом додаткового тижня. Якщо саджанці виглядали загартованими, їх пересаджували в 10" горщик із середовищем Кеаі-Еагій у кількості до З саджанців на горщик.
Після 10-16 тижнів зріле насіння збирали, лущили та аналізували відносно жирних кислот.
ПРИКЛАД 16
Система для скринінгу по відношенню до мегануклеазної активності на основі дріжджів
Створювали штами дріжджів для скринінгу в якості хазяїв для скринінгу по відношенню до мегануклеазної активності. Ген дріжджів Аде2 (СепеїйКа 1987 4и0І-23(7)71141-8) (ЗЕО ІО МО: 36) використовували як маркерний ген з видимим проявом, а також як маркер, який селектується, на схемі, зображеній на фігурі 7. Фрагменти гена, що відповідають першим 1000 нуклеотидам бо кодуючої послідовності, Аде2 (5'-фрагмент Аде2) і останнім 1011 нуклеотидам кодуючої послідовності, Аде2 (3'-фрагмент Ааег), руйнували за допомогою
Між 5'-фрагментом Ааве2 і 3'фФрагментом Аде2 знаходились 305 нуклеотидів дуплікованих послідовностей. Отримані в результаті конструкції використовували для заміщення гена Аде2 (положення нуклеотидів 566193-564480 у хромосомі 15) штаму дріжджів ВУ4247. Отримані в результаті штами дріжджів для скринінгу МЕК8145, МЕК8189 і НО1327 можна охарактеризувати як ВУ4742 МАТа ПізЗзаенаї! Іеєиг2аеєнао уз2аенкао игазаеєна0 Саі2ю. Якщо розрізання мегануклеазою відбувається між дуплікованими послідовностями, може відбуватися гомологічна рекомбінація, у результаті чого утворюється функціональний ген Адег2.
Утворення функціонального гена Аде2 можна застосовувати в якості критерію відбору: якщо дріжджові клітини ростуть на середовищі з нестачею аденіну, то до росту здатні тільки ті з них, які мають функціональний ген Аае2.
Утворення функціонального гена Аде2 також можна використовувати як критерій скринінгу.
Клітини дріжджів з функціональним геном Аде2 були білими, тоді як такі, у яких відсутнє функціонування Аде2, проявляли червоне забарвлення у зв'язку з більш раннім нагромадженням метаболіту в шляху біосинтезу аденіну, що в результаті призводить до утворення червоних колоній з білими секторами, показаному на фігурах 8 і 9. Ступінь утворення білих секторів, що іноді поширюється на цілі колонії, вказує на величину активності розрізання, властивої мегануклеазам. Оскільки фенотип утворення секторів є якісним показником мегануклеазної активності, задіяли числову систему кількісних показників 0-4. Як показано на фігурі 9, кількісний показник 0 означає, що білі сектори не спостерігалися (було відсутнє розрізання мегануклеазами); кількісний показник 4 означає повністю білі колонії (повне розрізання сайту розпізнавання); кількісні показники 1-3 означають проміжні фенотипи утворення білих секторів (і проміжні ступені розрізання сайту розпізнавання).
ПРИКЛАД 17
Аналіз варіантних послідовностей розпізнавання для мегануклеази 1 І(53-4 і МНР14 х у маїсі
Для демонстрації активності розщеплення ідентифікованих у даному документі варіантних сайтів розпізнавання іп ріапіа варіантний сайт розпізнавання, який зустрічається в природі, (ЗБЕО ІО МО: 11) для мегануклеази МНРІ14ж- ідентифікували в маїсі та активність його розщеплення іп ріапіа (вимірювана по частоті мутагенезу сайту розпізнавання) і активність
Зо розщеплення іп міго порівнювали з активністю розщеплення припустимого сайту розпізнавання для МНР'І14.к.
Для визначення активності розщеплення сайтів розпізнавання іп ріапіа плазмідну ДНК, що містить касету експресії для мегануклеази МНР14, доставляли в зародки маїсу за допомогою бомбардування частинками для забезпечення можливості виникнення двониткового розриву з наступною ПЛР у реальному часі, яку здійснювали з аналізами Тадмап, які охоплюють сайти розпізнавання. Відносне число копій розраховували за допомогою способу ДАСІ відносно внутрішнього контролю в аналізі ТадМап з використанням нетрансформованих зародків в якості калібруючого стандарту. Зародки з відносним числом копій менше 0,8 вважали розщепленими та/або мутованими. Активність розщеплення мегануклеазою іп міїго аналізували, як описано в прикладі 9 на плазмідній ДНК.
Активність розщеплення плазмідної ДНК іп міго у варіантному сайті розпізнавання 5ЕО ІЮ
МО:11 була приблизно в З рази ефективнішою, ніж у припустимому сайті розпізнавання з ЗЕ
ІО МО: 14, залежно від температури реакційної суміші (див. фігуру 10А). Подібну тенденцію спостерігали іп ріапдіа, причому 35 956 зрілих демонстрували розщеплення в ендогенному варіантному сайті розпізнавання, що підтверджувалося мутагенезом, хоча тільки 15 90 демонстрували розщеплення (мутагенез) у припустимому сайті розпізнавання (див. фігуру 108).
Подібний аналіз можна здійснювати для варіантних сайтів розпізнавання для І 1053-4, описаних у даному документі або для будь-яких інших ідентифікованих варіантних сайтів розпізнавання. Очікується, що частоти модифікації сайту, у тому числі делеції, вставки або будь-які комбінації цих двох модифікацій, будуть підвищуватися для інших варіантних сайтів розпізнавання з покращеною активністю розщеплення, ідентифікованих у прикладі 10 (-70, 8Т (ШПа3-4); -110, -70, -20, -1Т, 48Т (ГідЗ-4); -110, -7б, -1Т, 48 (Паз3-4); -ЗА, -2а, -1Т, я2А, «7Т, -8с, --110 (МНРІ4-к); -ЗА, -20, -1Т, ї2А, 47, вс, Я411А (МНР'І4-); -ЗА, -20, -1Т, 7, 80, 110 (МНРІ4 ); -20, -1Т, ї2А, 4-7Т, 480, -110 (МНРІ14-); -20, -1Т, 47, -80, -110 (МНРІ14 в), що відповідають 5ЕО ІЮО МО: 13-35) або будь-якого іншого варіантного сайту розпізнавання, ідентифікованого за допомогою способу, описаного в даному документі, які будуть штучно вбудовувати в геном.
ПРИКЛАД 18
Аналіз варіантних послідовностей розпізнавання для мегануклеази 1 І3-4 і МНР 14 у сої бо Для тестування припустимих і варіантних сайтів розпізнавання для мегануклеаз І 1/03-4 і
МНРІ14- у дводольній рослині, такій як соя, послідовності сайтів розпізнавання маїсу можна клонувати в ДНК конструкції для трансформації та вводити в сою за допомогою біолістичної трансформації, як описано в прикладі 15.
Порівняння декількох сайтів розпізнавання, розташованих в одному тому ж локусі
Для порівняння активності розщеплення (ефективностей розрізання) у різних послідовностей розпізнавання можна розташувати кілька послідовностей розпізнавання в одній
ДНК конструкції та ввести різні конструкції, що містять кілька сайтів розпізнавання переважно в тому самому геномному локусі для виключення ефектів розташування. Трансформаційна система на основі ЕГР/ ЕКТ-опосередкованої сайт-специфічної інтеграції є цінним інструментом для досягнення вищевикладеної мети шляхом розташування різних донорних ДНК конструкцій у раніше охарактеризованих цільових сайтах (Ріапі РНпузіоІоду, Гі еї аї.,, 2009; заявка на патент
США Ме12/634775). Після того, як сайти розпізнавання інтегрувалися в геном сої, трансгенні трансформанти з однією копією можна ідентифікувати, характеризувати та вибирати в якості нових матеріалів для наступної трансформації відповідними мегануклеазами для оцінки активності розщеплення (ефективності розрізання) кожного сайту розпізнавання відповідною йому мегануклеазою. Оскільки кілька сайтів розпізнавання введені в той самий геномний сайт, ефективність розрізання відповідними мегануклеазами можна порівняти.
Із цією метою припустимий сайт розпізнавання для /І34 (5ЗЕБО ІЮ МО:13), а також припустимі сайти розпізнавання для МНР14-- (БЕО ІЮО МО:14) ії М526 (ЗЕО ІО МО: 37) клонували в донорну конструкцію для 551 РНР5Ь7712 (5БО ІО МО: 38) між геном маркера, який селектується, СОМ-АЇ5 і касет з генами ознак надекспресії ОСАТ2 (діацилгліцерол- ацилтрансферази) для надекспресії для високого вмісту масла, штучної мікроРНК для косупресії ЕАЮЗ ( Фф-3-десатурази) для високого вмісту ненасичених жирних кислот і косупресії
СА5 (галактинол-синтази) за допомогою шпильки для високого рівня доступної енергії (фігура 11 А). Трансгенні трансформанти з донорною ДНК РНР57712, інтегрованою в декілька раніше охарактеризованих геномних сайтів, одержували за допомогою біолістичної 551 трансформації сої частинками, як описано вище. Трансгенні трансформанти із чистими вставками генів ознак і послідовностей розпізнавання для мегануклеази відбирали, і їх будуть використовувати для наступного раунду трансформації мегануклеазами І І534, М526 і МНРІ14ж для дослідження
Зо активності розщеплення трьох припустимих сайтів розпізнавання.
Порівняння припустимих сайтів розпізнавання у порівнянні та варіантних сайтів розпізнавання, розташованих у тому самому локусі
Варіантний сайт розпізнавання для 1 1(53-4 (5ЕО ІЮ МО:22) і варіантний сайт розпізнавання для МНР14-- (З5ЕО ІЮО МО:35), а також припустимий сайт розпізнавання для М526 (5ЕО ІЮО МО: 37) клонували в іншу донорну конструкцію 55І РНРб2252 (5ЕБО ІЮО МО: 39) (фігура 11 В) і трансформували в деякі з тих же геномних сайтів сої за допомогою 551 трансформації.
Трансгенні трансформанти із чистими вставками генів ознак і послідовностей розпізнавання для мегануклеази будуть відбирати і будуть використовувати для іншого раунду трансформації мегануклеазами М526, МНРІ14-- і (10534 для дослідження активностей розщеплення сайтів розпізнавання. Оскільки всі сайти розпізнавання введені в ті самі геномні сайти, ефективності розрізання різних сайтів розпізнавання можна порівняти більш змістовно. Активність розщеплення варіантних сайтів розпізнавання для І (3-4 і МНР14-- (5ЕО ІО МО: 22 і 35) можна порівняти з активністю розщеплення їх припустимим сайтам розпізнавання (5ЕО ІО МО: 13 і 14), як описано в прикладі 17.
ПРИКЛАД 19
Спосіб націлювання вставки полінуклеотиду, який представляє інтерес, у специфічний хромосомний сайт у геномі рослини
Нуклеотидну послідовність, що містить варіабельну послідовність розпізнавання засобом для індукції двониткового розриву, вводили в геном цільового організму, досягаючи цільового сайту (який містить варіабельну послідовність розпізнавання) для вставки нуклеотидних послідовностей, які представляють інтерес. Можна потім отримати бібліотеку стабільних рослин або культивованих тканин, яка містить варіабельний сайт розпізнавання в різних положеннях по всьому геному рослини.
Одним прикладом таких варіантних сайтів розпізнавання є ЗЕО ІЮО МО: 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, які можуть розщеплюватися мегануклеазою І 1(53-4, яка кодується ЗЕО ІЮ МО: 1. Іншим прикладом варіантних сайтів розпізнавання є 5ЕО ІЮО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35, які можуть розщеплюватися мегануклеазою МНР14, яка кодується 5ЕО ІЮ МО: 3. В одному варіанті здійснення ЗЕО ІЮО МО: 15, 16, 17, 18, 19,20121 їі ЗЕО ІО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35 не є ендогенними відносно геному маїсу або рослини. бо Після того, як були отримані стабільна рослина або культивована тканина, фрагмент ДНК,
який містить полінуклеотид, який представляє інтерес, вводили в стабільно трансформовану рослину або тканини з наявністю білка, що індукує двонитковий розрив, такого як білок мегануклеази. Цей процес призводить в результаті до вставки полінуклеотиду, який представляє інтерес, у варіабельну послідовність розпізнавання.
Вважається, що трансформована рослина може містити кілька цільових сайтів, наприклад, без обмеження кілька сайтів розпізнавання, які можуть розщеплюватися засобом для індукції двониткового розриву, а також сайти рекомбінації, такі як сайти ЕКТ або сайти ОХ. Приклади сайтів розпізнавання відомі в даній технічній галузі та включають сайти ЕКТ (див., наприклад,
ЗепіаКе апа Воде (1994) Віоспетівігу 3371 2746-12751; Ниапо еї а!ї. (1991) Мисівєїс Асід5 Незеагсп 19:443-448).
ПРИКЛАД 20
Вловлювання геномних варіантних сайтів розпізнавання ендонуклеазою Сав5 і створення бібліотек для глибокого секвенування Шитіпа
Для вловлювання в геномній ДНК варіантних сайтів розпізнавання для засобів, що рідко розщеплюють ДНК, для індукції двониткового розриву, у яких більша частина розщеплених продуктів дасть в результаті тупі кінці, як наприклад, для ендонуклеаз Саз (Савзіцпаз еї аї. (2012)
Ргос. МаїЇ. Асад. Зсі БА 109:Е2579-86, діпек еї аї. (2012) Зсівпсе 337:816-21), можна використовувати приєднання аденіну до 3'-кінців розщепленого(их) варіантного(их) сайту(ів) розпізнавання в геномній ДНК. Адаптери, що містять комплементарний 3'-тиміновий липкий кінець можна потім використовувати для селективного лігування з тупими кінцями, які утворюються в результаті розщеплення ендонуклеазою Са», і збагачення ними.
Для створення матеріалу для вловлювання геномних варіантних сайтів розпізнавання будуть проводити іп міго аналізи розщеплення, та очищення будуть проводити, по суті, як описано в прикладі 3, за винятком того, що замість білка мегануклеази будуть використовувати очищений білок ендонуклеази Сазх і компонент(и)-нуклеїнові кислоти, необхідні для утворення функціонального комплексу ендонуклеази Сав5, здатного до розщеплення цільового сайту ДНК.
Реакції іп міго можна проводити в різних буферах, при різних температурах або з різними значеннями довжини(довжин) інкубації для одержання ідеальних умов розщеплення ендонуклеазою Сазв.
Зо З3'-липкий кінець з одного аденіну будуть потім приєднувати до розщеплених ендонуклеазою
Сазх тупих кінців при інкубуванні з розщепленою іп міго геномною ДНК при 37 "С протягом 30 хвилин в 50 мкл реакційної суміші, що містить АТР, їх буфер Кленова (МЕВпехобд і 15 фрагмента
Кленова ( без екзонуклеазної активності) і очищати. Нефосфорильовані або фосфорильовані біотинільовані адаптери, синтезовані та очищені за допомогою НРІ С, що містять 3'-тиміновий нуклеотидний липкий кінець, комплементарний 3'-аденіновому нуклеотидному липкому кінцю, можна потім лігувати із приблизно 2 мкг розщепленої ендонуклеазою Са5 подовженою аденіном
З геномною ДНК в 100 мкл реакційної суміші з лігазою Т4 (МЕВ). Отримані в результаті ліговані з адаптером, розщеплені ендонуклеазою Са5 припустимі та варіантні сайти розпізнавання можна потім збагачувати, секвенувати й ідентифікувати, подібно описаним у прикладах 4, 6, 7ів.
РСТ.52034, 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1160» Е. ї. ДЮ ПОМ ДЕ НЕМУР ЕНД КОМПАНІ
ПАЙАНТІВ ХАЙ-БРЕД ІНТЕРНЕШНЛ, ХНК
ДЕШАМОП, Стефан
ІНгАтШ, Джейме
ЛЕ, Жонгсен
Ллака, в'ктор
Янг, Джошуа «АЙ» СПОСОБИ ІДЕНТИФІКАЦІЇ ВАРТАНТНИХ САЙТІВ РОЗПІЗНАВАННЯ ДЛЯ
СКОНСТРУЙОВАНИХ ЗАСОБІВ, ЩО РІДКО РОЗЩЕПЛЮЮТЬ, ДЛЯ ХНДУКЦІЇ
ДЕОоНиТКОВОгО РОЗРИВУ, КОМПОЗИЦІЇ З НИМИ ТА ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «30» ввего вс «150» у 61/777218 «їі 2013-03-12 «605 39 «170» раїептти верстя 3.5 «гм 1. «її» 13053 «а12х ДНК | І «213» штучна послідовністим «его кейі» Меагануклаеаза 1365-44 «00» її й аїдазсассз аотасавсва ЧчавактсстиЯ сестасстоа ссзстесає зоасвосоде БО постссатся зпдасосадаї саадссаває сацісстаса ачсксваЗся сеадсьстсє 120 стоассттсс адутозссся зазозсозсая зуосястодє ссстсдасав остчексвдас 180 оздассоооо соадстасої стасоассос пддотсоЗках ссдастасоа астстессад 240 атсазпрсссс тасасааєтт сстсасссад стссаоссуЄє костсвачсї дадосводаа 300 сасосозасєс тсасстоза пзЕсаїтсазу сазстсессст сззссазая якессодає 360 дадкїсстоа асусокоасас осодассвас саувтсосод ссстсваєда садсавувеє 420 сопсавуаєца сстспсаває сасосодасо ассстоЗаст ссстесссаЗзу віссусапава Я зЗтстаїсос саїстсвзодс атссадсвсс дсажксстсоо стісстсаая сесоовттса 540
ЧдачзЕсіссо задсастсву адстодаася астааатсса зодоаатжссє пастстаєста 600
Чпссдосттсо тадасодсоя свостссите аїтсусотсса ссавоссосо ссаотоаєтає БО зайтсесваос асдасстссо сссодзаїтс ассоїтовосс адазоасоса дадоасостаов 720 ттсстсоаса аостваїсох севовсоВо Фсорестасо сстасавссо сосок 789 тссотастаєс зскістссса даїсазоссс стосасавсє їестсаєсся дстссвУєса Бе) ттсстсавус сазадсадаа зсапасоаває стсоссстав адаїсзесова асаЗстсссс о тспоссвада зессссода сазостсста давахотоса сосодоссца ссаозЕсУся Бо ссстсаззсо асвосадлявс ссосавзуасо асстсозаца соеосччас даєсстуває 1020 сссстсаосо здаадазоаа Яаксдсссссс год це
СТ. 052014. 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «ій 2 «ії» 350 хаїй» БІЛОК «її» штучна послідовність ай» «жеі» Мегануклеавза 1163-4 «4005 2 мет Аза отВг Був ТУР Ахип уз бі Ре ци цей тує дви Аїа «1у вна
Уа! Абе бу А5р с1у бак їТе ув Аза бій Т1е уз го Ахп бій аг 29 25 30 сСуз цу Ре цу ні біп ей бего се Тв ве бій Уді Твк бій Куб 35 чо ч5
Тв ооїв Ага АгО Тр овБе фіку Ар овує ви ма! А5роєїи їв о1у май 50 55 бо сіу Туг ма! Туг Абр Аг б1іу Зег о уа! Звк Ар о туг іч ву Зеробів 55 79 25 во
І1е уз вго ву нів Ап вне цец Те обіп цец бій РКО Ре ем бух 85 90 35 ієн уз сій Суб біп Аа Ап о сву Уа! Меч цу Х12 Хв сій сій ву що 105 мо вк 5ег Аїа бух бій бек рго Ахр обу Ре ів бім ма! Су5 Тнг о тгр 120 125 маі Ар бій те АТа АЇВ фе) Ап Ар бек фу ТАК Аг Ку ТгОТАг 130 115 140 ек бій ти" маї Або АЇвз ма! цен Ар бек сец Рго С1у бег мУді су 445 150 155 150 сіу цен Бег Рко 5екоб5ій АТ бег явг Аа АТ Бек бек Аїа 5ег 5ег 165 170 ї75
Бек вро 51У бек бу їіє 5ег бій АТа Сез Аго Аа ЄТу АТа твгофух їх 185 150
Зег бух біц Не ба їв Туг цео Аа б1у Ре Уаї Ахр сіу Авр сту 195 200 27595
Заг ті тів АТа бек Ті Буя Рго Аго біп Суя Тук бух ріпа ух НІ 210 215 г2й сім еп АкЯ ви сти ве твгомаї тТвг сп буб тТве бій Аг Абу тер що РСТ.О52014. 022500 лЛЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 285 230 235 240
Ре вени Ар ГУує це й! Ар осів ХТе біу ма! біу тук маї Туй АБО 245 ач а дя біУ Зег узі хаб Абр Ту Агу бен его бів ї1е цу рго цеу нів 250 255 275
Ави Ре без тпг ші кео сів Рго бпе гбец рух се уз їй муз 1 273 250 2а5
Аїв Аза сви маї єм їм Те ХТе сій бій мцеб вго бог Аїд вух 1 290 я З00
Бек оРго АБроцуз вне ви бів маї Су тпготго маі Азов ста ї1е Аа 305 зо 315 320
Аїа бе Ап Абробек уз ТВгоАгО Су ТК Тк бек їв тТвб Узі го 325 330 335
Аїа Уа! без Ар бек рен бек сі уз бух Сук 5ег Бег ро 340 345 350 «ах З «вії» 1053 «тій» ДИК «213» штучна послідовність «вв «223» ЖМегануклваза МНРЖЯ «ах З зтозасасса заїасазсиз спачкіссто стєтаєстод ксЗдскссає ддасодсоає ва засесслсса тсососвове савоссоайс садтсєткаса восссвяЯся ссвастевта 120 стдассттса ссутодассса сазодасосво афосустувЕ сестсодвсах дстдаксдає 150 сззваїсоцоо содосазваах ссосозссоє засо КоЄ ссоаастасає сстстсесав 240 аксазвсссс сосасавстї сстсасссво стссвоссв ссстсавусї Чавосвовад 300 садасоаасс тсессстЗзав даїсаїтсово сазстссссє соддюсаводи усе дае збо зазутсстозЗ аЗотусасяс ЗсозахсЗає сазаїсосоюв ссстсадсуй садсавуасс Яга сосавдасча ссісодазаєс затосодоасо аесскЗозсє ссстсссвуа акссосудав Я
Ччаєствтсюс сатсстсазос атесапсусс Ясахссксою сстсстсазя сссоЗЯсся 5340 чодасстссо вачсветслоа вассоовоса ястаявсеса вудавевсох сс асето БОЮ чесацетссо тодасоцсох совскссраєо аїкосузсва шсазуєсуаа ссвукссває ББО завастскавує вссаодстеже єстоассто ассяєеасся адазцаєцка пдасосастав 720 тжжстєотака востоуєсоа спааасоню оувестаса тссусдасса ЗпдВісово 780 їсссястаєс вастстссса датсавоссс стосакавст тестсассса дстссаЗссо 40
РОСТІ О2200 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ кКсстсваєє бадвасадай дсвоосоває стсоссссоЧа зпатсатсоа усадсісссс БІО) ссодссавад зесссссода сазуссссто баззсовоса сасоосісоа ссаваєсося я
Зуссстсвасо асаосаауає ссосвадака асстсооааа сочтосовос зстстводе 1020 тссстсвосЯ збаадазува кс сссс тод 3053 «5305 8 «а» 350 «212» ВІЛОЖ «її» штучна послідояність его» «3» Меагануклеаза МНРІ1Я4 «А» 4
МЕЖ АБп ТВ обу тТук Ази Бу бід Рйе без бец тує цеу Аїа о1у РВе і 5 10 15 чаї ар сім Ахробіу Зек їв Хіє дід бій ї16 бух Рго Ай Бій бек я 30
Туг цух Рие Кук Ні біп цец Мет гей тик оРМе ТвгоУаї Те обія бух
А) 5
ТйгоБів АгЯ Аг Тко Бе сей дяр бух цер Уві ар сої ї1е бі ма! 0 55 во
ЗіУ цух маї АгО АБр лгО бу 5ег Уді бек Ар туг Ів цец 5ег сій 70 75 во
І1е фу Рго цец ніх Аяп вВйе цен) тТйг о біп без оїйп го ве ре) суз 85 90 55
Мен бує біп бух бій АЇВ АЖи Бенц узі без фу їі 11 бій бій ве 100 105 що
Рго Зег АТд Суб бій бег Рго Ар оГув Рава іео бів уді Суз ТвгОтер 115 120 125
Маї дер Бій Ї15 Аза Аа фе АБ АброЗаг уз Тйг о АгЯ був ТК ОТВЕ 330 155 140 зег бій тік мМаї Аго АТа маї йеч Ар бег ієу вго Фу зоб ма) сіу 145 ї150 155 160 с іу цен бек Рго бек біп дія хеаг хег Аа Аїв бег оЗег Аїда Зве бог 165 170 175 чего Рео бі Зегооіу Хе его біз АТ ем Абу АВ Ту Аа ствг ух 180 185 190 хег бух бій Ре сви во тує без Аїд б1у вх Уді Ахробіу дв діу
. СТО 22500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 195 20й и
Бег їі Іів АТа Аїа ї1е вуз РгО АБИ Ой его отує рух ВВ рух Ні 210 215 Хей
Фів бен бек кеш тВе Ре тТВе оуді тТНе єЄїй вух Тйг бій Аг Абу тер 225 230 235 243 вве еп АБр о Сух сем Ма Ар сін Т1е сіу ма! сіу Тук Уа! дго Авр 245 250 255 віп біу баг Уа! бек ніх тук бій рец зек сів їТе ух бро цеци нів 260 7563 270
Аа РНе мен тик осів без бій Рго РВе бец вух емо їух Їй гух сій 275 «Во 285 діз дело цен Уві ви фу їТа їі біу біп беу бро беб Аза уз 16 250 295 300
Баг рго АзроСух РН ем бій ма! Су5 тТйгб тер оУЗі Азробій Пе діа 305 318 315 320
А1їа ви А5а АБроЗек дує Те оАго Гу Те отТВг его бі) тВгома! Аго 325 30 335 дів чаї бе) Ар бек ей Бек бі уз су цу бег бек га 340 345 330 «2310» 5 хаїї» АХ «23й» ДНК , «її» штучна послідовність
СУ
«223» дефосфорильований здаптер «дО» . хайї» ті5сотезсиге «айв» С38533.,413 «в2З3» пп являє собою а, с, 5 або ї «МК 5
Зоссовасвто стозаєтвад асбтсестос аддасдсвпий п 4ї «2105 5 хазїї» 24 «2і25 ДНК , , «ії» штучна послідоввість
У
«2235 Праймер А еКюЮх 5 чітансатує тораттдаза єтіє 24
РКТ.П52О014 022509 ПЕРЕЛІК пОослІДОВНОСТЕЙ «а 7 «вії» 23 «217 дик ! хеї32 штуЧНЯА пПОоСсЛіДОВнНІСсТті «г20х х223» Праймер В «Нюх 7 сазусаодеаєв зсотусаїзсо а 21 «210» 8 «а1ї» б «2їлУ днк «13» штучна послідовність «220» й . «223» Х1імшіпа-сумісний адаптер «ЦЮ» 8 й азкчаєсзсвза сдассассца чаїстасасЕ «сткжссстас вовасасєтст тесдатстис 60 а 61 «вій» з «Її» З «Й» ДНК й «и3і3» штучна послідовність кл вО» | й «23» маркерна послідовність «АЮ» а дсаозасує а «10» 30 «гії» З «їй» ДНК І й «К1ї» штучня послідовність «Ох й й й х?23» комплементарна послідовність маркерної послідовності «400 30 асетессос З «мох каії» 22 «аї» ДНК І , «2135 штучна послідовність «го «РйЗ» 5-3" послідовність з фігури 2 «Зх 1 сзацазолау сасоїсвОсї та 2 «0» 12 «ВУ А? хаіоз ДНК «2135 штучна пеклідовність ко СТ ШВ2014 022500 пЕРЕЯТК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
БИ Оя хй23» 3-5 послідовність з фігури 2 «4005 15 квт є отосаЯсвя ах 22 «Мі» 13 кій 2 «Фійх дик ; й «213» штучна послідовність сеййх І хаоЗ» передбачувана послідовність розпізнаввяня для ГХ53-4 кЗ00» 13 зтасасстса сасотвсосоа Її 22 «ек 34 ка» 22 «ій ДНК «332 штучна послідовність хво» й й , «223» передбачувана лоспідовність розпізнавання для мні «3002 14 . сазасзовіє сасотсадат є 22 «і» 15 ках 2 «2312» ДНК І «іх штучна послідовність «ех , , , о І «23» Варіантна послідовність розпізнавання для МІб3-54, 1 с «Ох стіаїасктсв сасутасося та 22 «еЩ0» 16 «ії» 22 «2142 ДНК й «ії» штучна послідовність «й» й | , «2йїх Варіантниа послідовність розпізнавання для рта3-4, ис «Ох 16 І аквессстся сасутасося та 22 кеїО» 17 «КЛ ве козїйм ДНК й , хі3» штучна послідовність хадОох й й й й «23» Варіантна послідовність розпізнавання для 1103-4, 526 ка00Оз 17 зсатасстсо касоотасуєо та км «210» 18
РСТ.052014 022500 ЛЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ каїїх 22
«237» ДНК , й «2135 штучна послідовність
«220» о й І
«ва3» Варіднтняа послідовність розпізнавання для Щ3653-4, -1Т «4005 ТВ І зтаїзсстса тасокасосео її ие «3105 19
«й» 22
«з» ДНК о й
«213» штучна послідовність
«223» Вашщрзіднтна послідовність розпізнавання для їта3-4, 8
«КН 35 ахатасстся сасотасота та Фе «2305 50
«ії» 2
«2125 ДНК І хиїї» штучна послідовність
«ее» й ,
«223» Варіднтна послідовність розпізнавання для (ЦТ43-54,-9с, ВТ
«00» 20 дізкссстса сасотасута та 22 «0»
«211» 22
«2312» ДНК Й ,
«233» штучна послідовність
«ев» : ; ; ! .
«й2ї» Варіантна послідовність розпізнавання для 1І0354, 1, с,
«аб, т, Вт
«вй» 21 статсссусо сгасоївсЯко ха 22 «Ох 22
«11» 2
«вій» ДНК Й й
«ам штучна ПОСЛіДОВНУЄТЬ
«ВО
«223У Варіантна послідовність розпізнавання для СТса3-4, С,
-йб, т, ВТ
«005 092 що стахссстка тасутасеса а г «05 3
«її» 22
«сей» ДНК
«213» штучна йослідаані сті
«айох !
«223» Баріамтна послідовність розпізнавання для МИРІЖв, «ЗА
Сто Ої4 Пп22500 ПЕРЕЛІМЮ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «Ю» 3 сзаавсацзат сасатсаааї т 22 «М за кеїії» ий «212» ДНК й І хеі3» штучна послідовність «Рух й й , І «Фй32 Баріантна послідовність розпізнавання для МНРі4Ма, 720 «00» 34 сазасасвіо сасоуссацах т? «0» 35 «гаї» 22 хеїйх ДНК й й «213» штучний послідовність «ФО» І й І . «223» Взріантна послідовність розпізнавання для МНРІЯЮ, її «4005 25 сзаасванїї твсдїсадві т 22 «30» 25 «ії» 82 «Аза ДНК , «213» штучна послідовність «вою що «оа3» варіантна послідовність розпізнавання для МНРІіЯю, А «ОО» 26 сазасасате садоптсащах її 22 ках 27 «8315 22 «йїйх ДНК й , «235 штучна послідовність «20» й й «23 Варізнтна послідовність розпізнавання для МИРІЯж, ит «300 97 свавсацатс сасуїсвіа їх 25 «2ібх 28 «Кі» 25 «232» ДНК й І «13» штучна послідовність «283У Варіантна послідовність розпізнавання для МНЕ14Х, за «4005 78 Й садзсазаєе сасоєсвоцх її 22 «205 28 «її» 8 «212 ДНК
ОО ВСтТ МАФІЯ 022500 пЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«213» штучна послідовність хай» «223» Варіантна послідовність розпізнавання дяя МНЕ1Як, іо «Ой» 29 сазасадате сасаїсаваї ї9 22 «М» 30 «21х 82 «ефе» ДНК «213» штучна послідовність «вод «йаЗх Варіантнв послідовність розпізнавання для МНРіЯж, «А «8005 сзаасвовії сасоссвуаї та 2? «ЕМ Зі «2112 22 «йї2х ДНК й «213» штучна песлідовність «ййїх Вавізнтна послідовність розпізнавання для МНРІЯХЮ, «53А, 25,
-1Т, ТА, ит, зб, На «400» 31 І сазасаззазо сзядпісатвх 9 82 «Ме «21їх 82 «912» ДНК | І «213» штучна послідовність «асо» І , І , Й І «223» Варіантна послідовність розпізнавання для МНАЛЯАж, -3А, кв,
-їт, -еА, йтТ, ж, МА «800» 32 сазасзчавоу сзачссакиї та як «310» 33 «аїїх 29 «212» ДНК І й «33» штучна послідовність «В й й , й «43» Варіантна послідовність розпізнаванни для МНРІі4», ЗА, "5,
«Мт, ут, Вб, Іа «00» 33 сазвкацзяадз гасоїсатох 3 22 «вій» 34 «йіїх 22 «12» ДНК , . «213» штучна послідовність «?22б0У , й , І «223» Варіантна послідовність розпізнавання для МИРІФь, хйб, іт,
заА, вт, Вб, «ІВ
РОСТОВ ІЯ 02500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «4005 34 каавсзваса таадісатчх та 25 «г1і0х 35 «вії 2 «гій» ДНК й «213» штучна лослідовність
НИ ! «2И3» Варіантна послідовність розпізнавання для МивіЯк,-и5, 1, ит, 86, іії6 «ММ 35 саааказчаста тасотсатої тя їв «2105 36 «вії 3716 «в1йж ДНК. «13» Звеспакомусев сереуУївзіве «щюЮх 36 стассздаза ЗааЗЗчсокс адааакстяс сакустаєта сдаавесасх слаба а «0 язаїоєсаєс ссатасуєах зассстткта азоваціаїс їссасадіїіса зттЯсувава 120 асстатсіву заїсаазаса зсастттасєї тссвавааєу зазаїтссдає саасєвсттсс 150 тстассвіт сатсатсліє стжсЗетоОс Всатстеєс стстатсттс вазсоватея 240 пчзаїосіва асдасстова зсадвітїтаас дадсвасаао азтстасаєт зводаадссасх 300 сазанюажм астаціаасі ссозкатсета зітїваєчтає ссаїзвої асзпаавккса. збо тасттатода ствостатух сдсесватує зсссзестоа саїтастаєе стосатеа Я2о зЕсснаїсай васстцпаста ссусастаєс аубататсає стсвестессо тазатассав 480 зсдтаєтата гаїсдазаує сіїтозссво пітаїтсаєза засазасттс атоасссоваз 540 звозтсатсї созаааутто сстадтттса кувазтстттса задсвоктта тахазаттсї бо зесіКЕтовї Зсодавттав стттїтстто затазкасат застскст зазазазтсв 660 задасацата заасттазоца датакссяиааї айїзвасуазв азссоздахі сСтогазсасє Тай сазсйіавса стФфасатстт тазвсаасттЕ тавттатазе асаїжтстта сотсятоех 780 авгїзтїаса зстатЗсєтооа сазвтдастс сії косаїуз зстасоаваєс добгаакасх 850 запхуаттаз стсктестоа сскестаста зоязстваває довга асан з00 ксагтатва вігчекосої зайвісяска одабстстст сувазєтасат сстастатва з60 свагсаазза авасазоава зісодЗасаза асавтсвааої акЗдастста озвасавецоа 1020 касаттачів одудовасзає сездузсасакє дахтеєсдау зсвеасаваса зустсвасвх 1050 тазоасозкса атасізоасо стоазадсокс сстоссвай саватавоєв ассссватва ло ссасЗттавії одстссЕКсє ссаассстєк соататсдав аавствуєта звазасоїоа 290 тзкастазся зітуадчатто засвічсах серссстаса ствааадаваєс кісазогава 1260 зсаїсссава ттазаазтїї вссесткстсс воззасавіс зодітЗатає заЯйасвазта 1350
РСТ.0В2О14 022500 ПЕРЕЛТК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ їатісззазва дадсатстна їтсвзазаатоЗ стаївосацє асссазачко кесстуєода ї38о зсзадскачі дадасастссс таїткозасої спозадачаї сток сатесотстє 1440 чадоєсоаод астстсдосях асозспдаао адосвасттс зісосалада агааддлавї 1500 заїсссорова стола тастозавоа тсоссстста тасоссуаая затодасаєс 1550 аКіІтяикійна узаттзвасзо ссасвасток узайтсткЕ засос тач ост ста 1520 сссазвіїуса зоастаєсє зсвазровсаа Баїттекваєсє стафоєтвсо сесстостад 1680 ашттссЧчас кссохтсСавс стави сЯза ЯстЯстодся апзаватасла ссаавтсттї 1740 зсессаоск чдотаїнсо зсоходаває зкствтїса ззавсаооЗа захо ссах 1800 таавсоззажтт дссссавоас сісасзасто поаЗасаствх ассаттдато стіосоїсає 1860 ткстсавтьт бадостсвку срацаксват аттоднтктУ ссзатусєсяа зозаткесає 1920 зкстстстсс вссатїтасва соузасоссат бабуєтааах з кодаз асазаасатає 1959 ззазавтаня пдустаазаа сскосоазно засаттвосЯя астсесєвазіє сстсявсоха 2040 сітататозз дазозщіста звссїзасво ззазотачух сасзтазата стат схе 2100 сашсасовсо спазтосоаас авазаседав стасатстаса зусаввастя акаттесваї 2160 саазавїсест Яссостсзаз аастЯадастх дазадсваато чісСявассавЕ тазу содЧаве 2220 сахїсатспЗда сазастста асттессооії ватесстусс ссахотосоЗ тссааавов 820 мцчвенйт ссатісваво їрасватаєє стстустсат адзастссас візаві 2580 васахасасє ассїссосва одсаязсокоЯ заїтаззася атсатсосто чдазстоосоо 2500 спестоастсає сіоссацака собкЗоєтуєЄ ватдаєсаста сітсстотсяа ссодсотосс 2450 сптвазасютс їсттасствзо аїтудзосаца їтстсвасвє їсавткатоЄ вадтасстад 25720 апотеїєсса ятазстяссо їсЗзстзттза сзаїтзотако засоєстоєсує тт асх 2580 сасаєтаєтх досусттату аїттссазціта їасаасдаза асддзасауї стат тваа 2540 цсазоаавза дайютестко ссязадсаєа аавуксаоая астатсЗЯєє асвавостта 2700 тстводазасє заасаахтвса савоєсстаєст датасасксо сїасадсзаяеє заткатавава 27650 тоататасст зветствоо сеутуєтакЯ асізсаєсая зт воВсте сасасвкаова 2829 затсвасаст тасаоутоєс стіксттвао заїсссатас зтазраєсає ттастаасв 2880 їтзсаїзсвтя їссаотааса зоазосзаЗзяЯ засзаєтасс состава асо нив 2540 азаатавсат стсозтасво стсататазо осодстєват осадзяссой дозтдасосї 3000 асвсісвваах асстесуїєаєа стсссваата тазатосовс зататастсть сетссттеса 3060 їаїсайсваї аксетк ст ссасєтоваах сасЯавісаа зсстуозаса здазствавя з120 ссазаєтаєз азосатсаєтї сзаїтссаЗЄ састотассо тгзасеттЕ кстататохе 31850 сасісдуктає сстсаасасс єтатаатаЕ сссісодаао акстсссває асатеєта 3240 зацсосієтЕ осссовсахз тазотоасссЗ заіссіїтос стссзацозес заст 3300 скайсвавкоу савоктксс ажсаквтетх саЗатттвасє тавасстсатє засазстс9х 3360
Ст. 2014 029500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ аїасттохав сйтаавоудата зЗЯїсодода Ясттесттаа зтатссусєтес азсаєдссва 3420 їзвясвасатт садассттУ ТскУїтвави сабо осУє соках саттуєастЕ 3480 тссаїясзоа аважїтестте гстастест стаїтовстаз стоозузасст атстссстаї 3540 ззасдексстс сузістсата Кт сВс стуасссядт заааЕстасо своасвоата 3500 шіатсатсцо састтсвтто ссстсасавт Тосвсствос аасзадасте одассатаєй 3660 аавшаскссс зтссвзаатви тссїстсесак ссетассто їсссататх дсвїсо 3715 «Ме 37 «вію й яеї2» ДНК І , «23135 штучна послідовність «220» о. «223» Пперадбачувана послідовність розпізнавання для М526 «00» 37 зчатадтдася тасотоссст вс 22 «210» 38 «кії» 16824 «212» ДНК , І «ії» штучня послідовність «22 «223» плазміда БНЕ57712 «0 й «віх тівс твасчгае «Ред» (150273.,.5120273 «223» п являє собою а. є, З або с «а00» 358
Ффазоатссаа остсвасосо сеочестста сстосесЕсу дстосодаву сесстасжесе 5) одзаоктсста сістссаздиа зотатавзуаа сттсасатоє хусстсосос азассавсвах 120 сесцзесісЕ згаохоссає стзавтсата тосотатсвї асвтяааносЄ атоагаттавх 180 тусашсскосу кстаасуає дактатоксса татдчаєосає сстсадтвса атстасестко 240 абассясата зстзадссаз сессозсасс соссаасвсс состуасасу ссскосЗоЗ КІ) сі ствсї сесоосатсс Ясттаєзоає ааостотове сужстссЯвдо вастусатує 365 пссаозаоозєє стсассотов ссассзаває зсосовоасв аввовасстс відатасуєє аао тастттата постаатуєс атозвссвава їсссттваса сов со тессвскоа) 3850 саїсацдзессс сосвоавазо вісаввоват стксттоваоа сесттт ссососетаа 540 кстостасех дсазасаава азасєсвсесаєс тассзоасоає пото сєсозаєсаза БО0 застассяає ст їссЗ аздоїтаяста одстісадсяо зососзвата ссазятвска бо теСсСтестауї оузоссожаю Ксаодєсасс астїсвасав стессосаЗса сседсстасах 72а зестсостсє пстайтссто стассяятво стастуссад Сн оатазо саке 7во ссодастаса сісзадасєва садітаєсоЗ аївадоасеса осядесоацос гуаасуводца 840
РОСТ ОБгО14 ОЛУ500 пЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ шфтсяїтасає аслдсссзос ттзоазсвдая созсстася: созастодоа басстасвос БІТ,
Зідзосисто здазадсосс асосстсссо садодволаз досодвсадо сасссооза 950 седсасоюх содвасвода дапесосасоз одовосттос воздддааас ясстозтатс 1020 їстаївоїсс тутсоаскх соссасстсї дасттоаюся совет сохкастсає 3080 савоовоося двасстакзо йззадвсосса всаакесуОас сет росте 11540 кстастовес КксттЧсксВЄ авокстите стосвЕсвВіЄ сестваттєю зсозасвасс 1200 тастассес стстовоїца здетелсвассо сісоссосво ссозасаВвеє оафосвоєо 2650 захсаатоад сазозазосо осазовосЯєс сазтвсосза зсофсехстсє сссусасотї 1320 зассоаїєса сіаатосяоо сідяїсвоат сіснаєсссо соаазетаят асовстеВех 1380 атасзаззає сасласавії тссстстада ваїавтстсто тЕтазсттта здазодацах 1440 атаєсстатцо азайвсстоз звстсаєсісо асусстоєсо аазаЯцссст датсовазая 1500
Жтісоасачко тстссдассЕ патесазстс сссаозоадЧосЯ заозаєстсу тессткаде ЗО їтїсеааїсзїзо пададсотад зсастотесто судоїслазта остосчссов Чіа 1620 зазуаїсаЕї атоктсїсо Ясастєтаса їсздссЯсус ксссдатссс вазастоєт 1650 засзіхздоо аатссавсях дадсставесс гастзсаєсю сссассавоє асвознкосе 17409 зсепхеосзаод асстдсстоз азссазаєто сссастЯттс тосазєсодї сосодавоєх 18500 аточатосоа їсостосоЗс суаїсктвос сазасовасУ сг соЯссс астсодасся 1860 свапоаатсо оссзатєасас касвеуосує даїтссвкає ососзаттує суатсессяї 1920
Ятахвтсаст дусавастує датооасоас ассоссзеату сетесессЯє дсваЗсксхе 1950 патозостов тоссетодос создуастує сссозацісс вфсаєстсяє зсасусоуах 00 їксорастеси зсвзатухссї дасодасавї уассосатаа саосдчетсаї соазстозадє 2Ммю соадосовтеє: ксвоодакс ссаватасоло оїсоссавса кстксстсто дадассзтав 2160 тсЧоєттота счозосвеса озкосиєтає Ктсозосоца Засасесоа скоса 222а тсЧссосоазс сссооосота татастссак аттоуіеєсто аксавстста ссадаЯстто 2280 петозсЯдса «сЕтсовтоЧа хоасзоасстоЯв ососазооеєс дактасеасоє звтскссода 2340 тссададсєсяо доассоїсоб Ззсотасасаз ахсосссоєсв ззадсосоює сокстодасс 2400 расастоко садзадтасе соссодатааї ссалассдає дссссвосвє сосссовоо 2460 ссазадозат зутоазоосас застава дасссозсто стзасвавос ссоазадоза 25320 пдсхтазост9о стастуєсає состовосаа тавстзосає аассссттдо посетстаза 2580 сочаїсттда паст остовааода доваєтатає ссоуатовїсє чесчадасс 2540 свсасоїїва скдааоттсс таїсссорвад сссстатест стзоазаєтта вооазастте 2700 сассавсасєва сасаатддсо зссассассв ссадаассає ссовттежсою тектостст 8750 сасвссссяс сісесссава ссвітаста заїссасссї ссстетстеє сатсвавссс 2520 тсассязвасєк спассасост стісдяватса ваїзттссаї стссавассс сесасоосов «ВО
РСТ. 052014 022500 ПЕРЕВІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ счессстсВс савудавосу ссавссасоо асо пїсасодькс асстсеспасо 2940 васстсусяа здосоасудає зесскковуя адасоуєсода баоодсадодс зсозсасов 3000 такЕсЯсуса ссссодсоЯЕ дсоссвасзя вбасссаєса опсостсасо соастссассз 3060 ссасссусаа сесостссся соссасовує аоуЗкаосЯї сессоссоаєс завдостася 120 скскУускссстс садссссссс дпсотссса стуссасстс судссссодє яссассазес ЗО тсФіцдзосЯя сстсассовс осескаатув асаусоатссс вассвдісосс зесассоЗсс 3240 адассавсо ссодзасоатс засассдаса ссткссвача зассссувіє зсозаачеоа з300 дсацатссах сасдазосає заєтаєстся Жестсдасуї сдасваєдіс сессосоісо 3350 тсоссчЧацоє сттессцес сассвестосоа десяссссЯд єссапсссє асовасаєс зага сслизоасЯх ссадсаосва стсдссогує ставстодоа совосссУуєє адсстксссо 3480 чесасстсос сзодстодєсс аддесссссу ссодваЗссса астодавасає астотсавдас 3540 псзусатоаоа досссззааа сссеКестсх асаєсвасоад сяаасязіття заїссаато з600 стдватєсуво ссассстасте озастсастяа зсаттсссЯаї суствосаєї ттзасазос З65о0 тгоосзасскх ссстастов оасоаакате сесттсадає астоадотато сасдутасто 3720 утасастза статостаєх сзсзаєаота акстастосї сусстстоЗа осзадаєккв 375О0 зкдассоЗсах тастодоаза стсоаоадссе сбостадіао пассвзадаєє зкїсисатсо 3840 ахассчакс тоссдадате зодазоаасв аусацососа собгаЯїсооєх тосоясавакєх 3900 тдавустоЗс сетоавозза зїтяадтатом стттооааОа осозазуваату Заддосавух 3950 та сКцюЮ адотсодаца Заадзоаєта асосасядла зсасавоке ссасідцоех 02о зсвазасаєх ссадавсосо зЕКІсСтссос апсасостає совет захоазвостоа 4080 стаатачада соастаєтетх аосастоона стобосаоса хсяватовод астосцсачх 4140 сктзсазачса сапувазсеЯ збосиотвоє тазсстсвою сдосесєтаца Зссасочаке дво ттдоаїттвсс гтосоЗстатс захоастест гсостзаєсс созЧастот осасттоаси 4268 ттаатодова ходіацітжс ассатьнато кісзозаціїї фссастаха взадеоавуа 4350 зкстсссауї їзадататту ктостоваса ахсазсаїтт Ззбатаєато стсавсаода 4350 ачизкачаїт: стасавуєсс даїадзостс асассівйтст говацатссо сствосова 4445 едацасаєх сесавасато стсавоїтїто стаатаєтто собовтаєса зсаасосова 4500 їтчпасдвацаа доазовостє довосдосаз ттсаозоваї дстопасаєс сстдосссся 560 звесттсттоа соссаттато ссссвїсзоу аодсасатате оссуатоає: сссаодсвато 46520 чатсссіїсяз одатосоахтв астозодоксо всодосгадвас дзоосаєтоа кросствоає за80 кааатеєтсс стоаквстта сКостасза саїзтяаказоу абазкоустує сствуєсосв 4740
Фахове тосаотзавс аїсаєвУВсе оізохзУє стадінесаад зсажееватї 4800
ЖКсеКЕКтаК сСсвасттасєтї асатасвота осаїстаєст зестстовво їстуаїатєсх 48060 секатсекст датах сс сода стоссоїваї чадасєтоава атавтвнех зга
Стик О2и5О0 пЕВБЛІМ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ адтазєвата ттїстоствзоа аайсстазос звасанесто стозацияеї савзавуєєав 49380 тачззаїсаваЗ стасихасіс засацеесс єв Є засада сасосадатє 5040 саастжстет гзозастсає стазвсаатс зогадавтос ахастесскт ска екас 5З300 какттактта сксттаЗко9 вваскоєаве саатстеоис зкосзоваса часове 51650 амтасужсса сазвасажст сттстестсо атстїсвсяя зоасуатаєсо вазїссадай зва акта кса завоассаваа акодсяваує сасазакатх завасвуаах возсостака зво зісвасттса атавсавота осаїсвсоК сстаотеста засссассво Зоосадатсх З340 здясусосяс сататвсстє асзсотасиас здівазсаха зсесасатес сстассваве 5400 зцдастсасає садаїтсєсзаз остестаєтс суавохстсся актстаяасата зазхатадоа. 5460 асстссзата тсастосяаці содссдосадс всассоєсоа судатесота совсссатоє 5520 сестссвскта ссостбакка аєтзаїстоЗ таасвохссу тастіватєсво стасттяєсс з580 тсоссссатс атдаєтзаєс стоасацісї созатоссає адсвстаасе айсстстад 5540) зісаївзадаа зазоссазою засзаааода дасававсас затовчаота сссттосих 5700 дасзататст задтутсзєаа аазттсаваса даазсосзає сасасасаоє Здасаксвєсх 750 таєссастао стоассадаа ссоссосас заоаказааа застоаЗаАссст сапазассах з82й зсасзасаає асотастсає зазоотоїса ахсоазсаює ссаавасакс сассаястєа Кв) асссаїсвіз адссстсаса стат каст ставсссзає стсаавастсЯ башті 5540 сассасстса ттсттоітта їттсвасвсс сотсвззасто сятоссассс согооассваа ОО тФіссасоса Коссайсвад йасскаїтсасх аїайеказст асавтстсад соску 5ОбО сассатсазо аассвостса акатсссзої всассутаєї заевуаатсся адататасто 5190 созссосата астаєсуаєт сасзакаста слацісосоз дасавааася асасодсасс віщо сазаассцсу зсватссоат азтоассссостї атсрасасса ттасссвасс дагусоаває 6280 сттстстста бістодсаса єсттсадсат їсссастітс стсасяаткт ссатостака 5300 ствдсосаатк ссастасєтсє оссасстаї чаїтосасаї осаосовасо стостазаца 6250 сдастсссса госзасовзо засто ссай бдсдатастся сетатсссва длаасттсеЕ 512 саїхстораза стетжкоЗсс пстасетссс сатзасісто сасаздаєзу таЗаєстада 6450 дессасасає асасасєтасс ссстозасоє сседоазаотає свестовето стовозодеся 65540 стоядссосва засвацсасс сссовосває саїсаєстсс аїсявасасх соска с ввой сітсатоааа сЯдіссстих стаїсзаєол осадозусау сстассоває дао 5600 ссжтакстссс оссскесся встскссЯдО сЕстсвассї дасажзесоуа ставссасов. 65720 сазсадатає дяссосодво ваїсзієтов стссласодс сасуєстсва дстссдався ува їааспосваає Зусайсазасо сассаства ссуаксвасст стоагсоссся сскстуєстя 540 сіссастаса тстозаїттсси состтсктаа содутссстс засісстасд ссаассацах зда сахтдосода засчасссасє зВскоісуєс сасаваасіс задсссасто дсадзавяка 8860
РСТ. 52014 022500. ПЕРЕЯТК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ сакстесодоає сассаєссссс асецсастаї соасасоада Зестттоас Зааттоссає тоха сзачаозоЗстї зуатовксса восістесс пдросашессх дгестсета туастеєсає 29 сазсваасттс суаусоєстс тстасацяуз зсасстсато аостоправо ссасекстає 7140 стссззуайо сестосявоа сестсстсза осозавнссао їстаєстоса тсоїсаєсов 2200 тдозосасао заааоусстс тооссвовсс соосоксато дасстоутує састсавосо 7260 зайву зсссзастта зсатодацяї судавастяїс асесттаксс ссатсвзечас 7320 ссстоосоза засоассіс ахзассаоух хаусавсоає задтсоуєсса дустатаєса 2380 аітссвасвну сстуссзаза астстссетоо яетсассссе сстсєдЧчатує атосесстпазао 7440 сУкетЕсває тасозтоєсо іст стасиуосов сесуєсзаса тд кав 75 шжсссссВек пасттоєстх атстсссаса ссессассзвс павзЗааотоє ссуаатасся 7560 счуассватаєс зЕспссовас сзсвосозат стасзасядо сасєзавоатв адек 7020 совгсодцасс падовочуса авоовосссс ададткссЗа атозітовух авосвассос 7580 застатбайс гдзайзтзсах дсапдсосва дадстсатод зоаасятода ататтяхатс 7740 сазссатута асазотатває азвстолосте сатетсвоту сткстзсова гвааасаваоо 2500 зізссатрат атастзаєас тстатстату сассттакко кстзкоата аахкктесесє 7860 твстатстаса зассассуда йссесочасуд сстатвваає Ззскесазасяи дстасазавяс 7920 зватосакас тасаадастт їстазаслат їставсстта псаттоасува созовасяква. 7589 песо: задаа Засаїзаєсза статаватода аоазуєстяак стссатттат аїатсатата БО ттасссаст аїотаттата ссзозатаєт ааздовоасат азсаастаса заздавоада щоб тотаксса сСкетасзсату збабастаєс сясссакякта сстасвестах ссасстатке 8160 зататстіста тавубітсда кссатоатат сеставтакєт ссвостата сотатасоай 8220 аапосастат стозастсте стастстота саладаєтоЗ атсасссссв аазтадакех 82850 айсттааїтсту зскосттссї зсапаїляза дзазавтстат оадітуек: затадяиатат 8340 туазудзаси: дазазкваїза свазтазсаї аїзасатато їзтатазатсї гастаїзата 8300 тзасакєттат статаазаай ослаатаєтя тсасазатстї збасазісЯх Єсадесекиє 8460 таззасавнає стсваттасї тазвасоачає їазасяитаєт сузсткккка встатттазє 52 нваїтаїтат стіаазсяаствт абозавіїтЕ сІттСЄстВЕс апсдавалатє зазаєтадах 85850 тазодацоас засодсассс сважссттяє асадйссзаст тссасзадаав зуссвавтса 5540 зачдасзасив адазасавос авацуааатт тексвасетО ацїтоїстто сттустЯсах 8700 заїттасоса зївазасаєт зсасатаавсс стієтадасва тасазвсвато козак 82760 касттадете сессбатеех зессктсах садсаззова свааїзаааї зазватоядає 8к2о астжсацоца тост саасу тастттстад асотасЯяжсс гіссясазта сатаастаєх 88850 акта азатязатай зоолізазлех ат стсвсайау стдазасаєу 8940 «хактикттяЯ сстадатота тасксоалата дасстізаата гтятозснакта аск стаха 9000
РТ. 52014 022500 ЙБРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ттдастзазс атасватєсаз таїтаватаї пасаж їзтатазоаїх Чптасасатав ІН)
Іст аєзазу абззалявіа гозсвааааї зааттттадя бат євса тжтасдадяа. Зт120 аавзведазкат сттхзоссата засазатчасє савсятастує гасзасстта акта 9180 зактсстаса каїасзІтсЗ адакізааай садатватса стазуздаво одаїсстасу 9240 тсяасстссто ссасттаси єусзсчсвай сачазаччца сузаввассв єсткассако З300 заксвстстк сасассатіт сівстадсяаз зсазатсіса асзастовад ссаЗзсстсх 9360 кЕжсесоКЕст СК тасавса сссЕссттва затаотвова ЕЕ ЕКЕса сатозстає 9420 таасетасса здапатастє аїєдЗавтада отасясаттї зхазатотастє астаавттада 480 зсахзазава зсаЕкЯссх дасзсоитаа Ссстусоаво Фо савсе сайвааюти 9540 акжЕтсвзствт атзазттета аспавадєзе затсоааттса сатностодя яауадававоа 9500 заадЗставсї засазосзає ассксабсоч ссЯсжестає скаустадуо гехачекаЧуе обо заятзїаата азоїтосвазх яса заастасаку стовесстає свстатакх 3720 сзваадоодаз саїтажітах зосзбаїстає заасотодаст стскївассс гтодатавой 5780 аїстстзстча Ззгазастово сктосттваст атозаїтсссз саятсестаєс саксвзатазо п840 тассіциа іа ки жессата їссЗодоавоє Кісасстасє сссатавтах 9905 тласстїстс савозасава осацаосссає зссстесЕсЄ Кс ЕстсЕ сатадтват 9960 тазасссУкєє асезасткта застктазат сти ту аазнстестес аск стсх 106020
Щхтоссакоа тессцсіскх пстетодадцх аассткоксс Ззадосахтоса сасдчастаца 19059 тссатавстта авіссЯтосас ахсасозвоЯ стодЯабстоза атуансссУ стікає 10140 ст їзадва ааттеттктаЯ гтасааїватє сазастттаат стат ттвакх тозкастаєє 10200 астсткакжа ссвістутОї св таке актдавістах Зізсататеї сскводаах 0250 тстсткассї заст атасзоатст асустсттоєа сєесмкоссех бастсксоВс 10320 сттотЯхтоо гкатттатсЕ асатаїєтаї созстостссяо зсозуасату їсвсважЕсх 10389 тоЗасстасс танці ста згаазачазо тасттаетиз азозесачоайх сузваасссо 0440 чІттїзтаїтз затааастаз ацаїтовсата тако кокЕ даткстстх сводатаавсе ТО500 тс ттоаз акаататодєс азізестсах стазатетоє Зтасатажеє секастоавте 10560 т тооаттЗ студвтстє аївазсазат стасуоссос зтозоссаа вавосесзах 10620 всзасвачев стос сазоуасваво саїтоатасех агтетатвате стчтотавсе 10680 акзаЯїсес сасоксотасє гааїуєраву чосаазавтв завсасасна саацтєсЯхе 40750 щїжхстсваах ааїотозадо тадаззатою аассаєоссї сскстсттує зхусозеа 10800 азататтзає адасєзоатясо созоксЯас стусавазеко встсасота сесестсова ї086о оЗаоазавчисї загласасає сЕТсставсат ссутзасвса зва аттааваде 10920 ттаїсаавая зтттазавїв здзавовоова ссстстазах аватстзаєтї тасадаве 10980 авковЕсттїтста атвасіїїїс зссзакзава авідїсатаа азатасутта зазаоаїатах їло40 бо
РСТ.Н852014 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛУДОВНОСТЕЙ таїспататс єїстесаїтоз сзазгвазаз дазайвнава абвазаскта зохававакий М1о0 зуастцавУє дастстзоос птосасазає аїзісавксс сзссааєває стбатткавіє 160 свазтаяатаїї: оаастатаєт аксссакайс сЕссаЕстях стататасс зебасатвай 22 вассттвЕсх оттстзооє піссатовай ХВтКЕттто аїтжтатестс соттоуєлавда кеВ) двайїсатоту сеттутакся ссСастсаєста гтасавосісе стсатоасає дсславеко 11350 асууєтазЕк отак сессттакове тстогастає сасстаацеє тест ссЕ 11400 таєстісткса ссадосстда созсасстя зкасодісся содабасася сатозетазя 1460 тхздетоцсс аастЕтасто созастасао дасте асястадута застати 15520 зктакттзсдая аіаатавіда ааадяатайс статсаттаї бавсвадаєс ататтаоеїа 11580 зЕстоттавс сстатазтва заззаатзсх дтаасаєсся састасатоз саасатстї 11540 «ксасссттЕс ати гохстоатаЗ сс состава сахткессхх 11700 сессЄтазатї кгодватасят тзтсатсята татавастаа затастазаа асзооаттає 11760 асазаєдата паїазтласа сазасвеста тадаїстадє гусватасатх ссаазстянс 1820 тзхатсцата стосаазаєа азастацвсто саттдатаст дзтяазаваза тавІсасцкоЄ 11880 тКтстодаст ваїтдатосаа сатастскта асаїтосст тажттсаєее тесадйзавай 11940 стКЕсЕтаЗк тстовасЕсЖ ссзетаєтто хттсссавїсє ссзттосоза ктозаєсвтх 150900 тоасттсомат сасазасаса асхтзопсац дсасвтоасає сузксвааке сасааскЕає 12060 татоїсавтда сттааатіса цюшеаотаса стасєстаєса сосатосвії асвітаЧчета 12120 дасссоатав славі стоїсвзасавй баїзавіата заїзакоїтт стататстаса ї218о0 ззаїазсваї звісавався заст кка їстітаттваа саауаетеко ТЕБЕ 12240 ахдасохтсс гтаатеїтта состексссс сттсттттаз зіїтзузасв ссттаєсатс 15300 агаазаєсаа дтасталявза застасатає їтсаїтааабса аїавсасава таттіїтаяа 12360 зааїстраза сватваїдаз свататтаса сайївзтсасу зазатстсатх захазаваха ї2А2) ттататавакх заяатотвнаї зосапїтати тобадовава заЗзстастоса сусахазках 12480 чїзсваавазо абтавайтиз аствттятаз яїзазствнасає тазатсаато сова 12540 тсаддатаах дайвазетай звана тто свастаяавеке стататутає свсасасвеса 12500 заїааєднах засаотавза айазссаца сааасаєтса ссятстсата адатастсва 126550 заїзастуаїа зазататаца ста та сосазстводс саоссяавад дадаасясод 12720 дтатаїзсва азадацівсс їттазаїтст астутасттс стттаєтсся дасотсктта 12780 тахсазао асаїтасуєва зоаїсссваї сасавзкста затакттсаї савсасттва 12840 тастттєста тт татжсст зтсстатаво єзаєсссває тстєсеваса Стосттаттс 125900 асисазаства ставуаваах сттссаїдає сссссзаосо зссостасвтс дастазаїса 12960 тсазстаттс сазустасої аїттадозаї ссотоаозаута садсаавато агатаєсстао 15020 зсзехозсях ссавадіїсеї дасвасатто ассясттеєє тазсттяЯссе патвастасе 13080 вСТ.И52О14 022500 ПЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ стастосоої дасаоастає стістотахує сзасткоодоЧЯ ссасаєтава саататсяда 13150 тсовттасто ссадевоєоує ссссатааою стсвоїовсє састсаєкох ооасссаває 13200 стсстстстя кттсавтуєт дсасВкско собасоавсс свзатттазст асітассасо 13960 акстссттса дасадіссва щісасссвує ссасттссте састодаєзо Яассєтав 33320 асататаскт саподасааа бахадоссва БтсстаатЯаї стасваєсте окостацося 3133850 хчстоєсрасо ссасестуазЯ васаткоаас ттозсаазок сСзааатазе састяскаєоу 13440 стостОЧЕс сларссекоЗ адзсасасєто зЗазакоасс сплодісвіс застассссв іЇ35й зостасотат стопувосис зсуЗзаосака йозаоззсоах асаєсстацає пободасассе 13580 зачсаттсо9 азасатазчає састсостто атстоасстча савттаїсттс тасосазстда 13620 тоудаєтоаттх стзсдазчаао зо уазсс асвоссстса акессвовех Зодсястосє 13650 аасячтоссс тратазоаацекх сазатЯдссст стсастстве Ксссаааесє сесствіау 13740 їсавтаство сатосттеку сятозосста акстсдасає стассотоаає сітстссава 13800 статссваст сассазоаскх асСттстКстЯ стозосавоа стстстсває ахотастеса 13860 ацдасавазса савассвата ссовасатех асаассітає остудссато соч 13920 зссстозава ат созастє дасзацектс авотатттса Стастеотасе страте а 13950 зеасстсдазо зсссастцод задїзаястас аозсатсва стастссаау сіссутаках 14050 задач зозосасвоє азЗатозтах асттовасоо воасаттеля Зстахасовов 14100 авсаєвоаасса сстатттоас стасстовкУ чівастттта састокЧчато часте 14160 соазозадас асуаоцесвс зсссстсаве асзаватоЗЯ сбастуєсяз сазтасссоЯ 14220 ззавоачтясо агосссасс аааїтозаасс зосссесктє гсесасксс засостадса 14280
Віт сЯкУЄх соаасссавс аїсоссасст атсатувсст аїсуазавсо дгосавуїса 14340 ссастсєсве стсоукксосєє Зайсзасате жстсоавсах осастєсаво дасакстаси і-й зуєсватссс сїтлавстас заїсттоксс хсассатаєї охоадсєсає ссдоваваса 14480 тбаватстаця седадссааа спосо сас астясосаве дао ссзад ссатазачах 14520 атасопозаа одбсадестацо соївсясаЗо тзаотттста ссістаєсті стовзсататає 345850 атазтаакта ссаїтазтта ізо тазьвї датїатттсаа заст сазваєвада 34640 очатосляха сатазсзакс астеттстає засетатаво тутататати стазкетака 14700 асттттстал сатасзасса зазсахудсоа акотосанах сствочестас сессссоцах 14760 ажхстссасЗо стбачасссс Ястусосватє зотозасзає сттуасттоо тстаатттая 14820 сект ссвОа асресассає возсацовсов одасавовее дсаатсаза запас 14880 тасазасаїс стіуааоасає зтосїсяваз заїстіпссє зосязасода зтоз3аатов 14540 хзасттосяс согтжксаві аЗдісатзак аоопсоосаає асо со заєвсоааса 15000 кУссацсеоїї двацівавца Чавес сх сасесватес васосассяє сусассеисх 15060 ссузасвЕкя стдасязтаяд сесассттаї астдазеває зіонстссВх чес ас 15120
СТ. 052014. 022500. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ авазасазвтс сСаїсасвосо ївааапїтає саїтсвоацтяЗ птсяватадо одеса 15180 хетсвтатас стсватаксс ссзкссаяах асвтсакст зесатастес зсвавстесс 152540 «хвіасозаЯ сссоозавтаз сіатавесю псзостастЕ сссаотаває стссвадосе ї15300 тасасссацс зосасвосяа гсодассастт дайстттатс дадтісяаса ст саодах 15360 часяссасва сатозссвос асзадзастеє асзсесєоще бассозстто тасткессє 15420 тязвотасає аїтузсазау Тест стсВО садазуавях ззасстозия засеоваса ї15450 їттспазсаза зтсаєсдотаа зсоїсолчат сидастсята дйсавасатоа ссзодсаттоа 15540 затаєзовоЗ заоссссоза ссзавоактово задоссатто азссттатса ядосвстоє ї156500 цосачївссс заїстодааєс тзачоппокеє достссавох стесЕсосяЯ звасавеесса 15650 тсассосата даватсааєста ссааусадає савасавцто дустатаксє ссаватастє 15720 позшсасс зсстацосах абсо тотастссас озастєссста віаситазсх 15759 ау снакк даїбасстсо дяссастесс сайтетасст ссвазоасета чзасссачсво 15540 савсацівесЗ зассассєса азс ссяа дсссавеоки сссдвуусуа суссасваса 15900 їочссвосає ядозстосао асиїттадава Єсодсстаєа Кут оство завтасасух 15960
Тсаздазаєс стокусадса ззаду остоаатвас сіфрвнтоїе дала 15020 сасюкаат аоссзаасєсу доастсатаса садасатосє зосастазаз гадавзадвоно 16050 час сс зазусуаЗто доссастоаа ссхтаєувава зсастуєтов саякваєсуз 16140 тстоатаїто сттаУтЯкоЗ сессядотто опстсасадза асззкссвес зссосатада 16200 звотацітаїтс здусазоєса засазустоді саатоскокс здазасстод абаксассЕ 15260 сІввотатат саєсттуєто хастссасва йстсєсяввЕ асвійаоссто Зазказесоа 16320 тзастсзаєс заствусооаєс сесчасасаа ОКогозоачЕ астлаатада сЯсссате 165380 чтасоалаїєс йссзсастза асзаадсває Сзааостсві асатасстс состзаасе 18440 ддаатосаазв зааттууїсс скістсоїка КстЕКсдсся сттЕтастау свсутахкав 16500 їхастастта аксассЕско стасозстс астататсся дістаросса зуоассдсоаа 16560 зсеїззазоаса атастсвтсас сттяїтасотас саасасатоз сатдатацієї статастацс 16620 аостатваса стааостоссх статок є тотахатсва саладчатсях кассоєоаа 15680 тасатоассяє отасосассс тасттвзаєво дсзасоохао састтавш асуссосо 185740 сазтоасстка сс озоасеЕксоЯ твасоаттттс ачістваак ссттосеттЕ 16800 чеасзеЗО зсув Коса 165824 «ха «231» 188922 хизї2» ДНЕ «213» штучна послідовність «ВО «8223» Плазміда РНРБ2557 ов РСТШВ2014 Оле ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «айї» щівс, Тейтике «222» С9373,,(9373) «даї3» появляє собою з, с, 9 або «Од» 3 зазусксста ттссазацвіїє сстаттстсЕ зоаадцтата дозасттссв ссасаєдаєв Бо сваїтуосоЯс сассусіїсс вдзаєсассс пабссстсткс ткессістсса сассосвося 120 хссссаававсо састаставй гссассескес Єжстссстса ссзазаєссте ассаааєсса 150 зассзкостст сдазассаза їоїтесатек ссавассссс сасузсуосу ссстутеасса о азбдазасосс авассасудад сссттсЯктУє сасувітсУс стссопосова сстсоасявоа з0о0 зсдсосзсат ссстотодає зсостодада дасаадусої засоасодіо стсосатасс 360 сезесцасЯс зссдзсосдау асссассвод сустсасосо стссясесоєс атссосвасо 420 тостсссосо ссасозусво одсовсоКеЕ ссоссоссза адостасосо сестесссса 480 всестссссоу секстосае дссвестссо пдссссоусає сассвассто коса 540 тсоассавсує тесазсодає додсатсссау ссотсосєсах сассдассая дссадессоєсс БО зчатовтсою сассдасасс ттссаадава ссссозесЯх здадосоває адаїссатса БО сдаадсасаа стассісатєс стсовсоєсо асдасаєссс ссусаєсоєс Зесозвоскх 720 тстткессасЄ сассіссоус сосессдотс содссстсає сдасаттссс ададаєсоєс 7ва аЗсазсваєт соссукосст ааттЗадвсо адсссоссава сстссссоді тасстсасса р)
Частдсєссао оссссссосс дадасссаз соудвзасасаї сесадасте ассахо9а9а з00 сссазадасс сеїістстас Фссвосувта Зсадістааа сессвотасх дазетазоос 950 астстастода астсастоЗє ветсссвіто ставсаєтсе засос зЗаасесехе 1020 сттвттодіЗа тозататтссо сетсадатас судотасока счрвуастиєх татЗстаавсе 1080 асустоєков сяатаотсак суп КосЕтУ ссссбююа: заз стояе дассусатта 1140 сезудааЗсе сдазассЕЕ дстацтасая стзаЗассУє сасастоає аскоаскета 1500 ссязовітоЗ павуааєза) саззосясасо соссаЯзеста сосоодаттто ааастоцес 1260 тбааооовах сватаєсоакйх стодачоазуа авдодлотода обогавокех датсесвазо 1170 чЕтоЗаснца здачаттзає з'освЗазас зсавцтктсс аттодуїтас задасаттсс 1380 здоазсокозЕ сістссосяа сасоствесо адотсксяа сЗадстваасї аатодачато 3440 ствссаїстадя тастодоЗс: здасзУсатс зазкосадос сососаВсх сасааВкаса 1500 зовдассоуза дсвзусчахсо зссссабаЧа Зісттодачс сагуосксх поча ассо 1560 свастяттао кастстаЕк Яставсссто оо9стастоє ооїтозсає? заховав 1620 псаотттсає сатазатаєх садазосуцу ссзстатаво зоусоЧачаве сісссВотти 1650 зпатвІкоєх отовасази саусаєттоо зЗстатоавтаат ссазкосовну два 1740 зсазоєссза стачазстсасє асстаїстто дазаїссос тазсуачадс оадзтаттке 1500 сазасатост садосстесх датоесттога ЗаесассоУс зусоасазеко зсозаваадо 18650
РТ. МБКО14 02200 ПЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ заозасттад зусадсаас саозобаатнх тудвсасесс тедеєссстає сетей 1920 саттакасс ссассавааз сатосвстос саасчастес свастаатода остесаада 19580 атесваєзаас тодоЧпасЧях пзсадаасов добастоате дестацаєся азсостсс 2040 часа Стутаєвата гаїатзадаї затустотсс таустосавзо асстозесто 2 кдсотазасаї сасачїістої зоба отлдосаасас зії тактгЕ сег 2160 засттастає асосаотацс ажстатєстаї сестотавес суасасстсс тато сстох и! ассотоуєсох садах Ядстусаотох дастоааввт: даїоасусєтад саатаахаки 2280 сто гтляза дустааоса аоааїстосх дайозвотса заноствато даязссадасе 2360 асататтсва СОСЕКЕКСЕХ Іс стассоо гтоотаявсу саїзоаєтсв асттстстта щюЮ часксаиссе азусваксво савзастесат астесткх таасітосса текасттасе 7460 тстаззтодла астоковсса асо сЗ асвозасоава їттодассає ссатссаса 2520 заавкатскск ТЕжОстсзат стссзсзаня сдатассоаа акссадазчах аа есааа 25850 адісаузаайт досаавзУуєсія тваатавсаа засаЧадтво асоскотавї соастесаах 2940 засазаєчзеає ассасесссс сао стаЧа сссассавоц зсадвістач дсесЯассоах 2700 чдатспзсостас зсЯссстасс зазсвоятах асутсатуєх зстатсестс асасосасох 2750
Чсзеаацттс стастссоза детсстаттс басатадаоє зхаочавсїк седататтає «820 тосвуєцасс оусетсосоє севссдасоба сссотасєдає ссасуссстє сатесдссоєс 2580 їтастазєєз асссдотаис адсссякаст заїсауттає стаїссстсс сссатсатва 2940 ттаатсттва свосстсуаа сессасляса стуаєтазес їсттоЗатса базова о 3000 ссзазозаса зазоаадася зазсасазто ваастатсстї Єтосатвоса атоїставох щ06о тсаїзвааїх сазасвазаа сосваїсаса сасастозає зісаєсєттвЕє састаостоз зі2а ткасоззїсоєсє сососсазоз даззавааст дсассссава адссатосає засавсасоє 31850 астсзкаайуц сКоассвзассоя зусасссскаа ззсаттсвес австсавско арка з24а сткасактко стос сствза сссваєстса вастсовасу сестксесосс асстсвссх 3300 тасссатієс аасяасссусєс заастесата ссаєсссото Яссаааєутс сатосацих 3150 васавчакск ябсоастасза зивостосва кстсодсссв Фк тсакс аксазуавсс 342 заїтЕсазтат сстаутасас сутатєвзад аасттаааї зсвстосус сосакцуаста З48о тсрастсвса звсастазсяво їсосозоаса адзасозасас дЯсасссвая аксоасуодая 2540 тссзататус сесустатсо асассаєтасє тсаассуата тоацасстес тстетаоссх 3600 шасзкасстт саоасаттссс зсЕсусстса саастессає ястатостоє зсваєтссве ЗБ тостсєтувсс застав зсутазосао кобасостоє тазаозсвас ссессотсса 3720 асузачиазоє чассавасой тастсосста сттсвзазааа стссттсяхс тузавостсе зо ттовксестз сессссата зсжстасаса зоасодтоза бстоаадссе асосвсаєсах 38540 астассстсє засеєссвзо осз3саєсаєс соатсостов Задатастод сеосарчаєй 3500 вСтТ.ОЗа014 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ заадатасстссо засавтсакс вссассатся аотассеіст ясссоссткс втдазасох 39650 стсттстах саасоазсий оадсвоссто ссодосозоав сестстесто СЕС зга ккісстастє Тесс: сзасстоаса аопсуЗаттаа ссаєдасаає адататвасс за8о соплозаїс вістаостсс азсооссасо сстсодостс сязастстває посаасодса 4140 асзасодсас састазесєов соасссттоє сутесЯссіс хостуостсс астодсаєсто 4200 віїссзеаст їсттзасодо сосстсвасе сстасоссва ссаоатсатї ооспозадасу 4260 зсссасаосІ дісусссаса зазстсазос ссастодсай ааватасатс сжсоастасс 4320 асссссасод свісахсоос асодіаоссї стоусоодзат соєсаскоао оддлустадах 4380 заїссзадекх стстссоЗоє віжестУєіт сесттажоає тсесассває застіссязо 4440 тосстсеста споязвовоїає сісатдадеєс тоуоаатсЯс скстоєстсс авовацессх 4500 чсазвассек сстсавоєух зассаосста сстосатсоє суссоауєвох асасавалаа 4550 зестЕстоос сасасссцеє опїсакозасєс тЗатастаст сааЗсозааао дУусткосхс 40520 пзсттдотах звасуссода датиссяссс стожеесссах сабпосстт согдачазсо 4550 засстстактва ссзадстзос ззсдисазах соссСсааВкї сізссодас сазсаОктто 4740 тсвасазете ссттодаттс асскттсстх братосвжає ссоводсоєс тссвассаси 4800 ахассцассе тоїссестаєс зопсуасссо сзасаєтех все єтес сесвтсВсе з86О тосстсажст сссасасссс ассоасозац ааосутссза абассаєсдає сратасатсо 4920 ссзвяскоса зсозатстас азсодосаса зодатоадаєз тЕтсатсазЕ тоассоває 4980 «вщосавзоз зоссссаоав кгссозасва ссдазувачс доссукадцх асзаваєтава 5540 акосасуїаа сусвачадє ксасоювоаз сатоюзатат ктеїахессцає сабасзаєсао 5300 їзсавтвастї Заястссавїс сзетусткс татозатава сзазодахує хзтозбасах 5150
Хявсаєтста сстатоасасс ставок ест атязсяавте сесісттаєє актахавайсе 5220 зкстозаатсо гЧасобйсста сзуаатостї сазаєзутає алазаєсвнаї зтокастатя 5280 апасттєста васазжтста ассттадсає осоаасоай асабавоує сазЗаауаса 5340 їавсааукає затодазцдяая діток стсс акттататат тазгтататтас ссасткатаї 5400 астатаство оатостазцю здасзізаса аетатаавой падваціктяЯ тасссвеска 546а татахтзтає асєтвсссатс табзбсаєтає зсстатссас стасставто кссттсааа 5520
ЯїстОаїсса тзататтісї вакаїтац стуасатута табозлавод гастатїтоа 580 астстсесас сстогтаїтавна даскоцетса сссттвавоє пабсстатєех заттттаєто 5540 сжісттасадч зстазааалаз азктаковнує са тквата заатастоза був таааа 5700 тазєдаїхаяа гзасзтатаз таїтатуктата сааятттаї асаататаас актсакстах 5760 азазаавосва ататжоєсат ззакстатає затсукітао ссттастода асозвтстса 5820 асктатестаза сазовоутана сасаїттуає ссуттЗокта сттвасаває баттатесаа зво савстататоз заст сітзссазка айуадізааза їказастацо заЗаєваса 5540
Ст. О52014.029500 ПЕРЕНІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ дічФесссавї ссттатасаа скаастссса сазузавоаєс азвссадаца свасазаваа 5000 асазосаазу сазаттїссї азтттузоку оссткастко стосатазтє сатосавтда 6050 васастзсас агдассстк глазсвзотада зсвасавсто вссоїкось хадстістее 65170 тактствет ттстаїтсзос аазвоазатазз таззастазаа солодасвекї садках е 5150 тсаавсосаєстї стствозсеє асукестЕсс асаатасята астаставасе аатсттавах 65240 зазхаавуоа таддатакти тест стеє атавзадетва затакесєтає ско ка БЮ оЗаїзсатакт содзатаднісє тазаївтайа асаататтх сгтатаїсода стазасятахт 6360 затсвасаїї ялататзата КЖТІЄККктаєа їаооітотас всаїзатстт асазодатаа 6420 дазастаєдах заддаїтзаах тсставзасатт сстасатста сузуазазаа адатвссета 6480
Зссаєааатста аатдассзає азс Евса зссттвокай їтсасаавтх сстататота «540 їзтсїоцалаї Саааласаца їаагсостза опоаазоадааї сстасутсає стсстсах 5600 сорт утса Сослазсаоа заопозсоаа апассасстс ассатоазваєс асесттсваса бо ссатттткас тадсзаасна Чісісзясва стЗаацссац стсростітсс оС 6720 засаасастсх стітовваїа таза їттссасато ахттастаає відессваазо 5760 асосттаїто азіадацізс авсастїоєла сотастаств астзоаасає озадазосах 6840 тассстваса сдатавісст зсзазовсоє тазесссваа Звіссваттє свастататав 5900 зітатозсоа андсалаато авіїсвсата устозовохо азавзоазаво стаастваца 5960 засавсяскхї сапсууссос їїствастяО стадоассто ЗзУсзосуває деузатазвує 70хо тасаааціту гсодітвояах тасотсстоз ссттатсвеє йбаочктсвай Ода 7Ово заєсзааочу Ффиітатовао спасе стсЕ суаттсттоЗз аїдзоватсе сассадоКав мо зЕсозостас ттзастатоз аїсссаєзох себасссатс забавах есе цасва 7200 стхУКНост жссаївІстЯ Заоасеєтся КсКОссКІта квосаттвас скЕскссазу 7200 васайвоуаза Ясссасассс їсте КсКЕ сСтстстсата атаасктвяа КттОгтатад 7390 астктзваєст стазатоїте сттттпазає тс тЕСтсСтЄто ссвсЗаєссс 7380 четсесасто соровоаєзаєс стотссзаЧе тахотосато астадаєсєє тассувакее 7440 шкохзсаєса соазодсчао зстоваасоа астстеєкк сітуассткО гзодаануєх 7500 ста єкос дусааєсааї теїзактвох сттваїттває астаттаєкт ттаттссве "зо ктктостадс сетазкуаско азттоаусос зтясттсста очазаттсте сОассувасй 7820 тс :Етатас адатсєтатвс їсттодстся тосесттаєт ссттоазюстто тастпдстах 2880 ттоусстзсах асттаткоас торісдатов дасаташсас автссттода сесасттокх 7740 пахставтаа заодаотосі стаїїзйпаада ссзаЗзасода сзтксаї татасавахта 78а0 застузацові: счасасаїтао угода тЯ тстсттсяазв абаавееето ЕсоЗаазсай 7850 тяходсвата ссттусстяв асттотастає агавтітстта стат є подассаксоа 7920 аштстзсва зсаавІстає зассосакоз ЯсСсотазвоо сслатасяй сп кО 7980
РОСТ. И52О014 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Текст тяодо Засазосаїє зїзсттатує всдаттсстЯх діавссатуа яесскскасо 8040 їтотастзаї зтдазлороса задаатааваєс асадаасаво Кссосттс тсаваєаато 8100 тоаадасада заатодавсс зтосстсстс тстсосатої паїстазавї аствоасводає 160 чдасасотсва зссоасстяас адатсвастс дасосасуєс сесазаЗада аодусєсавка его асасзЕскеє базсатЕтту засасааати ссаустАтст ззааатетаї сзазазаткх УЖ зазаїтааоза дасовасіст їтязаїтанаї стазасттаєз аваттсатуа тт засав 8350 пттттсзсса зтайзазато ссСаїзлазат атостазайай Збасзісаєс асо 0 «хакзаїлаз тазазацзаваа звазазатай зазтізаців лаваасрвмоаї сЗазетовех 8460 ттапасЗтат атазатаїзї савссоссуєс засазтттат Сїзаєссвза їзсястуаай яко тахвіїактс сасацвкстие атктзЕстах атаїттаста табязавасту ката й5во тапйостоттс асуавататху тт тУВЕиЕ баїстссоєу дсладазчаах сакхусоскт 8640 шкохсодссяс ссассактос ацетткусся тосаскочес кчастоасоз тако кає 8700 тттКОЕКЕСК татоаЕсттЯ «осїзсдаст єдйусстоса тсСтстЕтатс ссттсатсво к7БО зІїтовктсодЕ їасстазтаї одсссатода тасасосаєа пдстазаєстай зсЧассявся 8820 їїостасода сдатаодваат: їсти тає сззосззаст аїттссатаї табодазсаа 8880 тзатзадяаа затаїтстає саїтатствас адлатсатах тадттавттт Яктаастета 8940 таахазавоз аасастотаа састсасаєх дсабодтавс акстсткссас сесуссатк 9000 стека соакасккк тест: сзазасттатт їсссттсттх таяатттовда 5060 ахзсаттажєс ассабатата застдлаата стааааасяч дастзсясва атозсааата 9120 зтазкаєсавза таїстатааа Естацдесоса атататесва астазстата сода іо заааїтливасє таодстосатт патастоата аваазататс атасосстс тадастовка 9240 асосастаста сстттовасає сосстесатс тат сса ддалазост сссвосксте а300 чатссстсат татстаєстс ссаїстссак буїгувактсуз зісасисасх ссеїзскасяа З360 затасваттї аппіводізс атосаїт99ї сзваїссасо зас тасо ксатовстта зага заакссаквої зотасвістас стассасзса тосгаїтатає суоссвуаєє тозтадосва з480 «иттусїтОї сваєватата зататазата ака ктатє астасозваає дасаотоатс 9540 ваайсззаса піт атске саїсадсзао асо срісеаоа сука Зб тасстзсаст тссссссттс тт тОаатткс аовзасвзсттх яусатсаїєва аатсвавтвс 9650 таазавлате асататсєся сапатзатаа сисазавтаеє кссавазазу стовззатаах 220 заїовасзах аїтасататт зтсасовдаа гссаєтазта зазататтаї агаззеаава З780 татазсазта чЕсатастета чзБазайзаче зстчсасоаса газіатаитас йзааазвк ся 2840 ззасдаавста єстаїваатаз їазсастана їтлаїтаотоа зїсатаєсва затаатцдзвай 9900 ааусааатая застктасаах садстсстаї ябуксаєтзса сзсасвзаса збаваакава Бо зЗзтазаваава їтабозідаа гвтстассаї сссасаавцає аїбстзазаста зсдаїзааай 16020
РСТ.І2014, 022500 СЛЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ їатацаттвЕ СТТЄтатоса астзостзос сзвазаовом зсвсопдпотаї асатааазна 10080 затассткта аастсстсаста хастсесх ажжсетоВсо Ес ататес авотодаєах т0140 асуєчавоаї стсзаттатс зобсстзаата сттсаїттзає встїзакєаст сттстатх 10290 вітсстаккє татаясаок сссОакЕстс ссаавсастє такт сасає ааствастай щавБа пчаайссес сасадсссссо сазвосоассо ствутсваєє авотсатсва статссаву 10320 стакчїатку овааосетах Заааївсаоєс аяуаєчяитаї зсетазасио созтатссяв 10380 чес сстазса асаїтозсса сттесєттоас таЯасстовта астастіста хоасочіоата 10440 застає отозассває стіозодассає встававсав атсасаєсоз ттастоскад зо500 сзатуєсссс асвадатєси Ззсодсссаст састтсодос ссаваєстсє тсестатте 105560 затястодса что ка тазасссаах єкобстастЕ зссесаассе ссстсавасв 106520
ЧЕскадвєси сссовоссяезе СІссТетЯсх овасадаВек сттїовасає чївстїсава 10680 часазатсавта Фуссаасксс Саакокстас азс є сессатос одеса є 10740 сстовуаасу гтуаосттох саазоєтаза тої сясх астотостоє сусваєстазо 10800 сеттповчЯх асастоооза зтзастсяву чісвісааєеЕ зетскаассє асутаїі Кай 10860 чазвітсусчо збсасаацаа чдасчасвтає стадасоуію асатссаває аїстодаває 10920 чтазассаст тесттоассе Ясстдатвнатє таїтестатО сто сой Савко с 10580 заЗчаасЄ чавоссвсяс ссстсвактс садаєтозоавт астоссааса зкосссудає 115040 задустсвах здссстстса стстоадтєсс аадссксстс татаїтєсава кестозсаєо оо «ттосттато зозсстватс созсасстас сусдатекке тссавзстат ссевастсасс і1л160 ааасесастт сесттостаз осаздастеї стсаасатот астксавода саадіасяво 31229 ссаатассоз асатотасва ссттесосто оссяхосічЕ десзксвесс хуаазаках МВо звассттвзасєз запстсазоє засесясеас сатостоста звїстаавсс ттадаЗе 11340 астачзавуї застусачоє саісааєстас сссзаостс Зкатасодоз зсстЯхаай Мо тасзосавуя буататастх спвсодадяс агсолЗає атуздлаасаї здассаєста 11460 тгсазсстас стоатаотай сктстасоасе отоатоЧатх детсстоасоа дазавсеоо 11520 зшщісдкассс стсзутаєди одуспоЕкас тассвасяає дсссодачна згас ов 11580 сссассоват тдачтсадсс сссттстєте тастксавко стдасвжатє сотастсодах 11640 сесавсвісєо сксасстасса созсстаєкя адавсоятоє заоссассає тессасстся 11700 тЕсостозас заовістсте пзасатаєсає тссавудаса їттасазоєс захсссткта 11760 затстасавтк гкусссскоє саїостокОю суссасссоу паззсоєтва аттадассва 118270
ЧсаавотсУ тсастзтсоа косаосоцую сссаацссях зодазататає ззпдаавво М18550 сстапишсотз сосзодізає сстстосттс тассіттоаї ахаїататна тазктатесаї 11940 тваттазтаз сазтаїаата ттїсазатат сстсгтсвааа зідаваодає ззотатака 1:х000 цсватстУсжх сеСтОсаЧиє сзсаякУса саїзсктза Кттаївясте ттстазтаха 12060 вСт.в2014 022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ І їоассадазє «Коса Е зезодксста оЯстаєттсс ссутататсх ссвкоцдссо ї212а чассссасто сасаятааса засавсстта асссоожека засяє сессодоасоЗ 12150 сассасвзоса суосязодас задчастотав ссбазаоооа тоЗсстога засос 2240 зачтзсятиї тсззозавіс так гсвосу засадою заотооєчає сезсассомх 12300 тесазіводії сатойтаоо: зоусовсоако дастсузиса совасатоєс адсоссодазо 12360 тазаздацано подостовсс саактсуоко зоуссассясв сет стссЗо окатеоссоа 12420 садтаасссвз ссктетасту аоазуосоєва стссакожеє ксксусадая асавіссяке 12480 асвосатаза зпїтассвіс зоутавніся забсзадізоє статстеаєкстє якатассеся 12540 атятстссує ссзаутатат сассттостя тастссасаз астсссатат асозадскко 12600 цазчсаассоз содсстодсад стастєссра зсваасстєє запосттача сссвосадса 12660 саотаатува ссасттоває тіїатсазає ссвзасаєсте садЗасоасаЯ ссасвясату Уго зЗзссзосасва состотасає зїссозатасє досекогасе сагессєтава чеувсатУЄто 312750 азалацісст дстсзосаав адавосочає сСтуосозесе воасаессто оадазцаєсв 12840 сказсаЯзтеах сузоаттява сткаїяавааса засатуєсяв саттддалиста тауадчЧчавиї 127500 седазассаз затузовоада ссветЯавсс їбатсвовоас астастопса засссавсе 12960 тобаастова дохо ссаадістоє ссасвудває засосаїсас сосаєаоааа 13020 тавхтатсво асзуатсава сазоїашісї асоккєссая атасттоачатє здесаєсоєсї 13080 адїатитси ссттсттота стссасоаас їсссаавтає атадсстопа сазтсово 13140 асстсєдавекс зсжесссаох птассіссав зустстаЧчаєсс свосаоасасяа зсаатовасе 13200 всїїттвасттх коссзадстс аасоїтстса забтозсосс асаосавтозс сазсасдяза У25О0 їхохазисаї тадоазасєсва сствтветтО Уссстразеї зсатастсва зааатостах 13320 тсзосазавцо задссадессо посозсессод зстасєтаза сазуУсвся дізачЕвосс 13350 ззаїкузосє сатзсасана сатссядса ссдазатача ззооЕ Ффрасссааво 13440 товУкоЗусс астазасст асодзвосасє тастодсвзУє зассЯвссто атаїсактка 13500 чзтскоЗсссс авоссадсес асзоавасад тссатсассу саїтзуавота чястассвудс 135650 звадісзааси асбуцісайх усоїсазаа зсстодатаї сассоєстяу Яхакатсатк 13620 ттостатаст ссасазастс ссаазтасаї восстодазе зобстдасовс стадтесдасх 136850 звасзоассвсо азсасаачхоє двасевеста затаватчсї соска тас часова 13740 састанатаз аасанісаля осттвтатат ассстссосї зайдссоває Зсазводазає 138500 тадехстскс ссаєтаксих стоаскасттт бассаоухасо тактавтсас тастеватсв і3860 тсестастта субстсаєта свзіссудіст зоассавазс сасчаадета ззаЗсвасяє 13920 цсасткує асутастаає асзбодатосо атак тато ссабстадеє аїзаєсвхзаЗ 13580 стакстстоя ЯгесескЯєа тастзагаза сйаїсавсасї зусолатоаче чатсесасас 14040 зчтассстаст таотацдосаа сорозазсаст саовостЯкос стткасатЯя оссттоєсхе 1-00
СТ. 2014 022500 ПЕРЕЛІХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ тост тозаа сеутттотзах ос тсоаЯт стзаашесвЕ зестстЯасуєЄ асусоосаоу 14160 аксссстаса додазасссав астстодсоса ссазсстста сестастст дстусадааяа 14220 тксстаттсс даадтсесствз стстссадаа зотатзоваа сетсасатоє тассесягоє 14250 затсвсойт стсоваєксї зтазсотсяс стзаатсотя тотусзтовї зсаїтазоаеЕ 14340 атотаїттєзаї соїзоєсясаЯ їтстазсцрає зататутсса гатодтосасє стсвотаса 14400 зістостсте всодєсусата зстзавссаєд ссссозсасс сассвлсасс состуасуєв 14460 сестовсодо сттЯасстєї ссесодсатсс асттасвновс аацстоатовс секстссадо 14550 ацстасзстеї ЗксзЗачоаст стсассекса оасссовває дсесувайсо два 14550 отовтасоаєс таїїтттата спостазвтоїс асгозссадваа їсссттдасо козу еся 15640 сссзссоаа суссаоаеєсс сосзоаназо асслазЯзаиЄ стссктовда сестсЕскх 14700 стдсосотаа сстостастї освазсазааа азаєсвссяє тассвосоус ока 13760 ссовЗаткава зстассяизе тссКжЕсссЯ задатайсто зстсзасаЗ азсосазака 14820 ссазаївсто тссттстває дізоссостао ствоазсеасс асттсвадаа сістосвуса 14880 ссзсстасат асстеостст дстазкесто стассвокав стоастоссво тудсавса 14550 їсотатстта ссоазастова стозауасоав тадттассод аїзазоасаса осо соаас 15000 єсазсопоЗз9 остсосесвс асазсссаос ссозазсяза суасстасде созастзава 15060 тасстаєвос чтуасдсатто зоалавасоасє асосттсссо задудадаза досазасазо 15120 тажссоотаз ЗзспдсацоЗї созавсачоз забдсосвсой 9доозусктсє аздочиава 15180 асстоастаєс тіїататісс туссповиї сассасстео засттовясо совка 15240 тдатостсоє сазасозаса дассстатоо ваяавасусса асвасуєоус стеестасоо 15500 тЕсСствасст їттЯстуусс стігтостсяЄ ВтУттстїс стосеттатс сестоаскс 15550 чсоузасзасс уктастяссоє стттазотяз Зстоатвссоя сЕсресозсао ссблаасуаєс 15420 пзососаоса аоїсаотозо соводавося даадвососс садіассва ассесстее 15480 сесясоасят поссдаттса бтаатосвоз стоассвове стсодатсесо совзавставє 15540 зсдастсаст аїладазуас сасадксочтт їсостствоЗ датзатітто стався 15600 адззодзває зсасссатоЗ азаадчестоа астісассрвсо всусстссо апдзаусекех 15660 дахсдаззад стсозсаЯсо гстссоавссї Заїасвостс їсодаоЗзаса зада стся 15720 тосттсєвОас сесоасосац дено счкоо асатотссто сазосаавтя дстасоссуа. 15780 тЗаїтєстзс азаваїтсуть атоїттатсо псасттсоса хсяоссасес гсссоВесс ї5840 здзазатостх дасастоово застісвосоя даусстоассє таїтусаїст сессоссукує 5900 асзоаоатоас асастосаво зсстасестуа зассзадско сесостеєеє сво ссоВ 153960 сопсодацост атоозтосов ссостасоЗс соаїсттазс садасовося дакссоассс 16020 зхїсвасско сазаучазісц Зісвасасає сазсатоЗзсчк засттсятає зсосовккує ї6о8о їадтїссссат окотатсаст досазаєтоє датодасуає ассотсвото сзтссоссяє 16140
РСТ.Ш5е014.022500 ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ псацосестс Затовоастоа тосттдаоє совазастоє сессаватсс доасасстсоє 15500 тасосидає сгтсодстсса дсаавтетсст засоодасваї пассасаєав сазсодісає 16260
Ссастодадеє Запдсоватос ссоЗодатес ссватасово Зїсоссваса тесту 165320 зодаосстоєд сгтаосстаса содаосвзоса часосостає сбсозоасова зоасатесода 16380 зсстосадаа єсоассасудс сссобоасата сакастссс абсцес то вссяастста 16440 сазан Ягтозсодса асттсовЕда свсаосттоюд зсусвоаоЧес датосвасоєс 16500 звассвсссяз тссодадско доста соо бдсосасасах зЕсесссоса дазосЯсоус 155850 кКесссоадасс пасузстуто садлдютасе соссдаєває дозвасєсває зссссзосає 16629 соЯсссозда Зсзазоззаї зохезоазтає аосствоОвис заєссдосто стазасазаоє 16680 ссЗааводаа ЯстовУстою стостуссас суссуацсва сазстазсат засссстсци 16740
Часстістаза соадоїтсктуа соч остодзаадов оодластастає ссодатовес 16800
Чісзаоосст сасотдєтаай са 15822

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання, причому зазначений спосіб включає а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення двониткового розриву в розпізнавання зазначену геному ДНК, де двонитковий розрив приводить у результаті до утворення нуклеотидного липкого кінця; р) лігування першого адаптера із зазначеним нуклеотидним липким кінцем; с) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (Б), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; а) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (с), з еталонною геномною послідовністю ДНК; та е) ідентифікацію варіантного сайта розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву.
2. Спосіб за п. 1, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву вибирають із групи, що складається з мегануклеази, нуклеази "цинкові пальці", ТАЇ - ефекторної нуклеази, транспозази і сайт-специфічної рекомбінази.
3. Спосіб за п. 1, де нуклеотидний липкий кінець являє собою 3'-нуклеотидний липкий кінець.
4. Спосіб за п. 1, де нуклеотидний липкий кінець являє собою 5'-нуклеотидний липкий кінець.
5. Спосіб за п. 1, де перший адаптер, лігований з нуклеотидним липким кінцем, являє собою нефосфорилований по 5' адаптер.
6. Спосіб за п. 1, де геномну ДНК вибирають із групи, що складається із прокаріотичної ДНК, еукаріотичної ДНК і синтетичної ДНК.
7. Спосіб за п. б, де еукаріотичну ДНК виділяють із рослини, дріжджів або тварини.
8. Спосіб за п. 7, де рослину вибирають із групи, що складається із сої, соняшнику, бавовнику, люцерни, каноли, тютюну, картоплі, Агарійорвіх, сафлору, маїсу, рису, сорго, ячменя, пшениці, проса, вівса, цукрової тростини, газонної трави та проса прутоподібного.
9. Спосіб за п. 1, де засіб для індукції двониткового розриву отримують із І-Стеї.
10. Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання з покращеною активністю розщеплення для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання, причому зазначений спосіб включає а) приведення в контакт геномной ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатним до введення двониткового розриву в розпізнавання зазначену геному ДНК, де двонитковий розрив приводить у результаті до утворення нуклеотидного липкого кінця; р) лігування першого адаптера із зазначеним нуклеотидним липким кінцем; с) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (Б), і лігування другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, що оточують двонитковий розрив; а) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (с), з еталонною геномною послідовністю ДНК; та е) ідентифікацію варіантного сайта розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву; І) аналіз активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву у варіантних сайтах розпізнавання з (4); та 9) ідентифікацію варіантного сайта розпізнавання, який приводить в результаті до підвищеної активності сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву в порівнянні з активністю в припустимому сайті розпізнавання.
11. Спосіб за п. 10, де про підвищену активність сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву свідчить а) вищий відсоток (95) розщеплення варіантного сайта розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайта розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на геномній ДНК; р) вищий відсоток (906) розщеплення варіантного сайта розпізнавання в порівнянні з відсотком (95) розщеплення припустимого сайта розпізнавання, де сайти розпізнавання розташовані на плазмідній ДНК; с) вища оцінка в аналізі на дріжджах для варіантного сайта розпізнавання в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання; або 9) будь-яка комбінація (а), (Б) і (с).
12. Спосіб націлювання вставки полінуклеотиду, який представляє інтерес, у специфічний Зо хромосомний сайт у геномі рослини, причому зазначений спосіб включає а) трансформацію рослинної клітини або рослини фрагментом ДНК, що містить полінуклеотид, який представляє інтерес, де зазначений геном зазначених рослинної клітини або рослини містить щонайменше один варіантний сайт розпізнавання, вибраний із групи, що складається з ЗЕО ІО МО: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 і 35; р) забезпечення мегануклеази, здатної утворювати двонитковий розрив у варіабельному сайті розпізнавання з (а); і с) відбір зазначених рослинної клітини або рослини, що містить зазначений полінуклеотид, який представляє інтерес, інтегрований у зазначений варіантний сайт розпізнавання.
13. Спосіб за п. 12, де забезпечення зазначеної мегануклеази включає інтеграцію в геном зазначених рослинних клітин нуклеотидної послідовності, що кодує мегануклеазу 5ЕО 10 МО: 3.
14. Рослина або рослинна клітина, отримана за допомогою способу за п. 12.
15. Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення рідкого двониткового розриву в припустимий сайт розпізнавання, причому зазначений спосіб включає а) приведення в контакт геномної ДНК із сконструйованим засобом, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву, здатного до введення двониткового розриву в зазначену геномну ДНК, де двонитковий розрив приводить у результаті до утворення тупого кінця; р) створення нуклеотидного липкого кінця з тупого кінця з (а); с) лігування першого адаптера з нуклеотидним липким кінцем з (Б); а) розрізання лігованої ДНК, отриманої на стадії (с), і лігування щонайменше одного другого адаптера з розрізаним нуклеотидним кінцем для забезпечення ампліфікації та секвенування фрагментів геномної ДНК, які оточують двонитковий розрив; е) вирівнювання нуклеотидних послідовностей фрагментів ДНК, отриманих в (4), з еталонною геномною послідовністю ДНК; та І) ідентифікацію варіантного сайта розпізнавання, що містить зміну щонайменше по одній нуклеотидній основі в порівнянні з припустимим сайтом розпізнавання зазначеного сконструйованого засобу для індукції двониткового розриву.
16. Спосіб за п. 1 або п. 15, де сконструйований засіб, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву являє собою ендонуклеазу Сав. 60
17. Спосіб за п. 16, де ендонуклеаза Саз здатна до утворення комплексу з направляючою РНК,
де зазначений комплекс дозволяє ендонуклеазі Саз вводити двонитковий розрив у зазначену геномну ДНК. ІЙ 4 пики ро ви Я 4 т - с нт нини я 405 я. їв 23 4 КК Я ; ї М Є ки и. ли х К- я, з жи У й » Ох і. Перехназнняї осо у , Х и в У пли й а Ї і: й о: і і щакцих свхкекуваних - рака й й КЗ Ля й й ве ке ія ще я 5 м Ух х а т й Кз я й і К я, й: : т Ь ка ОМА ак ЗІ В - нене нен ни шелест! С АЇА б А А б А А б сія сіб т сія бос тт АХ ет т тест КІ сб т соя БІТ сб А А ТІ чн.
Ї т -- ме повин: лини зимове т (днк СЕ 1 КЕ Га яз зів єю віз оч шо омшо Бої мої мо бе Бе вх БД ох сх бу ТВ ЗО ЗМО Ре ЗВ Я ох і п Н шш ши ши ! Ж тез сліфвн ит и оби НИ ЗІБ хи ВИ ЗОНЙ; ОК ОЮХ ох ОІД аб; Моєї МК ОЗ Шх с ж ох 0) КОХ ЗОВНІ М о ПИЙ ОБ ПЯЙ ЗМ МУ ко бу аж ОХ ЛИ і шк ЗО ЖЕО МИ ОЗ ох МОБ, деркдтвчівяних у пр НІИЦДІРАДІБДА ЛІЧЕНІ МЧЧРЧчЧчНННЯ пеаеннняю РАЗТІАРТІІЮС РАС і Кі Та СЕТИ ТАТА С ТА АВ И ФІГ, ЗА клад овнев ШИ Ши ШИ ШИ С зт сайт розпізнавання Й щі і | | ШИ СЕТ ЕЗ ЕТ ЕЛЕНСЯЕЯ ЕЛЕ ЛЕНСИ ССС СТ СТ СЛ ССС : ген вх ня вх ЗИ дО ЕН МОМ 42 Ми БЖ еВ сх ох ох БЕБІ аБх о ях БА оо БИ сх хо вх ОХ 5 Жов ЗІБ Ма, ОО мя Б ш оМмщім яко ях пф ВА Мі мо йХЯЕД хо зо БМИЯКЯ Зх У яеіВЯ тб юхо ех | Ж ощозмомо мох як б оні ЕМО м їх МОБ Ох хе КО кожних пи и их пи ох З р по ох По он под ОК В а п п ОХ п по ВИК реежененй реРдіААСІА ДІА ТІТІвІАИСІДІТІСРАСІАТТІКІТІ ті Та аа «Фіг. зв Жакскоуклвихе 8-3 «В «В 79 -В -ї |» і о. ве: й щі І БІ Я -3 1 «В з 1 Ге | «о То у мох ие шли ши чи и ри ча ча о мч п о Ж ЦЕ т я т я с б от ся с А Єв ТА сб сот а и ше ше ши я ни чне п в и п и и о НИ и п и но В М Ж А ТА т а с с т сс я сб такс бебі А Па т А т я б с т ба ТМ я боб т а б б сб 1 А Ж А т А т я с с т са ся сстясотб тА с ше ще ше ше ши а ши и и чн нн з нн с п и и У Ше В р т а т сс от с БТ А сс от я соб сб тя я ще не ДЕ тА т ре с от с А А сб та сети Ф Н
ФІГ. ЗА ин ними пинннініннь пнінінін він» зінінінінінінін зііннінні» инших пінні ї У » :- - і з нини мини ви зи 2 ши везе ОВ з/8|215 з я Із яз СЕ вія я СЕ поеми А Ех СИ ДИ ЗА иа З о п и А З Ж сен онаннн нн Н ЗЕ ЩЕ Я с М НЕ в п НЕ ИН ше м не ие М М ши шини и ше чини не их о ни че М нн ше ЕЕ и о М НН Ж б а вав Ас ат ШЕ я сот вААТІ я и ши и чи не ши м ме не в и и не м чн в М жо іс а я й є в б АТ ТА вот ваті си ше ше ше и ше и не м не п о чи и пе ни и Ше и о жо с А А я ся б АТ т б АС б т соя от тт Я б А А А С А б А т т с сс тА ВАТ ТЕ Я б А А А Є А б А ТТ С АС 6 Тс ААТІ Я с Аа ас я с а БІД а е те А ШЕ т т ФІ СУА С в А А соя с АФІША есе т с а ПІ т т Ж), с в а я са с а ДФ а св г кт КЕ | т ге ФІ тот ЩІ, Б ше ж ж и НЕ и НН НТ ЕЕ Ши ШЕ ши и Ж Я ЩЕ У М Я. що
Фіг. яв пз й Я дя Б ЩО ширш ш РН як - шк ка МИ дея с БИ и нання. х і: х 5 А у : ся В х Ї 5 ОО - шини шини б | - нЯй « Я Я Я Шин шк шк шк ЩО Що шо ше | й ші ---4 4-4. ;4-- А д ко ГА С ювавнуваня ШІ « а Я "й -В чЯг. 5А ЯА?градуєву дам, ЗА хохлау З ам ра ші щ и нин 5-5 й і Мішин ЩІ й ; нини нини Шх З дк нн С шини 7 виш Ши 5; шини С и Є г ни ш ш ш ш щ ЩО Щі п юШШ051 ще - З-А а|- 5-ях-5ж5 :-«жК4-- шк А- «хх 565 да и «А нших ше: ши Ше ШО поноттн «ТуВІ як, сл, аб, КН, ВІ шо ФГ. А Буеея ле
ХК. Вб т назв
Ш шов о МК р Те 8 а в не ши С й х Ме е щ- х ш аКБ- 5 5 - 5-0 ші шщ що що шк М -А- Х. х Х ЗШ: ши: ших щЕ1---- ; | х зи ж х. Ж. с М. миші ші шо шк: що ш ших шк ших ши: ших шх деелюннняа СЗАДОИЙ, ЗАД, СЗТ, СЛИНУ СЖеТеЙ, сейкни ОККО СО ПМ Пон ЯМ ТС, Вал М М МЕНІ
ФІГ. вв ЗА Свае, З ИН вв Щ 59903 р ра 5 ее ри є «703 / тт : зві Збропла М уклав п Во Амот / ї пе / НК ! : Лустий комтротх в / Ю 5 ю ні Ко 540 Цкнля ЧНО ТА
4,784 5 / й 42845 /
3.84 - е пд 3 42843 ; Е / 2 а / і В - Ве Обробленні Ї і
Е. 2,28 44 заегануклеаЗсю звавок й / х ви шу ул і і З 1284 і / / - Е й і 0,784 3 ; гу ік: і 0284 - - т Пустий контроль) З НЕ І 20 23 0 33 30 Цнкак
ЯНГ. в Система для скринінгу на основі дренажів ЯЕКОЛЬ Табти розпізнавання дах І ( | свя митинукдезаи не: НЕ КУН, ; З : ж: ОО шк шк Ге 51А-Й-- іхез |-Аде? У) в лонемю ее щ ПО иНН Ж ЧУ й Травсфоудмація пахзмідою з нукаважни Ко Тозріавння а щш векомвція З У 5 «Ї) що Б ж ДИ ї це ЧЕ 5 г г в.
Числова шкала для сиривінгу з дриюдавми шо ви я пелкта я я НВ РІК По шоп фі И ОТИТ ИЯ и В НН УВО ТД ЕК тих оо ння НН Н г г: зе нн пн 555 шк в 5 АХ ОО В вх с М Он М ох КО ОН ЗКУ я ТУ ОО ОК ОО ОО ОеоХ с о По п вах хх ОЙ нн пи КооКо а о ОО 000 с 5 о п о Ой и. ОО я о Па Я о. ОКей п и В ОКО я с ву с с: МО с ОО я ОО оо с ОО ОО Ох о о. ще о ще с ОХ о Я о с о. ОО м й УК я СЯ ОН о ОК ах ОК ОКХ ОО ОХ КО М ВУ ОО я ОО В о о ОО о ПО о о и КЕ 3 Не ще ОМ В ОК ОБО я о г ОК ОО МО У ОК и в ня БО я ой Су о ОВО в я М я Кор С я МОМ ОКО ОМ ОК МУ Я М и с
М о. ОК ОВ я ню ж я я ОО о Я БО В ОО ОБО ОО я ОМ і. о и їх ПН Х пе зоталхда, УК галактаза ФГ ШОУ з м у зх Кк - с ї и Бай М т - ШСЗ о ЕЕ 7 ще зх Ку днк Кя і В гуни г о у 5 Сід -А- -«К-К5--5 ць НЕ як Ї Е ; і й нини С ння КА 5 ; КО шо Я х. я не ) ! Її У С ІК х Я С ши КЕ ї ОК, . що зм В Кк БИЙ ї і ї Ме; : ) о Ме У ; ОА ; ІЗ ж і 5. х ур окр зва І УДК мк й І.
5. ока: х: Зо Ь КО ч Ж кт М Ї і вк х. ших 5 и х дод зх Щи М ок г їх З Ко х у х. у хх 4 ІЗ х; у 5 нини х х М ї «а 6 й і : ЩО ше РМ пед М щи і М 0 -Ьх55- ших ш х сх Е у у З дну 5 , зи 5 ї А Е не с й: Б Ах ; У Е Ї 5 Ще у Я й ЗВ М. З - 4 Кн сх м Ж я КВ У а оо: ших х. Ж. /ЗА--Х-- Е с й щкх ЩО й т І8у дя Ух і ТО Я нави ЩО Кеш і у ги ї ; ред од о. до Є УА БО о хо 5 Ел Кх Я о. ке і ше с К. о - ШЕ . Ї Ф док ї 5 й з й ОО : її З що ще с ж. пт у ХО ююююкююююєсся МУКИ: Ф 5 ка ;, ор хі її
ВУ. фея КС есесеевруесттнй основ ІМ «ЗАО, «ИН ЯА зви? г ну «ЗМ, ЗАВ, я се «ие перхдйлухаеио Бажаний газ Бл "НЕ Я "о Толя ша де похкімуканкх у май ї х їй з воконокенх мох "Не ше Іво Вохо, ЗВ КОХ Махна нн Удав
ФІГ. А СА ІК Зп:х, ЗЗОК МОНІю МУКИ:
МАО Я - пет і ІМ хуудонозх у ЗЕриДОКУЮ Ух ПАК : щ гоР / 1Д0- нн нанаан ни вон : Й | АЛ о 3 ; ев нет: Й ; . ай о З що ! да Гой 4 и, й по арт і лий ОН в ; ср ек й ву я пити ї 6» р й ЗУ астив Уууюехаеву хи. мех тнОоМх що ! х Й ? умунучяоикит маку 5 й 2 40 що Що що г Вимохцза ками окохох дих в ркредаху мам пай: КЕНІЯ у хх рагоюювоина ДЕМОНИ
Яг. зов дп. КП пер. х ! СИС ПК, ! г КУ Си-САБо ПА 1/0 ут томою СМ-САБІ СН х Мине ШО со ДН «Антон в най у м / ЩІ сМ-АБУ СНИ а СМ-САБО ПКН--.. л У ОМА5 РІЛВ55 СИ-САВІ СТВІ НОТІ ї й о А плям к, ; - 0 Дб тем ; позмсяє 15 ле і творам я саи: нн амаваннх БКЗЗИЯ ще і і х гі а передняч, пий: рознімання МТ У, ре я СХ б авпівнумий сзйт розпізнавання МеНІЯя КО ошн-нк -Вї - САВО емо а Же А к-ПРОМОТОР ВКОНГЛІЦИНІНУ З КЕЦЕВНИ ГОЛДЕРЕДНИХ 355 р чи: семюх и зх Гл Р 6923) (ДЕН А попереднях 199 ї и / 1 ет я «І в / Н УТЕРМІЧМАТОР ФАЗЕЗЛІНУ АННА У внМЕНИЙ ПОПЕВЕДНиК 154 / САН промов ЯНГ, ТА
ТУ пем. У Но птомоторт Я КГ І щ ХХ ОА РІМ КЗ ТЕРМ. кл х я урни хай розпізманачня 526 щу я ; с: Я пери тНниЙ сайт позпінаєвва МРНІЯ» СМ-бАБО СВІ Й А І-І ПЕ. Її. Ен инті у, фе ---ПРОМОТОР В-КОВГЛІЦИНІНУ НЯ нтеОона , ; ; ІБЩ2 п: Й ОА 1? у 44 рад мово си-баб3 (ЯН Ух Ку (МАСА НІ о | Оп ТЕРМІНАТОР ВАЖОЛІНУ САЖІ ИНА Кн КИ у; вени я й | ПІД- ВМ пРОмОтов я Ор, "ДІМА У кінцевий попЕРЕДНИК 359 КТІУ пеомото | М нюх втяя го і попередмик 159 че угон З ННЦЕВНЯ ПОПЕРЕДНИК МО ОСМ-ЯВІО пем
Фе.
UAA201509935A 2013-03-12 2014-03-10 Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву UA123532C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361777238P 2013-03-12 2013-03-12
PCT/US2014/022500 WO2014164466A1 (en) 2013-03-12 2014-03-10 Methods for the identification of variant recognition sites for rare-cutting engineered double-strand-break-inducing agents and compositions and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123532C2 true UA123532C2 (uk) 2021-04-21

Family

ID=50513431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201509935A UA123532C2 (uk) 2013-03-12 2014-03-10 Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10329574B2 (uk)
CN (1) CN105189788B (uk)
CA (1) CA2905289C (uk)
RU (1) RU2694686C2 (uk)
UA (1) UA123532C2 (uk)
WO (1) WO2014164466A1 (uk)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
BR112016003561B8 (pt) 2013-08-22 2022-11-01 Du Pont Método para a produção de uma modificação genética, método para a introdução de um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta, método para a edição de um segundo gene em um genoma de planta e método para gerar uma planta de milho resistente ao glifosato
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
EP3066201B1 (en) 2013-11-07 2018-03-07 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CA2956487A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
CN109804066A (zh) 2016-08-09 2019-05-24 哈佛大学的校长及成员们 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
AU2017342543A1 (en) 2016-10-14 2019-05-02 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
CN108070610B (zh) * 2016-11-08 2021-11-09 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 植物基因组定点敲入方法
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
US11661624B2 (en) 2017-03-30 2023-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying and characterizing gene editing variations in nucleic acids
EP3612205B9 (en) * 2017-04-21 2023-10-04 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases specific for recognition sequences in the pcsk9 gene
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CA3097963A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for homology-directed repair of cas endonuclease mediated double strand breaks
EP3790993A4 (en) * 2018-05-11 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING AND CHARACTERIZING DOUBLE STRAND BREAK SITES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
AU2019280712A1 (en) 2018-06-06 2021-01-07 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
KR20210104068A (ko) 2018-12-14 2021-08-24 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 게놈 편집을 위한 신규한 crispr-cas 시스템
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
CN114174530A (zh) * 2019-04-05 2022-03-11 克拉雷特生物科学有限责任公司 用于分析核酸的方法和组合物
RU2722933C1 (ru) * 2019-06-11 2020-06-05 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания днк на основе cas9 белка из бактерии demequina sediminicola
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
CN113667727B (zh) * 2020-05-13 2023-05-16 华中科技大学 一种获得线性质粒dna断裂位置序列信息的方法
WO2023230631A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Roger Paul Hellens Novel methods for identification and use of upstream open reading frames
WO2024077110A2 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Roger Paul Hellens Uorf::reporter gene fusions to select sequence changes to gene edit into uorfs to regulate ascorbate genes

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
DE3805150A1 (de) * 1987-04-11 1988-10-20 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
AU668096B2 (en) 1991-08-27 1996-04-26 Syngenta Participations Ag Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
TW261517B (uk) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
HUT70467A (en) 1992-07-27 1995-10-30 Pioneer Hi Bred Int An improved method of agrobactenium-mediated transformation of cultvred soyhean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5731181A (en) 1996-06-17 1998-03-24 Thomas Jefferson University Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
WO1999025821A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for genetic modification of plants
NZ504511A (en) 1997-11-18 2002-12-20 Pioneer Hi Bred Int Recombinant proteins comprising fused first and second distinct site specific recombinase and use in methods for the integration of foreign DNA into eukaryotic genomes
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
ATE454459T1 (de) 1997-11-18 2010-01-15 Pioneer Hi Bred Int Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme
US7102055B1 (en) 1997-11-18 2006-09-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for the targeted insertion of a nucleotide sequence of interest into the genome of a plant
DE69920879T2 (de) 1998-02-26 2005-10-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Konstitutive maispromotoren
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
AR025996A1 (es) 1999-10-07 2002-12-26 Valigen Us Inc Plantas no transgenicas resistentes a los herbicidas.
BR0307383A (pt) 2002-01-23 2005-04-26 Univ Utah Res Found Mutagênese cromossomica alvo utilizando nucleases de ramificações de zinco
EP1485475B2 (en) 2002-03-15 2017-09-20 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
WO2004031346A2 (en) 2002-09-06 2004-04-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
ATE420188T1 (de) 2004-02-02 2009-01-15 Pioneer Hi Bred Int Ap2-domäne-transkriptionsfaktor odp2 (ovule development protein 2) und verwendungsverfahren
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
ATE466933T1 (de) 2005-03-15 2010-05-15 Cellectis I-crei-meganuklease-varianten mit modifizierter spezifität sowie verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
KR100851035B1 (ko) 2005-08-23 2008-08-11 대한민국 ＧＣＰ-Ⅱ를 유효성분으로 함유하는 β-아밀로이드의 뇌내축적 예방 및 치료용 약학적 조성물과 치료제 스크리닝용조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법
DK2341149T3 (en) 2005-08-26 2017-02-27 Dupont Nutrition Biosci Aps Use of CRISPR-associated genes (Cas)
CA2691440A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
WO2009114321A2 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2011082318A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants
WO2011082310A2 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
US9044492B2 (en) * 2011-02-04 2015-06-02 Cellectis Sa Method for modulating the efficiency of double-strand break-induced mutagenesis
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
US9518293B2 (en) * 2011-07-07 2016-12-13 Children's Medical Center Corporation High throughput genome-wide translocation sequencing
US9873907B2 (en) * 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9

Also Published As

Publication number Publication date
CA2905289A1 (en) 2014-10-09
US20160032297A1 (en) 2016-02-04
RU2015143201A (ru) 2017-04-20
CN105189788B (zh) 2018-07-13
RU2694686C2 (ru) 2019-07-16
US20190367934A1 (en) 2019-12-05
CA2905289C (en) 2023-03-07
CN105189788A (zh) 2015-12-23
US10329574B2 (en) 2019-06-25
WO2014164466A1 (en) 2014-10-09
BR112015022542A2 (pt) 2017-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123532C2 (uk) Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву
JP7241683B2 (ja) 開花を変化させるための組成物及び方法ならびに生産力を向上させるためのアーキテクチャー
KR102136088B1 (ko) 식물계에서의 중금속 감소
EP1991685B1 (en) Compositions and methods for increasing plant tolerance to high population density
CN108064129A (zh) 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
CN105916987A (zh) 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法
US20070107084A1 (en) Dof (DNA binding with one finger) sequences and methods of use
CN103074310A (zh) 异戊烯基转移酶序列及其使用方法
MX2008013354A (es) Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9, y metodos para usarlas.
WO2019161151A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US20150024388A1 (en) Expression of SEP-like Genes for Identifying and Controlling Palm Plant Shell Phenotypes
CA2917103A1 (en) Transgenic plants produced with a k-domain, and methods and expression cassettes related thereto
BR112015020368B1 (pt) Uso de primeiro e segundo ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos si como marcadores genéticos moleculares, kit para controlar hibridização ou autoincompatibilidade em plantas, construto genético e método para manipular autoincompatibilidade em uma planta
WO2019161150A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
JP2023531153A (ja) Ｃ３植物における生産能力の増強
KR101711586B1 (ko) 식물체의 가임성을 조절하는 애기장대 유래의 ASKβ 유전자 및 이의 용도
US20220307042A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
CN101479294A (zh) 对应于玉米d9基因的突变等位基因和野生型等位基因的分离的多核苷酸分子和使用方法
Jiang et al. Efficient Gene Editing and Overexpression of Gametophyte Transformation in a Model Fern
Maqbool Molecular Characterization of Tiller Number Trait in Wheat (Triticum Aestivum L. Em. Thell.)
EP3975701A1 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
EA043050B1 (ru) Способы повышения урожая зерна
WO2019161148A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
Upham Nan Lu, Jared D. Carter, Tatiana Boluarte Medina, Sarah H. Holt, Norma Constanza Manrique-Carpintero
Lu Transposon Tagging in Strawberry and Potato and Characterization of Representative Strawberry Mutants