BR112015020368B1 - Uso de primeiro e segundo ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos si como marcadores genéticos moleculares, kit para controlar hibridização ou autoincompatibilidade em plantas, construto genético e método para manipular autoincompatibilidade em uma planta - Google Patents

Uso de primeiro e segundo ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos si como marcadores genéticos moleculares, kit para controlar hibridização ou autoincompatibilidade em plantas, construto genético e método para manipular autoincompatibilidade em uma planta Download PDF

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Abstract

MANIPULAÇÃO DE AUTO-INCOMPATIBILIDADES EM PLANTAS A presente invenção relaciona-se aos métodos para controlar hibridização em plantas e produzir plantas híbridas. A presente invenção também se relaciona aos ácidos nucléicos codificando sequências aminoácidas para proteínas de auto-incompatibilidade (SI) em plantas, e o uso do mesmo para a manipulação do SI, incluindo a produção da semente, em plantas, particularmente da família Poaceae. A presente invenção também se relaciona aos kits, composições, construtos e vetores incluindo tais ácidos nucléicos, e polipeptídeos relacionados, elementos regulatórios e métodos. A presente invenção também se relaciona a expressão de genes de reconhecimento de auto-gameta em plantas e aos ácidos nucléicos, construtos, marcadores moleculares e métodos relacionados.

Description

Campo da Invenção
[001]A presente invenção relaciona-se a métodos de controlar hibridização em plantas e métodos para produzir plantas híbridas. A presente invenção também se relaciona a ácidos nucleicos e fragmentos de ácidos nucleicos codificando sequências de aminoácidos para proteínas com autoincompatibilidade em plantas, em particular através do reconhecimento do auto-gameta em plantas de gramas e espécies de cereais, e o uso dos mesmos para a manipulação do SI, incluindo produção de semente, em plantas. A presente invenção também se relaciona a kits, composições, construtos e vetores incluindo tais ácidos nucleicos, e polipeptídeos relacionados, elementos regulatórios e métodos.
[002]A presente invenção também se relaciona a expressão de genes de reconhecimento de auto-gameta em plantas e aos ácidos nucleicos relacionados, construtos, marcadores moleculares derivados de ácidos nucleicos e métodos relacionados.
Antecedente da Invenção
[003]O fenômeno através do qual algumas espécies de plantas que florescem são incapazes de reproduzirem com sucesso através de auto-polinização tem sido denominado "autoincompatibilidade " (SI). Uma definição de AI foi aceita como proposto por Lundqvist, sendo "a inabilidade de uma semente de planta hermafrodita fértil produzir zigotos após auto-polinização". Estra fraseologia foi a fim de distinguir entre SI e o efeito das barreiras pós-fertilização. SI foi descrito em cerca de 30% de todas as plantas em floração, e é o sistema mais importante para prevenção de auto- fertilização. A parte chave deste sistema é auto-reconhecimento, em que o pistilo discrimina entre auto- ou não-auto-polinização para ou inibir ou permitir a germinação do tubo polínico e/ou alongamento e fertilização resultante.
[004]Existem mecanismos genéticos múltiplos que regulam e permitem o sistema, SI não representa um sistema único. A base molecular do mecanismo SI da planta tem sido bem estudada em vários grupos de espécies de plantas dicotiledôneas. Locus dos genes de autoincompatibilidade (locus S) foram identificados em tabaco alado (Nicotiana alata) e Brassica rapa (L. (sin. campestris) no final da década de 1980. Investigações biológicas subsequentes usando múltiplas abordagens têm identificados fatores SI, para ajudar a elucidar a base molecular dos mecanismos SI nessas espécies.
[005]Espécies de plantas dentro da família Poaceae (grama e cereal) podem apresentar um hábito reprodutivo endogâmico obrigatório controlado por um sistema SI gametofítico de dois locus (denominado S e Z), em que o genótipo pólen é controlado de forma independente por sua própria constituição genética. O sistema é conservado entre espécies Poaceae alogama, tais como cevada silvestre (Hordeum bulbosum L.) e centeio cereal (Secale cereale L.) e tem sido encontrado ser amplamente conservado dentro da família, mas é esperado ser geneticamente e mecanisticamente distinto a partir de mecanismos SI de locus único bem caracterizados de plantas dicotiledôneas.
[006]Os mecanismos Poaceae-específicos previnem auto-fertilização através do arraste do alongamento do tubo polínico do gameta auto-gerado na superfície estigmática. Embora vários dos sinais moleculares-chave envolvidos nos sistemas SI específicos de dicotiledôneas têm sido identificados, a base molecular do sistema Poaceae permanece desconhecido.
[007]Concentrações de cálcio livre são essenciais para crescimento celular direcionado nos tubos de pólen em muitas espécies. O papel que o cálcio desempenha foi inicialmente identificado como aumentar a rigidez da parede celular e regular a permeabilidade. Entretanto, a concentração específica do cálcio na célula é crítica, como cálcio livre é tipicamente mantida a c. 100 nm devido a metabolismo celular sendo baseada em fosfatos livres, e se os níveis de cálcio citosólico livre elevam acima dessa concentração, interferência com o estado de energia da célula resultará devido a formação dos sais de cálcio. Estudos dos gradientes de cálcio dentro do tubo de pólen têm identificado um gradiente aumentado na ponta de crescimento ativo, e o aumento tem sido postulado ser absorvido pelo crescimento celular.
[008]Previamente, cálcio tem sido identificado desempenhar um papel na regulação do sistema SI na família Peaceae. Tratamento com bloqueadores do canal de cálcio (lantano e verapamil) tem sido demonstrado inibir o mecanismo SI do azevém perene. Pelo tratamento estigmas cortados com os agentes bloqueadores químicos do auto-pólen foi capaz de germinar.
[009]Os loci S e Z do azevém perene (Lolium perenne L.) têm sido atribuídos como grupos de ligação (LGs) 1 e 2, respectivamente, em regiões de macrosintenia conhecidas como os genomas das espécies de cereal endogâmicos de arroz (Oryza sativa L.) e trigo (Triticum aestivum L.). Mapeamento de estrutura fina do loci Poaceae foi feito para grama canária azul (Phalaris coerulescens L.) e cereal centeio (Secale cereale L.), e as regiões contendo gene candidatas foram delimitadas a intervalos 0,26 cM e 1,5 cM para os loci S e Z, respectivamente. A presença dos marcadores associados a gene (baseado em cDNA) nesses estudos permitiu análise comparativa para definir o mapa de colinearidade ao redor do loci SI para espécies de Paceae de autoincompatibilidade e auto-compatibilidade. A região contendo Z 1,5 cM proposta exibiu microsistenia com um clone BAC (OSJNBa0070O11: GenBank Acc. No. AL606445) a partir do cromossoma do arroz 4 c. 125 kb em comprimento, ao qual os 12 genes preditos têm sido associados.
[0010]Para plantações endogâmicas, entendimento e regulação de mecanismos SI podem simplificar e acelerar procedimentos de reprodução. Por exemplo, conhecimento do sistema SI baseado em S-RNase de Solanaceae fundamentou um método para o desenvolvimento do cultivo de amêndoa através do uso de uma linhagem mutante auto-compatível (Sc) previamente caracterizada. O programa envolveu introdução do alelo Sc nas variedades de amêndoa existentes para fixação aumentada dos genes para conteúdo de óleo favorável e composição de ácido graxo. Endogamia também permite manutenção mais simples das linhagens elite agronomicamente.
[0011]No esquema de endogamia semi-híbrida padrão para espécies de plantações de pasto endogâmicas, dois grupos de cultivares são intercruzados para gerar uma população progênie com produção aumentada devido a heterose. Entretanto, cerca de metade da progênie é derivada a partir do intracruzamento dentro de cada grupo parental e não recebe o benefício de heterose. Heterose na massa de forragem tem sido também relatada em azevém perene e outras espécies de plantações de grama usando o sistema de endogamia semi-híbrida.
[0012]Em um novo esquema com tecnologia genotípica de SI, uma população restrita SI-alelo é estabelecida, e intercruzamento entre a população restrita e u grupo cultivar gera uma população progênie com uma proporção mais alta de uma progênie híbrida. Um experimento com trevo vermelho proveu proporções híbridas mais altas em progênies e produções de sementes aumentadas quando as populações restritas foram usadas.
[0013]Referência a qualquer técnica anterior na especificação não é, e não deve ser tomada como um conhecimento ou qualquer forma de sugestão que esta técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum na Austrália ou qualquer outra jurisdição ou que esta técnica anterior pode razoavelmente ser esperada para ser comprovada, entendida e reconhecida como relevante por um versado na técnica.
[0014]É um objeto da presente invenção superar, ou pelo menos aliviar, uma ou mais dificuldades ou deficiências associadas com a técnica anterior.
Resumo da Invenção
[0015] As Requerentes têm usado uma extensiva e inclusiva abordagem envolvendo ambos, modificação genômica e transgênica para dissecção molecular da via SI em monocotiledôneas. Perfis espaço-temporal da expressão gênica, genômicos comparativos, sequenciamento clone BAC e sequenciamento do exoma inteiro sugere que os componentes da via SI (os genes S e Z) podem ser codificados por uma coleção dos genes dentro da família Poaceae que não têm sido previamente caracterizados como tendo essas funções no azevém.
[0016]As Requerentes têm encontrado que modificação ou seleção dos genes localizados no loci S e Z das plantas endogâmicas da família Poaceae é uma estratégia atrativa para controlar polinização e fertilização por repressão ou ativação do mecanismo SI. As Requerentes têm também encontrado que modificação ou seleção dos genes localizados nos loci S e Z das plantas da família Poaceae podem ser usados para controlar hibridização ou produzir plantas híbridas em números mais altos que as abordagens de endogamia convencionais. Por identificação das sequências de ácido nucleicos dos genes, modificação transgênica através da regulação negativa ou através da expressão induzida permite esquemas de endogamia híbrida serem possibilitados. Modificação dos ácidos nucleicos através do rompimento do gene alvo, pelo uso das nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) ou nucleases dedo de zinco (zinc finger) (ZFNs), mediando clivagem de sítios alvos específicos no ácido nucleico, levando a micro-deleções e inserções dentro da sequência de ácido nucleico endógena, também permite controle da fertilização. O uso dos marcadores moleculares derivados da variação inerente originados de dentro de sequências de ácido nucleico podem também prover um meio preditivo para controle de fertilização.
[0017]Uma biblioteca genômica baseada em azevém pereno BAC composto de 50.304 clones de BAC (131 x placas de 384 poços) (tamanho médio do inserto = 113 kb) tem sido construída para sustentar a união contig, e estimada por corresponder a c. 3,4 equivalentes do genoma (Spangenberg e colaboradores. 2005; Forster e colaboradores. 2008). Uma combinação do mapeamento da ligação genética de fina-estrutura e caracterização genômica física permite implementação da clonagem baseada em mapa para isolar genes SI de azevém pereno.
[0018]Em adição, sequenciamento do genoma inteiro tem sido feito para gerar contigs gênicos a partir do genoma de azevém pereno que assiste com identificação gênica e caracterização de ácido nucleico. Esses esforços têm sido realizados em um genótipo de planta simples que tem sido clonalmente propagado para prover fonte de material suficiente (Cogan e colaboradores. 2012a, Forster e colaboradores. 2012). Um perfil do gene de expressão global (transcriptoma) também tem sido extensivamente gerado e caracterizado através do sequenciamento de ácidos nucleicos RNA a partir da mesma planta como foi usado para a sequência genômica (Cogan e colaboradores. 2012b, Forster e colaboradores. 2012).
[0019]Indicação e caracterização dos genes S e Z podem permitir estabelecimento de novas metodologias de reprodução para azevém pereno.
[0020]Por exemplo, plantas da família Poaceae podem ser transformadas com um ácido nucleico do gene Z gametofítico em que (1) transformação com o referido ácido nucleico do gene Z transforma uma planta auto-incompatível da família Poaceae em uma planta auto-compatível ou (2) transformação com o referido ácido nucleico específico do gene Z transforma uma planta auto-compatível da família Poaceae em uma planta auto-incompatível. Em uma modalidade preferida, o gene Z gametofítico pode codificar uma subunidade proteasoma 26S, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo não pólen (NOP), ou uma protease ubiquitina-específica, tal como uma protease ubiquitina-específica 22.
[0021]Por exemplo, plantas da família Poaceae podem ser transformadas com um ácido nucleico do gene S gametofítico em que (1) transformação com o ácido nucleico específico do gene S transforma uma planta auto-incompatível da família Poaceae em uma planta auto-compatível ou (2) transformação com o referido ácido nucleico específico do gene S transforma uma planta auto-compatível da família Poaceae em uma planta auto-incompatível. Em uma modalidade preferida, o gene S gametofítico pode codificar um Cullin, um receptor de glutamato ou precursor do mesmo, ou homólogo “seven in absentia” (SIAH).
[0022]Consequentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma composição ou kit para hibridização ou controle de autoincompatibilidade (SI) em plantas, a referida composição ou kit incluindo: um primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus Z de uma planta da família Poaceae; e um segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus S de uma planta da família Poaceae.
[0023]Preferivelmente os referidos primeiro e segundo ácidos nucleicos são substancialmente purificados ou isolados.
[0024]Em uma modalidade preferida, o primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico pode ser um gene Z gametofítico.
[0025]Em uma modalidade preferida, o segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico pode ser um gene S gametofítico.
[0026]Em uma modalidade particularmente preferida, o primeiro e segundo ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico podem ser selecionados a partir do grupo de ácidos nucleicos e fragmentos de ácido nucleicos como de agora em adiante descrito.
[0027]Por exemplo, o gene Z pode codificar uma subunidade proteasoma 26S, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo não pólen (NOP), ou uma protease ubiquitina-específica, tal como uma protease ubiquitina-específica 22, como de agora em adiante descrito.
[0028]Por exemplo, o gene S pode codificar um Cullin, um receptor glutamato ou precursor do mesmo, ou um homólogo “seven in absentia” (SIAH), como descrito adiante.
[0029]Em uma modalidade ainda preferida, os primeiros e segundos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico podem estar inclusos em um construto ou vetor, como descrito adiante.
[0030]Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método para controlar hibridização em uma planta ou para produzir plantas híbridas, o referido método incluindo: o estabelecimento ou identificação de uma primeira variedade de planta com um haplótipo locus Z e um primeiro haplótipo locus S; o estabelecimento ou identificação de uma segunda variedade de planta com um segundo haplótipo do locus Z e um segundo haplótipo do locus S; e o cruzamento das referidas variedades de plantas para produzir plantas híbridas; em que os referidos haplótipos são selecionados de forma que a primeira variedade de planta é heterozigota em ambos os loci S e Z e a referida segunda variedade de planta é homozigota em um dos loci S e Z e heterozigota em outros loci S e Z.
[0031]Preferivelmente a primeira e segunda variedades de plantas são da família Poaceae. Mais preferivelmente elas são espécies de grama, particularmente, gramas de pastagem tais como azévem (Lolium) ou festuca (Festuca arundinaceum, de outra forma conhecida como Lolium arundinaceum).
[0032]Preferivelmente os haplótipos são de genes de acordo com a presente invenção, como descrito adiante.
[0033]Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método de manipulação da autoincompatibilidade em uma planta, o referido método incluindo introdução na referida planta de uma quantidade efetiva de um ácido nucleico, construto e/ou vetor de acordo com a presente invenção.
[0034]Em uma modalidade preferida o método envolve alternar o estado SI da planta.
[0035]Em uma modalidade preferida, o método pode incluir introdução na referida planta:
[0036]um primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus Z de uma planta da família Poaceae; e
[0037]um segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus S de uma planta da família Poaceae.
[0038]Por exemplo, o gene Z pode codificar uma subunidade proteasoma 26S, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo não polínico (NOP), ou uma protease ubiquitina-específica, tal como uma protease ubiquitina-específica 22, como descrito adiante.
[0039]Por exemplo, o gene S pode codificar uma Cullin, um receptor glutamato ou precursor do mesmo, ou um homólogo “seven in absentia” (SIAH), como descrito adiante.
[0040]A presente invenção também contempla co-expressão de um ácido nucleico da presente invenção com um gene codificando um mediador ou modulador da atividade SI.
[0041]Pelo estado SI é significado a habilidade ou inabilidade de uma semente de planta hermafrodita fértil a produzir zigotos após a auto-polinização.
[0042]Por um "mediador ou modulador da atividade SI" é significado uma molécula que aumenta ou de outra forma modifica expressão, atividade ou função do SI em uma célula de planta, calo de planta, planta, semente ou outra parte da planta. Por exemplo, o mediador ou modulador da atividade SI pode melhorar o crescimento do tubo polínico, ou aumentar a ação ou atividade dos mecanismos SI.
[0043]Por "uma quantidade efetiva" é significado uma quantidade suficiente para resultar em uma característica fenotípica identificável na referida planta, ou uma planta, semente de planta ou outra parte da planta derivada da mesma. Tais quantidades podem ser facilmente determinadas por um versado na técnica apropriado, levando em consideração o tipo de planta, a via de administração e outros fatores relevantes. Tal um versado facilmente será capaz de determinar uma quantidade adequada e método de administração. Ver, por exemplo, Maniatis e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, a inteira revelação da mesma é aqui incorporada por referência.
[0044]Usando os métodos e materiais da presente invenção, autoincompatibilidade pode ser induzida, aumentada, diminuída, reprimida ou de outra forma alterada, em uma planta transformada relativa a uma planta controle não transformada, por exemplo, pela incorporação de cópias adicionais de um senso de ácido nucleico da presente invenção, preferivelmente para super expressar o polipeptídeo ou no senso de supressão. Eles podem ser diminuídos ou de outra forma alterados, por exemplo, por incorporação de um ácido nucleico antisenso da presente invenção.
[0045]Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para alterar o estado SI de uma planta, o referido método incluindo identificação de um gene codificando um polipeptídeo que é ativo na via SI da planta e regulação positiva ou negativa da expressão do referido gene para reprimir ou induzir o mecanismo SI na referida planta. Preferivelmente o referido gene é um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Preferivelmente a planta é como descrita anteriormente aqui.
[0046]Por expressão "regulada positivamente" do referido gene é significado aumentar a expressão do referido gene e, como um resultado, a proteína codificada pelo gene, em uma planta relativa a uma planta controle.
[0047]Por expressão "regulada negativamente" do referido gene é significado diminuir expressão do referido gene e, como um resultado, a proteína codificada pelo gene, em uma planta relativa a uma planta controle.
[0048]A regulação positiva ou negativa pode ser realizada pelos métodos conhecidos aos versados na técnica. Por exemplo, um gene pode ser regulado positivamente por incorporação de cópias adicionais de uma cópia senso do gene. Um gene pode ser regulado negativamente, por exemplo, por incorporação de um ácido nucleico antisenso, uma estrutura deslocada ou de outra forma uma cópia senso modificada do gene, ou ácido nucleico codificando RNA de interferência (RNAi). Regulação positiva ou negativa pode também ser alcançado através do uso de nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição ou nucleases dedo de zinco, mediando clivagem de sítios alvos específicos no ácido nucleico, levando a micro- deleções e inserções dentro da sequência de ácido nucleico endógena.
[0049]Técnicas para incorporação dos construtos genéticos da presente invenção nas células de plantas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas incluem introdução de projétil de alta velocidade às células, tecidos, calos, embriões imaturos e maduros. Células incorporando os construtos genéticos da presente invenção podem ser selecionadas, como descrito acima, e então cultivadas em um meio apropriado para regenerar plantas transformadas, usando técnicas bem conhecidas na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes serão aparentes aos versados na técnica. As plantas resultantes podem ser reproduzidas ou sexualmente ou assexuadamente, usando métodos bem conhecidos na técnica.
[0050]Por "repressão do mecanismo SI" de uma planta é significado reduzir a tendência da planta para inibir alongamento do tubo polínico e resultando a fertilização da auto-polinização.
[0051]Por "ativação do mecanismo SI" de uma planta é significado introduzir a tendência da planta para inibir o alongamento do tubo polínico e resultando fertilização da auto-polinização.
[0052]Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando uma proteína da planta com autoincompatibilidade (SI), sequências antisenso da mesma, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes da mesma. Preferivelmente, o ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em uma subunidade proteasoma, mais particularmente uma subunidade proteasoma 26S, um Cullin (Cullins são suportes moleculares responsáveis para unir ubiquitina E3 ligases, mais particularmente E3 ubiquitina ligases baseadas em RING), um receptor glutamato ou precursor do mesmo, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo não polínico (NOP), um homólogo “seven in absentia” (SIAH), e uma protease ubiquitina-específica, mais particularmente uma protease ubiquitina-específica 22.
[0053]O ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico pode ser isolado a partir de ou correspondente a um gene a partir de uma planta da família Poacea. Em uma modalidade preferida o ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico pode ser isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir de uma espécie de grama, particularmente uma grama de pastagem tal como azevém (Lolium) ou festuca (Festuca), mais particularmente azevém pereno (Lolium perenne L.) ou festuca do prado (Festuca arundinaceum, de outra forma conhecido como Lolium arundinaceum).
[0054]Por "ácido nucleico" é significado uma cadeia de nucleotídeos capazes de informação genética. O termo geralmente refere-se a genes ou funcionalmente fragmentos ativos ou variantes dos mesmos e outras sequências no genoma do organismo que influencia seu fenótipo. O termo "ácido nucleico" inclui DNA (tal como cDNA ou DNA genômico) e RNA (tal como mRNA ou microRNA) que é fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas, ácidos nucleicos sintéticos e combinações das mesmas.
[0055]Ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ter genes de comprimento inteiro ou partes dos mesmos, e são também referidos como "fragmentos de ácido nucleico" e "sequências nucleotídicas" nesta especificação. Para conveniência, a expressão "ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico" é utilizada para cobrir todas essas.
[0056]Por "substancialmente purificado" é significado que o ácido nucleico é livre dos genes, que, no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual o ácido nucleico da invenção é derivado, flanqueia o ácido nucleico. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um ácido nucleico que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus replicante autonomamente; ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um genômico ou fragmento de cDNA produzido por PCR ou restrição de endonuclease de digestão) independente de outras sequências. Também inclui um ácido nucleico que é parte de um gene híbrido codificando sequência polipeptídica adicional. Preferivelmente, o ácido nucleico substancialmente purificado é 90%, mais preferivelmente 95%, ainda mais preferivelmente 98% puro.
[0057]O termo "isolado" significa que o material é removido a partir de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se é de ocorrência natural). Por exemplo, um ácido nucleico de ocorrência natural presente em uma planta vida não é isolado, mas o mesmo ácido nucleico separado a partir de alguns ou todos dos materiais co-existentes no sistema natural, é isolado. Tais ácidos nucleicos podem ser parte de um vetor e/ou tais ácidos nucleicos podem ser parte de uma composição, e ainda ser isolado em que tal um vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural.
[0058]Tais ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico podem ser unidos para formar um consenso contig (contíguo). Como aqui utilizado, o termo " consenso contig " refere-se a uma sequência nucleotídica que é unida a partir de duas sequências nucleotídicas constituintes que dividem regiões comuns ou sobrepostas de sequência homóloga. Por exemplo, a sequência nucleotídica de dois ou mais ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico podem ser comparados e alinhados a fim de identificar sequências comuns ou sobrepostas. Onde sequências comuns ou sobrepostas existem entre dois ou mais ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico, as sequências (e então seus ácidos nucleicos correspondentes ou fragmentos de ácido nucleico) podem ser unidas em uma sequência nucleotídica contígua simples.
[0059]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando uma proteína de planta auto-incompatível (SI) ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando uma proteína de planta SI, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0060](a) as sequências mostradas nas SEQ ID NOS:1 a 70;
[0061](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrada nas SEQ ID NOS:71 a 140;
[0062](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0063](d) sequências antisenso das sequências recitadas em (a) e (b);
[0064](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[0065](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[0066]Preferivelmente, a proteína SI é selecionada a partir do grupo consistindo em uma subunidade proteasoma, mais preferivelmente uma subunidade proteasoma 26S, um Cullin, um receptor glutamato ou precursor do mesmo, uma protease dedo de zinco, uma proteína contendo C2 e domínios aminoácidos GRAM, mais preferivelmente uma proteína envolvida na transdução de sinal, tráfego de membrana, e/ou processos acoplados de membrana, mais preferivelmente uma proteína codificada por um gene NOP, um SIAH, e uma protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina-específica 22.
[0067]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento do ácido nucleico codificando uma subunidade proteasoma, mais preferivelmente uma subunidade proteasoma 26S, ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando uma subunidade proteasoma, mais preferivelmente uma subunidade proteasoma 26S, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0068](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:58 e Figura 3;
[0069](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:128;
[0070](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0071](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[0072](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[0073](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (e).
[0074]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando um Cullin, ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando um Cullin, referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0075](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:20 e Figura 5;
[0076](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:90;
[0077](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0078](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[0079](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[0080](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[0081]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando um receptor glutamato ou precursor do mesmo, ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando um receptor de glutamato ou precursor do mesmo, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0082](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:39 e Figura 7;
[0083](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:109;
[0084](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0085](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[0086](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[0087](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[0088]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando uma protease dedo de zinco, ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando uma protease dedo de zinco, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0089](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:62 e Figura 9;
[0090](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:132;
[0091](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0092](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[0093](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[0094](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[0095] Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando um domínio C2 e GRAM contendo polipeptídeo, preferivelmente um polipeptídeo não polínico (NOP), ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando um domínio C2 e GRAM contendo polipeptídeo, preferivelmente um polipeptídeo não polínico (NOP), o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0096](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:59 e Figura 11;
[0097](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:129;
[0098](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[0099](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[00100](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[00101](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[00102]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando um homólogo “seven in absentia”, ou complementar ou antisenso a uma sequência codificando um homólogo “seven in absentia”, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00103](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:40 e Figura 13;
[00104](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:110;
[00105](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[00106](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[00107](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[00108](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[00109]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado ou fragmento de ácido nucleico codificando uma protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina-específica 22 ou complementar ou antisenso à sequência codificando uma protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina- específica 22, o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00110](a) as sequências mostradas na SEQ ID NO:54 e Figura 15;
[00111](b) uma sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:124;
[00112](c) complementos das sequências recitadas em (a) e (b);
[00113](d) sequências antisenso às sequências recitadas em (a) e (b);
[00114](e) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c) e (d); e
[00115](f) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b), (c), (d) e (e).
[00116]A presente invenção compreende fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos ácidos nucleicos da presente invenção. Por "funcionalmente ativo" em relação ao ácido nucleico é significado que o fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular SI em uma planta. Por exemplo, pode ser capaz de manipular um proteasoma em uma planta, mais particularmente uma subunidade proteasoma, ainda mais particularmente uma subunidade proteasoma 26S. Por exemplo, pode ser capaz de manipular uma E3 ubiquitina ligase em uma planta, mais particularmente uma Cullin. Por exemplo, pode ser capaz de manipular canais de influxo em uma planta, mais particularmente receptores glutamato. Por exemplo, pode ser capaz de manipular atividade protease ubiquitina- específica em uma planta, mais particularmente uma atividade protease dedo de zinco. Por exemplo, pode ser capaz de manipular transdução de sinal, tráfego de membrana, e/ou processos acoplados de membrana em uma planta. Por exemplo, pode ser capaz de manipular SIAH em uma planta. Por exemplo, pode ser capaz de manipular uma protease ubiquitina-específica, mais particularmente uma protease ubiquitina-específica 22.
[00117]Tais variantes incluem variantes alélicas de ocorrência natural e variantes de ocorrência não natural. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais dos nucleotídeos são contemplados desde que as modificações não resultam em perda de atividade funcional do fragmento ou variante. Preferivelmente o fragmento ou variante funcionalmente ativo tem pelo menos aproximadamente 80% de identidade à parte relevante da sequência mencionada acima em que o fragmento ou variante corresponde, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 98% de identidade. Tais variantes funcionalmente ativos e fragmentos incluem, por exemplo, aqueles tendo mudanças de ácido nucleico conservados.
[00118]Fragmentos particularmente preferidos incluem fragmentos das sequências de ácido nucleico que incluem regiões hipervariáveis do gene gametofítico na orientação senso ou anti-senso, e variantes funcionalmente ativos desses fragmentos, ver Figuras 17 a 37.
[00119]Preferivelmente o fragmento tem um tamanho de pelo menos 20 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menor 50 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos.
[00120]Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento variante pode incluir uma sequência mostrada nas Figuras 17 a 37 do mesmo.
[00121]Por "mudanças de ácido nucleico conservado" é significado substituições de ácido nucleico que resultam em conservação do aminoácido na proteína codificada, devido a degeneração do código genético. Tais variantes e fragmentos funcionalmente ativos também incluem, por exemplo, aqueles tendo mudanças de ácido nucleico que resultam em substituições de aminoácidos conservados de um ou mais resíduos na sequência de aminoácido correspondente.
[00122]Por "substituições de aminoácidos conservadas" é significado a substituição de um aminoácido por outro da mesma classe, as classes sendo como segue:
[00123]Não polar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
[00124]Polar não carregado: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
[00125]Acídico: Asp, Glu
[00126]Básico: Lys, Arg, His
[00127]Outras substituições de aminoácidos conservadas podem também ser feitas como segue:
[00128]Aromática: Phe, Tyr, His
[00129]Doador de Próton: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp
[00130]Aceptor de Próton: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln
[00131]Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um construto genético incluindo um ou mais ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.
[00132]Em uma modalidade preferida o construto genético pode incluir uma sequência quimérica compreendendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção e um gene codificando um mediador ou modulador da atividade SI.
[00133] Em uma modalidade preferida, o construto genético pode incluir:
[00134]um primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido primeiro ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus Z de uma planta da família Poaceae; e
[00135]um segundo ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando um polipeptídeo SI, em que o referido ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico é isolado a partir de ou corresponde a um gene a partir do locus S de uma planta da família Poaceae.
[00136]O termo "construto genético" como aqui utilizado refere-se a uma união artificial ou molécula de ácido nucleico isolado que inclui o gene de interesse. Preferivelmente o construto genético é uma molécula de ácido nucleico recombinante. Em geral um construto pode incluir o gene ou genes de interesse, um gene marcador que é alguns casos pode também ser o gene de interesse e sequências regulatórias apropriadas. Deve ser apreciado que a inclusão das sequências regulatórias em um construto é opcional, por exemplo, tais sequências podem não ser requeridas e situações onde as sequências regulatórias de uma célula hospedeira são para serem usadas. O termo construto inclui vetores, mas não devem ser vistos com sendo limitados aos mesmos.
[00137]Por uma "sequência quimérica" é significado um híbrido produzido por meios recombinantes através da expressão de um gene de fusão incluindo dois ou mais ácidos nucleicos ligados que originalmente codificam proteínas separadas, ou fragmentos funcionalmente ativos ou variantes dos mesmos.
[00138]Por um "gene de fusão" é significado que dois ou mais ácidos nucleicos são ligados em tal uma forma que permite expressão da proteína de fusão, preferivelmente como uma fusão traducional. Isto tipicamente envolve remoção do códon de parada a partir de uma sequência de ácido nucleico codificando para uma primeira proteína, então unindo a sequência de ácido nucleico de uma segunda proteína in frame. O gene de fusão é então expresso por uma célula como uma proteína única. A proteína pode ser construída para incluir a sequência inteira de ambas as proteínas originais, ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante de um ou ambos.
[00139]Em uma modalidade preferida, o construto genético de acordo com a presente invenção pode ser um vetor.
[00140]Por um "vetor" é significado um construto genético usado para transferir material genético a uma célula alvo. O termo vetor compreende ambos, vetores de clonagem e expressão. Vetores são sempre moléculas recombinantes contendo moléculas de ácido nucleico a partir de várias fontes.
[00141]O vetor pode ser de qualquer tipo adequado e pode ser viral ou não viral. O vetor pode ser um vetor de expressão. Tais vetores incluem sequências cromossomais, não cromossomais e ácido nucleico sintético, por exemplo, derivados de vírus de planta; plasmídeos bacterianos; derivados do plasmídeo Ti a partir de Agrobacterium tumefaciens; derivados do plasmídeo Ri a partir de Agrobacterium rhizogenes; DNA fago; cromossomos artificiais de levedura; cromossomos artificiais bacterianos; cromossomos artificiais bacterianos binários; vetores derivados a partir das combinações de plasmídeos e DNA fago. Entretanto, qualquer outro vetor pode ser usado desde que sela replicável ou integrativo ou viável na célula alvo.
[00142]Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, o vetor pode incluir um elemento regulatório tal como um promotor, um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e um terminador; o referido elemento regulatório, ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico e terminador sendo operacionalmente ligado.
[00143]Por um "promotor" é significado uma sequência de ácido nucleico suficiente para transcrição direta de uma sequência de ácido nucleico operacionalmente ligada.
[00144]Por "operacionalmente ligada" é significado que o(s) ácido(s) nucleico(s) e uma sequência regulatória, tal como um promotor, são ligados de tal forma a permitir expressão do referido ácido nucleico sob condições apropriadas, por exemplo, quando moléculas apropriadas tal como proteínas ativadoras transcricionais são ligadas à sequência regulatória. Preferivelmente um promotor operacionalmente ligado está a montante do ácido nucleico associado.
[00145]Por "a montante" é significado na direção 3'->5' junto com o ácido nucleico.
[00146]O promotor e terminador pode ser de qualquer tipo adequado e pode ser endógeno à célula alvo ou pode ser exógeno, provido que eles são funcionais na célula alvo.
[00147]O promotor usado nos construtos e métodos da presente invenção pode ser um promotor constitutivo, tecido específico ou induzível. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor vírus mosaico de couve flor constitutivo (CaMV35S) para expressão em muitos tecidos de plantas, um "promotor fotosintético" induzível (por exemplo, 1,5-bifosfato ribulose), capaz de mediar a expressão de um gene no tecido fotosintético em plantas sob condições leves, ou promotor tecido-específico tal como um promotor semente-específico, por exemplo, a partir de um gene selecionado a partir do grupo consistindo no gene Brassica napus napin, gene Zea mays zein 4, gene Orysa sativa PR602 e gene Triticum aestivum_glutelina.
[00148]Uma variedade de terminadores que pode ser empregada nos construtos genéticos da presente invenção é bem conhecida por aqueles versados na técnica. O terminador pode ser do mesmo gene como a sequência promotora ou um gene diferente. Terminadores particularmente adequados são sinais de poliadenilação, tal como o (CaMV)35S poliA e outros terminadores a partir de genes nopalina sintase (nos) e a octopina sintase (ocs).
[00149]O construto genético, em adição ao promotor, o gene e o terminador, pode incluir elementos adicionais necessários para expressão do ácido nucleico, em combinações diferentes, por exemplo, estrutura vetor, origem de replicação (ori), sítios de múltiplas clonagens, sequências espaçadoras, aumentadores, íntrons (tais como íntron Uniquitina Ubi de milho), genes de resistência antibiótica e outros genes marcadores selecionáveis [tal como o gene neomicina fosfotransferase (nptll), o gene hidromicina fosfotransferase (hph), o gene fosfinotricina acetiltransferase (bar ou pat)], e os genes repóster (tal como gene beta-glucuronidase (GUS) (gusA)]. O construto genético pode também conter um sítio de ligação ribossômico para início da tradução. O construto genético pode também incluir sequências apropriadas para amplificação da expressão.
[00150]Aqueles versados na técnica apreciarão que os vários componentes do construto genético são operacionalmente ligados, de forma que o resultado na expressão do referido ácido nucleico. Técnicas para operacionalmente ligar os componentes do construto genético da presente invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas incluem o uso dos ligadores, tais como ligadores sintéticos, por exemplo, incluindo um ou mais sítios de restrição de enzima.
[00151]Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção provê um elemento regulatório substancialmente purificado ou isolado capaz de causar a expressão de um gene exógeno em células de plantas. Preferivelmente o elemento regulatório é isolado a partir de um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando uma proteína de planta de autoincompatibilidade (SI) e fragmentos e variantes funcionalmente ativos dos mesmos. Preferivelmente, o elemento regulatório é isolado a partir de um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico codificando uma subunidade proteasoma, mais particularmente uma subunidade proteasoma 26S, um Caullin, um receptor de glutamato ou precursor do mesmo, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo com ambos domínios aminoácidos C2 e GRAM, mais preferivelmente um gene não polínico (NOP), um SIAH, ou uma protease ubiquitina específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina-específica 22.
[00152]O elemento regulatório pode ser uma molécula de ácido nucleico, incluindo DNA (tal como cDNA ou DNA genômico) e RNA (tal como mRNA) que é de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas e combinações das mesmas.
[00153]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um promotor. Em uma modalidade preferida, o elemento regulatório inclui um promotor do gene da subunidade proteasoma, mais preferivelmente um promotor do gene da subunidade proteasoma 26S. Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um promotor gene Cullin. Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um receptor glutamato ou promotor do precursor gênico. Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um promotor do gene da protease dedo de zinco. Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um promotor a partir de um polipeptídeo com ambos domínios aminoácidos C2 e GRAM, mais preferivelmente um promotor a partir do gene não polínico (NOP). Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um promotor do gene SIAH. Em outra modalidade preferida o elemento regulatório inclui um promotor do gene da protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente um promotor do gene protease 22 ubiquitina-específica.
[00154]Preferivelmente o elemento regulatório pode ser isolado a partir de ou corresponde a um elemento regulatório a partir de uma planta da família Poaeae. Em uma modalidade preferida o elemento regulatório pode ser isolado a partir de ou corresponde a um elemento regulatório a partir de espécies de grama, particularmente uma grama de pasto tal como azevém (Lolium) ou festuca (Festuca), mais particularmente azevém pereno (Lolium perenne L.) ou festuca dos prados (Festuca arundinaceum, de outra forma conhecido como Lolium arundinaceum).
[00155]Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor a partir de um gene da subunidade proteasoma 26S a partir de azevém pereno.
[00156]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 3; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor é localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 2335 da Figura 3.
[00157]Em outra modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor de um gene Caullin a partir de azevém pereno.
[00158]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 5; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor é localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 294 da Figura 5.
[00159]Em outra modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor a partir do receptor glutamato ou gene precursor do azevém pereno.
[00160]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 7; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor é localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 788 da Figura 7.
[00161]Em outra modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor do gene da protease dedo de zinco a partir de azevém pereno.
[00162]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 9; ou um fragmento ou variante funcionalmente ativo do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor é localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 625 da Figura 9.
[00163]Em outra modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor de um gene NOP a partir de azevém pereno.
[00164]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 11; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor está localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 7924 da Figura 11.
[00165]Em outra modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor a partir do gene SIAH a partir de azevém pereno.
[00166]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 13; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor é localizado a montante do códon de partida ATG mostrado na posição 124 da Figura 13.
[00167]Em outra modalidade particularmente preferido deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui um promotor a partir do gene da protease ubiquitina-específica a partir da azevém pereno.
[00168]Preferivelmente o elemento regulatório inclui um elemento promotor da sequência mostrada na Figura 15; ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo, incluindo regiões hipervariáveis. O versado na técnica entenderá que o elemento promotor está localizado no códon de partida ATG mostrado na posição 6784 da Figura 15.
[00169]Por "funcionalmente ativo" neste contexto é significado que o fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de causar expressão de um transgene em células de planta, particularmente dos tecidos reprodutivos. Tais variantes incluem variantes alélicos de ocorrência natural e variantes de ocorrência não natural. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais dos nucleotídeos são contemplados desde que as modificações não resultem em perda da atividade funcional do elemento regulatório. Preferivelmente o fragmento ou variante funcionalmente ativo tem pelo menos aproximadamente 80% de identidade para a parte relevante da sequência mencionada acima ao qual o fragmento ou variante corresponde, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de identidade, ainda preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 98% de identidade. Preferivelmente o fragmento tem um tamanho de pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 150 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos.
[00170] Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00171]Nucleotídeos 0 a 2334 da Figura 3,
[00172]Nucleotídeos 500 a 2334 da Figura 3, e
[00173]Nucleotídeos 1000 a 2334 da Figura 3;
[00174]ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo.
[00175]Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00176]Nucleotídeos 0 a 293 da Figura 5, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos mesmos.
[00177]Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00178]Nucleotídeos 0 a 787 da Figura 7, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos mesmos.
[00179]Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00180]Nucleotídeos 0 a 624 da Figura 9, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos mesmos.
[00181]Em uma modalidade particularmente preferida deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00182]Nucleotídeos 0 a 7923 da Figura 11,
[00183]Nucleotídeos 6968 a 7923 da Figura 11, e
[00184]Nucleotídeos 7468 a 7923 da Figura 11,
[00185]ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo.
[00186]Em uma modalidade particularmente preferido deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00187]Nucleotídeos 0 a 123 da Figura 13, e fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos mesmos.
[00188]Em uma modalidade particularmente preferido deste aspecto da invenção, o elemento regulatório inclui uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00189]Nucleotídeos 0 a 6783 da Figura 15,
[00190]Nucleotídeos 5087 a 6783 da Figura 15,
[00191]Nucleotídeos 5587 a 6783 da Figura 15, e
[00192]Nucleotídeos 6087 a 6783 da Figura 15;
[00193]ou um fragmento funcionalmente ativo ou variante do mesmo.
[00194]Por um "gene exógeno" é significado um gene não nativamente ligado ao elemento regulatório referido. Em certas modalidades da presente invenção o gene exógeno é também não nativamente ligado na planta relevante ou célula de planta.
[00195]O gene exógeno pode ser de qualquer tipo adequado. O gene exógeno pode ser um ácido nucleico tal como DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) ou RNA (por exemplo, mRNA), e combinações dos mesmos. O gene exógeno pode ser um gene capaz de manipular SI em uma planta, ou ser um fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) do mesmo que é capaz de manipular SI em uma planta. Tais variantes incluem sequências de ácido nucleico que são anti-senso ao referido gene alvo ou um análogo, derivado, mutante ou fragmento do mesmo. O transgene pode codificar para uma proteína ou sequência de RNA dependendo da condição alvo e se a regulação negativa ou positiva da expressão gênica é requerida.
[00196]O elemento regulatório de acordo com a presente invenção pode ser usado para expressar genes exógenos aos quais é operacionalmente ligado na produção de plantas transgênicas. Preferivelmente o elemento regulatório é usado para expressão gênica nos tecidos reprodutivos da planta.
[00197]Preferivelmente, os construtos genéticos da presente invenção são substancialmente purificados ou isolados, como descrito aqui anteriormente. Por "substancialmente purificado", no corrente contexto, é significado que o construto genético é livre dos genes, que, no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual o ácido nucleico ou promotor da invenção é derivado, flanqueia o ácido nucleico ou promotor. O termo do mesmo inclui, por exemplo, um construto genético que é incorporado em um vetor; em um plasmídeo ou vírus de replicação autônoma; ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto; ou que exista como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um genômico ou fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Também inclui um construto genético que é parte de um gene híbrido codificando sequência polipeptídica adicional. Preferivelmente o construto genético substancialmente purificado é pelo menos aproximadamente 90% puro, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 98% puro.
[00198]Como uma alternativa do uso de um gene marcador selecionável para prover uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas, a presença do construto genético nas células transformadas pode ser determinada por outras técnicas bem conhecidas na técnica, tal como PCR (reação em cadeia da polimerase), análise de hibridização de Southern blot, ensaios histoquímicos (por exemplo, ensaios GUS), cromatografia em camada fina (TLC), análise de hibridização northern e western blot.
[00199]Os construtos genéticos e vetores da presente invenção podem ser incorporados em uma variedade de plantas, preferivelmente monocotiledôneas, preferivelmente da família Poaceae, tais como gramas a partir dos gêneros Lolium, Festuca, Paspalum, Pennisetum, Panicum e outras forragens e relvas, milho, aveia, cana de açúcar, trigo e cevada.
[00200]Os construtos genéticos da presente invenção podem ser introduzidos em plantas por qualquer técnica adequada. Técnicas para incorporar os construtos genéticos da presente invenção em células de plantas (por exemplo, por transdução, transfecção, transformação ou alvo gênico) são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas incluem introdução mediada por Agrobacterium, introdução mediada por Rhizobium, eletroporação para tecidos, células e protoplastos, fusão de protoplato, injeção em órgãos reprodutivos, injeção em embriões imaturos e introdução de projétil em alta velocidade em células, tecidos, caules, embriões imaturos e maduros, transformação biolística, transformação Whiskers, e combinações dos mesmos. A escolha de técnica dependerá grandemente no tipo de planta ou fungo a ser transformado, e pode ser facilmente determinado por um versado na técnica. Para transformação dos protoplastos, transformação mediada por PEG é particularmente preferida.
[00201]Células incorporando os construtos genéticos da presente invenção podem ser selecionadas, como descrito abaixo, e então cultivadas em um meio apropriado para regenerar plantas transformadas, usando técnicas bem conhecidas na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, serão aparentes aos versados na técnica. As plantas resultantes podem ser reproduzidas, ou sexualmente ou assexuadamente, usando métodos bem conhecidos na técnica, para produzir gerações sucessivas de plantas transformadas.
[00202]Em um aspecto adicional da presente invenção é provido uma célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte da planta, incluindo, por exemplo, transformada com, um vetor ou construto, ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico da presente invenção. Preferivelmente a célula de planta é uma célula de planta transformada.
[00203]Por uma "célula de planta transformada" é significado uma célula de planta que tenha passado por transformação.
[00204]Por "transformação" é significado transferência de ácido nucleico em uma célula de planta.
[00205]Por um "transgene" é significado um ácido nucleico adequado para transformar uma célula de planta.
[00206]A célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte da planta pode ser a partir de qualquer espécie adequada. Em uma modalidade preferida a célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte de planta pode ser a partir de monocotiledônea, preferivelmente da família Poaceae, tais como gramas a partir dos gêneros Lolium, Festuca, Paspalum, Pennisetum, Panicum e outras forragens e relvas, milho, aveia, cana de açúcar, trigo e cevada.
[00207] A presente invenção também provê uma planta, semente de planta ou outra parte da planta, ou um extrato de planta derivado a partir da célula de planta ou planta da presente invenção e preferivelmente incluindo, por exemplo, transformada com, um vetor ou construto, ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico, ou elemento regulatório da presente invenção.
[00208]Os ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser usados para isolar cDNAs e genes codificando proteínas SI homólogas a partir da mesma ou outras espécies de planta, usando protocolos dependentes de sequência, tais métodos de hibridização do ácido nucleico, e métodos de amplificação de DNA e RNA como exemplificado por vários usos das tecnologias de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, reação em cadeia da polimerase, reação em cadeia da ligase).
[00209]Por exemplo, outros genes da subunidade proteasoma 26S, receptor de glutamato ou genes precursores, genes da protease dedo de zinco, genes NOP, genes SIAH, ou genes da protease ubiquitina-específica podem ser isolados diretamente pelo uso de todos ou uma porção dos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção como padrões de hibridização para selecionar bibliotecas a partir da planta desejada empregando a metodologia bem conhecida por aqueles versados na técnica. Padrões oligonucleotídeos específicos baseados nas sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser designados e sintetizados por métodos conhecidos na técnica. Além disso, as sequências inteiras podem ser usadas diretamente para sintetizar padrões de DNA por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica tais como marcação de DNA iniciador aleatório, corte de tradução, ou técnicas de marcação terminal (end-labelling), ou padrões de RNA usando sistemas de transcrição in vitro disponíveis. Em adição, iniciadores específicos podem ser desenhados e usados para amplificar uma parte de todas das sequências da presente invenção. Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou reações de amplificação marcados depois, e usados como padrões para isolar cDNA de comprimento inteiro ou fragmentos genômicos sob condições rigorosas apropriadas.
[00210]Em adição, segmentos curtos dos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser usados em protocolos para amplificar ácidos nucleicos mais longos ou fragmentos de ácidos nucleicos codificando genes homólogos a partir de DNA ou RNA. Por exemplo, reação em cadeia da polimerase pode ser feita em uma biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonado em que a sequência de um iniciador é derivado a partir das sequências de ácido nucleico da presente invenção, e a sequência de outro iniciador leva vantagem da presença do trecho ácido poliadenílico para a terminação 3' do precursor de mRNA codificando genes de plantas. Alternativamente, a segunda sequência iniciadora pode ser baseada em sequências derivadas a partir de um vetor de clonagem. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem seguir o protocolo RACE (Frohman e colaboradores. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8998, a inteira revelação do qual é incorporado aqui por referência) para gerar cDNAs pelo uso de PCR para amplificar cópias da região entre um ponto único na transcrição e a terminação 3' ou 5'. Usando sistemas 3' RACE e 5' RACE (BRL) comercialmente disponíveis, fragmentos 3' ou 5' específicos podem ser isolados (Ohara e colaboradores. (1989) Proc. Natl. Acad Sci USA 86:5673; Loh e colaboradores. (1989) Science 243:217, as inteiras revelações dos quais são aqui incorporadas por referência). Produtos gerados pelos procedimentos 3' e 5' RACE podem ser combinados para gerar cDNAs de comprimento inteiro.
[00211]Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um polipeptídeo SI substancialmente purificado ou isolado. Preferivelmente, o polipeptídeo SI é selecionado a partir do grupo consistindo em uma subunidade proteasoma, mais particularmente uma subunidade proteasoma 26S, uma Cullin, um receptor de glutamato ou precursor do mesmo, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo incluindo ambos, domínios aminoácidos C2 e GRAM, mais preferivelmente um polipeptídeo codificado pelo gene não polínico (NOP), um SIAH, e uma protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina- específica 22.
[00212]O polipeptídeo SI pode ser isolado a partir de ou corresponde a um polipeptídeo a partir de uma planta da família Poaceae. Em uma modalidade preferida o polipeptídeo SI pode ser isolado a partir de ou corresponder a um polipeptídeo a partir de uma espécie de grama, particularmente uma grama de pastagem tais como azevém (Lolium) ou festuca (Festuca), mais particularmente azevém pereno (Lolium perenne L.) ou festuca dos prados (Festuca arundinaceum, de outra forma conhecido como Lolium arundinaceum).
[00213]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo SI substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00214](a) sequências mostradas nas SEQ ID NOS:71 a 140 presentes;
[00215](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas nas SEQ ID NOS:1 a 70 presentes;
[00216](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00217](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) (b) e (c).
[00218]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê uma subunidade polipeptídica substancialmente purificada ou isolada do proteasoma, mais particularmente uma subunidade 26S proteasoma do polipeptídeo, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00219](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:128 da mesma;
[00220](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:58 e Figura 3 presentes,
[00221](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00222](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00223]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo Cullin substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00224](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:90 presente;
[00225](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:20 e Figura 5 presentes;
[00226](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b) e
[00227](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00228]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo do receptor de glutamato substancialmente purificado ou isolado ou precursor do mesmo, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em:
[00229](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:109 presente;
[00230](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:39 e Figura 7 presentes;
[00231](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00232](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00233]A presente invenção também provê uma planta, semente de planta ou outra parte da planta, ou um extrato de planta derivado de uma célula de planta ou planta da presente invenção e preferivelmente incluindo, por exemplo, transformada com, um vetor ou construto, ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico, ou elemento regulatório da presente invenção.
[00234]Os ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser usados para isolar cDNAs e genes codificando proteínas SI homólogas a partir das mesmas ou outras espécies de plantas, usando protocolos dependentes de sequência, tais como métodos de hibridização de ácido nucleico, e métodos de amplificação de DNA e RNA como exemplificado por vários usos de tecnologias de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, reação em cadeia da polimerase, reação e cadeia da ligase).
[00235]Por exemplo, outros genes da subunidade proteasoma 26S, genes Cullin, receptor glutamato ou genes precursores, genes da protease dedo de zinco, genes NOP, genes SIAH, ou genes da protease ubiquitina-específica podem ser isolados diretamente pelo uso de todas ou uma porção dos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção como padrões de hibridização para seleção de bibliotecas a partir da planta desejada empregando a metodologia bem conhecida por aqueles versados na técnica. Padrões de oligonucleotídeos específicos baseados nas sequências de ácido nucleico da presente invenção podem ser desenhados e sintetizados pelos métodos na técnica. Além disso, as sequências inteiras podem ser usadas diretamente para sintetizar padrões DNA pelos métodos conhecidos pelos versados na técnica tal como um marcador do iniciador de DNA aleatório, corte de tradução, ou técnicas de marcação terminal, ou padrões de RNA usando sistemas de transcrição in vitro disponíveis. Em adição, iniciadores específicos podem ser designados e usados para amplificar uma parte ou todas as sequências da presente invenção. Os produtos de amplificação resultante podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após reações de amplificação, e usados com padrões para isolar cDNA de comprimento inteiro ou fragmentos genômicos sob condições de rigidez apropriadas.
[00236]Em adição, segmentos curtos dos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser usados nos protocolos para amplificar ácidos nucleicos mais longos ou fragmentos de ácido nucleico codificando genes homólogos a partir de DNA ou RNA. Por exemplo, reação de cadeia da polimerase pode ser feita em uma biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonado em que a sequência de um iniciador é derivado a partir das sequências de ácido nucleico da presente invenção, e a sequência do outro iniciador leva vantagem da presença dos tratos de ácido poliadenílico para terminação 3' do mRNA precursor codificando genes de planta. Alternativamente, a segunda sequência iniciadora pode ser baseada em sequências derivadas do vetor de clonagem. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem seguir o protocolo RACE (Frohman e colaboradores. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:8998, a revelação inteira do qual é aqui incorporada por referência) para gerar cDNAs pelo uso de PCR para amplificar cópias da região entre um ponto único no transcrito e a terminação 3' ou 5'. Usando sistemas 3' RACE e 5' RACE comercialmente disponíveis (BRL), fragmentos 3' ou 5' cDNA específicos podem ser isolados (Ohara e colaboradores. (1989) Proc. Natl. Acad Sci USA 86:5673; Loh e colaboradores. (1989) Science 243:217, as revelações inteiras dos quais são aqui incorporados por referência). Produtos gerados pelos procedimentos 3' e 5' RACE podem ser combinados para gerar cDNAs de comprimento inteiro.
[00237]Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um polipeptídeo SI substancialmente purificado ou isolado. Preferivelmente, o polipeptídeo SI é selecionado a partir do grupo consistindo em uma subunidade proteasoma, mais particularmente uma subunidade proteasoma 26S, um Cullin, um receptor glutamato ou precursor do mesmo, uma protease dedo de zinco, um polipeptídeo incluindo ambos domínios aminoácidos C2 e GRAM, mais preferivelmente um polipeptídeo codificado por um gene não polínico (NOP), um SIAH, e uma protease ubiquitina-específica, mais preferivelmente uma protease ubiquitina-específica 22.
[00238]O polipeptídeo SI pode ser isolado a partir de ou corresponder a um polipeptídeo a partir de uma planta da família Poaceae. Em uma modalidade preferida o polipeptídeo SI pode ser isolado a partir de ou corresponde a um polipeptídeo a partir de espécies de grama, particularmente uma grama de pastagem tais como azevém (Lolium) ou festuca (Festuca), mais particularmente azevém pereno (Lolium perenne L.) ou festuca do prado (Festuca arundinaceum de outra forma conhecida como Lolium arundinaceum).
[00239]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo SI substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00240](a) sequências mostradas nas SEQ ID NOS:71 a 140 presentes;
[00241](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas nas SEQ ID NOS:1 a 70 presentes;
[00242](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00243](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00244]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo da subunidade proteasoma substancialmente purificado ou isolado, mais particularmente um polipeptídeo da subunidade proteasoma 26S mais particularmente, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00245](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:128 presente;
[00246](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:58 e Figura 3 presentes;
[00247](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00248](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) (b) e (c).
[00249]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo Cullin substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00250](a) sequência mostrada na SEQ ID NO: 90 presente;
[00251](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:20 e Figura 5 presentes;
[00252](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00253](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) (b) e (c).
[00254]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo do receptor de glutamato substancialmente purificado ou isolado ou precursor do mesmo, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00255](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:109 presente;
[00256](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO: 39 e Figura 7 presentes;
[00257](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00258](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00259]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo da protease dedo de zinco substancialmente purificada ou isolada, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00260](a) sequência mostrada na SEQ ID NO: 132 presente;
[00261](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO: 62 e Figura 9 presentes;
[00262](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00263](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00264]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo NOP substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00265](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:129 presente;
[00266](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:59 e Figura 11 presentes;
[00267](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00268](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00269]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo SIAH substancialmente purificado ou isolado, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00270](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:110 presente;
[00271](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:40 e Figura 13 presentes;
[00272](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00273](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00274]Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um polipeptídeo protease ubiquitina-específica substancialmente purificada ou isolada, o referido polipeptídeo incluindo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em:
[00275](a) sequência mostrada na SEQ ID NO:124 presente;
[00276](b) polipeptídeos codificados pelas sequências mostradas na SEQ ID NO:54 e Figura 15 presentes;
[00277](c) fragmentos funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a) e (b); e
[00278](d) variantes funcionalmente ativos das sequências recitadas em (a), (b) e (c).
[00279]A presente invenção compreende fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos polipeptídeos da presente invenção. Por "funcionalmente ativo" neste contexto é significado que o fragmento ou variante tem uma ou mais das propriedades biológicas da proteína correspondente a partir da qual o fragmento ou variante é derivado. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais aminoácidos são contemplados de forma que as modificações não resultam na perda da atividade funcional do fragmento ou variante. Preferivelmente o fragmento ou variante tem pelo menos aproximadamente 80% de identidade para a parte relevante da sequência mencionada acima para a qual o fragmento ou variante corresponde, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 98% de identidade. Tais variantes e fragmentos funcionalmente ativos incluem, por exemplo, aqueles tendo substituições de aminoácidos conservadas de um ou mais resíduos na sequência de aminoácido correspondente.
[00280]Por "substituições de aminoácidos conservadas" é significado a substituição de um aminoácido por outro da mesma classe, as classes sendo como segue:
[00281]Não polar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met Phe, Trp
[00282]Polar não carregado: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
[00283]Acídico: Asp, Glu
[00284]Básico: Lys, Arg, His
[00285]Outras substituições de aminoácidos conservadas podem também ser feitas como segue:
[00286]Aromático: Phe, Tyr, His
[00287]Doador de Próton: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp
[00288]Aceptor de Próton: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln
[00289]Preferivelmente o fragmento tem um tamanho de pelo menos cerca de 10 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 200 aminoácidos.
[00290]Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento ou variante pode incluir uma sequência mostrada nas Figuras 38 a 58 presentes.
[00291]Em uma modalidade adicional deste aspecto da invenção, é provido um polipeptídeo recombinantemente produzido a partir de um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Técnicas para recombinantemente produzir polipeptídeos são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00292]Disponibilidade das sequências nucleotídicas da presente invenção e sequências de aminoácidos deduzidas facilitam a seleção imunológica das bibliotecas da expressão de cDNA. Peptídeos sintéticos representando porções das sequências de aminoácidos imediatas podem ser sintetizados. Esses peptídeos podem ser usados para imunizar animais para produzir anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidade para peptídeos e/ou proteínas incluindo sequências de aminoácidos. Esses anticorpos podem ser então usados para selecionar bibliotecas de expressão de cDNA para isolar clones de cDNA de comprimento inteiro de interesse.
[00293]Em um aspecto ainda adicional da presente invenção é provido um método de isolar um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico da presente invenção, o referido método incluindo sequenciamento de fragmentos de ácido nucleico a partir de uma biblioteca de ácido nucleico.
[00294]A biblioteca de ácido nucleico pode ser qualquer tipo adequado e é preferivelmente uma biblioteca cDNA.
[00295]O ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico pode ser isolado a partir de um plasmídeo recombinante ou pode ser amplificado, por exemplo, usando reação em cadeia da polimerase.
[00296]O sequenciamento pode ser feito por técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00297]Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção envolve variação na identificação na sequência de um gene codificando um polipeptídeo que é ativo na via SI de uma planta distribuindo tais variantes como marcadores moleculares. Mais particularmente, o método inclui determinação da constituição genética específica de uma planta dentro da família Poaceae nos loci S e Z através da análise da variação genética nos loci S e Z usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Esta variação genética pode ser em regiões ao redor dos genes SI e pode ser usada em uma forma proxy. Exemplos da variação da sequência dentro dos genes e seus polipeptídeos codificados são mostrados nas Figuras 17 a 58.
[00298]Consequentemente, a presente invenção provê uso de um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico da presente invenção ou um SNP do mesmo como um marcador genético molecular.
[00299]Mais particularmente, ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleicos de acordo com a presente invenção e/ou informação da sequência nucleotídica da mesma pode ser usada como um marcador molecular genético para marcador do loci do trato quantitativo (QTL), mapeamento QTL, impressão digital de DNA em uma seleção assistida por marcador, particularmente em gramas tal como Lolium perenne. Ainda mais particularmente, ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser usados como marcadores genéticos moleculares no melhoramento da planta em relação ao controle ou manipulação SI. Ainda mais particularmente, informação da sequência revelando SNPs em variantes alélicos dos ácidos nucleicos ou fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser usadas como marcadores genéticos moleculares para marcação e mapeamento QTL e em seleção assistida por marcador, particularmente em gramas tal como Lolium perenne.
[00300]Como aqui utilizado, exceto onde o contexto requer de outra forma, o termo "compreende" e variações do termo, tais como "compreendendo", "compreende" e "compreendido", não são tencionados excluir aditivos, componentes, números inteiros ou passos adicionais.
[00301]Como aqui utilizado, exceto onde o contexto requer de outra forma, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem aspectos plurais.
Descrição Detalhada das Modalidades
[00302]A presente invenção irá agora ser mais completamente descrita com referência aos exemplos acompanhantes e figuras. Deve ser entendido, entretanto, que a seguinte descrição é somente ilustrativo e não deve ser tomado em qualquer forma como uma restrição na generalidade da invenção descrita acima.
Breve Descrição dos Desenhos/Figuras Nas figuras:
[00303]Figura 1. Ideograma genética comparativa da região S delimitado em Lolium perenne L. em comparação dos modelos de genomas de Oryza sativa e Brachypodium distachion. Genes identificados em comum entre Oryza sativa e Brachypodium distachion são indicados por linhas de junção. Fragmentos unidos dos clones BAC sequenciados de Lolium perenne L. são indicados junto com sua localização predita dentro do mapa do genoma comparativo e seu conteúdo gênico. Conteúdo gênico das sequências nucleotídicas Lolium perenne L. são documentadas como genes ortólogos baseados na numeração Oryza, com um prefixo Lp.
[00304]Figura 2. Ideograma genético comparativo da região Z delimitado em Lolium perenne L. em comparação aos modelos de genoma de Oryza sativa e Brachypodium distachion. Genes identificados em comum entre Oryza sativa e Brachypodium distachion são indicados por linhas de junção. Fragmentos unidos de clones BAC sequenciados a partir de Lolium perenne L. são indicados com sua localização predita dentro do mapa do genoma comparativo e seu conteúdo gênico. Conteúdo gênico das sequências nucleotídicas de Lolium perenne L. é documentado como genes ortólogos baseados na numeração Oryza, com um prefixo Lp.
[00305]Figura 3. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene da subunidade do proteasoma LpOs06g0607800 26S de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene Lp0s06g0607800 é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00306]Figura 4. Mapa do vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpOs06g0607800_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00307]Figura 5. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene Cullin LpOs05g0149600 de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene Cullin é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00308]Figura 6. Mapa do vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpOs05g0149600_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00309]Figura 7. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene do Receptor de Glutamato LpOs06g0680500 de Lolium perenne (LpGlu1). O códon inicial (ATG) do gene do receptor de glutamato é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00310]Figura 8. Mapa de vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpGlu1_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00311]Figura 9. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene da protease dedo de zinco LpOs04g0648500 de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene da protease dedo de zinco é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00312]Figura 10. Mapa de vetor de transformação contendo o cassete de expressão LpOs04g0648500_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00313]Figura 11. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene não polínico (LpNOP) LpOs06g0607900 de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene LpNOP é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00314]Figura 12. Mapa de vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpNOP_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00315]Figura 13. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene Homólogo “seven in absentia” (LpSIAH) de LpOs05g0152900 de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene LpSIAH é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00316]Figura 14. Mapa de vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpSIAH_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00317]Figura 15. Sequência de ácido nucleico do clone genômico que contém o gene LpTC116908 de Lolium perenne. O códon inicial (ATG) do gene LpTC116908 é mostrado em negrito itálico sublinhado.
[00318]Figura 16. Mapa de vetor de transformação contendo o cassete de expressão ZmUbi_LpTC116908_nos de Lolium perenne usado na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00319]FIGURAS 17-28. Variantes CDS locus S. Variação da sequência detectada é identificada dentro de [ ] com ambas as formas alélicas descritas.
[00320]Figuras 28-37. Variantes CDS locus Z. Variação da sequência detectada é identificada dentro de [ ] com ambas as formas alélicas descritas.
[00321]Figuras 38-49. Tradução de aminoácido predita mostrando variantes aminoácidos locus S.
[00322]Figuras 50-58. Tradução de aminoácido predita mostrando variantes aminoácidos do locus Z.
[00323]Figuras 59-79. Sequências de ácido nucleico dos cassetes de expressão ZmUbi_SI gene_nos usadas na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L.
[00324]Legenda: sítio de Entrada attB1 (negrito sublinhado); promotor Zea mays Ubi (itálico) + íntron (sublinhado itálico); região codificando Lolium perenne nas orientações antisenso e senso (sublinhado); íntron rga2 (negrito); terminador Nopaline synthase (nos) (negrito itálicos): sítio Entrada attB2 (negrito sublinhado)
[00325]Figura 80. Descrição pictorial da transformação do tubo; A, preparação do material doador azevém; B, iniciação do calo embrionário somático; C, proliferação do calo; D, tratamento osmótico; E. distribuição biolística do transgene incluindo expressão cassete; F, crescimento do calo no meio de cultura tecidual incluindo seleção de agente apropriado; G, regeneração da planta transgênica putativa a partir do calo; H, estabelecimento da planta transgênica putativa.
[00326]Figura 81. Avaliação PCR do estado transgênico para cultivar indivíduo a partir de eventos transgênicos regenerados. Cada evento de transformação foi avaliado através do cultivo individual separado a partir da planta regenerada. Somente exemplos onde os três cultivos deram confirmação positiva da presença do transgene, fez o evento ser aceito para avaliação adicional. Os suportes com números 1 e 2 na figura identifica 1, um evento transgênico que pode ser descartado como todos cultivos são negativos para a presença do transgene e 2, um evento transgênico onde todos os três cultivos têm gerado um resultado positivo para a presença do transgene.
[00327]Figura 82 A e B. Coloração FDA de grãos de pólen viáveis, por exemplo, plantas transgênicas com construtos de SiRNA para a regulação negativa de um gene candidato S e Z, respectivamente. Ambos, grãos de pólen viáveis e não viáveis podem ser vistos em ambos, A e B.
[00328]Figura 83. Estágios de dissecção da flor de azevém. A - Flores intactadas de azevém. Sob alcance da maturidade reprodutiva os anteros são liberados partir da flor. As papilas estigmáticas então estenderão e se tornarão visíveis. B - espiguetas individuais foram cortadas a partir da ponta floral para dissecção adicional. C - Ambos, tecidos reprodutivos masculinos e femininos foram cortados a partir de espiguetas. D e E - o tecido feminino foi ainda cortado para examinar o crescimento do tubo polínico em estigmas polinados.
[00329]Figura 84. Reação incompatível do crescimento do tubo polínico. A e B, exemplos dos grãos de pólen únicos germinando nas papilas estigmáticas e sob crescimento de contato é arrastado. Os tubos polínicos sob contato sempre se tornaram aumentados na forma através da pressão citoplasmática, indicado pelas setas. C, uma reação incompatível da auto-polinização a partir de uma planta transgênica contendo o construto SiRNA para LpOs05g0149600.
[00330]Figura 85 Crescimento do tubo polínico compatível com plantas não transformadas. Pólen foi tomado a partir das plantas azevém não relacionadas e colocado em flor não transformada. O tubo polínico fez contato com a papila estigmática e então continuou para crescer em uma forma direcionada para o ovário. O tubo de pólen sob crescimento depositará plugs calosos em intervalos regulares (indicados pelas setas) para reter pressão citoplasmática, permitindo as células espermáticas migrarem com sucesso para o ovário. Essas regiões vagas se tornarão vacuoladas.
[00331]Figura 86. Reação polínica compatível. O tubo de pólen fez contato com a papila estigmática e então continuou a crescer em uma forma direcionada para o ovário. O tubo polínico compatível depositará plugs calosos em intervalos regulares (indicados por setas). A reação foi observada na auto-polinização de uma planta transgênica contendo o construto siRNA para o LpOs06g0680500.
[00332]Figura 87. Imagens microscópicas da interação pólen-estigma de duas plantas diferentes contendo o construto siRNA para o gene LpOs05g0152900. Os dois eventos transgênicos diferentes (A e B) mostram uma variação de fenótipos a partir do incompatível para parcialmente compatível.
[00333]Figuras 88-108. Perfis de expressão dos genes SI de Lolium perenne. Perfis de expressão foram determinados através da análise BLAST das leituras sequenciais a partir de múltiplos tecidos do genótipo Impact04 de Lolium perenne L., comparado às sequências gênicas CDS de Brachypodium distachion usadas como padrões ortólogos.
[00334]Figura 109. Diagrama esquemático da reprodução de grama híbrida F1. Plantas foram inicialmente genotipadas usando marcadores em ou ao redor do loci S e Z. As misturas parentais são então geradas e multiplicadas, com teste do grau de heterose entre as misturas uma vez que semente suficiente tenha sido gerada.
Exemplos Exemplo 1. Isolamento dos genes SI
[00335]Ambos os locus S e Z foram delimitados através de genômicos comparativos e clone BAC e sequenciamento genômico. Todos os genes dentro dos dados de sequência foram identificados (Tabelas 1 e 2). Sequências foram determinadas através do programa de predição FGENESH. Perfis de expressão foram determinados para cada gene como descrito no Exemplo 6. Perfis de expressão foram determinados através da análise BLAST das sequências lidas para múltiplos tecidos do genótipo Impact04 de Lolium perenne L. comparado às sequências gênicas CDS de Brachypodium distrachion usadas como padrões ortólogos (Ver figuras 88-108). Tabela 1. Genes identificados dentro do locus S
Figure img0001
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Tabela 2. Genes identificados dentro do locus Z
Figure img0004
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Exemplo 2. Dados de resequenciamento identificados na variância nucleotídica do DNA
[00336]Um coorte de 21 genes foi selecionado como candidatos chaves dos loci S e Z. Os genes foram selecionados baseados no perfil de expressão bem como anotação de sequência.
[00337]A coleção de todos os 21 genes teve iniciadores PCR desenhados para sequenciar novamente as regiões codificantes dos genes. Os amplicons PCR desenhados foram otimizados para gerar fragmentos genômicos maiores. Um total de 50 genótipos de plantas foi usado como um padrão de DNA o re-sequenciamento. As 50 plantas foram escolhidas como uma disseminação diversa das plantas com uma ampla variedade potencial da diversidade para maximizar a variação alélica no loci gênico senso re-sequenciado.
[00338]Os amplicons foram gerados, então agrupados para cada genótipo e fisicamente cortados para fragmentos menores. Códigos de barra para DNA e adaptadores de sequenciamento foram ligados aos fragmentos cortados para identificar cada amostra e então todas as amostras foram combinadas e sequenciadas usando uma próxima geração da plataforma Illumina MiSeq com 300 bp x 2 leituras.
[00339]Os dados de sequência resultante foram atribuídos novamente às amostras individuais usando o código de barra e foi então avaliado para qualidade e leituras de baixa qualidade removidas. As sequências lidas foram então alinhadas em referência aos genes amplificados e bases variantes identificadas. As amostras individuais foram então combinadas para dar um conjunto de dados para identificar todas as bases variantes a partir de 50 amostras, com potencialmente 100 alelos diferentes.
[00340]As bases variantes foram gravadas para cada gene para identificar se a variação foi sinônima ou não sinônima na natureza. Um requerimento minimalístico para cada dos genes sob investigação pode ser para ter 5 ou mais aminoácidos variantes identificados dentro do transcrito. Um total de 5 aminoácidos variantes pode permitir um máximo de 32 haplótipos potenciais a partir do conjunto de dados permitindo completar recombinação máxima do pareamento aleatório.
[00341]Com 100 haplótipos foram re-sequenciados, altos níveis de diversidade são esperados, entretanto pode haver um grau de sobreposição entre os haplótipos a partir das plantas escolhidas de forma que o número total dos haplótipos únicos pode ser inferior que o número sequenciado.
[00342]Azevém pereno tem sido caracterizado como tendo um grau alto de variação de sequência dentro de seu genome, com estimativa variando de 1 SNP a cada 20-30 bases dentro de uma base gênica nos 2-4 haplótipos do re- sequenciamento. Com duas exceções, todos os genes re-sequenciados continham variação suficiente nas regiões codificantes dos genes que podem gerar uma diversidade suficiente de polipeptídeos que podem distribuir a variabilidade alélica requerida (Ver Figuras 17 a 58). Variação da sequência detectada é identificada dentro de [ ] com ambas formas alélicas descritas.
[00343]Os genes LpOs05g0151300 e LpOs05g0152400 não têm diversidade suficiente, com somente 3 w 2 aminoácidos variantes, respectivamente.
Exemplo 3 - Isolamento dos genes SI: Clonagem dos genes do Proteasoma dos azevéns LpOs06g0607800 26S
[00344]A fim de desenvolver novos marcadores gênicos para mapeamento genético e físico de fina escala dos loci SI de azevém pereno, ligados aos marcadores RFLP derivados de cDNA heterólogo foram selecionados a partir do locus S e Z na base da co-segregação ortolocus no cereal centeio e/ou alpista azul. Desenvolvimento de marcador molecular, mapeamento genético e dissecção da região são descritos em Shinozuka e colaboradores (2010). Como um resultado da sintenia da sequência comparativa de fina-escala do conjunto de dados unido com o modelo das espécies Poaceae, especificamente Oryza sativa e Brachypodium distachyon, foi alcançado para as regiões S e Z delimitadas. Usando o complemento gênico definido a partir do modelo das espécies Poaceae, uma biblioteca BAC foi lida com pares iniciadores específicos aos genes descritos e 39 clones específicos foram identificados. A identificação dos clones BAC selecionados foi verificada através do sequenciamento direto dos amplicons locus-específico. Os clones BAC específicos foram então sequenciados usando a tecnologia Sanger e/ou GSFLX e os dados resultantes foram sequenciados de forma unida usando o pacote do programa Newbler. Seguindo, sequenciamento e união das sequências de nucleotídeo tipo gene foram identificados usando BLAST e ferramentas do programa de predição gênica. Baseado na informação derivada a reiteração do procedimento foi feita para seleção dos clones adicionais para ainda aumentar a resolução e dados de sequência para unir mapas físicos para as regiões do locus SI (Figuras 1 e 2).
[00345]Marcadores moleculares foram re-sequenciados dos loci gênicos específicos, identificados a partir do sequenciamento BAC e geneticamente mapeados em uma população de segregada de Lolium perenne L. para confirmar a localização da sequência gerada.
[00346]O genoma de um único genótipo Lolium perenne L. (a planta - Impact04) tem sido sequenciado para aproximadamente 70 X de cobertura, gerando c. 2 bilhões de leituras de sequenciamento das leituras da sequência de emparelhamento-terminal de 100 bp na plataforma Illumina GA2X e HiSeq2000. Os dados da sequência foram filtrados para leituras de alta qualidade antes de ser unidos usando o pacote do programa SOAPdenovo v. 1.05. A união da sequência tem sido empiricamente otimizada através da avaliação iterativa do desempenho baseado em uma variação das entradas de tamanhos kmer, nos termos de números de bases unidas, e a média de comprimento dos contigs unidos e suportes. Uma união ótima gerou 1,9 milhões de suportes cobrindo c. 1.7 Gb, enquanto todos os contigs e singletons cobrem c. 3.5 Gb.
[00347]Comparação de contigs e suportes para as sequências codificantes do modelo de espécies de gramas Brachypodium distachyon L. permitiu identificação dos ortólogos de azevém perene putativo para c. 86% de todos os genes preditos e transcritos alternados a partir do modelo das espécies de grama. A abordagem de tubos foi implementada baseada em um método de análise BLAST altamente paralelo a fim do transcrito do grupo e sequências genômicas relevantes a cada sequência gênica Brachypodium em uniões baseadas em CAP3 local individuais. Esta abordagem gerou 23.285 arquivos gênicos que foram indexados para o gene Brachypodium. Desenvolvimento da biblioteca de sequência exoma permitiu identificação de uma grande coleta de contigs gênicos, junto com os elementos regulatórios correspondentes. A coleção de contigs foi então selecionada para a presença dos genes preditos dentro dos loci S e Z que não têm sido identificados através dos processos de seleção BAC.
[00348]Um gene Lolium perenne L. novo foi identificado a partir da sequência relacionada ao clone BAC que revelou similaridade de sequência com o gene de arroz Os06g0607800, então o gene azevém foi designado LpOs06g0607800 (SEQ ID NO:58 e Figura 3). O gene azevém foi anotado como um gene da subunidade proteasoma 26S através da análise BLASTx (em um valor = 3e-65 comparado a sequência de aminoácido de arroz). O gene também continha um domínio AAA ATPase (SEQ ID NO:128).
[00349]Em adição ao gene da subunidade 26S do proteasoma do azevém identificado na região do locus Z através do sequenciamento BAC, foi comparado através da análise BLAST à sequência genômica Impact04 através da análise BLAST. A identificação da sequência a partir de clones BAC bem como a sequência genômica permitiu a identificação das bases da sequência variante a partir da região codificante do gene (Figuras 33 e 54).
[00350]Proteólise intracelular é principalmente regulado e permitido através da via ubiquitina-proteasoma ou via autofagia-lisosoma/vacúolo. Eventos proteolíticos desempenha papéis significantes no SI através da rejeição do auto-pólen. Proteólise mediada por ubiquitina é envolvida no mecanismo SI de Brassicaceae e o Solanaceae.
[00351]O 26S proteasoma consiste no elemento do número 20S do proteasoma (CP) e a partícula regulatória 19S (RP). Proteólise ocorre no compartimento 20S, enquanto o elemento 19S confere dependência de ATP e a especificidade do substrato ao CP. O RP consiste em dois elementos: um anel de seis subunidades AAA-ATPase (sempre abreviado como RPT) que é esperado funcionar em desdobramento alvo e transporte, e três subunidades não-ATPase (sempre abreviado como RPN). Como o gene da subunidade 26S Proteasoma LpOs06g0607800 contém o domínio AAA-ATPase, é da classe RPT.
[00352]Linhagens mutantes Arabidopsis thaliana L., em que a subunidade RTP2 do gene 26S do proteasoma é rompida, têm demonstrado que transmissão de gametas masculino e feminino requer uma cópia normal do gene RPT2 para evitar o aborto e falência na gametogênese. No tabaco (Nicotiana tabacum L.) o gene NtRpn3 foi encontrado fisicamente interagir com uma proteína quinase dependente de cálcio e se tornou fosforilada em uma forma dependente de cálcio.
[00353]Enquanto as Requerentes não desejam ser restritos pela teoria, o gene LpOs06g0607800 de 26S do proteasoma é então proposto ser um determinante feminino do locus Z.
Exemplo 4 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura de grampo invertida do gene LpOs06g0607800 do 26S Proteasoma
[00354]O cassete de expressão LpOs06g0607800 consiste no promotor, região Não traduzida 5' e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) a partir de Zea mays (Toki e colaboradores,1992) seguindo por 500 bp da sequência codificante do gene LpOs06g0607800 a partir de L. perenne em um repetição invertida interrompida pelo íntron 2 no gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subsp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete do grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00355]A seleção do cassete (distribuído ou em cis ou trans) compreende o promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Actin (Act1) de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph a partir de E. coli (Kaster e colaboradores, 1983) códon-otimizado para expressão em monocotiledôneas, que codificam uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminado transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosáico de couve flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00356]A seleção do cassete foi sintetizada por um fornecedor de síntese gênica comercial (GeneArt, Life Technologies) e clonado em um vetor que permite a Entrada. O cassete de expressão LpOs06g0607800 foi sintetizado por um fornecedor de síntese gênica comercial (GeneArt, Life Technologies) com sítios de flanqueamento attB. Para distribuição no cis do cassete de expressão LpOs06g0607800 foi sub-clonado em pDONR221 II (Invitrogen, Life Technologies) em uma reação BP Clonase. O clone ENTRY resultante foi usado em uma reação LR Clonase II (Invitrogen Life Technologies) com o vetor que permite Entrada codificando o cassete de expressão hph. Colônias de todos os plasmídeos unidos foram inicialmente selecionadas por digestão da restrição do minoprep DNA. Endonucleases de restrição foram obtidas de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e Promega (Promega Corporation, WI). Preparações de plamídeos foram feitas usando o Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden) ou o Pure Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation, WI) seguindo as instruções dos fornecedores. DNA plasmidial dos clones selecionados foi sequenciado usando Sequenciamento ABI Sanger e protocolo de sequenciamento do ciclo v3.1 Terminador Big Dye (Applied Biosystems, Life Technologies). Sequência de dados foram unidos e analisados usando o programa SEQUENCHER® (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).
[00357]Um ideograma do cassete de expressão gênico é mostrado na Figura 4. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 75.
Exemplo 5 - Transformação biolística de azevém repene (Lolium perenne) para expressão de produtos dsRNA do gene 26S Proteasoma LpOs06g0607800 para regulação negativa mediada por RNAi do SI
[00358]Co-transformação biolística do azevém pereno com os vetores contendo a sequência gênica do 26S Proteasoma LpOs06g0607800, dirigindo a expressão do cassete de RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência de higromicina foi conduzida em calos enbriogênicos para azevém pereno.
[00359]O vetor utilizado junto com o protocolo de transformação tem previamente sido usado com sucesso em experimentos de transformação de planta (Bilang, e colaboradores, 1991; Spangenberg, e colaboradores, 1995a; Spangenberg, e colaboradores, 1995b; Ye, e colaboradores, 1997; Bai, e colaboradores., 2001). O método de transformação biolística do azevém pereno é delineado na Figura 80.
[00360]Avaliação fenotípica das plantas transgênicas resultantes foi feita por crescimento de plantas para maturidade, então seguindo o período de vernalização de a 5o C com 12 horas de iluminação pode dez semanas, as plantas foram sujeitas a 22o C com 24 horas de iluminação. A mudança na temperatura e compreendendo do comprimento do dia iniciou a floração nas plantas, que então ocorreu 2-3 semanas mais tarde. Antes das flores de azevém abrirem o pico de floração foi checado para alterações ou deformidades morfológicas e fora, então contidas dentro de um saco de papel para isolar as flores de outros doadores potenciais de pólen. O pico de floração pode ser mantido em seu estado isolado até floração ser completada, em cujo tempo o conjunto de semente pode ser avaliado. Múltiplos picos podem ser ensacados por planta e cada espigueta avaliada visualmente para produção de semente.
[00361]Uma vez uma planta transgênica putativa regenerou no meio seletivo, a planta foi dividida em três cultivares de plantas únicas. Cada cultivar foi individualmente selecionado para a presença do transgene através de PCR convencional. Iniciadores oligonucleotídeos têm sido destinados para a região promotora que originou o gene Ubiquitina (Ubi) a partir de Zea mays bem como um segundo ensaio que tinha como alvo a sequência íntron RGA2 de Triticum turgidum subesp, que interrompe o azevém invertido repetido do gene alvo. Essas regiões foram escolhidas para minimizar amplificação cruzada a partir do genoma de azevém endógeno. Os ensaios foram desenvolvidos e inicialmente testados no DNA genômico de azevém não transformado para confirmar que a amplificação cruzada não ocorre. Eventos transgênicos foram somente selecionados quando todos os três cultivares retornaram um resultado positivo para a presença do transgene com ambos os ensaios. Se resultados variáveis foram vistos, os cultivares únicos que foram positivos foram retornados para o meio de crescimento e cresceram adicionalmente, até eles poderem ser divididos novamente em três cultivares e novamente selecionados.
[00362]Figura 81 mostra a avaliação do estado transgênico para cultivares individuais a partir dos eventos transgênicos regenerados. Cada evento de transformação foi avaliado através de três cultivares individuais a partir da planta regenerada. Somente exemplos onde todos os três cultivares deram confirmação positiva da presença do transgene, o evento foi aceito para avaliação adicional. Os suportes com números 1 e 2 na figura identificam 1, um evento transgênico 1 que pode ser descartado como todos os cultivares são negativos para a presença de um transgene e 2, um evento transgênico onde todos os três cultivares têm gerado um resultado positivo para a presença do transgene.
[00363]Uma média de 12 eventos transgênicos diferentes por construto foi gerada, com uma variação de 3-19. As plantas foram transferidas para o solo e foram mantidas em uma estufa de contenção apropriada. Tabela 3. Números de eventos transgênicos gerados para sete genes candidatos passando por avaliação funcional
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[00364]Avaliação fenotípica foi feita sob a planta alcançando a maturidade reprodutiva. Inicialmente grãos de pólen foram avaliados para viabilidade para garantir uma resposta possa ser vista. Um efeito comum nas células de plantas passando por uma transformação e processo de cultura tecidual é fertilidade reduzida da planta inteira resultante. A viabilidade foi confirmada através de coloração com diacetato de fluoresceína (FDA). FDA é um composto lipofílico e é membrana-permeável e não fluorescente. Grãos de pólen viáveis terão atividade esterase intracelular e serão capazes de fazer hidrólise enzimática da FDA sob sua entrada na célula. Uma vez FDA foi hidrolisado dentro do grão de pólen viável será um composto altamente fluorescente que é capaz de difundir fora d célula e será retida, produzindo uma intensa fluorescência verde dentro do citoplasma.
[00365]Figura 82 mostra coloração FDA de grãos de pólen viáveis, por exemplo, plantas transgênicos com construtos SiRNA para a regulação negativa de um candidato gene S e Z, respectivamente. Ambos, grãos de pólens viáveis e não viáveis podem ser vistos em ambos A e B.
[00366]Uma vez a viabilidade do pólen foi confirmada, interações pólen-pistilo foram avaliadas. Dissecção dos tecidos florais das plantas azevém em floração foi feita para microscopicamente avaliar interações pólen-pistilo.
[00367]Figura 83 mostra estágios de dissecção da flor de azevém. A - flores intactas de azevém. Alcançado a maturidade reprodutiva os anteros são liberados das flores. As papilas estigmáticas irão então se estender e se tornar visíveis. B - espiguetas individuais foram cortadas a partir de um pico floral para dissecção adicional. C - Ambos, tecidos reprodutivos masculinos e femininos foram cortados a partir de espiguetas. D e E - o tecido feminino foi ainda cortado para examinar o crescimento do tubo polínico nos estigmas polinizados.
[00368]Cada evento transgênico foi representado pelas três plantas como descritos nos processos de seleção por PCR. Múltiplos eventos transgênicos são requeridos como a inserção do construto SiRNA transgene é provável resultar em uma variação dos níveis de expressão. Esta diferença na expressão entre os eventos transgênicos é provavelmente para levar a uma variação de fenótipos para a reação. A reação pólen-pistilo compatível/incompatível pode ser visualizada através da absorção do tubo de pólen sob contato com o tecido estigmático, ou tubo polínico direcionou o crescimento para o ovário. Múltiplas flores por planta são requeridas para avaliar a confiança pelo fenótipo observado. Uma vez tecidos estigmáticos polinizados foram isolados, coloração com anilina azul foi feita e o tecido visualizado sob um microscópio fluorescente invertido. Uma variação das reações foi observada. Incidências de autoincompatibilidade foi visto para muitas plantas, enquanto exemplos da compatibilidade particular foi também visto.
[00369]Figura 84 mostra uma reação incompatível do crescimento do tubo polínico. A e B, exemplos de grãos de pólen únicos germinando nas papilas estigmáticas e sob crescimento de contato são retidos. Os tubos polínicos sob contato sempre se tornarão aumentados no formato através da pressão citoplasmática, indicado pelas setas. C, uma reação incompatível da auto-polinização a partir da planta transgênica contendo o construto SiRNA para LpOs05g0149600.
[00370]Figura 85 mostra um crescimento do tubo polínico compatível com plantas não transformadas. Pólen foi tomado a partir das plantas azevém não relacionadas e colocadas em uma flor não transformada. O tubo polínico fez contato com as papilas estigmáticas e então continua o crescimento em uma forma direcionada para o ovário. O tudo polínico em crescimento depositará plugs calosos em intervalos regulares (indicados pelas setas) para reter pressão citoplasmática, permitindo as células de esperma migrarem com sucesso para o ovário. Essas regiões desocupadas se tornarão vacuoladas.
[00371]Figura 86 mostra uma reação de pólen compatível. O tubo polínico tem feito contato com a papila estigmática e então continuou o crescimento em uma forma direcionada para o ovário. O tubo polínico compatível depositará plugs calosos em intervalos regulares (indicados por setas). A reação foi observada na auto-polinização de uma planta transgênica contendo o construto siRNA para o LpOs06g0680500.
[00372]Figura 87 mostra imagens microscópicas da interação pólen-estigma de duas plantas diferentes contendo o construto siRNA para o gene LpOs05g0152900. Os dois eventos transgênicos diferentes (A e B) mostram uma variação de fenótipos a partir de incompatível para parcialmente compatível.
Exemplo 6 - Análise da expressão do gene 26S Proteasoma LpOs06g0607800
[00373]Um genótipo único do azevém pereno foi sujeito a análise de transcriptoma através de sequenciamento profundo das amostras de cDNA derivados a partir dos tipos de tecidos distintos múltiplos. Um total de 19 amostras de RNA diferentes foi gerado a partir de tecidos vegetativos, incluindo amostras folhas, pseudocaule e raiz para ambos os aspectos terrestres e subterrâneos da expressão gênica (Tabela 4). Em adição, uma coleção de bibliotecas reprodutivas foi gerada a partir de anteras, pistilos, estigmas e pistilos polinizados. As bibliotecas foram preparadas para sequenciamento baseado em ilumina usando o método de preparação RNASeq. Cada biblioteca teve um código de barras interno para permitir a discriminação seguindo o processo de sequenciamento.
[00374]Um total de c. 0,6 bilhões de leituras de sequenciamento foi gerado a partir da plataforma Illumina HiSeq2000. Aproximadamente 30 milhões de leituras de sequência foram gerados a partir de cada amostra tecidual. As sequências geradas foram então filtradas, e qualidade diminuída para garantir < 3 bases por sequência lida foram chamados como "N" e média e qualidade Phred local foi > 30 em todos os exemplos.
[00375]As leituras de qualidade filtrada foram então analisadas por BLASTn contra as sequências codificantes do genoma de Brachypodium distachion. O número de emparelhamentos BLASTn por gene foram contados por tipo de tecido e tabulado. Como o número de leituras gerado por amostra variou, a contagem de leitura mapeada em BLASTn foi normalizada no 75o percentil para gerar valores normalizados para análise comparativa. O genoma de Brachypodium distachion foi usado como um genoma inteiro referência nesta análise para atenuar problemas de ausência gênica ou uniões incompletas de qualquer catálogo gênico gerado de novo. Tabela 4. Análise da expressão gênica através do sequenciamento de RNA a partir de tecidos diferentes de Lolium perenne L.
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[00376]A sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpOs06g0607800, quando comparada contra a porção codificante da sequência genômica de Brachypodium distachion, identifica Bradi1g36400 como a sequência gênica de pareamento mais próximo. O perfil de expressão que tem sido gerado a partir dessa análise identifica um amento dramático na expressão gênica ao longo de tempo nos tecidos do pistilo sob auto-polinização (Figura 104). Um nível constante da expressão gênica é detectado através da planta inteira, entretanto alguma interferência na análise a partir de outros membros da família gênica é possível. Alternativamente, a expressão gênica do gene pode ter uma função alternativa através de todos os tecidos, ou pode demonstrar expressão gênica não-tecido específica como um resultado dos elementos promotores particulares.
Exemplo 7 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene Cullin LpOs05g0149600 de azevém
[00377]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, um novo gene Lolium perenne L. foi identificado a partir da sequência relacionada com clone BAC que revelou similaridade de sequência com o gene Os05g0149600 de arroz, então o gene do azevém foi designado LpOs05g0149600 (SEQ ID NO: 20 e Figura 5). O gene do azevém foi anotado como um gene Cullin através da análise BLASTx (SEQ ID NO:90).
[00378]Em adição o gene Cullin do azevém identificado na região do locus S através do sequenciamento BAC, foi comparado através da análise BLAST para a sequência Impact04 genômica através da análise BLAST. A identificação da sequência a partir dos clones BAC bem como a sequência genômica permitiu a identificação das bases da sequência variante a partir da região codificante do gene (Figura 21).
[00379]Cullins são suportes moleculares responsáveis por unir as E3 ubiquitina-ligases baseadas em RING. Dentro das famílias Solanaceae, Rosaceae e Plantaginaceae o mecanismo SI envolve a formação de um complexo consistindo em um gene Cullin, u gene F-box junto com um supressor da proteína cinetócoro. Os processos complexos da atividade ubiquitina E3 ligase que liga as cadeias poliubiquitina às proteínas alvos, tal que proteínas ubiquitinadas são degradadas pelo 26S proteasoma. O gene Cullin dentro do complexo desempenha um papel na união das outras subunidades, e ligações a um composto adicional que recruta proteínas ubiquitinas a ligarem às proteínas alvos.
Exemplo 8 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura de grampo invertido do gene LpOs05g0149600
[00380]O cassete de expressão LpOs05g0149600 consiste em promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) a partir de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 500 pb da sequência codificante do gene LpOs05g0149600 a partir de L. perenne em uma repetição invertida interrompida por íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete de grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00381]A seleção do cassete (distribuída ou em cis ou trans) compreendeu promotor, região 5' não traduzida e íntrom a partir do gene Actin (Act1) a partir de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph a partir do códon-otimizado de E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monocotiledôneas, que codifica uma proteína que confere resistência para o antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosáico da couve-flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00382]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuída e sequenciada como descrito no Exemplo 4.
[00383]Um ideograma do cassete de expressão gênico é mostrado na Figura 6. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 63.
Exemplo 9 - Transformação biolística do azevém pereno (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene Cullin LpOs05g0149600 para regulação negativa mediada por RNAi do SI
[00384]Co-transformação biolística do azevém pereno com vetores contendo a sequência gênica LpOs05g0149600, dirigindo a expressão do cassete RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência a higromicina foi conduzida no caule embriogênico para azevém pereno, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 10 - Análise da expressão do gene Cullin LpOs05g0149600
[00385]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificado como o gene LpOs05g0149600, quando comparado contra a porção codificante da sequência genômica Brachypodium distachion, identifica Bradi2g35830 como a sequência gênica de emparelhamento mais próxima. O perfil de expressão que tem sido gerado a partir esta análise identifica o nível constitutivo da expressão gênica em todos os tecidos (Figura 92). Entretanto, níveis significativamente elevados da expressão gênica são vistos em pistilo e pistilo polinizado em 5 minutos bem como, flor inteira e estigma a 0 e 5 minutos. O padrão de expressão visto pode ser descrito como aumento no estigma a partir de 0 a 5 minutos junto com um aumento correspondente no pistilo a 5 minutos que então diminui ao nível constitutivo em um ponto de tempo de 1 hora.
Exemplo 11 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene do receptor glutamato LpOs06g0680500 de azevém
[00386]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, um novo gene Lolium perenne L. foi identificado a partir da sequência relacionada ao clone BAC que revela similaridade de sequência com o gene Os06g0680500 de arroz, então, o gene do azevém foi designado LpOs06g0680500 (Figura 7 e SEQ ID NO:39). O gene do azevém foi anotado como um gene do receptor glutamato através de análise BLASTx (e valor = 0 comparado à sequência de aminoácido de arroz) e foi identificado como contendo o domínio GABA requisito (SEQ ID NO:109).
[00387]Genes do receptor glutamato têm sido identificados em Arabidopsis thaliana e tabaco como formando canais de influxo nos tipos celulares da ponta que passam padrões direcionados do crescimento tal como aqueles dos tubos de pólen, bem como pelos radiculares. Estudos nas células da raiz de Arabidopsis mostram que glutamato induz uma despolarização acentuada do potencial de membrana, e um aumento concomitante no cálcio intracelular. Crescimento dos tubos polínicos do tabaco em presença de um antagonista do receptor de glutamato tem sido mostrado ser reprimido, como é também o caso para captação específica direcionada de cálcio. Experimentos com gene noucates dos genes do receptor de glutamato expressando pólen em Arabidopsis têm documentado redução nas taxas de crescimento bem como morfologia anormal da ponta e tubo.
[00388]Enquanto as Requerentes não desejam estar restritos por teoria, gene do receptor de glutamato LpOs06g0680500 LpGlu1 é então proposto ser o determinante masculino do locus S.
Exemplo 12 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura grampo invertido do gene LpOs06g0680500 LpGlu1
[00389]A sequência de ácido nucleico identificado como gene LpOs06g0680500 tem um fragmento 484pb selecionado como um elemento designado para cassete de expressão. O promotor do gene ubiquitina Zea mays (Christensen e colaboradores. 1992) foi usado para dirigir a expressão e o terminador do gene nopalina sintase (nos) (Bevan, 1984; Rogers e colaboradores. 1985) foi selecionado para deter a transcrição.
[00390]O cassete de expressão LpGlu1 consiste no promotor, região 5' não traduzida e íntrom a partir do gene Ubiquitina (Ubi) a partir de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 484 pb da sequência codificante do gene LpGlu1 a partir de L. perenne em uma repetição invertida interrompida pelo íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete de grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00391]A seleção do cassete (distribuição ou em cis ou trans) compreendeu o promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Actin (Act1) a partir de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph a partir de códon-otimizado em E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monicotiledôneas, que codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00392]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuído e sequenciado como descrito no Exemplo 4.
[00393]Um ideograma do cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 8. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 68.
Exemplo 13 - Transformação biolística do azevém perene (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene do receptor de glutamato LpOs06g0680500 para regulação negativa mediada por RNAi do SI
[00394]Ci-transformação biolística do azevém perene com os vetores contendo a sequência do gene LpOs06g0680500 LpGlu1, dirigindo a expressão do cassete RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência a higromicina foi conduzida nos caules embriogênicos para azevém perene, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 14 - Análise da expressão do gene do receptor glutamato LpOs06g0680500
[00395]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpOs06g0680500, quando comparado contra a porção codificante da sequência genômica de Brachypodium distachion, identifica Bradi1g32800 como a sequência gênica de emparelhamento mais próximo. O perfil de expressão que tem sido gerado a partir desta análise identifica altos níveis da expressão gênica nos tecidos vegetativos e alguma expressão gênica nos anteros (Figura 97). Os genes glutamato representam uma família gênica dentro do genoma Brachypodium distachion que serão envolvidos em muitas funções através dos diferentes tecidos de plantas e consequentemente mapeamento das sequências relacionadas ou funções alternativas para genes glutamato é provável e podem explicar a expressão constitutiva. Não obstante, um aumento significante na expressão é detectado em anteros e não no pistilo feminino ou tecidos estigma.
Exemplo 15 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene LpOs04g0648500 do azevém
[00396]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, um novo gene Lolium perenne L. foi identificado a partir da sequência relacionada ao clone BAC que revelou similaridade de sequência como gene Os04g0648500 do arroz, então o gene azevém foi designado LpOs04g0648500 (Ver, Figura 9 e SEQ ID NO:62). O gene azevém perene foi identificado como fisicamente ligado ao gene relacionado a TC116908. O marcador genético derivado de TC116908 co-segregado com o locus Z é centeio (Secale cereale L.) (Hackauf e Wehling 2005). No clone BAC do azevém perene incluindo o ortólogo TC116908, LpOs04g0648500 e outros 2 genes foram identificados (Shinozuka e colaboradores. 2010).
[00397]O gene LpOs04g0648500 foi anotado como um gene protease 22 ubiquitina-específico através de uma análise BLASTx (SEQ ID NO:132). O gene continha uns domínios a Znf-UBP e BRAP2. O domínio Znf-UBP exibe a atividade da protease ubiquitina-específica e funções como proteína estabilizadora através da de- ubiquitinilação alvo-específico. O domínio BRAP2 humano foi originalmente identificado como interagindo com os produtos do gene BRCA1 (câncer de mama 1). A procura da homologia de sequência indicou que este domínio é também conservado no Arabidopsis At2g26000 [proteína contendo domínio dedo de zinco (ubiquitina- hidrolase)] e At2g42160 [proteína da família dedo de zinco (RING finger tipo C3HC4)], sugerindo que este gene é envolvido no sistema ubiquitina-proteasoma.
[00398]Nos sistemas SI baseado em S-RNase e tipo Brassicaceae, envolvimento do sistema ubiquitina-proteasoma tem sido sugerido. O complexo proteasoma 26S é ligado com um UBP, e a partícula regulatória 19S do complexo proteasoma 26S é ativada por UBP. Nos clones BAC ligados ao locus Z, genes relacionados ao proteasoma 26S (LpTC116908 e LpOs06g0607800) foram identificados, dos quais produtos podem interagir com o produto gênico LpOs04g0648500.
[00399]Enquanto as Requerentes não desejam estar restritos por teoria, o gene protease 22 ubiquitina-específico LpOs04g0648500 é então proposto ser um dos determinantes SI no locus Z.
Exemplo 16 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura de grampo invertida do gene LpOs04g0648500
[00400]A sequência de ácido nucleico identificado como gene LpOs04g0648500 tem um fragmento 578 pb selecionado como um elemento designado para cassete de expressão. O promotor do gene ubiquitina Zea mays (Christensen e colaboradores. 1992) foi utilizado para dirigir expressão e terminador do gene nopalina sintase (nos) foi selecionado para reter a transcrição.
[00401]O cassete de expressão LpOs04g0648500 consiste no promotor, região 5' não traduzido e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 578 pb da sequência codificante do gene LpOs04g0648500 a partir de L. perene em uma repetição invertida interrompida por íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00402]A seleção de cassete (distribuído ou em cis ou trans) compreendida do promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Actin (Act1) de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph do códon-otimizado de E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monocotiledôneas, que codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00403]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuída e sequenciada como descrito no Exemplo 4.
[00404]Um ideograma do cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 10. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 77.
Exemplo 17 - Transformação biolística do azevém perene (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene LpOs04g0648500 para regulação negativa de SI mediada por RNAi
[00405]Co-transformação biolística do azevém perene com os vetores contendo a sequência gênica LpOs04g0648500, dirigindo a expressão do cassete RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência a higromicina foi conduzida no caule embriogênico para azevém perene, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 18 - Análise de expressão do gene LpOs04g0648500
[00406]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpOs04g0648500, quando comparado contra a porção codificante da sequência genômica Brachypodium distachion, identifica Bradi5g23970 como a sequência gênica de emparelhamento mais próximo. O perfil de expressão que tem sido gerado a partir desta análise identifica um baixo nível de expressão constitutiva em todos os tecidos, com um aumento em todas as amostras reprodutivas. O nível mais alto da expressão gênica foi detectado nas amostras de pistilo (ver, Figura 106).
Exemplo 19 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene azevém LpOs06g0607900
[00407]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, um novo gene Lolium perenne foi identificado a partir da sequência relacionada ao clone BAC que a similaridade da sequência revelada com o gene Os06g0607900 de arroz, e o gene de azevém foi então designado LpOs06g0607900 (ver, Figura 11 e SEQ ID NO:59). O gene continha ambos, domínios aminoácidos C2 e GRAM (SEQ ID NO:129). O domínio é compreendido de 2 domínios altamente conservados que são separados por uma região básica. O domínio C2 é um módulo com alvo na membrana dependente de cálcio que é encontrado nas proteínas envolvidas na transdução de sinal ou tráfego de membrana. O domínio é sempre envolvido na ligação do fosfolipídeo dependente de cálcio e nos processos de alvos de membrana. O domínio GRAM é uma glicosiltransferase, ativadores GTPase tipo Rab e domínio miotubularina. O domínio é associado com processos acoplados de membrana e transdução de sinal. O domínio GRAM foi primeiro computacionalmente identificado em 2000 (Doerks e colaboradores) e análise funcional do domínio tem desde que elucidado papéis na associação de proteína com uma membrana alvo.
[00408]O arroz homólogo do novo gene identificado a partir da caracterização da sequência BAC tem sido parcialmente descrito na sua função e tem sido designado o gene "não polínico" (Osnop). O gene Osnop do arroz foi identificado e caracterizado através de uma estratégia de inserção de transposon Ds. O gene deletado revelou anteros anormais e nenhuma produção de pólen. Através de fusões de promotores com o gene repórter GUS, o gene endógeno foi caracterizado como mostrando a expressão gênica tardia na formação do pólen e na germinação dos tubos polínicos (Jiang e colaboradores. 2005).
[00409]Enquanto as Requerentes não desejam estar restritos por teoria, o gene LpOs06g0607900 não polínico (LpNOP) é então proposto ser o determinante masculino do locus Z.
Exemplo 20 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura grampo invertida do gene LpOs06g0607900 LpNOP1
[00410]O cassete de expressão LpOs06g0607900 consiste no promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) a partir de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 400 pb da sequência codificante do gene LpOs06g0607900 a partir de L. perenne em uma repetição invertida interrompida por íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00411]A seleção de cassete (distribuição ou cis ou trans) compreendida do promotor, região 5' não traduzido e íntron a partir do gene Actin (Act1) a partir de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph de códon-otimizado do E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monocotiledôneas, que codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00412]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuída e sequenciada como descrito no Exemplo 4.
[00413]Um ideograma do cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 12. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 76.
Exemplo 21 - Transformação biolística do azevém perene (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene LpOs06g0607900 para regulação negativa mediada por RNAi do SI
[00414]Co-transformação biolística do azevém perene com os vetores contendo a sequência gênica LpOs06g0607900, dirigindo a expressão do cassete RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência a higromicina foi conduzida no caule embriogênico para azevém perene, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 22 - Análise da expressão do gene LpOs06g0607900
[00415]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpOs06g0607900, quando comparado contra a porção codificante da sequência do genoma de Brachypodium distachion identifica Bradi1g36390 como a sequência genética de emparelhamento mais próximo. O perfil de expressão que tem sido gerado a partir desta análise identifica altos níveis de expressão gênica quase que exclusivamente em anteros. Expressão limitada tem sido detectada nas flores e estigma polinizado em 0 minutos, que podem resultar a partir de anteros na flor ou germinação inicial do grão de pólen (ver Figura 105).
Exemplo 23 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene homólogo de um “seven in absentia” LpOs05g0152900 de azevém
[00416]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, a partir do sequenciamento do exoma do genótipo Impact04, um gene Lolium perenne L. foi identificado que a similaridade de sequência revelada com o gene Os05g0152900 de arroz (Figura 13 e SEQ ID NO: 40). Devido a similaridade de sequência com genes homólogos “seven in absentia” (SIAH), o gene identificado foi designado LpSIAH (SEQ ID NO: 110).
[00417]Proteínas SIAH consistem em um domínio RING finger no N-terminal e um domínio Sina no C-terminal, e ter uma atividade ubiquitina-E3 ligase quando um homodímero é formado (Den Herder e colaboradores. 2008). Supressão da função da proteína SIAH em espécies de plantas resulta nos sistemas de raiz aumentados, folhas ampliadas e número de disparos aumentados, sugerindo que a proteína SIAH é envolvida em uma ampla variação dos processos de desenvolvimento de planta.
[00418]Substratos das proteínas SIAH são degradados em uma via relacionada a ubiquitina seguindo interação. Proteínas do receptor de glutamato são substratos das proteínas SIAH. O domínio RING finger da proteína SIAH e o domínio de interação SIAH das proteínas do receptor de glutamato são essenciais para interação. Interação do SIAH e proteínas de receptor de glutamato exerce efeitos na modulação corrente de cálcio. Um gene tipo receptor de glutamato, LpGlu1, foi identificado como sendo localizado fisicamente perto de LpSIAH.
Exemplo 24 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura grampo invertida do gene LpOs05g0152900 LpSIAH
[00419]O cassete de expressão LpSIAH consiste no promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 400 pb da sequência codificante do gene LpSIAH a partir de L. perenne em uma repetição invertida pelo íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00420]A seleção do cassete (ditribuído ou em cis ou trans) compreendida do promotor, região 5' não traduzido e íntron a partir do gene Actin (Act1) a partir de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph a partir do códon-otimizado de E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monocotiledôneas, que codifica uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) (Chenault and Melcher 1993).
[00421]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuída e sequenciada como descrito no Exemplo 4.
[00422]Um ideograma do cassete de expressão gênico é mostrado na Figura 14. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 69.
Exemplo 25 - Transformação biolística do azevém perene (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene LpOs05g0152900 LpSIAH para regulação negativa do SI mediada por RNAi
[00423]Co-transformação biolística do azevém perene com os vetores contendo a sequência gênica LpOs05g0152900 LpSIAH, dirigindo a expressão do cassete RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência à higromicina foi conduzida nos caules embriogênicos para azevém perene, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 26 - Análise de expressão do gene LpOs05g0152900 LpSIAH
[00424]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpOs05g0152900, quando comparado contra a porção codificante da sequência genômica Brachypodium distachion, identifica Bradi2g35550 como a sequência gênica de emparelhamento mais próximo. O perfil de expressão que foi gerado a partir desta análise identifica a expressão gênica predominantemente em anteros e o estigma polinizado em 0 minutos. Baixa ou insignificante expressão em todos os outros tecidos foi observada (ver Figura 98).
Exemplo 27 - Isolamento dos genes SI: Clonagem do gene LpTC116908 de azevém
[00425]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 3, um novo gene de Lolium perenne L. foi identificado a partir da sequência relacionada ao clone BAC que revelaram similaridade de sequência com o gene Os04g0647300 de arroz e o gene TC116908 de cevada, então o gene azevém foi designado LpTC116908. No centeio (Secale cereale L.), um marcador genético derivado de TC116908 co-segregado com o locus Z de centeio. Próximo do marcador derivado de TC116908, 4 marcadores genéticos foram localizados (Hackauf e Wehling 2005). Os marcadores genéticos correspondentes foram atribuídos para parte inferior de LG2 do azevém perene (Shinozuka e colaboradores. 2010). Clones BAC contendo sequências relacionadas ao marcador genético foram sequenciados para identificar genes Lolium perenne L. codificados no locus Z (Ver, Figura 15 e SEQ ID NO:54).
[00426]O gene LpTC116908 foi anotado como um gene da protease 22 ubiquitina-específica através de uma análise BLASTx (SEQ ID NO:124). O gene continha um Znf-UBP (processamento de protease ubiquitina-específica dedo de zinco) e domínios peptidase C19. O domínio Znf-UBP exibe a atividade de protease ubiquitina-específica e funções como estabilizador de proteína através de de- ubiquinilação alvo-específico. O domínio peptidase C19 divide similaridade de sequência ao domínio tipo Znf-UBP e possui atividade peptidase ubiquitina-específica. O gene LpTC116908 foi expresso nos órgãos de reprodução de azevém perene (Shinozuka e colaboradores. 2010).
[00427]Nos sistemas SI baseado em S-RNase e tipo Brassicaceae, envolvimento do sistema ubiquitina-proteasoma tem sido sugerido. O complexo 26S proteasoma está ligado com uma UBP, e a partícula 19S regulatória do complexo 26S proteasoma é ativa por UBP. Nos clones BAC ligados ao locus, genes relacionados 26S proteasoma (LpOs06g0607800 e LpOs04g0648800) foram identificados, dos quais produtos podem interagir com o produto gênico LpTC116908.
[00428]Enquanto as Requerentes não desejam ser restritos por teoria, o gene da protease 22 ubiquitina-específica LpTC116908 é então proposto ser um dos determinantes SI do locus Z.
Exemplo 28 - Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura grampo invertida do gene LpTC116908 LpOs04g0647300
[00429]O cassete de expressão LpTC116908 consiste no promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e colaboradores 1992) seguido por 492 pb da sequência codificante do gene LpTC116908 a partir de L. perenne em uma repetição invertida interrompida por íntron 2 do gene RGA2 a partir de Triticum turgidum subesp. durum (Douchkov e colaboradores 2005). O cassete grampo foi terminado com a região 3' não traduzida (UTR) compreendendo o terminador transcricional e sítio de poliadenilação do gene nopalina sintase (nos) a partir de A. tumefaciens pTi15955 (Fraley e colaboradores 1983).
[00430]A seleção do cassete (distribuído ou em cis ou trans) compreendeu promotor, região 5' não traduzida e íntron a partir do gene Actin (Act1) de Oryza sativa (McElroy e colaboradores 1990) seguido por uma versão sintética do gene hph a partir do códon-otimizado de E. coli (Kaster e colaboradores 1983) para expressão em monocotiledôneas, que codificam uma proteína que confere resistência ao antibiótico higromicina. Este cassete foi terminado com o 3' UTR compreendendo o terminador transcricional e sítios de poliadenilação a partir do gene 35s do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) (Chenault e colaboradores 1993).
[00431]A seleção do cassete foi sintetizada, distribuída e sequenciada como descrito no Exemplo 4.
[00432]Um ideograma do cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 16. A sequência inteira do cassete de expressão é mostrada na Figura 73.
Exemplo 29 - Transformação biolística do azevém perene (Lolium perenne) para expressão dos produtos dsRNA do gene LpTC116908 para regulação negativa do SI mediada por RNAi
[00433]Co-transformação biolística do azevém perene com os vetores contendo a sequência gênica LpTC116908, dirigindo a expressão do cassete de RNAi e a versão sintética do gene hph a partir de E. coli para resistência a higromicina foi conduzido no caule embriogênico para azevém perene, como descrito no Exemplo 5.
Exemplo 30 - Análise de expressão do gene LpTC116908
[00434]Usando os métodos ressaltados no Exemplo 6, a sequência de ácido nucleico identificada como o gene LpTC116908, quando comparado contra a porção codificante da sequência do genoma Brachypodium distachion, identifica Bradi5g23920 como a sequência gênica de emparelhamento mais próximo. O perfil de expressão que gerado a partir desta análise identifica um baixo nível de expressão constitutiva em todos os tecidos, com um aumento significante em ambas as amostras de estigma polinizado. Pequenos aumentos na expressão gênica são também identificados em amostras de pistilo bem como pseudocaules (Figura 102).
Exemplo 31. Geração dos vetores de transformação contendo uma estrutura grampo invertida
[00435]Construtos SiRNA foram preparados para todos os 21 genes candidatos, usando os métodos ressaltados no Exemplo 4. A partir dos dados de re- sequenciamento a região de 300-500 pb mais conservada do gene foi escolhida para o desenho. Locus S LpOs05g0148600 LpOs01g0369700 LpOs05g0149100 LpOs05g0149500 LpOs05g0149600 LpOs05g0150400 LpOs05g0150500 LpOs05g0151300 LpOs05g0152400 LpOs06g0680500 LpOs05g0152900 LpOs05g0153200 Locus Z LpOs04g0645500 LpOs04g0645600 LpOs04g0647300 LpOs03g0193400 LpOs06g0607800 LpOs06g0607900 LpOs04g0648500 LpOs04g0648600 LpOs04g0648900
[00436]Figuras 59 a 79 mostram sequência de ácido nucleico da expressão de cassetes usados na transformação mediada por biolística de Lolium perenne L. Legenda: sítio de Entrada attB1 (negrito sublinhado); promotor Zea mays Ubi (itálicos) + íntron (sublinhado itálico); região codificante Lolium perenne nas orientações antisenso e senso (sublinhado); íntron rga2 (negrito); terminador Nopaline synthase (nos) (negrito itálicos); sítio de Entrada attB2 (negrito sublinhado)
Exemplo 30: Aplicação dos dados genômicos a partir do intervalo S e Z na reprodução de grama híbrida F1
[00437]Heterose ou força híbrida é o fenômeno onde o desempenho de um híbrido F1 é maior que aquele dos parentais. Cultivares de azevém hoje são comumente reproduzidos a partir de um número limitado de parentais elite (4-12), policruzados juntos e então policruzados para aumentar os números de sementes adequados para comercialização. Não existem atividades ou esquemas comerciais para capturar heterose na reprodução de azevém correntemente.
[00438]A identificação dos marcadores genéticos no desequilíbrio da ligação com os loci S e Z permitem predição haplotípica. A habilidade do genótipo dos indivíduos para haplótipos S e Z abrem um novo caminho para produção de azevém híbrida F1 eficiente por seletivamente estrangular e combinar haplótipos. A produção de azevém híbrido F1 por estrangulamento seletivo dos alelos SI usando marcadores genéticos ligados revela o maior potencial para aplicação de custo efetivo para reprodução do azevém comercial no futuro próximo. A aplicação dos marcadores genéticos SI para estrangulamento SI permite aos criadores trabalhar com qualquer germoplasma a sua disposição com sem requerimentos antecedentes. O haplótipo definindo marcadores SI permitirá aos criadores estrangular seletivamente haplótipos SI (sem o próprio) dentro de grupos definidos para reduzir a compatibilidade do dentro do grupo e então trazer dois grupos juntos para cruzamento aleatório, onde os haplótipos SI garantem que a compatibilidade entre o grupo é maior que dentro, resultando na produção aumentada da progênie F1.
[00439]Por exemplo, nos estágios iniciais de um acompanhamento da reprodução das plantas fenotipicamente elite pode ser genotipado com os marcadores moleculares ligados ao SI e uma predição haplotípica foi feita. Pares de indivíduos (denominados grupos parentais) pode então ser identificados onde um indivíduo é heterozigoto em ambos S e Z e o outro indivíduo é homozigoto em um locus, ou S ou Z, e heterozigoto no outro locus (para os mesmos haplótipos presentes no indivíduo heterozigoto), por exemplo: Ind x s1s2-z1z2 Ind y s1s2-z1z1
[00440]Dois grupos parentais onde os haplótipos S e Z entre os grupos são completamente diferentes são identificados e levados para o próximo passo. Os dois grupos selecionados são referidos como grupo A e B nos seguintes estágios.
[00441]Seguindo a partir do grupo parental inicial o desenvolvimento de sementes é multiplicado. Durante este estágio de volume de semente, grupo A e B são mantidos em isolamento para garantir que nenhum haplótipo SI estrano seja introduzido através do fluxo do pólen ou semente externa.
[00442]Um ciclo de acoplamento aleatório dentro de cada grupo trará as frequências do haplótipo S e Z ao equilíbrio, com 50% de indivíduos heterozigotos em ambos os loci S e Z, 25% de homozigotos em S e Z para um dos haplótipos, e os remanescentes 25% de indivíduos homozigotos no mesmo locus mas para o haplótipo oposto, por exemplo: 25% inds - si si -z1 z2 50% inds - s1s2-ziz2 25% inds - s2s2-ziz2
[00443]Pareamento aleatório não selecionado continuado dentro de dois grupos manterá as frequências homozigotas e heterozigotas enquanto o número de sementes aumenta. Em cada ciclo de pareamento, o locus heterozigoto alternará, por exemplo:
Figure img0009
[00444]Pólen dentro dos grupos nunca será compatível com outros indivíduos heterozigotos em ambos os loci S e Z. Consequentemente esses indivíduos (que fazer até 50% das plantas) somente serão doadores de pólen, não produzindo qualquer semente, resultando em uma taxa de produção de semente de 50% dentro dos grupos.
[00445]Uma vez que semente suficiente tenha sido gerada dentro dos grupos, números iguais de semente podem ser combinados e semeados para produção de semente F1. Como pólen de dentro dos grupos não é compatível com os respectivos indivíduos heterozigotos S e Z, somente pólen de entre os dois grupos fertilizará esses indivíduos, resultando naquelas plantas produzindo 100% de semente híbrida F1. Os indivíduos remanescentes, que são compatíveis com pólen, ambos de dentro e entre os grupos produzirão ambos, semente híbrida F1 e entro do grupo. Entretanto, como existe um número maior de combinações haplotípicas compatíveis a partir de entre- grupos, então de dentro-grupos, uma proporção maior da semente será os híbridos F1.
[00446]A partir da simulação de todas as combinações haplotípicas entre e dentro dos grupos, e a proporção das combinações compatíveis, a percentagem teórica da semente híbrida F1 produzida seguindo o esquema descrito é >83%. Com indivíduos híbridos prováveis de serem mais vigorosos e competitivos que a semente dentro do grupo, a proporção de híbridos, >83% é provável aumentar na fazenda, quando do crescimento sob uma situação de pasto competitivo. No desenho da reprodução proposta, grupo A e B alcançarão frequência de equilíbrio haplótipo após um ciclo de cruzamento, significando que cultivadores podem dar o volume de sementes dentro dos grupos por tantas gerações como considerado necessário, desde que os grupos sejam mantidos em isolamento a partir do pólen externo. Isto também permite cultivadores a fazer pequenos testes cruzados entre os grupos com cada volume de semente até garantir que a heterose ainda permanece na progênie. No ponto durante o desenho de reprodução tem um requerimento para polinização controlada.
[00447]Este desenho de reprodução pode ser aplicado a qualquer espécie de grama endogâmica pertencendo a Poaceae que tenha loci S e Z regulando a autoincompatibilidade sem limitação. Mais preferivelmente as espécies de grama podem ser do clade Bambusoideae, Ehrhartoideae (antigamente Oryzoideae) ou Pooideae. Mais preferivelmente as espécies de grama podem ser da tribo Poeae. Mais preferivelmente as espécies de grama podem ser do gênero Lolium, Festuca, Poa, Dactylis, Bromus, Secale, Pennisetum e Panicum. Mais preferivelmente as espécies de grama podem ser do gênero Lolium e Festuca. Mais preferivelmente as espécies podem ser do gênero Lolium. Mais preferivelmente as espécies Lolium pode ser Lolium perenne (azevém perene), Lolium multiflorum (azevé italiano), Lolium boucheanum (azevém híbrido) Lolium arundinaceum (festuca dos prados) e Lolium pratense (festuca dos prados).
[00448]Figura 109 mostra um diagrama esquemático da reprodução da grama híbrida F1. Plantas são inicialmente genotipadas usando marcadores em ou ao redor dos loci S e Z. Dois grupos parentais são então gerados e multiplicados, com teste do grau de heterose entre os grupos uma vez que semente suficiente tenha sido gerada.
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Claims (8)

1. Uso de primeiro e segundo ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos SI como marcadores genéticos moleculares, CARACTERIZADO pelo fato de que é para estabelecer uma primeira cepa de planta com um primeiro haplótipo locus Z e um primeiro haplótipo locus S; e uma segunda cepa de planta com um segundo haplótipo locus Z e um segundo haplótipo locus S; e em que a primeira cepa de planta é heterozigota em ambos os locus S e Z e a dita segunda cepa de planta é homozigota em um dos locus S e Z e heterozigota no outro dos locus S e Z; em que a primeira e segunda cepas de plantas são plantas da família Poaceae; em que o dito primeiro ácido nucleico é isolado de, ou corresponde a, um gene do locus Z de uma planta e o dito segundo ácido nucleico é isolado de, ou corresponde a, um gene do locus S de uma planta; e em que o primeiro e segundo ácidos nucleicos incluem uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências definidas nas SEQ ID NOs: 20, 39, 40, 54, 58, 59 e 62.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o haplótipo locus Z é do dito primeiro ácido nucleico que codifica uma subunidade 26S do proteassoma, um polipeptídeo não polínico (NOP), ou uma protease ubiquitina- específica e o dito haplótipo locus S é do dito segundo ácido nucleico que codifica um Cullin, um receptor ou precursor de glutamato do mesmo, ou um homólogo “seven in absentia” (SIAH).
3. Kit para controlar hibridização ou autoincompatibilidade (SI) em plantas, o dito kit CARACTERIZADO pelo fato de que inclui: um primeiro ácido nucleico que codifica um polipeptídeo SI, em que o dito primeiro ácido nucleico é isolado de, ou corresponde a, um gene do locus Z de uma planta da família Poaceae; e um segundo ácido nucleico que codifica um polipeptídeo SI, em que o dito segundo ácido nucleico é isolado de, ou corresponde a, um gene do locus S de uma planta da família Poaceae; em que o dito primeiro e segundo ácidos nucleicos incluem uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas sequências definidas nas SEQ ID NOs: 20, 39, 40, 54, 58, 59 e 62.
4. Kit, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito primeiro ácido nucleico codifica uma subunidade 26S do proteassoma, um polipeptídeo não polínico (NOP), ou uma protease ubiquitina-específica e o dito segundo ácido nucleico codifica um Cullin, um receptor ou precursor de glutamato do mesmo, ou um homólogo “seven in absentia” (SIAH).
5. Kit, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos primeiro e segundo ácidos nucleicos são incluídos em um construto ou vetor.
6. Construto genético CARACTERIZADO pelo fato de que inclui um ácido nucleico que codifica uma proteína SI da planta operacionalmente ligado a um promotor ou terminador heterólogo, em que o dito ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste nas sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 20, 39, 40, 54, 58, 59 e 62.
7. Construto genético, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito construto é um vetor.
8. Método para manipular autoincompatibilidade em uma planta, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que inclui introduzir na dita planta um ácido nucleico selecionado dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20, 39, 40, 54, 58, 59 e 62, ou um construto genético, como definido na reivindicação 6 ou 7.
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