CN113980108B

CN113980108B - 不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因及其应用

Info

Publication number: CN113980108B
Application number: CN202111516711.0A
Authority: CN
Inventors: 高长斌; 汪爱华; 李兵; 张雪丽; 宋莉萍
Original assignee: Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN113980108A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及不结球白菜自交亲和性相关的等位基因及其应用。本发明通过表型筛选，鉴定到一个表现为自交亲和的不结球白菜材料，进一步采用遗传分析、基因克隆、表达分析和序列比对分析等技术手段成功分离得到一个新的不结球白菜自交不亲和位点等位基因，该基因可导致不结球白菜表现为彻底的自交亲和。本发明所提供的等位基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示。本发明还进一步提供了所述等位基因的分子标记，以及所述等位基因、分子标记的应用。本发明获得的自交亲和性状相关等位基因将极大提高育种效率，降低制种成本。

Description

不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因及其应用。

背景技术

植物的自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是指雌蕊柱头能够识别自身的花粉，使自身的花粉粒不能萌发或花粉管不能伸长生长，导致不能正常授粉或授粉不能正常结籽的现象。自交不亲和性在防止植物自交衰退，促进异交，维持其遗传多样性方面具有重要的作用，广泛分布于十字花科蔬菜作物(白菜、甘蓝、萝卜、西兰花等)中。在遗传上自交不亲和性受S位点复等位基因控制(也叫做S单倍型)。在芸苔属物种中，S单倍型种类繁多，前人根据S位点基因的序列相似性将S单倍型分成了两类，I类和II类S单倍型。S位点主要包括两个关键的识别基因：SRK，控制着柱头的识别特异性；SP11/SCR，控制着花粉的识别特异性。S位点的两个关键识别基因完全连锁，他们之间几乎不发生重组交换。当含有相同单倍型的花粉落到自身的柱头上时，花粉SP11/SCR蛋白与柱头SRK蛋白进行识别，引起SRK蛋白的自体磷酸化以及之后的一系列信号传导途径，最终表现为柱头对自花花粉的抑制作用以及异化花粉的识别作用。在十字花科芸薹属物种中，大量的自交不亲和S单倍型已经被鉴定，白菜中大约鉴定到100个，甘蓝中鉴定到50个。由于自交不亲和性的影响，不结球白菜的自交结实率很低，严重影响育种材料的繁殖和种子生产。在育种工作中，为了选育自交系，技术人员不得不通过人工剥蕾进行自交留种，耗费大量的人力。在种子生产过程中，由于自交不亲和性的影响，常常导致不育系的繁殖效率很低。因此，筛选自交亲和的不结球白菜，鉴定自交亲和的基因位点，将能极大提高育种效率，降低制种成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与不结球白菜自交亲和性相关的等位基因，该基因能使不结球白菜表现为自交亲和的性状。

本发明的技术方案是不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因，所述等位基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

具体的，SEQ ID No.2所示编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体的，SEQ ID No.4所示编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供了与不结球白菜亲和性相关的分子标记BrSRK325b-1043，其核苷酸序列如SEQ ID No.1的第176～1218位所示。

本发明还提供了扩增所述分子标记BrSRK325b-1043的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了与不结球白菜亲和性相关的分子标记BrSCR325-152，其核苷酸序列SEQ ID No.3的第212～363位所示。

本发明还提供了扩增所述分子标记BrSCR325-152的引物对，其核苷酸序列如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了所述的不结球白菜自交亲和性状相关等位基因、分子标记或扩增分子标记的引物在不结球白菜育种中的应用。

具体的，所述应用为在亲和性表型调查分析、回交后代分析或杂交子代目标基因跟踪中的应用。

本发明还提供了所述与不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因的获得方法，包括如下步骤：

(1)亲和小白菜S单倍型鉴定：利用白菜自交不亲和I类和II类S单倍型通用引物对自交亲和材料‘325’进行PCR扩增，同时对PCR产物进行测序分析，亲和小白菜含有一个II类的S单倍型，命名为‘BrS-325’；

(2)“325”自交亲和性的遗传分析：将“325”与自交不亲和的小白菜‘326326’进行杂交，构建F₂的遗传分离群体，调查所有单株自花授粉表型，发现“325”的自交亲和性受单个S位点控制；

(3)“325”S位点序列信息获取：采用纳米孔测序技术(Nanopore sequencing)对“325”进行全基因组测序分析，得到亲和小白菜S位点(BrS-325)的完整序列信息，提取出自交不亲和基因BrSRK-325b和BrSCR-325的序列信息；

(4)S位点自交不亲和基因表达分析：采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测“325”成熟花蕾中自交不亲和基因BrSRK-325b和BrSCR-325的表达，发现两个自交不亲和基因均能正常表达；

(5)氨基酸序列变异分析：将自交不亲和基因BrSRK-325b和BrSCR-325的氨基酸序列与公布的其他II类S位点基因的氨基酸序列进行比较分析，发现BrSRK-325b的高变区域和BrSCR-325的连接区域存在多个氨基酸的变异，影响了BrSRK-325b和BrSCR-325的相互识别反应，最终导致“325”表现为自交亲和的表型。

本发明还提供了获得自交亲和不结球白菜的方法，包括如下步骤：将自交亲和材料“325”与不亲和的育种材料进行杂交，后代以不亲和材料为轮回亲本进行连续回交，每代用自交亲和基因的分子标记跟踪目标基因，连续回交4代后，挑选含有目标基因的单株进行自交，在后代用分子标记鉴定植株的基因型，结合表型考察，最终得到些纯合的自交亲和株系。

本发明的有益效果：本发明通过对材料“325”的自交亲和性进行遗传和分子分析，发现其自交亲和性受一个来自II类S单倍型BrS-325控制，进一步鉴定出自交不亲和基因BrSRK-325b和BrSCR-325的序列变异导致“325”表现为自交亲和。基于变异的序列，本发明提供了选育自交亲和白菜的优异等位基因和相关分子标记，利用本发明的基因将促进自交亲和不结球白菜的选育，极大提高育种效率，降低制种成本。

附图说明

图1亲和小白菜“325”的表型考察和S单倍型鉴定；(a)苯胺蓝染色观察“325”自交授粉花粉生长情况，Bar＝100μm。(b)“325”自交授粉角果发育，Bar＝2cm。(c)利用I类和II类S单倍型鉴定通用引物检测“325”的S单倍型，PS5和PS15及PK1和PK4检测I类S单倍型，PS3和PS21及SRK II-E4L和E7R检测II类S单倍型。(d)和(e)采用MEGA-X软件中的邻接法构建II类S单倍型SCR和SRK的核苷酸序列的进化树。

图2亲和材料“325”与不亲和材料“326”的表型考察；(a)苯胺蓝染色观察亲和系“325”、自交不亲和系“326”及杂交种F₁的花粉粒萌发和花粉管生长情况，Bar＝100μm。(b)自交亲和系“325”，自交不亲和系“326”及F₁角果发育图片，Bar＝1cm。(c)自交亲和系“325”，自交不亲和系“326”及F₁自交授粉的平均每角果长度，误差线由统计10个角果产生。用T检验进行显著性分析。(d)自交授粉的平均每角果粒数，误差线由统计10个角果产生。(e)F₂群体中的部分材料的表型和基因型鉴定，PK1与PK4鉴定I类S单倍型，SRKII-E4L与SRKII-E7R鉴定II类S单倍型。SC：自交亲和；SI：自交不亲和；H：I类和II类；I：I类S单倍型；II：II类S单倍型。

图3 SCR和SRK基因的表达分析；(a)花药中SCR的相对表达水平。在“325”和杂交种F₁中检测BrSCR-325表达。在“326”和杂交种F₁中检测BrSCR-12表达。(b)柱头中SRK的相对表达水平。在“325”和杂交种F₁中检测BrSRK-325表达。在“326”和杂交种F₁中检测BrSRK-12表达。误差线有三个生物学重复产生标准误差，以Actin7作为内参基因。

图4 SRK和SCR的氨基酸序列比对和进化分析(a)II类SCR的氨基酸序列比对，比对序列的上方，红线代表信号肽，红色C*和红色的实线方框代表SCR保守的半胱氨酸；红色虚线方框代表SCR与SRK的接触区域(CRI，CRII，CRIII)，红色方块代表SCR与SRK接触的氨基酸残基；黄色虚线方框表示BrSCR-325的变异氨基酸残基。箭头和圆柱分别表示II类SCR的β股和α螺旋。(b～d)，II类SRK的HVI，HVII，HVIII的氨基酸序列比对；参考I类BrSRK-8，BrSRK-9，红色圆点代表BrSRK-8/BrSRK-9与SCR接触的氨基酸残基相同位点上的II类SRK与SCR接触的氨基酸残基，黄色圆点代表SRK与SCR接触的氨基酸位点(参考II类SRK，SCR的蛋白结构)，蓝色圆点代表参与SRK二聚化作用的氨基酸残基。紫色方框表示SRK-325的变异氨基酸残基。(e和f)II类SCR和SRK的进化树分析。

图5BrSRK-325b和BrSCR-325基因特异性分子标记开发；图中所用材料为自交亲和系‘325’，自交不亲和系‘QR44’和他们的杂种F1，图上部分为BrSRK-325b特异性分子标记扩增结果，下部分为BrSCR-325特异性分子标记扩增结果；M代表Marker。

图6.BrSRK-325b基因特异性分子标记BrSRK325b-1F/BrSRK325b-1R在BC₁分离群体中的检测结果；1～12孔和14～25孔为利用325与QR44构建的回交群体BC1(QR44为轮回亲本)的部分单株，13孔为Marker2000，利用分子标记BrSRK-1F/BrSRK-1R检测BrSRK-325b在BC1群体中的分布情况。

图7自交后期群体中自交亲和植株亲和表型分析；(a)荧光显微镜下观察花粉管能完全穿过柱头组织；(b)自花授粉后30天的角果能正常伸长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的一种与不结球白菜自交亲和性状相关的基因及其应用进行详细的说明，但是不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1自交亲和基因的鉴定

1、亲和小白菜S单倍型鉴定

在白菜的育种群体中，筛选到一个自交表现为亲和的小白菜材料，命名为“325”。苯胺蓝染色结果表明，自交授粉后大量花粉萌发且花粉管成束穿过柱头乳突细胞，表现出完全亲和的表型(图1a)。结籽实验表明，该材料自交授粉角果发育正常，结实率高(图1b)。为了了解该材料的S单倍型情况，利用白菜的I类和II类S单倍型通用引物对该材料进行PCR鉴定，如图1c所示，仅有II类S单倍型特异性引物能在自交亲和系“325”中有效扩增。以上结果表明“325”含有一个II类的S单倍型。为了最终进一步获得该II类S单倍型的信息，根据4个已知II类S单倍型中SRK和SCR基因的序列信息开发特异性引物，从亲和材料“325”中克隆了SRK和SCR基因的相关序列并进行测序分析。将扩增测序获得的序列与已知的II类SRK和SCR基因序列进行比对分析，结果显示亲和白菜SRK基因的第一个外显子以及SCR基因的序列与已知II类S单倍型的SRK，SCR的序列存在较大差异。基于“325”和已知的II类S单倍型中SRK，SCR基因的核苷酸序列构建系统进化树，结果表明“325”的S单倍型与BrS-60具有最近的亲缘关系(图1d和e，比对序列信息见表2)。以上结果表明，从亲和小白菜“325”中鉴定了一个新的II类S单倍型，命名为BrS-325。所用引物信息如表1所示。

表1白菜S单倍型检测引物列表及II类SRK、SCR扩增引物对信息

表2图1d和e中比对序列信息

基因名称	基因登录号	基因名称	基因登录号
				BrSCR-29	AB067449.1	BrSRK-29	AB008191.1
BrSCR-40	AB067450.1	BrSRK-40	AB211197.1
				BrSCR-44	AB067451.1	BrSRK-44	AB211198.1
BrSCR-60	AB067446.1	BrSRK-60	AB032474.1
				BoSCR-15	AB024416	BoSRK15	Q9XFW5/Y18259
BoSCR-5	Q8S9C1	BoSRK-5	Y18259/Q9T0M1
				BoSCR-2b	Q8S9C2	BoSRK-2b	AB024416

2、“325”自交亲和性的遗传分析

为了了解亲和小白菜“325”自交亲和的遗传特性，将其与I类S单倍型(BrS-12)的自交不亲和的白菜“W 326”进行杂交，构建F₁材料，并创建其F₂分离群体。苯胺蓝染色结果表明，“325”自交授粉后可见成束的花粉管穿过柱头，呈现完全亲和的表型；而在“W 326”以及F₁自交授粉后，仅观察到少量的花粉粒粘附和萌发，表现出强的自交不亲和特性(图2a)。自交授粉结实结果表明，“325”自交授粉后角果正常发育，平均每角果长度为3.9cm，每角果粒数为18.47粒；而在“W 326”以及F₁的自交授粉后，角果发育显著受到抑制，每角果长度为1.43cm和1.71cm，每角果籽粒数为1.55和3.88粒，结实率显著低于自交亲和的“325”的结实率(图2b，c，d)。对F₂群体的单株进行S单倍型的鉴定，如表2所示，BrS-12BrS-12︰BrS-12BrS-325︰BrS-325BrS-325的分离比为20︰50︰22(3︰1，χ²＝0.094，P<0.05)；在开花期，对F₂群体进行套袋自交，调查其自交授粉的表型。如表3所示：自交不亲和与自交亲和的分离比为SI︰SC＝70︰22(3︰1，χ²＝0.73，P<0.05)。如图2e所示，F₂群体中部分单株的S单倍型鉴定以及表型考察结果，表明分离群体中所有单株的基因型和表型一致，以上结果说明“325”的自交亲和性受到单个S位点BrS-325控制。

表3“325”自交亲和性遗传分析

3、“325”S位点序列信息获取

为了获取亲和小白菜“325”的完整基因组信息并解析其自交亲和的原因，采用纳米孔测序技术(Nanopore sequencing)对“325”进行全基因组测序分析。总共获得超过3百万条序列，N50的序列长度为27kb。采用从头组装的方法(next denove)对测序序列进行基因组组装，初步获得一个440.847Mb的拼接基因组，经过多种模型的纠错去冗余，最终获得了一个大小约为376.7M的小白菜的基因组，包含314条序列重叠群，重叠群的N50为4.54Mb，其N50比已完成基因组测序白菜的N50序列更长，组装的重叠群更少。在“325”全基因组序列信息获取的基础上，得到亲和小白菜S位点(BrS-325)的完整序列信息，并提取出自交不亲和基因BrSRK-325b和BrSCR-325的完整序列信息。BrSRK-325b具有典型的自交不亲和基因特征，包含7个外显子和6个内含子，全长为6083bp(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2)；同样的BrSCR-325与公布的SCR基因高度同源，包含2个外显子和1个内含子，全长为391bp(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4)。

SEQ ID No.1，BrSRK-325b核苷酸序列，斜体部分为用作分子标记的区域，带下划线的部分为引物区域：

SEQ ID No.2，BrSRK-325b氨基酸序列：

MKGVHNIYHHSYSFSFLLVFLVLILFHPALSIYVNTMSSSESLTISSNRTLLSPGGVFELGFFKPSGRSRWYLGIWYKKVSQKTYAWVANRDSPLTNSIGTLKISGNNLVLLGQSNNTVWSTNRTRGSARSPMIAELLPNGNFVMRYSNNKDSSGFLWQSFDFPTDTLLPDMKLGYDLKTGRNRFLTSWKSSDDPSSGNFTYRLDIRRGLPEFILMNQSYEVQRSGPWNGMEFSGIPEVQGLNYMVYNYTENSEEIAYSFQMTNQSIYSRLTVSDLLILNRFTWIPSSPGWRQFWGLPTDGCDYLFRCGSYAYCDINTSPNCNCIRGFVPKNRQRWDLRDGTDGCVRTTRLSCGGDGFLRLNNMTLPDTKTATVDRRIDVKKCEERCLNDCNCTSFATADVRNGVLGCVFWTGELVEIRKQAVGGQDLYVRLNAVDLDFSSNEKRDQPGKIIGWSIGVSVVLILTVIVFCFWKRRQKQAKADATPIVGNQVLMNEVVLPRKKINFSGEEEVEDMELPLMEFEAVVTATEHFSDFNKVGKGGFGVVYKGKLVDGQEIAVKRLSEMSAQGTDEFMNEVRLIAKLQHNNLVRLLGCCVYEGEKILIYEYLENLSLDSHLFDGTRSCRLNWQMRFDIINGIARGLLYLHQDSRFRIIHRDLKASNVLLDKDMTPKISDFGMARIFGRNETEANTRKVVGTYGYMSPEYAMNGTFSMKSDVFSFGVLLLEIISGKRNKGFCYSDSNLNLLGCVWRNWKEGHGLEIVDRVIIDSSSPTFRPHEILRCLQIGLLCVQERVEDRPMMSSVVLMLGSEAALIPQPKHPGYCVSGSSLETYSTWSKRPDDENCTVNQITMSIIDAR*SEQ ID No.3BrSCR-325核苷酸序列，斜体部分为用作分子标记的区域，带下划线的部分为引物区域：

SEQ ID No.4BrSCR-325氨基酸序列：

MRYATYRYVFVTKIHYLCFIFLILTYVQALDVGPRICPEGIAEQDTINGRCSNFWNPNCDLMGKNVTNCYCVSYTPDS-SKSTCYCCKVKS*

SEQ ID No.21BrSRK-325a核苷酸序列：

atgaaaggggtacataacatttaccaccattcttacagcttctcgttcttgctagtcttccttgtcttgattctatttcatcctgccctttcgatctatgtcaacactatgtcgtcttcagagtctctcacaatctcaagcaacagaacacttgtatctcccggtggagtcttcgagcttggtttcttcaaaccctcgggacgctcgcgatggtatctcggaatatggtataagaaagtctcccagaaaacctacgcatgggtcgccaacagagacagccctctcaccaattccattggaaccctcaaaatctcgggcaacaatcttgtcctgctaggtcagtctaataacactgtttggtcgacaaatcgtactagaggaagtgcgagatctccaatgatagcagagcttcttcccaacggtaattttgtaatgagatactccaacaacaaagactcaagtggattcttgtggcagagtttcgattttccgacagatactttacttccggatatgaaactaggctacgatctcaaaacagggcgcaacaggttccttacatcatggaaaagttcagatgatccgtcaagcggaaatttcacgtacagactcgacattcgaaggggattgcctgagtttattcttatgactcttgtttttaaaatgcaaaggagtggtccatggaatggaatcgagtttagtggcataccggaggtgcaaggattaaactacatggcttacaattatacggagaacagtgaggagatcacttacacgttccatatgactaaccaaagcatctattccagattgacaatcaatgactttacactcaatcgattcacgtggatcccgccatcatcggcatggagcacgttctggactataccaatggacggttgcgattatcttttcttctgtgggtcttatgcttattgtcacataaacacgtcacctaactgtaactgtattaaagggtttgttcccaagaaccgggagcggtgggacttgagagacggatcacaggggtgtgtgaggacgacgcggttgagctgtagtggagatggctttttgcggctaaacaatatgaatttgccggatactaagacggcgtctgtggatcggacaattgatgtgaaaaaatgtgaagagaagtgtcttagagattgtaactgtacgtcgtttgctattgcagatgttcgaaacggcggattgggttgtgtgttttggaccggagaactcgttgagatccggaaatacgccgttggtggtcaagatctttacgtcagattgaacgctgctgatctaggttagtttaatctctttaaacgaaacacatcgaatatcatgtcatattttttcccgatccaaatattttacaagtcctaagaaatcttttctactttcagtttctatgaatttgtttagttaaaaagttatcaagtgcgaaatatacaactgattaacgagaagggtgaataaaatttccaatccaagttgttttttttttactctataactgagattgtatattatatatatatatatatcactaaatttaaaaataactaaaaataaattaattgtatataaaaatgtatttaataaaactataaactttgtgttacatatgtaattagttttgaaatggaaaggatattgtactttcacatactttagctttgaacaaaacctgcttaaataagggtttaaaattaatcattttaaaattttatttatttagttatttttgactaatcatttaacatgtatttcaaaatttaaataataaatgttagccattcatccaaaaaaaaaagtaaacaaaaagcaaataaatagtggatacaaagttataaaatgcataatatatgatatatattttctggctaataagatacaaaatagtagttattagcccgtactttgcatggaacatatatagtagatataaaatcgtaaataaataaatttaaatatatttttctgttggacaactaaataaaattatttaaacacgaattatacatgcaacggccggctaatataaaagtatataactatttatgtttacgaattctgtagaagcaggaagataaaatagatgagatagttcggcaaaacaagggatgtgatacaacatcatttgaaaaaaaaaaactcatcattcatgtcatgtcagcgtcaggcgtcgcgtcactacctacataagacattatacattagtttttggttttcgttccttacaaaagaagagtagtccaaaagagttcttaaattagaggtttatattaattgattaaaaaaaaagaaattaaatggtttaatcaattcacattaaaataataatattttgtttgtttaagaactcatttgaattttggaaaattgcatggtataacaccaaaaaaaatccaaaacccactcactaaccaaaataacattctttcacttcttttctcttctttttttatttttttgttaaagacttcttcttttctcttcttatctctctagtttctttctacaaaaccaatttctttttctttttagctatttcacaaataaacctttggattttccctgataagggcgctatgtcctcaatctcatactaatttcttaacctgtagaagtcactttttttggtttttgttttaatgcactgcaataaccattcatgccagaaattttgagttggtcagcttaatagcttgttaaatgtttgacacgactctttgcagatttttcctcaggtgagaagagagaccgaactggaaaaatcataggttggggtattggagtcagtgttatgcttattctgagcgttatcgtgttctgcttttggaagaggagacagaagcaatcaaaagcagaggcaacacctattggtaaatggataatataaccttcattttattttatttttatgtaaacttttattctatgttctgattctttatgtgtttgaatgaaaatagtctataaagtgggaaaccaagttctaatgaacgaggtggtgttaccaagaaagaagataattttttctggagacaacgaagtagaagatttggaacttccgttgatggagtttgaagctgttgtcacagccaccgaacatttctctgattttaacaaggtcggagaaggtggtttcggtgttgtttacaaggtaaaaataatgatttactatgtgtttcaaaaaaaatatataatgatttactatgaataagaataagatctataactgcggttggttttcgtaacgcgctaagagtttttaatacgataagaaaatattagtccaaaaacgtccagcaactaaacatttacaatgagtaaagacaataatgttaagagcaaaccgatttttagtaaactgcttacaaaaaaatactacagttatataaatttaaagaaatctattgacttacataatgcggtactctatataaaatatgtagatttaactaaaaactagagattggtgcacggatattcgtttttgctttgcaaaaaaaatattttccttatataaatggtaatatatatttttaaaatttagatatattaaataattatttaatatatttttaaacacattttacaatttataatgaataattttattttattttttgatctgtcaaatgttaaaactatatttttaaaatataatccgtgtgtccgtgcaaatatattttgtatcgatcaaaaatttaatgtaaaaaaaatttgttatctgttgttatatttggtttatacaatcaaataattcagtatattatttacaattttgtgttttatattatgtattttatagcatttttatgtttttttagacatagttaatattcgaaaataataagatataactagcccgtaataataaaatcttgttacattttttacattgattaagtataatttattgtttagcgagattataggaaatattttttaaataagcaatacataattttgtacttcattttaggaaaatggtaggtaaatttattacttcaatggctatgattgtaaataatttgaaaaactaagagttaatttatatttgtatttatcttttaatagattagataaataaaatgttacaaaaaagattagataaataaatataaatgggataaaaactgatgagcaaataaaaggtcaataaaaaataaagtgaagtttaaagataaccaagtgtgatacaaagaaaatgttaattttaaaaaacgacacatagtttaacttggattttttttgtggataattgtagaagaaatttaacaccgtataaaataaaataaaaagtattcttaaatatgctcctaagttttatttgaaattaaatgccttaaccaatgtttctttttattgaaatgctctgttggttttgtataaatgatcaagtatgtgttaccagggaaagttagttgacgggcaagaaattgcggtgaagagactatcggaaatgtcagctcaaggtaccgatgagttcatgaatgaagttaggctaattgcaaagcttcagcacaataatcttgtccgacttcttggctgttgtgtttatgagggcgagaagatcttgatctacgagtacttggagaatctaagcctcgattctcatctctttggttagtgcctcaagacaacagacagatttatttatacagttaaatgtctttggaaatatgttaatgtgattctgttgtgaactaaatgcagatggaaccaggagctgtaggttaaattggcaaatgagatttgatattatcaatggcattgctcgagggcttctgtatcttcaccaagattcacggtttagaatcattcatagggatttgaaagcaagcaatgtcttgcttgataaagatatgactccaaaaatttcagacttcggaatggctaggatctttggacggaatgagacggaagctaacacgagaaaggtggtcggaacttagtaagcaactaaagcagcatcatattttgaa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SEQ ID No.21BrSRK-325a氨基酸序列：MKGVHNIYHHSYSFSFLLVFLVLILFHPALSIYVNTMSSSESLTISSNRTLVSPGGVFELGFFKPSGRSRWYLGIWYKKVSQKTYAWVANRDSPLTNSIGTLKISGNNLVLLGQSNNTVWSTNRTRGSARSPMIAELLPNGNFVMRYSNNKDSSGFLWQSFDFPTDTLLPDMKLGYDLKTGRNRFLTSWKSSDDPSSGNFTYRLDIRRGLPEFILMTLVFKMQRSGPWNGIEFSGIPEVQGLNYMAYNYTENSEEITYTFHMTNQSIYSRLTINDFTLNRFTWIPPSSAWSTFWTIPMDGCDYLFFCGSYAYCHINTSPNCNCIKGFVPKNRERWDLRDGSQGCVRTTRLSCSGDGFLRLNNMNLPDTKTASVDRTIDVKKCEEKCLRDCNCTSFAIADVRNGGLGCVFWTGELVEIRKYAVGGQDLYVRLNAADLDFSSGEKRDRTGKIIGWGIGVSVMLILSVIVFCFWKRRQKQSKAEATPIVGNQVLMNEVVLPRKKIIFSGDNEVEDLELPLMEFEAVVTATEHFSDFNKVGEGGFGVVYKGKLVDGQEIAVKRLSEMSAQGTDEFMNEVRLIAKLQHNNLVRLLGCCVYEGEKILIYEYLENLSLDSHLFDGTRSCRLNWQMRFDIINGIARGLLYLHQDSRFRIIHRDLKASNVLLDKDMTPKISDFGMARIFGRNETEANTRKVVGTYGYMSPEYAMNGTFSMKSDVFSFGVLLLEIISGKRNKGFCYTDSNLNLLGCVWRNWKEGQGLEIVDRVIIDSSSPTFRPREILRCLQIGLLCVQERVEDRPMMSSVVLMLGSEAALIPQPKQPGYCVSGSSLETYSTWSKRRDDENFTVNQFTMSIIDAR*

4、S位点自交不亲和基因表达分析

SRK和SCR作为自交不亲和的识别因子，其功能完整性对于自交不亲和性的发生至关重要，SRK和SCR的正常表达是配体/受体特异性识别的前提。为了了解BrSRK-325b，BrSCR-325的表达水平是否导致“325”自交不亲和性丢失，采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)在花药中检测SCR基因的表达水平，在成熟花蕾的柱头中检测SRK基因的表达水平。结果显示，在“325”中BrSCR-325表达正常，具有较高的表达水平；在杂交种F₁(325×326)中，BrSCR-12表达正常，而BrSCR-325的表达受到抑制，这种表达抑制可能受控于“326”材料中的BrS12-SMI对BrSCR-325启动子的甲基化作用。柱头中SRK基因的检测结果显示，BrSRK-325b和BrSRK-12均能表达正常，具有较高的转录水平(图3)。以上结果表明，在转录水平上，BrSCR-325和BrSRK-325b均具有正常的功能。

5、SRK和SCR氨基酸序列变异分析

为了进一步探究不结球白菜“325”自交亲和的原因，分析是否存在氨基酸的变异影响SRK与SCR的相互识别过程。对白菜II类S单倍型中进行SRK和SCR氨基酸序列进行了比对分析。白菜的5个II类SCR(BrSCR-325，BrSCR-44，BrSCR-60，BrSCR-40和SCR-29)的氨基酸序列相似性为57％到73％，II类SRK(BrSRK-325a，其核苷酸和氨基酸序列见SEQ ID No.20和SEQ ID No.21；BrSRK-325b，BrSRK-60，BrSRK-44，BrSRK-40，BrSRK-29)的氨基酸序列保守性在86.67％到94.62％之间。在S位点上存在两个SRK基因,以相反的转录方向分布在S位点上，将其命名为BrSRK-325a和BrSRK-325b；其中BrSRK-325b带来自交亲和性状。II类SCR和SRK的进化树分析结果显示，白菜和甘蓝的S单倍型种间对之间具有更高的序列相似性和最近的亲缘关系；本发明鉴定的新的II类S单倍型BrS-325与BrS-60和BoS-15的亲缘关系更近(图4e和f)。

SCR与SRK的接触区域(contact region I，II，III)以及SRK的高变区域(hypervariable region I，II，III)对于SCR与SRK的识别作用至关重要，突变该区域的氨基酸残基，破坏了同一单倍型SRK与SCR的相互识别，阻止了自交不亲和信号的产生。因此，基于预测的白菜II类SRK和SCR的蛋白结构模型，分析了白菜II类S单倍型中SCR与SRK的接触区域(CR I，CR II，CR III)以及SRK的高变区域(HV I，HV II，HVIII)氨基酸残基的变异情况。II类SCR的接触区域氨基酸序列比对结果表明，在BrSCR-325的CR II和CR III区域存在一些氨基酸的替换(如62位的蛋氨酸，75位的苏氨酸以及78位的丝氨酸)以及氨基酸的缺失(如对应于BrSCR-60的83位脯氨酸，对应于BrSCR-44的80位的精氨酸)，这些位点上的氨基酸参与到II类SCR与SRK的接触作用，形成相应的作用力(如氢键等)，BrSCR-325上的这些氨基酸的缺失或突变影响BrSCR-325与BrSRK-325的的相互识别作用(图4a)。

参考BrSRK-8/BrSRK-9以及II类SRK的蛋白结构模型，在SRK的高变区域上，一些参与SRK与SCR接触形成相互作用力以及参与SRK二聚化作用的氨基酸残基被鉴定出来。II类SRK的多重序列比对结果表明，12个半胱氨酸在II类SRK的S胞外结构域上是保守的，维持SRK的蛋白结构；在SRK的高变区域，HV I和HV II的序列多态性较高，HV III的序列相对保守(图4bcd)。与已知的II类SRK保守的氨基酸序列相比，在BrSRK-325b的HV I上，存在三个连续氨基酸(第219位的苯丙氨酸Phe，第220位亮氨酸Leu，第221位的天冬酰胺Asn)的缺失以及两个氨基酸的替换(如第220位的脯氨酸Pro/络氨酸Tyr和222位的蛋氨酸Met/缬氨酸 Val)，这些氨基酸参与SRK和SCR的识别过程。在BrSRK-325b的HV II上，包含许多的变异氨基酸残基(在BrSRK-325b的HV II区域，包括第277位的亮氨酸，第286位的丝氨酸，第292位的精氨酸，第300位的甘氨酸，第303位的络氨酸，第305位的脯氨酸)，这些位点上的氨基酸变异可能影响SCR与SRK的相互识别以及SRK的二聚化作用，导致SI信号无法产生，进而改变了小白菜的自交不亲和性。

实施例2自交亲和基因的应用

1、分子标记的开发及亲本、杂种F₁基因型鉴定

根据自交亲和等位基因BrSRK-325和BrSCR-325与其他II类S位点基因的序列差异，分别开发特异性分子标记BrSRK325b-1043和BrSCR325-152，大小分别为1043bp和152bp(图5)。分子标记的引物为：

BrSRK325b-1F(SEQ ID No.5)：agcttggtttcttcaaaccctc；

BrSRK325b-1R(SEQ ID No.6)：caatactccatttcgaacatcagcc；

BrSCR325-1F(SEQ ID No.7)：gtgggacctcggatatgcccg；

BrSCR325-1R(SEQ ID No.8)：gtactcttcgaagaatccggagtg；

将含有BrSRK-325和BrSCR-325基因的自交亲和系“325”与轮回亲本小白菜自交不亲和系‘QR44’进行杂交得到F₁代种子。提取杂种F₁代植株的DNA，利用开发的分子标记来检测植株的S位点基因型，结果发现开发的分子标记能在“325”和杂种F₁中成功检测(图5)。以上结果表明改分子标记能有效检测出杂交子代植株中是否含有BrSRK-325和BrSCR-325基因，可用于跟踪目标基因。

2、回交后代的分子标记辅助选择

在温室种植杂种F₁代的植株，于开花期去掉花蕾的雄蕊，同时授以轮回亲本‘QR44’的花粉，构建自交亲和系“325”与‘QR44’的回交分离群体BC₁；继续种植BC₁分离群体的植株，于苗期提取叶片组织的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳对BrSRK-325b和BrSCR-325基因特异性分子标记进行检测。结果表明，在检测的24个BC₁植株中，有13个单株中能有效扩增出BrSRK-325b基因的分子标记BrSRK325b-1043的特异性条带，在其余的11个单株中未出现目标条带(图6)。挑取含有目标基因的单株用于后续的回交授粉。

3、亲和性表型调查分析

以‘QR44’为轮回亲本，采用相同的回交方式与检测方法最终得到BC₄分离群体，挑选含有目标基因的单株进行剥蕾自交，得到BC₄F₂分离群体。在分离群体中，挑选BrSRK-325b和BrSCR-325纯合基因型的单株共8株进行自交亲和性的表型分析。于开花期，授粉24h之后将处理过的雌蕊置于荧光显微镜下，观察花粉管的萌发状态(花粉管观察方法参考高长斌，博士论文，2013)。通过荧光显微镜，可以观察到全部8个单株的花粉均能正常萌发，长出花粉管并且能顺利穿过柱头的乳突细胞，进入花柱中，到达胚珠完成受精(图7A)。所有植株在套袋自交后角果能够正常生长，植株表现为自交亲和(图7B)；以上结果表明通过杂交、连续回交和分子标记辅助选择等技术手段成功获得了自交亲和的不结球白菜材料。

序列表

<110> 武汉市农业科学院

<120> 不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6083

<212> DNA

<213> atificial

<400> 1

atgaaagggg tacataacat ttaccaccat tcttacagct tctcgttctt gctagtcttc 60

cttgtcttga ttctatttca tcctgccctt tcgatctatg tcaacactat gtcgtcttca 120

gagtctctca caatctcaag caacagaaca cttttatctc ccggtggagt cttcgagctt 180

ggtttcttca aaccctcggg acgctcgcga tggtatctcg gaatatggta taagaaagtc 240

tcccagaaaa cctacgcatg ggtcgccaac agagacagcc ctctcaccaa ttccattgga 300

accctcaaaa tctcgggcaa caatcttgtc ctgctaggtc agtctaataa cactgtttgg 360

tcgacaaatc gtactagagg aagtgcgaga tctccaatga tagcagagct tcttcccaac 420

ggtaattttg taatgagata ctccaacaac aaagactcaa gtggattctt gtggcagagt 480

ttcgattttc cgacagatac tttacttccg gatatgaaac taggctacga tctcaaaaca 540

gggcgcaaca ggttccttac atcatggaaa agttcagatg atccgtcaag cggaaatttc 600

acgtacagac tcgacattcg aaggggattg cctgagttta ttcttatgaa tcaaagttat 660

gaagtgcaaa ggagtggtcc atggaatgga atggagttta gtggcatacc ggaggtgcaa 720

ggattaaatt acatggttta caattatacc gagaacagtg aggagatcgc ttactcgttc 780

caaatgacca accaaagcat ctactccaga ttgacagtca gtgacttatt gattctcaat 840

cgattcacgt ggatcccgtc atcaccggga tggcgtcagt tctggggttt accaacggac 900

ggttgcgatt atcttttccg ctgtgggtct tatgcttatt gtgacataaa cacgtcacct 960

aactgtaact gtattagagg gttcgttccc aagaaccggc agcggtggga cttgagggac 1020

ggaacagatg ggtgtgtcag gacgacgcgg ctgagctgtg gtggcgatgg gtttttgcgg 1080

ctaaataaca tgactttgcc ggatactaag acggcgactg ttgatcggag aattgatgta 1140

aaaaaatgtg aagagaggtg tcttaacgat tgtaactgta cgtcgtttgc gacggctgat 1200

gttcgaaatg gagtattggg ttgtgtgttt tggaccggag agctcgttga gatccggaaa 1260

caagccgtag gtggtcaaga tctttacgtc agattgaatg ctgttgatct aggttagttt 1320

aatctcttaa aactaaacac attggatatc tgtcatgaat aatttttaat tttgtcctga 1380

taaggaagtc accataattt tttccgatcc aatattttac gtcttattac atttttctat 1440

taatttgatt tgttaatata catctaatta acgaagaggt tgaataaaat ttccaatcca 1500

aactgtttct tgttttaatc ttgaaaattg atattcagta tatatatatt taacggatcc 1560

gtacccctga tgagtcatca gtccaaggct ggacaaaacc agtcggaaat gatccaaatg 1620

tcccacggac aaaatcccgt aagagctagg cgccactact tggctaacac ataatcaggg 1680

ccggacttga ccaaggtcaa gcattattaa aaatattaaa gccaatttgg caagaattat 1740

tgttggttca catacttatt tcttaacctg tcgaagtcaa tctttttttc gttttaatgc 1800

gctgcaatag ccattcatgg caaaaagttg aagttggtca gcttaatagc tttttaattt 1860

ttttagacga ctctttgcag atttttcctc gaatgagaag agggaccaac ctggaaaaat 1920

cataggttgg agtattggag tcagtgttgt tcttattctg actgttatcg tgttctgctt 1980

ttggaagagg agacagaagc aagcaaaagc agatgcaaca cctattggta aatgagtaat 2040

aaccttcagt ttcttttact tttctgtaaa tttttcttct atgtttcttt ttctgaaaga 2100

gtttttttct tctatgtact gatcctttat gtgttcgaat gaaaataata tgtcaagtgg 2160

gaaaccaagt tctaatgaac gaggtggtgt taccaagaaa gaagataaat ttttctggag 2220

aggaagaagt agaagatatg gaacttccat tgatggagtt tgaagctgtt gtcacagcca 2280

cggaacattt ctctgatttt aacaaggtcg gaaaaggtgg ttttggtgtt gtttacaagg 2340

taaaaataat gaaggaatca ctgtgaattt tgtttttgtc aaaaaggaat cactatgaat 2400

aagaatagaa tctatcattg cgttcgtaac gtgctaagag tttttaatac gataagcaaa 2460

ataaaatatt agaccaaaaa agtccaagaa ctaaacattt acaatggcaa ttctgataaa 2520

tagaccattt tcaaattttg gtcacaaaaa gatataataa ggagaaaagt gaccaaaaag 2580

gaggaaagtg atcaaaagga ggaaaatgac caaaatgttt tatttaataa gtaaaaagac 2640

tttaatattc taaatatata aaaaaaatta aaactttttt ttatagtttt agattatatg 2700

ttttcaaatt cgaattattt taattttttt ttgaattttt tttttgaatt ttttttttgt 2760

aattcgaaaa tactttgaac tatttttaaa atttttattt tcaaatttta atatttattt 2820

tttattttac aaaattttaa actccaatcc caaatcttca ccccttaact ctaaatccta 2880

agatttagat taattaacac tagagttata aatgtatatt tacctcttta ataaaatatt 2940

ttggtcattt tatttcttag aatctgtatt tgtgaccaaa acttttttaa tgctatcctt 3000

gggtattttt ctatttacaa tgatcaaaca caatttttaa gacgaaaaca atttataata 3060

aactgtttac aaaatactac agtaatgtaa atttatagaa aactattgac ttacaagctg 3120

tcggtacttt atataaaata tgtagaatag taaaaaataa ataaatataa atgggacaaa 3180

aactgatgac caaataaaag tcaataaaaa ataaagtgaa ctttaaatat aaacacgtga 3240

gatacaaaga aaatgttaat tttgttaaaa gaaacatagt ttaacttgga tttttttgtg 3300

ggtaatttta caagaaaatt aataccgaat aaaataaaaa gtatttctaa atatatattt 3360

attgaaaaaa ggcttactaa gtattcttaa atatgctcct aaattttact tgaaatcaaa 3420

tacctaaacc attgtttctt ttttattgaa tagacaccac tatgttggtt ttgcataagt 3480

gataaattag attccgatct gtgtttttat tttttaattt attgaccaaa cactgcttta 3540

caaactacaa ttattttgtt tcgaatctta tataacaatt tatttttgtg tttttatgat 3600

ttgttttttt tcttcaaatt aaatatggta tttgtttaaa atagattaaa gatgatatgt 3660

gtgatttaac agtataaata ctaataacaa tgtgttctca ttattgaaat gaagtaatga 3720

tttgaatcga cgaatttaaa ctaaaaatga tttttttttg tcatatattt gtgtcttagt 3780

gctaaccatc agtctacact attttttttc tatacgattt agaagctact attatctttg 3840

aaagcacata tatttatgga tgaaccattt tgataaaact tgcatgaatt tataactttt 3900

ataagaaaaa taataattta aaaggtgttt ataatatgta gttttaagaa gtattttcat 3960

atccggcaca gatctgtggt tgaactggta gacccggtac cttgcatatc attttgttca 4020

catttaatga aaaatcgtat attaaaaatt tgatagaacc ctttacaaac acaaaaaaac 4080

ttgttaaact cgcgacctaa taccgttgat tcgataaaaa cactaaatat ctgataatac 4140

ttttaatttt tgttaaatta ctcacatatt ttttagtatt agataaactt gtgattctgt 4200

atacttggat gaaatgtttt ttattacatc caaataaaaa atgataatat aaaaagcata 4260

ttgatatgaa aattttaatt tattttcctc attaataacc tattgtaagt ttgcattgtt 4320

tatttttaga tttaaatttt aattttatga tactttttta aagattttta aatacttgta 4380

attgacatat caatattatg tataaaatga tatcataaaa taatattttt tttatttttg 4440

tgtatatatt catttttcat cgttaaataa tattatacac aaaaaatgat attcaagtat 4500

gtaaataatg gtgtaggatt tggatttttg gtttgtattg aaaatatgca taatatctga 4560

atgatatatt ttggatattg atacatagat atagaaaaat aatattttga tgtcattatg 4620

tttgttaatt tatatagggt tcataatata gtaggtccaa tatttaaaca caaaatattt 4680

atatttaatt taaagtttat atatcttata aatatatgta tgcataatat ttattgatta 4740

tttaagtgta tatataggct caaaacgtta atgaatttta gtaatcactt gtaaaagtaa 4800

atgtattctt gggaaaatta tgatttttgt taagcgtata aatcaggaat gattatattt 4860

tactatttta gtattattga ttatgtgttc ccagggaaag ttagttgacg ggcaagaaat 4920

tgcggtgaag agactatcgg aaatgtcagc tcaaggtacc gatgagttca tgaatgaagt 4980

taggctaatt gcaaagcttc agcacaataa tcttgtccga cttcttggct gttgtgttta 5040

tgagggcgag aagatcttga tctacgagta cttggagaat ctaagcctcg attctcatct 5100

ctttggttag tgcctcaaga caacagacag atttatttat acagttaaat gtctttggaa 5160

atatgttaat gtgattctgt tgtgaactaa atgcagatgg aaccaggagc tgtaggttaa 5220

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aagattcacg gtttagaatc attcataggg atttgaaagc aagcaatgtc ttgcttgata 5340

aagatatgac tccaaaaatt tcagacttcg gaatggctag gatctttgga cggaatgaga 5400

cggaagctaa cacgagaaag gtggtcggaa cttagtaagc aactaaagca gcatcatatt 5460

ttgaaacaaa gagctacctg agtacagagt taaacctgat agcttatcta tttaatattt 5520

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Leu Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Phe His Pro Ala Leu Ser Ile

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Tyr Val Asn Thr Met Ser Ser Ser Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ser Asn

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Met Arg Tyr Ser Asn Asn Lys Asp Ser Ser Gly Phe Leu Trp Gln Ser

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Leu Tyr Leu His Gln Asp Ser Arg Phe Arg Ile Ile His Arg Asp Leu

645 650 655

Lys Ala Ser Asn Val Leu Leu Asp Lys Asp Met Thr Pro Lys Ile Ser

660 665 670

Asp Phe Gly Met Ala Arg Ile Phe Gly Arg Asn Glu Thr Glu Ala Asn

675 680 685

Thr Arg Lys Val Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Met Ser Pro Glu Tyr Ala

690 695 700

Met Asn Gly Thr Phe Ser Met Lys Ser Asp Val Phe Ser Phe Gly Val

705 710 715 720

Leu Leu Leu Glu Ile Ile Ser Gly Lys Arg Asn Lys Gly Phe Cys Tyr

725 730 735

Thr Asp Ser Asn Leu Asn Leu Leu Gly Cys Val Trp Arg Asn Trp Lys

740 745 750

Glu Gly Gln Gly Leu Glu Ile Val Asp Arg Val Ile Ile Asp Ser Ser

755 760 765

Ser Pro Thr Phe Arg Pro Arg Glu Ile Leu Arg Cys Leu Gln Ile Gly

770 775 780

Leu Leu Cys Val Gln Glu Arg Val Glu Asp Arg Pro Met Met Ser Ser

785 790 795 800

Val Val Leu Met Leu Gly Ser Glu Ala Ala Leu Ile Pro Gln Pro Lys

805 810 815

Gln Pro Gly Tyr Cys Val Ser Gly Ser Ser Leu Glu Thr Tyr Ser Thr

820 825 830

Trp Ser Lys Arg Arg Asp Asp Glu Asn Phe Thr Val Asn Gln Phe Thr

835 840 845

Met Ser Ile Ile Asp Ala Arg

850 855

Claims

1.不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因，所述等位基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因，其特征在于，SEQ IDNo.2所示编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述不结球白菜自交亲和性状相关的等位基因，其特征在于，SEQ IDNo.4所示编码蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.与不结球白菜亲和性相关的分子标记BrSRK325b-1043，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1的第176～1218位所示。

5.扩增权利要求4所述分子标记BrSRK325b-1043的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNo.5和SEQ IDNo.6所示。

6.与不结球白菜亲和性相关的分子标记BrSCR325-152，其核苷酸序列SEQ ID No.3的第212～363位所示。

7.扩增权利要求6所述分子标记BrSCR325-152的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示。

8.权利要求1～3任一项所述等位基因，权利要求4或6所述分子标记，或，权利要求5或7所述扩增分子标记的引物对在不结球白菜育种中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用为在亲和性表型调查分析、回交后代分析或杂交子代目标基因跟踪中的应用。

10.获得自交亲和不结球白菜的方法，其特征在于，包括如下步骤：将自交亲和材料“325”与不亲和的育种材料进行杂交，后代以不亲和材料为轮回亲本进行连续回交，每代用自交亲和基因的分子标记跟踪目标基因，连续回交4代后，挑选含有目标基因的单株进行自交，在后代用分子标记鉴定植株的基因型，结合表型考察，最终得到纯合的自交亲和株系。