CN103451283A - 甘蓝型油菜自交不亲和位点s单倍型的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于油菜分子育种领域，涉及甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法、分子标记与应用。制备了鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记体系，其包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2。将上述标记组合得到的2对双重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。上述PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其DNA序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示和SEQ ID NO：9所示。本发明为油菜分子育种提供了实用标记和利用方法。

Description

甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测方法及应用。 

背景技术

利用杂种优势提高产量是国内外油菜生产的重要目标和发展方向。油菜杂种优势利用途径有细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、自交不亲和、化学杀雄等方法。细胞质雄性不育是当前应用最广泛的油菜杂种优势利用途径，尽管它存在保持系和恢复系的选育周期长、有潜在的细胞质负效应等缺点。我国主要是波里马细胞质雄性不育，其育成的杂交种占领我们油菜种植面积的60%左右；国外主要是萝卜细胞质雄性不育，除了德国NPZ种子公司及其股份占有公司利用MSL系统（具体内容属于该公司机密）、加拿大Bayer公司利用其具有自主知识产权的转基因细胞核雄性不育系统选育杂交种外，其他公司基本上都是利用萝卜细胞质雄性不育选育杂交种。 

我们在研制出一种大量繁殖自交不亲和系的方法（专利号：ZL200810236719.X）的基础上，将自交不亲和三系（自交不亲和系、保持系、恢复系）杂种选育方法（傅廷栋主编，1995）简化为“两系”（是指自交不亲和系、恢复系）杂种选育方法（专利号：ZL200810236960.2）。与波里马细胞质雄性不育和萝卜细胞质雄性不育相比，自交不亲和两系杂交种选育方法具有育种程序简单、杂交种选育周期短、杂种优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。 

自交不亲和表型鉴别在两系杂种选育中起很重要的作用。通常用田间亲和指数法来进行判别，即在田间通过套袋自交结籽情况计算亲和指数（Self-compatibility Index,简写为SCI，亲和指数=籽粒数/花朵数），不仅费时因而效率低下、受时间限制（必须在油菜开花后进行），而且结果还易受环境影响。我们利用候选基因法，发展了与S-1300的自交不亲和性连锁的SCAR标记（专利号：ZL200710053354.2）、与丙409自交不亲和保持性连锁的SCAR标记（专利号：ZL200810047237.X）。研究发现甘蓝型油菜普遍存在S单倍型（Zhang等，Theor Appl Genet,2008,117(2):171-179），上述SCAR标记在很多材料上检测不到，因而应用具有很大的局限。创建甘蓝型油菜S单倍型的分子检测技术，用来准确鉴别自交不亲和性，可解决选育自交不亲和系和恢复系效率低下因而杂种配合力不高的问题、并用于自交不亲和杂种纯度鉴定。这些相关内容，迄今还没有报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用同源基因法克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点（又称S位点）基因，根据基因序列差异设计引物，找到可区分人工创建的自交不亲和甘蓝型油菜和天然的自交亲和甘蓝型油菜的S单倍型的SCAR（Sequence characterized amplified regions,序列特征扩增区域）分子标记，应用得到的SCAR分子标记对甘蓝型油菜自交不亲和表型进行快速而又准确的选择，用于选育自交不亲和系和鉴定自交不亲和两系杂种纯度，以加快油菜自交不亲和新品系的育成。 

具体地，本发明通过以下技术方案实现： 

申请人通过克隆甘蓝型油菜自交不亲和位点（又称S位点）基因，根据基因序列差异设计引物，筛选得到一套用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记组合，其包括4个SCAR分子标记：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，上述4个SCAR分子标记的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID NO：6，7，8，9所示。对这4个SCAR分子标记进行组合得到的2对双重PCR标记，分别是：SRK1-1+SRK-1300组合和SCR7-2+SRK-1300组合，上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其中将上述两个标记共同组合的使用效果会更好。 

试验表明，我们利用上述分子标记或其组合，创建了利用甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记体系改良自交不亲和系的方法以及用于鉴定甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度的方法。 

甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测技术及其应用，其具体步骤如下： 

A、甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型分子检测技术的创建： 

1）以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和恢复系‘8400’为父本进行杂交，得到F₁种子，种植F₁种子得到F₁植株，对F₁植株套袋自交得到F₂分离群体，取所得F₁植株花粉与母本S-1300进行回交，获得BC₁分离群体；以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和保持系Bing409为父本进行杂交，得到F₁种子，种植F₁种子得到F₁植株，对该F₁植株套袋自交得到F₂分离群体，取所得F₁植株花粉与Bing409进行回交，获得BC₁分离群体 

2）调查F₂和BC₁植株的自交不亲和表型,采用亲和指数法进行分类； 

3）利用已知的候选基因序列,分别克隆步骤1）的S-1300、‘8400’和Bing409的自交不亲和性S位点基因，这些基因包括雌蕊决定基因SRK和雄蕊决定基因SP11；根据基因有差异序列设计引物（该引物的DNA序列见表5：），对S-1300、‘8400’和Bing409进行PCR扩增和电泳检测； 

4）回收、克隆、测序步骤3）筛选得到的甘蓝型油菜自交不亲和S位点SCAR标记的DNA片段； 

5）根据步骤3）所示的引物和步骤4）所示的DNA序列，获得两个多重PCR标记（其序列分别如SEQID NO：6、7、8、9所示）使其能通过一次PCR反应区分纯合亲和S₁S₁、S₇S₇，杂合亲和S₁S_s-1300、，以及纯合不亲S_S-1300S_S-1300三种基因型。选择稳定有差异扩增的引物对F₂和BC₁分离群体进行标记性状关联分析，确定其是否与自交不亲和性状连锁； 

6）利用步骤4）得到的SCAR标记引物和步骤5）获得的多重PCR引物，扩增甘蓝型油菜，确定甘蓝型油菜自交不亲和S位点基因型。 

上述A步骤得到的分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和系遗传改良种的应用方法如下： 

B、所述分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和系选育中的应用 

1）以甘蓝型油菜自交不亲和系自交不亲和系S-1300为母本，与自交亲和的甘蓝型油菜品种/品系‘8400’为父本进行杂交，得到杂种一代即F1种子；利用上述A步骤5）中获得的多重PCR引物，扩增甘蓝型油菜自交不亲和系母本S-1300和自交亲和的甘蓝型油菜父本，筛选得到在双亲间有差异扩增的多重PCR引物； 

2）种植所得的F₂，在苗期分单株取幼嫩叶片抽取DNA，利用B中步骤1）获得的在双亲间有差异扩增引物检测各单株的基因型；拨除具有父本纯合基因型（S₁S₁，S₇S₇）和父本杂合基因型（S₁S_s-1300、S_s-1300S₇）的单株，保留母本纯合基因型（S_S-1300S_S-1300）的单株；对保留单株进行人工剥蕾自交，得到F₃种子，同时进行套袋自交，利用亲和指数法（Zhang等，2008）对甘蓝型油菜亲和指数的分类标准，检测亲和性；种植所有单株亲和指数均小于2的F₃家系，根据苗期长势、生育期等确定目标F₃家系，并对其所有单株进行套袋自交，所有单株亲和指数均小于2的F₄家系即为新的自交不亲和系。 

3）取自交亲和的甘蓝型油菜父本‘8400’和‘Bing409’花粉与B中第1）步骤所得F₁杂交得到回交一代（BC₁）种子；种植该BC₁，在苗期分单株提取幼嫩叶片的总DNA，利用B步骤中2）获得的在双亲间有差异扩增引物检测各单株的基因型；拨除具有父本纯合基因型（S₁S₁、S₇S₇）的单株，保留父本杂合基因型（S₁S_s-1300、S_s-1300S₇）的单株；根据苗期长势、生育期等选择部分保留单株，与父本‘8400’和‘Bing409’杂交得到BC₂种子；种植BC₂种子，采用与上述相同的方法选择父本杂合基因型（S₁S_s-1300、S_s-1300S₇）的单株，与父本‘8400’和‘Bing409’杂交得到BC₃种子，继续上述步骤，得到BC₄种子。种植BC₄，分析各单株基因型，对父本杂合基因型的单株进行自交或剥蕾自交，得到BC₄F₂种子。种植BC₄F₂，分析各单株基因型，对母本纯合基因型（S_S-1300S_S-1300）的单株进行自交、利用亲和指数法（参考文献同上）确认其为不亲和性，同时，剥蕾自交得到BC₄F₃，即新的自交不亲和系。 

4）在油菜开花前在F₁植株主花序或生长状态较好的侧枝花序上选取大小在2.5～4mm之间的花蕾，进行小孢子培养。提取经小孢子培养获得的再生苗叶片总DNA（方法见参见《具体实施方式》），利用B中步骤2）的方法获得的在双亲间有差异扩增引物检测每一获得的再生苗的基因型；选择母本纯合基因（S_S-1300S_S-1300）单株进行继代培养，移栽田间；对加倍成功的即双单倍体植株，进行人工剥蕾自交，同时进行套袋自交，利用亲和指数法（参考文献同上）检测亲和性，所有亲和指数小于2的双单倍体植株即为新的甘蓝型油菜自交不亲和系。 

C、分子标记检测技术在甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度鉴定的应用 

1）以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本、与亲和甘蓝型油菜为父本‘8400’和‘Bing409’杂交，得到F1种子；种植甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、父本‘8400’和‘Bing409’和F1杂种，于苗期分单株提取叶片总DNA；利用A中步骤5）获得的多重PCR引物，扩增S-1300和父本‘8400’和‘Bing409’，选择在父母本间有差异扩增带的引物分析F1杂种各单株的基因型，与双亲的扩增带型进行比较，计算父母本杂合基因型的比例，即为杂种纯度。 

在上述发明中，A步骤中的3）所述的与甘蓝型油菜A基因组自交不亲和S位点完全连锁的显性标记引物的DNA序列如下： 

SRK1-1 

正向引物5'-CTTCTGATCATGTTTTGCCTCTG-3'， 

反向引物5'-CGAGATCTTTGGGACCATATTTC-3'； 

SCR1-1 

正向引物5'-TCTGAATCATGAAATCTGCTGT-3'， 

反向引物5'-TTAAAAGGATTCTGCAAAGTTCT-3'； 

SRK-1300 

正向引物5'-GTTCGGTTCACTACGTAAAAAC-3'， 

反向引物5'-CTGAGGAATAATAGGAGATACG-3'； 

SCR7-2 

正向引物5'-GACTTTGACATCTGTTCAAGGT-3'， 

反向引物5'-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3'； 

本发明的积极效果是： 

本发明成功得到甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子检测技术体系包括4个SCAR分子标记SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，及其转化得到的两对多重PCR标记：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用，其中将上述两个标记共同组合的使用效果更好。 

检测自交不亲和系S-1300和亲和甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型，发现S-1300的S单倍型不同于亲和甘蓝型油菜的S单倍型；F2和BC1分离群体个体基因型与其亲和表型一致，证明本发明得到的SCAR分子标记与自交不亲和性紧密连锁，可应用在自交不亲和表型鉴定上。本发明创建了SCAR分子标记技术与杂交、回交、小孢子培养技术结合选育甘蓝型油菜自交不亲和系的方法。本发明创建了SCAR分子标记技术应用于自交不亲和杂种纯度鉴定的方法。利用这些分子标记鉴别自交不亲和表型、辅助育种，可以克服自交不亲和杂种选育过程和杂种纯度鉴定中根据表型选择的缺点，解决选育自交不亲和系和恢复系效率低下因而杂种配合力不高的问题、提高育种效率、促进甘蓝型油菜自交不亲和两系杂种选育方 法快出品种、多出品种、出好品种。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300中BnSRK-1300的核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：2是甘蓝型油菜恢复系8400中BnSRK-1的核苷酸序列及编码区（CDS）。 

序列表SEQ ID NO：4是甘蓝型油菜恢复系8400中BnSP11-1的核苷酸序列。 

序列表SEQ ID NO：5是甘蓝型油菜保持系‘B409’中BnSP11-7的核苷酸序列： 

序列表SEQ ID NO：6是本发明制备的分子标记SRK1-1的核苷酸序列 

序列表SEQ ID NO：7是本发明制备的分子标记SCR1-1的核苷酸序列 

序列表SEQ ID NO：8是本发明制备的分子标记SRK-1300的核苷酸序列 

序列表SEQ ID NO：9是本发明制备的分子标记SCR7-2的核苷酸序列 

图1：本发明的SCAR分子体系的技术流程图。 

图2：本发明的SCAR分子标记应用于选育自交不亲和系的技术流程图。 

图3：甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型SCAR分子标记的开发原理。图中方框所示的位置表示每个标记的引物设计位点。 

图4：SCAR分子标记SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2在甘蓝型油菜S-1300、‘8400’、S-1300×8400F₁、Bing409和S-1300×Bing409F₁基因组DNA的扩增结果。图中标记如下：图4中的扩增结果按照上下泳道顺序依次为分子标记SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2；按照左右顺序泳道依次为甘蓝型油菜S-1300、‘8400’、S-1300×8400F₁、Bing409和S-1300×Bing409。 

图5：多重PCR分子标记的扩增效果。图5中a表示的是多重PCR分子标记SRK1-1+SRK-1300的扩增效果，以Bing409的DNA作为对照；图5中b表示的是多重PCR分子标记SCR7-2+SRK-1300的扩增效果，以‘8400’的DNA作为对照。 

图6：多重PCR分子标记在90份杂种F₁材料中的部分扩增效果。图6中a表示的是多重PCR分子标记SRK1-1+SRK-1300的扩增效果，以亲本S-1300及‘8400’的DNA作为对照；图6中b表示的是多重PCR分子标记SCR7-2+SRK-1300的扩增效果，以亲本S-1300及Bing409的DNA作为对照。 

图7：本发明的利用SCAR分子标记选育得到的自交不亲和系自交结籽情况。图7中.a表示的是自交几乎不结籽的情况；图7中.b表示的是剥蕾自交正常结籽的情况。 

具体实施方式

实施例1 

1、分离群体的获得 

以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300（见文献：马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17（3）：211-213）为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和恢复系‘8400’为父本进行杂交（Gao等.The genetic characterization of self-incompatibility in a Brassica napus line with promising breeding potential，Mol Breed2013,31:485-493）得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与S-1300进行回交，获得BC₁分离群体。同样地，以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和保持系Bing409为父本进行杂交，得到F₁种子，将F₁种子播种得到F₁植株，对该植株套袋自交得到F₂分离群体，取F₁植株花粉与Bing409进行回交，获得BC₁分离群体材料（Tang等CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11in Brassica napus L.Mol Breed，2009，24:245-254）。 

2、油菜基因组DNA的提取 

从本发明计划任务需要进行分子标记检测的甘蓝型油菜小苗（包含普通小苗（非小孢子再生苗）和小孢子再生苗）中提取基因组DNA（即总DNA），具体提取方法参照李佳等（李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13（5）：521-523）报道的方法。 

3、利用亲和指数法判断表型 

当甘蓝型油菜植株的主枝上有3～5朵花开放时，摘除主枝上已开放的花朵和花序中心的小蕾以限制主枝无限生长，然后用硫酸钠纸袋套住主枝和2～3个侧枝，每隔一天把纸袋向上抽提，在抽提的过程中用手轻拍纸袋进行人工辅助授粉。大约10天后，依结籽情况对甘蓝型油菜植株的自交不亲和性做出初步判断（见图7）。对初步判断为自交不亲和的单株要尽可能多的在侧枝上进行剥蕾自交以繁殖种子。油菜成熟收获后，脱粒、考察套袋自交结实情况，按照下列公式计算亲和指数：亲和指数=籽粒数/花朵数。具体方法参见Zhang等（Zhang等，Development of SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L,Molecular Breeding,2008，21:305-315）对甘蓝型油菜亲和指数的分类标准，以指数2为标准，凡亲和指数<2的单株定为自交不亲和，亲和指数≥2的单株定为自交亲和。对自交不亲和单株选择两个分枝进行剥蕾自交收获种子。 

4.生物信息相关分析与引物设计 

序列分析用DNAstar软件处理，序列的比对在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）及华中农业大 学孟金陵教授所在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的芸薹属信息网站（http://122.205.95.67/）中进行，已知序列间的比对用ClusstalX2.0软件处理(Larkin et al.,2007)。引物设计的原则为：引物GC含量为40%-70%，Tm值为60℃-70℃，目标片段长度在400～1300bp之间，引物的长度为20bp-22bp，引物内无二级结构，引物间不能相互配对。所用到的引物均通过Oligo6.0软件设计并由上海生物工程有限公司合成。 

5.PCR扩增条件 

PCR扩增的反应体系：1×PCR buffer，1.35mM MgCl2，0.08mM dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶（上述四种试剂购自MBI Fermentas,Lithuania公司），100ng DNA，正、反向引物（见表1，表2，表3所有引物）各0.45μM，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，复性温度45s，72℃60s，38个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存。反应是在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用1×TAE缓冲液（0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH8.0），电压3V/cm，电泳1.5hrs左右。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP）拍照保存，记录扩增结果。 

6.回收、克隆、测序SCAR标记片段的方法 

将扩增的目标DNA片段从1.2%的琼脂糖胶上用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（购自上海生物工程公司）进行回收。操作程序按试剂盒说明书提供的方法：用刀片挖出目标片段放入1.5ml的离心管，加入Bing Buffer II，置于50-60℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8,000rmp离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rmp室温离心1min，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rmp离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer，室温放置2min；12,000rmp离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。 

取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用表1所示的引物进行PCR扩增，在1.2%的琼脂糖胶检测扩增片段是否为所需的目标片段。如果不是则需要重新扩增回收。如果是所需目标片段则进行下一步TA-克隆操作。回收的目标片段连接在pMDT-18载体（购自宝生物工程大连有限公司代理)。操作程序按该公司提供的试剂盒说明书操作。试剂盒中试剂在使用前先短暂离心将其收集在管底部。在0.5ml的离心管中建立目标片段连接反应体系是Solution I2.5μl，pMDT-18载体0.5μl，DNA2.0μl。 

用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应；准备LB液体培养基和LB固体培养基（含100mg/ml氨苄青霉素（amp）,24mg/ml的异丙基硫代－β-D－半乳糖苷（IPTG）和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷（X-Gal）；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻（大约5min）。离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管（放在冰上预冷）；用手指轻弹装有感 受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec（勿摇动），然后在冰上放置2min；加500μl的LB液体培养基后在37℃振荡培养1.5hrs（150rmp/min）；吸取振荡培养后的转化液100μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-24hrs；蓝、白斑筛选，挑选12个阳性克隆在无菌的液体LB培养基（含50ug/ml的amp）振荡培养16-24hrs；取2μl菌液作PCR模板，用正向引物:R-vm-48（5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'；反向引物M13-47：5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）扩增，在1.2％的琼脂糖胶上检测目标片段是否转化成功。如果所得的片段比目标片段大200bp左右，证明转化成功，编号并吸取300μl送给上海生工公司进行序列测定。剩余200μl浑浊菌液加200μl50％无菌的甘油在1.5ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。 

7.甘蓝型油菜S-1300、‘8400’和Bing409的S单倍型组成的分析 

甘蓝型油菜（AACC）来自于两个二倍体物种白菜（AA）和甘蓝（CC），含有两个S单倍型，分别位于A基因组和C基因组（Okamoto等，Self-compatibility in Brassica napus is caused by independent mutations in S-locus genes，Plant J，2007，50:391-400)报道在其所研究的45份甘蓝型油菜中，C基因组上均有来自于甘蓝的隐性（又称为II类）S单倍型BoS-15，命名为BnS-6。 

表1甘蓝型油菜S-1300、‘8400’和Bing409的S单倍型组成分析所用引物信息 

本发明人利用特异性扩增BnS-6雌蕊决定基因（NCBI基因登录号AB270772）SRK的引物对SRK15-3+4和引物SRK15-5+6(Gao等，The genetic characterization of self-incompatibility in a Brassica napus line with promising breeding potential，Mol Breed，2013,31:485-493)进行本发明的研究。利用引物对SRK15-3+4扩增甘蓝型油菜S-1300、‘8400’和Bing409，均产生了380bp的片段，序列分析表明这三个片段完全一致；引物对SRK15-5/SRK15-6在S-1300、‘8400’和Bing409中也得到了相同的扩增结果，产生的663bp片段也完全一致。序列比对结果表明S-1300、‘8400’和Bing409均含有与甘蓝BoS-15同源的S单倍型，即BnS-6。 

我们使用了I类S单倍型的通用引物组合PS5+PS15与PK1+PK4(Nishio T,Registration of S alleles in Brassica campestris L.by the restriction fragment sizes of SLGs.Theor Appl Genet.1996,92:388–394;Nishio T,Polymorphism of the kinase domain of the S-locus receptor kinase gene(SRK)in Brassica oleracea L.1997,Theor Appl Genet95:335–342).分析A基因组上S单倍型的组成，同时，利用引物组合S40-5+S60-2被用于检测S-1300中的功能位点(Zhang et al.2008a)，引物组合SP11-1L+SP110被用于检测Bing409中的功能位点（Tang等，CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11in Brassica napus L.Mol Breed，2009，24:245-254)。引物PS5/PS15只能在品种‘8400’中有效扩增，扩增所得的的1336bp的片段与BnSLG-1具有99%的序列相似性。引物PK1/PK4也只能在品种‘8400’中有效扩增，扩增所得的897bp的片段与BnSRK-1具有100%的序列相似性，表明来自于品种‘8400’的A基因组S单倍型为BnS-1，属于I类S单倍型。引物组合S40-5+S60-2只能在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300中能有效扩增，扩增所得一个1058bp的片段，序列分析表明该片段与BrSRK-60具有99%的序列相似性，因此推测S-1300含有一个来自BrS-60的II类S单倍型命名为BnS-1300。引物组合SP11-1L+SP110只能在Bing409中能有效扩增，产生一个303bp的片段，序列分析表明该片段与BrSP11-29（NCBI网站的注册号为AB067449）具有100%的序列相似性，表明Bing409的A基因组S单倍型来源于II类隐性的BrS-29，即为BnS-7。所有引物的信息，扩增情况及S单倍型的鉴定结果见表1。 

根据上述结果，甘蓝型油菜S-1300、‘8400’和Bing409在C基因组上具有相同的S单倍型BnS-6，但A基因组上具有不同的S单倍型。因此，区分甘蓝型油菜S单倍型的关键在于区别其A基因组的S单倍型。所有引物扩增产物的回收、克隆和测序详细叙述见实例1步骤6（回收、克隆、测序SCAR标记片段的方法），序列分析在NCBI(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行。 

8.利用同源序列法克隆自交不亲和系S-1300的BnSP11-1300与BnSRK-1300基因 

在BrS-60的序列（GenBank accession no.AB097116）中，由于BrSRK-60基因的序列比较长，依据BrSRK-60的序列我们分别设计了两套引物来克隆BnSRK-S-1300的序列。利用表3所示从S40-1+S40-2到SRK4-7L5+SRK4-7L6的10对引物扩增S-1300基因组DNA，将扩增序列进行拼接，得到了一个长7936bp的片段（可参考已经录入的序列表SEQ ID NO：1）。采用同样的方法，利用表3所示从S60-1-3L1+S60-1-3R1到SRK4-7L3+SRK4-7L2的8对引物在S-1300中的扩增序列进行拼接，得到了一个长7916bp的片段（可参考已经录入的序列表SEQ ID NO：1）。将这两个片段进行序列比对，相似性为100%，表明对BnSRK-1300基因组序列的克隆是准确的。同时以S-1300花蕾的cDNA为模板，利用表3所示引物SRK60-CDNA-1+SRK60-CDNA-2扩增得到了一个长2580bp的片段。将以上测序得到的结果进行序列比对整合BnSRK-1300的基因组序列与CDS序列，得到BnSRK-1300的长度为7967bp（可参考已经录入的序列表SEQ ID NO：1），包含7个外显子与6个内含子。序列比对分析发现，BnSRK-1300与BrSRK-60(GenBank accession no.AB097116)的CDS序列具有100%的相似性，但是他们的基因组序列在内含子1，内含子3与内含子5却分别有数个碱基的差异。 

克隆自交不亲和基因BnSP11-1300与BnSRK-1300所用引物的信息均列在表2中。 

表2克隆BnSP11-1300与BnSRK-1300基因的引物 

9.利用同源序列法克隆甘蓝型油菜‘8400’的BnSRK-1与BnSP11-1基因 

由于甘蓝型油菜‘8400’的A基因组S单倍型为BnS-1，与BoS-15高度同源，因此，我们根据BoS-15序列设计了引物用于克隆BnSRK-1与BnSP11-1基因，引物信息列于表3。 

采用Trizol Reagent法提取‘8400’成熟花蕾的mRNA，然后使用RevertAid(Fermentas)试剂盒进行反转录反应（按试剂盒自带的说明书操作），产生cDNA。以cDNA为模板，用引物SRK1-CDS-1+SRK1-CDS-2进行扩增，对扩增的片段进行回收、克隆、测序得到一个长度为2556bp的片段（可参考已经录入的序列表SEQ ID NO：2），该片段包含BnSRK-1基因的全长CDS序列。序列分析表明，该片段与甘蓝型油菜品系Westar中克隆的BnSRK-1基因CDS序列具有100%的相似性(BnSRK-1基因登录号：GenBank Accession No：AB270767.1)。 

利用表3所示的4对引物S1D1+S1D5、S1D6+S1D7、S1D16+S1D17和S1D18+S1D19扩增‘8400’基因组DNA，将PCR扩增产物进行回收、克隆、测序，得到了4个大小不同的序列。将这些序列进行拼接，得到了一个包含BnSP11-1基因编码区全长为4387bp的序列（参见：序列表SEQ ID NO：4，）序列比对分析发现，该序列与甘蓝型油菜品系Westar中克隆的BnSP11-1基因具有99%的序列相似性，但在内含子区的不同位置存在3个碱基的缺失和一个2bp的转换。 

表3克隆‘8400’中自交不亲和基因BnSRK-1与‘B409’中的BnSP11-7基因所用的引物 

10.利用同源序列法克隆甘蓝型油菜Bing409的BnSP11-7基因 

根据Tang等（Tang等CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11in Brassica napus L.Mol Breed，2009，24:245-254)对保持系Bing409的研究和甘蓝型油菜S单倍型BnS-7的序列，我们设计了引物克隆保持系Bing409BnSP11-7基因，引物信息如表3所示。用引物SCR29-3/SCR29-4特异性扩增Bing409基因组DNA，将PCR产物进行回收、克隆、测序得到长度为1784bp的片段（可参见已录入序列SEQ ID NO：5），包含了BnSP11-7的基因编码序列及其5’侧翼序列和启动子序列，与白菜BrSP11-29全长CDS序列(NCBI登录号AB067449.1)序列比对相似性为100%。 

11.甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型分子检测技术的创建 

通过对甘蓝型油菜S-1300、‘8400’和Bing409的自交不亲和S位点基因的序列进行比较，根据序列的差异设计引物，开发标记，建立了甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的分子检测技术。所有标记的开发原理列于图3。 

依据BnSRK-1基因的CDS序列，开发了一个S单倍型BnS-1特异的分子标记SRK1-1，该标记只在‘8400’与S-1300×8400F₁中有效扩增，而不在S-1300和Bing409及S-1300×Bing409F₁中扩增（图4）。对扩增片段进行回收、克隆、测序，发现其长度为883bp（参见：序列表SEQ ID NO：6）。采用与上述相同的方法，依据BnSP11-1的序列，开发了另一个S单倍型BnS-1特异的分子标记SCR1-1。与SRK1-1一样，SCR1-1只在‘8400’与S-1300×8400F₁中有效扩增，而不在S-1300和Bing409及S-1300×Bing409F₁中扩增（图4），对扩增片段进行回收、克隆、测序，发现其长度为412bp（参见：序列表SEQ ID NO：7）。 

根据甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300中自交不亲和基因BnSRK-1300的序列开发了一个自交不亲和性的分子标记SRK-1300，该标记能扩增产生一个472bp的片段（参见：序列表SEQ ID NO：8），但只能在自交不亲和系S-1300及其配置的S-1300×8400F1和S-1300×Bing409F1中有效扩增，而不能在‘8400’和Bing409中扩增（图4）。 

Tang等（CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11in Brassica napus L.Mol Breed，2009，24:245-254)开发了一个甘蓝型油菜S单倍型BnS-7特异性的分子标记，现命名为SCR7-1，该标记能扩增产生一个303bp的片段（参见：序列表SEQ ID NO：9）。我们在该分子标记扩增片段的基础上进行重新开发，得到了另一个甘蓝型油菜中S单倍型BnS-7特异性的分子标记SCR7-2，其长度为230bp（参见：序表SEQ ID NO：9），，与SCR7-1具有相同的扩增结果（图4）。 

表4自交不亲和分子标记体系中分子标记的引物序列及扩增结果信息 

为了在分子标记辅助育种过程中更好地应用开发的分子标记，将SCAR分子标记SRK1-1和SCR7-2 分别与SRK-1300进行组合，摸索扩增条件，成功得到了两个多重PCR分子标记，可用于鉴定S单倍型BnS-1、BnS-7和BnS-1300。分子标记组合SRK-1300+SRK1-1能有效区分自交不亲和系S-1300、‘8400’、S-130×8400F1的基因型，而不能在Bing409中得到扩增结果（图5）。分子标记组合SRK-1300+SCR7-2能有效区分S-1300、Bing409与S-130×Bing409F1的基因型，而不能在‘8400’中得到扩增结果（图5）。 

多重PCR分子标记的扩增条件如下： 

分子标记SRK-1300与SRK1-1的组合扩增条件： 

PCR扩增条件：94℃，4分钟；94℃，30秒，57℃，35秒，72℃，1分钟，循环35次；72℃,10分钟。 

分子标记SRK-1300与SCR7-2的组合扩增条件： 

PCR扩增条件：94℃，4分钟；94℃，30秒，55℃，35秒，72℃，1分钟，循环35次；72℃,10分钟。 

12.甘蓝型油菜自交不亲和位点基因型与表型的连锁关系 

在S-1300×8400的杂交组合中，F₁单株均正常结籽，表现为自交亲和，表明相对于‘8400’的自交亲和性，S-1300的自交不亲和性是一个隐性性状。在分离群体S-1300×8400F₂中，表现为亲和的植株有131株，表现为不亲和的植株有37株，符合孟德尔3:1(χ²=0.643)的分离比例；在BC₁的分离群体中，表现为亲和的植株有54株，表现为不亲和的植株有47株，符合孟德尔1:1(χ²=0.356)的分离比例（详见表5）。 

表5分离群体F₂与BC₁的亲和表型调查 

群体

植株数目

亲和

不亲和

分离比

χ2

[0112] 

(S-1300×8400)F2	168	131	37	3:1	0.643
						(S-1300×8400)×S-1300BC1	101	54	47	1:1	0.356
(S-1300×Bing409)F2	436	105	331	3:1	0.1498
						(S-1300×Bing409)×Bing409BC1	132	69	63	1:1	0.1894

在S-1300×Bing409的杂交组合中，F₁单株均不能正常结籽，表现为自交不亲和，表明相对于保持系Bing409的保持性，S-1300的自交不亲和性是一个显性性状。按照相同的方法，调查分离群体的表型。从表7中可以看出，在分离群体F₂中，不亲和的植株有331株，亲和的植株有105株，符合孟德尔3:1(χ²=0.1498)的分离比例；在BC₁的分离群体中，亲和的植株有69株，不亲和的植株有63株，符合孟德尔1:1(χ²=0.1894)的分离比例。 

在S-1300×8400F₂中，自交不亲和植株全部为SRK-1300纯合基因型，亲和植株全部含有标记SRK1-1，其中90株为SRK1-1和SRK-1300杂合基因型、41株为SRK1-1纯合基因型。在(S-1300×8400)×S-1300BC₁中，自交不亲和植株全部为SRK-1300纯合基因型，亲和植株全部为SRK1-1和SRK-1300杂合基因型，基因型与表现型完全一致（表6）。 

表6分离群体‘S-1300×8400’F₂和(S-1300×8400)×S-1300BC₁的表型与基因型鉴定 

aSCAR分子标记扩增结果。‘+’：有扩增带；‘-’：无扩增带。 

b表示的是表型调查的植株数目。SC：亲和植株数；SI：不亲和植株数。 

在S-1300×Bing409F₂中，105亲和植株全部为标记SCR7-2纯合型，自交不亲和植株中115株为SRK-1300纯合基因型、216株为SCR7-2和SRK-1300杂合基因型。在(S-1300×Bing409)×Bing409BC₁中，亲和植株全部为SRK-1300纯合基因型，自交不亲和植株全部为SCR7-2和SRK-1300杂合基因型，基因型与表现型完全一致（表7）。 

表7分离群体S-1300×Bing409F₂和(S-1300×Bing409)×Bing409BC₁的表型与基因型鉴定 

a SCAR分子标记扩增结果。‘+’：有扩增带；‘-’：无扩增带。 

b表示的是表型调查的植株数目。SC：亲和植株数；SI：不亲和植株数。 

以上研究结果表明S-1300的自交不亲和性在遗传上受单位点控制，符合孟德尔遗传规律；甘蓝型油菜自交不亲和位点基因型与表型完全连锁，可以预测表现型。 

13.甘蓝型油菜自交不亲和位点S单倍型的检测 

利用上述自交不亲和分子标记体系检测了90份自交亲和的甘蓝型油菜自交系与自交不亲和系S-1300的S位点单倍型。所有的材料都能被SRK15-3+4有效扩增，表明这些材料C基因组上均含有一个共同的S单倍型BnS-6。标记SRK-1300只能在自交不亲和系S-1300中出现，说明自交不亲和系S-1300具有特异的S单倍型。SRK1-1能在47份自交系中有效扩增，说明这些材料的A基因组上均含有S单倍型BnS-1，剩下的43份材料能被SCR7-2有效扩增，表明这些材料含有S单倍型BnS-7（扩增结果见表8）。 

表8亲本材料的来源，用自交不亲和分子标记的扩增效果及杂种F₁的表型 

a表示杂种F₁的表型，SI：自交不亲和；SC：自交亲和。 

+：有效扩增；-：没有扩增。 

本发明检测到甘蓝型油菜C基因组上只有1种自交不亲和S位点单倍型、A基因组上有3种自交不亲和S位点单倍型（表9），说明该分子检测技术能有效鉴定油菜中S位点的基因型。 

自交不亲和系S-1300的A基因组上具有独特的自交不亲和S位点单倍型，该分子检测技术可用于自交不亲和系选育和自交不亲和杂种纯度鉴定。 

表9自交不亲和系S-1300及91份自交系的基因型，杂种的的表现型统计结果 

注：‘+’：有扩增带；‘-’：无扩增带。 

14.甘蓝型油菜自交不亲和位点SCAR标记检测技术与杂交育种方法结合选育自交不亲和系 

2008年3月，在中国湖北武汉华中农业大学试验农场以自交不亲和系甘蓝型油菜S-1300为母本，与自交亲和的油菜品种浙油18（中国公开推广的油菜品种）杂交，得到杂种一代（F₁）种子。2008年9月播种F₁种子，两行约20植株。2009年3月对F₁进行套袋自交，结籽正常；油菜角果成熟后，收获F₁植株自交种子，得到F₂种子。2009年9月播种F₂种子，8行约80株；当年11月中旬的油菜7-8叶期，取植株幼嫩的心叶，两个亲本S-1300和浙油18取混合样，F₂群体分单株、每株取1-2克，利用常规方法抽取DNA，利用SCAR标记SRK-1300和SRK1-1检测各植株的基因型。2010年3月对F₁植 株进行套袋自交，对只有SCAR标记SRK-1300的植株进行剥蕾自交。角果成熟时，检测亲和指数，发现在所有套袋自交的48植株中，有10株结籽很少，判定为自交不亲和，其余38株都结籽正常。分子标记检测的结果表明，10株自交不亲和植株全部只有SCAR标记SRK-1300扩增带，为母本S-1300纯合基因型；13株自交亲和植株只有SCAR标记SRK1-1扩增带，为父本浙油18纯合基因型。另外的25株亲和油菜为父母本杂合基因型。油菜角果成熟后，收获具有母本S-1300纯合基因型的F₂植株剥蕾自交种子，得到F₃种子。2011年9月播种F₃种子，共计两行约20植株，于苗期分单株取幼嫩叶片1-2克抽取DNA，利用SCAR标记SRK-1300和SRK1-1检测基因型，发现被检测的15植株均为只有SCAR标记SRK-1300扩增带，为母本S-1300纯合基因型。2012年春天，根据苗期长势我们选择了10株进行套袋自交和剥蕾自交，收获F₃植株剥蕾自交种子得到F₄。2012年9月播种F₄种子，共10个系、每系两行约20植株。2012年春天，根据苗期长势、生育期等确定目标F₄家系4个，并对其所有单株进行套袋自交，每系选择3单株进行人工剥蕾，在4个家系被调查的48株油菜中，全部为自交不亲和，确认为新的自交不亲和系。 

各世代表型和基因型调查结果列于表10。 

表10自交不亲和系选育过程植株基因型和表现型的检测结果 

a SCAR分子标记扩增结果。‘+’：有扩增带；‘-’：无扩增带。 

b括号内表示的是植株表现型。 

15.甘蓝型油菜自交不亲和位点SCAR标记检测技术与回交育种方法结合选育自交不亲和系 

2010年春天，在华中农业大学试验农场以自交不亲和系S-1300为母本，与自交亲和的甘蓝型油菜品种华双5号（中国公开推广的油菜品种）杂交，得到杂种一代（F1）种子。2010年夏天，在中国甘肃省和政县华中农业大学西北油菜试验基地，取甘蓝型油菜品种华双5号花粉与F₁杂交得回交一代（BC₁）。2010年秋天种植BC₁种子，3行约30单株。利用多重PCR标记组合SRK-1300+SRK1-1和SRK-1300+SCR7-2扩增S-1300和华双5号，发现多重PCR标记组合SRK-1300+SCR7-2在S-1300和华双5号均有一条有差异的扩增带，可以用来选择回交群体杂合基因型的植株，而多重PCR标记SRK-1300+SRK1-1只在母本S-1300中扩增，不能鉴别父本纯合和杂合两种基因型。在当年12月中旬油菜越冬前，选择苗期长势好的10个单株挂牌，分单株取幼嫩叶片1-2克，抽取总DNA（按前述通用方法），利用多重PCR标记组合SRK-1300+SCR7-2检测各单株的基因型，拔除父本纯合基因型植株、保留父母本杂合基因型的植株4株。2011年3月以4株父母本杂合基因型植株为母本分别与华双5号杂交得到BC₂，混合收获。2011年夏天，将BC₂种子种植在甘肃省和政县华中农业大学西北油菜试验基地，3行约30单株，根据苗期长势选择12株挂牌、取叶片抽取总DNA，检测基因型，保留父母本杂合基因型植株5株。在油菜开花期取华双5号花粉进行杂交得到BC₃，混合收获BC3种子。2011年9月播种BC₃种子，3行约30单株，根据苗期长势选择20株挂牌、取叶片抽取总DNA，检测基因型，保留父母本杂合基因型植株8株。2012年春天，进行套袋自交和剥蕾自交，8株油菜的亲和指数均小于2，为自交不亲和，收获剥蕾自交种子得到BC₃F₂，混合收获BC₃F₂种子。2012年夏天，将BC₂F₂种子种植在甘肃省和政县华中农业大学西北油菜试验基地，5行约50单株，根据苗期长势选择30株挂牌，取叶片抽取总DNA，检测基因型，保留母本纯合基因型植株8株。油菜开花期进行套袋自交和剥蕾自交，8株油菜自交结籽均很少，为自交不亲和，分单株收获剥蕾自交得到BC₃F₃。2012年9月分株系播种BC₃F₃种子，每株系2行约20单株。2013年春天，根据长势和整齐性选择植株套袋自交，每系选10株左右，其中5株进行大量的剥蕾自交，并取叶片抽取总DNA，检测基因型。亲和性调查结果为所有植株亲和指数均小于2，为自交不亲和，基因型检测结果为全部是母本纯合基因型。各世代表型和基因型调查结果列于表10。 

16.甘蓝型油菜自交不亲和位点SCAR标记检测技术结合小孢子培养技术选育自交不亲和系 

2009年春天，在华中农业大学试验农场以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300为母本，与甘蓝型油菜自交亲和的油菜品种Bing409杂交（该品种具有株型直立、抗倒伏、抗病害等优点），得到杂种一代（F₁）种子。2009年秋天种植F₁种子；2010年春天，油菜开花前取F₁植株大小合适的花蕾，进行小孢子培养（小孢子培养技术参见文献：Mathias R等.An improved in vitro-culture procedure for embryoids derived from isolated microspores of rape(Brassica napus L.).Plant Breed,1988100:320-322.）；利用多重PCR标记SRK-1300+SRK1-1和SRK-1300+SCR7-2扩增S-1300和Bing409，发现多重PCR标记组合SRK-1300+SCR7-2在S-1300和华双5号均有一条有差异的扩增带，因此其被用来检测分离群体植株的基因型，而多重PCR标记组合SRK-1300+SRK1-1只在母本S-1300中扩增。小孢子培养具体步骤为：(1）取花蕾：上午温度低于20°C以前取油菜花序上2～4mm大小的蕾。（2）花粉的培养（全程无菌操作）：挑选好的花蕾先用75%的酒精消毒30s，转入0.1%的升汞消毒10min，然后用无菌水洗涤三次，每次5min；在U型管中加少量B5液体培养基（本实施例的具体培养基的配方及pH见Mathias R等.1988），研磨花蕾，将悬浮液用双层纱布过滤；将滤液先800r/min离心5min，去上清，加入B5液体培养基，再离心去上清；将离心得到的花粉用NLN16液体培养基（本实施例的具体培养基的配方及pH）悬浮起后导入培养皿，32°C暗培养48～72h.然后800r/min离心5min后去上清，底部花粉用NLN13液体培养基悬浮起后，于培养皿中25°C培养至胚状体出现。（3）叶型胚培养：胚状体出现后将培养皿移到50r/min的摇床上，子叶胚形成后转移到B5固体培养基上，光照培养。（4）再生植株继代：胚状体发育成再生植株，每个再生植株上切1～3个不定芽，转接到B5固体培养基的锥形瓶中，光培养。成苗后移栽到大棚炼苗。 

本实施例共得到178个再生苗，取再生苗叶片抽取总DNA，利用多重PCR标记组合SRK-1300+SCR7-2检测基因型，其中68个再生苗只有标记SRK-1300，110个再生苗只有标记SCR7-2。淘汰110个只有标记SCR7-2的再生苗，对具有标记SRK-1300的68个再生苗进行继代培养。2010年10月，将继代培养的苗子移栽至大田，最终成苗53株。2011年春天，开花期发现14株表现出分支多，花朵小和不育等特点，为未加倍的单倍体，其余39株均开花正常，对这些植株进行套袋自交和剥蕾自交，成熟期检测到所有植株的亲和指数均小于2，判定为自交不亲和。2011年秋天种植DH（双单倍体）种子，每系1行约10株；2012年春天，对所有植株进行套袋自交，并取叶片抽取总DNA，检测基因型。亲和性调查结果为所有植株亲和指数均小于2、为自交不亲和，基因型检测结果为全部是母本纯合基因型。各世代表型和基因型调查结果列于表10。 

17.甘蓝型油菜自交不亲和位点SCAR标记检测技术检测自交不亲和杂种纯度 

2011年春天，以S-1300为母本、与90份亲和甘蓝型油菜(zhang等，2008，TAG)杂交，得到90份F1种子，同时，取幼嫩叶片1-2克，抽取DNA，利用多重PCR标记SRK-1300+SRK1-1和SRK-1300+SCR7-2分析S-1300和90份亲和甘蓝型油菜的S位点基因型，每份材料只产生一个标记，其中，标记SRK-1300只在S-1300中出现，47份亲和甘蓝型油菜有标记SRK1-1，剩余的43份亲和甘蓝型油菜有标记SCR7-2。 

2011年秋天，种植S-1300、父本（90份材料）和F1杂种，S-1300和父本各1行约10株，F1杂种3 行约30株；苗期分单株取幼嫩叶片1-2克，每份F1随机取20单株，抽取总DNA，检测S位点基因型，统计具有母本基因型、父本基因型和父母本杂合基因型的F1植株数，计算父母本杂合基因型植株占总调查植株数的比例，即杂种纯度。实际结果列于表11。 

表11本发明的SCAR分子标记检测杂种纯度的结果 

表11的说明：注：‘+’：有扩增带；‘-’：无扩增带。 

杂种纯度（%）=杂合基因型植株数/20株×100。 

Claims (4)

1.人工创造的用于鉴别甘蓝型油菜自交不亲和S单倍型的SCAR分子标记，其特征在于所述的分子标记为：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2，将上述4个SCAR分子标记进行组合得到如下所述的2对双重PCR标记组合：SRK1-1+SRK-1300组合及SCR7-2+SRK-1300组合，上述双重PCR标记组合为共同组合使用或单独使用；

上述分子标记对应的核苷酸序列如下所述：

SRK1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

SCR1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

SRK-1300的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

SCR7-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜自交不亲和系遗传改良中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜自交不亲和系选育中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜自交不亲和杂种纯度鉴定中的应用。

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