CN112118731A - 自交亲和性甘蓝植物及其培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代。根据本发明，提供了具有自交亲和性的甘蓝植物。由此，可针对甘蓝植物提供能够实施稳定且高效的原种种子生产的技术手段。

Description

自交亲和性甘蓝植物及其培育方法
对相关申请的引用
本申请基于作为在先日本专利申请的日本特愿2018-030872号(申请日：2018年2月23日)主张优先权权益，日本特愿2018-030872号的全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及赋予了自交亲和性(self compatibility，SC)的甘蓝(Brassica oleracea)植物。更详细而言，本发明涉及通过向甘蓝作物原本具有的自交不亲和性(selfincompatibility，SI)基因导入功能缺失型的基因座来克服制种方面的问题的技术。
背景技术
十字花科植物是起源于中近东、地中海沿岸的植物种，芸薹(Brassica)属植物中包含农业上极为重要的作物。其中，甘蓝种(Brassica oleracea)是极为重要的植物种，其包括B.oleracea var.capitata(卷心菜)、B.oleracea var.italica(西兰花)、B.oleraceavar.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleraceavar.gongyloides(苤蓝)、B.oleracea var.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、B.oleraceavar.albograbra(芥蓝)等。
以甘蓝为代表的许多十字花科植物具有“自交不亲和性”的性质，即，即使与具有和自体相同的S单倍型(haplotype)的植物的花粉交配，柱头上的花粉萌发、花粉管伸长也会受到阻碍而无法受精。利用该性质，在十字花科作物中，自20世纪60年代起确立了用于向市场提供杂交第一代(F1)品种的大规模制种体系，各种苗公司对F1品种积极进行了开发。继承双亲的优异性质的F1品种与原生品种、固定种相比，品种内的一致性高、显示出适应各种环境的优异能力，因此商业利用价值高，在许多国家得到利用。
对F1进行制种的具体方法中，在同一场圃中栽培具有某种S单倍型的亲本株系、和具有其他S单倍型的亲本株系，介由利用了蜜蜂等的虫媒来进行群体交配。该过程中当然也将接受自体花粉、来自相同株系的花粉，但由于SI的性质而使得自这些花粉的萌发、花粉管伸长受到阻碍，因此不会形成自交种子(selfed seed)。另一方面，自具有不同的S单倍型的株系受粉的情况下，发生正常的受精而进展至形成F1种子。
如上所述，植物原本具有的SI在F1制种体系中的利用价值高，但另一方面也存在问题。
作为一种生物学现象，SI的功能的呈现并非是完美的，其强度根据遗传背景、S单倍型的种类、环境因素而变化，存在自体花粉的花粉管伸长未被阻止从而以一定比例混入了由自花受精产生的自交种子的问题。
为了解决该问题，迄今为止，育种人员从甘蓝内存在的许多S单倍型中筛选出了SI的功能强效呈现的株系。尽管如此，在进行大规模商业水平上的制种时，仍然无法完全避免混入自交种子。
作为F1种子提供的商品中包含了这样的自交种子的情况下，不仅会降低品种的价值，也会酿成对于种苗公司而言重要的亲本株系流出至其他公司的问题。
作为解决前述问题的手段，进入20世纪90年代后，开始实施利用了细胞质雄性不育性(cytoplasmic male sterility，CMS)的F1制种。所谓CMS，是在细胞质基因组内具有引起雄性不育的致病基因的母系遗传性状。根据作物的不同，也存在不育性状的表现不稳定的种，但甘蓝的CMS非常稳定，不易受到环境的影响，因此能够实现高纯度的F1种子生产。
另一方面，十字花科作物原本具有的SI得以维持，在为了进行F1制种而增殖亲本株系(原种增殖)的情况下，SI作为不理想的性质而残留。
即，在利用了CMS的F1制种体系中，完全不需要SI的性质，但由于无论哪个亲本株系均具有SI，因此存在即使进行通常的交配也几乎不发生自花受精、无法高效地进行自交种子的增殖的问题。另外还存在下述问题：在F1制种时的亲本株系彼此具有相同的S单倍型的情况下，也无法对将它们组合而得到的F1进行制种。
迄今为止，还针对用于打破自交不亲和性(SI)的方法进行了各种研究。例如，通过(i)利用手动交配进行蕾期授粉的方法、(ii)使已开放的花暴露于CO2的方法、或(iii)实施将NaCl水溶液散布至花等操作的方法，尝试了原种增殖(文献T.Guohua等，CruciferaeNewsletter(1986)p75(非专利文献1))。
然而，存在利用手动交配的蕾期授粉耗费时间和劳力、难以进行大规模的生产、CO2处理和NaCl处理依赖于各株系的遗传背景、S单倍型从而SI打破效果不稳定的问题，所有种苗公司均在原种增殖方面持续陷入困境(文献Niikura等，Theor Appl Genet(2000)vol.101p1189(非专利文献2))。
需要说明的是，作为相关的现有技术，例如，日本专利4346933号(专利文献1)中记载了十字花科植物的S基因型鉴定方法。另外，国际公开公报WO2014/115680A(专利文献2)中，记载了具有自交亲和性的十字花科植物的繁育方法。然而，该文献中以芜菁种(Brassica rapa)作为对象，其虽然同为芸薹属植物，但与甘蓝种完全不同。本领域技术人员熟知，即使植物的“属”相同，只要“种”不同，则针对某一“种”的见解仍然无法直接适用于其他的“种”。
如上所述，尚未报道在利用了CMS的甘蓝的F1种子制种体系中高效且稳定地增殖原种株系的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利4346933号
专利文献2：国际公开公报WO2014/115680A
非专利文献
非专利文献1：Cruciferae Newsletter(1986)p75 T.Guohua等，“Use of CO2 andsalt solution to overcome self-incompatibility of Chinese cabbage(B.campestris spp.Pekinensis).”
非专利文献2：Theor Appl Genet(2000)vol.101p1189 S.Niikura等，“Geneticanalysis of the reaction level of self-incompatibility to a4％CO2 gastreatment in the radish(Raphanus sativus L.).”
非专利文献3：Breeding Science(2003)vol.53p199 M.Watanabe等，“Recentprogress on self-incompatibility research in Brassica species.”
非专利文献4：Theor Appl Genet(1996)vol.92p388,T.Nishio等，“Registrationof S alleles in Brassica campestris L by the restriction fragment sizes ofSLGs.”
非专利文献5：Breeding Science(2004)vol.54p291 A.Horisaki等，“Effectiveness of insect-pollination to evaluate the level of self-incompatibility and genetic variation in Brassica rapa L.”
非专利文献6：Proc Natl Acad Sci(1997)vol.94p7673 M.Kusaba等，“Strikingsequence similarity in inter-and intra-specific comparisons of class I SLGalleles from Brassica oleracea and Brassica campestris:Implications for theevolution and recognition mechanism.”
非专利文献7：Plant Cell(2007)vol.19p3961 M.Kitaura等，“Two distinctforms of M-locus protein kinase localize to the plasma membrane and interactdirectly with S-locus receptor kinase to transduce self-incompatibilitysignaling in Brassica rapa.”
非专利文献8：Plant Cell(2012)vol.24p4607 E.Indriolo等，“The ARC1 E3ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species andhas a conserved role in Arabidopsis lyrata self-pollen rejection.”
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于针对甘蓝植物提供能够实施稳定且高效的原种种子生产的技术手段。另外，本发明的目的还在于针对甘蓝植物确立无论在怎样的亲本株系之间均能实施F1制种而无需关注亲本S单倍型的技术。
用于解决课题的手段
一直以来，本申请的发明人为了针对甘蓝植物开发能够实施稳定且高效的原种种子生产的技术而反复进行了深入研究。从大量研究中，本申请的发明人注意到了甘蓝植物原本具有的自交不亲和性。
本申请的发明人认为，如果能利用缺失了自交不亲和性的功能的自交亲和性基因，则能实现自体交配或与相同S单倍型的交配，从而即使不进行特殊的处理也能够高效地增殖原种，不仅如此，具有相同S单倍型的亲本株系之间的F1也能进行制种。
作为自交亲和性株系的具体利用方法，例如，将用于交配的纸袋套在已开花的花序上，仅施以用手拍打袋等物理性冲击而使自体花粉附着于柱头，从而发生受精。进行大规模的制种的情况下，也可以通过蜜蜂等的虫媒授粉来高效且大量地得到自花受精种子。
尽管如上所述的方法具有这样大的商业优势，但在西兰花、卷心菜等主要的甘蓝作物中却并未利用该方法，这是因为在这些作物中不存在自交亲和性的遗传资源。
本申请的发明人广泛调查了甘蓝种和其近缘物种的遗传资源，重复S单倍型的DNA分析、交配试验而进行了深入研究。耗费巨大劳力进行各种调查、研究的结果是，成功地从坂田种苗株式会社持有的遗传资源中发现了芥蓝“K-3”株系、甘蓝野生种“T-16”株系、及花椰菜“CF-33”株系具有SC的性质。
芥蓝、甘蓝野生种、花椰菜是西兰花、卷心菜的近缘物种，但对于用作育种原材料的目的而言，具有许多对于对象作物的不良性状，因此一直以来存在难以进行利用等问题。尤其在这些种中，在S基因座附近存在许多对表观性状造成影响的因子，因此仅通过简单进行回交而无法高效地培育亲本株系的情况是常见的。
因此，本申请的发明人对S等位基因附近进行了详细分析，经过大规模群体中的回交，从而成功地培育出导入了SC的高品质西兰花、卷心菜。
如此，本申请的发明人发现了具有自交亲和性的甘蓝株系，并证明了其能够培育产业利用价值高的育种株系。并且，通过利用根据本发明的自交亲和性的甘蓝植物、或自交亲和性株系的培育方法，能够培育新的自交亲和性株系，而通过利用该株系，能够实施稳定的原种种子生产。进而，通过利用如此培育的株系，能够开发新组合的F1品种，而无需关注用于繁育F1品种的亲本双方的S单倍型。
本发明是基于上述见解的发明。
即，根据本发明，可提供以下的发明。
＜1＞具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代。
＜2＞前述＜1＞的具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代，其是自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因被自交亲和性的甘蓝植物的位于S基因座的基因置换而成的。
＜3＞前述＜1＞或＜2＞的具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代，其是通过将自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配、从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体而得到的。
＜4＞前述＜1＞～＜3＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物，其在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
＜5＞前述＜4＞的甘蓝植物、或其后代，其通过向自交不亲和性基因座导入包含所述(a)～(c)中任一者的DNA的S等位基因而成为自交亲和性。
＜6＞前述＜1＞～＜5＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物、或其后代，所述自交亲和性甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
＜7＞甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”。
＜8＞甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”。
＜9＞前述＜7＞或＜8＞的甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其中，基因座“BoS-SC1”具有下述(i)～(iii)的碱基序列：
(i)序列号1所示的碱基序列；
(ii)与序列号1所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(iii)将序列号1所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
＜10＞前述＜7＞～＜9＞中任一项的甘蓝植物、或其后代，所述甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
＜11＞甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”。
＜12＞甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”。
＜13＞前述＜11＞或＜12＞的甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其中，基因座“BoS-SC2”具有下述(I)～(III)的碱基序列：
(I)序列号2所示的碱基序列；
(II)与序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(III)将序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
＜14＞前述＜11＞～＜13＞中任一项的甘蓝植物、或其后代，所述甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
＜15＞由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花、或其后代。
＜16＞由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花、或其后代。
＜17＞前述＜1＞～＜16＞中任一项的植物或其后代的植物体的一部分。
＜18＞前述＜1＞～＜16＞中任一项的植物或其后代的种子。
＜19＞具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的培育方法，其包括将自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配、从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体的步骤。
＜20＞前述＜19＞的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交亲和性的甘蓝植物的自交亲和性与位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因关联。
＜21＞前述＜19＞或＜20＞的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交亲和性的甘蓝植物在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
＜22＞前述＜19＞～＜21＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其包括：以个体具有前述＜21＞的(a)～(c)中任一者的DNA作为指标来筛选自交亲和性植物，从而从杂交后代中筛选自交亲和性的个体。
＜23＞前述＜19＞～＜22＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其还包括：使用位于与包含与自交亲和性关联的基因的S基因座非常接近的区域(距S基因座0～4cM)的DNA标记来判别基因型，筛选具有自交亲和性的个体。
＜24＞前述＜19＞～＜23＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其包括：将前述的自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)作为回交亲本株系来进行连续回交。
＜25＞前述＜19＞～＜24＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，前述的自交亲和性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种、由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种、由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种、或由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种。
＜26＞前述＜19＞～＜25＞中任一项的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交不亲和性的甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
＜27＞甘蓝植物的自交亲和性的检测用标记，其具有下述(A)～(C)中任一者的碱基序列：
(A)序列号1或序列号2所示的碱基序列；
(B)与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(C)将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
＜28＞甘蓝植物的制种方法，其包括将通过前述＜19＞～＜26＞中任一项的培育方法得到的自交亲和性甘蓝植物、或其后代自交繁殖并制种的步骤。
＜29＞维持或增殖有用的杂交第一代株系的亲本株系的方法，其中，使用前述＜19＞～＜26＞中任一项的培育方法来维持或增殖有用的杂交第一代株系的亲本株系。
＜30＞用于对甘蓝植物的S基因座附近区域进行基因型分析的标记，其具有序列号10～15所示的碱基序列中的任意一者以上。
＜31＞利用了细胞质雄性不育(CMS)的甘蓝的杂交第一代种子的制种方法，所述方法包括下述步骤：
利用具有自交亲和性的甘蓝植物，使杂交第一代株系的亲本株系增殖。
＜32＞前述＜31＞的制种方法，其中，前述的具有自交亲和性的甘蓝植物在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
＜33＞前述＜31＞或＜32＞的制种方法，其中，前述的具有自交亲和性的甘蓝植物为下述1)～6)中任一者：
1)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
2)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
3)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
4)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
5)由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花、或其后代；及
6)由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花、或其后代。
发明效果
通过利用根据本发明的具有自交亲和性性状的甘蓝植物，能够培育制种性优异的新的甘蓝亲本株系。通过利用如此繁育的SC株系，用于采集F1种子的亲本株系的原种增殖变得高效。因此，能够大幅度削减一直以来所需的交配劳力，缩小制种场圃的栽培面积。此外，可期待在以往的SI株系中屡屡成为问题的原种种子的稳定供给方面也有较大贡献。
另外，通过利用如此培育的株系，能够开发新组合的F1品种，而无需关注用于F1制种的制种亲本的S单倍型。由此能够拓宽F1品种的范围，从而拓宽育种的可能性本身。
附图说明
[图1]示出实施例2中的各代的西兰花(盆植栽培)的植株外形(grass figure)。图中，(a)示出在回交中使用的SI系的优良株系(elite line)“BR-9”的植株外形，(b)示出回交的中途阶段的植株外形，以及(c)示出BC进行至成为与BR-9同样的植株外形而得到的SC株系“SC-BR-9”的植株外形。
[图2]示出实施例2中培育的西兰花(场圃栽培)。图中，(a)示出在回交中使用的SI系的优良株系“BR-9”的植株外形，(b)示出BC进行至成为与“BR-9”同样的植株外形而得到的SC株系“SC-BR-9”的植株外形，以及(c)示出将“SC-BR-9”置换为CMS细胞质而得到的株系“CMS-SC-BR-9”的植株外形。
[图3]示出实施例3的网室制种试验的结果(“SC-BR-9”、及“CMS-SC-BR-9”)。
[图4]示出实施例4的网室制种试验的结果(“SC-BR-6”、及“CMS-SC-BR-6”)。
[图5(A)]示出实施例6中的卷心菜的SI系优良株系“CB-3”、和导入了SC因子的“SC-CB-3”的结实的情况。图示出花序的形态，自下位的花蕾起依次开花。
[图5(B)]图为实施例6中交配后经过1个月以上的时间点的荚的情况。
[图5(C)]图示出计数实施例6中在各荚内形成的种子数量的结果。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
自交亲和性甘蓝植物及其培育方法
本发明如前所述，涉及具有自交亲和性的甘蓝(Brassica oleracea)植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代。
此处，具有自交亲和性的甘蓝植物是自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因被自交亲和性的甘蓝植物的位于S基因座的基因置换而成的。即，根据本发明的自交亲和性甘蓝是指，通过将自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的位于S基因座的基因用具有自交亲和性的其他甘蓝植物的位于S基因座的基因置换，从而自交不亲和性变成自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)。
此处，所谓“置换而成”，是指表现自交不亲和性的性状的基因被置换为能表现自交亲和性的基因，置换手段没有特别限定。
根据本发明的具有自交亲和性的甘蓝植物(自交亲和性甘蓝植物)缺失了S基因原本具有的自交不亲和性功能，从而能够将该植物作为材料来培育具有自交亲和性的新型甘蓝植物。换言之，根据本发明的自交亲和性甘蓝植物是向自交不亲和性基因座导入从自交亲和性甘蓝植物中发现的包含自交亲和性因子的S等位基因从而成为自交亲和性的甘蓝植物，并且包括其后代。
此处，对于判断“自交亲和性甘蓝植物”是否具有“自交亲和性”的方法没有特别限定，可通过已知的方法进行判断，例如，可通过本说明书中记载的自交亲和性植物的筛选方法、例如利用自花授粉的交配试验、后述的S单倍型导入时的交配试验、后述的开花交配与蕾期交配的结实率的比较、利用已知的与S基因座相关的DNA标记等来进行判断。具体而言，例如，可按照后述实施例1中记载的方法来判断是否具有自交亲和性。
本发明中，所谓“甘蓝植物”，为十字花科的植物，是指芸薹属植物的甘蓝种的植物，其中包括B.oleracea var.capitata(卷心菜)、B.oleracea var.italica(西兰花)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleraceavar.gongyloides(苤蓝)、B.oleracea var.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、及B.oleraceavar.albograbra(芥蓝)等。
另外，所谓“自交亲和性”(self-compatibility，SC)，是指甘蓝植物原本具有的自交不亲和性(self-incompatibility，SI)的功能缺失、可实现与自体、或具有与自体相同的S单倍型的植物的授精的性质。
根据本发明的自交亲和性甘蓝植物典型而言具有如下特征。
(1)由于自交不亲和性的功能缺失，因此可实现与自体或具有与自体相同的S单倍型的植物的高效交配，从而能够高效地实施以往难以实现的原种种子的增殖。
(2)具体而言，是在S基因座具有序列号1或序列号2所示的DNA序列的植物，是通过具有其等位基因而显示自交亲和性的植物。
(3)通过将具有上述序列的株系用于交配材料，能够培育具有自交亲和性的新型亲本株系。
·培育方法
根据本发明，使发现了自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物交配，从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体，由此能够培育使自交不亲和性的甘蓝植物具有自交亲和性而成的植物。
即，根据本发明的具有自交亲和性的甘蓝植物的培育方法如前所述，包括使自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配、从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体。
此处作为原材料使用的“自交亲和性的甘蓝植物”是具有自交亲和性因子的甘蓝植物，就利用自花授粉的交配试验而言，通过进行后述的S单倍型导入时的交配试验、后述的开花交配与蕾期交配的结实率的比较、利用已知的与S基因座相关的DNA标记等，能够筛选具有自交亲和性因子的甘蓝植物。具体而言，例如，可按照后述实施例1中记载的方法来筛选具有自交亲和性因子的甘蓝植物。
另外，前述的自交亲和性的甘蓝植物的“自交亲和性”与位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因关联。即，本发明中，“自交亲和性”是取决于位于S基因座的基因的功能或其功能的缺失(或被推测为如此)，或者是指由于位于S基因座的基因的影响而表现出的自交亲和性，不包括例如由于S基因座以外的影响而成为自交亲和性这样的情况。需要说明的是，甘蓝植物中，如后文在实施例1中所述的那样，根据以往的见解，认为即使是具有SI的性质的植物，也会在多数情况下由于S基因座以外的影响而表现为SC(Horisaki等，2004(非专利文献5))。
本发明中，作为原材料使用的“自交亲和性甘蓝植物”在S基因座具有下述(a)～(c)中任一者的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
此处，“具有DNA”的情况下的用语“具有”可语义转换为“包含”，优选语义转换为“实质上由......形成”(consisting substantially of)，更优选语义转换为“由......形成”(consisting of)。
另外，前述(b)中，所谓“与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性”，包含下述这样的DNA：在使用BLAST、FASTA等用于同源性检索的已知算法(例如，使用缺省即初始设定的参数)计算时，与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有至少95％、优选至少96％、进一步优选至少97％、进一步优选至少98％、特别优选至少99％的序列同一性的DNA。
此处所谓“序列同一性”，例如在将2条碱基(核苷酸)序列进行比对时(其中可以引入空位，也可以不引入空位)，是指一致的碱基数量相对于包括空位在内的碱基总数的比例(％)。
另外，此处，(b)的DNA“与植物的自交亲和性的表现相关”是指，由于(b)的DNA，使得在S基因座具有该DNA的植物实质上表现出自交亲和性。
另外，前述(c)中，“将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列”中的“多个”是指例如10个左右、期望7个左右、优选5个、更优选3个。
根据本发明的一个优选方式，本发明的培育方法中，作为原材料的“自交亲和性的甘蓝植物”是由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种、由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种、由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种、或由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种。
另外，就此处作为原材料使用的“自交不亲和性的甘蓝植物”而言，只要能与前述的作为原材料使用的“自交亲和性的甘蓝植物”进行交配、且具有十字花科植物原本具有的自交不亲和性即可，没有特别限制。但是，关于花椰菜及芥蓝，由于已知其是自交亲和性的，因此将花椰菜及芥蓝从作为原材料使用的“自交不亲和性的甘蓝植物”中排除。“自交不亲和性的甘蓝植物”优选为西兰花、卷心菜、抱子甘蓝、苤蓝、叶牡丹、羽衣甘蓝，更优选为西兰花、卷心菜。
本发明的培育方法中，首先，将自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配。然后，从交配而得到的杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体。
即，如此操作，将作为原材料的“自交亲和性的甘蓝植物”的S基因座的S单倍型导入自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)，从杂交后代中，选出导入了S单倍型且具有自交亲和性的个体。
此处，就交配而言，只要将作为原材料的“自交亲和性的甘蓝植物”与“自交不亲和性的甘蓝植物”进行交配、能得到杂交后代即可，没有特别限制，可以是虫媒等自然交配、手动交配等中的任何。另外，此处所谓的交配的含义也包括回交。
在导入S单倍型时，通过交配试验可确认该植物是自交亲和性还是自交不亲和性。
具体而言，实施利用自花授粉的交配试验、和作为比较对象的、使用了S单倍型不同的株系的花粉进行异花授粉的交配试验。将自花授粉和异花授粉的结果进行比较，可将结出了同等程度的种子的情况判断为自交亲和性，将自花授粉的结实率低的情况判断为自交不亲和性。
另外，一般而言，SI是已开放的花中的反应，因此，通过将开花交配(open flowerpollination；OP)和蕾期交配(bud pollination；BP)的结实率进行比较，也能够判断该植物显示SI和SC中的哪一种性质。在蕾期中SI相关基因的表达量少，因此，如果剥除花萼、花瓣而强制进行授粉，则只要是卵细胞具备了受精能力的阶段，即能够形成种子。利用该原理，在OP交配的结实率低于BP交配的结实率的情况下，可判断为SI株系。
另外，本发明中，S单倍型的分析中可将如Watanabe等人的文献(2003)(非专利文献3)中所记载的、位于S基因座的基因群(S受体激酶；SRK、S位点糖蛋白；SLG、S位点蛋白11；SP11(＝S位点富含半胱氨酸蛋白；SCR))的多态性作为指标进行分类。用于分类的手段可以是任何方法，例如，可使用如Nishio等人的文献(1996)(非专利文献4)所记载的通常已知的引物等。另外，也可基于序列号1或序列号2制备DNA标记来进行分析、或分析S基因的碱基序列。
因此，根据本发明的优选方式，从杂交后代中的自交亲和性的个体的筛选可以将个体具有前述的(a)～(c)中任一者的DNA作为指标来筛选自交亲和性植物。即，具有前述的(a)～(c)中任一者的DNA即表示自交亲和性。
如此，本发明中，在自交亲和性的判断中，通过利用DNA标记实施S基因座的分析，即使在S基因座呈杂合型的状态下，仍然能够判别有无自交亲和性基因座，从而可实施比交配试验更为高效的回交。
因此，根据本发明的优选方式，本发明的育种方法包括：将前述的自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)作为回交亲本株系来进行连续回交。
进行回交的过程中，在不实施特殊筛选的情况下，各代的个体群中的基因组置换率的平均值在第一代(BC1F1)中为75％，在第二代(BC2F1)中为87.5％，在第三代(BC3F1)中为93.75％，在第四代(BC4F1)中为96.875％，随着世代推进而具有愈发接近回交亲本株系的基因型。因此，为了从回交亲本株系繁育仅置换S基因座而成的实用的近等基因系，一般而言，需要6～7次的回交。
为了更高效地进行这样需要长时间的回交，也可使用全基因组DNA标记，使S基因座以外的区域在早期接近回交亲本株系。
例如，如前所述，在回交第一代(BC1F1)中以平均值计75％的基因组具有与回交亲本株系相同的基因型，而由于BC1F1代为分离世代，因此各个个体所具有的基因组置换率不同，若扩大群体的规模，因个体而异，也可能获得90％以上的基因组区域显示与回交亲本株系相同的基因型的个体。通过筛选这样的个体，能够在早期、以较少的代数使S基因座以外的区域具备与回交亲本株系相同的基因型。
关于作为全基因组DNA标记可利用的具体手段，在具有回交亲本株系的基因组序列信息的情况下，可制备基于该信息的DNA标记，进行各基因座的基因分型。
另外，即使在没有回交亲本株系的基因组序列信息的情况下，也可通过利用RAPD(随机扩增多态性DNA，Random Amplified Polymorphic DNA)法、SRAP(相关序列扩增多态性，sequence-related amplified polymorphism)法、AFLP(扩增片段长度多态性，Amplified fragment length polymorphism)法等随机PCR法，从分离世代中筛选具有与回交亲本株系相近的基因型的个体。除此以外，如果是以能综合性分析基因组中分散存在的大量SNPs的方式设计而成的SNPs基因分型芯片(affymetrix公司制品、Illumina公司制品等)，则也可使用这样的手段进行分析。
作为回交时其他应注意的事项，可举出与S基因座连锁的非目标性状的连锁累赘(Linkage Drag)。
通常的回交中，将S基因所在的6号染色体以外的区域置换为回交亲本株系的基因型虽然如前述那样耗费时间，但只要增加代数即可比较容易地实施。另一方面，针对S基因座附近的区域，需要有意识地将其排除的育种计划。
作为具体例，可设计位于S基因座附近的标记，在分离世代中与判别S基因座的标记一同对各个个体的基因型进行分析。大多数情况下两种标记进行共分离，而极少数情况下连锁断裂，出现S基因具有自交亲和性株系的基因座、同时附近的基因组区域显示回交亲本株系的基因型的个体。通过筛选这样的个体，能够筛选将与S基因座连锁的非目标性状切离的个体。
S基因座附近的DNA序列信息可通过利用NCBI中登记的甘蓝的组装信息(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000695525.1/)来获得。只要在进行交配的株系间，利用如序列号10～15所示的位于S基因座附近的标记时能得到多态性，则也可利用这些。通过利用这样的手段将连锁累赘抑制在尽可能小的区域内，能够赋予更接近回交亲本株系的性状。
由此，根据本发明的优选方式，使用位于与包含与自交亲和性关联的基因的S基因座非常接近的区域(距S基因座0～10cM、优选0～4cM)的DNA标记来判别基因型，能够筛选具有自交亲和性、同时S基因座附近的基因组区域具有回交亲本株系的基因型的个体、即表型显示极其接近回交亲本株系的植株外形的个体。
作为这样的DNA标记，可举出具有序列号10～15所示的碱基序列中的任意一者以上的DNA标记作为优选例。
此处，所谓DNA标记“具有”碱基序列，是指该标记具有该碱基序列。本发明中，DNA标记意指可以将对应的碱基序列内的碱基中的任意一个或数个(例如，1个、2个或3个，优选为1个或2个，更优选为1个)进行取代、缺失、添加或删除，或者也可以是包含对应的碱基序列作为一部分、且保持规定的性质的序列。这样的情况下，用语“具有”可语义转换为“包含”。另外，针对允许取代、缺失、添加或删除1个碱基的情况，可将“具有”语义转换为“实质上由......形成”。
即，这样的DNA标记可用于分析甘蓝植物的S基因座附近区域的基因型。
花药培养、花粉培养中的双单倍体的繁育可按照Palmer C等，(1996)“In VitroHaploid Production in Higherplants”第3卷(KluwerAcademic Publishers编者：SJain,S Sopory及RVeilleux)的143～172页来实施。
如此培育的新型自交亲和性的株系可用作F1制种体系中的父本。另一方面，由于自花授粉所产生的自交种子大量结实，因此不能将其直接用作母本。为了作为母本进行使用，需要制备具有CMS细胞质从而不发生自花授粉的A系(line)。
如果是已有回交亲本株系的CMS株系的情况，则只要以新制备的自交亲和性株系作为B系而实施2次回交，即可培育仅S基因座及其附近被置换而得的A系。
以往的自交不亲和性株系为了增殖种子需要耗费大量劳力，但在导入了自交亲和性的亲本株系的情况下，仅进行虫媒授粉即能容易地结实，进行种子的增殖。将如此增殖的亲本株系的种子作为原种，能够实施大规模的F1制种。
此处，所谓A系及B系，是指利用了细胞质雄性不育的制种体系中的细胞质雄性不育系、及保持系。两个株系的核基因组构成几乎是一致的，因此植物体的表型类似，但由于细胞质的影响，A系不产生花粉。通过将B系的花粉与A系交配而得到原种种子，将该原种种子作为F1制种的种子亲本使用。
本发明中，所谓“亲本株系”，是指为了繁育F1品种而培育的株系，通常以农业性状不同的2种亲本株系作为材料，使它们交配而繁育F1品种。
本发明中，所谓“原种增殖”，是指对F1品种进行制种所需要的亲本株系种子的增殖。
自交亲和性甘蓝植物
根据本发明的自交亲和性甘蓝植物如前所述，是通过后述的本发明的培育方法培育的植物及其后代。
另外，根据本发明的自交亲和性甘蓝植物是在S基因座具有下述(a)～(c)中任一者的DNA的、具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括芥蓝、花椰菜)、或其后代：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
根据本发明的优选方式，根据本发明的甘蓝植物是通过向自交不亲和性基因座导入包含前述(a)～(c)中任一者的DNA的S等位基因而成为自交亲和性的甘蓝植物、或其后代。
另外，所谓根据本发明的自交亲和性甘蓝植物的“后代”，不仅包括自花授粉所产生的自交后代，也包括来自花药·花粉培养的后代、使根据本发明的自交亲和性甘蓝植物与能与该植物交配的甘蓝植物进行交配而得的杂交种。因此，“后代”也包括例如将根据本发明的自交亲和性甘蓝植物作为花粉亲本(父本)、将能与该植物交配的甘蓝植物作为种子亲本(母本)进行交配而得到的后代。另外，已经存在回交亲本株系的CMS株系的情况下，只要以新制备的自交亲和性株系作为B系而实施2次回交，即可培育仅S基因座及其附近被置换而得的A系。如此得到的细胞质雄性不育的自交亲和性甘蓝植物也可包括于后代中。此外，“后代”也包括例如通过根据本发明的自交亲和性甘蓝植物与能与该甘蓝植物融合的植物的细胞融合而得的植物、种属间杂交植物。
根据本发明的其他方式，本发明也涉及根据本发明的自交亲和性甘蓝植物或其后代的植物体的一部分、或者它们的种子。
此处，所谓“植物体的一部分”，包括花、叶、茎、根等器官或它们的一部分或者组织、或者来自这些器官或组织的细胞、细胞的聚集体等。
根据本发明的优选方式，根据本发明的自交亲和性甘蓝植物典型而言为不包括花椰菜和芥蓝的甘蓝植物，优选为西兰花、卷心菜、抱子甘蓝、苤蓝、叶牡丹、羽衣甘蓝，更优选为西兰花、卷心菜。
根据本发明的一个优选方式，根据本发明的自交亲和性甘蓝植物、或其后代可以是下述中的任一者：
1)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
2)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
3)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
4)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
5)由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花、或其后代；及
6)由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花、或其后代。
优选的是，前述的基因座“BoS-SC1”具有下述(i)～(iii)的碱基序列：
(i)序列号1所示的碱基序列；
(ii)与序列号1所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；及
(iii)将序列号1所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
另外，优选的是，前述的基因座“BoS-SC2”具有下述(I)～(III)的碱基序列：
(I)序列号2所示的碱基序列；
(II)与序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(III)将序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
与前述(b)的情况同样，前述(ii)的“与序列号1所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性”及前述(II)的“与序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性”是指包含下述这样的DNA：在使用BLAST、FASTA等用于同源性检索的已知算法(例如，使用缺省即初始设定的参数)计算时，与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有至少95％、优选至少96％、进一步优选至少97％、进一步优选至少98％、特别优选至少99％的序列同一性的DNA。
另外，与前述(c)的情况同样，前述(iii)的“将序列号1所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列”及前述(III)的“将序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列”中的“多个”是指例如10个左右、期望7个左右、优选5个、更优选3个。
根据本发明的其他方式，也可提供具有下述(A)～(C)中任一者的碱基序列的、甘蓝植物的自交亲和性的检测用标记：
(A)序列号1或序列号2所示的碱基序列；
(B)与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(C)将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
需要说明的是，关于此处所谓的(B)及(C)，以与前述的(b)和(c)中的碱基序列相同的含义来定义。
根据本发明的另一其他方式，可提供甘蓝植物的制种方法，其包括将通过本发明的培育方法得到的自交亲和性甘蓝植物、或其后代自交繁殖并制种的步骤。
此处，将通过本发明培育的自交亲和性株系进行自交繁殖的情况下，作为交配方法，使自体或相同株系的花粉在柱头进行交配即可。作为具体的方法，用镊子夹取已开放的花的花药，使其与柱头接触从而将花粉授粉。除此以外，也可将用于交配的纸袋套在已开花的花序上，仅施以用手拍打袋等物理性冲击而使自体花粉附着于柱头，从而发生受精。
另外，进行大规模的制种的情况下，在阻挡了昆虫从外界侵入的网室内，种植多株相同株系的植物，实施利用了蜜蜂等的虫媒授粉，由此能够高效且大量地得到自花受精种子。
进行更大规模的制种的情况下，在室外的、以不发生预想外的杂交的方式进行了充分隔离管理的场圃中，种植多株相同株系的植物，实施利用了蜜蜂等的虫媒授粉，由此能够高效且大量地得到自花受精种子。
根据本发明的另一其他方式，可提供使用本发明的培育方法来维持或增殖有用的杂交第一代品种的亲本株系的方法。
另外，根据本发明的另一其他方式，也可提供利用了细胞质雄性不育(CMS)的甘蓝的杂交第一代种子的制种方法，所述方法的特征在于，利用具有自交亲和性的甘蓝植物，使杂交第一代株系的亲本株系增殖。
通过这样的本发明的方法，能够省略以往被认为是必需的(1)打破SI所需要的步骤(蕾期授粉、CO2处理、NaCl处理等)、(2)考虑SI的强弱来规划增殖的策略(制种规模等的计划)的步骤。
另外，根据本发明，可提供能够在不关注优良株系彼此的S单倍型的情况下考虑制备F1的亲本组合的育种方法。
实施例
通过下述的实施例具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
实施例1：自交亲和性因子的探索
为了探索自交亲和性因子，将西兰花、卷心菜、花椰菜、芥蓝、叶牡丹、及其他甘蓝野生种作为材料，实施了交配试验、及利用S单倍型判别标记的S基因座分析。
根据利用自花授粉的交配试验的结果，选定了SI极弱、或完全为自交亲和性的株系。
作为S单倍型判别标记，使用序列号3～9所示的已知的引物，分析各株系的S单倍型。
结果，即使是相同S单倍型的株系，也如以往的见解所见，在多数情况下由于S基因座以外的影响而成为SI或表现为SC(Horisaki等，2004(非专利文献5))。
另一方面，针对芥蓝的“K-3”株系、甘蓝野生种的“T-16”株系、及花椰菜的“CF-33”株系，对将这些株系交配而得到的群体的分离后代进行了调查，结果，只要是具有与这些原材料相同的S单倍型的个体，即稳定地显示SC的表型。
据此推测，上述原材料的自交亲和性是由位于S基因座的基因的功能缺失导致的。
作为将位于S基因座的基因之一的SLG(S位点糖蛋白)扩增的引物，使用PS5(序列号3)、及PS15(序列号4)，对扩增的DNA片段的碱基序列进行分析。
结果，K-3具有序列号1(将该基因型作为“BoS-SC1”)的碱基序列，T-16及CF-33具有序列号2(将该基因型作为“BoS-SC2”)的碱基序列。
通过NCBI的Blast进行检索，结果，序列号1的碱基序列被登记为XM＿013734339(BoS-13样的SLG)，序列号2的碱基序列被登记为D85202(BoS-16的SLG)。
关于序列号2的碱基序列，Kusaba等(1997)(非专利文献6)的文献中，将其视作甘蓝种内存在的许多自交不亲和性基因的复等位基因之一，但并未提及该等位基因是自交亲和性的。
关于序列号1的碱基序列，同一文献中，认为其与基于株系名称为TO1000的基因组组装而被推定为SLG的基因相关，另一方面，虽然记载了TO1000株系为自交亲和性，但并未提及其是由S基因座导致的自交亲和性。实际上，也报道了许多如前述那样虽然表现为自交亲和性、但为极弱的自交不亲和性的情况、由于S基因座以外的信号转导因子的缺失而导致呈自交亲和性的情况(M.Kitaura等，2007(非专利文献7)及E.Indriolo,2012(非专利文献8))。
因此，根据前述的Kusaba等人的文献等，难以判断包含序列号1的基因座是否与自交亲和性相关。
在这样的情况下，本申请的发明人如以下实施例2～6中所记载的那样，利用大规模的回交的群体，并实施重复许多世代的试验，由此在本发明中首次将包含序列号1及序列号2的基因座本身鉴定为显示自交亲和性的基因座。
实施例2：向西兰花“BR-9”育种株系导入SC
将芥蓝株系“K-3”(S单倍型为BoS-SC1，保藏编号FERM BP-22347)作为SI功能缺失株系的原材料，将坂田种苗株式会社持有的西兰花的亲本株系“BR-9”(S单倍型为BoS-18)作为回交亲本株系，实施了交配试验。
高效地进行回交(Back cross；BC)时，基本而言，利用S单倍型标记实施DNA检验，筛选S基因座呈BoS-SC1/BoS-18的杂合型的个体，在确认表型的同时，将“BR-9”进行连续回交。
需要说明的是，前述的芥蓝株系“K-3”的种子已于2017年9月29日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏人添加的识别用标示：K-3，保藏编号：FERM BP-22347)。
首先，将具有BoS-SC1的芥蓝“K-3”、与西兰花“BR-9”进行交配，对F1进行制种，然后，经数年而进行“BR-9”的回交。为了高效地进行回交，利用20种RAPD引物进行筛选，筛选出显示与回交亲本株系“BR-9”相近的基因型的个体。
结果，在BC2F1代筛选出了上述RAPD标记与“BR-9”完全一致的个体。
然而，播种BC3F1代，使用幼苗进行S基因座的DNA筛选，然后定植于场圃进行表型调查后，作为结果，这些筛选个体大多是与“BR-9”相比成熟快、且头部的聚拢松弛、作为西兰花的商品价值低的个体(图1b)。
该结果表明，在与位于6号染色体的BoS-SC1基因非常接近的位置可能存在与早熟性、头部的聚拢相关的因子。
第二年，播种BC4F1，针对发芽的1581个个体，利用S单倍型标记实施DNA检验，筛选后，定植于场圃。
在头部已经长成的时机确认成熟期、头部的聚拢、平滑程度等表型，筛选出植株外形比较接近“BR-9”的30个个体。
同时，使用位于与S基因座非常接近的两侧的DNA标记BoC6MK1(实施了利用序列号10及11的PCR。位于距离S基因座1.1cM处)、和BoC6MK2(实施了利用序列号12及13的PCR。位于距离S基因座0.3cM处)进行基因分型分析，结果，从经过表型筛选的30个个体中成功地筛选出两侧的标记被置换为“BR-9”型的4个个体。然后，从这些个体得到自交种子及花药·花粉培养后代。
播种上述筛选株的后代，筛选S基因座呈BoS-SC1纯合型的个体后，将得到的自交亲和性的“SC-BR-9”株系栽培于场圃中。与前述同样地，在花蕾长出1个月时调查表型，结果，这些个体的植株外形、成熟期与作为BC亲本的“BR-9”相似至无法区分的程度(图1c、及图2)。
使用该株系，与“BR-9”的A系(细胞质雄性不育)株系进行回交，从而也完成了自交亲和性的“SC-BR-9”的细胞质雄性不育株系“CMS-SC-BR-9”(保藏编号FERM BP-22349)(图2)。
需要说明的是，前述的西兰花株系“CMS-SC-BR-9”的种子已于2017年9月29日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏人添加的识别用标示：CMS-SC-BR-9，保藏编号：FERM BP-22349)。
根据以上的结果，通过筛选即使S基因座为来源于芥蓝的BoS-SC1纯合型、非常接近的基因组区域仍重组为回交亲本株系“BR-9”的基因型而得的个体，首次成功培育出作为西兰花具有高商品价值的自交亲和性株系。
实施例3：自交亲和性株系的利用虫媒的制种试验
使用将“BR-9”原本具有的S基因(BoS-18)置换为BoS-SC1的正常细胞质株系“SC-BR-9”(B系)、和其CMS株系“CMS-SC-BR-9”(A系)，通过虫媒授粉实施了网室中的制种试验(图3)。
以重复试验为目的，使用2个网室，分别栽培A系和B系各24株，利用蜜蜂进行虫媒交配，调查得到的种子重量。
关于第1区的平均产量，A系(A line)为30.4g/株，B系(B line)为36.2g/株，关于第2区的平均产量，A系为35.8g/株，B系为29.7g/株，产量非常高(表1)。
原来的SI株系即“CMS-BR-9”和“BR-9”(BoS-18纯合型)的制种试验中，以7株的平均值计，仅能以A系为0.02g/株、B系为0.61g/株的量制种，相比之下其差异是明显的。
由上述情况确认了按照本发明培育的株系的确是制种性优异的株系。
[表1]
网室 株系 株数 合计产量(g) g/株 备注
室-1 CMS-SC-BR-9 24 729.67 30.4 SC株系(A系)
室-1 SC-BR-9 22 795.68 36.17 SC株系(B系)
室-2 CMS-SC-BR-9 21 752.72 35.84 SC株系(A系)
室-2 SC-BR-9 24 713.26 29.72 SC株系(B系)
室-3 CMS-BR-9 7 0.17 0.02 SI株系(A系)
室-3 BR-9 7 4.29 0.61 SI株系(B系)
实施例4：向西兰花“BR-6”育种株系导入SC、及其CMS株系的培育
针对其他西兰花亲本株系“BR-6”，也将作为自交亲和性因子的原材料的甘蓝野生种“T-16”作为材料，尝试了自交亲和性化。
与实施例2同样地操作，使用S单倍型判别标记，同时进行“BR-6”的回交，筛选表型，进一步使用S基因座附近的标记BoC6MK1(实施了利用序列号10及11的PCR。位于距离S基因座1.1cM处)、和BoC6MK3(实施了利用序列号14及15的PCR。位于距离S基因座2.2cM处)进行基因分型分析，经过基于该基因分型分析的筛选，对得到的BC4F1S1代的表型进行调查。
结果表明，通过筛选即使S基因座为来源于“T-16”的BoS-SC2纯合型、非常接近的基因组区域仍重组为回交亲本株系“BR-6”的基因型而得的个体，显示出成熟期、外观与BC亲本株系“BR-6”极为相近的植株外形。
使用如此培育的“SC-BR-6”(正常细胞质，B系)及其CMS株系“CMS-SC-BR-6”(雄性不育细胞质，A系)(保藏编号FERM BP-22348)，与实施例3同样地操作，实施了网室中的制种试验(图4)。
需要说明的是，前述的西兰花株系“CMS-SC-BR-6”的种子已于2017年9月29日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏人添加的识别用标示：CMS-SC-BR-6，保藏编号：FERM BP-22348)。同样地，保藏人添加的识别用标示为Milkyway的株系的种子已于2017年9月29日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室)进行了国际保藏(原始保藏)(保藏编号：FERM BP-22350)。
栽培A系、B系各14株，实施虫媒交配，结果，关于各系的平均种子产量，A系中为39.5g/株，B系中为39.8g/株，显示出具有高的制种性(表2)。
由以上的结果表明，即使S基因座为BoS-SC2纯合型，仍然可培育作为西兰花具有高商品价值的自交亲和性株系。
[表2]
网室 株系 株数 合计产量(g) g/株 备注
室-4 CMS-SC-BR-6 14 553.68 39.55 SC株系(A系)
室-4 SC-BR-6 14 557.58 39.83 SC株系(B系)
室-5 CMS-BR-6 186 104 0.56 SI株系(A系)
室-5 BR-6 190 无数据 无数据 SI株系(B系)
实施例5：自交亲和性SC卷心菜的开发(4个株系)
将芥蓝的株系“K-3”(S单倍型为BoS-SC1，保藏编号FERM BP-22347)作为SI功能缺失株系的原材料，将坂田种苗株式会社持有的卷心菜的亲本株系“CB-20”(叶深系卷心菜，S单倍型为BoS-5)、“CB-35”(寒玉系卷心菜，S单倍型为BoS-51)、“CB-23”(春系卷心菜，S单倍型为BoS-8)及“CB-97”(球系卷心菜，S单倍型为BoS-15)分别作为回交亲本株系，进行了交配试验。
高效地进行回交(BC)时，基本而言，利用S单倍型标记实施DNA检验，筛选S基因座分别呈BoS-SC1/BoS-5、BoS-SC1/BoS-51、BoS-SC1/BoS-8、及BoS-SC1/BoS-15的杂合型的个体，在确认表型的同时，将“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”进行连续回交。
首先，将具有BoS-SC1的芥蓝“K-3”、与卷心菜“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”分别进行交配，对F1进行制种，然后，经数年而分别进行“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”的回交。
为了高效地进行回交，利用20种RAPD引物进行筛选，在各回交株系中，筛选出显示与各回交亲本株系“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”相近的基因型的个体。
结果，“CB-20”、“CB-35”、及“CB-23”在BC4F1代中筛选出了上述RAPD标记与各回交亲本株系完全一致的个体。
另外，“CB-97”在BC4F1代中筛选出了上述RAPD标记与其回交亲本株系几乎一致的个体。
进一步推进世代，在场圃中试种，确认了表型与原来的回交亲本株系等同。
在各株系中，经由自交繁殖或者花药·花粉培养而得到BoS-SC1的同型结合体，首次成功培育出卷心菜的自交亲和性株系。
进一步地，分别进行与“CB-20”、“CB-35”、“CB-23”及“CB-97”的A系(细胞质雄性不育)株系的回交，从而也完成了自交亲和性的“SC-CB-20”、“SC-CB-35”、“SC-CB-23”及“SC-CB-97”的各株系、以及细胞质雄性不育株系“CMS-SC-CB-20”、“CMS-SC-CB-35”、“CMS-SC-CB-23”及“CMS-SC-CB-97”的各株系。
实施例6：向SC卷心菜的其他株系的导入和手动交配试验
以实施例5中培育的自交亲和性卷心菜株系作为基础，进一步将其他卷心菜培育株系进行交配，开展保有自交亲和性的卷心菜的培育。
作为其一例，将“CB-3”(球系卷心菜，S单倍型为BoS-2b)作为种子亲本，将前述的实施例5中培育中途的具有自交亲和性的“CB-97”(球系卷心菜，S单倍型为BoS-SC1/BoS-15)的BC5F1代作为花粉亲本，进行交配，繁育F1。
高效地进行回交(BC)时，基本而言，利用S单倍型标记实施DNA检验，筛选S基因座分别呈BoS-SC1/BoS-2b的杂合型的个体，在确认表型的同时，将“CB-3”进行连续回交。
对于具有自交亲和性的等位基因的“CB-3”株系的BC4F1代，进一步将“CB-3”进行回交及自交繁殖，培育具有自交亲和性的卷心菜“SC-CB-3”株系。
将新培育的自交亲和性的“SC-CB-3”与SI系的回交亲本株系“CB-3”一同作为材料，实施利用手动交配的交配试验。
结果如下。
十字花科植物的花序呈如图5(A)那样的形态，自下位的花蕾起依次开花。
针对这样的花序，在同一天实施开花交配(open flower pollination；OP)和蕾期交配(bud pollination；BP)，并实施自交不亲和性/自交亲和性的检验。进行蕾期交配时，用镊子切除花萼、花瓣，剥出雌蕊而进行授粉。对于交配后的花蕾、花，基于如图5(A)所示的规则进行编号，在交配后经过1个月以上、种子饱满的时间点，计数各位置的结实种子数量。
图5(B)为交配后经过1个月以上的时间点的荚的情况。
SI系的回交亲本株系在比示出交配时间点的OP/BP边界的毛线更靠下位处几乎未形成种子。另一方面，就BP区而言，在交配的时间点，SI基因未在柱头表达，因此能确认到形成了种子。与之相对，可知在导入了SC的株系中，不仅在BP区、在OP区也形成了大量的种子。
图5(C)示出计数在上述株系的各荚内形成的种子数量的结果。
如结果所示，SI系的回交亲本株系“CB-3”在OP区的荚中几乎没有形成种子，与之相对，在BP区中形成了每1个荚为10粒左右的种子。另一方面，导入了SC性状的株系在OP区形成了多达10-20粒左右的种子，确认了能够赋予自交亲和性性状。
以上的结果显示，即使在此前并不知晓存在自交亲和性株系的西兰花、卷心菜中，也能够按照本发明来导入自交亲和性、培育兼具作为作物的品质的株系。
Figure IDA0002738194300000011
Figure IDA0002738194300000021
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Figure IDA0002738194300000051
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PCT/RO/134表
Figure QDA0002738194290000011
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Claims (33)

1.具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代。
2.如权利要求1所述的具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代，其是自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因被自交亲和性的甘蓝植物的位于S基因座的基因置换而成的。
3.如权利要求1或2所述的具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)、或其后代，其是通过将自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配、从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体而得到的。
4.如权利要求1～3中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物，其在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
5.如权利要求4所述的甘蓝植物、或其后代，其通过向自交不亲和性基因座导入包含所述(a)～(c)中任一者的DNA的S等位基因而成为自交亲和性。
6.如权利要求1～5中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物、或其后代，所述自交亲和性甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
7.甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERMBP-22347确定的芥蓝品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”。
8.甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERMBP-22349确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”。
9.如权利要求7或8所述的甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其中，基因座“BoS-SC1”具有下述(i)～(iii)的碱基序列：
(i)序列号1所示的碱基序列；
(ii)与序列号1所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(iii)将序列号1所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
10.如权利要求7～9中任一项所述的甘蓝植物、或其后代，所述甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
11.甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”。
12.甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”。
13.如权利要求11或12所述的甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其中，基因座“BoS-SC2”具有下述(I)～(III)的碱基序列：
(I)序列号2所示的碱基序列；
(II)与序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(III)将序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
14.如权利要求11～13中任一项所述的甘蓝植物、或其后代，所述甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
15.由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花、或其后代。
16.由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花、或其后代。
17.权利要求1～16中任一项所述的植物或其后代的植物体的一部分。
18.权利要求1～16中任一项所述的植物或其后代的种子。
19.具有自交亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)的培育方法，其包括将自交亲和性的甘蓝植物与自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)进行交配、从杂交后代中筛选具有自交亲和性的个体的步骤。
20.如权利要求19所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交亲和性的甘蓝植物的自交亲和性与位于自交不亲和性基因座(S基因座)的基因关联。
21.如权利要求19或20所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交亲和性的甘蓝植物在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
22.如权利要求19～21中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其包括：以个体具有权利要求21所述的(a)～(c)中任一者的DNA作为指标来筛选自交亲和性植物，从而从杂交后代中筛选自交亲和性的个体。
23.如权利要求19～22中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其还包括：使用位于与包含与自交亲和性关联的基因的S基因座非常接近的区域(距S基因座0～4cM)的DNA标记来判别基因型，筛选具有自交亲和性的个体。
24.如权利要求19～23中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其包括：将所述自交不亲和性的甘蓝植物(不包括花椰菜和芥蓝)作为回交亲本株系来进行连续回交。
25.如权利要求19～24中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交亲和性的甘蓝植物为由保藏编号FERM BP-22347确定的芥蓝品种、由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花品种、由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种、或由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种。
26.如权利要求19～25中任一项所述的自交亲和性甘蓝植物的培育方法，其中，所述自交不亲和性的甘蓝植物为西兰花或卷心菜。
27.甘蓝植物的自交亲和性的检测用标记，其具有下述(A)～(C)中任一者的碱基序列：
(A)序列号1或序列号2所示的碱基序列；
(B)与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列；或
(C)将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列。
28.甘蓝植物的制种方法，其包括将通过权利要求19～26中任一项所述的培育方法得到的自交亲和性甘蓝植物、或其后代自交繁殖并制种的步骤。
29.维持或增殖有用的杂交第一代株系的亲本株系的方法，其中，使用权利要求19～26中任一项所述的培育方法来维持或增殖有用的杂交第一代株系的亲本株系。
30.用于对甘蓝植物的S基因座附近区域进行基因型分析的标记，其具有序列号10～15所示的碱基序列中的任意一者以上。
31.利用了细胞质雄性不育(CMS)的甘蓝的杂交第一代种子的制种方法，所述方法包括下述步骤：
利用具有自交亲和性的甘蓝植物，使杂交第一代株系的亲本株系增殖。
32.如权利要求31所述的制种方法，其中，所述具有自交亲和性的甘蓝植物在S基因座具有由下述(a)～(c)组成的组中的任意一种以上的DNA：
(a)包含序列号1或序列号2所示的碱基序列的DNA；
(b)包含与序列号1或序列号2所示的碱基序列具有95％以上的序列同一性的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA；或
(c)包含将序列号1或序列号2所示的碱基序列中的1个或多个碱基进行缺失、取代、插入及/或添加而得的碱基序列、且与植物的自交亲和性的表现相关的DNA。
33.如权利要求31或32所述的制种方法，其中，所述具有自交亲和性的甘蓝植物为下述1)～6)中任一者：
1)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERMBP-22347确定的芥蓝品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
2)甘蓝植物(不包括芥蓝)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERMBP-22349确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC1”；
3)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22350确定的花椰菜品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
4)甘蓝植物(不包括花椰菜、甘蓝野生种)、或其后代，其在S基因座具有被发现存在于由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花品种中的、自交亲和性的基因座“BoS-SC2”；
5)由保藏编号FERM BP-22349确定的西兰花、或其后代；及
6)由保藏编号FERM BP-22348确定的西兰花、或其后代。
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