JP2023540218A - 新規病害耐性スイカ植物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2感染に対して高い耐性を示す新規スイカ植物に関する。本発明はまた、種子及び前記植物の部分、例えば果実に関する。本発明はさらに、このような種子及び植物を形成及び使用する方法に関する。本発明はまた、前記高い耐性に関連する新規遺伝子配列及び前記新規遺伝子配列に関連する分子マーカに関する。
Description
本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2感染に対して高い耐性を示す新規スイカ植物に関する。本発明はまた、種子及び前記植物の部分、例えば果実に関する。本発明はさらに、このような種子及び植物の形成方法及び使用方法に関する。本発明はまた、前記高い耐性に関連する新規遺伝子配列、及び、前記新規遺伝子配列に関連する分子マーカに関する。
スイカ(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum and Nakai)は、カラハリ砂漠に近い地域におけるアフリカ南部が起源であると考えられている重要な特殊作物である(Dane & Liu,2007)。これは、主要な農業生産地域のすべてにおいて一般的な作物であると共に、2018年における世界生産量は103,931,337トンとされている(国際連合食糧農業機関により提供されたデータによる)。2019年には、米国における生産量のみで最大5億6100万米ドル相当であった(USDA Vegetables 2019 Summary)。
植物病原体はスイカを含む重要な作物に甚大な被害を引き起こすことが知られており、食料供給と、植物性の原料に依存する他の産業の両方に広く影響が及ぶ顕著な農業上の損失がもたらされてしまう。そのため、作物の生産に係る農業上の有害生物に係る発生率及び/又は影響を低減させる必要性が長期にわたって認識されている。このような病原体の例は、植物真菌のフザリウム オキシスポルム(Fusarium oxysporum)(F.オキシスポルム(F.oxysporum))属である。F.オキシスポルム(F.oxysporum)は、特にこれらに限定されないが、エンドウマメ、バナナ、綿、トマト、スイカ等を含む種々の作物植物に壊滅的な被害を与えることが知られている。F.オキシスポルム(F.oxysporum)は、分化型(f.sp.)と呼ばれる数々の異なる特殊な形態により特徴付けられ、その各々が多様な宿主に感染することで病害が引き起こされる。F.オキシスポルム(F.oxysporum)の少なくとも48種の異なる分化型が存在している。
F.オキシスポルム(F.oxysporum)の一つの特定の分化型は、F.オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(F.oxysporum f.sp.niveum)(FON)であり、これは、アジアンプロテクテッド(Asian protected)、チャールストングレイ(Charleston Grey)、クリムゾンスイート(Crimson Sweet)、シュガーベイビー(Sugar Baby)、ジュビリー(Jubilee)及びオールスイート(Allsweet)種を含むスイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)種の種々の種類のスイカに感染する。数々の品種がFONに対して確認されており、品種0、1、2、及び3が含まれる(Martyn and Bruton,1989;Zhou et al.,2010)。
いくつかの耐性元がFON2品種に対して記載されている。
米国特許第7,550,652号明細書、米国特許第8,173,873号明細書、及び、米国特許第8,212,118号明細書には、それぞれ、スイカ系統SP-4、SP-5及びSP-6が開示されており、そのすべてがFON2外寄生に対して耐容性であるか、又は、中程度に耐性であると記載されている。
米国特許出願公開第14/507,277号明細書には、FON2耐性を有する一方で望ましい商業的特徴を保持するスイカ植物が開示されている。FON2形質は、長い間知られているスイカにおけるFON2耐性の潜在的なソースである系統種PI-296341-FRから誘導される(Martyn and Netzer,1991)。
Wechter et al.(2012)には、スイカ育種におけるFON2耐性に対する多数の追加の潜在的なソースが記載されている。
Ren et al.(2015)には、スイカ(C.lanatus subsp.citroides)系統種PI296341-FRに由来する第9染色体上の一つのFON2耐性QTL、及び、低耐性のエリート系統97103に由来する第10染色体上の一つのFON2耐性QTLが報告されている。
Branham et al.(2017)にはまた、スイカ(C.lanatus subsp.citroides)系統種USVL246-FR2に由来するFON2耐性に関連するQTLが報告されており、一次的なものが第9染色体上に位置されており、一方で二次的なものが第10染色体上に位置されていた。
スイカにおけるFON2耐性形質に対する潜在的なソースが存在しているにもかかわらず、スイカ生産者が利用可能な許容可能な園芸品質(甘くて食用可能な果実をもたらす)を有するFON2耐容性又は耐性の商業的な材料は現在存在していない(Meru and McGregor,2016;Pal et al.,2020)。したがって、商業的に関連するスイカ生殖質に適応可能であると共に、より容易で良好なFON2耐性管理をもたらすこととなる、FON2変種に対する耐性に係る新規ソースに対する要求が未だ存在している。
本発明は、高いFON2耐性形質を含む新規スイカ植物を包含すると共に提供することにより、FON2変種に対する向上した耐性に係る要求を解決するものである。育種集団において高いFON2耐性に関連する一つのQTLを同定することにより、及び、その対応する配列をエリートスイカ植物に遺伝子移入することにより、スイカ植物のFON2耐性能を大きく高め、これにより、全体的な植物性能に対して好影響がもたらされた。第10染色体上に位置するFON2耐性QTL(QTL10)及びその対応する遺伝子移入配列は優性の性質を有し、したがって、この配列の一回のコピーで向上したFON2耐性表現型が既に提供される。
全体として、本発明において開示されている向上したFON2耐性スイカ植物の特徴は、FON2の影響下にある圃場においてスイカ品種を展開する際における経済的及び商業的効率を高めるための新規解決法をスイカ栽培者にもたらす。
第1の実施形態において、本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)感染に耐性である栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物であって、そのゲノム中に、FON2に対する耐性を付与するスイカ(C.lanatus subsp.citroides)由来の遺伝子移入配列を含むものを提供し、ここで、前記遺伝子移入配列は、第10染色体上に位置されていると共に、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
本発明のさらなる実施形態において、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列は、配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号16、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、及び/若しくは、配列番号71、又は、前記配列の1つ以上に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%同一である配列の少なくとも1つを含む。
本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、前記少なくとも1つのSNPマーカに対してヘテロ接合である。本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、前記少なくとも1つのSNPマーカに対してホモ接合である。
本発明のさらなる実施形態において、前記遺伝子移入配列は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先に含まれている。
さらなる実施形態において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を含有しないスイカ植物とを交配することにより得られる。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、近郊系、二ゲノム性半数体、二倍体、三倍体、四倍体又はハイブリッド植物である。
特に限定されないが、葉、茎、根、花又は花部、果実、苗条、配偶体、胞子対、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合体、胚、分裂組織部位、カルス組織、種子、挿木、細胞若しくは組織培養物、又は、特に果実を産する植物に成長した際においても本発明に係るFON2耐性形質をなお示す、植物のいずれかの他の部分若しくは産物を含む前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物から得られる植物部位、器官又は組織の提供がさらなる実施形態である。
さらなる実施形態において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載の植物を産する種子を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を生産する方法であって、
a)前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を欠く栽培種スイカ植物とを交配するステップ;
b)FON2に対する耐性を付与する、第10染色体上に位置された前記遺伝子移入配列を含む子孫植物を選択するステップであって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出するステップを含むステップ
を含み、これにより、高いFON2に対する耐性を有する植物を生産する方法を提供する。
a)前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を欠く栽培種スイカ植物とを交配するステップ;
b)FON2に対する耐性を付与する、第10染色体上に位置された前記遺伝子移入配列を含む子孫植物を選択するステップであって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出するステップを含むステップ
を含み、これにより、高いFON2に対する耐性を有する植物を生産する方法を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかの方法に関し、ここで、この方法は:
c)選択された子孫を自配させるステップ、又は、選択された子孫と他のスイカ植物とを交配してさらなる子孫を生産するステップ
をさらに含む。
c)選択された子孫を自配させるステップ、又は、選択された子孫と他のスイカ植物とを交配してさらなる子孫を生産するステップ
をさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態に記載の方法に関し、ここで、さらなる子孫は、選択され、及び、さらに2~10世代自配/交配される。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関し、ここで、ステップa)の植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先である。
さらなる実施形態において、本発明はFON2に対する耐性を示すF1スイカ植物を生産する方法に関し、この方法は、前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物である近郊系スイカ植物と、異なる近郊系スイカ植物とを交配させて、F1ハイブリッド子孫を生産するステップを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示すと共に、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列の少なくとも1つのコピーを有する栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を同定する方法を提供するものであり、前記方法は、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出し、これにより、FON2に対する耐性を示すスイカ植物を同定するステップを含む。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出し、これにより、FON2に対する耐性を示すスイカ植物を同定するステップを含む。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態に係る方法に関し、ここで、前記方法は、前記1つ以上のSNPマーカを含むスイカ植物を選択するステップ、及び、選択されたスイカ植物と第2のスイカ植物とを交配して、少なくとも1つの前記SNPマーカを含むと共に、FON2に対する高い耐性を示す子孫スイカ植物を生産するステップをさらに含む。
定義
本出願の範囲内で使用される技術用語及び表現は、一般に、本明細書において以下に特に示されない場合、植物の育種及び栽培の関連技術においてそれらに一般的に適用される意味を与えられるべきである。
本出願の範囲内で使用される技術用語及び表現は、一般に、本明細書において以下に特に示されない場合、植物の育種及び栽培の関連技術においてそれらに一般的に適用される意味を与えられるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈上特に明記されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「植物」への言及は、1つ又は複数の植物を含み、「細胞」への言及は、細胞、組織などの混合物を含む。
「栽培種スイカ」又は「エリートスイカ」植物は、本発明の範囲内において、もはや自然の状態でなく、人間の世話により、農業での使用及び/又は人間による消費のために、開発及び栽培植物化された植物を指すと理解され、スイカ(C.lanatus subsp.citroides)系統種などの野生スイカ系統種は除外される。例として、実施形態において、本発明に係る栽培種又はエリートスイカ植物は、赤色の果肉を有し、及び/又は、8超、好ましくは10超のブリックスレベルを有する果実を成長させることが可能である。或いは、又は、追加的に、栽培種スイカ植物は、ハイブリッド、三倍体又は四倍体植物である。或いは、又は、追加的に、栽培種スイカ植物は、三倍体種なし植物である。或いは、又は、追加的に、栽培種スイカ植物は、スイカ(C.lanatus subsp.lanatus)植物である。スイカ(C.lanatus subsp.lanatus)植物と野生スイカ系統種との種間交配の文脈において、栽培種スイカ植物は前記種間交配の子孫植物として定義され、ここで、前記子孫植物は、スイカ(C.lanatus subsp.lanatus)植物に対して少なくとも2回戻し交配されたものである。
「対立遺伝子」は、本発明の範囲内において、遺伝子又はQTLなどのいずれかの種類の同定可能な遺伝的決定因子の異なる形態と同一であるか、又は、これらに関連する種々の遺伝的単位の代替又は変異形態を指すと理解され、これらは、これらは相同染色体における同一の遺伝子座に位置しているために遺伝において代替的であるとされている。このような代替型又は異型は、一塩基多型、挿入、反転、転座若しくは欠失の結果であり得、又は例えば化学的若しくは構造的修飾、転写調節若しくは翻訳後修飾/調節によって引き起こされる遺伝子調節の結果であり得る。二倍体細胞又は生物において、所与の遺伝子又は遺伝要素の2つの対立遺伝子は、典型的に、相同染色体の対上の対応する遺伝子座を占有する。
相対的に、「向上したFON2耐性」又は「高いFON2耐性」という用語は、本明細書において、例えばFON2に対する耐性を付与するスイカ(C.lanatus subsp.citroides)植物由来の遺伝子移入配列を含んでおり、前記遺伝子移入配列が第10染色体上に位置されていると共にSNPマーカ1~15の少なくとも1つを含む本発明に係る植物は、前記遺伝子移入配列を含まない植物と比してFON2変種に対してより耐容性又はより耐性であることを意味すると理解される。
「向上したFON2耐性」は、本発明の範囲内において、本発明の遺伝子移入配列を含まない対照スイカ植物(例えば実施例のセクションに記載のもの)と比して、標準誤差を用いて、及び/又は、スチューデント検定を用いてP<0.05又はP<0.01で、FON2変種に対して統計的に有意に向上した耐性を有するスイカ植物を意味すると理解される。
「表現型」は、本発明の範囲内において、遺伝的に制御された形質の識別可能な特徴を指すと理解される。
「対照スイカ植物」は、本発明の範囲内において、本発明の栽培種スイカ植物と同一の遺伝的背景を有するスイカ植物を意味することが理解され、ここで、対照植物は、向上したFON2耐性に関連する本発明の遺伝子移入配列を有していない。特に、対照スイカ植物は、同一の植物品種に属すると共に、本発明に係る遺伝子移入配列を含まないスイカ植物である。対照スイカ植物は、本発明に係る栽培種のスイカ植物と同一の期間、及び、同一の条件下栽培される。本明細書において、植物品種は、UPOVの定義に準拠して理解される。それ故、対照スイカ植物は、近同質遺伝子系統、近交系又はハイブリッドであり得、ただし、これらは、本発明に係るスイカ植物と同一の遺伝的背景を有するが、対照植物は、向上したFON2耐性に関連する本発明に係る遺伝子移入配列を有していない。
「形質」という用語は、特徴又は表現型を指す。本発明の文脈において、FON2耐性形質は、向上したFON2耐性形質である。形質は、優性的若しくは劣性的に、又は、部分優性、半優性若しくは不完全優性的に継承され得る。本発明の文脈において、第10染色体上に位置されているFON2耐性付与性遺伝子移入配列は半優性である。本発明のスイカ植物はしたがって、形質についてヘテロ接合又はホモ接合であることが可能である。さらに、形質は一遺伝子的若しくは多遺伝子的であり得、又は、環境で1つ以上の遺伝子の相互作用に由来し得る。本発明の文脈において、第10染色体上に位置されているFON2耐性付与性遺伝子移入配列は、単独で、向上したFON2耐性形質の付与に十分である。
「雑種」、「雑種植物」及び「雑種子孫」という用語は、遺伝的に異なる親から生成された個体(例えば、遺伝的にヘテロ接合性又はほぼヘテロ接合性の個体)を指す。
「近交系」という用語は、遺伝的にホモ接合性又はほぼホモ接合性の集団を指す。近交系は、例えば、兄弟/姉妹育種若しくは自殖のいくつかの周期を通して又は二ゲノム性半数体生成において得られる。
「二ゲノム性半数体系統」という用語は、別の培養物に由来する安定した近交系を指す。特定の培地及び環境で栽培されたいくつかの花粉粒(半数体)は、n個の染色体を含有する胚を発達させ得る。次に、これらの胚は、「倍化」され、2n個の染色体を含有する。これらの胚の子孫は、「二ゲノム性半数体」と呼ばれ、本質的にもはや分離しない(安定している)。
「三倍体スイカ植物」及び「四倍体スイカ植物」という用語は、特定の倍数性を有するスイカ植物を指す。三倍体(「種なし」とも称される)スイカは、雌親としての四倍体スイカと雄親としての二倍体スイカとの真のF1ハイブリッドである(Kihara,1951)。二倍体スイカ植物は22本の染色体(2N=2X=22)を有する一方で、四倍体スイカ植物は44本の染色体(2N=4X=44)を有する。四倍体スイカ植物は二倍体スイカ植物の化学処理で得られる。コルヒチン又はオリザリンなどの化学物質が、染色体複製を誘起するために度々用いられる。四倍体スイカ植物の雌花が二倍体スイカ植物の雄花により受粉すると、四倍体植物の果実中にもたらされる種子は三倍体ハイブリッド種子である。三倍体種子から成長する三倍体ハイブリッド植物は、三倍体接合体は正常な生存可能な配偶子をもたらすことができないために自家不稔である(Fehr,1987)。したがって、種なしスイカ果実の生産を確実にするためには、三倍体植物における結実は、化学的手段で誘起するか、又は、時に二倍体授粉植物と呼ばれる二倍体スイカ植物による受粉により誘発する必用がある。
「遺伝的に固定された」という用語は、通常は前記遺伝子配列を含有しない植物のゲノムに安定的に組み込まれた遺伝子配列を指す。遺伝的に固定されている場合、遺伝子配列は、有性交配によって他の植物に容易で予測可能に継承可能である。
「台木」という用語は、挿木に対する受け部として用いられる植物を指す。典型的には、台木植物及び挿木は遺伝子型が異なるものである。実施形態において、本発明に係る植物は台木植物として用いられる。
「植物」又は「植物部分」という用語は、以後、本発明に係るスイカ植物から得ることができる植物部分、器官又は組織であって、葉、茎、根、花若しくは花部、果実、シュート、配偶体、胞子体、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合子、胚、分裂組織部位、カルス組織、種子、挿木、細胞若しくは組織培養物、又は特に果実を産生する植物へと成長した場合、本発明に係る向上したFON2耐性形質を依然として示す植物の任意の他の部分若しくは産物を含むが、これらに限定されない、植物部分、器官又は組織を指す。
「植物」は、任意の発達段階における任意の植物である。
「スイカ植物種子」は、実施形態にいずれかに記載のスイカ植物へと成長する種子である。
「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む植物の構造的及び生理的単位である。植物細胞は、単離された単一の細胞若しくは培養された細胞の形態であり得、又は例えば植物組織、植物器官若しくは植物全体などの高度に組織化された単位の一部としてのものであり得る。
「植物細胞培養物」は、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚株、胚嚢、接合子及び様々な発達段階における胚などの植物単位の培養物を意味する。
「植物器官」は、根、茎、葉、花芽又は胚など、明確で視覚的に構造化された植物の分化した部分である。
本明細書において使用される際、「植物組織」は、構造的及び機能的単位へと組織化された植物細胞の群を意味する。植物中又は培養物中の任意の植物組織が含まれる。この用語は、限定はされないが、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物並びに構造的及び/又は機能的単位へと組織化された植物細胞の任意の群を含む。上に列挙されるか又はこの定義によって包含される任意の特定のタイプの植物組織と併せた又はそれを伴わないこの用語の使用は、任意の他のタイプの植物組織を除外することが意図されない。
本明細書において使用される際、「育種」という用語及びその文法的変化形は、子孫の個体を生成する任意のプロセスを指す。育種は、有性若しくは無性又はそれらの任意の組合せであり得る。例示的な非限定的な育種のタイプは、交配、自殖、倍加半数体の派生的生成及びそれらの組合せを含む。
本明細書において使用される際、「確立された育種集団」という語句は、育種計画、例えば商業的育種計画において親によって生成され、及び/又は親として使用される潜在的育種パートナーの集合を指す。確立された育種集団のメンバーは、典型的に、遺伝子的に及び/又は表現型的に十分に特性決定されている。例えば、対象とするいくつかの表現型形質は、例えば、異なる環境条件下、複数の場所及び/又は異なる時間で評価され得る。代わりに又は加えて、表現型形質の発現に関連する1つ又は複数の遺伝子座が同定され得、育種集団のメンバーの1つ又は複数は、1つ又は複数の遺伝子座に関して、及び1つ又は複数の遺伝子座に関連する1つ又は複数の遺伝子マーカに関して遺伝子型を決定され得る。
本明細書において使用される際、「二倍体個体」という語句は、2組の染色体を有する個体を指し、典型的に、1つは、その2つの親のそれぞれからのものである。しかしながら、ある実施形態において、二倍体個体は、例えば、植物が自殖して植物の次の世代を生成する場合、同じ単一の生物からその「母親」及び「父親」の染色体の組を受け継ぎ得ることが理解される。
「ホモ接合」とは、本発明の範囲内において、相同染色体における1つ以上の対応する遺伝子座における同様の対立遺伝子を指すと理解される。本発明の文脈において、例えば第10染色体上に位置されている遺伝子移入配列といった、特定の遺伝子座における特定の遺伝子移入配列の2つの同一コピーを含むスイカ植物は、対応する遺伝子座においてホモ接合である。
「ヘテロ接合」は、本発明の範囲内において、相同染色体の1つ以上の対応する遺伝子座における対立遺伝子が異なっていることを指すと理解される。本発明の文脈において、第10染色体上に位置されている例えば遺伝子移入配列といった特定の遺伝子座における特定の遺伝子移入配列の1つのコピーを含むスイカ植物は、対応する遺伝子座においてヘテロ接合である。
「優性」対立遺伝子は、本発明の範囲内において、ヘテロ接合若しくはホモ接合状態で存在する場合に表現型を決定する対立遺伝子を指すと理解される。
「半優性」対立遺伝子は、本発明の範囲内において、ヘテロ接合若しくはホモ接合状態で存在する場合に表現型を決定する対立遺伝子を指すと理解される。しかしながら、表現型の強さは一般に、対立遺伝子がホモ接合状態で存在する場合により高い。
「劣性」対立遺伝子は、ホモ接合状態でのみ存在する場合に表現型を決定する対立遺伝子を指す。
「戻し交配」は、本発明の範囲内において、雑種の子孫が元の親の一方と繰り返し交配されるプロセスを指すものと理解される。異なる反復親が後の戻し交配において使用され得る。
「遺伝子座」は、本発明の範囲内において、遺伝子、QTL又は形質に寄与するその対応する遺伝子配列を含む染色体上の領域を指すものと理解される。
本明細書において使用される際、「マーカ遺伝子座」は、個体のゲノムに存在し、対象とする1つ又は複数の遺伝子座に関連するヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列を含む染色体上の領域を指し、これは、遺伝子又は形質に寄与する任意の他の遺伝的決定因子若しくは因子を含み得る。
「遺伝連鎖」は、本発明の範囲内において、同一の染色体において近接する遺伝子の位置による遺伝における特徴の関連性を指すと理解され、遺伝子座間の組み換え率によって計測される(センチモルガン、cM)。
本明細書において使用される際、本開示の主題に関連する「有性交配」及び「有性生殖」という語句は、配偶子の融合により(例えば、植物において受粉により種子を生成するなどの受精によって)子孫を生成することを指す。「有性交配」又は「他家受精」は、ある実施形態において、一個体の、別の個体による受精(例えば、植物における他花受粉)を指す。「自殖」という用語は、ある実施形態において、自家受精又は自家受粉による種子の生成、すなわち花粉及び胚珠が同じ植物からのものであることを指す。
本明細書において使用される際、「遺伝子マーカ」又は「DNAマーカ」という語句は、対象とする1つ又は複数の遺伝子座に関連する個体のゲノムの特徴(例えば、個体のゲノムに存在するヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列)を指す。ある実施形態において、遺伝子マーカは、文脈に応じて、対象とする集団において多型であるか、又は多型によって占有される遺伝子座である。遺伝子マーカとしては、多くの他の例の中でも、例えば一塩基多型(SNP)、インデル(すなわち挿入/欠失)、単純反復配列(SSR)、制限酵素断片長多型(RFLP)、ランダム増幅多型DNA(RAPD)、切断増幅多型配列(CAPS)マーカ、多様性アレイ技術(DArT)マーカ及び増幅断片長多型(AFLP)が挙げられる。遺伝子マーカは、例えば、表現型形質の変動性に寄与する染色体上の対立遺伝子を含有する遺伝子座の位置を特定するのに使用され得る。「遺伝子マーカ」という語句は、プローブとして使用される核酸の配列などのゲノム配列と相補的なポリヌクレオチド配列も指し得る。
本明細書において使用される際、「遺伝子型」という用語は、細胞又は生物の遺伝子構成を指す。個体の「一連の遺伝子マーカに対する遺伝子型」は、個体のハプロタイプに存在する1つ又は複数の遺伝子マーカ遺伝子座に対する特定の対立遺伝子を含む。
本明細書において使用される際、「子孫」という用語は、特定の交配の子孫を指す。典型的に、子孫は、2つの個体の育種から生じるが、いくつかの種(特にいくつかの植物及び雌雄同体の動物)は、自殖し得る(すなわち同じ植物が雄性及び雌性配偶子の両方のドナーとしての役割を果たす)。子孫は、例えば、F1、F2又は任意の次世代のものであり得る。
本明細書において用いられるところ、「量的形質遺伝子座」(QTL)という用語は、遺伝子マーカと、目的の形質の表現型に影響を与える染色体領域及び/又は遺伝子及び/又は遺伝子移入配列との間における関連性を指す。典型的には、これは、統計的に;例えば、文献において公開された1つ以上方法に基づいて決定される。QTLは、表現型形質に異なる影響を与える少なくとも2つの対立遺伝子を伴う、染色体領域、及び/又は、遺伝子座であることが可能である。
「レシピエントスイカ植物」という用語は、向上したFON2耐性に係る遺伝子移入配列を含むドナースイカ植物から得られたDNAを受け取るスイカ植物を示すために本明細書において用いられる。
「天然の遺伝的背景」という用語は、遺伝子配列の元の遺伝的背景を示すために本明細書において用いられる。このような背景は、例えば、スイカの野生系統種のゲノムであり得る。例えば、本発明の遺伝子配列は、スイカ(C.lanatus subsp.citroides)植物の第10染色体上の特定の位置で見い出された。反対に、スイカ(C.lanatus subsp.citroides)植物の第10染色体由来のこの遺伝子配列を含むDNAの、好ましくは栽培種スイカ植物、さらにより好ましくはスイカ(C.lanatus subsp.lanatus)植物である他のスイカ種の第10染色体上の同一の位置への、例えば栽培を介した導入を伴う方法は、天然の遺伝的背景を有さないこの遺伝子配列をもたらすこととなる。スイカ(C.lanatus subsp.citroides)背景から、好ましくは栽培種スイカ植物、さらにより好ましくはスイカ(C.lanatus subsp.lanatus)植物である他のスイカ種に本発明の遺伝子配列が導入される場合、これらは、「遺伝子移入配列」又は「遺伝子移入遺伝子配列」と称される。
「ドナースイカ植物」は、本発明の範囲内において、向上したFON2耐性に係る遺伝子移入配列をもたらすスイカ植物を意味すると理解される。
「マーカによる選択」は、本発明の範囲内において、例えば植物由来の1つ又は複数の核酸を検出する遺伝子マーカの使用を指すものと理解され、選択的育種計画においてそれらの植物が使用(又は回避)され得るように、核酸は、望ましい(又は望ましくない)形質に関する対立遺伝子を有する植物を同定するように所望の形質に関連している。
DNA中の単一部位における変異である一塩基多型(SNP)は、ゲノムの変異の最もよく見られるタイプである。一塩基多型(SNP)は、ゲノム(又は他の共有配列)中の一塩基(A、T、C又はG)が生物学的種のメンバー間又は個体の対合染色体間で異なるときに起こるDNA配列の変異である。例えば、異なる個体由来の2つの配列決定されたDNA断片、AAGCCTAと、AAGCTTAとは、一塩基の相違を含む。この場合、2つの対立遺伝子:C及びTがある。SNPアレイの基本原理は、DNAマイクロアレイと同じである。これらは、DNAハイブリダイゼーション、蛍光顕微鏡法及びDNA捕捉の集合である。SNPアレイの3つの構成要素は、核酸配列(すなわち増幅配列又は標的)を含むアレイ、1つ又は複数の標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイゼーションシグナルを記録し、それを解釈する検出システムである。所望のSNPマーカ対立遺伝子の有無は、二本鎖DNA色素又は蛍光レポータープローブ法を用いたリアルタイムPCRによって決定され得る。
「PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)」は、本発明の範囲内において、ゲノムのDNAの特定の領域又はサブセットを比較的大量に生成し、それにより、それらの領域に基づく様々な分析を可能にする方法を指すものと理解される。「PCRプライマ」は、本発明の範囲内において、DNAの特定領域のPCR増幅において使用される一本鎖DNAの比較的短い断片を指すものと理解される。
本明細書において使用される際、「プローブ」は、特定の標的分子又は細胞構造を認識しそれに結合することができ、したがって標的分子又は構造の検出を可能にする原子又は分子の群を指す。特に、「プローブ」は、分子ハイブリダイゼーションによって相補的な配列の存在を検出し、それを定量化するのに使用され得る標識されたDNA又はRNA配列を指す。
「配列同一性」。2つ以上の核酸又はタンパク質配列に関する「同一の」又は「同一性」という用語は、同じであるか、又は以下の配列比較アルゴリズムの1つを使用して若しくは目視検査によって測定される際、最大の一致について比較及び整列したとき、同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する2つ以上の配列又は部分配列を指す。互いに比較される2つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに関連する。本明細書において使用される際、2つの配列間のパーセント同一性/相同性は、2つの配列の最適アライメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列に共有される同一位置の数の関数である(すなわち%同一性=同一位置の数/位置の総数×100)。配列の比較及び2つの配列間のパーセント同一性の決定は、本明細書において後述されるように数学アルゴリズムを用いて行われ得る。例えば、配列同一性は、従来のように、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive Madison,WI 53711)などのコンピュータプログラムを用いて決定され得る。Bestfitは、2つの配列間の最も高い配列同一性を有するセグメントを発見するために、Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2(1981),482-489の遺伝子座相同性アルゴリズムを利用する。特定の配列が例えば本発明の参照配列と95%の同一性を有するかどうかを決定するためにBestfit又は別の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、好ましくは、同一性のパーセンテージが参照配列の全長にわたって計算されるように、及び参照配列におけるヌクレオチドの総数の5%までの相同性ギャップが許容されるように調整される。Bestfitを使用する場合、いわゆる任意選択的パラメータは、好ましくは、それらの予め設定された(「初期」)値のままである。所与の配列と、本発明の上記の配列との間の比較において見られる逸脱は、例えば、付加、欠失、置換、挿入又は組み換えによって引き起こされ得る。このような配列比較は、好ましくは、プログラム「fasta20u66」(William R.Pearson及びthe University of Virginiaによるバージョン2.0u66、1998年9月;W.R.Pearson(1990),Methods in Enzymology 183,63-98、添付の例及びhttp://workbench.sdsc.edu/も参照されたい)を用いても行われ得る。この目的のために、「初期」パラメータ設定が使用され得る。
実施形態
植物、種子、果実。
第1の実施形態において、本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)感染に対して耐性である栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物であって、そのゲノム中に、FON2に対する耐性を付与するスイカ(C.lanatus subsp.citroides)由来の遺伝子移入配列を含むものを提供し、ここで、前記遺伝子移入配列は、第10染色体上に位置されていると共に、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
植物、種子、果実。
第1の実施形態において、本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)感染に対して耐性である栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物であって、そのゲノム中に、FON2に対する耐性を付与するスイカ(C.lanatus subsp.citroides)由来の遺伝子移入配列を含むものを提供し、ここで、前記遺伝子移入配列は、第10染色体上に位置されていると共に、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
さらに、既述の実施形態に記載の植物においては:
a)SNPマーカ1に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号2の順方向プライマ及び配列番号5の逆方向プライマ、並びに、配列番号3のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
b)SNPマーカ2に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号7の順方向プライマ及び配列番号10の逆方向プライマ、並びに、配列番号8のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
c)SNPマーカ3に対するインデル遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号12の順方向プライマ及び配列番号15の逆方向プライマ、並びに、配列番号13のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
d)SNPマーカ4に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号17の順方向プライマ及び配列番号20の逆方向プライマ、並びに、配列番号18のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
e)SNPマーカ5に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号22の順方向プライマ及び配列番号25の逆方向プライマ、並びに、配列番号23のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
f)SNPマーカ6に対するC遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号27の順方向プライマ及び配列番号30の逆方向プライマ、並びに、配列番号28のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
g)SNPマーカ7に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号32の順方向プライマ及び配列番号35の逆方向プライマ、並びに、配列番号33のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
h)SNPマーカ8に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号37の順方向プライマ及び配列番号40の逆方向プライマ、並びに、配列番号38のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
i)SNPマーカ9に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号42の順方向プライマ及び配列番号45の逆方向プライマ、並びに、配列番号43のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
j)SNPマーカ10に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号47の順方向プライマ及び配列番号50の逆方向プライマ、並びに、配列番号48のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
k)SNPマーカ11に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号52の順方向プライマ及び配列番号55の逆方向プライマ、並びに、配列番号53のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
l)SNPマーカ12に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号57の順方向プライマ及び配列番号60の逆方向プライマ、並びに、配列番号58のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
m)SNPマーカ13に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号62の順方向プライマ及び配列番号65の逆方向プライマ、並びに、配列番号63のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
n)SNPマーカ14に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号67の順方向プライマ及び配列番号70の逆方向プライマ、並びに、配列番号68のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;並びに/又は
o)SNPマーカ15に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号72の順方向プライマ及び配列番号75の逆方向プライマ、並びに、配列番号73のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能である。
a)SNPマーカ1に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号2の順方向プライマ及び配列番号5の逆方向プライマ、並びに、配列番号3のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
b)SNPマーカ2に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号7の順方向プライマ及び配列番号10の逆方向プライマ、並びに、配列番号8のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
c)SNPマーカ3に対するインデル遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号12の順方向プライマ及び配列番号15の逆方向プライマ、並びに、配列番号13のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
d)SNPマーカ4に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号17の順方向プライマ及び配列番号20の逆方向プライマ、並びに、配列番号18のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
e)SNPマーカ5に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号22の順方向プライマ及び配列番号25の逆方向プライマ、並びに、配列番号23のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
f)SNPマーカ6に対するC遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号27の順方向プライマ及び配列番号30の逆方向プライマ、並びに、配列番号28のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
g)SNPマーカ7に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号32の順方向プライマ及び配列番号35の逆方向プライマ、並びに、配列番号33のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
h)SNPマーカ8に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号37の順方向プライマ及び配列番号40の逆方向プライマ、並びに、配列番号38のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
i)SNPマーカ9に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号42の順方向プライマ及び配列番号45の逆方向プライマ、並びに、配列番号43のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
j)SNPマーカ10に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号47の順方向プライマ及び配列番号50の逆方向プライマ、並びに、配列番号48のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
k)SNPマーカ11に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号52の順方向プライマ及び配列番号55の逆方向プライマ、並びに、配列番号53のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
l)SNPマーカ12に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号57の順方向プライマ及び配列番号60の逆方向プライマ、並びに、配列番号58のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
m)SNPマーカ13に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号62の順方向プライマ及び配列番号65の逆方向プライマ、並びに、配列番号63のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
n)SNPマーカ14に対するG遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号67の順方向プライマ及び配列番号70の逆方向プライマ、並びに、配列番号68のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;並びに/又は
o)SNPマーカ15に対するA遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号72の順方向プライマ及び配列番号75の逆方向プライマ、並びに、配列番号73のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能である。
本発明のさらなる実施形態において、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列は、対応するSNPマーカ1~15を保持しながら、配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号16、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、及び/又は配列番号71、又は、前記配列の1つ以上に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%同一である配列の少なくとも1つを含む。
本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、SNPマーカ5、7及び15の少なくとも1つを含む。本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、SNPマーカ5及び15を含む。
本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、前記少なくとも1つのSNPマーカについてヘテロ接合である。本発明のさらなる実施形態において、前記植物は、前記少なくとも1つのSNPマーカについてホモ接合である。
本発明のさらなる実施形態において、前記遺伝子移入配列は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先に含まれ、これから入手され、又は、これから入手可能である。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を含有しないスイカ植物とを交配することにより得られる。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、近郊系、二ゲノム性半数体、二倍体、三倍体、四倍体又はハイブリッド植物である。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は三倍体であり、及び、前記植物は、二倍体及び四倍体間の交配から生産される。さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、二倍体近郊系雄親系統及び四倍体近郊系雌親系統間の交配から生産される。さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供するものであり、ここで、前記植物は、本発明の遺伝子移入配列の3つのコピーを含む。
他の実施形態において、本発明に係る植物は雄性不稔性である。他の実施形態において、本発明に係る植物は細胞質雄性不稔性である。
他の実施形態において、本発明に係る植物は成熟したスイカ果実を成長させ、ここで、前記成熟した果実の内部の果肉はオレンジ色である。
さらなる実施形態において、本発明のスイカ植物は前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物であり、ここで、前記第10染色体上に位置されているFON2耐性付与性遺伝子移入配列は、以下の表4に開示されているSNPマーカ1~15のいずれかを用いて同定可能である。
さらなる実施形態において、本発明は、フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)感染に対して耐性である栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物であって、そのゲノム中に、第10染色体上に位置されているFON2に対する耐性を付与するスイカ(C.lanatus subsp.citroides)由来の遺伝子移入配列を含むものを提供し、ここで、前記植物ゲノムは:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型、及び
b)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型、及び
b)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む。
さらなる実施形態において、既述の実施形態の栽培種スイカ植物はさらに、表4に開示されているSNPマーカ2~14のいずれかに少なくとも第3の耐性対立遺伝子を含む。
さらなる実施形態において、本発明のスイカ植物は前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物であり、ここで、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078、又は、その子孫若しくは祖先は、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列のソースであり、また、ここで、植物18WMH505078の代表種子は、NCIMB受入番号43627で寄託されている。
特に限定されないが、葉、茎、根、花又は花部、果実、苗条、配偶体、胞子対、花粉、葯、小胞子、卵細胞、接合体、胚、分裂組織部位、カルス組織、種子、挿木、細胞若しくは組織培養物、又は、特に果実を産する植物に成長した際においても本発明に係るFON2耐性形質をなお示す、植物のいずれかの他の部分若しくは産物を含む前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物から得られる植物部位、器官又は組織の提供がさらなる実施形態である。
さらなる実施形態において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載の植物を産する種子を提供するものである。
さらなる実施形態において、本発明は、スイカ台木としての前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の使用に関する。さらなる実施形態において、本発明は、スイカ台木としてのスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先の使用に関する。
他の実施形態においては、スイカ果実を生産し、収穫するための、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物、植物部位又は種子の使用が考えられている。
他の実施形態において、本発明は、いずれかの実施形態に記載のスイカ植物、植物部位又は種子の使用に関し、ここで、スイカ植物、植物部位又は種子は、スイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先である。
さらなる実施形態において、本発明は、圃場、温室又はビニールハウスに播種するための、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物、植物部位又は種子の使用に関する。
一実施形態においては、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物により生産されたスイカ果実を提供する。
本発明はさらに、FON2耐性形質を前記FON2耐性形質を含まないスイカ植物に遺伝子移入するための、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の使用に関する。
本発明はさらに、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物に関し、ここで、前記植物はさらに、FON1に対する耐性に関連するQTLを含み、ここで、前記QTLは第1染色体上に位置されていると共に、前記QTLはスイカ品種カルフーングレイ(Calhoun Grey)に由来する。
遺伝子配列、マーカ。
本発明はさらに、スイカ植物においてFON2耐性形質に関連する遺伝子移入遺伝子配列に関する。さらなる実施形態において、本発明の遺伝子配列は、第10染色体上に位置されている。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子配列は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816のドナー植物、又は、スイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)のドナー植物、又は、その子孫若しくは祖先であって前記遺伝子配列を含むものに、含まれており、これらから入手され、又は、これらから入手可能である。
本発明はさらに、スイカ植物においてFON2耐性形質に関連する遺伝子移入遺伝子配列に関する。さらなる実施形態において、本発明の遺伝子配列は、第10染色体上に位置されている。本発明のさらなる実施形態において、遺伝子配列は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816のドナー植物、又は、スイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)のドナー植物、又は、その子孫若しくは祖先であって前記遺伝子配列を含むものに、含まれており、これらから入手され、又は、これらから入手可能である。
他の実施形態において、本発明の遺伝子移入遺伝子配列は、第10染色体上に位置されていると共に、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
により特徴付けられる。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
により特徴付けられる。
本発明は、スイカ植物、特に栽培種スイカ植物においてFON2耐性形質を検出するためのキットを開示するものであり、ここで、前記キットは、以下から選択される少なくとも1つのPCRオリゴヌクレオチドプライマ対及びプローブを含む。
a)配列番号2の順方向プライマ、及び、配列番号5の逆方向プライマ、及び、配列番号3のプローブ;
b)配列番号7の順方向プライマ、及び、配列番号10の逆方向プライマ、及び、配列番号8のプローブ;
c)配列番号12の順方向プライマ、及び、配列番号15の逆方向プライマ、及び、配列番号13のプローブ;
d)配列番号17の順方向プライマ、及び、配列番号20の逆方向プライマ、及び、配列番号18のプローブ;
e)配列番号22の順方向プライマ、及び、配列番号25の逆方向プライマ、及び、配列番号23のプローブ;
f)配列番号27の順方向プライマ、及び、配列番号30の逆方向プライマ、及び、配列番号28のプローブ;
g)配列番号32の順方向プライマ、及び、配列番号35の逆方向プライマ、及び、配列番号33のプローブ;
h)配列番号37の順方向プライマ、及び、配列番号40の逆方向プライマ、及び、配列番号38のプローブ;
i)配列番号42の順方向プライマ、及び、配列番号45の逆方向プライマ、及び、配列番号43のプローブ;
j)配列番号47の順方向プライマ、及び、配列番号50の逆方向プライマ、及び、配列番号48のプローブ;
k)配列番号52の順方向プライマ、及び、配列番号55の逆方向プライマ、及び、配列番号53のプローブ;
l)配列番号57の順方向プライマ、及び、配列番号60の逆方向プライマ、及び、配列番号58のプローブ;
m)配列番号62の順方向プライマ、及び、配列番号65の逆方向プライマ、及び、配列番号63のプローブ;
n)配列番号67の順方向プライマ、及び、配列番号70の逆方向プライマ、及び、配列番号68のプローブ;及び/又は
o)配列番号72の順方向プライマ、及び、配列番号75の逆方向プライマ、及び、配列番号73のプローブ。
a)配列番号2の順方向プライマ、及び、配列番号5の逆方向プライマ、及び、配列番号3のプローブ;
b)配列番号7の順方向プライマ、及び、配列番号10の逆方向プライマ、及び、配列番号8のプローブ;
c)配列番号12の順方向プライマ、及び、配列番号15の逆方向プライマ、及び、配列番号13のプローブ;
d)配列番号17の順方向プライマ、及び、配列番号20の逆方向プライマ、及び、配列番号18のプローブ;
e)配列番号22の順方向プライマ、及び、配列番号25の逆方向プライマ、及び、配列番号23のプローブ;
f)配列番号27の順方向プライマ、及び、配列番号30の逆方向プライマ、及び、配列番号28のプローブ;
g)配列番号32の順方向プライマ、及び、配列番号35の逆方向プライマ、及び、配列番号33のプローブ;
h)配列番号37の順方向プライマ、及び、配列番号40の逆方向プライマ、及び、配列番号38のプローブ;
i)配列番号42の順方向プライマ、及び、配列番号45の逆方向プライマ、及び、配列番号43のプローブ;
j)配列番号47の順方向プライマ、及び、配列番号50の逆方向プライマ、及び、配列番号48のプローブ;
k)配列番号52の順方向プライマ、及び、配列番号55の逆方向プライマ、及び、配列番号53のプローブ;
l)配列番号57の順方向プライマ、及び、配列番号60の逆方向プライマ、及び、配列番号58のプローブ;
m)配列番号62の順方向プライマ、及び、配列番号65の逆方向プライマ、及び、配列番号63のプローブ;
n)配列番号67の順方向プライマ、及び、配列番号70の逆方向プライマ、及び、配列番号68のプローブ;及び/又は
o)配列番号72の順方向プライマ、及び、配列番号75の逆方向プライマ、及び、配列番号73のプローブ。
本発明はまた、スイカ植物、特に栽培種スイカ植物におけるFON2耐性形質遺伝子座の診断的選択及び/又は遺伝子型同定のための、本発明のSNPマーカの少なくとも1つ、少なくとも2つ又は少なくとも3つの使用を開示する。
本発明はさらに、スイカ植物、特に栽培種スイカ植物、より特定的に本発明に係るスイカ植物において、FON2耐性形質の存在を同定するため、及び/又は、スイカ植物、特に栽培種スイカ植物、特に本発明に係る本明細書に記載のスイカ植物におけるFON2耐性形質の遺伝子移入を監視するための、本発明に係るSNPマーカの少なくとも1つ、少なくとも2つ又は少なくとも3つの使用を開示する。本発明はさらに、表4から選択される少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマ又は一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマを伴うPCR反応において入手可能であるポリヌクレオチド(増幅産物)を開示し、この増幅産物は、本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列を含む、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先から入手可能である増幅産物に対応する。
上記のPCR反応において入手可能である前記増幅産物のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示す前記増幅産物及び/又はポリヌクレオチドの配列に対して、少なくとも95%、特に少なくとも96%、特に少なくとも97%、特に少なくとも98%、特に少なくとも99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドもまた本明細書において予期されている。
本発明に係るものであって、上記において本明細書に記載の増幅産物は次いで、FON2耐性形質遺伝子座の同定に使用可能である新規プライマ及び/又はプローブの生成又は開発に使用可能である。
本発明はしたがって、一実施形態において、本発明に係るものであって、上記において本明細書に記載の増幅産物から技術分野において公知である方法によって開発された派生マーカ、特に派生プライマ又はプローブにさらに関し、この派生マーカは、FON2耐性形質遺伝子座に遺伝的に関連付けられている。
育種方法。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を生産する方法を提供するものであり、この方法は
a)前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を欠く栽培種スイカ植物とを交配するステップ;
b)FON2に対する耐性を付与する、第10染色体上に位置された前記遺伝子移入配列を含む子孫植物を選択するステップであって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出するステップを含む、選択するステップ;
を含み、これにより、高いFON2に対する耐性を有する植物を生産する。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を生産する方法を提供するものであり、この方法は
a)前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を欠く栽培種スイカ植物とを交配するステップ;
b)FON2に対する耐性を付与する、第10染色体上に位置された前記遺伝子移入配列を含む子孫植物を選択するステップであって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出するステップを含む、選択するステップ;
を含み、これにより、高いFON2に対する耐性を有する植物を生産する。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかの方法に関し、ここで、この方法は:
c)選択された子孫を自配させるステップ、又は、選択された子孫と他のスイカ植物とを交配してさらなる子孫を生産するステップ
をさらに含む。
c)選択された子孫を自配させるステップ、又は、選択された子孫と他のスイカ植物とを交配してさらなる子孫を生産するステップ
をさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明は、さらなる子孫が選択され、さらに2~10世代自配/交配される前述の実施形態に係る方法に関する。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態のいずれかの方法に関し、ここで、ステップa)の植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先である。
他の実施形態において、本発明は、FON2耐性スイカ植物、植物部位又は種子を提供する方法に関し、ここで、前記方法は、以下のステップを含む。
a)本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列を含まない第1の植物と、いずれかの実施形態に記載の第2のスイカ植物とを交配するステップ、
b)子孫スイカ植物を得るステップ、及び
c)任意に、特徴付けられている前記子孫の植物であって、FON2変種に対する耐性を示す前記植物を選択するステップ。
a)本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列を含まない第1の植物と、いずれかの実施形態に記載の第2のスイカ植物とを交配するステップ、
b)子孫スイカ植物を得るステップ、及び
c)任意に、特徴付けられている前記子孫の植物であって、FON2変種に対する耐性を示す前記植物を選択するステップ。
さらなる実施形態において、本発明は、第2のスイカ植物が、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先である、前述の実施形態に係る方法に関する。
他の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、FON2耐性スイカ植物を生産する方法に関する。
a)前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の種子を提供するステップ
b)前記種子を発芽させ、これから成熟した稔性植物を育てるステップ、
c)a)の前記植物に自家受粉を誘発させ、果実を育て、及び、これから稔性種子を収穫するステップ、並びに
d)c)で収穫した種子から植物を育て、及び、FON2耐性スイカ植物を選択するステップ。
a)前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の種子を提供するステップ
b)前記種子を発芽させ、これから成熟した稔性植物を育てるステップ、
c)a)の前記植物に自家受粉を誘発させ、果実を育て、及び、これから稔性種子を収穫するステップ、並びに
d)c)で収穫した種子から植物を育て、及び、FON2耐性スイカ植物を選択するステップ。
他の実施形態において、本発明は、スイカ植物のFON2に対する耐性を高める方法に関し、この方法は、以下のステップを含む。
a)第10染色体上に位置されている1つの遺伝子移入配列に関連するFON2耐性形質を含むスイカを選択するステップであって、前記形質を、表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つの存在により同定が可能であるもの;
b)FON2耐性形質を含むステップa)の前記植物と、FON2耐性形質を含まず、且つ、ステップa)の植物と比してFON2に対する感受性を示すスイカ植物、特に栽培種スイカ植物とを交配するステップ、及び
c)前記交配に由来する、ステップb)の植物と比して高いFON2耐性を示す子孫を選択するステップ。
a)第10染色体上に位置されている1つの遺伝子移入配列に関連するFON2耐性形質を含むスイカを選択するステップであって、前記形質を、表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つの存在により同定が可能であるもの;
b)FON2耐性形質を含むステップa)の前記植物と、FON2耐性形質を含まず、且つ、ステップa)の植物と比してFON2に対する感受性を示すスイカ植物、特に栽培種スイカ植物とを交配するステップ、及び
c)前記交配に由来する、ステップb)の植物と比して高いFON2耐性を示す子孫を選択するステップ。
さらなる実施形態において、本発明はFON2に対する耐性を示すF1スイカ植物を生産する方法に関し、この方法は、前述の実施形態のいずれか一つに記載の植物である近郊系スイカ植物と、異なる近郊系スイカ植物とを交配させて、F1ハイブリッド子孫を生産するステップを含む。
選択方法。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示すと共に、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列の少なくとも1つのコピーを有する栽培種スイカ植物、好ましくは栽培種スイカ(Citrullus lanatus)植物を同定するための方法を提供するものであり、前記方法は、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出し、これにより、FON2に対する耐性を示すスイカ植物を同定するステップを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示すと共に、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列の少なくとも1つのコピーを有する栽培種スイカ植物、好ましくは栽培種スイカ(Citrullus lanatus)植物を同定するための方法を提供するものであり、前記方法は、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出し、これにより、FON2に対する耐性を示すスイカ植物を同定するステップを含む。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態に係る方法に関し、ここで、前記方法はさらに、前記1つ以上のSNPマーカを含むスイカ植物を選択するステップ、及び、選択されたスイカ植物と、第2のスイカ植物とを交配して、少なくとも1つの前記SNPマーカを含むと共にFON2に対する耐性を示す子孫スイカ植物を生産するステップを含む。
他の実施形態において、本発明は、本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列を含むスイカ植物を同定する方法に関し、ここで、前記方法は、以下のステップを含む。
a)FON2耐性形質について分離する集団を提供するステップ、
b)FON2に対する耐性を示す要素に対する分離集団をスクリーニングするステップであって、前記形質は、本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列の存在によって同定可能であるもの、
c)分離集団の1つの要素を選択するステップであって、前記要素はFON2耐性形質を含むもの。
a)FON2耐性形質について分離する集団を提供するステップ、
b)FON2に対する耐性を示す要素に対する分離集団をスクリーニングするステップであって、前記形質は、本発明のFON2耐性付与性遺伝子移入配列の存在によって同定可能であるもの、
c)分離集団の1つの要素を選択するステップであって、前記要素はFON2耐性形質を含むもの。
さらなる実施形態において、本発明は、第10染色体において遺伝子移入配列を含む栽培種スイカ植物を同定する方法であって、前記遺伝子移入配列はFON2に対する耐性を付与するものであり、以下を含む方法を提供する:
a)FON2耐性について分離する集団を提供するステップ、
b)表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つを検出するキットを用いて前記集団をスクリーニングするステップ、及び
c)表4の列挙において選択された前記少なくとも1つのSNPマーカを含む植物を同定するステップ。
a)FON2耐性について分離する集団を提供するステップ、
b)表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つを検出するキットを用いて前記集団をスクリーニングするステップ、及び
c)表4の列挙において選択された前記少なくとも1つのSNPマーカを含む植物を同定するステップ。
さらなる実施形態において、本発明は、第10染色体におけるFON2耐性形質の野生スイカソースを同定する方法を提供するものであり、この方法は以下を含む。
a)野生スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種を提供するステップ、
b)表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つを検出するキットを用いて前記スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種をスクリーニングするステップ、並びに
c)表4の列挙において選択された前記少なくとも1つのSNPマーカを含む野生スイカ系統種を同定するステップ。
a)野生スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種を提供するステップ、
b)表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つを検出するキットを用いて前記スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種をスクリーニングするステップ、並びに
c)表4の列挙において選択された前記少なくとも1つのSNPマーカを含む野生スイカ系統種を同定するステップ。
さらに他の実施形態において、本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物のゲノムから、好ましくはスイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先のゲノムから増幅し少なくとも1つのSNPマーカの使用に関し、ここで、前記SNPマーカは、以下のキットの一つ:
a)配列番号2の順方向プライマ、及び、配列番号5の逆方向プライマ、及び、配列番号3のプローブ;
b)配列番号7の順方向プライマ、及び、配列番号10の逆方向プライマ、及び、配列番号8のプローブ;
c)配列番号12の順方向プライマ、及び、配列番号15の逆方向プライマ、及び、配列番号13のプローブ;
d)配列番号17の順方向プライマ、及び、配列番号20の逆方向プライマ、及び、配列番号18のプローブ;
e)配列番号22の順方向プライマ、及び、配列番号25の逆方向プライマ、及び、配列番号23のプローブ;
f)配列番号27の順方向プライマ、及び、配列番号30の逆方向プライマ、及び、配列番号28のプローブ;
g)配列番号32の順方向プライマ、及び、配列番号35の逆方向プライマ、及び、配列番号33のプローブ;
h)配列番号37の順方向プライマ、及び、配列番号40の逆方向プライマ、及び、配列番号38のプローブ;
i)配列番号42の順方向プライマ、及び、配列番号45の逆方向プライマ、及び、配列番号43のプローブ;
j)配列番号47の順方向プライマ、及び、配列番号50の逆方向プライマ、及び、配列番号48のプローブ;
k)配列番号52の順方向プライマ、及び、配列番号55の逆方向プライマ、及び、配列番号53のプローブ;
l)配列番号57の順方向プライマ、及び、配列番号60の逆方向プライマ、及び、配列番号58のプローブ;
m)配列番号62の順方向プライマ、及び、配列番号65の逆方向プライマ、及び、配列番号63のプローブ;
n)配列番号67の順方向プライマ、及び、配列番号70の逆方向プライマ、及び、配列番号68のプローブ;及び/又は
o)配列番号72の順方向プライマ、及び、配列番号75の逆方向プライマ、及び、配列番号73のプローブ;
を用いて同定され、及び、ここで、前記SNPマーカは、スイカ植物におけるFON2耐性形質の存在を示して、FON2耐性形質を含むと共に示すスイカ植物を同定する。
a)配列番号2の順方向プライマ、及び、配列番号5の逆方向プライマ、及び、配列番号3のプローブ;
b)配列番号7の順方向プライマ、及び、配列番号10の逆方向プライマ、及び、配列番号8のプローブ;
c)配列番号12の順方向プライマ、及び、配列番号15の逆方向プライマ、及び、配列番号13のプローブ;
d)配列番号17の順方向プライマ、及び、配列番号20の逆方向プライマ、及び、配列番号18のプローブ;
e)配列番号22の順方向プライマ、及び、配列番号25の逆方向プライマ、及び、配列番号23のプローブ;
f)配列番号27の順方向プライマ、及び、配列番号30の逆方向プライマ、及び、配列番号28のプローブ;
g)配列番号32の順方向プライマ、及び、配列番号35の逆方向プライマ、及び、配列番号33のプローブ;
h)配列番号37の順方向プライマ、及び、配列番号40の逆方向プライマ、及び、配列番号38のプローブ;
i)配列番号42の順方向プライマ、及び、配列番号45の逆方向プライマ、及び、配列番号43のプローブ;
j)配列番号47の順方向プライマ、及び、配列番号50の逆方向プライマ、及び、配列番号48のプローブ;
k)配列番号52の順方向プライマ、及び、配列番号55の逆方向プライマ、及び、配列番号53のプローブ;
l)配列番号57の順方向プライマ、及び、配列番号60の逆方向プライマ、及び、配列番号58のプローブ;
m)配列番号62の順方向プライマ、及び、配列番号65の逆方向プライマ、及び、配列番号63のプローブ;
n)配列番号67の順方向プライマ、及び、配列番号70の逆方向プライマ、及び、配列番号68のプローブ;及び/又は
o)配列番号72の順方向プライマ、及び、配列番号75の逆方向プライマ、及び、配列番号73のプローブ;
を用いて同定され、及び、ここで、前記SNPマーカは、スイカ植物におけるFON2耐性形質の存在を示して、FON2耐性形質を含むと共に示すスイカ植物を同定する。
さらなる実施形態において、本発明は、FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物の遺伝子型を査定するための方法に関し、前記方法は以下のステップを含む。
a)前記植物からサンプルを提供するステップ、並びに
b)前記サンプル中において、第10染色体上に位置されていると共に前記FON2耐性に関連するQTL遺伝子座であって、SNPマーカ1及び15と、以下のSNPマーカの少なくとも1つとに隣接している前記QTL遺伝子座を検出するステップ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;及び/又は
xvi)SNPマーカ1及び15に隣接する前記QTL遺伝子座に関連するいずれかの他のDNAマーカ。
a)前記植物からサンプルを提供するステップ、並びに
b)前記サンプル中において、第10染色体上に位置されていると共に前記FON2耐性に関連するQTL遺伝子座であって、SNPマーカ1及び15と、以下のSNPマーカの少なくとも1つとに隣接している前記QTL遺伝子座を検出するステップ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;及び/又は
xvi)SNPマーカ1及び15に隣接する前記QTL遺伝子座に関連するいずれかの他のDNAマーカ。
さらなる実施形態において、本発明は、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物において、FON2に対する高い耐性に関連する遺伝子移入配列を同定する方法に関し、前記方法は、前記植物において、前記FON2に対する高い耐性に関連するQTL遺伝子座に遺伝的に関連付けられている少なくとも1つのDNAマーカの対立遺伝子を検出するステップを含み、ここで、前記対立遺伝子は、SNPマーカ1及び15に隣接するゲノム領域における第10染色体上に位置されている前記QTL遺伝子座の10cM以内、好ましくは5cM以内に位置される。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態に係る方法に関し、ここで、前記QTL遺伝子座は、以下のSNPマーカの少なくとも1つにより同定可能である。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型。
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型。
さらなる実施形態において、本発明は前述の実施形態に係る方法に関し、ここで、前記方法は、前記遺伝子移入配列を含む栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を選択するステップをさらに含む。
さらなる実施形態において、本発明は、前記FON2に対する高い耐性に関連するQTLを同定することにより、FON2に対する高い耐性を示す栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を同定する方法に関連し、この方法は:
a)スイカ植物由来の少なくとも1つのDNAマーカであって、FON2に対する高い耐性に関連する染色体区間に連結しているDNAマーカを検出するステップであって、前記染色体区間は、配列番号:1及び71に少なくとも80%配列同一性を有するSNPマーカに両側で隣接しているステップ;並びに
b)前記少なくとも1つのDNAマーカを含む前記スイカ植物を同定するステップ
を含む。
a)スイカ植物由来の少なくとも1つのDNAマーカであって、FON2に対する高い耐性に関連する染色体区間に連結しているDNAマーカを検出するステップであって、前記染色体区間は、配列番号:1及び71に少なくとも80%配列同一性を有するSNPマーカに両側で隣接しているステップ;並びに
b)前記少なくとも1つのDNAマーカを含む前記スイカ植物を同定するステップ
を含む。
使用。
本発明はまた、FON2耐性スイカ植物を生産するためにスイカ植物を育てるための前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物から得られるFON2耐性繁殖材料の使用に関し、ここで、前記FON2耐性は、標準的なアッセイ、特に以下の実施例2に記載のアッセイにおいて査定され得る。
本発明はまた、FON2耐性スイカ植物を生産するためにスイカ植物を育てるための前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物から得られるFON2耐性繁殖材料の使用に関し、ここで、前記FON2耐性は、標準的なアッセイ、特に以下の実施例2に記載のアッセイにおいて査定され得る。
本発明はまた、スイカ果実を生産するための前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物から得られるFON2耐性繁殖材料の使用に関する。
本発明はまた、FON2耐性に関連する他の遺伝子配列、例えば国際公開第2009/000736号に開示されている遺伝子配列に付随する本発明のFON2耐性遺伝子配列の使用が予期される。
他の実施形態において、本発明は、植物を育てるため、並びに、作物及び/又は果実を生産及び収穫するための、栽培種スイカ植物、植物部位又は種子、より好ましくは、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物、植物部位又は種子の使用に関する。
他の実施形態において、本発明は、生鮮市場用又は食品加工用の果実を生産するための、栽培種スイカ植物、より好ましくは、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物の使用に関する。
他の実施形態において、本発明は、栽培種スイカ植物、植物部位又は種子、好ましくは、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物、植物部位又は種子の使用に関し、ここで、前記栽培種スイカ植物、植物部位又は種子、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物、植物部位又は種子は、スイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先のものである。
さらなる実施形態において、本発明は、圃場、温室又はビニールハウスに播種するための、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培種スイカ植物、植物部位又は種子、より好ましくは栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物、植物部位又は種子の使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、前記形質を含まないスイカ植物に高いFON2耐性形質を付与するための、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の使用に関する。本発明はさらに、高いFON2耐性形質を前記形質を含まないスイカ植物に遺伝子移入するための、前述の実施形態のいずれかに記載のスイカ植物の使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、第10染色体上に位置すると共に高いFON2耐性に関連するQTL遺伝子座の存在についてスイカ植物の集団をスクリーニングするための、配列番号1~75のいずれかの使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、第10染色体上に位置すると共に高いFON2耐性に関連するQTL遺伝子座の存在についてスイカ植物の集団をスクリーニングするための、配列番号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66及び71のいずれかの使用に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、第10染色体上に位置すると共に高いFON2耐性に関連するQTL遺伝子座の存在についてスイカ植物の集団をスクリーニングするための、配列番号21、31及び71のいずれかの使用に関する。
本発明の記載に基づいて、本明細書に記載の前記遺伝子移入遺伝子配列を含むスイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先を保有する当業者は、本明細書に開示されているSNPマーカによる補助を伴って、技術分野において周知である育種技術を用ることにより、種々のタイプの他のスイカ植物に対する本発明の前記遺伝子移入遺伝子配列の導入に困難を伴うことはない。
種子寄託の詳細
本出願人は、2020年6月17日に、NCIMB受入番号43627で、NCIMB(NCIMB Limited,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland)に対して、スイカ(Citrullus lanatus)植物18WMH505078の2500粒の種子の寄託を行っている。
本出願人は、2020年6月17日に、NCIMB受入番号43627で、NCIMB(NCIMB Limited,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland)に対して、スイカ(Citrullus lanatus)植物18WMH505078の2500粒の種子の寄託を行っている。
本出願人は、専門家による解を選定すると共に、本特許の付与の告示が公告されるまで、又は、本出願が、拒絶され、取り下げられ、若しくは、みなし取り下げとされた場合には出願日から20年間は、EPC規則32(1)若しくは対応する他の国々の法規若しくは条約(専門家証人条項)に従って、寄託した材料は専門家のみに公開されることを要求する。
実施例1:生殖質及び集団の発育
スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)RCAT055816系統種と、アジアンプロテクテッド(Asian protected)タイプ97103系統との交配からもたらされたF1集団を、単粒法で2回自家受粉させてF3集団を得た。F3集団由来の系統群を、以下の実施例2に記載の表現型評価に従って、気候チャンバ中においてFON2に対する耐性についてスクリーニングした。高いFON2耐性に関連するQTLを、このF3集団において同定した(実施例3~5を参照のこと)。
スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)RCAT055816系統種と、アジアンプロテクテッド(Asian protected)タイプ97103系統との交配からもたらされたF1集団を、単粒法で2回自家受粉させてF3集団を得た。F3集団由来の系統群を、以下の実施例2に記載の表現型評価に従って、気候チャンバ中においてFON2に対する耐性についてスクリーニングした。高いFON2耐性に関連するQTLを、このF3集団において同定した(実施例3~5を参照のこと)。
その後、QTLに隣接してまたぐ分子マーカを、異なる遺伝的背景を有する栽培種スイカ系統:97103、シュガーベイビー(Sugar Baby)、チャールストングレイ(Charleston Grey)及びオールスイート(Allsweet)へのQTLの遺伝子移入の追跡に用いた。QTLをこれらの系統へ遺伝子移入するための十分な戻し交配、並びに、望ましい農学的及び園芸学的形質を回復させた後、自己子孫を形成して、QTL遺伝子座で戻し交配系統群ホモ接合をもたらした。
最初のF1集団に由来する18WMH505078とされた植物を保持し、2020年6月17日にNCIMB受入番号43627でNCIMBに寄託した。植物18WMH505078は、FON2耐性形質にヘテロ接合であるスイカの植物の種子であり、すなわち、植物18WMH505078は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)植物由来のFON2耐性付与性遺伝子移入配列の1つのコピーを含む。
実施例2:プロトコル。
実施例2A.真菌菌株。
フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)単離保存菌株を、長期保管のために、無水無菌ろ紙上で維持した。ジャガイモブドウ糖寒天(PDA)プレート上の培養物を小さい四角のろ紙に置いてFON2を培養し、26+2℃でインキュベートした。3L-エルレンマイヤーフラスコ中の1リットルのV8液体培地(200mL V-8ジュース、3.0g炭酸カルシウム、15g Bacto Agar、800mL DI-H2O)に小さい菌糸体プラグ(直径約1cm)を移すことで、液体培養物を成長させ、70rpm、28℃で、シェーカーインキュベータにおいて6日間インキュベートした。6日間で、菌糸体/分生子懸濁液を、4層のチーズクロスでろ過した。分生子を、血球計算器を用いて定量化した。分生子濃度を、無菌蒸留水で1×106分生子/mLに調節した。
実施例2A.真菌菌株。
フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種2(FON2)単離保存菌株を、長期保管のために、無水無菌ろ紙上で維持した。ジャガイモブドウ糖寒天(PDA)プレート上の培養物を小さい四角のろ紙に置いてFON2を培養し、26+2℃でインキュベートした。3L-エルレンマイヤーフラスコ中の1リットルのV8液体培地(200mL V-8ジュース、3.0g炭酸カルシウム、15g Bacto Agar、800mL DI-H2O)に小さい菌糸体プラグ(直径約1cm)を移すことで、液体培養物を成長させ、70rpm、28℃で、シェーカーインキュベータにおいて6日間インキュベートした。6日間で、菌糸体/分生子懸濁液を、4層のチーズクロスでろ過した。分生子を、血球計算器を用いて定量化した。分生子濃度を、無菌蒸留水で1×106分生子/mLに調節した。
実施例2B.植物の準備及び播種。
F3集団を、人工播種法を用いてFON2に対する耐性について評価した。各系統の30粒の種子を、2:1:1の割合で混合した土壌、バーミキュライト及びパーライトを含む50セルトレイに播いた。各系統の30粒の種子は、10粒の種子の3つの反復用試料に分割した。反復用の試料は個別のトレイに分布させてランダム化した。加えて、ブラックダイアモンド(Black Diamond)、カルフーングレイ(Calhoun Grey)及びSP-6栽培品種の各々種子5粒を、各トレイに播いてチェック用として用いた。実生を、16時間/8時間(昼間/夜間)の光周期で温室ベンチにおいて育てた。昼間温度は26+2℃に設定し、夜間温度は24+2℃とした。実生は、植えてから15日後に、上記のとおり調製したFON2種菌を用いて播種した。30mlの胞子懸濁液をトレイの各セルにピペットし、トレイを気候チャンバ中に置いた。植物を、蛍光灯の下で、16時間/8時間の昼間及び夜間の日内周期、26+2℃の温度で育てた。
F3集団を、人工播種法を用いてFON2に対する耐性について評価した。各系統の30粒の種子を、2:1:1の割合で混合した土壌、バーミキュライト及びパーライトを含む50セルトレイに播いた。各系統の30粒の種子は、10粒の種子の3つの反復用試料に分割した。反復用の試料は個別のトレイに分布させてランダム化した。加えて、ブラックダイアモンド(Black Diamond)、カルフーングレイ(Calhoun Grey)及びSP-6栽培品種の各々種子5粒を、各トレイに播いてチェック用として用いた。実生を、16時間/8時間(昼間/夜間)の光周期で温室ベンチにおいて育てた。昼間温度は26+2℃に設定し、夜間温度は24+2℃とした。実生は、植えてから15日後に、上記のとおり調製したFON2種菌を用いて播種した。30mlの胞子懸濁液をトレイの各セルにピペットし、トレイを気候チャンバ中に置いた。植物を、蛍光灯の下で、16時間/8時間の昼間及び夜間の日内周期、26+2℃の温度で育てた。
実施例2C.FON2耐性のスコアリング。
子葉の黄変などの最初の症候は播種後8~10日間(dpi)で生じた。植物を監視し、症候を14、18及び21dpiで査定した。植物を、以下に記載のとおり、定量的スケールでスコアリングした。
子葉の黄変などの最初の症候は播種後8~10日間(dpi)で生じた。植物を監視し、症候を14、18及び21dpiで査定した。植物を、以下に記載のとおり、定量的スケールでスコアリングした。
すべての植物を上記の半定量的格付けスケール(1~9)でスコアリングした。F3の各々について、以下の計算を用いて、個々の植物スコアリングと共に品種による調整平均を用いて病害スコアを算出した。
スコア=((R×9)+(S×8)+(T×7)+(U×6)+(V×5)+(W×4)+(X×3)+(Y×2)+(Z×1))/R+S+T+U+V+W+X+Y+Z
式中、
R=9に等しいスコアの植物の数;
S=8に等しいスコアの植物の数;
T=7に等しいスコアの植物の数;
U=6に等しいスコアの植物の数;
V=5に等しいスコアの植物の数;
W=4に等しいスコアの植物の数;
X=3に等しいスコアの植物の数;
Y=2に等しいスコアの植物の数;及び
Z=1に等しいスコアの植物の数。
スコア=((R×9)+(S×8)+(T×7)+(U×6)+(V×5)+(W×4)+(X×3)+(Y×2)+(Z×1))/R+S+T+U+V+W+X+Y+Z
式中、
R=9に等しいスコアの植物の数;
S=8に等しいスコアの植物の数;
T=7に等しいスコアの植物の数;
U=6に等しいスコアの植物の数;
V=5に等しいスコアの植物の数;
W=4に等しいスコアの植物の数;
X=3に等しいスコアの植物の数;
Y=2に等しいスコアの植物の数;及び
Z=1に等しいスコアの植物の数。
図1は、用いた病害スケールの代表的なFON2病理学アッセイ写真を示す。写真は播種から18日後に撮影した:(1)枯死した植物、(2)葉及び茎は倒れている、(3)100%の葉がしおれている、(4)75%の葉が退緑及びしおれの症候を示す、管束の変色(5)75%未満の葉が症候及び管束の変色を示し、植物は未だ直立している、(6)50%未満の葉が症候及び管束の変色を示す、(7)25%未満の葉が症候及び軽度の管束の変色を示す、(8)第一葉が退緑の症候を示すが、管束の変色はない、(9)健常で症候はない。
実施例2D.FON2高耐性形質の基礎となるQTL及び対応する遺伝子移入配列の同定方法。
QTLを発見するために、「R16×97103」集団の299個のF2個体にゲノムにまたがる298個の遺伝子マーカで遺伝子型を付け、遺伝子地図を算出した。これらの299個のF2個体の各々の自家受粉に由来するF3集団を栽培し、上記の実施例2A~Cに記載のとおりFON2について評価した。
QTLを発見するために、「R16×97103」集団の299個のF2個体にゲノムにまたがる298個の遺伝子マーカで遺伝子型を付け、遺伝子地図を算出した。これらの299個のF2個体の各々の自家受粉に由来するF3集団を栽培し、上記の実施例2A~Cに記載のとおりFON2について評価した。
QTLの検出を、R統計フレームワークにおけるR/qtlパッケージを用いて行った。先ず、関数「calc.genoprob」を用いて、遺伝子型確率を算出した(ステップ1cM)。Haley-Knott回帰法を行って、標準区間マッピングの結果の近似値を得た。次いで、完全自動化モデル選択フォワード/バックワードアルゴリズムをもたらす関数「stepwiseqtl」を呼び出した。主な効果に対するLOD閾値を10,000の順列により決定した。このアルゴリズムは、異なる可能性のある相互作用(例えば、エピスタシス)を考慮する。関数「refineqtl」を用いて、マルチプルQTLモデル(最尤推定値)との関係においてQTLの位置を絞り込んだ。関数「fitqtl」を用いて定義されたQTLモデルをフィッティングさせて、QTL効果の推定値を得た。
実施例3:高いFON2耐性に関連する一つのQTLの同定
一つのQTLを、F3集団由来のFON2耐性表現型に基づいて同定した。表1は、染色体上の位置、LODスコアとして測定したQTLの効果、及び、FON2耐性について第10染色体上のQTLにより説明される変動の割合を示す。
一つのQTLを、F3集団由来のFON2耐性表現型に基づいて同定した。表1は、染色体上の位置、LODスコアとして測定したQTLの効果、及び、FON2耐性について第10染色体上のQTLにより説明される変動の割合を示す。
QTLは、F3発見集団において半優性効果を示した。QTL位置における耐性親対立遺伝子の2つのコピーの存在により、3の非耐性スコアから>6の耐容性又は耐性スコアに平均病害耐性スコアが増加する。
実施例4:商業的背景へのFON2耐性付与配列の遺伝子移入
スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物は、柔らかく、赤色の果肉で、成熟時に果果肉ブリックス値が高く、オールスイート(Allsweet)の果皮パターンを有し、及び、小さな種子を有するが、一方で、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)スイカ植物は、白色の果肉で、ブリックス値が低く、非常に果肉が硬く、及び、種子がきわめて大きく、典型的なシトロイデス群(citroides)のものである。スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)スイカ植物に存在するFON2変種に対する高い耐性に関連する遺伝子配列を、実施例2に記載の人工テスト及びそれぞれのスイカ種に対するこれらの戻し交配後に、耐性植物を選択することにより、アジアンプロテクテッド(Asian protected)(97103)、シュガーベイビー(Sugar Baby)、クリムゾンスイート(Crimson Sweet)、及び、オールスイート(Allsweet)材料に遺伝子移入した。
スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物は、柔らかく、赤色の果肉で、成熟時に果果肉ブリックス値が高く、オールスイート(Allsweet)の果皮パターンを有し、及び、小さな種子を有するが、一方で、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)スイカ植物は、白色の果肉で、ブリックス値が低く、非常に果肉が硬く、及び、種子がきわめて大きく、典型的なシトロイデス群(citroides)のものである。スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)スイカ植物に存在するFON2変種に対する高い耐性に関連する遺伝子配列を、実施例2に記載の人工テスト及びそれぞれのスイカ種に対するこれらの戻し交配後に、耐性植物を選択することにより、アジアンプロテクテッド(Asian protected)(97103)、シュガーベイビー(Sugar Baby)、クリムゾンスイート(Crimson Sweet)、及び、オールスイート(Allsweet)材料に遺伝子移入した。
遺伝子移入系統は、高いFON2耐性に対して有利な遺伝子移入配列を含みながらも、赤色の果肉及び成熟時の高い果肉ブリックス値という点で反復親と類似の表現型が強調されていた。表現型検査の結果は、QTL10における代表的なマーカの存在又は不在に対するテストの結果と共に、97013背景について以下の表2にまとめられている。
遺伝子移入配列の基礎となるQTL10にまたがると共にこれを含むSNPマーカを含むすべての系統(例えば系統19WDL100846)は、>6の病害スコアを有する高いFON2耐性を示す。この遺伝子移入配列は、他のソースUSVL246及びPI296341-FRと比してRCAT055816ソースに対して特異的であり、これは、SNPマーカ1、7、10及び15を用いることで分かる。
この領域中において、QTL区間中の15のSNPマーカ、SH2496、SH2498、SH2508、SH2506、SH2507、SH2500、SH2488、SH2504、SH2512、SH2513、SH2492、SH2505、SH2493、SH2503及びSH2486は、唯一、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816に由来する一連のドナー耐性対立遺伝子に特異性を示し、これらから、SNPマーカSH2488、SH2504、SH2512及びSH2513は、耐性に最も密接に関連していた。
表3は、第10染色体上におけるQTLの遺伝的及び物理的位置の両方、並びに、QTLに密接に関連する15個のSNPマーカの位置を示す。
実施例5:QTL10に対する配列及びSNPマーカ情報
SNPマーカ1~15(SH2496、SH2498、SH2508、SH2506、SH2507、SH2500、SH2488、SH2504、SH2512、SH2513、SH2492、SH2505、SH2493、SH2503及びSH2486)の配列情報、及び、検出に係るこれらのそれぞれのPCRプライマ/プローブが、以下の表4にまとめられている。
SNPマーカ1~15(SH2496、SH2498、SH2508、SH2506、SH2507、SH2500、SH2488、SH2504、SH2512、SH2513、SH2492、SH2505、SH2493、SH2503及びSH2486)の配列情報、及び、検出に係るこれらのそれぞれのPCRプライマ/プローブが、以下の表4にまとめられている。
例として、第10染色体上の位置23,418,118bpにおけるSNPマーカ1(SH2496)(基準97103 v7配列に基づく)は、配列番号1の標的配列の位置129における特定の配列多型(耐性RCAT055816対非耐性対立遺伝子)により特徴付けられる。配列番号2及び5の対応する順方向及び逆方向プライマ、並びに、配列番号3及び4の耐性又は非耐性対立遺伝子に特異的なプローブもまた開示されている。
参考文献
・Branham S.E.et al.,2017,A GBS-SNP-based linkage map and quantitative trait loci(QTL)associated with resistance to Fusarium oxysporum f.sp.niveum race 2 identified in Citrullus lanatus var.citroides,Theor.Appl.Genet.130:319-330.
・Dane F.and Liu J.,2007,Diversity and origin of cultivated and citron type watermelon(Citrullus lanatus),Genetic Resources and Crop Evolution,Volume 54,Issue 6,pp 1255-1265.
・Fehr W.R.,1987,Principles of cultivar development,theory and technique,Vol.1,Macmillian Publishing Company.
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Claims (25)
- フザリウム オキシスポルムf.sp.ニヴェウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)品種1,2(FON2)感染に耐性である栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物であって、そのゲノム中に、FON2に対する耐性を付与するスイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)由来の遺伝子移入配列を含み、前記遺伝子移入配列は第10染色体上に位置されていると共に、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を含む、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物。 - a)SNPマーカ1に対する前記G遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号2の順方向プライマ及び配列番号5の逆方向プライマ、並びに、配列番号3のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
b)SNPマーカ2に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号7の順方向プライマ及び配列番号10の逆方向プライマ、並びに、配列番号8のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
c)SNPマーカ3に対する前記インデル遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号12の順方向プライマ及び配列番号15の逆方向プライマ、並びに、配列番号13のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
d)SNPマーカ4に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号17の順方向プライマ及び配列番号20の逆方向プライマ、並びに、配列番号18のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
e)SNPマーカ5に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号22の順方向プライマ及び配列番号25の逆方向プライマ、並びに、配列番号23のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
f)SNPマーカ6に対する前記C遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号27の順方向プライマ及び配列番号30の逆方向プライマ、並びに、配列番号28のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
g)SNPマーカ7に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号32の順方向プライマ及び配列番号35の逆方向プライマ、並びに、配列番号33のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
h)SNPマーカ8に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号37の順方向プライマ及び配列番号40の逆方向プライマ、並びに、配列番号38のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
i)SNPマーカ9に対する前記G遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号42の順方向プライマ及び配列番号45の逆方向プライマ、並びに、配列番号43のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
j)SNPマーカ10に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号47の順方向プライマ及び配列番号50の逆方向プライマ、並びに、配列番号48のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
k)SNPマーカ11に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号52の順方向プライマ及び配列番号55の逆方向プライマ、並びに、配列番号53のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
l)SNPマーカ12に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号57の順方向プライマ及び配列番号60の逆方向プライマ、並びに、配列番号58のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
m)SNPマーカ13に対する前記G遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号62の順方向プライマ及び配列番号65の逆方向プライマ、並びに、配列番号63のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;
n)SNPマーカ14に対する前記G遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号67の順方向プライマ及び配列番号70の逆方向プライマ、並びに、配列番号68のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能であり;並びに/又は
o)SNPマーカ15に対する前記A遺伝子型は、一対のオリゴヌクレオチドプライマ:配列番号72の順方向プライマ及び配列番号75の逆方向プライマ、並びに、配列番号73のプローブを伴う核酸フラグメントの増幅によるPCRにおいて同定可能である、
請求項1に記載の植物。 - 前記遺伝子移入配列は、配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号16、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、及び/若しくは配列番号71、又は、前記配列の1つ以上に対して少なくとも80%同一である配列の少なくとも1つを含む、請求項1又は2に記載の植物。
- 前記植物は、前記少なくとも1つのSNPマーカに対してホモ接合である、請求項1~3のいずれか一項に記載の植物。
- 前記遺伝子移入配列は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先に含まれている、請求項1~4のいずれか一項に記載の植物。
- 前記植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を含有しないスイカ植物とを交配することにより得られる、請求項1~5のいずれか一項に記載の植物。
- 前記植物は、近郊系、二ゲノム性半数体、二倍体、三倍体、四倍体又はハイブリッド植物である、請求項1~6のいずれか一項に記載の植物。
- その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている、スイカ植物18WMH505078の植物。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の植物の植物部位。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の植物又は植物部位をもたらす種子。
- FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を生産する方法であって:
a)請求項1~8のいずれか一項に記載の植物と、前記FON2耐性付与性遺伝子移入配列を欠く栽培種スイカ植物とを交配するステップ;
b)FON2に対する耐性を付与する、第10染色体上に位置された前記遺伝子移入配列を含む子孫植物を選択するステップであって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
を検出するステップを含む、選択するステップ;
を含み、これにより、高いFON2に対する耐性を有する植物を生産する方法。 - c)前記選択された子孫を自配させるステップ、又は、前記選択された子孫と他のスイカ植物とを交配してさらなる子孫を生産するステップ
をさらに含む、請求項11に記載の方法。 - さらなる子孫は、選択され、2~10世代自配/交配される、請求項12に記載の方法。
- ステップa)の前記植物は、スイカ シトロイデス亜種(Citrullus lanatus subsp.citroides)系統種RCAT055816又はスイカ植物18WMH505078(その代表種子はNCIMB受入番号43627で寄託されている)、又は、その子孫若しくは祖先である、請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。
- FON2に対する耐性を示すF1スイカ植物を生産する方法であって、請求項1~8のいずれか一項に記載の植物である近郊系スイカ植物と、異なる近郊系スイカ植物とを交配して、F1ハイブリッド子孫を生産するステップを含む、方法。
- FON2に対する耐性を示すと共に、FON2耐性付与性遺伝子移入配列の少なくとも1つのコピーを有する栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を同定する方法であって、以下のSNPマーカの少なくとも1つ:
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
を検出し、これにより、FON2に対する耐性を示すスイカ植物を同定するステップ
を含む、方法。 - 前記1つ以上のSNPマーカを含むスイカ植物を選択するステップ、及び、前記選択されたスイカ植物と第2のスイカ植物とを交配して、前記SNPマーカの少なくとも1つを含むと共にFON2に対する耐性を示す子孫スイカ植物を生産するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項10に記載の種子からスイカ植物を成長させるステップ、及び、前記植物にさらなるスイカ種子を生産させるステップを含む、スイカ種子を生産する方法。
- FON2に対する耐性を示す、栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物の遺伝子型を査定する方法であって:
a)前記植物からサンプルを提供するステップ、並びに
b)前記サンプル中において、第10染色体上に位置されていると共に前記FON2耐性に関連するQTL遺伝子座であって、SNPマーカ1及び15と、以下のSNPマーカ:
i)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
ii)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
iii)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
iv)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
v)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
vi)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
vii)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
viii)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
ix)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
x)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xi)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xii)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
xiii)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
xiv)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;並びに/又は
xv)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;並びに/又は
xvi)SNPマーカ1及び15に隣接する前記QTL遺伝子座に関連するいずれかの他のDNAマーカ
の少なくとも1つとに隣接している前記QTL遺伝子座を検出するステップ
を含む方法。 - 栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物において、FON2に対する高い耐性に関連する遺伝子移入配列を同定する方法であって、前記植物において、前記FON2に対する高い耐性に関連するQTL遺伝子座に遺伝的に関連付けられている少なくとも1つのDNAマーカの対立遺伝子を検出するステップを含み、前記対立遺伝子は、SNPマーカ1及び15に隣接するゲノム領域における第10染色体上に位置されている前記QTL遺伝子座の10cM以内、好ましくは5cM以内に位置される、方法。
- 前記QTL遺伝子座は、以下のSNPマーカの少なくとも1つ
a)配列番号1中の位置129に対応する位置におけるSNPマーカ1に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
b)配列番号6中の位置120に対応する位置におけるSNPマーカ2に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
c)配列番号11中の位置164に対応する位置におけるSNPマーカ3に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるインデル遺伝子型;
d)配列番号16中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ4に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
e)配列番号21中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ5に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
f)配列番号26中の位置135に対応する位置におけるSNPマーカ6に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるC遺伝子型;
g)配列番号31中の位置66に対応する位置におけるSNPマーカ7に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
h)配列番号36中の位置61に対応する位置におけるSNPマーカ8に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
i)配列番号41中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ9に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
j)配列番号46中の位置64に対応する位置におけるSNPマーカ10に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
k)配列番号51中の位置93に対応する位置におけるSNPマーカ11に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
l)配列番号56中の位置83に対応する位置におけるSNPマーカ12に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型;
m)配列番号61中の位置138に対応する位置におけるSNPマーカ13に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;
n)配列番号66中の位置69に対応する位置におけるSNPマーカ14に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるG遺伝子型;及び/又は
o)配列番号71中の位置51に対応する位置におけるSNPマーカ15に対してヘテロ接合若しくはホモ接合状態であるA遺伝子型
により同定可能である、請求項20に記載の方法。 - 前記遺伝子移入配列を含む栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を選択するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- FON2に対する高い耐性に関連するQTLを同定することにより、前記FON2に対する高い耐性を示す栽培種スイカ植物、好ましくは、栽培種スイカ(Citrullus lanatus subsp.lanatus)植物を同定する方法であって:
a)スイカ植物由来の少なくとも1つのDNAマーカであって、FON2に対する高い耐性に関連する染色体区間に連結しているDNAマーカを検出するステップであって、前記染色体区間は、配列番号1及び71に少なくとも80%配列同一性を有するSNPマーカに両側で隣接している、ステップ;並びに
b)前記少なくとも1つのDNAマーカを含む前記スイカ植物を同定するステップ
を含む、方法。 - 第10染色体におけるFON2耐性形質の野生スイカソースを同定する方法であって:
a)野生スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種を提供するステップ、
b)表4に列挙されているSNPマーカの少なくとも1つを検出するキットを用いて前記野生スイカ系統種又は複数の野生スイカ系統種をスクリーニングするステップ、並びに
c)前記表4の列挙において選択された前記少なくとも1つのSNPマーカを含む野生スイカ系統種を同定するステップ
を含む方法。 - 第10染色体上に位置すると共に高いFON2耐性に関連するQTL遺伝子座の存在についてスイカ植物の集団をスクリーニングするための、配列番号1~75のいずれかの使用。
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