CN117043333A

CN117043333A - 新型抗病西瓜植物

Info

Publication number: CN117043333A
Application number: CN202180052610.4A
Authority: CN
Inventors: M·金凯德; C·里左拉提; K·巴塔拉; M·奥利弗; A·桑杜
Original assignee: Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Current assignee: Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-11-10
Also published as: MX2023001949A; EP4203674A4; BR112023002935A2; IL300345A; US20230309482A1; AU2021330660A1; MA59289B1; KR20230054847A; EP4203674A2; WO2022046487A3; MA59289A1; WO2022046487A2; CA3189300A1; JP2023540218A

Abstract

本发明涉及展现对尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种感染具有增加的抗性的新型西瓜植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分，例如果实。本发明进一步涉及制造和使用此类种子和植物的方法。本发明还涉及与所述增加的抗性相关的新型基因序列，并且涉及与所述新型基因序列相关的分子标记。

Description

新型抗病西瓜植物

技术领域

本发明涉及展现对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)2号生理小种感染具有增加的抗性的新型西瓜植物。本发明还涉及所述植物的种子和部分，例如果实。本发明进一步涉及制造和使用此类种子和植物的方法。本发明还涉及与所述增加的抗性相关的新型基因序列，并且涉及与所述新型基因序列相关的分子标记。

背景技术

西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum and Nakai]是一种重要的特色作物，据信起源于非洲南部的喀拉哈里沙漠附近地区(Dane和Liu,2007)。西瓜是所有主要农业生产区的常见作物，2018年世界产量为103,931,337吨(来自联合国粮食及农业组织(Foodand Agriculture Organization)提供的数据)。2019年，仅美国的产量就值高达5.61亿美元(USDA蔬菜2019年概要[USDA Vegetables 2019Summary])。

已知植物病原体对重要作物(包括西瓜)造成相当大的损害，导致重大的农业损失，对食物供应和依赖植物材料的其他工业都产生普遍的严重后果。这样，长期以来存在降低农业有害生物的发生率和/或其对作物生产的影响的需要。此类病原体的实例是植物真菌的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)属。已知尖孢镰刀菌破坏许多作物植物，包括但不限于豌豆、香蕉、棉花、番茄、西瓜等。尖孢镰刀菌的特征在于几种不同的特殊形式，称为专化型(f.sp.)，每种形式都感染多种宿主以引起疾病。至少有48种不同专化型的尖孢镰刀菌。

一种特定专化型的尖孢镰刀菌是尖孢镰刀菌西瓜专化型(FON)感染毛西瓜亚种(Citrullus lanatus subsp.lanatus)的许多西瓜类型，其中包括Asian protected(亚洲保护)、Charleston Grey(查里斯顿)、Crimson Sweet(克伦生)、Sugar Baby(蜜宝)、Jubilee(久比利)和Allsweet(纯甜)类型。已经确定了FON的几个生理小种，并且包括0号、1号、2号和3号生理小种(Martyn和Bruton,1989；Zhou等人,2010)。

已经描述了针对FON 2号生理小种的一些抗性来源。

专利US 7,550,652、US 8,173,873和US 8,212,118分别公开了西瓜品系SP-4、SP-5和SP-6，均被描述为对FON 2侵染具有耐受性或中等抗性。

美国专利申请14/507,277公开了具有FON 2抗性同时保留期望的商业特征的西瓜植物。FON 2性状来源于种质PI-296341-FR，这是众所周知的西瓜中FON 2抗性的潜在来源(Martyn和Netzer,1991)。

Wechter等人(2012)描述了西瓜育种中FON 2抗性的许多另外的潜在来源。

Ren等人(2015)报道一个衍生自饲用西瓜亚种(C.lanatus subsp.citroides)种质PI296341-FR的9号染色体上的FON 2抗性QTL以及一个衍生自易感良种系97103的10号染色体上的FON 2抗性QTL。

Branham等人(2017)还报道了与衍生自饲用西瓜亚种种质USVL246-FR2的FON 2抗性相关的QTL，主要的一个位于9号染色体上，而次要的一个位于10号染色体上。

尽管存在西瓜中FON 2抗性性状的潜在来源，但目前没有可供西瓜种植者使用的具有可接受的园艺质量(产生甜味、可食用果实)的对FON 2具有耐受性或抗性的商业材料(Meru和McGregor,2016；Pal等人,2020)。因此，仍然需要针对FON 2菌株的新型抗性来源，这将提供更容易且更好的FON 2抗性管理同时可适应商业相关的西瓜种质。

发明内容

本发明通过包括且提供包含增加的FON 2抗性性状的新型西瓜植物解决了对FON2菌株的改善的抗性的需要。通过鉴别一个与育种群体中增加的FON 2抗性相关的QTL并且通过将其相应序列渗入良种西瓜植物，西瓜植物的FON 2抗性能力大大增加，这具有对总体植物性能的积极的影响。位于10号染色体(QTL10)上的FON 2抗性QTL及其相应渗入序列具有半显性性质，因此该序列的一个拷贝已经提供了改善的FON 2抗性表型。

总而言之，本发明内所公开的改善的FON 2抗性西瓜植物的特征向西瓜种植者提供了新型解决方案，以在存在FON 2压力的田地中部署西瓜品种时增强经济和商业效率。

在第一实施例中，本发明提供了对尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种(FON 2)感染具有抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物，该植物在其基因组中包含赋予FON 2抗性的来自饲用西瓜亚种的渗入序列，其中所述渗入序列位于10号染色体上并且包含以下SNP标记中的至少一个：

a)SEQ ID NO:1中在对应于位置129的位置处的SNP标记1在杂合或纯合状态下的G基因型；

b)SEQ ID NO:6中在对应于位置120的位置处的SNP标记2在杂合或纯合状态下的A基因型；

c)SEQ ID NO:11中在对应于位置164的位置处的SNP标记3在杂合或纯合状态下的插入/缺失基因型；

d)SEQ ID NO:16中在对应于位置51的位置处的SNP标记4在杂合或纯合状态下的A基因型；

e)SEQ ID NO:21中在对应于位置93的位置处的SNP标记5在杂合或纯合状态下的A基因型；

f)SEQ ID NO:26中在对应于位置135的位置处的SNP标记6在杂合或纯合状态下的C基因型；

g)SEQ ID NO:31中在对应于位置66的位置处的SNP标记7在杂合或纯合状态下的A基因型；

h)SEQ ID NO:36中在对应于位置61的位置处的SNP标记8在杂合或纯合状态下的A基因型；

i)SEQ ID NO:41中在对应于位置83的位置处的SNP标记9在杂合或纯合状态下的G基因型；

j)SEQ ID NO:46中在对应于位置64的位置处的SNP标记10在杂合或纯合状态下的A基因型；

k)SEQ ID NO:51中在对应于位置93的位置处的SNP标记11在杂合或纯合状态下的A基因型；

l)SEQ ID NO:56中在对应于位置83的位置处的SNP标记12在杂合或纯合状态下的A基因型；

m)SEQ ID NO:61中在对应于位置138的位置处的SNP标记13在杂合或纯合状态下的G基因型；

n)SEQ ID NO:66中在对应于位置69的位置处的SNP标记14在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或

o)SEQ ID NO:71中在对应于位置51的位置处的SNP标记15在杂合或纯合状态下的A基因型。

在本发明的另外的实施例中，所述赋予FON 2抗性的渗入序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、和/或SEQ ID NO:71中的至少一个或与所述序列中的一个或多个具有至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％同一性的序列。

在本发明的另外的实施例中，所述植物对于所述至少一个SNP标记是杂合的。在本发明的另外的实施例中，所述植物对于所述至少一个SNP标记是纯合的。

在本发明的另外的实施例中，所述渗入序列包含在以下中：饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另外的实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物通过将饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627)或其子代或祖先与不含有所述赋予FON 2抗性的渗入序列的西瓜植物杂交获得。

在另外的实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体、双倍体、三倍体、四倍体或杂种植物。

另外的实施例提供了可从根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、茎、根、花或花部分、果实、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物、或仍表现出根据本发明的FON 2抗性性状的植物(特别是当生长为产生果实的植物)的任何其他部分或产品。

在另一实施例中，本发明提供了产生根据前述实施例中任一项所述的植物的种子。

在另外的实施例中，本发明提供了用于产生表现出FON 2抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，该方法包括以下步骤：

a)将根据前述实施例中任一项所述的植物与缺乏所述赋予FON 2抗性的渗入序列的栽培的西瓜植物杂交；

b)选择包含赋予FON 2抗性的位于10号染色体上的所述渗入序列的子代植物，所述选择步骤包括检测以下SNP标记中的至少一个：

i)SEQ ID NO:1中在对应于位置129的位置处的SNP标记1在杂合或纯合状态下的G基因型；

ii)SEQ ID NO:6中在对应于位置120的位置处的SNP标记2在杂合或纯合状态下的A基因型；

iii)SEQ ID NO:11中在对应于位置164的位置处的SNP标记3在杂合或纯合状态下的插入/缺失基因型；

iv)SEQ ID NO:16中在对应于位置51的位置处的SNP标记4在杂合或纯合状态下的A基因型；

v)SEQ ID NO:21中在对应于位置93的位置处的SNP标记5在杂合或纯合状态下的A基因型；

vi)SEQ ID NO:26中在对应于位置135的位置处的SNP标记6在杂合或纯合状态下的C基因型；

vii)SEQ ID NO:31中在对应于位置66的位置处的SNP标记7在杂合或纯合状态下的A基因型；

viii)SEQ ID NO:36中在对应于位置61的位置处的SNP标记8在杂合或纯合状态下的A基因型；

ix)SEQ ID NO:41中在对应于位置83的位置处的SNP标记9在杂合或纯合状态下的G基因型；

x)SEQ ID NO:46中在对应于位置64的位置处的SNP标记10在杂合或纯合状态下的A基因型；

xi)SEQ ID NO:51中在对应于位置93的位置处的SNP标记11在杂合或纯合状态下的A基因型；

xii)SEQ ID NO:56中在对应于位置83的位置处的SNP标记12在杂合或纯合状态下的A基因型；

xiii)SEQ ID NO:61中在对应于位置138的位置处的SNP标记13在杂合或纯合状态下的G基因型；

xiv)SEQ ID NO:66中在对应于位置69的位置处的SNP标记14在杂合或纯合状态下的G基因型；和/或

xv)SEQ ID NO:71中在对应于位置51的位置处的SNP标记15在杂合或纯合状态下的A基因型；

从而产生对FON 2具有增强的抗性的植物。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括：

c)使所选择的子代自交或使所选择的子代与另一西瓜植物杂交，以产生另外的子代。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例所述的方法，其中选择另外的子代，并且再自交/杂交2代至10代。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤a)的植物是饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另外的实施例中，本发明涉及产生表现出FON 2抗性的F1西瓜植物的方法，该方法包括将近交西瓜植物(是根据前述实施例中任一项所述的植物)与不同的近交西瓜植物杂交，以产生F1杂种子代。

在另外的实施例中，本发明提供了用于鉴别表现出FON 2抗性且具有所述赋予FON2抗性的渗入序列的至少一个拷贝的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，所述方法包括以下步骤：检测以下SNP标记中的至少一个：

o)SEQ ID NO:71中在对应于位置51的位置处的SNP标记15在杂合或纯合状态下的A基因型；

从而鉴别表现出FON 2抗性的西瓜植物。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例所述的方法，其中所述方法进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的西瓜植物，并且使所选择的西瓜植物与第二西瓜植物杂交，以产生包含所述SNP标记中的至少一个且表现出对FON 2增加的抗性的子代西瓜植物。

附图说明

图1示出了代表所使用的疾病程度的FON 2病理学测定图。

具体实施方式

定义

如果下文没有另外说明，在本申请范围内所使用的技术术语和表述一般被给予在植物育种和栽培相关领域中通常应用于其上的意义。

如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，提及“一种植物”包括一种或多种植物，并且提及“一种细胞”包括多种细胞、组织等的混合物。

“栽培的西瓜”或“良种西瓜”植物在本发明的范围内被理解为是指不再是呈天然状态，而是已经通过人类的照料进行发育和驯化并且供农业使用和/或人类消费且不包括野生西瓜种质(例如饲用西瓜亚种种质)的植物。作为实例，在实施例中，根据本发明所述的栽培或良种西瓜植物能够生长具有红色果肉和/或糖度水平超过8、优选地超过10的果实。可替代地，或另外地，栽培的西瓜植物是杂种、三倍体或四倍体植物。可替代地，或另外地，栽培的西瓜植物是三倍体无籽植物。可替代地，或另外地，栽培的西瓜植物是毛西瓜亚种植物。在毛西瓜亚种植物和野生西瓜种质之间的种间杂交的背景下，栽培的西瓜植物被定义为所述种间杂交的子代植物，其中所述子代植物已与毛西瓜亚种植物回交至少两次。

在本发明的范围内“等位基因”被理解为是指与基因或任意类型的可鉴定遗传决定子(例如QTL)的不同形式相同的或关联的不同遗传单位的可替代或变体形式，它们在遗传中是可替代的，因为它们处于同源染色体的同一基因座处。这类可替代或变体形式可以是单核苷酸多态性、插入、倒置、易位或缺失的结果，或是基因调控(由例如化学或结构修饰引起的)、转录调控或翻译后修饰/调控的结果。在二倍体细胞或生物体中，给定基因或遗传元件的两个等位基因典型地占有同源染色体对上相应的基因座。

相对而言，术语“改善的FON 2抗性”或“增加的FON 2抗性”在本文中被理解为意指根据本发明所述的植物，例如包含赋予FON 2抗性的来自饲用西瓜亚种植物的渗入序列，其中所述渗入序列位于10号染色体上并且包含SNP标记1至15中的至少一个，当与缺乏所述渗入序列的植物相比时对FON 2菌株具有更强的耐受性或抗性。

“改善的FON 2抗性”在本发明的范围内被理解为意指与缺乏本发明的渗入序列的对照西瓜植物(例如，如实例部分所述的)相比具有统计学上显著的改善的FON 2抗性的西瓜植物，使用标准误差和/或使用学生检验(Student’s test)P<0.05或P<0.01。

“表型”在本发明的范围内应理解为是指在基因上控制的性状的可区分的一个或多个特征。

“对照西瓜植物”在本发明范围内意指具有与本发明的栽培的西瓜植物相同的遗传背景的西瓜植物，其中该对照植物不具有与改善的FON 2抗性连锁的本发明的渗入序列。特别地，对照西瓜植物是属于同一植物品种的西瓜植物，并且不包含本发明的渗入序列。使对照西瓜植物在与本发明的栽培西瓜植物相同的条件下生长相同的时间长度。本文根据UPOV的定义理解植物品种。因此，对照西瓜植物可以是近等基因株系、近交株系或杂种，条件是它们具有与本发明的西瓜植物相同的遗传背景，除了该对照植物不具有与改善的FON2抗性连锁的本发明的渗入序列。

术语“性状”是指特征或表型。在本发明的上下文中，FON 2抗性性状是改善的FON2抗性性状。性状可以是以显性或隐性方式或是以部分显性、半显性或不完全显性方式遗传的。在本发明的上下文中，位于10号染色体上的赋予FON 2抗性的渗入序列是半显性的。因此，本发明的西瓜植物的性状可以是杂合的或纯合的。此外，性状可以是单基因的或多基因的，或者可以是由一种或多种基因与环境相互作用而产生的。在本发明的上下文中，单独的位于10号染色体上的赋予FON 2抗性的渗入序列足以赋予改善的FON 2抗性性状。

术语“杂种”、“杂种植物”以及“杂种子代”是指由在基因上不同的亲本产生的个体(例如，在基因上是杂合的或主要是杂合的个体)。

术语“近交株系”是指在基因上是纯合的或近乎纯合的群体。例如，近交株系可以通过几个循环的兄弟/姐妹育种或自交或双单倍体产生来获得。

术语“双单倍体株系”是指由花药培养得出的稳定的近交株系。在特定培养基和环境中培养的一些花粉粒(单倍体)可以发育成含有n个染色体的小植物。然后使这些小植物“加倍”并且包含2n个染色体。这些小植物的子代称为“双单倍体”并且基本上不再分离(稳定的)。

术语“三倍体西瓜植物”和“四倍体西瓜植物”是指具有特定倍性水平的西瓜植物。三倍体(也称为“无籽”)西瓜是作为雌性亲本的四倍体西瓜和作为雄性亲本的二倍体西瓜之间的真正F1杂种(Kihara,1951)。二倍体西瓜植物具有22条染色体(2N＝2X＝22)，而四倍体西瓜植物具有44条染色体(2N＝4X＝44)。四倍体西瓜植物经由二倍体西瓜植物的化学处理获得。秋水仙碱或安磺灵等化学品常用于诱导染色体重复。当四倍体西瓜植物的雌花被二倍体西瓜植物的雄花授粉时，四倍体植物的果实中结出的种子是三倍体杂种种子。从三倍体种子生长的三倍体杂种植物是自交不育的，因为三倍体受精卵不能产生正常的活性配子(Fehr,1987)。因此，为了确保无籽西瓜果实产量，三倍体植物上的坐果必须通过化学手段诱导，或者由二倍体西瓜植物(有时称为二倍体传粉植物)授粉触发。

术语“遗传上固定的”是指已经稳定掺入通常不含所述遗传序列的植物基因组中的遗传序列。当遗传上固定时，遗传序列可以通过有性杂交以容易和可预测的方式传播给其他植物。

术语“砧木”是指用作接穗植物托的植物。典型地，砧木植物和接穗植物具有不同的基因型。在实施例中，如本发明所述的植物用作砧木植物。

下文中的术语“植物”或“植物部分”是指可从根据本发明的西瓜植物获得的植物部分、器官或组织，包括但不限于叶、茎、根、花或花部分、果实、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、花药、小孢子、卵细胞、受精卵、胚、分生区、愈伤组织、种子、插条、细胞或组织培养物、或仍表现出根据本发明的改善的FON 2抗性性状(特别是当生长为产生果实的植物)的任何其他部分或产品。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物。

西瓜植物种子是生长成为根据实施例中任一项所述的西瓜植物的种子。

“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单一细胞或经培养的细胞的形式，或作为高等组织化单元(例如像，植物组织、植物器官或全株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花芽或胚。

如本文所用“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。该术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

如本文所用，术语“育种”及其语法变体是指生成子代个体的任何过程。育种可以是有性的或无性的，或其任意组合。示例性非限制性育种类型包括杂交、自交、双单倍体衍生物生成及其组合。

如本文所用，短语“建立的育种群体”是指由育种计划中的亲本产生和/或用作亲本的潜在育种配偶的集合；所述育种计划为例如商业育种计划。建立的育种群体的成员典型地在基因和/或表型方面得到充分表征。例如，可能已经评估感兴趣的几个表型性状，例如在不同的环境条件下、在多个位置和/或在不同的时间。可替代地或另外，可能已经鉴别一个或多个与表型性状的表达相关的遗传基因座，并且可能已经就该一个或多个遗传基因座方面以及就与该一个或多个遗传基因座相关的一个或多个基因标记方面对育种群体的一个或多个成员进行基因型分析。

如本文所用，短语“二倍体个体”是指具有两组染色体的个体，典型地，一组来自它的两个亲本中的每一个。然而，应理解在一些实施例中，二倍体个体可以从相同的单一生物体接收它的“母本”和“父本”组的染色体，如当植物自体授粉以产生植物的继代时。

“纯合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应位点处的相同的等位基因。在本发明的上下文中，在特定基因座处包含特定渗入序列(例如，位于10号染色体上的渗入序列)的两个相同拷贝的西瓜植物在相应的基因座上是纯合的。

“杂合的”在本发明的范围内应理解为是指在同源染色体上的一个或多个相应位点处的不同的等位基因。在本发明的上下文中，在特定基因座处包含特定渗入序列(例如，位于10号染色体上的渗入序列)的一个拷贝的西瓜植物在相应的基因座上是杂合的。

“显性”等位基因在本发明的范围内应理解为是指当以杂合或纯合状态存在时决定表型的等位基因。

“半显性”等位基因在本发明的范围内应理解为是指当以杂合或纯合状态存在时决定表型的等位基因。然而，等位基因以纯合状态存在时表型强度总体上较高。

“隐性”等位基因是指当仅以纯合状态存在时决定表型的等位基因。

“回交”在本发明的范围内应理解为是指使杂种子代与亲本之一重复往回杂交的方法。不同的轮回亲本可以被用在随后的回交中。

“基因座”在本发明的范围内应理解为是指染色体上包含对性状有贡献的基因、QTL或其相应的基因序列的区域。

如本文所用，“标记基因座”是指染色体上包含存在于个体基因组中并且与一个或多个感兴趣的基因座相关的核苷酸或多核苷酸序列的区域，该区域可能包含对性状有贡献的基因或任何其他遗传决定子或因子。

“基因连锁”在本发明的范围内应理解为是指由于基因在同一染色体上的位置邻近而引起的遗传特征关联性，通过位点之间的重组百分比来量度(厘摩，cM)。

如本文所用，短语“有性杂交的”和“有性生殖”在本发明公开的主题的上下文中是指配子融合以产生子代(例如，通过受精，如在植物中通过授粉产生种子)。“有性杂交”或“异体受精”在一些实施例中是指一个个体被另一个体受精(例如，植物中的异花授粉)。术语“自交”在一些实施例中是指通过自体受精或自花授粉产生种子；即花粉和胚珠来自同一株植物。

如本文所用，短语“基因标记”或“DNA标记”是指个体的基因组中与一个或多个感兴趣的基因座相关联的特征(例如，存在于个体的基因组中的核苷酸或多核苷酸序列)。在一些实施例中，基因标记在感兴趣的群体中是多态性的，或基因座被多态性占据，这取决于上下文。基因标记包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失(indel)(即，插入/缺失)、简单序列重复(SSR)、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标记、多样性阵列技术(DArT)标记以及扩增片段长度多态性(AFLP)以及许多其他实例。基因标记可以例如用于对染色体上包含对表型性状的可变性有贡献的等位基因的遗传基因座进行定位。短语“基因标记”还可以指与基因组序列互补的多核苷酸序列，如用作探针的核酸的序列。

如本文所用，术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体的单倍型中存在的一个或多个基因标记位点的特定等位基因。

如本文所用，术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后代。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自交(即，同一株植物充当雄性和雌性配子两者的供体)。这一个或多个后代可以是例如F₁、F₂或任何继代。

如本文所用，术语“数量性状基因座”(QTL)是指基因标记与影响感兴趣的性状表型的染色体区域和/或基因和/或渗入序列之间的关联。典型地，这是统计学确定的；例如，基于文献中公开的一种或多种方法。QTL可以是具有差异地影响表型性状的至少两个等位基因的染色体区域和/或遗传基因座。

术语“受体西瓜植物”在本文中用于指示将接受从供体西瓜植物获得的DNA的西瓜植物，该DNA包含用于改善的FON 2抗性的渗入序列。

术语“天然遗传背景”在本文中用于指示基因序列的原始遗传背景。例如，这样的背景可以是野生西瓜种质的基因组。例如，在饲用西瓜亚种植物的10号染色体上的特定位置发现了本发明的基因序列。相反，涉及将包含该基因序列的DNA经由例如育种从饲用西瓜亚种植物的10号染色体转移到另一西瓜物种(优选地栽培的西瓜植物，甚至更优选地毛西瓜亚种植物)的10号染色体上的相同位置的方法将导致该基因序列不在其天然遗传背景中。当本发明的基因序列从饲用西瓜亚种背景转移到另一西瓜物种，优选地栽培的西瓜植物，甚至更优选地毛西瓜亚种植物，它们被称为“渗入序列”或“渗入基因序列”。

“供体西瓜植物”在本发明的范围内被理解为意指提供改善的FON 2抗性的渗入序列的西瓜植物。

“基于标记的选择”在本发明的范围内应理解为是指例如使用基因标记从植物中检测一个或多个核酸，其中该核酸与所希望的性状相关联，以鉴别出携带期望的(或不期望的)性状的等位基因的植物，使得在选择性育种计划中可以使用(或避免)那些植物。

单核苷酸多态性(SNP)是DNA中单个位点的变异，是基因组中最常见的变异类型。单核苷酸多态性(SNP)是当基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸—A、T、C或G—在生物物种的成员或个体的成对染色体之间不同时发生的DNA序列变异。例如，来自不同个体的两个测序的DNA片段，AAGCCTA至AAGCTTA，含有单个核苷酸的差异。在这种情况下，存在两个等位基因：C和T。SNP阵列的基本原理与DNA微阵列相同。这些是DNA杂交、荧光显微镜法和DNA捕获的融合。SNP阵列的三个组分是包含核酸序列(即，扩增的序列或靶标)的阵列，一个或多个标记的等位基因特异性寡核苷酸探针，以及记录并解释杂交信号的检测系统。期望的SNP标记等位基因的存在或不存在可以通过使用双链DNA染料的实时PCR或荧光报告探针法来确定。

“聚合酶链反应(PCR)”在本发明的范围内应理解为是指产生基因组的DNA或一个或多个子集的相对较大量的特定区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。“PCR引物”在本发明的范围内应理解为是指DNA的特定区域的PCR扩增中所使用的相对较短的单股DNA片段。

如本文所用的“探针”是指能够识别并且结合于特定目标分子或细胞结构并且因而允许目标分子或结构的检测的一组原子或分子。特别地，“探针”是指可以用于通过分子杂交来检测互补序列的存在并且对其定量的经过标记的DNA或RNA序列。

“序列同一性”。在两个或更多个核酸或蛋白序列的背景下，术语“同一的”或“同一性”是指如使用以下序列比较算法之一或通过目测进行测量，当比较和比对最大相应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。如果彼此进行比较的两个序列长度不同，则序列同一性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基具有同一性的较短序列的核苷酸残基的百分比。如本文所用，考虑了空位的数目以及每个空位的长度(在这两个序列的优化比对中需要引入它们)，这两个序列之间的百分比同一性/同源性是这些序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成，如下文所述的。例如，常规地可以通过使用计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，针对Unix的版本8，遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group)，大学研究园区(University Research Park)，威斯康星州麦迪逊市科学先驱路575号(575Science Drive Madison,WI)53711)来确定序列同一性。Bestfit使用Smith和Waterman,应用数学进展2(Advances in Applied Mathematics2)(1981),482-489的局部同源性算法以便找到两个序列之间具有最大序列同一性的区段。当使用Bestfit或另一序列比对程序来确定一个特定的序列是否与本发明的一个参考序列具有例如95％的同一性时，优选地对参数进行调整从而在参考序列的整个长度上对同一性的百分比进行计算并且允许参考序列中同源性空位占核苷酸总数的高达5％。当使用Bestfit时，优选地将所谓的任选的参数保留在它们预设(“默认”)值。在给定的序列和上述本发明的序列之间的比较中出现的偏差可能是由例如添加、缺失、取代、插入或重组引起的。优选地还可以使用程序“fasta20u66”(版本2.0u66，1998年9月，由William R.Pearson和弗吉尼亚大学编写；还参见W.R.Pearson(1990),Methods in Enzymology[酶学方法]183,63-98所附的实例以及http://workbench.sdsc.edu/)进行这种序列比较。出于这个目的，可以使用“默认”参数设定。

实施例

植物、种子、果实。

另外，前述实施例的植物，其中：

a)SNP标记1的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；

b)SNP标记2的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；

c)SNP标记3的所述插入/缺失基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ IDNO:13；

d)SNP标记4的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18；

e)SNP标记5的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:22和反向引物SEQ ID NO:25，以及探针SEQ ID NO:23；

f)SNP标记6的所述C基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:27和反向引物SEQ ID NO:30，以及探针SEQ ID NO:28；

g)SNP标记7的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:32和反向引物SEQ ID NO:35，以及探针SEQ ID NO:33；

h)SNP标记8的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:37和反向引物SEQ ID NO:40，以及探针SEQ ID NO:38；

i)SNP标记9的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:42和反向引物SEQ ID NO:45，以及探针SEQ ID NO:43；

j)SNP标记10的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:47和反向引物SEQ ID NO:50，以及探针SEQ ID NO:48；

k)SNP标记11的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:52和反向引物SEQ ID NO:55，以及探针SEQ ID NO:53；

l)SNP标记12的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:57和反向引物SEQ ID NO:60，以及探针SEQ ID NO:58；

m)SNP标记13的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:62和反向引物SEQ ID NO:65，以及探针SEQ ID NO:63；

n)SNP标记14的所述G基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:67和反向引物SEQ ID NO:70，以及探针SEQ ID NO:68；和/或

o)SNP标记15的所述A基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:72和反向引物SEQ ID NO:75，以及探针SEQ ID NO:73。

在本发明的另外的实施例中，所述赋予FON 2抗性的渗入序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、和/或SEQ ID NO:71中的至少一个或与所述序列中的一个或多个具有至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％同一性同时保留相应SNP标记1至15的序列。

在本发明的另外的实施例中，所述植物包含SNP标记5、7和15中的至少一个。在本发明的另外的实施例中，所述植物包含SNP标记5和15。

在本发明的另外的实施例中，所述渗入序列包含在以下中、获自或可获自以下：饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另外的实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是三倍体，并且其中所述植物是由二倍体与四倍体之间的杂交产生的。在另外的实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物是由二倍体近交雄性亲本系与四倍体近交雌性亲本系之间的杂交产生的。在另一实施例中，本发明提供了根据前述实施例中任一项所述的植物，其中所述植物包含本发明的渗入序列的3个拷贝。

在另一实施例中，根据本发明的植物是雄性不育的。在另一实施例中，根据本发明的植物是细胞质雄性不育的。

在另一实施例中，根据本发明的植物生长成熟的西瓜果实，其中所述成熟果实的内部果肉是橙色的。

在另外的实施例中，本发明的西瓜植物是根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物，其中位于10号染色体上的所述赋予FON 2抗性的渗入序列可以使用下文表4中公开的SNP标记1至15中的任一个来鉴定。

在另外的实施例中，本发明提供了对尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种(FON 2)感染具有抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物，该植物在其基因组中包含位于10号染色体上的赋予FON 2抗性的来自饲用西瓜亚种的渗入序列，其中所述植物基因组包含：

a)SEQ ID NO:1中在对应于位置129的位置处的SNP标记1在杂合或纯合状态下的G基因型，以及

b)SEQ ID NO:71中在对应于位置51的位置处的SNP标记15在杂合或纯合状态下的A基因型。

在另外的实施例中，前述实施例的栽培的西瓜植物进一步包含在表4中公开的SNP标记2至14中的任一个的至少第三抗性等位基因。

在另外的实施例中，本发明的西瓜植物是根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物，其中饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078，或其子代或祖先是所述赋予FON 2抗性的渗入序列的来源，并且其中植物18WMH505078的代表性种子已保藏在NCIMB登录号43627下。

在另一实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物作为西瓜根茎的用途。在另外的实施例中，本发明涉及西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先作为西瓜根茎的用途。

在另一实施例中，设想了根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物、植物部分或种子用于产生并收获西瓜果实的用途。

在另一实施例中，本发明涉及根据任何实施例所述的西瓜植物、植物部分或种子的用途，其中所述西瓜植物、植物部分或种子是西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另一实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物、植物部分或种子用于播种田地、温室或塑料大棚的用途。

在一个实施例中，本发明提供了由根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物产生的西瓜果实。

本发明进一步涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物将FON 2抗性性状渗入缺乏所述FON 2抗性性状的西瓜植物中的用途。

本发明进一步涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物，其中所述植物进一步包含与FON 1抗性相关的QTL，其中所述QTL位于1号染色体上，并且所述QTL衍生自西瓜品种Calhoun Grey(卡红)。

基因序列、标记。

本发明进一步涉及西瓜植物中与FON 2抗性性状连锁的渗入基因序列。在另外的实施例中，本发明的基因序列位于10号染色体上。在本发明的另外的实施例中，基因序列包含在以下中、获自或可获自以下：饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078的供体植物(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627)或其子代或祖先，并且包含所述基因序列。

在另一实施例中，本发明的渗入基因序列位于10号染色体上并且其特征在于以下SNP标记中的至少一个：

本发明公开了用于检测西瓜植物(特别是栽培的西瓜植物)中的FON 2抗性性状的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自以下的至少一种PCR寡核苷酸引物对和探针：

a)正向引物SEQ ID NO:2和反向引物SEQ ID NO:5，以及探针SEQ ID NO:3；

b)正向引物SEQ ID NO:7和反向引物SEQ ID NO:10，以及探针SEQ ID NO:8；

c)正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；

d)正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:20，以及探针SEQ ID NO:18；

e)正向引物SEQ ID NO:22和反向引物SEQ ID NO:25，以及探针SEQ ID NO:23；

f)正向引物SEQ ID NO:27和反向引物SEQ ID NO:30，以及探针SEQ ID NO:28；

g)正向引物SEQ ID NO:32和反向引物SEQ ID NO:35，以及探针SEQ ID NO:33；

h)正向引物SEQ ID NO:37和反向引物SEQ ID NO:40，以及探针SEQ ID NO:38；

i)正向引物SEQ ID NO:42和反向引物SEQ ID NO:45，以及探针SEQ ID NO:43；

j)正向引物SEQ ID NO:47和反向引物SEQ ID NO:50，以及探针SEQ ID NO:48；

k)正向引物SEQ ID NO:52和反向引物SEQ ID NO:55，以及探针SEQ ID NO:53；

l)正向引物SEQ ID NO:57和反向引物SEQ ID NO:60，以及探针SEQ ID NO:58；

m)正向引物SEQ ID NO:62和反向引物SEQ ID NO:65，以及探针SEQ ID NO:63；

n)正向引物SEQ ID NO:67和反向引物SEQ ID NO:70，以及探针SEQ ID NO:68；和/或

o)正向引物SEQ ID NO:72和反向引物SEQ ID NO:75，以及探针SEQ ID NO:73。

本发明还公开了根据本发明的SNP标记中的至少一个、至少两个或至少三个用于在西瓜植物(特别是栽培的西瓜植物)中进行FON 2抗性性状基因座的诊断性选择和/或基因分型的用途。

本发明还公开了根据本发明的SNP标记中的至少一个、至少两个或至少三个用于鉴别在西瓜植物(特别是栽培的西瓜植物，更特别地是根据本发明的西瓜植物)中FON 2抗性性状的存在和/或用于监测FON 2抗性性状渗入西瓜植物(特别是栽培的西瓜植物，特别是根据本发明的且如本文所述的西瓜植物)的用途。本发明进一步公开了可在涉及至少一个寡核苷酸引物或选自表4的PCR寡核苷酸引物对的PCR反应中获得的多核苷酸(扩增产物)，其中扩增产物对应于可获自饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078的扩增产物(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627)，或其子代或祖先，该扩增产物包含本发明的赋予FON 2抗性的渗入序列。

本文还考虑了与所述扩增产物的序列具有至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％序列同一性的多核苷酸，和/或表现出与可在上述PCR反应中获得的所述扩增产物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

然后，根据本发明所述和上文所述的扩增产物可用于产生或开发可用于鉴定FON2抗性性状基因座的新引物和/或探针。

因此，在一个实施例中，本发明还涉及衍生的标记，特别是衍生的引物或探针，这些标记由根据本发明所述的且如上文所述的扩增产物通过本领域已知的方法开发，这些衍生的标记与改善的FON 2抗性性状等位基因遗传连锁。

育种方法。

从而产生对FON 2具有增强的抗性的植物。

在另一实施例中，本发明涉及提供FON 2抗性西瓜植物、植物部分或种子的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)使缺乏本发明的赋予FON 2抗性的渗入序列的第一植物与根据任何实施例的第二西瓜植物杂交，

b)获得子代西瓜植物，以及

c)任选地选择所述子代植物，其特征在于所述植物表现出对FON 2菌株的抗性。

在另外的实施例中，本发明涉及前述实施例的方法，其中第二西瓜植物是饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另一实施例中，本发明涉及产生FON 2抗性西瓜植物的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物的种子，

b)使所述种子发芽并从中生长成熟可育的植物，

c)诱导a)下所述植物的自花授粉，生长果实并从中收获可育种子，以及

d)从c)下收获的种子生长植物并选择FON 2抗性西瓜植物。

在另一实施例中，本发明涉及增加西瓜植物的FON 2抗性的方法，该方法包括以下步骤：

a)选择包含与位于10号染色体上的一个渗入序列相关的FON 2抗性性状的西瓜，其中所述性状可以通过在表4中列出的SNP标记中的至少一个的存在来鉴定；

b)使步骤a)的包含FON 2抗性性状的所述植物与西瓜植物(特别是栽培的西瓜植物，其不包含FON 2抗性性状并且与步骤a)的植物相比显示对FON 2的易感性)杂交，以及

c)与步骤b)的植物相比，从显示增加的FON 2抗性的所述杂交中选择子代。

选择方法。

在另外的实施例中，本发明提供了用于鉴别表现出FON 2抗性且具有所述赋予FON2抗性的渗入序列的至少一个拷贝的栽培的西瓜植物，优选地栽培的西瓜植物的方法，所述方法包括以下步骤：检测以下SNP标记中的至少一个：

从而鉴别表现出FON 2抗性的西瓜植物。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例所述的方法，其中所述方法进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的西瓜植物，并且使所选择的西瓜植物与第二西瓜植物杂交，以产生包含所述SNP标记中的至少一个且表现出FON 2抗性的子代西瓜植物。

在另一实施例中，本发明涉及鉴定包含本发明的赋予FON 2抗性的渗入序列的西瓜植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)提供FON 2抗性性状分离的群体，

b)从分离群体筛选出展现出FON 2抗性的成员，其中所述性状可以通过本发明的赋予FON 2抗性的渗入序列的存在来鉴定，

c)选择分离群体中的一个成员，其中所述成员包含FON 2抗性性状。

在另外的实施例中，本发明提供了用于鉴别包含在10号染色体上的渗入序列的栽培的西瓜植物的方法，其中所述渗入序列赋予FON 2抗性，该方法包括：

a)提供FON 2抗性分离的群体，

b)使用检测在表4中列出的SNP标记中的至少一个的试剂盒来筛选所述群体，以及

c)鉴别包含表4列表中选择的所述至少一个SNP标记的植物。

在另外的实施例中，本发明提供了用于鉴定在10号染色体上的FON 2抗性性状的野生西瓜来源的方法，该方法包括：

a)提供一个野生西瓜种质或多个野生西瓜种质，

b)使用检测在表4中列出的SNP标记中的至少一个的试剂盒来筛选所述西瓜种质或多个野生西瓜种质，以及

c)鉴别包含在表4列表中选择的所述至少一个SNP标记的野生西瓜种质植物。

在又另一实施例中，本发明涉及由根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物的基因组、优选地由饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627)或其子代或祖先的基因组扩增的至少一个SNP标记的用途，其中所述SNP标记使用以下试剂盒之一来鉴定：

o)正向引物SEQ ID NO:72和反向引物SEQ ID NO:75，以及探针SEQ ID NO:73；

并且其中所述SNP标记指示西瓜植物中FON 2抗性性状的存在，以鉴别包含且表现FON 2抗性性状的西瓜植物。

在另外的实施例中，本发明涉及用于评估表现出FON 2抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述植物的样品，以及

b)在所述样品中检测位于10号染色体上且与所述FON 2抗性相关的QTL基因座，所述QTL基因座的侧翼为SNP标记1和15、以及以下SNP标记中的至少一个：

xv)SEQ ID NO:71中在对应于位置51的位置处的SNP标记15在杂合或纯合状态下的A基因型；和/或

xvi)与侧翼为SNP标记1和15的所述QTL基因座相关的任何其他DNA标记。

在另外的实施例中，本发明涉及在栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物中鉴别与对FON 2增加的抗性相关的渗入序列的方法，所述方法包括以下步骤：在所述植物中检测与所述对FON 2增加的抗性相关的QTL基因座遗传连锁的至少一个DNA标记的等位基因，其中将所述等位基因定位在侧翼为SNP标记1和15的基因组区域中位于10号染色体上的所述QTL基因座的10cM内，优选地5cM内。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例所述的方法，其中所述QTL基因座可以通过以下SNP标记中的至少一个来鉴定

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：选择包含所述渗入序列的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物。

在另外的实施例中，本发明涉及通过鉴别与对FON 2增加的抗性相关的QTL来鉴别表现出所述对FON 2增加的抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，该方法包括以下步骤：

a)从西瓜植物中检测至少一个DNA标记，所述DNA标记连锁至与对FON 2增加的抗性相关的染色体区间，其中所述染色体区间的两侧翼为与SEQ ID NO:1和71具有至少80％序列同一性的SNP标记；以及

b)鉴别包含所述至少一个DNA标记的所述西瓜植物。

用途。

本发明还涉及可从根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物获得的FON 2抗性繁殖材料用于生长西瓜植物以产生FON 2抗性西瓜植物的用途，其中所述FON 2抗性可在标准测定，特别是如下面实例2中所述的测定中评估。

本发明还涉及可从根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物获得的FON 2抗性繁殖材料用于生产西瓜果实的用途。

本发明还考虑了与其他基因序列(例如，WO 2009/000736中公开的那些基因序列)相关的本发明的FON 2抗性基因序列的用途，这些其他基因序列与FON 2抗性相关。

在另一实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的栽培的西瓜植物、植物部分或种子，更优选地栽培的毛西瓜亚种植物、植物部分或种子用于生长植物并且产生以及收获农作物和/或果实的用途。

在另一实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的栽培的西瓜植物，更优选地栽培的毛西瓜亚种植物用于产生用于新鲜市场或用于食品加工的果实的用途。

在另一实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的栽培的西瓜植物、植物部分或种子，优选地栽培的毛西瓜亚种植物、植物部分或种子，其中所述栽培的西瓜植物、植物部分或种子，优选地所述栽培的毛西瓜亚种植物、植物部分或种子是西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下)或其子代或祖先。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的栽培的西瓜植物、植物部分或种子，更优选地栽培的毛西瓜亚种植物、植物部分或种子用于播种田地、温室或塑料大棚的用途。

在另外的实施例中，本发明涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物对缺乏增加的FON 2抗性性状的西瓜植物赋予所述性状的用途。本发明进一步涉及根据前述实施例中任一项所述的西瓜植物将增加的FON 2抗性性状渗入缺乏所述性状的西瓜植物中的用途。

在另外的实施例中，本发明涉及SEQ ID NO 1-75中任一个用于筛选存在位于10号染色体上且与增加的FON 2抗性相关的QTL基因座的西瓜植物群体的用途。

在另外的实施例中，本发明涉及SEQ ID NO 1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66和71中任一个用于筛选存在位于10号染色体上且与增加的FON 2抗性相关的QTL基因座的西瓜植物群体的用途。

在另外的实施例中，本发明涉及SEQ ID NO 21、31和71中任一个用于筛选存在位于10号染色体上且与增加的FON 2抗性相关的QTL基因座的西瓜植物群体的用途。

基于本发明的描述，拥有如本文所述的饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078(其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627)或其子代或祖先的技术人员使用本领域熟知的育种技术在本文公开的SNP标记的支持下能毫无困难地将本发明的所述渗入基因序列转移到其他各种类型的西瓜植物中。

种子保藏详情

申请人已于2020年6月17日由NCIMB(NCIMB有限公司，弗格森大厦，克莱伯斯通庄园，巴克斯本，阿伯丁AB21 9YA，苏格兰(NCIMB Limited,Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland))将西瓜植物18WMH505078的2500粒种子保藏在NCIMB登录号43627下。

申请人选择专家解决方案，并要求根据EPC第32(1)条或其他国家或条约的相应法律和规则(专家证人条款)仅向专家发布保藏的材料，直到专利授权的提及公布为止，或者如果申请被驳回、撤回或者视为撤回的，自申请日起20年。

实例

实例1：种质和群体发展

由饲用西瓜亚种RCAT055816种质与Asian protected类型97103品系之间杂交产生的F1群体经由单个种子家系自花授粉两次以获得F3群体。根据在下文实例2中描述的表型评估在气候室中筛选FON 2抗性的来自F3群体的家族。与增加的FON 2抗性相关的QTL在该F3群体中进行鉴定(参见实例3至5)。

此后，使用侧翼和跨越QTL的分子标记来跟踪QTL向具有不同遗传背景(97103、Sugar Baby、Charleston Grey和Allsweet)的栽培的西瓜品系的渗入。在足够的回交将QTL渗入这些品系并恢复期望的农艺和园艺性状后，产生自交子代以产生在QTL基因座处的纯合的回交家族。

将衍生自初始F1群体的称为18WMH505078的植物保留且于2020年6月17日在NCIMB登录号43627下保藏于NCIMB。植物18WMH505078是具有FON 2抗性性状杂合的西瓜植物的种子，即，植物18WMH505078包含来自饲用西瓜亚种植物的赋予FON 2抗性的渗入序列的一个拷贝。

实例2：方案。

实例2A.真菌菌株。

尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种(FON 2)分离的培养原种在脱水无菌滤纸上保存用于长期储存。FON 2通过将一小块带有培养物的滤纸放置在马铃薯右旋糖琼脂(PDA)板上培养并且在26℃+2℃下孵育。液体培养物通过将小菌丝塞(约1cm直径)转移至3L锥形瓶中的1升V8栽培液(200mL V-8液、3.0g碳酸钙、15g Bacto琼脂、800mL DI-H2O)中生长并且在振荡孵育箱中以70rpm在28℃下孵育6天。在第6天，将菌丝/分生孢子悬浮液通过四层纱布过滤。使用血球计将分生孢子量化。用无菌蒸馏的H2O将分生孢子浓度调整至1×106分生孢子/mL。

实例2B.植物的制备和接种。

使用人工接种方法评估FON 2抗性的F3群体。将每个品系的30粒种子播种到50个细胞托盘中，该托盘含有以2:1:1的比率混合的土壤、蛭石和珍珠岩。每个品系的30粒种子被分成三份，每份10粒种子。将各份分配到单独的托盘中并随机分组。另外，在每个托盘中播种Black Diamond(黑宝石)、Calhoun Grey和SP-6栽培品种各5粒种子以用作检查。将幼苗在温室平台上以16h/8h(日/夜)的光周期生长。白天温度设定在26℃+2℃以及夜晚温度在24℃+2℃。在种植后15天使用如上所述制备的FON 2接种物接种幼苗。将30ml的孢子悬浮液移液至托盘的每个单元，并将托盘置于气候室中。在26℃+2℃的温度下将植物以16h/8h日夜的昼间周期在荧光下生长。

实例2C.FON 2抗性的得分。

子叶发黄等第一个症状出现在接种后8-10天(dpi)。在14、18和21dpi下监控植物并且评估症状。植物在如下所述的定量量表中进行评分。

评级症状

9 没有症状的健康植物。

8 第一片显示萎黄症状、无维管变色的叶。

7 少于25％的显示萎黄的叶。茎没有维管变色。植物生长是正常的。

6 少于50％叶具有萎黄和萎蔫症状。茎有轻微维管变色。植物没有发育不良。

5 少于75％叶具有萎黄和萎蔫症状。茎有维管变色。植物直立。

4 超过75％的显示萎黄和萎蔫、发育不良的生长的叶。茎显示维管变色。

3 所有叶萎蔫、发育不良的生长。

2 叶和茎塌陷。

1 植物死亡。

所有植物在上文半定量评定量表(1-9)上进行评分。按照个体植物的品系得分使用调整的平均值使用以下算式来计算每个F3的疾病得分：

得分＝((R*9)+(S*8)+(T*7)+(U*6)+(V*5)+(W*4)+(X*3)+(Y*2)+(Z*1))/R+S+T+U+V+W+X+Y+Z；其中

R＝得分等于9的植物数量；

S＝得分等于8的植物数量；

T＝得分等于7的植物数量；

U＝得分等于6的植物数量；

V＝得分等于5的植物数量；

W＝得分等于4的植物数量；

X＝得分等于3的植物数量；

Y＝得分等于2的植物数量；以及

Z＝得分等于1的植物数量。

图1展示了代表所使用的疾病程度的FON 2病理学测定图。图是在接种后第18天拍摄的：(1)死亡植物，(2)叶和茎塌陷，(3)100％的叶是萎蔫的，(4)75％的叶显示萎黄和萎蔫、维管变色的症状，(5)少于75％的显示症状和维管变色的叶，植物仍然直立，(6)少于50％的显示症状和维管变色的叶，(7)少于25％的显示症状和轻微维管变色的叶，(8)第一片显示萎黄症状、无维管变色的叶，(9)健康，无症状。

实例2D.鉴别引起FON 2增加的抗性性状的QTL及相应渗入序列的方法。

针对QTL发现，将“R16 x 97103”群体的299个F2个体用跨越基因组的298个基因标记进行基因分型，并计算遗传图谱。如上文实例2A-C所述，使衍生自这些299个F2个体中的每一个的自花授粉的F3群体生长，并对FON 2进行评估。

使用R统计框架中的R/qtl包进行QTL检测。首先，使用函数‘calc.genoprob’来计算基因型概率(步骤1cM)。进行哈利-诺特(Haley-Knott)回归，以提供标准区间作图的结果的近似值。然后，调用函数‘stepwiseqtl’，它提供了完全自动化的模型选择前向/后向算法。主效应的LOD阈值由10,000次置换决定。该算法考虑了不同的可能的相互作用(例如，上位性)。函数‘refineqtl’用于在多重QTL模型(最大似然估计)的背景下细化QTL的位置。函数‘fitqtl’用于拟合明确的QTL模型并获得QTL效应的估计。

实例3：鉴定一个与增加的FON 2抗性相关的QTL

根据来自F3群体的FON 2抗性表型对一个QTL进行鉴定。表1显示了染色体位置，以LOD得分测量的QTL的影响，以及由10号染色体上的QTL对FON 2抗性的解释的变异百分比。

表1：与FON 2抗性相关的显著的QTL。

染色体	LOD	％var	P值(F)
				10	12.2	13.1	1.83e-12＊＊＊

“LOD”＝对数拟然评分，“％var”＝由QTL解释的表型变异百分比，

“P值(F)”＝由于通过F测试的随机机会检测到的QTL的概率。

QTL显示F3发现群体中的半显性影响。在QTL位置处的抗性亲本等位基因的两个拷贝的存在使平均疾病抗性得分从<3的易感得分增加至>6的耐受性或抗性得分。

实例4：赋予FON 2抗性的一个或多个序列渗入商业背景

毛西瓜亚种植物在成熟时具有软的红色果肉，果实果肉糖度高，Allsweet外皮图案和微小的种子，然而饲用西瓜亚种西瓜植物具有白色果肉，低糖度，非常坚硬的果肉，和非常大的种子，典型的饲用组。通过在实例2中描述的人工测试后选择抗性植物将存在于饲用西瓜亚种西瓜植物中的与对FON 2菌株具有增加的抗性相关的基因序列渗入Asianprotected(97103)、Sugar Baby、Crimson Sweet和Allsweet材料，并且与其各自的西瓜类型回交。

渗入品系在成熟时红色果肉和果实果肉糖度高方面突出了与轮回亲本相似的表型，同时包含对增加的FON 2抗性的有利的渗入序列。用于97013背景的表型结果，以及在QTL10中测试存在或不存在代表性标记的结果在下表2中总结。

表2：侧翼且表征QTL10和相应FON2表型的SNP标记的存在或不存在。

所有包含SNP标记跨越以及包含引起QTL10的渗入序列的品系(例如品系19WDL100846)都表现出增加的FON 2抗性，其中疾病得分>6。如与其他来源USVL246和PI296341-FR相比，这一渗入序列对RCAT055816来源具有特异性，这可以从SNP标记1、7、10和15的使用中看出。

在该区域内，在QTL区间内的十五个SNP标记(SH2496、SH2498、SH2508、SH2506、SH2507、SH2500、SH2488、SH2504、SH2512、SH2513、SH2492、SH2505、SH2493、SH2503和SH2486)对仅来自饲用西瓜亚种种质RCAT055816的供体抗性等位基因的选择显示出特异性，并且其中SNP标记SH2488、SH2504、SH2512和SH2513对抗性最密切连锁。

表3显示出在10号染色体上的QTL的基因和物理位置两者以及与QTL紧密连锁的十五个SNP标记的位置。

表3.在10号染色体上的QTL的基因图

实例5：QTL10的序列和SNP标记信息

用于检测的SNP标记1至15(SH2496、SH2498、SH2508、SH2506、SH2507、SH2500、SH2488、SH2504、SH2512、SH2513、SH2492、SH2505、SH2493、SH2503和SH2486)及其各自PCR引物/探针的序列信息在下表4中总结。

表4.

作为实例，在10号染色体(根据参考97103v7序列)上的位置23,418,118bp处的SNP标记1(SH2496)的特征在于SEQ ID NO:1的靶序列的位置129处的特定序列多态性(抗性RCAT055816对比易感等位基因)。也公开了SEQ ID NO 2和5的相应正向和反向引物，以及对SEQ ID NO 3和4的抗性或易感等位基因具有特异性的探针。

文献目录

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Kinkade, Matthew

Oliver, Marc

Sandhu, Ajay

Rizzolatti, Carine

Bhattarai, Kishor

<120> 新型抗病西瓜植物

<130> 82148-WO-REG-ORG-P-1

<160> 75

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 190

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (88)..(88)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (98)..(98)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (110)..(110)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (146)..(148)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 1

ttaaataaat ttaaattagt acaacatcta gcttgtttta ctcttttgct ttttgaatta 60

catttttact aaaaaaaaaa gaaaaaanct cttaaacntt ttttttaaan aaaacttaag 120

tttttattgt ggccaatgtg tatatnnnta tattgatgga ttgaagagcc aactaagcca 180

tcaaaattga 190

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

acaacatcta gcttgtttta c 21

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 3

cacattggcc acaa 14

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 4

atacacattg gccataa 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggctcttcaa tccatca 17

<210> 6

<211> 178

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (14)..(14)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (54)..(54)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (177)..(177)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 6

tcatcatttt cttnttttct accaccatgg acatgaagaa gtttacctgc gccntccttg 60

tcgccaccgc caccgtgagt gctgctatgg cctccggtga aggcccggct cccgcaccca 120

gcccatcctc cggcgaagcc tcatctgcag ccgctttgca agctgttgga gccttcnt 178

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

accaccatgg acatgaagaa gt 22

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 8

aggatgggct gggtgc 16

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 9

atgggccggg tgcg 14

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

caaagcggct gcagatgag 19

<210> 11

<211> 284

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (12)..(12)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (58)..(58)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (60)..(61)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (66)..(66)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (87)..(87)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (107)..(117)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (153)..(153)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (183)..(183)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (186)..(186)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (194)..(194)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (213)..(214)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (241)..(241)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 11

atattttcat anaaattaac tccaaactaa aaggagatat tctaagattt actaaaantn 60

nataanctaa atttgaatat ttaaaantac atagactaaa attgtannnn nnnnnnntac 120

agattattaa atgatatttt aacaaaacaa ttnaaaaaga ataccctctt cttcatttct 180

ctngcntttt tcantttctg tctcgaaaaa aannaaaaaa ataaaattgt tttgtaaatt 240

ntctttcata catcgaaccg tgtaaaacta tctagcgagt aatg 284

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tccaaactaa aaggagatat tc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 13

tgaagaagag ggtattctt 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 14

atgaagaaga gggctattc 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tacacggttc gatgtatg 18

<210> 16

<211> 122

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (10)..(10)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 16

acgccagatn gaagccagat cgttgcggtc aggtaggtgc ctggtgggaa agtgacgtag 60

cagcgagaag gcgaggggca gctgttgatg gcggactgga tggcggcggt gtcgtagtgg 120

ag 122

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cgttgcggtc aggtaggt 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

ctggtgggaa agtgacgta 19

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 19

tggtgggaac gtgacgt 17

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

catccagtcc gccatcaaca g 21

<210> 21

<211> 153

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<400> 21

gataattaat cttgccttgg acgagccaac catagggaac tcaaagctcg aagcctatga 60

aaatattcag caatggctaa taaacatctt gcagcttgtc gagttgtcaa catttgttgc 120

aatcggtgaa tcgtttggtg tctcaaattc tct 153

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

acgagccaac catagggaac tc 22

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 23

actcgacaag ctgcaaga 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 24

ctcgacaagc agcaagat 18

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgattcaccg attgcaacaa atgt 24

<210> 26

<211> 246

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (60)..(60)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (115)..(115)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (195)..(195)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 26

nttttttttc tttcttcttt ctctctttgc aaatattaat cctcaatgaa aacagagttn 60

aagtattgac atcttgttta tatgttaatt attgtttaaa catagtgaat tttcnatctc 120

ttaaaatctt ataacccaat aggtgtatca attaaaatac tatgaataaa tctagatttt 180

ttctcggtga ttcangacta ttttcactaa attctaatta aagtcaattc aaaattacct 240

aaacaa 246

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ctctctttgc aaatattaat cc 22

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 28

tgatacacct attgggtta 19

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 29

ttgatacacc tattggct 18

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

tgactttaat tagaatttag tgaa 24

<210> 31

<211> 117

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<400> 31

aaaatgaata gggtatctaa ccctagaatt tagatgaaat gagacagaaa atccgttgga 60

caactaaaaa attagctgaa gaactctagc aaagccatca gtggttacct ttttgga 117

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ccctagaatt tagatgaaat gag 23

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 33

ccgttggaca actaaaa 17

<210> 34

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 34

cgttggacaa ctcaaa 16

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

tggctttgct agagttc 17

<210> 36

<211> 137

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (7)..(7)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 36

atgaagnatt tgatgtacac tcggaagatg aatcagtaag tccaattttc ctttctccac 60

agtattaata tttcatagta actttgttgt attagagctt tgtcgtcgga tgccactatt 120

ttccgttgtc acatgat 137

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tcggaagatg aatcagtaag tccaa 25

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 38

tcctttctcc acagtattaa 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 39

cctttctcca cggtattaa 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

agtggcatcc gacgacaaag 20

<210> 41

<211> 211

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (151)..(151)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (203)..(203)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 41

agatcatcat atctcatttc cctcttcctt gcagcctcag ttagcgctgt tttaacaagt 60

ctttttgcaa ttccctgagt ttgtcaaaaa ggatggagtg atcagatcaa tgctatgagc 120

atatacagaa gaaacttaag tacttaagaa ngcaacgtac tgctcttggg ttattataca 180

caatctcgac agcttgttga ttngttagat g 211

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

cctcttcctt gcagcctcag tt 22

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 43

tccctgagtt tgtcaaaa 18

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 44

caattccctg agtttatcaa a 21

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

tgtcgagatt gtgtataata accca 25

<210> 46

<211> 113

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (73)..(73)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (75)..(75)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 46

taatataact ctcctaaatg accgtttaat tagtcactca aaaagcccaa accaacatcg 60

aaaagatcct acncnaccaa agtgacgcca aacacaagat ggtctcttta aca 113

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

accgtttaat tagtcactca a 21

<210> 48

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 48

ccaacatcga aaagatc 17

<210> 49

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 49

ccaacatcga aacgat 16

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

gtttggcgtc actttg 16

<210> 51

<211> 310

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (55)..(55)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (123)..(123)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (147)..(147)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (150)..(150)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (197)..(197)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (199)..(199)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (211)..(211)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (227)..(227)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (258)..(258)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 51

atgttgatcc taatctttta agcatttgtt tacttatttt aaagcattaa acttnatact 60

cataacttaa agtgtttggt ttaacttttt aaatgtttaa ttttaaaaat aaatcatttt 120

agnaaaaaaa ttaaagtgtt tgacgancan tcaaaattgt ttttaaaata cttttaaaat 180

taattttaaa tcgattntng ttaatgaaag ntggttttta gttaaancat agtgttttgg 240

tttatatttt tgttaacngt gattgaaaac aaagtttgtt tggatgcact aaatgtgatt 300

tagatagatg 310

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

agcatttgtt tacttatttt aaagca 26

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 53

ttggtttaac tttttaaatg t 21

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 54

tggtttaact ttttaagtgt 20

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

agtgcatcca aacaaac 17

<210> 56

<211> 171

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (9)..(9)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (124)..(124)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (158)..(158)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 56

tgaagaacna tactcaatct acaccggtta ctgaagttaa gaactcgaat caaactgaat 60

cgaagaatgc ccctccggtg gtagatgatc aggttaagag ttcggggctg aaaccgattc 120

catngaataa tggaagttct agggcagagg agaaaaangt atcgacgaat t 171

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

acaccggtta ctgaagttaa gaac 24

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 58

ctccggtggt agatgatc 18

<210> 59

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 59

ctccggtggt ggatgat 17

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

tcctctgccc tagaacttcc att 23

<210> 61

<211> 208

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (117)..(117)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 61

caaaaaaatc ccagaatgct ctccgactct ggtctacatt tctgactaaa agtttcacct 60

gtttctctaa tcaaaaactg tatttcatga cttgatcttt gtattgcaat aatcttnaag 120

tctaaggaat atcgaatgga taaaatgggc ccttctgtaa ttgcatcagt ggtataagca 180

acagcaggat taaacggaac agttttcc 208

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

ctccgactct ggtctacatt tctg 24

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 63

cccattttat ccattcga 18

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 64

agggcccatt ttatctattc g 21

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

cctgctgttg cttataccac tga 23

<210> 66

<211> 149

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (84)..(85)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (92)..(92)

<223> n是a、c、g、或t

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (99)..(99)

<223> n是a、c、g、或t

<400> 66

tctttctctc tcatagtctg tcctctgtac cttgcacaac tccccctcac accttctttt 60

tcataaatgg ggaaaatgaa aaannggaaa tngagattng aaattgttga aaagggaaaa 120

tgaaccatga tattggcatt tacggagga 149

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

tcctctgtac cttgcacaac tc 22

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 68

tcattttccc catttatga 19

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 69

tttcattttc cctatttatg a 21

<210> 70

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

catggttcat tttccctttt caaca 25

<210> 71

<211> 113

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<400> 71

tagtcatatc ctgaaacctt tcgaactccg aggataaaca agaagcatgg attagaagtg 60

gaaacaacaa tcacattatg tccaactgct cccaagctta taccgatatt atc 113

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

tcgaactccg aggataaaca aga 23

<210> 73

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 73

cacttctaat ccatgc 16

<210> 74

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 74

cacttctaac ccatgc 16

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

gggagcagtt ggacataatg tgat 24

Claims

1.一种对尖孢镰刀菌西瓜专化型1,2号生理小种(FON 2)感染具有抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物，所述植物在其基因组中包含赋予FON 2抗性的来自饲用西瓜亚种的渗入序列，其中所述渗入序列位于10号染色体上并且包含以下SNP标记中的至少一个：

2.根据权利要求1所述的植物，其中：

c)SNP标记3的所述插入/缺失基因型可以在PCR中通过用以下寡核苷酸引物对扩增核酸片段来鉴定：正向引物SEQ ID NO:12和反向引物SEQ ID NO:15，以及探针SEQ ID NO:13；

3.根据权利要求1或2所述的植物，其中所述渗入序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:66、和/或SEQ ID NO:71中的至少一个或与所述序列中的一个或多个具有至少80％同一性的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物对于所述至少一个SNP标记是纯合的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的植物，其中所述渗入序列包含在以下中：饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078，其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下，或其子代或祖先。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的植物，其中所述植物通过将饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078，其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下，或其子代或祖先与不含有所述赋予FON 2抗性的渗入序列的西瓜植物杂交获得。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的植物，其中所述植物是近交、双单倍体、二倍体、三倍体、四倍体或杂种植物。

8.一种西瓜植物18WMH505078的植物，其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下。

9.一种根据权利要求1至8中任一项所述的植物的植物部分。

10.一种产生根据权利要求1至9中任一项所述的植物或植物部分的种子。

11.一种用于产生表现出FON 2抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，所述方法包括以下步骤

a)将根据权利要求1至8中任一项所述的植物与缺乏所述赋予FON 2抗性的渗入序列的栽培的西瓜植物杂交；

从而产生对FON 2具有增强的抗性的植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包括：

13.根据权利要求12所述的方法，其中选择另外的子代，并且再自交/杂交2代至10代。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中步骤a)的植物是饲用西瓜亚种种质RCAT055816或西瓜植物18WMH505078，其代表性种子保藏在NCIMB登录号43627下，或其子代或祖先。

15.一种产生表现出FON 2抗性的F1西瓜植物的方法，所述方法包括将近交西瓜植物，所述近交西瓜植物是根据权利要求1至8中任一项所述的植物，与不同的近交西瓜植物杂交，以产生F1杂种子代。

16.一种用于鉴别表现出FON 2抗性且具有所述赋予FON 2抗性的渗入序列的至少一个拷贝的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，所述方法包括以下步骤：检测以下SNP标记中的至少一个：

从而鉴别表现出FON 2抗性的西瓜植物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括选择包含所述一个或多个SNP标记的西瓜植物，并且使所选择的西瓜植物与第二西瓜植物杂交，以产生包含所述SNP标记中的至少一个且表现出FON 2抗性的子代西瓜植物。

18.一种产生西瓜种子的方法，所述方法包括从根据权利要求10所述的种子生长西瓜植物，并且允许所述植物产生另外的西瓜种子。

19.一种用于评估表现出FON 2抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自所述植物的样品，以及

20.一种在栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物中鉴别与对FON 2增加的抗性相关的渗入序列的方法，所述方法包括以下步骤：在所述植物中检测与所述对FON 2增加的抗性相关的QTL基因座遗传连锁的至少一个DNA标记的等位基因，其中将所述等位基因定位在侧翼为SNP标记1和15的基因组区域中位于10号染色体上的所述QTL基因座的10cM内，优选地5cM内。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述QTL基因座可以通过以下SNP标记中的至少一个来鉴定

22.根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：选择包含所述渗入序列的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物。

23.一种通过鉴别与对FON 2增加的抗性相关的QTL来鉴别表现出所述对FON 2增加的抗性的栽培的西瓜植物，优选地栽培的毛西瓜亚种植物的方法，所述方法包括以下步骤：

b)鉴别包含所述至少一个DNA标记的所述西瓜植物。

24.一种鉴定在10号染色体上的FON 2抗性性状的野生西瓜来源的方法，所述方法包括：

a)提供一个野生西瓜种质或多个野生西瓜种质，

b)使用检测在表4中列出的SNP标记中的至少一个的试剂盒来筛选所述野生西瓜种质或多个野生西瓜种质，以及

25.SEQ ID NO 1-75中任一个用于筛选存在位于10号染色体上且与增加的FON 2抗性相关的QTL基因座的西瓜植物群体的用途。