UA126271C2 - Спосіб одержання вкорочених рослин кукурудзи - Google Patents

Спосіб одержання вкорочених рослин кукурудзи Download PDF

Info

Publication number
UA126271C2
UA126271C2 UAA201711563A UAA201711563A UA126271C2 UA 126271 C2 UA126271 C2 UA 126271C2 UA A201711563 A UAA201711563 A UA A201711563A UA A201711563 A UAA201711563 A UA A201711563A UA 126271 C2 UA126271 C2 UA 126271C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
allele
corn
shortening
specified
Prior art date
Application number
UAA201711563A
Other languages
English (en)
Inventor
Тай Джейсон БАРТЕН
Алана Н. БРАУН
Едвард Джеймс Карджилл
Эдвард Джеймс КАРДЖИЛЛ
Ромен ФУКЕ
Хосе Рафаель Ґомес
Хосэ Рафаель Гомес
Метью Шон Маренґо
Метью Шон Маренго
Ґарсіа Мануель Ойорвідес
Гарсиа Мануель Ойорвидес
Джанетт М. Піверс
Джанетт М. ПИВЕРС
Денніс Ганґ Ян
Деннис Ганг Ян
Original Assignee
Монсанто Текнолоджі Елелсі
МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Монсанто Текнолоджі Елелсі, МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЭлЭлСи filed Critical Монсанто Текнолоджі Елелсі
Publication of UA126271C2 publication Critical patent/UA126271C2/uk

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/121Plant growth habits
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10Seeds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684Zea mays [maize]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13Plant traits
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172Haplotypes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу селекції рослини або насіння кукурудзи, який включає проведення маркерного аналізу для виявлення в популяції рослин або насіння кукурудзи рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості в локусі, причому вказаний алель укороченості містить тимідин (Т) в позиції 72 SEQ ID NO: 7; і селекцію вказаної рослини або насіння кукурудзи, що містить вказаний алель укороченості, а також стосується способу створення популяції рослин кукурудзи.

Description

СПОСОБИ Ї КОМПОЗИЦІЇ для ОДЕРЖАННЯ ВКОРОЧЕНИХ РОСЛИН
КУКУРУДЗИПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
ІЇ001| Ця заявка заявляє пріоритет Попередніх патентних заявок США Мо 62/153831 і 62/180430, поданих 28 квітня 2015 року і 16 червня 2015 року, відповідно, які включені в цей документ шляхом посилання в повному обсязі.
ПЕРЕЛІК ВКЛЮЧЕНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І002| Перелік послідовностей, що міститься у файлі з назвою «РЗ4302УМО00 їх», розмір якого становить 27912 байт (виміряно у М5-М/іпдом5Ф), створеному 19 квітня 2015 року, який містить 120 нуклеотидних послідовностей, поданий в електронному вигляді і включений шляхом посилання в повному обсязі.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ІЇОО3| В останні декілька десятиліть було досягнуте стійке підвищення врожайності, наприклад, пшениці і рису. Таке підвищення частково пояснюється застосуванням добрив і пестицидів, а також впровадженням напівдомінуючих мутацій укороченості, що зменшують висоту рослини. Для вищих рослин частіше зустрічається вилягання у відповідь на сильні зливи або вітри, а важчі суцвіття високоврожайних елітних сортів також роблять їх чутливішими до вилягання. Навпаки, культури з меншою висотою є більш стійкими до вилягання. Більше того, ознаки карликовості і напівкарликовості можуть додатково забезпечити вищу щільність насаджень і сприяти покращенню індексу збору врожаю і відгуку на нітроген. Упровадження карликових сортів пшениці і рису послужило наріжним каменем так званої «зеленої революції» кінця 20-го століття. 004) Маїс (7еа тауз І), що є членом роду ОСгатіпеає, має циліндрові стебла, подібні до стебел інших трав. Стебла маїсу товсті, губчасті всередині і розділені на частини, що мають назву міжвузлій і вузлів. Кількість вузлів варіює від 8 до 40 в залежності від підвиду і умов вирощування. Комерційний гібридний маїс звичайно зростає до висоти більше 2 метрів, причому кожна рослина має або один, або два качани. Качан звичайно росте приблизно на одній третині висоти рослини або приблизно в трьох футах від землі. Отже, рослина маїсу, яка дає великий качан на додаток до значної структури листя і стебла, може зіткнутися із значною проблемою механічної стійкості. Зменшення висоти рослини маїсу може покращити механічну
Зо стійкість рослини.
І0О5) Більше ніж 40 моногенних карликових мутантів були описані для маїсу. Більшість із цих мутантів демонструє значне зменшення врожайності зерен і, отже, вони не застосовуються для підвищення врожайності культур в зародковій плазмі, яка чутлива до вилягання. Тому важливою метою в розведенні кукурудзи є виявлення і використання мутацій карликовості або напівкарликовості, що дають невисокі рослини без серйозного впливу на інші органи, особливо на репродуктивні органи (наприклад, на качани).
І0О6) У разі маїсу вкорочені мутанти демонструють невелику висоту внаслідок зменшення довжини міжвузлій, без відповідного зменшення кількості міжвузлій, а також кількості і розміру інших органів, включаючи листя, качан і щіточку. Див. Кетріоп У). Негей. 11:111-115(1920); Ріїш єї а!., МоіІеєсціаг Вгеєдіпо, 20:83-91(2007). В даний час для маїсу виділені три вкорочених мутанти: вкорочений 1 (Бі!), вкорочений 2 (ріг) і вкорочений З (Ббг3). Обидві мутації Бг1 ії бг3 призводять до такого зменшення висоти рослин кукурудзи, яке вважається занадто серйозним для комерційної експлуатації через потенційний вплив на урожайність. Навпаки, мутант Ббг2 володіє особливим агрономічним потенціалом завдяки укороченню міжвузлій нижньої частини стебла без явного зменшення інших органів рослини. Крім того, лінії бг2 демонструють незвичайну силу стебла і стійкість до вітрового вилягання, тоді як листя часто є темнішим і довше зберігається в активному зеленому стані, ніж листя рослин дикого типу. Фенотип Ббг2 нечутливий до обробки гібелінами, ауксинами, брасиностероїдами і цитокінінами, що вказує на відсутність впливу мутації бг2 на біосинтез цих гормонів.
І007| МийКапі еї аІ. ідентифікували геномну послідовність гена Вг2 та депонували її в
СепВапк, обліковий номер АУЗ366085. Див. Зсіепсе, 302(5642)81-84 (2003). Вг2 був анотований для кодування передбачуваного білка, подібного до аденозинтрифосфат (АТФ)-зв'язуючого касетного переносника класу Р-глікопротеїнів (ПГП) із множинною лікарською стійкістю (МЛС).
Ріїш еї а. повідомляли про алелі Ббг2-23, що містять делецію 8 п.о. на 3'-кінці гена Вгаг, і заявляли про пряму залежність між цією делецією і фенотипом укороченості у рослин рг2-23. Див. Ріїм еї аІ., МоїІесшіаг Вгеєдіпд, 20:83-91(2007). Тим не менше, мутації вкороченості кукурудзи не використовувалися в комерційних цілях, частково через серйозність змін, пов'язаних із доступними мутантними алелями вкороченості. 008) В розведенні кукурудзи існує потреба в ідентифікації зародкової плазми кукурудзи, яка бо забезпечуватиме нові, комерційно значущі мутантні алелі вкороченості, наприклад, такі, що дають фенотип помірної вкороченості і збережений або покращений вихід зерен. Також необхідно розробити поліморфні маркери для моніторингу та інтрогресії нових мутантних алелів укороченості, а також розвивати агрономічно елітні кукурудзяні лінії, що містять ознаку вкороченості, для підвищення продуктивності рослин.
КОРОТКИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
І009| Цей винахід відноситься до способів селекції рослини або насіння кукурудзи, які включають (а) виявлення в популяції рослин кукурудзи або насіння кукурудзи рослини або насіння, що містить алель укороченості в поліморфному локусі, причому поліморфний локус пов'язаний або сполучений із маркером, вибраним з групи, що складається із зФЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і (5) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості. В деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі в межах близько 20 сМ, 10
СМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО
І МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У інших аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮО МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 5-8, 9-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із зЗЕО ІЮ МО: 7 і 95.
У деяких аспектах знайдений алель укороченості вибраний з групи, що складається із БЕО ІЮ
МО: 27-48. У деяких аспектах вказані способи включають схрещування першої рослини кукурудзи, що містить алель укороченості, з другою рослиною кукурудзи для одержання популяції рослин або насіння кукурудзи. В інших аспектах вказані способи додатково включають зворотне схрещування з другою рослиною кукурудзи. В деяких аспектах у вказаних способах відбирають рослину кукурудзи або насіння із сегрегованої популяції або популяції гаплоїдного розведення. В деяких аспектах у вказаних способах вибирають рослину кукурудзи або насіння із одного або більше місцевих сортів або подвійних гаплоїдних популяцій. В деяких аспектах стадія (б) вказаних способів включає застосування маркерного аналізу, представленого в цьому
Зо документі. В інших аспектах вказані способи додатково включають генотипування популяції рослин кукурудзи або насіння за однією або декількома поліморфними послідовностями, вибраними з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах вказані способи додатково включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІО МО: 71-75. У деяких аспектах знайдений алель укороченості вибраний із групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 76-80. 0010) В одному аспекті цього документу пропонуються способи створення популяції рослин кукурудзи, які містять щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою вкороченості, причому вказані способи включають стадії (а) генотипування першої популяції рослин кукурудзи, причому популяція містить щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою вкороченості, і, при цьому, щонайменше один алель укороченості пов'язаний із маркером, вибраним з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; (5) селекції із першої популяції однієї або більше рослин кукурудзи, які містять щонайменше один алель укороченості; і (с) одержання з відібраних рослин кукурудзи другої популяції, із створенням в такий спосіб популяції рослин кукурудзи, які містять щонайменше один алель укороченості. В деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щонайменше для одного алеля вкороченості в межах близько 20 СМ, 10 СМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із 5ЕО ІО МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щонайменше для одного алеля вкороченості в межах близько 20 сМ, 10
СМ, 5 сМ, 1 СМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО
ІО МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У інших аспектах вказані способи включають генотипування маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щонайменше для одного алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щонайменше для одного алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІО МО: 7 і 95. У деяких аспектах алель укороченості вибирають з групи, що складається із ЗЕО ІЮО МО: 27-48. У інших аспектах вказані способи додатково включають генотипування першої популяції рослин кукурудзи в одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У деяких аспектах стадія (а) цих способів додатково включає генотипування першої популяції бо рослин кукурудзи в одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах стадія (а) цих способів додатково включає генотипування першої популяції рослин кукурудзи для алеля вкороченості, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 76-80.
ІЇО011| В одному аспекті цього документа пропонуються способи селекції рослини або насіння кукурудзи, причому вказані способи включають: (а) генотипування популяції рослин кукурудзи або насіння в поліморфному локусі, пов'язаному із маркером, вибраним з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і (Б) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості у вказаному поліморфному локусі. В деяких аспектах ці методи включають генотипування в поліморфному локусі в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 см, 0,5 СМ або менше 0,5 сМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У інших аспектах вказані способи включають генотипування маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу в межах близько 20 СМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 сМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ
МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 7 і 95. У деяких аспектах рослина або насіння, відібрані вказаними способами, містять алель укороченості, вибраний з групи, що складається із «ЕО ІЮ МО: 27-48. У інших аспектах вказані способи додатково включають генотипування популяції рослин кукурудзи або насіння в одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 71-75. У деяких аспектах стадія (а) цих способів додатково включає генотипування першої популяції рослин кукурудзи в одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах стадія (а) цих способів додатково включає генотипування першої популяції рослин кукурудзи щодо алеля вкороченості, вибраного з групи, що складається із ФЕО ІЮО МО: 76-80.
ІЇ0012| В одному аспекті цього документа пропонуються способи селекції рослини або насіння кукурудзи, причому спосіб включає: (а) виділення нуклеїнової кислоти з рослини або насіння кукурудзи; (б) аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення поліморфного маркера,
Зо пов'язаного з гаплотипом укороченості, причому гаплотип укороченості містить один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше алелів укороченості маркерів, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 1-22 і 86-109; і (с) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що має гаплотип укороченості. В деяких аспектах вказані способи включають виявлення поліморфного маркера в межах близько 20 СМ, 10 СМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від гаплотипу вкороченості. В інших аспектах вказані способи включають виявлення гаплотипу вкороченості, що містить один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше алелів укороченості маркерів, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування обох локусів ЗЕО ІЮ МО: 7 і 95. У деяких аспектах гаплотип укороченості містить одну або більше, дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше послідовностей, вибраних з групи, що складається із 5ЕО І МО: 27-48. У інших аспектах вказані способи додатково включають аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення однієї або більше поліморфних послідовностей, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 71-75. У деяких аспектах стадія (Б) цих способів додатково включає аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення однієї або більше поліморфних послідовностей, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах вказані способи додатково включають аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення одного або більше алелів укороченості, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ
МО: 76-80.
ЇО013| В одному аспекті цього документа пропонуються способи інтрогресії ознаки вкороченості в сорт кукурудзи, причому спосіб включає: (а) схрещування першого сорту кукурудзи, який володіє ознакою вкороченості, із другим сортом кукурудзи, який не володіє ознакою вкороченості, для одержання однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків; (б) аналіз однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків для виявлення алеля вкороченості, причому алель укороченості пов'язаний з маркером, вибраним з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1- 22 і 86-109; і (с) селекцію рослини кукурудзи-нащадка, що містить укорочений алель. В деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості у межах ,близько 20 сМ, 10
СМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО 60 ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості локусу, вибраного з групи, що складається із
ЗЕО ІО МО: 5-8, 11 -22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості локусу, вибраного з групи, що складається із ФЕО ІЮО МО: 7 і 95. У інших аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22, 71-75 і 86-109. У деяких аспектах алель укороченості вибраний з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 27-48 і 76-80.
І0014| Рослини або насіння кукурудзи, вибрані або одержані із застосуванням способів, описаних в цьому документі, можуть містити одну генну конверсію геномної ділянки Вг2. У деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи містять знижений рівень мРНК або білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах рослинам або насінню кукурудзи властива знижена активність білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В деяких аспектах висота вибраної рослини в зрілості є меншою на близько 10 95, 20 95, 30 95, 40 95, 50 95, 60 95 або 70 95 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах урожайність вибраної рослини дорівнює або перевищує урожайність контрольної рослини, що не містить алеля вкороченості. В деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи, вибрані із застосуванням вказаних методів, вимагають для початку цвітіння на близько 5 95, 10 95, 15 9б, 20 95 або 25 95 одиниць тепла менше, ніж контрольні рослини. В інших аспектах рослини або насіння кукурудзи, вибрані із застосуванням цих способів, досягають відносної зрілості на близько 10 95, 15 95, 20 905, 25 905, 30 95, 35 95, 40 95 або 45 95 днів раніше, ніж відносної зрілості досягають контрольні рослини. 0015) В іншому аспекті цього документу пропонуються гібридні вкорочені, карликові або напівкарликові рослини кукурудзи або частини вказаних рослин, що містять алель укороченості, який характеризується однією або більше послідовностями, вибраними з групи, що складається із «БО ІЮО МО: 27-48. У деяких аспектах, рослини кукурудзи , запропоновані в цьому документі, є елітними лініями. Такі елітні лінії можуть бути трансгенними або нетрансгенними, інбредними або гібридними.
Зо 0016) В одному аспекті цього документу пропонується ємність з елітним насінням кукурудзи, що містить алель укороченості, що характеризується однією або декількома послідовностями, вибраними з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 27-48. Вказане насіння може бути трансгенним або нетрансгенним. Крім того, воно може бути інбредним або гібридним насінням.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0017| У 5ЕО ІО МО: 1-22 наведені поліморфні маркерні послідовності, що узгоджуються з ознакою вкороченості. У 5ЕО ІЮ МО: 23-26 представлені приклади послідовностей праймерів і зондів для маркера генотипування ЗЕО ІЮ МО: 7. У 5ЕО ІЮО МО: 27-48 представлені відповідні приклади укорочених алелів, як наведено в Табл. 2. У 5ЕО ІЮ МО: 49-70 представлені відповідні приклади невкорочених алелів, як наведено в Табл. 2. У 5ЕО ІЮ МО: 71-75 представлені додаткові поліморфні маркерні послідовності. У 5ЕО І МО: 76-80 наведений відповідний приклад алелів укороченості, як наведено в Табл. 7. У 5ЕБЕО ІЮ МО: 81-85 представлений відповідний приклад невкорочених алелів, як наведено в Табл. 7. У 5ЕБЕО ІЮ МО: 86-109 представлені додаткові Вг2-зв'язані поліморфні послідовності У 5ЕБЕО І МО: 112-116 представлені приклади послідовностей праймерів і зондів для маркера генотипування ЗЕО ІЮ
МО: 95. Фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що описані в цьому документі поліморфні маркери включають різні алелі, які включають, але не обмежуючись цим, наведений приклад алелів.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
ІЇ0018| Якщо не вказано інше, терміни необхідно розуміти відповідно до їх звичайного використання фахівцями в даній галузі техніки. Приклади ресурсів, де описані численні терміни, що відносяться до молекулярної біології і використовуються в цьому документі, можна знайти в
АїІрепз сеї аї!., МоІесшіаг Віоіоду ої ТНе Сеїї, їй Едйіоп, Сапапа бсієпсе Рибіїзпіпод, Іпс.: Мем мок, 2007; Вієдег еї аї., Сіо5загу ої Сепеїїсв: СІазвіса! апа Моїесшіаг, Бій еайіоп, Зргіпдег-Мепад: Мем
УОгК, 1991; Кіпод еї аї, А Обіспопагу ої Сепейіс5, 6Іп ейа., Охіога Опімегейу Ргез5: Мем/ МогК, 2002; і
Ї ем/іп, Сепез ІХ, Охіога Опімегейу Рге55: Мем/ МогК, 2007. Використовується номенклатура для баз ДНК, наведена у 37 СЕК 5 1.822. 0019) Використовувані в цьому документі терміни у формах однини, наприклад, включають посилання на множину, якщо зміст явно не диктує іншого. Так, наприклад, посилання на «рослину» в однині додатково включає множину рослин; крім того, в залежності від контексту, 60 використання терміну «рослина» може додатково включати генетично подібне або ідентичне потомство цієї рослини; використання терміну «нуклеїнова кислота» необов'язково включає, як практичне застосування, декілька копій цієї молекули нуклеїнової кислоти; аналогічно, термін «зонд» необов'язково (і звичайно) включає декілька аналогічних або ідентичних молекул зонда. (0020) В цьому документі термін «рослина» відноситься до суцільної рослини, будь-якої її частини або культури клітин або тканин, одержаних з рослини, які містять будь-яке із: суцільних рослин, компонентів або органів рослин (наприклад, листя, стебел, коріння і т.д.), рослинних тканин, насіння, рослинних клітин та/або їх потомства. Рослина-нсащадок може належати до будь-якого покоління потомства, наприклад, Е1, Е2, ЕЗ, 4, Е5, Еб, Е7 і т.д. Рослинна клітина є біологічною клітиною рослини, узятою з рослини або одержаною шляхом культивування із клітини, узятої з рослини.
І0021) В цьому документі термін «рослина кукурудзи» або «рослина маїсу» відноситься до рослини виду 7еа тауз І і включає всі різновиди рослин, які можна розводити з кукурудзи, включаючи види дикого маїсу. (0022) В цьому документі термін «карликова рослина» відноситься до незвичайно маленької рослини. Звичайно довжина або висота такої «карликової рослини» є зменшеною в порівнянні з висотою контрольної рослини дикого типу (наприклад, вся решта ознак, за винятком ознаки вкороченості) на близько 30 95, 35 905, 40 95, 45 95, 50 95, 55 95, 60 95 і більше. Висота або довжина «напівкарликової» рослини є зменшеною в порівнянні з висотою контрольної рослини дикого типу на близько 5 95, 10 95, 15 95, 20 95, 25 95, 30 95 або менше. Звичайно, але не винятково, така вкорочена рослина характеризується зменшеною довжиною стовбура, стебла або пагону в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу.
І0023) В цьому документі термін «укорочена рослина» відноситься до рослини з невеликою висотою унаслідок зменшення довжини міжвузлію без відповідного зменшення кількості міжвузлій або кількості та розміру інших органів, зокрема, але не обмежуючись цим, листя, качана і щіточки. «Вкороченість» відноситься до аномальної варіації рослин, що характеризуються вкороченням міжвузлій, без відповідного зменшення розмірів інших частин рослини.
І0024| В цьому документі термін «зародкова плазма» відноситься до живих джерел генетичного матеріалу. Зародкова плазма може бути частиною організму або клітини або може
Зо бути відокремлена від організму або клітини. Загалом, зародкова плазма забезпечує генетичний матеріал певного молекулярного складу, що є фізичною основою для деяких або всіх спадкових якостей організму або клітинної культури. В цьому документі термін «зародкова плазма» включає клітини, насіння або тканини, з яких можна вирощувати нові рослини або частини рослин, такі як листя, стебла, пилок або клітини, з яких можна культивувати суцільні рослини.
І0025| В цьому документі термін «асоційований 3» або «пов'язаний 3» відноситься до розпізнаваного та/або аналізованого взаємозв'язку між двома об'єктами. Наприклад, фраза «пов'язаний з ознакою вкороченості» відноситься до ознаки, локусу, гена, алелі, маркера, фенотипу і т.д. або його експресії, наявність або відсутність яких може впливати на протяжність, ступінь та/або швидкість, з якою рослина або її частина, які володіють ознакою вкороченості.
Таким чином, маркер «асоціюється 3» є ознакою, якщо він пов'язаний з нею, і якщо присутність маркера є показником того, чи буде та/або якою мірою бажана ознака або форма ознаки мати місце у рослині/зародковій плазмі, що містить маркер. Аналогічним чином маркер «асоціюється» з алелем, якщо він пов'язаний з ним, і якщо присутність маркера є показником наявності алеля в рослині/зародковій плазмі, що містить маркер. Наприклад, «маркер, пов'язаний з фенотипом укороченості» відноситься до маркера, присутність або відсутність якого можна застосовувати для прогнозування того, чи рослина демонструватиме фенотип укороченості. (0026) В цьому документі сантиморган («СМ») є одиницею вимірювання частоти рекомбінації і генетичної відстані між двома локусами. Один СМ дорівнює 1 95 вірогідності того, що маркер в одному генетичному локусі буде відокремлений від маркера в другому локусі в результаті схрещування в одному поколінні. Генетичні відстані можуть бути обчислені за значеннями рекомбінації із застосуванням функції Косамбі (Козатрбі, Те евійпайоп ої тар аївіапсе5 їоот гесотбіпайоп маІев. АппаїЇ5 ої Еидепісв, 12:172-75 (1944)).
І0027| В цьому документі термін «тісно пов'язаний» означає, що маркер або локус знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від іншого маркера або локусу. Наприклад, 20 СМ означає рекомбінацію між маркером і локусом з частотою, що дорівнює або є меншою за близько 20 95. 0028) У цьому документі термін «локус» позначає ділянку хромосоми, в якій знаходиться поліморфна нуклеїнова кислота, що визначає ознаку, ген або маркер. Локус може бути одним 60 нуклеотидом, декількома нуклеотидами або більшою кількістю нуклеотидів у ділянці геному.
Локуси відповідно до цього документу включають один або декілька поліморфізмів у популяції; наприклад, альтернативні алелі присутні у деяких людей. «Локус гена» являє собою специфічне розташування хромосом в геномі виду, у якого можна знайти конкретний ген.
І0029| В цьому документі термін «алель» відноситься до альтернативної послідовності нуклеїнової кислоти у визначеному локусі. Довжина алеля може бути настільки маленькою, як 1 нуклеотидна основа. Наприклад, перший алель може зустрічатися на одній хромосомі, тоді як другий алель зустрічається на другій гомологічній хромосомі, наприклад, як це буває на різних хромосомах гетерозиготного індивідуума або між різними гомозиготними або гетерозиготними індивідуумами в популяції.
І0ОЗ30) В цьому документі термін «алель вкороченості» означає алель у визначеному локусі, який надає або приймає участь у створенні фенотипу вкороченості або, альтернативно, є алелем, що дозволяє ідентифікувати рослини з фенотипом укороченості або рослини, що можуть дати потомство з фенотипом укороченості. Наприклад, алель вкороченості маркера може бути маркерним алелем, що сегрегує з укороченим фенотипом.
І0031| В цьому документі термін «частота алелів» відноситься до частоти (частки або відсотка), з якою алель присутній в локусі в організмі індивідуума, в лінії або в популяції ліній.
Наприклад, для алеля «А» диплоїдні індивідууми генотипу «АА», «Аа» або «аа» мають частоту алелів 1,0, 0,5 або 0,0, відповідно. Можна оцінити частоту алелів усередині лінії шляхом усереднювання частот алелів для вибірки індивідуумів з цієї лінії. Аналогічно, можна обчислити частоту алелів в популяції ліній шляхом усереднювання частоти алелів для ліній, що становлять популяцію. Для популяції з кінцевою кількістю індивідуумів або ліній частота алелів може бути виражена як кількість індивідуумів або ліній (або будь-якого іншого вказаного угрупування), що містить алель. Алель позитивно корелює з ознакою, якщо він пов'язаний з нею, і якщо присутність алеля є індикатором того, що бажана ознака або форма ознаки виникатиме для рослини, що містить алель. Алель негативно корелює з ознакою, якщо він пов'язаний з нею, і якщо присутність алеля є індикатором того, що бажана ознака або форма ознаки не виникатиме для рослини, що містить алель.
ІЇ0032| У цьому документі термін «схрещений» або «перехресний» означає одержання потомства шляхом запліднення (наприклад, клітин, насіння або рослин) і включає схрещування
Зо рослин (статеве) і самозапліднення (самозапилення).
І0033) В цьому документі «схрещувати зворотно» і «зворотне схрещування» відносяться до процесу, при якому рослину-нащадок повторно зворотно схрещують з одним із її батьків. У схемі зворотного схрещування батько-донор відноситься до батьківської рослини з бажаним геном або локусом для інтрогресії. Батько-реципієнт (використовуваний один або декілька разів) або «повторний» батько (використовується два або більше разів) відноситься до батьківської рослини, в яку вбудовується ген або локус. Наприклад, див. Кадої еї аї., МагКег-азвівієа
ВасКсгто55зіпуд: А Ргасіїсаї Ехатрієб, у ТЕСНМІООЕВ ЕТ ОТІІ5АТІЮМЗ ОЕ5 МАКОШСБОКЬ5
МОГ ЕСОИГ АІВЕ5 ГГ ЕВ СО ООШЕ5, Мої. 72, рр. 45-56 (1995); та Орепзпау еї а!., Магкег-азвівівй зеїІесіоп іп ВасКсго55 Вгеедіпду, у РКОСЕЕСІМО5 ОБ ТНЕ ЗУМРОБІОМ "АМАЇУ5ІЗ ОБ
МОГЕСОГСАК МАККЕК ОАТА," рр. 41-43 (1994). Первинне схрещування дає покоління Е1.
Термін «ВС1» відноситься до другого використання повторного батька, «ВС2» відноситься до третього використання повторного батька і т.д. У деяких аспектах зворотне схрещування здійснюється неодноразово, з потомством індивідуумів кожного подальшого покоління зворотного схрещування, яке є безпосередньо зверненим до одного і того ж батьківського генотипу. 0034) В цьому документі термін «елітна лінія» означає будь-яку лінію, яка була одержана в результаті розмноження і селекції для переважних агрономічних характеристик. Аналогічним чином, «елітна зародкова плазма» або елітний штам зародкової плазми є зародковою плазмою з переважними агрономічними характеристиками. Численні елітні лінії доступні і відомі фахівцям в галузі розведення кукурудзи. 0035) В цьому документі термін «генетичний елемент» або «ген» відноситься до спадкової послідовності ДНК, наприклад, геномної послідовності, що має функціональне значення. Крім того, термін «ген» може бути використаний для позначення, наприклад, кКДНК та/або мРНК, кодованої геномною послідовністю, а також до вказаної геномної послідовності.
І0036| В цьому документі термін «генотип» позначає генетичну будову індивідуума (або групи індивідуумів) в одному або більше генетичних локусах, на відміну від спостережуваної ознаки (фенотипу). Генотип визначається алелем(ями) одного або більше відомих локусів, які індивідуум успадкував від своїх батьків. Термін «генотип» може використовуватися для позначення генетичної конституції індивідуума в одному локусі, в множинних локусах або, в 60 більш загальному плані, термін «генотип» може використовуватися для позначення генетичних характеристик індивідуума для всіх генів в його геномі. Термін «генотип» додатково може відноситися до визначення генетичної будови індивідуума (або групи індивідуумів) в одному або більше генетичних локусах.
І0037| У цьому документі термін «гаплотип» означає генотип індивідуума у множинних генетичних локусах. Як правило, генетичні локуси, описані гаплотипом, фізично і генетично пов'язані, наприклад, в одному і тому ж діапазоні хромосом. Крім того, гаплотип може відноситися до комбінації ОНП (однонуклеотидний поліморфізм) алелів, розташованих в межах одного гена.
І0038| В цьому документі термін «фенотип» або «фенотипова ознака» або «ознака» відноситься до одній або декількох знайдених характеристик клітини або організму, на які може впливати генотип. Фенотип можна спостерігати неозброєним оком або знайти будь-яким іншим способом оцінки, відомим з рівня техніки, наприклад, за допомогою мікроскопії, біохімічного аналізу, геномного аналізу, аналізу переносимості певних захворювань і т.д. У деяких випадках фенотип безпосередньо контролюється одним геном або генетичним локусом, наприклад, «ознака одного гена». В інших випадках фенотип є результатом присутності декількох генів.
Ї0039| У цьому документі термін «нерівноважне зчеплення» (НЗ) відноситься до невипадкової сегрегації генетичних локусів або ознак (або обох). У будь-якому випадку нерівноважне зчеплення передбачає, що відповідні локуси знаходяться в межах достатньої фізичної близькості вздовж довжини хромосоми, таким чином, що вони сегрегують разом з більш ніж випадковою (тобто, невипадковою) частотою (у разі косегрегувальних ознак, локуси, що лежать в основі ознак, знаходяться в достатній близькості один від одного). Пов'язані локуси косегрегують більш ніж у 50 95 випадків, наприклад, від близько 51 95 до близько 100 95 випадків. Нерівноважне зчеплення можна виміряти за допомогою одного із способів, представлених у НеагісК, Сатеїіс адібзедиййгішт теазигев: ргосеєд м/йй сашіоп. Сепеїсв5, 117:331-41(1987). Термін «фізично зв'язаний» іноді використовується для позначення ситуації, коли два локуси, наприклад, два локуси маркера, є фізично присутніми на одній і тій же хромосомі. Переважно два зв'язаних локуси розташовані в безпосередній близькості, таким чином, що рекомбінація між гомологічними парами хромосом не відбувається між двома локусами під час мейозу з високою частотою, наприклад, таким чином, що зв'язані локуси косегрегують щонайменше у близько 90 95 випадків, наприклад, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95, 99,5 95, 99,75 95 або більше випадків.
Ї0040| У цьому документі термін «маркерний аналіз» означає спосіб виявлення поліморфізму у визначеному локусі із застосуванням конкретного методу, наприклад вимірювання щонайменше однієї ознаки фенотипу (наприклад, кольору насіння, кольору квітів або інших ознак, що виявляються візуально), поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ), одноосновного розширення, електрофорезу, вирівнювання послідовностей, гібридизації алельспецифічних олігонуклеотидів (АСО), випадково ампліфікованої поліморфної
ДНК (ВАПД), технології на основі мікрочіпів, технології секвенування нуклеїнової кислоти і т.д.
І0041) В цьому документі термін «селекція за допомогою маркера» (СДМ) означає процес, за допомогою якого фенотипи відбирають на базі маркерних генотипів. «Розведення із застосуванням селекції за допомогою маркера» відноситься до процесу селекції бажаної ознаки або ознак рослини або рослин шляхом виявлення однієї або більше нуклеїнових кислот у рослині, причому нуклеїнова кислота пов'язана з бажаною ознакою, з подальшою селекцією рослини або зародкової плазми, що містить вказані одну або декілька нуклеїнових кислот.
І0042| У цьому документі термін «поліморфізм» означає наявність однієї або більше модифікацій у популяції. Поліморфізм може виявлятися як модифікація нуклеотидної послідовності нуклеїнової кислоти або як модифікація амінокислотної послідовності білка.
Поліморфізм включає наявність одного або більше варіантів послідовності нуклеїнової кислоти або ознаки нуклеїнової кислоти в одному або більше локусах в популяції, що складається із
БО одного або більше індивідуумів. Варіант може включати, але не обмежуючись цим, одну або декілька модифікацій нуклеотидних основ, введення одного або більше нуклеотидів або делецію одного або більше нуклеотидів. Поліморфізм може виникати в результаті випадкових процесів реплікації нуклеїнових кислот, шляхом мутагенезу, як наслідок мобільних елементів геному, в результаті варіації кількості копій і в процесі мейозу, наприклад, нерівномірного схрещування, дуплікації геному і розривів та злиття хромосом. Варіація може бути поширеною або може бути присутня в популяції з низькою частотою, причому перша приносить більше користі в загальному розведенні рослин, тоді як остання може бути пов'язана з рідкісними, але важливими фенотиповими варіаціями. Корисні види поліморфізмів можуть включати однонуклеотидний поліморфізм (ОНП), інсерції або делеції в послідовності ДНК (інсерційно- бо делеційні поліморфізми), прості повтори послідовності ДНК (ППП), поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів та ОНП мітку. Додатково, генетичний маркер, ген, одержана з ДНК послідовність, одержана з РНК послідовність, промотор, 5'-четрансльована ділянка гена, 3'- нетрансльована ділянка гена, мікроРНК, міРНК, локус толерантності, маркер сателіту, трансген,
МРНК, дл мРНК, профіль транскрипції і характер метилування можуть включати поліморфізм.
Крім того, наявність, відсутність або варіація кількості копій вищезгаданого можуть включати поліморфізм. 0043) У цьому документі термін «ОНП» або «однонуклеотидний поліморфізм» означає зміну послідовності, що відбувається, коли один нуклеотид (А, Т, С або с) в послідовності геному модифікований або варіює. «Маркери ОНП» існують, якщо ОНП співставлені із сайтами в геномі.
І0044)| В цьому документі термін «маркер» або «молекулярний маркер» або «маркерний локус» є терміном, що використовується для позначення послідовності нуклеїнової кислоти або амінокислотної послідовності, яка є достатньо унікальною, щоб характеризувати конкретний локус в геномі. Будь-яка знайдена поліморфна ознака може використовуватися як маркер, якщо вона успадковується по-різному і виявляє нерівноважне зчеплення з фенотиповою ознакою, що представляє інтерес. Для кукурудзи було розроблено декілька маркерів та інтегрованих генетичних карт, наприклад, карта ОМС 98, карта Мезівей Авзосіацнйоп Марріпд (МАМ), генетична карта Іпіептпайїєй В7З/Мо! 7 (ІВМ2) і карта ІНКЕ Спр2004. Більш детально див. таїігедабр.огд/дага сепіег/тар. Всі маркери застосовуються для визначення конкретного локусу в геномах кукурудзи. Картовано велику кількість таких маркерів. Див. таїі7едаб.огу/Заїа сепіег/тагКег. Таким чином, кожен маркер є показником певного сегменту
ДНК, що має унікальну нуклеотидну послідовність. Позиції карти забезпечують міру відносних положень окремих маркерів відносно один одного. Якщо вказано, що ознака пов'язана з даним маркером, буде зрозуміло, що фактичний сегмент ДНК, послідовність якого впливає на ознаку, як правило, косегрегує з маркером. Більш точну і визначену локалізацію ознаки можна одержати, якщо маркери ідентифіковані по обидві сторони від ознаки. Шляхом вимірювання зовнішнього вигляду маркера(ів) у потомстві схрещування, наявність ознаки може бути визначена відносно простими молекулярними тестами без фактичної оцінки зовнішнього вигляду самої ознаки, що може бути складним і трудомістким, оскільки фактична оцінка ознаки
Зо вимагає зростання рослин до стадії та/або в умовах навколишнього середовища, при яких може бути виражена ознака. Молекулярні маркери широко застосовуються для визначення генетичного складу кукурудзи. В деяких аспектах маркери, застосовувані в цьому винаході, виявляють бали нижньої межі виявлення (НМВ) 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше або 9 або більше для відповідної ознаки, що представляє інтерес (наприклад, укороченість), при вимірюванні із застосуванням способу, відомого з рівня техніки, такого як Одепе Мегзіоп 2.23 (1996) з параметрами за умовчанням. 0045) У цьому документі термін «частота генетичної рекомбінації» означає частоту події схрещування (рекомбінації) між двома генетичними локусами. Частоту рекомбінації можна спостерігати, слідуючи сегрегації маркерів та/або ознак після мейозу. В деяких випадках два різні маркери можуть мати однакові координати генетичної карти. В цьому випадку два маркери знаходяться в такій безпосередній близькості один від одного, що вказана рекомбінація відбувається між ними з такою низькою частотою, що вона не виявляється.
І0046| У цьому документі термін «генетична карта» означає взаємозв'язок генетичного зв'язку між локусами на одній або більше хромосомах (або групах зчеплення) всередині даного виду, як правило, у вигляді діаграми або табличної форми. «Генетичне картування» являє собою процес визначення зв'язуючих взаємозв'язків локусів із застосуванням генетичних маркерів, сегрегації популяцій по маркерах і стандартних генетичних принципів частоти рекомбінації. «Місце на генетичній карті» є місцеположенням на генетичній карті відносно навколишніх генетичних маркерів в одній і тій же групі зв'язків, де вказаний маркер може бути знайдений в межах певного виду. Навпаки, «фізична карта» геному відноситься до абсолютних відстаней (наприклад, вимірюється в парах основ або ізольованих і таких, що перекриваються, суміжних генетичних фрагментах, наприклад, контигах). Загалом, чим ближче два маркери або геномні локуси розташовані на генетичній карті, тим ближче вони лежать один до одного на фізичній карті. Фізична карта геному не враховує генетичну поведінку (наприклад, частоту рекомбінації) між різними точками фізичної карти. Відсутність точної пропорційності між генетичними відстанями і фізичними відстанями може існувати у зв'язку з тим, що вірогідність генетичної рекомбінації не є однорідною по всьому геному; деякі ділянки хромосом є «гарячими точками» схрещування, тоді як інші ділянки демонструють тільки рідкісні події рекомбінації, якщо демонструють взагалі. Крім того, мінливість генетичного картографування може бо спостерігатися між різними популяціями одних і тих же культур. Незважаючи на цю мінливість генетичної карти, яка може існувати між популяціями, генетична карта та інформація щодо маркерів, одержані для однієї популяції, як правило, є придатними для багатьох популяцій при ідентифікації рослин з бажаними властивостями, протидії селекції рослин з небажаними властивостями і в розведенні СВМ. Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі техніки, частота рекомбінації (та, як результат, положення генетичної карти) в будь-якій конкретній популяції не є статичними. Генетичні відстані, що розділяють два маркери (або маркер і локус кількісної ознаки (ЛКО)), можуть варіюватися в залежності від того, як визначаються положення карти.
Наприклад, такі змінні, як використовувані популяції батьківського картування, програмне забезпечення, застосовуване при картуванні маркерів або картуванні ЛКО, і параметри, введені користувачем програмного забезпечення для картування, можуть вносити свій внесок до взаємозв'язку ЛКО маркера на генетичній карті. Однак не передбачається, що цей документ обмежуватиметься будь-якими конкретними популяціями картування, застосуванням будь-якого конкретного програмного забезпечення або будь-яким конкретним набором параметрів програмного забезпечення для визначення зв'язку конкретного маркера або гаплотипів із бажаним фенотипом. В межах кваліфікації звичайного фахівця в даній галузі техніки знаходиться екстраполяція нових ознак, описаних у цьому документі, на будь-який генофонд або популяцію, що представляє інтерес, і застосування будь-якого конкретного програмного забезпечення і параметрів програмного забезпечення. Дійсно, спостереження, що стосуються генетичних маркерів і гаплотипів у популяціях, на додаток до описаних в цьому документі, легко можна одержати за допомогою цього документу. У деяких аспектах генетичні відстані, вказані в цьому документі, обчислюються за значеннями рекомбінації із застосуванням функції Косамбі (Козатрбі, Те евійтайоп ої тар дівіапсев їот гесотрбіпаїййоп маІШев. Аппаї!5 ої Еодепісв, 12:172- 75 (1944)). 0047) У цьому документі термін «селекція» або «відбір» в контексті вибору або селекції за допомогою маркера відноситься до дії селекції або відбору бажаних індивідуумів, звичайно із популяції, на базі деяких попередньо визначених критеріїв. 0048) У цьому документі термін «праймер» відноситься до олігонуклеотиду (синтетичного або природного), що здатний діяти як точка ініціації синтезу нуклеїнової кислоти або реплікації вздовж комплементарної нитки при вміщенні в умови, за яких синтез комплементарної нитки каталізується полімеразою. Як правило, довжина праймерів становить від 10 до 30 нуклеотидів, але можуть застосовуватися довші або коротші послідовності Праймери можуть бути представлені у двохнитковій формі, хоча однониткова форма застосовується частіше. Праймер може додатково містити детектовану мітку, наприклад, 5'-кінцеву мітку. 0049) У цьому документі термін «зонд» відноситься до олігонуклеотиду (синтетичного або природного), що є комплементарним (хоча і не обов'язково повністю комплементарним), до цільового полінуклеотиду і утворює дуплексну структуру шляхом гібридизації щонайменше з однією ниткою цільового полінуклеотиду. Звичайно зонди є олігонуклеотидами завдовжки від 10 до 50 нуклеотидів, але можуть застосовуватися довші або коротші послідовності. Зонд може додатково містити детектовану мітку. 0050) У цьому документі термін «популяція рослин» або «рослинна популяція» означає набір, що містить будь-яку кількість, включаючи один, окремих індивідуумів, об'єктів або даних, від яких одержані зразки для оцінки. Найчастіше терміни відносяться до популяції рослин, що розмножується, члени якої відбираються і схрещуються таким чином, щоб дати потомство в програмі розведення. Популяція рослин може включати потомство одного селекційного схрещування або декількох селекційних схрещувань і може бути фактичними рослинами або рослинним матеріалом або представленням рослин іп 5іїйсо. Члени популяції не обов'язково повинні бути ідентичними членам популяції, вибраним для використання у подальших циклах аналізів або зрештою вибраним для одержання кінцевих рослин-нащадків. Часто популяція рослин походить від одного схрещування двох батьківських рослин, але може також бути одержана в результаті двох або більше схрещувань між одними і тими ж або різними батьками.
Хоча популяція рослин може включати будь-яку кількість індивідуумів, фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що селекціонери рослин звичайно використовують розміри популяцій від однієї або двох сотень індивідуумів до декількох тисяч, і що звичайно відбирають найпродуктивніші 5-20 95 популяції для використання у подальших схрещуваннях, щоб покращити продуктивність подальших поколінь популяції.
Ї0051| У цьому документі термін «сорт» і «різновид» використовуються синонімічно і означають групу рослин усередині виду (наприклад, 2. тауз І.), що поділяють певні генетичні ознаки, які відокремлюють їх від інших можливих сортів усередині цього виду. Сорти кукурудзи можуть бути інбредними або гібридними, хоча комерційні сорти кукурудзи є в основному 60 гіоридними, щоб використовувати гібридну силу. Індивідууми в гібридному сорті кукурудзи є гомогенними, майже ідентичними з генетичної точки зору, з більшістю локусів в гетерозиготному стані.
І0052| У цьому документі термін «місцевий сорт» відноситься до динамічної популяції культивованої рослини, що має історичне походження, відмінну ідентичність і не виявляє формального покращення культури, а також часто є генетично різнорідною, адаптованою до місцевих умов і пов'язаною з традиційними системами сільського господарства. Див. Сатаспо
Ма єї а!., Ріапі Сепеїїс НКезошгсев: СНагасієгігайоп апа Оігайоп 3(3):373-84 (2006).
Ї0053| У цьому документі термін «інбредний» означає лінію, яка була виведена для генетичної гомогенності. 0054) У цьому документі термін «гібрид» означає потомство спаровування між щонайменше двома генетично несхожими батьками. Не обмежуючись цим, приклади схем спаровування включають одиночні схрещування, модифіковане одиночне схрещування, подвійне модифіковане одиночне схрещування, трибічне схрещування, модифіковане трибічне схрещування і подвійне схрещування, при якому щонайменше один батько в модифікованому схрещуванні є нащадком схрещування між сестринськими лініями. 0055) У цьому документі термін «інтрогресія» відноситься до перенесення бажаного алеля генетичного локусу з одного генетичного фону в інший. 0056) У цьому документі термін «моногенно конвертований» або «моногенна конверсія» відноситься до рослин, які створені із застосуванням техніки селекції рослин, відомої як зворотне схрещування, або за допомогою генної інженерії, де відновлюються практично всі бажані морфологічні і фізіологічні характеристики сорту на додаток до перенесення одного гена в сорт методом зворотного схрещування або за допомогою генної інженерії.
І0057| Вкорочені мутанти кукурудзи демонструють невелику висоту в результаті зменшення довжини міжвузловини без відповідного зменшення кількості міжвузловин, кількості та розміру інших органів, включаючи листя, качан і щіточку. Див. Рі еї аї., МоІесшаг Вгеєдіпо, 20:83- 91(2007). Виділені три вкорочені мутанти Бгаспуїйс! (Бі1), ргаспуйс2 (рг2) ії ргаспуйсЗ (рг3).
Вкороченим мутантом маїсу з особливим агрономічним потенціалом є рецесивна мутація біг, що приводить до зменшення довжини міжвузлій нижнього стебла без явного зменшення інших органів рослин. Крім того, лінії бг2 демонструють незвичайну силу стебла і стійкість до вітрового вилягання, тоді як листя часто є темнішим і довше зберігається в активному зеленому стані, ніж листя рослин дикого типу. Фенотип Брг2 нечутливий до обробки ГА, ауксинами, брасиностероїдами і цитокінінами, що указує на відсутність впливу мутації бг2 на біосинтез цих гормонів. МиМапі еї аіІ. ідентифікували геномну послідовність гена Вг2 і депонували його в
СепВапк під обліковим номером АУ366085. Див. З5сіепсе, 302(5642)81-84 (2003). Вг2 був анотований для кодування передбачуваного білка, подібного до аденозинтрифосфат (АТФ)- зв'язувального касетного переносника класу Р-глікопротеїнів (ПГП) з множинною лікарською стійкістю (МЛС).
І0058| Вкорочена, карликова або напівкарликова кукурудза, описана в цьому документі, може володіти властивостями, які роблять її придатною для виробництва зерна і фуражу, особливо для виробництва в умовах короткого сезону. Зокрема, обмежена кількість одиниць тепла в умовах короткого сезону знижує врожайність зерна і знижує вірогідність отримання урожаю, що досяг фізіологічної зрілості в поточному році. Розкриті укорочені, карликові або напівкарликові рослини кукурудзи вимагають для початку цвітіння меншої кількості одиниць тепла (наприклад, що вимагають 10 9б), ніж звичайні гібриди, і звичайно досягають фізіологічної зрілості раніше, ніж звичайні сорти. Подібно до напівкарликової пшениці, сорго і рису, рослини кукурудзи, описані в цьому документі, є менш схильними до стеблового і кореневого вилягання через коротші стебла і нижче розташування качана. Крім того, рослини кукурудзи, описані в цьому документі, мають потенціал виробництва високоякісного фуражу завдяки високому співвідношенню качана до соломи. 0059 Крім того, модифікована будова рослини і зменшена площа листя на рослині для розкритої вкороченої, карликової або напівкарликової кукурудзи дозволяють підвищити щільність насаджень, щоб максимізувати урожай зерна і фуражу. Звичайні сорти кукурудзи як правило висаджують із щільністю від 80000 до 90000 рослин на гектар з відстанню між рядками 0,76 м. На протилежність цьому, рослини, описані в цьому документі, можуть бути вирощені з невеликими зернами із вужчими рядками площею близько 0,25 м із щільністю насаджень до 200000 рослин на гектар. Щільність насаджень кукурудзи впливає на стан освітлення, що, в свою чергу, впливає на темпи росту рослин. Таким чином, описані в цьому документі рослини кукурудзи додатково забезпечують відмінну групову структуру, достатню дію сонячного світла і високий урожай зерна. Виробництво кукурудзи, розкритої в цьому документі, з такою високою бо щільністю популяції рослин, додатково забезпечує агроекологічні переваги, такі як знижений тиск бур'янів, поверхневий стік та евапотранспірація. Наприклад, коротші рослини з меншою кількістю і коротшим листям є краще адаптованими до водного стресу, ніж вищі рослини з високою щільністю насаджень. Крім того, запропоновані у цьому винаході рослини кукурудзи краще себе відчувають в порівнянні із звичайною кукурудзою в умовах низького вмісту азоту і володіють вищою стійкістю до пониженого освітлення.
І0О60) Ріїш єї аї. раніше повідомляли про алель Ббг2-23, що містить делецію 8 п.о. на 3'-кінці гена Вгг, і заявляли про наявність прямого зв'язку між цією делецією та фенотипом вкорочення у своїх рослинах Ббг2-23. Див. Ріїш еї аї., МоїІесшаг Вгеедіпд, 20:83-91(2007). Делеція 8 п.о. розпочинається в положенні 4148 у послідовності МРНК Вг2 на базі посилання на геномну послідовність АУ366085. Без делеції 8 п.о. білок Вг2 (РОР'ІІ) містить амінокислотні залишки М-С-
УМ (аспарагін-гліцин-триптофан) з уражених кодонів. Хоча делеція 8 п.о. спричиняє зсув рамки, нова послідовність як і раніше кодує М (аспарагін), а потім 5-М/ (гліцин-триптофан). Всупереч тому, що описано Ріїш еї аїЇ, делеція 8 п.о. у панелі ВК2Р мі не узгоджується з фенотипом вкороченості. Це говорить про відсутність прямого зв'язку між делецією 8 п.о. і фенотипом вкороченості. Однак, цей документ включає генотипування делеції 8 п.о. разом з одним або декількома маркерами, розкритими у цьому документі, що пов'язані з ознакою вкороченості.
ІЇОО61| В одному аспекті цього документу пропонуються способи селекції рослини або насіння кукурудзи, які включають (а) забезпечення популяції рослин або насіння кукурудзи; (Б) виявлення в популяції рослини або насіння кукурудзи, що містить алель вкороченості в поліморфному локусі, причому поліморфний локус пов'язаний із маркером, вибраним з групи, що складається із зЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і (с) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель вкороченості. В деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У інших аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості у поліморфному локусі в межах приблизно 20 сМ, 10
СМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО
ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля
Зо вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 5-8, 9-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 7 і 95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі в нерівноважному зчепленні із маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109, і демонструючим показник НВО 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше або 9 або більше. У деяких аспектах стадія (а) вказаних способів включає схрещування першої рослини кукурудзи, що містить алель вкороченості, із другою рослиною кукурудзи для одержання популяції рослин кукурудзи. В інших аспектах стадія (а) додатково включає зворотне схрещування із другою рослиною кукурудзи. В деяких аспектах вказаних способів рослину або насіння кукурудзи вибирають з популяції сегрегації або популяції гаплоїдного розведення. В інших аспектах вказаних способів рослину або насіння кукурудзи вибирають з одного або більше місцевих сортів. У деяких аспектах вказані місцеві сорти походять з Північної Америки,
Мексики або Італії. В деяких аспектах стадія (Б) вказаних способів включає застосування маркерного аналізу, представленого у цьому документі. В деяких аспектах стадія (р) вказаних способів включає застосування одного або більше праймерів, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮО МО: 23 їі 24. В інших аспектах стадія (Б) вказаних способів включає застосування одного або більше зондів, вибраних з групи, що складається із «ЕО ІЮ МО: 25 і 26. В іншому аспекті цього документу пропонуються способи селекції рослини або насіння кукурудзи, які включають (а) виявлення в популяції рослин або насіння кукурудзи рослини або насіння кукурудзи, що містить алель вкороченості в поліморфному локусі, причому поліморфний локус пов'язаний з маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і (Б) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель вкороченості. В інших аспектах вказані способи додатково включають генотипування популяції рослин або насіння кукурудзи по одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах вказані способи додатково включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. У деяких аспектах знайдений алель вкороченості вибирають з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 76- 80. (0062) В іншому аспекті цей винахід відноситься до способів селекції рослини або насіння бо кукурудзи, що включають: (а) генотипування популяції рослин або насіння кукурудзи в поліморфному локусі, пов'язаному із маркером, вибраним з групи, що складається із ЗЕО ІЮ
МО: 1-22 і 86-109; і (р) селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель вкороченості у вказаному поліморфному локусі. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування в поліморфному локусі в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 сМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. В інших аспектах вказані способи включають генотипування маркера, вибраного з групи, що складається із ФЕО
ІО МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щодо щонайменше одного алеля вкороченості в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 см або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86- 95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щодо щонайменше одного алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із ФЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щодо щонайменше одного алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІО МО: 7 і 95. У деяких аспектах рослина або насіння, відібране вказаними способами, містить алель вкороченості, вибраний з групи, що складається із зЗЕО ІЮ МО: 27-48. У інших аспектах вказані способи додатково включають генотипування популяції рослин або насіння кукурудзи в одній або більш поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75.
У деяких аспектах стадія (а) вказаних способів додатково включає генотипування першої популяції рослин кукурудзи в одній або більше поліморфних послідовностях, вибраних з групи, що складається із 5ЕО ІЮ МО: 71-75. У подальших аспектах стадія (а) вказаних способів додатково включає генотипування першої популяції рослин кукурудзи щодо алеля вкороченості, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 76-80.
ЇОО63| У деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вищезгаданих способів, є гомозиготними за алелем вкороченості. В інших аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вказаних способів, є гетерозиготними за алелем вкороченості. В деяких аспектах рослини кукурудзи або насіння, відібрані із застосуванням вказаних способів, є інбредними. В деяких аспектах рослини кукурудзи або насіння, відібрані із застосуванням вказаних способів, є гібридними. В інших аспектах рослини кукурудзи або насіння, відібрані із застосуванням вказаних способів, знаходяться в агрономічно елітному
Зо середовищі. В деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вказаних способів, дають карликові, напівкарликові або укорочені рослини. В деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вказаних способів, містять моногенну конверсію геномної ділянки Вг2. В деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи містять знижений рівень мРНК або білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах активність білка Вг2 в рослинах або насінні кукурудзи є зниженою в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. У деяких аспектах висота відібраної рослини у стадії зрілості є зниженою приблизно на 10 95, 20 95, 30 90, 95, 50 95, 60 95 або 70 95 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах врожайність відібраної рослини дорівнює або перевищує 40 врожайність контрольної рослини, що не містить алеля вкороченості. В деяких аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вказаних способів, вимагають для початку цвітіння на близько 5 95, 10 95, 15 95, 20 95 або 25 956 одиниць тепла менше, ніж контрольні рослини. В інших аспектах рослини або насіння кукурудзи, відібрані із застосуванням вказаних способів, досягають відносної зрілості на близько 10 95, 15 905, 20 95, 25 95, 30 95, 35 95, 40 95 або 45 95 днів раніше, ніж відносної зрілості досягають контрольні рослини.
Ї0064| В одному аспекті цей винахід відноситься до способів створення популяції рослин кукурудзи, що містять щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою вкороченості, причому спосіб включає стадії (а) генотипування першої популяції рослин кукурудзи, і, при цьому, популяція містить щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою вкороченості, притому, що щонайменше один алель вкороченості пов'язаний із маркером, вибраним з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; (5) селекції із першої популяції однієї або більше рослин кукурудзи, що містять щонайменше один алель вкороченості; і (с) одержання з відібраних рослин кукурудзи другої популяції, із створенням таким чином популяції рослин кукурудзи, що містять щонайменше один алель вкороченості. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу щодо щонайменше одного алеля вкороченості в межах приблизно 20 сМ, 10 СМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 сМ від маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У інших аспектах вказані способи включають генотипування маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу в межах близько 20 сМ, 10 60 СМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від маркера, вибраного з групи, що складається із ФЕО
ІО МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 5-8, 11-22 і 86-95. У деяких аспектах вказані способи включають генотипування локусу, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІО МО: 7 і 95. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі, що знаходиться у нерівноважному зчепленні з маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109, і демонструючим показник НВО 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше або 9 або більше. У деяких аспектах ці методи включають генотипування популяції сегрегації або популяції гаплоїдного розведення. У деяких аспектах стадія (а) вказаних способів включає застосування маркерного аналізу, представленого в цьому документі. У деяких аспектах стадія (а) вказаних способів включає застосування одного або більше праймерів, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 23 ії 24. В інших аспектах стадія (а) вказаних способів включає застосування одного або більше зондів, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІО М: 25 і 26. У деяких аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, є гомозиготною за алелем вкороченості. В інших аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, є гетерозиготною за алелем вкороченості. В деяких аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, є інбредною. В деяких аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, є гібридною. В інших аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, знаходиться в агрономічно елітному середовищі. В деяких аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, дає карликові, напівкарликові або вкорочені рослини. В деяких аспектах популяція рослин кукурудзи, одержаних вказаними способами, містить моногенну конверсію геномної ділянки Вг2. В деяких аспектах рослини кукурудзи, одержані вказаними способами, містять знижений рівень мРНК або білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах активність білка ВіІ2 у рослинах кукурудзи, одержаних вказаними способами, є зниженою в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В деяких аспектах висота одержаної рослини у стадії зрілості є зменшеною приблизно на 10 95, 20 95, 30
Фо, 40 90, 50 95, 60 95 або 70 95 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах врожайність одержаної рослини дорівнює або перевищує
Зо врожайність контрольної рослини, що не містить алеля вкороченості. В деяких аспектах рослини кукурудзи, одержані вказаними способами, вимагають для початку цвітіння на близько
Б Ув, 10 96, 15 95, 20 96 або 25 9565 одиниць тепла менше, ніж контрольні рослини. В інших аспектах рослини кукурудзи, одержані вказаними способами, досягають відносної зрілості на близько 10 95, 15 95, 20 905, 25 905, 30 905, 35 905, 40 95 або 45 95 днів менше, ніж досягають відносної зрілості контрольні рослини.
І0065| В одному аспекті цього документу пропонуються способи селекції рослини або насіння кукурудзи, причому спосіб включає: (а) виділення нуклеїнової кислоти з рослини або насіння кукурудзи; (Б) аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення поліморфного маркера, пов'язаного із гаплотипом укороченості, причому гаплотип укороченості включає один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше алелів укороченості маркерів, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і (с) селекцію рослини або насіння кукурудзи з гаплотипом укороченості. У деяких аспектах вказані способи включають виявлення поліморфного маркера в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 см від гаплотипу вкороченості. В інших аспектах вказані способи включають виявлення гаплотипу вкороченості, що містить один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше алелів укороченості маркерів, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. В деяких аспектах вказані способи включають генотипування обох локусів ХЕО ІЮ МО: 7 і 95. В деяких аспектах стадія (Б) вказаних способів додатково включає аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення однієї або більше поліморфних послідовностей, вибраних з групи, що складається із ЗЕО ІЮ
МО: 71-75. В подальших аспектах вказані способи додатково включають аналіз нуклеїнової кислоти для виявлення одного або більше алелей вкороченості, вибраних з групи, що складається із ФЕО ІЮ МО: 76-80.
ІЇ0066| В одному аспекті цього документу пропонуються способи інтрогресії ознаки вкороченості в сорт кукурудзи, причому спосіб включає: (а) схрещування першого сорту кукурудзи, що містить ознаку вкороченості, із другим сортом кукурудзи, що не містить ознаки вкороченості, для одержання однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків; (Б) аналіз однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків для виявлення алеля вкороченості, причому алель бо вкороченості пов'язаний з маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІО МО: 1-22 і 86-
109; ї (с) селекцію рослини кукурудзи-нащадка, що містить алель вкороченості. В деяких аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості в межах приблизно 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 сМ від маркера, вибраного з групи, що складається із
ЗЕО ІЮО МО: 1-22 і 86-109 і 71-75. В інших аспектах вказані способи включають виявлення алеля вкороченості маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109 і 71-75.
І0067| В іншому аспекті цього документу пропонуються гібридні вкорочені, карликові або напівкарликові рослини кукурудзи або їх рослинна частина, що містить алель вкороченості, який характеризується однією або більше послідовностями, вибраними з групи, що складається із
ЗЕО ІЮ МО: 27-48. В деяких аспектах запропоновані в цьому документі рослини кукурудзи є елітними лініями. В деяких аспектах елітні рослини кукурудзи, представлені в цьому документі, є гомозиготними за алелем вкороченості. В інших аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи є гетерозиготними за алелем вкороченості. В деяких аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи є інбредними. У деяких аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи є гібридними. В інших аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи є трансгенними. В деяких аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи вимагають для початку цвітіння на близько 5 95, 10 90, 15 95, 20 95 або 25 95 одиниць тепла менше, ніж контрольні рослини. В інших аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи досягають відносної зрілості на близько 10 95, 15 95,20 95,25 95, 30 965, 35 95, 40 95 або 45 95 днів раніше, ніж досягають відносної зрілості контрольні рослини. В деяких аспектах, запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи містять моногенну конверсію геномної ділянки Вг2. В деяких аспектах запропоновані в цьому документі елітні рослини кукурудзи містять знижений рівень
МРНК або білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах активність білка Вг2 в елітних рослинах кукурудзи, запропонованих в цьому документі, є зниженою в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості.
В деяких аспектах висота запропонованих в цьому документі елітних рослин кукурудзи у стадії зрілості є зниженою на близько 10 95, 20 905, 30 95, 40 95, 50 95, 60 95 або 70 95 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить алеля вкороченості. В інших аспектах врожайність елітних рослин кукурудзи, запропонованих в цьому документі, дорівнює або перевищує
Зо врожайність контрольної рослини, що не містить алеля вкороченості. 0068) В одному аспекті цього документу пропонується ємність з елітним насінням кукурудзи, що містить алель вкороченості, який характеризується однією або декількома послідовностями, вибраними з групи, що складається із ЗЕО ІО МО: 27-48. У наступному аспекті цього документу пропонується ємність з насінням трансгенної елітної кукурудзи, що містить алель вкороченості, який характеризується однією або декількома послідовностями, вибраними з групи, що складається із 5ЕО ІЮ МО: 27-48. У деяких аспектах це трансгенне насіння є гібридним насінням. Ємність з насінням кукурудзи у відповідності до цього документу може містити будь- яку кількість, масу або об'єм насіння. Наприклад, ємність може містити щонайменше або більше, ніж 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 або більше насіння. Як альтернатива, ємність може містити щонайменше або більше, ніж 1 унцію, 5 унцій, 10 унцій, 1 фунт, 2 фунти, З фунти, 4 фунти, 5 фунтів або більше насіння.
Ємності з насінням кукурудзи можуть бути будь-якою ємністю, доступною з рівня техніки. Як необмежуючий приклад ємність може бути коробкою, сумкою, пакетом, мішечком, рулоном стрічки, пробіркою або бутлем.
І0069| В одному аспекті розкрите в цьому документі насіння кукурудзи може піддаватися різним видам обробки. Наприклад, насіння можна обробляти для покращення проростання шляхом грунтовки насіння або дезинфекції для захисту від хвороботворних мікроорганізмів. У іншому аспекті на насіння може бути нанесене будь-яке доступне покриття, щоб покращити, наприклад, здатність до проростання, схожість насіння і захист від патогенів, що інфікують насіння. Покриття насіння може бути будь-якою формою покриття для насіння, включаючи, але не обмежуючись цим, грануляцію, плівкове покриття та інкрустацію. У деяких аспектах рослини кукурудзи або способи, розкриті у цьому документі, застосовуються в комбінації з одним або декількома пестицидами, включаючи, але не обмежуючись цим, гербіциди, фунгіциди, інсектициди, мікробіоциди, нематоциди, репеленти комах, бактерициди та інші речовини, застосовувані для боротьби з шкідниками. В інших аспектах описані в цьому документі рослини кукурудзи або способи застосовуються в комбінації з одним або декількома триазолами, стробілуринами, ациламінокислотами, піримідинами, піридинами, арилфенілкетонами, амідами, бензанілідами, імідазолами, динітрофенолами, морфолінами, фенілсульфамідами |і фосфорорганічними сполуками, їх похідними та їх комбінаціями, що можуть бути застосовані 60 для обробки насіння, листя, дренажу або краплинної обробки.
І0070)| В одному аспекті цього документу пропонуються клітини, тканини і органи рослин кукурудзи, що не є репродуктивним матеріалом і не опосередкують природного розмноження рослини. В іншому аспекті цього документу додатково пропонуються клітини, тканини і органи рослин кукурудзи, які є репродуктивним матеріалом і опосередкують природне розмноження рослини. В іншому аспекті цього документу пропонуються клітини, тканини і органи рослин кукурудзи, що не можуть підтримувати себе за допомогою фотосинтезу. В іншому аспекті цього документу пропонуються соматичні клітини рослини кукурудзи. Соматичні клітини, на протилежність клітинам зародкової лінії, не опосередкують розмноження рослин. 0071) Запропоновані клітини, тканини і органи можуть походити з насіння, фруктів, листя, сім'ядоль, гипокотилів, меристем, ембріонів, ендосперму, коріння, пагона, стебла, стручка, квітки, суцвіття, стебла, квітконіжки, стовпчика, дихальця, рецептакулуму, пелюстки, чашолистка, пилку, пильовика, нитки, яєчника, яйцеклітини, навколоплоднику, флоеми, судинної тканини. В іншому аспекті цього документу пропонується хлоропласт рослин кукурудзи. У наступному аспекті цього документу пропонуються епідермальні клітини, продих, листя або кореневі волоски, коріння для зберігання або бульба. В іншому аспекті цього документу пропонується протопласт кукурудзи.
І0072| Кваліфікованим фахівцям буде зрозуміло, що рослини кукурудзи природним чином відтворюються через насіння, а не через безстатеве розмноження або вегетативне розмноження. В одному аспекті цього документу пропонується ендосперм кукурудзи. В іншому аспекті цього документу пропонуються клітини ендосперму кукурудзи. В додатковому аспекті цього документу пропонується стерильна чоловіча або жіноча рослина кукурудзи, яка не може відтворюватися без втручання людини. 0073) В одному аспекті описані в цьому документі рослини кукурудзи вибрані з підвиду 7еєа тау5з Г. підвид тау5. У додатковому аспекті розкриті в цьому документі рослини кукурудзи вибрані з групи 7еа таузх І. підвид таух Іпаепіайа, інакше відомої як кукурудза зубоподібна. В іншому аспекті описані в цьому документі рослини кукурудзи вибрані з групи 7еа тауз І. підвид тауз Іпдигага, інакше відомої як крем'яниста кукурудза. В одному аспекті розкриті в цьому документі рослини кукурудзи вибирають з групи 7еа тауз І. підвид тау5 Засспйагаїа, інакше відомої як цукрова кукурудза. В іншому аспекті описані в цьому документі рослини кукурудзи
Зо вибрані з групи 7еа таух І. підвид тау5 Атуїасеа, інакше відомої як м'яка кукурудза. У ще одному аспекті описані в цьому документі рослини кукурудзи вибрані з групи 7еа тауз І. підвид тау5 Емепа, інакше відомої як попкорн. Крім того, рослини, описані в цьому документі, включають гібридні, інбредні, частково інбредні або є членами визначених або невизначених популяцій.
І0074| В наступному аспекті цього документу пропонуються перероблені продукти, виготовлені з розкритих рослин кукурудзи. Такі продукти включають, але не обмежуючись цим, муку, масло, рослинний екстракт, крохмаль або продукти ферментації або розщеплення. В іншому аспекті цього документу додатково пропонується кукурудзяна мука, яка по суті не містить олії, і яка одержана із застосуванням олієвмісного насіння будь-якої з описаних в цьому документі рослин. В іншому аспекті цього документу додатково пропонується спосіб одержання кукурудзяної муки шляхом подрібнення олієвмісного насіння будь-якої з описаних в цьому документі рослин.
І0075| Різні розкриті в цьому документі лінії кукурудзи можна застосовувати для перенесення описаного в цьому документі алеля вкороченості в нові сорти із застосуванням різних методів перехресного запилення і селекції. Крім того, селекціонери можуть одержувати гібриди, використовуючи описані в цьому документі рослини кукурудзи. Із застосуванням стандартних методів схрещування, зворотного схрещування і селекції, фахівці в даній галузі техніки можуть одержувати комерційні сорти кукурудзи з різними іншими бажаними ознаками, окрім карликовості. Наприклад, селекціонери можуть одержувати комерційні карликові лінії кукурудзи і додаткові ознаки, такі як висока ефективність використання поживних речовин, новонабута стійкість до гербіцидів, підвищена врожайність, боротьба з комахами, стійкість до грибкових захворювань, стійкість до вірусу, стійкість до нематод, стійкість до бактерій, високий вихід олії, високий вихід білка, контроль проростання і утворення пагонів, покращене харчування тварин і людини, стійкість до стресових чинників навколишнього середовища (наприклад, до стресу, спричиненого посухою), підвищена засвоюваність, продукування промислових ферментів, продукування фармацевтичних білків, продукування фармацевтичних пептидів, продукування фармацевтичних молекул невеликого розміру, покращені якості з точки зору обробки, покращений смак, покращене утворення гібридного насіння, зниження алергенності, покращене продукування біополімеру або біопалива і цитоплазматична чоловіча бо стерильність.
І0076| Рослини або лінії кукурудзи, розкриті в цьому документі, додатково можуть бути генномодифікованими для експресії різних фенотипів, що представляють агрономічний інтерес.
Приклади залучених в цьому відношенні генів, включають, але не обмежуючись цим, гени, що забезпечують стійкість до шкідників або хвороб, гени, що забезпечують стійкість або переносимість гербіцидів, гени, що модифікують вміст олії, гени, що контролюють чоловічу стерильність, гени, що впливають на стійкість до абіотичного стресу, та інші гени і фактори транскрипції, що впливають на ріст і агрономічні характеристики рослин, такі як врожайність, цвітіння, висота рослин або будова рослин.
Трансформація кукурудзи
ІЇ0077| Розкриті в цьому документі рослини кукурудзи також можуть бути генетично трансформовані. Розроблені численні способи трансформації рослин, включаючи протоколи біологічної і фізичної трансформації рослин. Див., наприклад, Мій, еї аїЇ., «Ргоседигев ог
Іпігодисіпд ЕБогеідп ОМА іпіо Ріапі5» в Меїподз іп Ріапі МоїІесшаг Віоіоду апа Віоїесппоіоду, СІїСК
В. К. апа Тпотрзоп, У. Е. Ед5. (СКС Ргезв5, Іпс., Воса Каїоп, 1993) стор. 67-88. Крім того, доступні вектори експресії і способи культивування іп міго для трансформації рослинних клітин або тканин і регенерації рослин. Див., наприклад, Сгибрег, еї аї.,, «Месіог5 ог Ріапі
Тгапоїоппайоп» в Меїйоаз іп Ріапі МоїІесціаг Віоіоду апа ВіотесппоЇоду, СІїсК В. К. апа Тпотрзоп,
У. Е. Едв. (СВО Ргез5, Іпс., Воса Кап, 1993) стор. 89-119.
ІЇ0078| Один із способів введення вектора експресії в рослини базується на природній трансформаційній системі АдгоБрасіегшт. Див., наприклад, Ногзсп, еї аї., Зсіеєпсе 227:1229 (1985). А. Штегасіеп5 і А. гпігодепе5 являють собою патогенні для рослин бактерії грунту, які генетично трансформують рослинні клітини. Опис векторних систем Адгобасіегішт і способів опосередкованого Адгорасіегійшт перенесення гена наведений, наприклад, у патенті США Мо 5563055 (Том/пзепа і Тпотав5), що включений до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
І0079| Декілька способів трансформації рослин, що в сукупності згадуються як пряме перенесення генів, були розроблені як альтернатива опосередкованій Адгобасіегійт трансформації. Загальноприйнятим способом трансформації о рослин є балістична трансформація, при якій ДНК переноситься на поверхню балістичних мікрочастинок. Вектор
Зо експресії вводиться в рослинні тканини за допомогою біолістичного пристрою, який прискорює мікрочастинки до швидкостей 300-600 м/с, що є достатнім для проникнення в клітинні стінки і мембрани рослинних клітин. (0080) Іншим способом фізичної доставки ДНК в рослини є ультразвукова обробка клітин- мішеней. Як альтернатива, для введення векторів експресії в рослини застосовуються ліпосома і злиття сферопласта. Крім того, можна застосовувати електропорацію протопластів та суцільні клітини і тканини.
І0081) Після трансформації цільових тканин кукурудзи експресія гена селекційного маркера дозволяє переважну селекцію трансформованих клітин, тканин та/або рослин із застосуванням способів регенерації і селекції, добре відомих з рівня техніки.
І0082| Вищезазначені способи трансформації звичайно застосовують для одержання трансгенного сорту. В подальшому трансгенний сорт можна схрещувати з іншим (нетрансформованим або трансформованим) сортом, щоб одержати новий трансгенний сорт.
Як альтернатива, генетичну ознаку, що була вбудована в конкретну лінію кукурудзи із застосуванням вищезгаданих способів трансформації можна перенести в іншу лінію, застосовуючи традиційні способи зворотного схрещування, добре відомі в рослинництві.
Наприклад, підхід із зворотним схрещуванням можна застосовувати для перенесення вбудованої ознаки із звичайного, неелітного сорту в елітний сорт або із сорту, що містить в геномі чужорідний ген, у сорт або сорти, які не містять цього гена. 0083) Рослини або насіння кукурудзи, розкриті в цьому документі, додатково можуть бути одержані одним або декількома способами конструювання геному або можуть підлягати подальшому геномному редагуванню. Наприклад, один або декілька алелів укороченості можуть бути введені в геном без ознаки вкороченості. Ілюстративні способи конструювання геному включають мегануклеази, цинк-пальцеву нуклеазу, ефекторні нуклеази, подібні до активаторів транскрипції (ТАГЕМ), і систему СКІБРЕ-са59. Див., наприклад, са) еї аї., Тгепавз іп
Віотесппоіоду, 31(7):397-405 (2013).
Додаткове розведення
І0084| Розкриті в цьому документі рослини кукурудзи можна додатково розводити із застосуванням одного або більше відомих з рівня техніки способів, наприклад, чистопорідного розведення, повторної селекції, масової селекції і мутаційної селекції. Чистопорідне розведення 60 починається із схрещування двох генотипів, таких як сорт кукурудзи, що містить алель укороченості, описаний в цьому документі, та інший сорт кукурудзи, позбавлений такого алеля.
Якщо двоє первинних батьків не забезпечують всіх бажаних характеристик, то інші джерела можуть бути включені в популяцію виробників. При чистопорідному способі вищі рослини самозапилюються і відбираються у послідовних дочірніх поколіннях. У подальших дочірніх поколіннях гетерозиготний стан поступається місцем гомогенним сортам в результаті самозапилення і селекції. Як правило, у способі чистопорідного розведення застосовується п'ять або більше послідовних дочірніх поколінь самозапилення і селекції: Е1 у Е2; Е2 у ЕЗ; ЕЗ у
Е4; Б4 у Б5 ї т.д. Після достатнього інбридингу послідовні дочірні покоління сприятимуть збільшенню насіння одержаного сорту. Одержаний сорт може містити гомозиготний алель у близько 95 95 або більше локусів.
І0085| На додаток до застосування зворотного схрещування для досягнення конверсії, зворотне схрещування може додатково застосовуватися в поєднанні з чистопорідним розведенням. Як обговорювалося раніше, зворотне схрещування можна застосовувати для перенесення однієї або більше конкретних бажаних ознак з одного сорту, батька-донора, в одержаний сорт, який носить назву повторного батька і володіє в цілому хорошими агрономічними характеристиками, але не володіє бажаною ознакою або ознаками. Однак, ту ж саму методику можна застосовувати для зсуву потомства до генотипу повторного батька, з одночасним збереженням багатьох ознак не повторного батька, зупиняючи зворотне схрещування на ранній стадії і продовжуючи самозапилення і селекцію. Наприклад, сорт кукурудзи може бути схрещений з іншим сортом для одержання рослини-нащадка першого покоління. Потім рослина-нащадок першого покоління може бути зворотно схрещена з одним із батьківських сортів для одержання ВСІ або ВС2. Рослини-нащадки самозапилюються і відбираються таким чином, що новостворений сорт володіє багатьма бажаними атрибутами повторного батька, все ж таки зберігаючи деякі з бажаних атрибутів одноразового батька. В цьому підході використовують цінність і сильні сторони повторного батька для застосування в нових сортах кукурудзи. (0086) Рекурентна селекція є способом, застосовуваним у програмі розведення рослин для покращення популяції рослин. Спосіб передбачає індивідуальне перехресне запилення рослин для одержання потомства. Потомство вирощують, і потомство з кращими характеристиками
Зо відбирають будь-якою кількістю способів селекції, що включають індивідуальну рослину, потомство напівсибів, потомство повних сибів і самозапилюване потомство. Відібране потомство перехресно запилюють один з одним, одержуючи потомство для іншої популяції. Цю популяцію висаджують, і знов рослини з кращими характеристиками відбирають для перехресного запилення. Рекурентна селекція є циклічним процесом і, таким чином, може повторюватися стільки разів, скільки це потрібно. Мета рекурентної селекції полягає у покращенні характеристик популяції. Далі покращена популяція може бути використана як джерело матеріалу для розведення з метою одержання нових сортів для комерційного застосування або розведення, включаючи одержання синтетичної лінії. Синтетична лінія являє собою результуюче потомство, утворене шляхом інтеркросингу декількох відібраних сортів.
І0087| Масова селекція є ще одним корисним способом для застосування в поєднанні з підсиленою молекулярним маркером селекцією. При масовій селекції насіння індивідуальних рослин відбирають на базі фенотипу або генотипу. Далі відібране насіння об'єднують і застосовують для вирощування наступного покоління. Для масової селекції потрібне вирощування популяції рослин великими партіями, що дозволяє рослинам самозапилюватися, збір насіння насипом, і подальше використання зразка насіння, зібраного насипом, для висадки наступного покоління. Крім того, в рамках програми розведення замість самозапилення можна застосовувати цільове запилення. 00881) Крім того, для введення нових ознак в рослини кукурудзи, описані в цьому документі, можна застосовувати мутаційну селекцію. Мутації, що виникають спонтанно або спричинені штучно, можуть бути корисними джерелами мінливості для селекціонера. Метою штучного мутагенезу є збільшення швидкості мутації до бажаної характеристики. Швидкість мутацій може бути збільшена багатьма різними способами, включаючи температуру, довгострокове зберігання насіння, умови культивування тканин, опромінювання; наприклад, рентгенівські промені, гама-промені (наприклад, кобальт 60 або цезій 137), нейтрони (продукт ядерного поділу урану 235 в атомному реакторі), бета-випромінювання (що випромінюється радіоїзотопами, такими як фосфор 32 або карбон 14) або ультрафіолетове випромінювання (від 2500 до 2900 нм) або хімічні мутагени (такі як аналоги основ (5-бром-урацил), споріднені сполуки (8-етокси-кофеїн), антибіотики (стрептонігрин), алкілувальні агенти (сульфурний іприт, нітрогенний іприт, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, 60 гідроксиламін, нітратна кислота або акридини. Як тільки бажана ознака виникає в ході мутагенезу, ця ознака може далі бути вбудована в існуючу зародкову плазму традиційними способами розведення.
І0089) У деяких аспектах цього документа пропонуються подвійні гаплоїдні рослини і насіння кукурудзи, які містять ознаку укороченості або маркерні алелі вкороченості. Підхід подвійних гаплоїдів (ПГ) дає ізогенні рослини в коротші терміни і є особливо придатним для генерації інбредних ліній та кількісних досліджень генетики. ПГ рослин можуть бути одержані у відповідності до способів, відомих з рівня техніки. Наприклад, початкова стадія включає гаплоїдизацію рослини, що приводить до одержання популяції, яка дає гаплоїдне насіння. Не гомозиготні лінії схрещують з батьком-індуктором, що дає гаплоїдне насіння. Насіння, в якому містяться гаплоїдні ембріони і нормальний триплоїдний ендосперм, переносять на другу стадію.
Після селекції гаплоїдного насіння з популяції, відібране насіння піддають подвоєнню хромосом для одержання подвійного гаплоїдного насіння. Спонтанне подвоєння хромосом у клітинній лінії приведе до розвитку нормальних гамет або до розвитку нередукованих гамет з гаплоїдних клітинних ліній. Хімічну сполуку, таку як колхіцин, можна застосовувати для збільшення швидкості диплоїдизації. Колхіцин зв'язується з тубуліном і запобігає його полімеризації в мікротрубочки, тим самим зупиняючи мітоз в метафазі що можна застосовувати для збільшення швидкості диплоїдизації, тобто подвоєння кількості хромосом. Вказані химерні рослини самозапилюються для одержання диплоїдного (подвійного гаплоїдного) насіння.
Одержане насіння ПГ культивують, а потім оцінюють і застосовують для одержання схрещених тестових гібридів. 0090) У цьому документі додатково пропонується одержання гібридного насіння, що містить один або декілька алелів укороченості, описаних в цьому документі, і демонструє укорочений, карликовий або напівкарликовий фенотип. Одержання гібрида кукурудзи в програмі розведення рослин кукурудзи включає три стадії: (1) селекцію рослин з різних пулів зародкової плазми для первинних схрещувань з метою розведення; (2) самозапилення відібраних в результаті схрещувань з метою розведення рослин впродовж декількох поколінь для одержання серії інбредних ліній, які, хоча і відрізняються одна від одної, передають ознаку потомству та є високою мірою однорідними; і (3) схрещування відібраних інбредних ліній з відмінними інбредними лініями для одержання гібридів. Під час процесу інбридингу в кукурудзі сила ліній
Зо зменшується. Енергія відновлюється, коли дві різні інбредні лінії схрещують для одержання гібриду. Важливим наслідком гомозиготності та однорідності інбредних ліній є те, що гібрид між парою певних інбредів завжди буде одним і тим же. Після того, як були ідентифіковані інбреди, які дають гібрид з кращими характеристиками, гібридне насіння можна відтворювати необмежено до тих пір, поки зберігається гомогенність інбредних батьків.
І0091| Схрещуваність лінії, а також продуктивність лінії є фактором селекції покращених ліній кукурудзи, які можуть застосовуватися як інбредні для одержання гібридів. Схрещуваність відноситься до внеску лінії як батька при схрещуванні з іншими лініями для одержання гібридів.
Гібриди, одержані з метою селекції ліній з кращими характеристиками, позначають як тестові схрещування. Одним із способів вимірювання схрещуваності є застосування значень розведення. Значення розведення базуються на загальному середньому значенні кількості тестових схрещувань. Потім це середнє значення коректують для виключення ефектів навколишнього середовища і коректують з урахуванням відомих генетичних взаємозв'язків між лініями.
І0092| Одержання гібридного насіння вимагає інактивації пилку, що виробляється жіночою батьківською рослиною. Неповна інактивація пилку залишає можливість самозапилення. Таке ненавмисне самозапилене насіння може бути випадково зібране і упаковане разом з гібридним насінням. Аналогічним чином, оскільки чоловіча батьківська рослина вирощується на полі поруч із жіночою батьківською рослиною, існує також вірогідність того, що самозапилене насіння чоловічого батька може бути випадково зібране і упаковане разом з гібридним насінням. Після висадки насіння з гібридного мішка можна ідентифікувати і відбирати такі самозапилені рослини. Ці самозапилені рослини є генетично еквівалентними одній з інбредних ліній, застосовуваних для одержання гібриду. Незважаючи на те, що існує можливість включення інбредів у мішки з гібридним насінням, це зустрічається рідко, оскільки вживаються заходи обережності, щоб уникнути таких включень. Вказані самозапилені рослини можуть бути ідентифіковані і відібрані фахівцем в даній галузі техніки за допомогою візуальних або молекулярних способів.
Виявлення маркера 0093) У цьому документі також пропонуються нові поліморфні маркери з геномної ділянки
Вгг2, які можна застосовувати для селекції вкорочених рослин кукурудзи. Приклади поліморфних бо маркерів наведені у Табл. 2 і 7 з вказівкою їх алелів укороченості. Крім того, маркери в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від вказаних типових маркерів можуть бути ідентифіковані з рівня техніки і застосовані в описаних у цьому документі способах. (0094) Генетичні маркери можна відрізнити один від одного (а також від численних алелів будь-якого конкретного маркера) на базі довжини та/або послідовності полінуклеотиду. Загалом, будь-яка диференціально успадковувана поліморфна ознака (включаючи поліморфізм нуклеїнових кислот), що сегрегує серед потомства, є потенційним генетичним маркером.
Ї0095| Як набір поліморфні маркери служать корисним інструментом для одержання ідентифікаційних відбитків рослин, що дозволяють визначити ступінь ідентичності ліній або сортів. Вказані маркери можуть служити основою для визначення асоціацій з фенотипом і можуть застосовуватися для забезпечення генетичного ефекту. Впровадження селекції за допомогою маркера залежить від можливості виявлення і аналізу основних генетичних відмінностей між індивідуумами.
Ї0096| В цьому випадку способи аналізу нуклеїнової кислоти включають, але не обмежуючись цим, способи виявлення на базі ПЛР, способи на базі мікрочіпів, способи на базі мас-спектрометрії та/"або способи на базі секвенування нуклеїнової кислоти. В одному аспекті виявлення поліморфних сайтів у зразку ДНК, РНК або кДНК може бути полегшене за рахунок застосування способів ампліфікації нуклеїнової кислоти. В таких способах навмисно підвищується концентрація полінуклеотидів, що охоплюють поліморфний сайт або включають цей сайт і послідовності, розташовані дистально або проксимально по відношенню до нього.
Такі ампліфіковані молекули можуть бути легко знайдені за допомогою гель-електрофорезу, способів виявлення флуоресценції або інших засобів.
І0097| У способі досягнення такої ампліфікації застосовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) із застосуванням пар праймерів, які здатні гібридизуватися з проксимальними послідовностями, що визначають поліморфізм, у їх двохнитковій формі. Способи типування
ДНК на базі мас-спектрометрії описані в патентах США 6613509 і 6503710 і процитованих у них посиланнях.
І0098| Поліморфізми в послідовностях ДНК можуть бути знайдені або типовані різними ефективними способами, добре відомими з рівня техніки, зокрема, але не обмежуючись цим, такими, які розкриті в патентах США МоМо 5468613, 5217863; 5210015; 5876930; 6030787;
Коо) 6004744; 6013431; 5595890; 5762876; 5945283; 5468613; 6090558; 5800944; 5616464; 7312039; 7238476; 7297485; 7282355; 7270981 і 7250252, всі з яких включено до цього документу шляхом посилання в повному обсязі Однак композиції і способи за цим винаходом можна застосовувати в поєднанні з будь-яким способом типування поліморфізму для типування поліморфізмів у зразках геномної ДНК. Застосовувані зразки геномної ДНК включають, але не обмежуючись цим, геномну ДНК, виділену безпосередньо з рослини або насіння, клоновану геномну ДНК або ампліфіковану геномну ДНК.
І0099| Наприклад, поліморфізми в послідовностях ДНК можуть бути знайдені шляхом гібридизації з алельспецифічними олігонуклеотидними (АСО) зондами, як описано в патентах
США 5468613 і 5217863. У патенті США 5468613 розкрита алельспецифічна олігонуклеотидна гібридизація, при якій одиничні або множинні нуклеотидні варіації в послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути знайдені в нуклеїнових кислотах за способом, в якому послідовність, що містить нуклеотидну варіацію, ампліфікують, наносять на мембрану і обробляють міченим олігонуклеотидним зондом, специфічним по відношенню до послідовності. 00100) Крім того, цільова послідовність нуклеїнової кислоти може бути знайдена за способами лігування зонду, як описано в патенті США 5800944, де цільову послідовність ампліфікують і гібридизують із зондами, з подальшим лігуванням для виявлення міченої частини зонда. 00101) Додатково, для виявлення поліморфізму можна застосовувати мікрочіпи, в яких комплекси олігонуклеотидних зондів збирають з перекриттям, щоб представляти одинарну послідовність таким чином, що відмінність від цільової послідовності в одній точці приведе до часткової гібридизації зонда (Вогемії; еї аЇ., Сепоте Кев5. 13:513-523 (2003); Сиці еї аї.,
Віоіптоптаїйсв 21: 3852-3858 (2005)). Очікується, що на будь-якому мікрочіпі присутні множинні цільові послідовності, що можуть представляти гени та/або некодуючі ділянки, причому кожна цільова послідовність представлена скоріше серією олігонуклеотидів, що перекриваються, ніж одним зондом. Така платформа забезпечує високу пропускну спроможність для скринінгу множинних поліморфізмів. Однофункціональний поліморфізм (ОФП) являє собою поліморфізм, що виявляється одним зондом в матриці олігонуклеотиду, де ознакою є зонд в масиві.
Типування цільових послідовностей за допомогою способів на базі мікрочіпів розкрите в патентах США 6799122; 6913879; і 6996476.
І00102| Цільова послідовність нуклеїнової кислоти додатково може бути знайдена за способами зв'язування зондів, як описано в патенті США 5616464, із застосуванням щонайменше однієї пари зондів, послідовності яких є гомологічними суміжним частинам цільової послідовності нуклеїнової кислоти, і містять бічні ланцюги, які нековалентно зв'язуються з утворенням стовбура при спаровуванні основ зондів із цільовою послідовністю нуклеїнової кислоти. Щонайменше один з бічних ланцюгів містить групу, що фотоактивується, яка може утворювати ковалентний поперечний зв'язок з іншим елементом бічного ланцюга стовбура. 00103) Інші способи виявлення ОНП та інсерційно-делеційних поліморфізмів включають способи добудови за однією основою (ДОС). Приклади способів ДОО включають, але не обмежуючись цим, такі, які розкриті в патентах США 6004744; 6013431; 5595890; 5762876; і 5945283. Способи ДОО базуються на подовженні нуклеотидного праймера, суміжного з поліморфізмом, з метою введення при подовженні праймера детектованого нуклеотидного залишку. В деяких аспектах у способі ДОО застосовуються чотири синтетичних олігонуклеотиди. Два з олігонуклеотидів служать ПЛР-праймерами і є комплементарними до послідовності локусу геномної ДНК, яка фланкує ділянку, що містить аналізований поліморфізм.
Після ампліфікації ділянки геному, що містить поліморфізм, продукт ПЛР змішують з третім і четвертим олігонуклеотидами (так звані подовжуючі праймери), що призначені для гібридизації з ампліфікованою ДНК, суміжною з поліморфізмом, у присутності ДНК-полімерази і двох диференціально мічених дидезоксинуклеозидтрифосфатів. Якщо поліморфізм присутній в шаблоні, то один з мічених дидезоксинуклеозидтрифосфатів може бути доданий до праймера в добудові ланцюга за однією основою. Далі присутній алель виводиться шляхом визначення того, яка із двох диференціальних міток була додана до подовженого праймера. Гомозиготні зразки будуть приводити до включення тільки однієї з двох мічених основ, і, таким чином, буде знайдена тільки одна з двох міток. У гетерозиготних зразках присутні обидва алелі і, таким чином, вони спрямовують введення обох міток (у різні молекули подовжуваного праймера), і, таким чином, будуть знайдені обидві мітки.
Ї00104| В іншому способі виявлення ОНП поліморфізми та інсерційно-делеційні поліморфізми можуть бути знайдені за способами, розкритими в патентах США МоМо 5210015;
Зо 5876930; ії 6030787, в яких олігонуклеотидний зонд містить 5'-рлуоресцентний репортерний фарбник і 3і-гасник фарбника, ковалентно зв'язаний з 5- і 3'-кінцями зонду. Якщо зонд не пошкоджений, близькість репортерного фарбника до гасника призводить до пригнічення флуоресценції репортерного фарбника, наприклад, шляхом Форстеровського перенесення енергії. Під час ПЛР прямі і зворотні праймери гібридизуються з конкретною цільовою послідовністю ДНК, що фланкує поліморфізм, тоді як гібридизаційний зонд гібридизується з поліморфізмвмісною послідовністю в ампліфікованому продукті ПЛР. У подальшому циклі ПЛР
ДНК-полімераза з активністю 5'(3' екзонуклеази розщеплює зонд і відокремлює репортерний фарбник від гасника, що приводить до підсилення флуоресценції репортера.
Ї00105| В іншому аспекті локус або локуси, що представляють інтерес, можуть бути безпосередньо секвеновані із застосуванням технологій секвенування нуклеїнової кислоти.
Способи секвенування нуклеїнової кислоти відомі з рівня техніки і включають технології, що надаються 454 |йе Зсієпсе5 (Бренфорд, Коннектикут), Адепсоишгі Віозсіепсе (Беверлі,
Масачусетс), Арріїейа Віозузіет5 (Фостер-Сіті, Каліфорнія), ГІ-СОК Віовсіепсе5 (Лінкольн,
Небраска), Мітріесеп Зузіет5 (Медисон, Вісконсін), Шитіпа (Сан-Дієго, Каліфорнія) і Мібізеп
Віотесппоіодіез (Х'юстон, Техас). Вказані технології секвенування нуклеїнової кислоти включають такі формати, як паралельний аналіз з гранулами, секвенування шляхом лігування, капілярний електрофорез, електронні мікрочіпи, «біочіпи», мікрочіпи, паралельні мікрочіпи та одномолекулярні масиви, як описано у 5егмісе, Зсіепсе 311:1544-46 (2006). 00106) В альтернативних аспектах способи іп 5йїсо можна застосовувати для виявлення маркерних локусів, що представляють інтерес. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що містить маркерний локус, який представляє інтерес, може зберігатися в комп'ютері. Цільову послідовність маркерного локусу або її гомолог можна ідентифікувати із застосуванням відповідного алгоритму пошуку нуклеїнової кислоти, як це передбачено, наприклад, у таких легкодоступних програмах, як ВІ А5Т або навіть прості текстові редактори.
І00107| Будь-який з вищезазначених типів маркерів можна застосовувати в контексті цього документа для визначення алелів укороченості або гаплотипів укороченості, пов'язаних з укороченістю. 00108) Маркери для застосування у способах за цим винаходом переважно повинні бути діагностичними за своєю природою, щоб зробити висновки про наступні популяції. Досвід, що бо існує на сьогоднішній день, показує, що маркери ОНП можуть бути ідеальними для картування,
оскільки вірогідність того, що конкретний алель ОНП одержаний з незалежних джерел в існуючих популяціях певного виду, є дуже низькою. Таким чином, маркери ОНП, схоже, будуть придатними для відстежування і сприяння інтрогресії ЛКО, особливо у разі генотипів. 00109) У деяких аспектах генотипування кукурудзи, включаючи виявлення ОНП, описане в цьому документі, може бути здійснене за допомогою високопродуктивного неруйнуючого відбору насіння. У деяких аспектах в такий спосіб відбирається гаплоїдне насіння, і тільки насіння із щонайменше одним генотипом цільового маркера відбирається для подвоєння. Були описані пристрої і способи для високопродуктивного неруйнуючого відбору насіння, що дозволило б подолати недоліки статистичних вибірок шляхом здійснення індивідуального аналізу насіння. Наприклад, заявка на видачу патенту США серійний номер 11/213430 (подана 26 серпня 2005 року); заявка на видачу патенту США серійний номер 11/213431 (подана 26 серпня 2005 року); заявка на видачу патенту США серійний номер 11/213432 (подана 26 серпня 2005 року); заявка на видачу патенту США серійний номер 11/213434 (подана 26 серпня 2005 року); і заявка на видачу патенту США серійний номер 11/213435 (подана 26 серпня 2005 року), заявка на видачу патенту США серійний номер 11/680611 (подана 2 березня 2007 року), які включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі, розкривають апарат і системи для автоматичного відбору проб насіння, а також способи відбору проб, тестування і накопичення насіння.
Асоціативне картування
ІЇ00110| В одному аспекті цього документа додатково пропонуються гаплотипи, маркерні локуси, зародкова плазма для проведення повногеномного асоціативного картування. Типові маркерні локуси і алелі укороченості наведені у Табл. 2. Повногеномне асоціативне картування проводиться для пошуку сигналів асоціації для різних складних ознак шляхом дослідження генетичної варіації у всьому геномі. Асоціативне картування спирається на можливості хромосомної рекомбінації впродовж великої кількості поколінь в історії виду, що дозволяє усунути зв'язок між ЛКО і будь-яким маркером, не пов'язаним з ним тісно, тим самим підвищуючи швидкість відкриття справжньої асоціації (Чдаппіпк апа Умаїхй, Оцапійаєйме Сепеїісв5,
Сепотісз апа Ріапі Вгеєдіпо, Капо, Ед. САВ Іпіегпайопаї, (2002) рр. 59-68).
І00111) Підхід, застосовуваний для виявлення зв'язку фенотипової варіації з генетичними
Зо локусами, полягає в асоціативному картуванні маркера-ознаки (МОА), також відоме як картування нерівноважного зчеплення (НЗ). На початку 1990-х років картування НЗ стало важливим інструментом картування генів з появою високопродуктивної технології генотипування і широко застосовується в генетиці людини для ідентифікації генів, що впливають на захворювання людини. Цей підхід був введений і почав застосовуватися в дослідженнях із картуванням генів рослин на початку 2000-х років (Ріїпі-Сагсіа єї а!. (2003) Аппи
Вем Ріапі Віої 54: 357-374). (00112) Картування НЗ припускає, що основною причиною НЗ є зв'язок, який пов'язує локуси на одній і тій же хромосомі разом при передачі наступному поколінню. Однак через події рекомбінації, накопичені протягом багатьох поколінь у природній популяції, кожна хромосома була глибоко перетасована, таким чином, що хромосома була розбита на безліч крихітних ділянок, де локуси як і раніше передаються разом, але локуси з різних ділянок мають тенденцію до незалежної передачі, неначебто вони походять з різних хромосом. Хромосомні ділянки, де локуси пов'язані разом при передачі, широко відомі як блоки НЗ (Кеїсп еї аї. (2001) Маїшге 411:199-204). Картування НЗ ідентифікує гени, що представляють інтерес, за допомогою генетичних маркерів на блоках НЗ, де розташовані гени. Це досягається шляхом виявлення значущих асоціацій між маркерами і ознаками, на які впливають гени, для вибірки неспоріднених індивідуумів або вибірки незв'язаних порід, які генотипують за вибраним набором маркерів, що охоплюють ділянки гена-кандидата або весь геном, і фенотипують за набором ознак, що представляють інтерес. 00113) В порівнянні з традиційними способами картування зв'язків, які звичайно базуються на популяціях штучної біпарентальної сегрегації (наприклад, Е2, ВС, ОН, КІ! і т.д.), картування
НЗ звичайно забезпечує краще розрізнення картування завдяки меншим розмірам блоків НЗ.
Крім того, картування НЗ є придатним для ідентифікації більш ніж двох функціональних алелів на асоційованих маркерах у зародковій плазмі. Крім того, картування НЗ є ефективним для оцінки природних популяцій.
Ідентифікація ЛКО 00114) У деяких аспектах маркери, алелі і гаплотипи, представлені в цьому документі, можуть бути застосовані для ідентифікації ЛКО, пов'язаних з висотою рослини і будовою рослини. Статистичні принципи ідентифікації ЛКО включають штрафний регресійний аналіз, бо гребневу регресію, одноточковий маркерний аналіз, складний аналіз родоводу, байєсівський аналіз Монте-Карло з використанням ланцюгів Маркова, тотожність за родоводом, картування діапазонів, складне картування діапазонів (СКД) і регресію Хасемана-Елстона.
І00115)| Маркери ОНП ідеально підходять для картування, оскільки вірогідність того, що конкретний алель ОНП одержаний з незалежних джерел в існуючих популяціях певного виду, є дуже низькою. Таким чином, маркери ОНП є придатними для відстежування і сприяння інтрогресії ЛКО, особливо у разі гаплотипів.
ІЇ00116| Генетичний зв'язок додаткових молекул-маркерів може бути встановлений за допомогою моделі картування генів, такої як, не обмежуючись цим, модель фланкувального маркера, описана у І апдег апа Воївієїп, Сепеїйіс5, 121:185-199 (1989), і картування діапазонів, засноване на методах максимальної правдоподібності, описаних у І апдег апа Воївіеїп, Сепеїісв, 121:185-199 (1989) і реалізоване в програмному пакеті МАРМАКЕК/ЛТІ. (Гіпсоїп апа ГІ апаег,
Марріпяа Сепев Сопігоїїпо Оцапійайме Тгайб О5іпд МАРМАКЕНВ/ОТІ, МУпійенеайд Іпвійше ог
Віотедіса! Кезеагсй, Мавззаспизейе, (1990). Додаткове програмне забезпечення включає
Одепе, версія 2.23 (1996), Оєерагтепі ої Ріапі Вгеедіпд апа Віотеїгу, 266 ЕЄтегзоп Наї, СогпеїЇ
Опімегейу, (паса, МУ, керівництво до якого включене до цього документу шляхом посилання в повному обсязі).
І00117| Обчислюють оцінку максимальної правдоподібності (ОМП) для присутності маркера, разом з допущенням відсутності ефекту ЛКО для ОМП, щоб уникнути фальшиво-позитивних результатів. Потім обчислюють 0910 співвідношення непарних значень (НМВ) як: НМВ - Іосд10 (ОМП для присутності ЛКО/ОМП без зв'язаної ЛКО). Оцінка НМВ по суті вказує на те, наскільки вірогіднішою є поява даних за умови наявності ЛКО в порівнянні з відсутністю. Порогове значення НМВ для виключення фальшиво-позитивного результату із заданою достовірністю, скажемо 95 95, залежить від кількості маркерів і довжини геному. Графіки, що ілюструють пороги
НМВ, наведені у І апаег апа Воївівїп, Сепеїіс5, 121:185-199 (1989), і додатково описані в Аги5 апа Могепо-Сопла|е; , Ріапі Вгеедіпд, Наужмага, ВозетагКк, Котадоза (еаз.) Спартап 8. Наї,
Гопаоп, рр. 314-331 (1993). 00118) Можна застосовувати додаткові моделі. Повідомлялося про численні модифікації та альтернативні підходи до картування діапазонів, зокрема із застосуванням непараметричних способів (Кгидіуак апа І апаег, Сепеїіс5, 139:1421-1428 (1995), повний вміст якого включений до
Зо цього документу шляхом посилання). Крім того, можна застосовувати численні регресійні способи або моделі, в яких здійснюється регресія ознаки на великій кількості маркерів (Чапзеп,
Віотейісз іп Ріапі Вгеєд, мап Оіеп, Удапзеп (едв5.) Ргосеєдіпдв5 ої Ше Міпій Мееїїіпу ої Ше Еисагріа зЗесіп Віотеїйсв іп Ріапі Вгеєдіпу, Те Меїйпепапав, рр. 116-124 (1994); Мерег апа М/псКе,
Адуапсеб5 іп Ріапі Вгеедіпуд, ВіасКмжеї!І, Вегіп, 16 (1994)). Поєднання методик картування діапазонів з регресійним аналізом, відповідно до якого здійснюється регресія фенотипу на один передбачуваний ЛКО в заданому діапазоні маркерів, і в той же час на ряд маркерів, що служать «кофакторами», описане дапзеп апа 5іат, Сепеїіс5, 136:1447-1455 (1994) и 2епд, Сепеїіс5, 136:1457-1468 (1994). Як правило, застосування кофакторів зменшує похибку зсуву і помилки вибірки в оцінених позиціях ЛКО (117 апа Меїспіпдег, Віотейсв5 іп Ріапі Вгеєдіпд, мап Оіеп,
Уапзеп (єдз.) Ргосеєдіподв ої Те Міпій Мееііпд ої Те Еисагріа бесіоп Віотеїгісз іп Ріапі Вгеєдіпо,
Тпе Меїйепйапаз, рр.195-204 (1994), таким чином покращуючи точність та ефективність картування ЛКО (7епод, Сепеїіс5, 136:1457-1468 (1994)). Вказані моделі можуть бути розширені для експериментів з декількома середовищами для аналізу взаємодій генотипу і навколишнього середовища (дапзеп еї а!., Тео. Аррі. Сепеї. 91:33-37 (1995)). 00119) Композиції і способи у відповідності до цього документу можна застосовувати для спрямування СДМ або розведення сортів кукурудзи із бажаним доповненням (набором) алельних форм, пов'язаних з перевершуючими агрономічними характеристиками (наприклад, вкороченість або карликовість). Будь-який із розкритих маркерних алелів можна вводити в лінію кукурудзи за допомогою інтрогресії, традиційним розмноженням (або вводити за допомогою трансформації або першого і другого) з одержанням рослини кукурудзи із перевершуючими агрономічними характеристиками.
Ї00120| Може бути здійснена інтрогресія вказаних маркерних локусів у будь-який бажаний геномний фон, зародкову плазму, рослину, лінію, сорт і т.д. як частина загальної програми розведення СДМ, призначеної для покращення будови кукурудзи і підвищення продуктивності.
І00121| Цей документ додатково відноситься до способу одержання рослини кукурудзи- нащадка і результуючого потомства рослин кукурудзи. В одному аспекті спосіб включає схрещування першої батьківської рослини кукурудзи з другою рослиною кукурудзи і вирощування батьківської рослини кукурудзи в умовах зростання рослин, які дозволяють одержати потомство рослин кукурудзи. Способи схрещування і вирощування рослин кукурудзи бо добре відомі фахівцям з рівня техніки. Таке потомство рослин кукурудзи можна аналізувати щодо алелів укороченості, як описано в цьому документі, і, таким чином, відбирати бажане потомство. Такі рослини-нащадки або їх насіння можна продавати на ринку для виробництва кукурудзи, застосовувати для одержання харчових продуктів, обробляти для одержання бажаного компоненту кукурудзи або далі застосовувати в подальших раундах розведення.
Щонайменше одна з першої або другої рослини кукурудзи може бути рослиною кукурудзи за цим винаходом, яка містить щонайменше одну з алельних форм маркерів за цим винаходом, таким чином, що потомство здатне успадковувати алель.
Розведення шляхом селекції за допомогою маркера (СДМ)
І00122| Поліморфні маркери та їх алелі вкороченості, представлені в цьому документі, можна застосовувати в СДМ розведенні вкороченої кукурудзи. В деяких аспектах поліморфні маркери, розкриті в цьому документі, знаходяться в кодуючій послідовності каузативного гена.
Вони ідеально підходять для СДМ, оскільки не очікується рекомбінації між ними і послідовністю
ДНК, відповідальною за фенотип. Маркери не повинні містити або відповідати каузальним мутаціям, щоб бути ефективними в СДМ.
І00123| Створення молекулярних маркерів в культурах може підвищити ефективність селекції рослин за допомогою СДМ. Генетичні маркери застосовуються для ідентифікації рослин, які містять бажаний генотип в одному або більше локусах, і які, як очікується, передаватимуть своєму потомству бажаний генотип разом із бажаним фенотипом. Генетичні маркери можна застосовувати для ідентифікації рослин, що містять бажаний генотип в одному локусі або в декількох не пов'язаних або пов'язаних локусах (наприклад, гаплотип), і очікується, що вони передаватимуть своєму потомству бажаний генотип разом із бажаним фенотипом. У цьому документі пропонуються засоби ідентифікації рослин, які містять алель укороченості, і таким чином є вкороченими або можуть приводити до появи укорочених рослин. 00124) Ідентифікація рослин або зародкової плазми, які містять маркерний локус або маркерні локуси, пов'язані з бажаною ознакою або ознаками, забезпечує основу для проведення СДМ. Рослини, які містять сприятливі маркери або сприятливі алелі, відбираються, тоді як рослини, які містять маркери або алелі, які негативно корелюють з бажаною ознакою, можуть бути відкинуті. Може бути здійснена інтрогресія бажаних маркерів та/або алелів у рослини з бажаним (наприклад, елітним або екзотичним) генетичним фоном для одержання
Зо інтрогресованої рослини або зародкової плазми, що містить бажану ознаку. В деяких аспектах передбачається, що численні маркери для бажаних ознак послідовно або одночасно відбираються та/або вводяться інтрогресією. Комбінації маркерів, відібраних для однієї рослини, є необмеженими і можуть включати будь-яку комбінацію маркерів, описаних в цьому документі, або будь-який маркер, пов'язаний із розкритими в цьому документі маркерами, або будь-які маркери, розташовані в межах діапазонів ЛКО, визначених в цьому документі. 00125) В деяких аспектах перша рослина або зародкова плазма кукурудзи, які виявляють бажану ознаку (донор, наприклад, укорочена кукурудза), можуть бути схрещені з другою рослиною кукурудзи або зародковою плазмою (реципієнтом, наприклад, елітною або екзотичною кукурудзою, в залежності від характеристик, які бажано одержати в потомстві) для створення інтрогресованої рослини або зародкової плазми кукурудзи в рамках програми розведення. У деяких аспектах рослина-реципієнт може додатково містити один або декілька локусів, пов'язаних з однією або декількома бажаними ознаками, що можуть бути локусами якісних або кількісних ознак. В іншому аспекті рослина-реципієнт може містити трансген.
І00126| В деяких аспектах реципієнтна рослина або зародкова плазма кукурудзи, як правило, не володіє бажаними властивостями в порівнянні з першою рослиною або зародковою плазмою кукурудзи, тоді як інтрогресована рослина або зародкова плазма кукурудзи демонструватиме покращені ознаки в порівнянні з другою рослиною або зародковою плазмою.
Інтрогресована рослина або зародкова плазма кукурудзи, одержані за вказаними способами, також є ознакою цього винаходу.
І00127| СДМ являє собою потужне спрощення селекції бажаних фенотипів та інтрогресії бажаних ознак в сорти (наприклад, інтрогресія бажаних ознак в елітні лінії). СДМ легко адаптується до високопродуктивних способів молекулярного аналізу, за допомогою яких можна швидко проводити скринінг великої кількості генетичного матеріалу рослин або зародкової плазми щодо цільових маркерів, і з економічної точки зору є значно вигіднішою, ніж культивування і спостереження за видимими ознаками рослин.
Інтрогресія ознаки вкороченості із застосуванням СДМ
ІЇ00128| В цьому документі пропонуються способи і маркери для інтрогресії ознаки вкороченості в новий сорт кукурудзи із застосуванням СДМ. Для досягнення інтрогресії доступні декілька способів. Наприклад, інтрогресія бажаного алеля у вказаному локусі може бути 60 передана щонайменше одному нащадку за допомогою схрещування двох батьків одного і того ж виду, де принаймні один із батьків містить в геномі бажаний алель. Як альтернатива, наприклад, передача алеля може відбуватися шляхом рекомбінації між двома донорськими геномами, наприклад, у злитому протопласті, де щонайменше один із протопластів-донорів містить у геномі бажаний алель. Бажаним алелем може бути, наприклад, алель селекційного маркера, ЛКО, трансген і т.п. В будь-якому випадку потомство, що містить бажаний алель, може бути повторно зворотно схрещене з лінією, що має бажаний генетичний фон, і здійснена селекція щодо бажаного алеля, щоб забезпечити фіксацію алеля у вибраному генетичному фоні. 00129) Інтрогресія одного або більше бажаних локусів із донорської лінії в іншу лінію досягається за допомогою повторного зворотного схрещування з повторним батьком, яке супроводжується селекцією для збереження одного або більш локусів від батька-донора.
Проводять аналіз потомства щодо маркерів, пов'язаних із ознакою вкороченості, і нащадків з одним або більше бажаними маркерами відбирають для подальшого використання. В іншому аспекті нащадки можуть бути проаналізовані щодо одного або декількох маркерів для селекції рослин з генотипом елітного з агрономічної точки зору батька.
ІЇ00130| Звичайно передбачається, що дії з інтрогресії ознак вимагають більше одного покоління, в якому потомство схрещують з повторним (елітним з агрономічної точки зору) батьком, або проходить самозапилення. Селекцію здійснюють на базі наявності одного або більше маркерів, пов'язаних із ознакою вкороченості, а також вона може бути здійснена на базі батьківського генотипу, що повторюється, де скринінг здійснюють на базі генетичного маркера та/або фенотипу. В іншому аспекті маркери за винаходом можна застосовувати в поєднанні з іншими маркерами, в ідеалі щонайменше на кожній хромосомі геному кукурудзи, для відстежування інтрогресії вкороченості в елітну зародкову плазму. В контексті цього документа застосовується спосіб і композиції для інтеграції ознаки вкороченості. Автори винаходу припускають, що цей документ буде корисним для створення комерційних сортів із ознакою вкороченості та іншими елітними з агрономічної точки зору фенотипами. (00131) Нижче наведені типові варіанти реалізації цього винаходу. 00132) Варіант реалізації винаходу 1. Спосіб селекції рослини або насіння кукурудзи, який включає:
Зо а. виявлення в популяції рослин або насіння кукурудзи рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості в поліморфному локусі, причому вказаний поліморфний локус пов'язаний з маркером, вибраним з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і
Юр. селекцію вказаної рослини або насіння кукурудзи, що містить вказаний алель укороченості. 00133) Варіант реалізації винаходу 2. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний локус знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 СМ або менше 0,5 сМ від вказаного маркера, вибраного з групи, що складається із ЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00134) Варіант реалізації винаходу 3. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний локус вибраний з групи, що складається із ЕО ІЮ
МО: 1-22 і 86-109. 00135) Варіант реалізації винаходу 4. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний локус знаходиться в нерівноважному зчепленні з вказаним маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 1-22 і 86-109, і його показник НМВ становить 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше або 9 або більше. 00136) Варіант реалізації винаходу 5. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний спосіб включає схрещування першої рослини кукурудзи, яка містить вказаний алель укороченості, з другою рослиною кукурудзи з одержанням вказаної популяції рослин або насіння кукурудзи.
І00137| Варіант реалізації винаходу 6. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 5, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає зворотне схрещування з указаною другою рослиною кукурудзи. 00138) Варіант реалізації винаходу 7. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана популяція рослин або насіння кукурудзи є сегрегуючою популяцією. 00139) Варіант реалізації винаходу 8. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана популяція рослин або насіння кукурудзи є популяцією гаплоїдного розмноження.
00140) Варіант реалізації винаходу 9. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана стадія (а) включає маркерний аналіз. 00141) Варіант реалізації винаходу 10. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана стадія (а) включає застосування одного або більше праймерів, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 23 і 24. 00142) Варіант реалізації винаходу 11. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана стадія (а) включає застосування одного або більш зондів, вибраних з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 25 і 26. 00143) Варіант реалізації винаходу 12. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння є гомозиготним за вказаним алелем укороченості. (00144) Варіант реалізації винаходу 13. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння є гетерозиготним за вказаним алелем укороченості. 00145) Варіант реалізації винаходу 14. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння є інбредним. (00146) Варіант реалізації винаходу 15. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння є гібридним.
І00147| Варіант реалізації винаходу 16. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння знаходиться в елітному з агрономічної точки зору середовищі. 00148) Варіант реалізації винаходу 17. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина є карликовою. 00149) Варіант реалізації винаходу 18. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина є напівкарликовою. 00150) Варіант реалізації винаходу 19. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина є укороченою. 00151) Варіант реалізації винаходу 20. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння містить моногенну конверсію у геномній ділянці Вг2. 00152) Варіант реалізації винаходу 21. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана популяція рослин або насіння кукурудзи відноситься до одного або більше місцевих сортів. 00153) Варіант реалізації винаходу 22. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння містить знижений рівень мРНК або білка Вг2 у порівнянні з контрольною рослиною, що не містить вказаного алеля вкороченості. 00154) Варіант реалізації винаходу 23. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина або насіння володіє пониженою активністю білка Вг2 в порівнянні з контрольною рослиною, що не містить вказаного алеля вкороченості. 00155) Варіант реалізації винаходу 24. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що висота вказаної відібраної рослини у стадії зрілості є зменшеною на близько 10 95, 20 95, 30 90, 40 95, 50 95, 60 95 або 70 95 у порівнянні з контрольною рослиною, що не містить вказаного алеля вкороченості. 00156) Варіант реалізації винаходу 25. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що врожайність вказаної відібраної рослини дорівнює або перевищує врожайність контрольної рослини, що не містить вказаного алеля вкороченості.
І00157| Варіант реалізації винаходу 26. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина потребує для початку цвітіння на близько 5 95, 10 95, 15 95, 20 95 або 25 95 одиниць тепла менше, ніж контрольна невкорочена рослина. 00158) Варіант реалізації винаходу 27. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана відібрана рослина досягає відносної зрілості на близько 10 95, 15
Фо, 20 95,25 95, 30 95, 35 95, 40 95 або 45 95 днів раніше, ніж досягає відносної зрілості контрольна невкорочена рослина. 00159) Варіант реалізації винаходу 28. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний алель укороченості є прогностичним для ознаки вкороченості з точністю щонайменше близько 50 95, 60 95, 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 99 95 або 100 95.
І00160)| Варіант реалізації винаходу 29. Спосіб селекції рослини або насіння кукурудзи, який включає: а. генотипування популяції рослин або насіння кукурудзи в поліморфному локусі, 60 пов'язаному з маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; і р. селекцію рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості у вказаному поліморфному локусі. 00161) Варіант реалізації винаходу 30. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 29, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний локус знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 СМ або менше 0,5 сМ від вказаного маркера, вибраного з групи, що складається із «БО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00162) Варіант реалізації винаходу 31. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 29, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний локус вибраний з групи, що складається із ЕО ІЮ
МО: 1-22 і 86-109. 00163) Варіант реалізації винаходу 32. Спосіб створення популяції рослин кукурудзи, які містять щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою вкороченості, причому вказаний спосіб включає стадії: а. генотипування першої популяції рослин кукурудзи, притому, що вказана популяція містить щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою укороченості, і, при цьому, вказаний щонайменше один алель укороченості пов'язаний із маркером, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109; р. селекцію із вказаної першої популяції однієї або більше рослин кукурудзи, які містять вказаний щонайменше один алель укороченості; і с. одержання із вказаних відібраних рослин кукурудзи другої популяції, із створенням таким чином популяції рослин кукурудзи, що містять вказаний щонайменше один алель укороченості. 00164) Варіант реалізації винаходу 33. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 32, який відрізняється тим, що вказаний щонайменше один алель укороченості знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1 сМ, 0,5 сМ або менше 0,5 СМ від вказаного маркера, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00165) Варіант реалізації винаходу 34. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 32, який відрізняється тим, що вказаний щонайменше один алель укороченості знаходиться на маркері, вибраному з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00166) Варіант реалізації винаходу 35. Спосіб селекції рослини або насіння кукурудзи, який включає:
Зо а. виділення нуклеїнової кислоти з рослини або насіння кукурудзи; р. аналіз вказаної нуклеїнової кислоти для виявлення поліморфного маркера, пов'язаного із гаплотипом укороченості, причому вказаний гаплотип укороченості містить один або більше, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім або більше алелів укороченості маркерів, вибраних з групи, що складається із
ЗЕО І МО: 1-22 і 86-109; і с. селекцію рослини або насіння кукурудзи із вказаним гаплотипом укороченості.
І00167| Варіант реалізації винаходу 36. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 35, який відрізняється тим, що поліморфний маркер знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 сМ, 1
СМ, 0,5 СМ або менше 0,5 СМ від вказаного гаплотипу вкороченості.
І00168) Варіант реалізації винаходу 37. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 35, який відрізняється тим, що вказаний поліморфний маркер вибраний з групи, що складається із БЕО
ІО МО: 1-22 ії 86-109.
І00169| Варіант реалізації винаходу 38. Спосіб інтрогресії ознаки вкороченості у сорт кукурудзи, який включає: а. схрещування першого сорту кукурудзи, що містить ознаку вкороченості, із другим сортом кукурудзи, що не містить вказаної ознаки вкороченості, для одержання однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків; р. аналіз вказаної однієї або більше рослин кукурудзи-нащадків для виявлення алеля вкороченості, причому вказаний алель укороченості пов'язаний із маркером, вибраним з групи,
БО що складається із БЕО ІЮО МО: 1-22 і 86-109; і с. селекцію рослини кукурудзи-нащадка, що містить вказаний алель укороченості. 00170) Варіант реалізації винаходу 39. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 38, який відрізняється тим, що вказаний алель укороченості знаходиться в межах близько 20 сМ, 10 сМ, 5 СМ, 1 СМ, 0,5 СМ або менше 0,5 сМ від вказаного маркера, вибраного з групи, що складається із «БО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00171) Варіант реалізації винаходу 40. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 39, який відрізняється тим, що вказаний алель укороченості знаходиться на вказаному маркері, вибраному з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 1-22 і 86-109. 00172) Варіант реалізації винаходу 41. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 39, який 60 відрізняється тим, що спосіб додатково включає:
а. схрещування вказаної відібраної рослини-нащадка із самою собою або із вказаною другою рослиною кукурудзи для одержання однієї або більше додаткових рослин кукурудзи- нащадків; і е. селекцію іншої рослини-нащадка, що містить вказаний алель укороченості. 00173) Варіант реалізації винаходу 42. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 41, який відрізняється тим, що стадія (є) селекції включає селекцію за допомогою маркера. 00174) Варіант реалізації винаходу 43. Гібридний карликовий або напівкарликовий сорт кукурудзи або його рослинна частина, що містить алель укороченості, який характеризується однією або декількома послідовностями, вибраними з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 27- 48. 00175) Варіант реалізації винаходу 44. Гібридний карликовий або напівкарликовий сорт кукурудзи або його рослинна частина згідно Варіанту реалізації винаходу 43, які відрізняються тим, що вказаний сорт є гомозиготним за вказаним алелем укороченості. 00176) Варіант реалізації винаходу 45. Гібридний карликовий або напівкарликовий сорт кукурудзи або його рослинна частина згідно Варіанту реалізації винаходу 43, які відрізняються тим, що вказаний сорт є трансгенним.
І00177| Варіант реалізації винаходу 46. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає генотипування вказаної популяції рослин або насіння кукурудзи за однією або більше поліморфними послідовностями, вибраними з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. 00178) Варіант реалізації винаходу 47. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 1, який відрізняється тим, що вказана стадія (а) додатково включає виявлення алеля вкороченості в поліморфному локусі, вибраному з групи, що складається із БЕО ІЮО МО: 71-75. 00179) Варіант реалізації винаходу 48. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 29, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає генотипування вказаної популяції рослин або насіння кукурудзи за однією або більше поліморфними послідовностями, вибраним з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75.
І00180)| Варіант реалізації винаходу 49. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 29, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає селекцію рослини кукурудзи або
Зо насінневого матеріалу, що містить алель укороченості, вибраний з групи, що складається із
ЗЕО І МО: 76-80.
І00181| Варіант реалізації винаходу 50. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 32, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає генотипування вказаної першої популяції рослин кукурудзи за однією або більше поліморфними послідовностями, вибраними з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 71-75. 00182) Варіант реалізації винаходу 51. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 32, який відрізняється тим, що стадія (а) вказаного способу додатково включає генотипування щонайменше за одним алелем укороченості, вибраним з групи, що складається із БЗЕО ІЮ МО: 76-80. 00183) Варіант реалізації винаходу 52. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 35, який відрізняється тим, що вказаний спосіб додатково включає аналіз вказаної нуклеїнової кислоти для виявлення однієї або більше поліморфних послідовностей, вибраних з групи, що складається із ФЕО ІЮ МО: 71-75. 00184) Варіант реалізації винаходу 53. Спосіб згідно Варіанту реалізації винаходу 35, який відрізняється тим, що стадія (Б) вказаного способу додатково включає аналіз вказаної нуклеїнової кислоти для виявлення щонайменше одного алеля вкороченості, вибраного з групи, що складається із БЕО ІЮ МО: 76-80.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Секвенування геномної ділянки Вг2 в панелі як укорочених, так і невкорочених рослин.
ІЇ00185| Цільове секвенування геномної ділянки Вг2 здійснювали на наборі із 23 патентованих інбредних ліній маїсу (Табл. 1). Вказаний набір ліній в подальшому буде мати назву панелі ВК2Р м1. Панель складається із чотирьох укорочених ліній з Північної Америки, шести укорочених ліній з Мексики, двох укорочених ліній з Італії і однієї вкороченої лінії невідомого походження. Як північноамериканська, так і мексиканська інбредні лінії одержані з джерела зародкової плазми з ознакою вкороченості, яка походить з Бразилії. Італійські інбредні лінії походять з незалежного європейського джерела зародкової плазми з ознакою вкороченості.
Для цілей порівняння панель додатково містить десять невкорочених ліній із цих же регіонів.
І00186| Мийапі еї аїЇ. ідентифікували геномну послідовність гена Вг2 і депонували Її в бо СепВапк, обліковий номер АУЗ366085. Див. Зсіепсе, 302(5642)81-84 (2003). Вг2 був анотований як кодуючий передбачуваний білок, подібний до аденозинтрифосфат (АТФ)-зв'язуючих касетних переносників класу Р-глікопротеїнів (ПГІП) із множинною лікарською стійкістю (МЛС).
Послідовності внутрішніх контигів з геномної ділянки, що містить ген Ві2, проаналізовані і позначені в Табл. 1 як Моп В73.
І00187| Для секвенування геномної ділянки Вг2 сконструйовані 16 наборів праймерів шляхом вирівнювання послідовності Моп В7З гена Вг2 із застосуванням ЮОМАбіаг. Вказані праймери можуть ампліфікувати повнорозмірний геномний ген Вг2, включаючи фланкуючу послідовність розміром 1 тис. п.о. у напрямі проти ходу транскрипції і другу фланкуючу послідовність розміром 2 тис. п.о. у напрямі по ходу транскрипції (всього близько 11000 п.о.).
ПЛР-ампліфікацію здійснювали із застосуванням геномної ДНК, виділеної з кожної лінії панелі
ВК2Р м. Умови термоциклізації ПЛР включають 30 секунд при 98 "С, 35 циклів по 5 секунд при 987С, 5 секунд при 60 "С, 15 секунд при 72 "С, 1,0 хвилину при 72 "С. Для аліквоти 50 мкл реакційної суміші ПЛР застосовували 10 нг/мкл геномної ДНК, по 10 мкМ кожного праймера (прямого і зворотного) і їх суміш ДНК полімерази для ПЛР РпПіге Ної ап І! (Тпепто Зсіепійіс).
Далі продукти ПЛР очищували згідно протоколу ЕхобБар (АПутеїгіх) і передавали на секвенування бЗапдег. Контиги послідовності збирали із застосуванням бедМап Рго в повнорозмірні геномні послідовності Вг2 для подальшої ідентифікації поліморфізму.
Таблиця 1:
Референтні лінії і панель ВК2Р. м', застосовувані для спрямованого секвенування геномної ділянки Вг2 (РаР1)
МОМ В73 7777/7717 нв//// 017771 ВА2" 0 |незастосовно| Референтний
АУЗббО85 В73 | о нв//// 0 ВА2 | незастосовно| Референтний
МРІЛЗУ 777777 нії 17777771711627 | нв | ввгРМ "ВК2: невкорочений фенотип; 7" Бг2: вкорочений фенотип; Її нв: невідомо; 1294213 (див. патент США 7166779); 1285291 (див. патент США 7211717); СМ995128 (див. патент США 8319066); СМ760185 (див. патент США 8581076); «Стать» позначає, яким чином лінія використовується в комбінаціях для одержання гібриду; Ч (чоловічий); Ж (жіночий).
Приклад 2. Ідентифікація нових поліморфізмів бг2 00188) На додаток до геномної ділянки Ві2, дані про послідовність також були одержані для панелі ВК2Р. м! для ділянки гена Вг2, що лежить в напрямі по ходу транскрипції. Поліморфізми послідовності ідентифіковані на базі геномної і розташованої в напрямі по ходу транскрипції послідовностей ВІі2, одержаних для панелі ВК2Р м'1. Всього ідентифіковано 190 поліморфізмів, включаючи ОНП та інсерційно-делеційні поліморфізми. Поліморфізм визначається як різниця в послідовності ДНК між будь-якою із 23 секвенованих ліній в порівнянні з еталонною послідовністю (МОМ В7З або АУ366085) або між будь-якою з ліній в порівнянні один з одним у панелі ВК2Р. м'1. В залежності від місцеположення поліморфізму також були визначені будь-які модифікації амінокислот, що виникають в результаті поліморфізму.
І00189| Щодо відповідності вкороченому фенотипу проаналізовані 190 ідентифікованих поліморфізмів. Зокрема, поліморфізми, наведені у БЕО ІЮ МО: 1-22, повністю узгоджуються із фенотипом укороченості в мексиканських і північноамериканських лініях панелі ВК2Р. м! (Табл. 2). Узгодженість визначається як наявність у всіх вкорочених лініях з Мексики і Північної
Америки одного алеля із наведених поліморфізмів, тоді як у всіх інших лініях присутній інший алель. (00190) Ріїм еї аІ. раніше повідомляли про алель рг2-23, що містить делецію 8 п.о. на 3'-кінці гена Вг2 і заявляли про прямий зв'язок між вказаною делецією і фенотипом укороченості у своїх рослинах Ббг2-23. Див. Ріїш еї аІ., МоІесціаг Вгеедіпд, 20:83-91(2007); див. також Саззапі еї аї.,
Ріапі Столи Ведиї., 64(2):185-92 (2011). В панелі ВК2Р. м! присутня така ж делеція 8 п.о., яка в цьому документі позначена як «делеція 8 п.0о.». Делеція 8 п.о. розпочинається в положенні 4148 послідовності МРНК Вг2 на базі посилання на геномну послідовність АУ366085. Без делеції 8 п.о. білок Вг2 (РОР'І) містить амінокислотні залишки М-(2-М/ (аспарагін-гліцин-триптофан) з уражених кодонів. Хоча делеція 8 п.о. спричиняє зсув рамки, нова послідовність як і раніше кодує М (аспарагін), а потім О-М/ (гліцин-триптофан). Це пов'язано з тим, що видалена послідовність 8 п.о. є частиною невеликого тетрануклеотидного повторення, яке дає повторення амінокислотних залишків в білку. Через зсув рамки делеція 8 п.о. прогнозовано призводить до видалення трьох амінокислот із трансльованого білка ВІі2. Однак незрозуміло, який вплив, якщо він присутній, видалені амінокислоти здійснюють на функції білка Вг2.
І00191| На протилежність описаному Рі еї аї.,, делеція 8 п.о. у панелі ВК2Р мі не узгоджується із фенотипом укороченості. Однак, »указана делеція, узгоджується з невкороченими чоловічими лініями, що походять з Північної Америки, Мексики та Ігалії (виділені напівжирним зображенням шрифту у Табл. 3). Це наводить на думку про відсутність прямого
Зо зв'язку між делецією 8 п.о. і фенотипом укороченості.
Таблиця 2:
Поліморфізми, що узгоджуються із фенотипом укороченості.
Алель
Алель обо
Положення Алель |вкорочен-і Алель без : Поло- в) Початок" полі- Кінець? | вкорочен- | остіу |ознаки вкороче- писав морі, врвтння Екон итрон ження морфізму" ості у зразку) зразку | ності у зразку з азку р У мРНК (БЕО І) разку (ЗЕО
ІЮ
202337238| 202337309|202337380|. т | 27 | 0 | 49 | онпо| 2375 | інтрон3 | нв 202337213Щ|202337384| т | 28 | 6 | 50 | онПпП ОЇ 2379 | інтрон3 | нв 202337218|202337389|.. 0 | 29 | А | 5 | онпо| 2384 | інтрон3з | нв 202337219- 6 |202337299| 202337368|202337439|.Й 0 | 32 | А | 54 | онпПо| 2434 | Інтрон3 | нв 202337336 | 202337407 | 202337478 202337633- 202337643- 202337645- 202337587| 202337648 |202337719|.. А | 37 | С | 5 | онпОо| 2714 | інтрон4 | нв
В напрямі по 12. |2о2343446 | 202343515 | 202343586 т зв с онп ходу транскрипції від Ві2
В напрямі по ходу 13 202343474 | 202343545 | 202343616 т 39 а 61 он транскрипції від Ві2
В напрямі по 14. |2го2343637 | 202343708 | 202343779 а 40 А в2 онп ходу транскрипції від Ві2 202343694| 202343765|202343836| 0 | 41 | с | 63 | онпо| нв | Внапряміпо| нв
Таблиця 2:
Поліморфізми, що узгоджуються із фенотипом укороченості.
Алель
Апель олеки
Маркер Положення Алель Вкорочен| Апель без вкороче-| Тип полі- | Положення | Екзон / Інтрон Поло-
Початок полі- Кінець" вкорочен- | остіу (ознаки вкороче- Й й ження (БО 0) морфізму" ості у зразку) зразку | ності у зразку вва У |морфізму| АУЗ6вОВо Ве мРНК (БЕО І) разку (ЗЕО
ІЮ ходу транскрипції від Ві2
В напрямі по 16. |202343695 | 202343766 | 202343837 А 42 с в4 онпП ходу транскрипції від ВІ?
В напрямі по ходу 17 202343696 | 202343767 | 202343838 ІФ. 43 т 65 он транскрипції від Ві2
В напрямі по 18 | 202343697 | 202343768 | 202343839 а 44 с онп ходу транскрипції від Ві2
В напрямі по 19. | 2го2343698 | 202343769 | 202343840 с 45 а 67 онп ходу транскрипції від Ві2
В напрямі по | 202343700 | 202343771 | 202343842 т 46 А онп ходу транскрипції від ВІ?
В напрямі по 21. |202343701 | 202343772 | 202343843 с 47 А онпП ходу транскрипції від Ві2
В напрямі по 202343773- ходу 22 202343702 202343776 202343847 ста 48 70 ІНДЕЛ транскрипції від Ві2
Таблиця 2 (продовження з наступної сторінки) «Фізичне місцеположення на публічній карті В7З3 Кеїбеп уЗ (п.о.); ОНП - однонуклеотидний поліморфізм; ІНДЕЛ - інсерційно-делеційний поліморфізм; п.о. - пари основ послідовності В7З3 Кеїбеп уЗ Аризонського інституту геноміки; нв: невідомо
Таблиця 3:
Огляд делеції 8 п.о. у панелі ВК2Р. м.
Номер зразка Делеція 8 п.о. Статус укороченості
МОМ в7З делеція відсутня
АУЗ66О85 делеція відсутня
МРІЛ делеція відсутня
МРІ2 делеція відсутня
МРІЗ делеція відсутня
МРІА делеція відсутня
МРІ5 делеція відсутня
МРІ-б делеція відсутня
МРІ-7 делеція відсутня
МРІ-8 делеція відсутня
МРІ9 делеція відсутня
МРІ-ТО делеція відсутня
МРТ делеція відсутня
МРІЛ2 делеція відсутня
МРІЗ делеція відсутня
І294213 делеція відсутня
І285291 делеція
СМ995128 делеція відсутня
СМ760185 делеція
Таблиця 3:
Огляд делеції 8 п.о. у панелі ВК2Р. м.
Приклад 3. Прогностичне значення поліморфного маркера ЗЕО ІО 7.
І00192| 5ЕО ІО 7 представляє однонуклеотидний поліморфізм (ОНП) у Вг2 Екзон 4, що містить алель укороченості (алель Т) і алель без ознаки вкороченості (алель С). Вказаний ОНП знаходиться в положенні 1560 послідовності мРНК Вг2 (РОР'І) на базі АУЗ66085 і відповідає 520-му амінокислотному залишку білка. Вказаний ОНП приводить до синонімічної заміни, оскільки обидва алеля дають кодон для лейцину (Табл. 4).
І00193| Мексиканські і північноамериканські лінії із фенотипом укороченості в панелі
ВК2Р М несуть алель укороченості ЗЕО ІЮ 7 (алель Т). Невкорочені лінії несуть алель без ознаки вкороченості (алель (3). Ознака вкороченості є рецесивною. Зв'язок між 5ЕО ІО 7 і вкороченістю був додатково протестований із застосуванням додаткових сортів кукурудзи, відсутніх у панелі ВК2Р мі. 5ЕБО 10 7 з точністю 100 95 прогнозує вкороченість у північноамериканських лініях (п - 20) ії з точністю 98 95 - в мексиканських лініях (п - 47). В італійських лініях (п - 14) ЗЕО ІО 7 прогнозує вкороченість із точністю 50 95 (Табл. 5). Одержані результати демонструють, що 5ЕС ІЮО 7 високою мірою пов'язана з ознакою вкороченості у мексиканських і північноамериканських лініях, але меншою мірою в італійських лініях.
Таблиця 4:
Праймери і зонди для виявлення поліморфізму ЗЕО І 7.
Хромосом | Прямий праймер | Зворотний Зонд Бг2 (ЗЕ вАТОААССТОТОасСІ астоАССАассс | ССатоСАСАА се (ЗЕО І 23 24 25
Т укорочений (Біг); С - невкорочений (Вг2)
Приклад 4. Аналіз інтронного сплайсинга
І(00194| 5ЕО ІО 7 була валідована на панелі вкороченого і невкороченого матеріалу з
Мексики, і продемонстровано, що вона з точністю 96 956 прогнозує вкорочений фенотип.
Оскільки декілька невкорочених мексиканських ліній у валідаційній панелі були генотиповані з алелем ТТ вкороченості, ймовірно, у цих лініях присутні додаткові поліморфізми, що здійснюють функціональний вплив на ознаку вкороченості. Інші 10 поліморфізмів, що повністю узгоджувалися з фенотипом укороченості в панелі ВК2Р. мі, розташовані в Інтроні З та Інтроні 4. Це наводить на думку про можливість впливу вказаних поліморфізмів на сплайсингові з'єднання інтрон/екзон і, таким чином, модифікації процесингу МРНК.
Ї00195| МІЗТА-Роїпі (доступно за адресою веб-сторінки ріреїїпе.ІБІ.дом/сді-ріп/даїемауг)
Зо застосовується для пошуку острівців інтронної консервативності при парних порівняннях в однодольних. Ідентифіковані мотиви сайтів сплайсинга, точки розгалуження і консервативні ділянки гена РОРІ на базі послідовності АУ366085. Маркер 5ЕО ІО 8 містить інсерцію 5'- атТоСат-3 на початку Інтрона 4 і на останньому нуклеотиді передбачуваного сайту сплайсинга.
Вказана інсерційна послідовність включає нуклеотиди консенсусного сайту сплайсинга «СТММОТ» (Кеаау еї аї!., Аппи. Кем. Ріапі ВіоІ.58:267-94(2007)). Близькість вказаної інсерції до
З-кінця ЄЕкзону 4 і до вірогідного сайту сплайсинга вказує на високу вірогідність функціональності.
Таблиця 5:
Характеристика точності 5ЕО ІО 7. 77111111 Укорочені | Невкорочені/ кл ПОН Те ООН КОН ТОН ва 7 Ї777777111111111110111111111111117111111111111111ло1 нини (Невкорочені//////777777111111111111111111111118111111111 77111111 Укорочені | Невкорочені/ ва 7 Ї77777111111111101111111111111711111111111111181 нини нн НІНІ
Укорочені 11111118 (Невкорочені//////77777111111111111111111111116111111111 у 77111111 Укорочені | Невкорочені/ пт ва 17111776
Таблиця 6:
Додаткова валідація точності 5ЕО ІО 7 при прогнозуванні ознаки вкороченості в лініях
Північної Америки або Мексики. (Невкорочені//////777777711111111111111111169111сС1СС 11111111 0Укорочені////////// Невкорочен/////:///«НФшФС(КЇй 49111110 та 11111100 ва 77777771111111111111111101111111117111111111111111171698сС1
Пропущені/////////77777711111111111111110111111111111111111111011 ниви
Таблиця 6:
Додаткова валідація точності 5ЕО ІО 7 при прогнозуванні ознаки вкороченості в лініях
Північної Америки або Мексики. 11111111 0Укорочені////////// |Невкорочені///7/7/:///-СШ та 11111101 ва 77777710 2231
Пропущені////////77777711111111111111110111111111111Ї1111111111111171
Приклад 5: Інтрогресія алеля вкороченості бг2 для одержання нового вкороченого сорту.
І00196| Рослина кукурудзи, що містить алель укороченості, описаний в цьому документі, схрещують з іншою невкороченою лінією кукурудзи, що володіє бажаною ознакою (наприклад, підвищеною врожайністю при стресі унаслідок засухи, холодовому, тепловому). Рослини- нащадки вказаного схрещування Е1 аналізують щодо наявності одного або більше маркерів
ОНП, наведених у Табл. 2, з метою селекції алеля укороченості. Потім проводять зворотне схрещування відібраної рослини-нащадка РЕ1 з батьківською невкороченою лінією кукурудзи, що володіє бажаною ознакою (повторний батько). Рослини з покоління ВС1 додатково генотипують із застосуванням маркерів ОНП, наведених у Табл. 2, з метою селекції алеля вкороченості.
Після декількох раундів зворотного схрещування (наприклад, 5-7 поколінь) одержують нову укорочену лінію кукурудзи, що володіє бажаною ознакою у батьківській елітній лінії, що повторюється.
Приклад 6: Додаткові поліморфізми Вг2 в екзоні 5.
І00197| В екзоні 5 послідовності, що кодує Вг2, ідентифіковані додаткові поліморфізми Вга2.
Вказані поліморфні послідовності наведені в Табл. 7. На базі вказаних поліморфізмів створені маркери, які застосовуються для контролю ознаки вкороченості, окремо або в поєднанні з одним або декількома поліморфізмами, наведеними у Табл. 2.
Таблиця 7:
Додаткові поліморфізми, ідентифіковані в екзоні 5 кодуючої послідовності Вг2.
Алель
Алель |Алель без! без
Алель укороче-| ознаки ознаки й Поло-
Маркер укороче- | ності у | вкороче- Івкороче- Тип полі- Положення в Екзон / ження (ЗЕО ІВ) враз зразку | ностіу | ностіу морфізму | АУЗ66085' | Інтрон Вг2 МРНК (ЗЕОІО)| зразку | зразку
ЗЕО І
І 75 16 2 щЦФ | 80 |С | 85 |онпо | 5306 |Екзон5 | 2793 "Геномне положення на АУ366085, розпочинаючи з першого нуклеотиду кодуючої ділянки і включаючи інтрони. гПоложення мРНК, розпочинаючи з першого нуклеотиду кодуючої ділянки і не включаючи інтрони.
Приклад 7. Додаткові поліморфізми ВІ2 і маркери для мексиканських («і північноамериканських ліній.
І00198| Результати подальшого секвенування панелі ВК2Р мі у Табл. 1 демонструють більшу кількість поліморфних послідовностей Вг2, а також надають оновлену інформацію щодо послідовності раніше ідентифікованих поліморфізмів. Вказані нові поліморфні послідовності і маркери, включаючи їх типові алелі вкороченості і алелі без ознаки вкороченості, наведені у
Табл. 8. Поліморфізми з Табл. 8 повністю узгоджуються із фенотипом укороченості в мексиканських і північноамериканських лініях панелі ВК2Р. м.
Таблиця 8:
Поліморфізми, що узгоджуються із фенотипом укороченості в мексиканських і північноамериканських лініях.
Маркер Положенн Я . Тип Положе Екзон /ІПолож (ЗЕ оча я Кіне Алель укороченості Алель без ознаки полімор ння в Інтрон | ення
Іо) ток" поліморфіз| ць у зразку вкороченості у зразку фізму АУЗ3660 Ві? | мРНК му" 85 2023і202337309І2023
Ми НИМШН НЕ Ес 8 |202337314| 0 2023|2023372222023 я 100000 8 |202337223| З 2023і202337643|2023 ее 1000 тя 8 |202337646| 7 2023і202337885І2023 м: ШСЗ 5 |202337890| 0 2023 2023
Інтрон м: ШЕШНШШ ЕЕ 5 (8) 2023120233801112023
Кей; НІНІ
З |2го2338012| 5 2023І20234106112023| інсерція, декілька 6127- зББІ1- 92 (4099 - 4112| тисяч пар основ ІНДЕЛ 6128 Екзон 5 ЗББ? б |202341062| 7 ЗЕО ІЮ МО: 111
ТТаССААДОССААТОаСТСа
САТО
СССАТОСАТОСАТСАТС
2023і20233907612023 сста 4143- | Інтрон 93 |Зз902 - 3921 СТСАААСТСАААСАСТСІ ІНДЕЛ 4227 4 6 |202339160| 0 ТОСА
СсСатСсАСОаСААТААСА
СТТАТТ (5ЕБЕО ІЮ МО: 118 20231202339186І2023|ІААСААТТССАТТТТ й 4253- | Інтрон
ЗБИВ тя 6 |202339187| 7 117 "Фізичне місцеположення на публічній карті В7З3 Кеїбеп у3 (п.0о.); ОНП - однонуклеотидний поліморфізм; ІНДЕЛ - інсерційно-делеційний поліморфізм; п.о. - пари основ послідовності В7З3 Кеїйзеп УЗ
Аризонського інституту геноміки; нв: невідомо.
І00199| Серед указаних нових маркерів 5ЕО ІО МО: 86 і 87 знаходяться на тій же ділянці, що і ЗЕО ІО МО: 1-4, і надають оновлені послідовності для попередніх чотирьох поліморфних маркерів. ЗЕО ІЮ МО: 88 представляє консолідацію поліморфізмів із ЗЕО ІЮ МО: 9 і 10.
Приклад 8: Додаткові поліморфізми Вг2 і маркери для італійських ліній.
І00200| В результаті подальшого секвенування додаткових укорочених італійських ліній одержаний новий поліморфний маркер Вг2 (5ЕО ІЮ МО: 95, Табл. 9), що узгоджується з фенотипом укороченості в італійських лініях панелі ВК2Р м! з Табл. 1. Вказаний маркер є унікальним для вкорочених ліній італійського походження. Алель без ознаки вкороченості ЗЕО
ІО МО: 95 містить інсерцію розміром 579 п.о.
002011 Крім того, додаткові поліморфізми (ЗЕО ІЮО МО: 96-109, Табл. 9) ідентифіковані в італійських укорочених лініях (Табл. 9). Несподівано було знайдено, що вказані маркери, хоча і виглядають унікальними для вкорочених італійських ліній, але алелі вкороченості виглядають ідентичними референтним послідовностям В7З (без ознаки вкороченості). (002021 Точність селекції за допомогою маркера була оцінена для 5ЕО ІЮ МО: 95. Серед 34 італійських ліній, генотипованих за 5ЕО ІЮО МО: 95, 8 ліній є вкороченими, а решта 26 ліній є невкороченими. Сім із 8 укорочених ліній несуть інсерцію розміром 579 п.о. (алель укороченості, послідовність інсерції наведена у 5ЕО ІЮО МО: 110), тоді як жодна із 26 невкорочених ліній не несе такої інсерції. Тому загальна точність прогнозування становить 97 95 (Табл. 10). Типові послідовності праймерів і зондів, застосовуваних для маркера генотипу 5ЕБЕО ІЮ МО: 95, наведені у Табл. 11.
Таблиця 10:
Визначення точності маркера 5ЕО ІО МО: 95 для італійських ліній. ліній розміром 579 п.о.
Вкороченіо//////77777777111111111111Ї1111111111111118111111111111111171
Невкорочені//////77777777111111111111Ї11111111111111126111111111 11111101
Таблиця 11:
Праймери і зонди для виявлення поліморфізму ЗЕО ІО МО. 95.
З З Вг2гб З
Е | Хромо- Й Й Й Й онд Вг2 без онд
О | сома Прямий праймер Зворотний праймер ознаки | укороченості
І вкороченості ріг
АТотТаАсСастАастАСТАА
САТССОаТТОоСАСТО | АаСТТТАсС (5ЕОІЮ МО: |ТсАТаСОСТСасСІ АаасСССаТтАТ 95 1 САСТСАС(5ЕОІО /|113, для ампліфікації ССАСТ (5ЕО І | АТОаас (5ЕО
МО: 112) невкороченого МО: 115) ІО МО: 116) поліморфізму) тасдлдайсСААсаСТАТАТОСТ ааАТ (ЗЕО ІО МО: 114, розташований на інсерції розміром 579 п.о. і для ампліфікації поліморфізму вкороченості)
Ї0020О3| Оскільки різноманітні модифікації можуть бути здійснені в описаних і проілюстрованих конструкціях і способах без виходу за межі об'єму винаходу, передбачається, що весь матеріал, викладений в попередньому описі або проілюстрований у доданих графічних матеріалах, повинен інтерпретуватися як ілюстративний, а не обмежуючий. Широта і об'єм цього розкриття не повинні обмежуватися будь-яким з вищеописаних типових варіантів реалізації винаходу, але повинні визначатися тільки у відповідності до наступної формули винаходу, доданої до цього документа, і її еквівалентами. Всі патентні і непатентні документи, процитовані в цьому документі, включені до цього документу шляхом посилання в повному обсязі.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Мопзапіо Тесппоіоду І І С «120» СПОСОБИ І КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ОДЕРЖАННЯ ВКОРОЧЕНИХ РОСЛИН КУКУРУДЗИ -130» РЗ4302М/000/0016517.00553 -1505 05 62/153,831 -1515 2015-04-28 -1505 05 62/180,430 -1515 2015-06-16 -160» 120 «170» Раїепіп версія 3.5 «21051 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(12) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 1 пдссіадса саїдссідсс айдассдас юсісадіда дзаадчіюданс аонаїдсід 60 пдасадіаї апаїадагїаї агагадіадс ссідтадай ШНсад асааааааад 120 аадаадаасяа адагдаацдіє щдс 143 «21052
Зо «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(12) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «40052 сіадсасаїд ссідссайцо ассдасідсі садідадаад айсадії ддсюноа 60 садіаїадаї апаїаїаїаї адіадсссід їадашнй Шсадасаа ааааадаада 120 адаасдадаї даадісєюдса аїї 143 2105 З «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(12) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 З асадссідс сайдассда сідсісадід адаадшдаїй саднодюдсі дидасацдіа 60 тадаїадата іІпіагадіад сссідіадаї ШИШсСа дасааааааа даадаадаас 120 бо дадаїдааді сіюдсаанса дії 143
«2105» 4 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(15) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(15) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 4 садссідсс айдассдас ідсісадіда даадіддне адноїдсід Ндасадіаї 60 адаїадазаї аппппдїадс ссюіадай Шсад асааааааад аадаадаасд 120 ададаацдіс юсаайсда ща 146 «21055 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (10)...(12) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (10)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 5
Зо дсдндаса діагадаїад аїаааад їтадсссщіа данні Ісадасаааа 60 ааадаадаап ппсдадаїда адісідсааї Ісдаїшо99 сададсаааї ссідсіддас 120 ддасасдасс ісаддісдсі дда 143 «21056 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (10)...(70) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (10)...(70) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 6 щасадіаїа даїадаїага їіаіадіадсс сіцдїіадаш шШшсада сааааааада 60 адаадаасоп даїдаацдісі дсаайсодді Шоадсад9дао саааїссідс юдасдддса 120 сдассісада ісасіддадс І 141 «2105 7 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(12) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівс їєайшге «222» (12)...(12) 60 «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція
«4005 7
ІшШНШше адасаааааа адаадаадаа сдадаюааод істдсаайнс дашоодса 60 ддоасаааїсс Іпсіддасда асасдассіс аддісдсідд аасідсадід дсідсддасда 120 садаїсоададс юддодадсса ода 143 -2105» 8 «2115 144 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (12)...(1 7) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(1 7) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 8 аддсддссад даїддссаас дсссасіссі іІсаїсаїсаа асіссссдас додсіасдаса 60 сдсаддіссд (ппппппссс діаїадсіад сісасіадсі дсасідссас Нсісісдсі 120
Тдсіссссса ссойосідс сіді 144 «2105 9 «2115 136 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (66)...(67) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220»
Зо «221» тівс Теайшге «222» (66)...(67) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 9 саасодсссас Іссісаїса Ісааасіссс сдасддсіас дасасдсада іссдісссоді 60 агадсппіад сісасіадсі дсасідссас Псісісдсі дсіссссса ссоносідс 120 сіднасісі ссааїс 136 «210510 «2115 136 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (64)...(65) «223» п-А, Т, С, С або делеція «220» «221» тівзс їєаште «222» (64)...(65) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 10 дсссасіссі ісаїсаїсаа асіссссдас додсіасдаса сдсададіссяо ісссдіаїад 60 сіаппдсіса сіадсідсас дссаснсі сісдсндсі сссссассаді юсідссіді 120 тдсісіссаа Іссасі 136 «2105 11 «2115 133 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» варіант «222» (62)...(62) 60 «223» п-А, Т, С, С або делеція
«221» тівзс їєаште «222» (62)...(62) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 11 сіссіїсаїс аїсааасісс ссдасддсіа сдасасдсад діссадісссо їаїадсіадс 60
Іпасіадсід сасідссасі ісісісдсії дсісссссас сайдсідсс дносісіс 120 сааїссасії діє 133 «210512 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Тїєаште «222» (10)...(70) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 12 сасасдсаса сасасадаїс дссідасаад ссадссайцо сіїсадаїса аадааасідс 60 діааїаацп сесії Цошсй сіссадад сасаадддад вддаонаїта 120 аддсіадіа ссщтасідас ї 141 «210513 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 13
Зо адссадссаї Ідснсадаї сааадааас! дсаїааїааї іссшеш сессії 60 пешссад апсасааддао аддадоадна їааддсіад їассідасід асідіасдаяд 120 ссдадайаа сддсадісас сіс 143 «210» 14 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 14 аїсдсссідс ддссащшо дсассассіа дісаїасаїд днсадіса Шссдісса 60
Насіасіас дпссдідсіс асссдідссду асдсоссдід саїіддісссс дісссддсід 120 даасосдісс Ісадаадада дад 143 «210515 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Теайшге «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 15 ссацасіас їасдассодід сісасссдід ссдасдсдсс дідсайдіс сссдїссс99 60 сіддаасодсд іІпсісддаад адададаїад адсасадсад асадоададас ададаюдаа 120 ддадаосодйї сдсссддіас адад 143 «210516 «2115 143 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 16 санасіасі асдассдідс Ісасссдідс сдасдсодссоу юсаїдаісс ссдісссддс 60 дааасдсоді спісддаада дададаїада дсасадсада садддадаса дддаддаааяд 120 чашдадсойс дсссддіаса даї 143 «210517 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 17 ацасіасіа сдассдідсі сасссощюсс дасдсодссоді дсаддіссс сдісссддсі 60 ддааасдсдісє спсддаадад ададаіадад сасадсадас адддадасад ддаддаадд 120 адодсонсд сссддїасаяд дії 143 «2105 18 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 18
Зо Насіасіас дассдідсіс асссдідссу асдсдссдід садісссс дісссоадесід 60 даасдсдісс Іпаддаадада дадаїададс асадсадаса дддадасад9 даюдаадда 120 тдасайсдс ссддіасадду На 143 «2105 19 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 19
Насіасіас дассдідсіс асссаїдсса асдсдссоюд садаїсссс дісссддсід 60 даасдсдісс Іпддаадада дадаїададс асадсадаса дддадасада даюдаадда 120 тдасайсдс ссддіасадду На 143 «2105» 20 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Теайшге «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 20 сіастасдас сдідсісасс сдідссдасд сдссоїдсаї даїссссдіс ссдасюдаа 60 сосдіссісу дпадададаяд аїададсаса дсадасадду адасадддаї адааддаща 120 сонсодсссо діасадойца ста 143 «2105» 21 «2115 143 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«221» тівс Тїєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 21 тТастасдасс аїдсісассс дідссдасдс дссоюдсаїюд діссссадїсс сддсіддаас 60 дсдіссісда апдададада іададсасад садасаддда дчасадддаю дааддаюддс 120 днсдсссда їасадонос їад 143 «2105» 22 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(15) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 22 асіасдассд ідсісасссд Ідссдасодсу ссдідсаїдо іссссдіссс дасіддаасо 60 сдіссісдда аппппдадад адаїададса садсадасад ддадасадодо аддааддаї 120 досонсдсс содіасададі дсіаяд 146 «2105 23 «2115 25 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (1)...(25) «223» праймер «4005» 23
Зо даюдаацдісї дсаайсоді Шоа 25 «210» 24 «211518 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс їєаштгте «222» (1)...(18) «223» праймер «400» 24 дсісассадс ссдаїсід 18 «2105 25 «211515 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (1)...(15) «223» ЗОНД «4005 25 ссдіссадаа ддай 15 «2105» 26 «2115 14 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєайште «222» (1)...(14) «223» ЗОНД «400» 26 бо сдіссадсазд даїй 14
«2105 27 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 27 пдссіадса саїдссідсс айдассдас юсісадіда дзаадчіюданс аонаїдсід 60 пдасадіаї азагадагаї азагадіадс ссідїіадай ШШсад асааааааазд 120 аадаадаасяа адагдаацдіє щдс 143 «2105» 28 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 28 сіадсасаїд ссідссайцо ассдасідсі садщдадаазд даїйсадії дссідіда 60 садіаїадаї! аїаааа!ї адіадсссід їадацні Шсадасаа ааааадаада 120 адаасдадаї даадісєюдса аїї 143 «2105» 29 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 29 асадссідс сайдассда сідсісадід адаадшдаїй саднодюдсі дидасацдіа 60 тадаїадата Шіагадіад сссідіадаї ШИШсСа дасааааааа даадаадаас 120 дадаїдааді сідсаайса дії 143 -2105» 30 «2115 142 «2125» ДНК «213» 7/ва таув5 «400» 30
Зо садссідсс айдассдас ідсісадіда даадідане адноїдсід Ндасадіаї 60 адаїадазаї адіадсссід їадайції Шсадасаа ааааадаада адаасдадаї 120 даадісідса айсоддни до 142 -2105 31 «2115 140 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 31 дсдідаса діагадаїад аїагааад їадсссідіа дани Ісадасаааа 60 ааадаадаас дадаюдаавії сідсаансу дішодсад досаааїссії асюдасод9да 120 сасдассіса даїсасюдда 140 «2105 32 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 32
Щщасадіаїа даїадаїага їіаіадіадсс сіцдїадаш ШШсада сааааааада 60 адаадаасодяа даїдаацдісі дсаайсодді Шоадсад9дао саааїссідс юдасдддса 120 сдассісада ісасіддадс І 141 -2105» 33 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 33 щасадіаїа даїадаїага їіаіадіадсс сіцдїадаш ШШсада сааааааада 60 адаадаасодяа даїдаацдісії дсаайсоді шддсадодао саааїссідс юдасодддса 120 сдассісада ісасіддадс І 141 «2105» 34 «2115 144 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«400» 34 аддсддссад даїддссаас дсссасіссі іІсаїсаїсаа асіссссдас дасіасдаса 60 содсадаїсса ідіссдіссс діаїадсіад сісасіадсі дсасідссас Псісісдсі 120
Тдсіссссса ссойосідс сіді 144 «2105 35 «2115 136 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 35 саасодсссас Іссісаїса Ісааасіссс сдасддсіас дасасдсада іссдісссоді 60 агадсоддіад сісасіадсі дсасідссас Псісісдсі дсіссссса ссоносідс 120 сіднасісі ссааїс 136 -2105» 36 «2115 136 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 36 дсссасіссі ісаїсаїсаа асіссссдас додсіасдаса сдсададіссяо ісссдіаїад 60 сіагадсіса сіадсідсас Ідссаснсі сісдсндсі сссссассаді юсідссіді 120 тдсісіссаа Іссасі 136 -2105 37 «2115 133 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 37 сіссіїсаїс аїсааасісс ссдасддсіа сдасасдсад діссадісссо їаїадсіадс 60 їаасіадсід сасідссасі ісісісдсії дсісссссас сайдсідсс дносісіс 120 сааїссасії діє 133 -2105» 38
Зо «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 38 сасасдсаса сасасадаїс дссідасаад ссадссацно сісадаїса аадааасідс 60 діааїааші сшсшсї пошсій сшіссадад сасаадддад ддааойнаїа 120 аддсіадіа ссщтасідас ї 141 2105» 39 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 39 адссадссаї Ідснсадаї сааадааас! дсаїааїааї іссшеш сессії 60 пешссад аїсасааддд ададоадона їааїдосіад їассюдасід асідтасдаяд 120 ссдадайаа сддсадісас сіс 143 «2105» 40 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 40 аїсдсссідс ддссашо дсассассіа дісаїасаїд днсадіса Шесаїсса 60
Насіасіас ддссдідсіс асссдідссду асдсоассоїд садаїсссс дісссдасіяд 120 даасосдісс Ісадаадада дад 143 «2105» 41 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 41 ссацасіас їасдассодід сісасссдід ссдасдсдсс дідсайдіс сссдїссс99 60 сіддаасодсо Ідсісддаад адададаїад адсасадсад асадоададас ададаюдаа 120 бо дадашодсодії сдсссддіас адао 143
«2105» 42 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 42 санасіасі асдассдідс Ісасссдідс сдасдсодссоу юсаїдаісс ссдісссддс 60 дааасодсодї саїсддаада дададаїада дсасадсада садддадаса ддааддоаааяд 120 чашдадсойс дсссддіаса даї 143 «2105 43 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 43 ацасіасіа сдассдідсі сасссощюсс дасдсодссоді дсаддіссс сдісссддсі 60 ддааасдсдіс сссддаадад ададаіадад сасадсадас адддадасад ддаюдаавчад 120 адодсонсд сссддїасаяд дії 143 «210» 44 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва таув5 «400» 44
Насіасіас дассдідсіс асссдідссу асдсдссдід садісссс дісссоадесід 60 даасдсдісс юддаадада дадаіададс асадсадаса дддадасада даюдаадда 120 тдасайсдс ссддіасадду На 143 «2105» 45 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 45
Зо Тастасіаса ассдідсіса сссдідссда сдсдссдїідс адіссссяа ісссдасіда 60 аасосдіссії ссдаададад адаїададса садсадасад ддадасаддао аодаададаї 120 досоунсдсс сдаїасадаі дес 143 «2105» 46 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 46 сіастасдас сдідсісасс сдідссдасд сдссоїдсаї даїссссдіс ссддсіддаа 60 сосдіссісд діадададад аїададсаса дсадасадду адасадддаї ддааддага 120 сонсодсссо діасадойца ста 143 «2105 47 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 47 тТастасдасс аїдсісассс дідссдасдс дссоюдсаїюд діссссадїсс сддсіддаас 60 дсдіссісда асдададада іададсасад садасаддда дасаддадац даададаадас 120 днсдсссда їасадонос їад 143 «2105» 48 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 48 асіасдассд ідсісасссд Ідссдасодсу ссдідсаїдо іссссдіссс дасіддаасо 60 сдіссісдда асісддадад адаіададса садсадасад ддадасадчад аїдааддаї 120 досонсдсс содіасададі дсіаяд 146 «2105» 49 «2115 143 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«400» 49 пдссіадса саїдссідсс айдассдас юсісадіда дзаадчіюданс аонаїдсід 60 пдасадіаї адаїадагаї агагадіадс ссідтадай ШНсад асааааааад 120 аадаадаасяа адагдааціс дс 143 2105 50 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 50 сіадсасаїд ссідссайцо ассдасідсі садщдадаазд даїйсадії дссідіда 60 садіаїадаї адаїаїааї адіадсссід їадашнй Шсадасаа ааааадаада 120 адаасдадаї даадісєюдса аїї 143 -2105 51 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 51 асадссідс сайдассда сідсісадід адаадшдаїй саднодюдсі дидасацдіа 60 тадаїадата іаіагадіад сссідіадаї ШИШсСа дасааааааа даадаадаас 120 дадаїдааді сідсаайса дії 143 «2105 52 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 52 садссідсс айдассдас ідсісадіда даадідане адноїдсід Ндасадіаї 60 адаїадацаї аїагадіадс ссюіадай ШШсСад асааааааад аадаадаасо 120 ададаацдіс юсаайсда ща 146 -2105 53
Зо «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «-4005 53 дсдндаса діагадаїад аїаааад їадсссідіа чаш Ісадасаааа 60
З5 ааадаадаад аасдадайїда адісідсааї Ісдаїшо99 сададсаааї ссідсіддас 120 ддоасасдасс ісаддісодсі дда 143 «2105» 54 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 54
Щщасадіаїа даїадаїага їіаіадіадсс сіцдїадаш ШШсада сааааааада 60 адаадаасда даїдаацдісі дсаайсодді Шоадсад9дао саааїссідс юдасдддса 120 сдассісада ісасіддадс І 141 2105 55 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 55
ІшШНШше адасаааааа адаадаадаа сдадаюааод істдсаайнс дашоодса 60 ддоасаааїсс Ідсіддасда асасдассіс аддісасща адсідсдаю осідсдоасод9 120 садаїсоададс юддодадсса ода 143 -2105 56 «2115 138 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 56 аддсддссад даїддссаас дсссасіссі іІсаїсаїсаа асіссссдас дасіасдаса 60 содсадаіссяо ісссдіаїад сіадсісасі адсідсасід ссасіїсісї сдсндсісс 120 бо сссассойна сідссіді 138
«2105 57 «2115 134 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 57 саасодсссас Іссісаїса Ісааасіссс сдасддсіас дасасдсада іссдісссоді 60 агадсіадсі сасіадсідс асідссасії сісісоасно сісссссасс ойосідссі 120 оносісісс ааїс 134 -2105 58 «2115 134 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз -4005 58 дсссасіссі ісаїсаїсаа асіссссдас додсіасдаса сдсададіссяо ісссдіаїад 60 сіадсісасі адсідсасід ссасіїсісї сдсідсісс сссассона сідссідна 120 сісіссааїс сасі 134 2105 59 «2115 133 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 59 сіссіїсаїс аїсааасісс ссдасоддсіа сдасасдсад діссадісссо їаїадсіадс 60 їсастадсід сасідссасі ісісісдсії дсісссссас сойосідсс їднасісіс 120 сааїссасії діє 133 -2105» 60 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 60
Зо сасасдсаса сасасадаїс дссідасаад ссадссайцо сіїсадаїса аадааасідс 60 діааїааце сшешсї нсшсц сшссадад сасаададад ддааойнаїа 120 аддсіадіа ссщтасідас ї 141 -2105 61 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 61 адссадссаї Ідснсадаї сааадааас! дсаїааїааї іссшеш сессії 60 псешссад адсасааддо ададоддона їіааїддсіад їассюасід асідїасдаяд 120 ссдадайаа сддсадісас сіс 143 «2105 62 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 62 аїсдсссідс ддссашо дсассассіа дісаїасаїд днсадіса Шесаїсса 60
Насіасіас дассдідсіс асссдідссду асадсоссдід саїддісссс дісссддею 120 даасосдісс Ісадаадада дад 143 -2105» 63 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 63 ссацасіас їасдассодід сісасссдід ссдасдсдсс дідсайдіс сссдїссс99 60 сіддаасодсод іІссісддаад адададаїад адсасадсад асадддадас адддаддаа 120 ддадаосодйї сдсссддіас ада 143 «2105» 64 «2115 143 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«400» 64 санасіасі асдассдідс Ісасссдідс сдасдсодссоу юсаїдаісс ссдісссддс 60 дааасодсоді ссісддаада дададагада дсасадсада садддадаса дададодаазд 120 чашдадсойс дсссддіаса даї 143 -2105 65 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 65 ацасіасіа сдассдідсі сасссощюсс дасдсодссоді дсаддіссс сдісссддсі 60 дааасдсдіс сісддаадад ададаіадад сасадсадас адддадасад ддаюддаадад 120 адодсонсд сссддїасаяд дії 143 -2105» 66 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 66
Насіасіас дассдідсіс асссаїдссду асдсдссдід сагдісссс дісссоадесід 60 даасдсдісс Ісддаадада дадаїададс асадсадаса дддадасаду даюдаадда 120 тдасайсдс ссддіасадду На 143 «2105 67 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 67
Тасіасіаса ассдідсіса сссдідссда сдсдссдідс адіссссод Ісссддсеюа 60 аасосдіссї сддаададад адаїададса садсадасад ддадасадаяд аїддааддаї 120 досоунсдсс сдаїасадаі дес 143 -2105» 68
Зо «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 68 сіастасдас сдідсісасс сдідссдасд сдссоїдсаї даїссссдіс ссдасюдаа 60
З5 сосдіссісу даадададад аїададсаса дсадасадду адасадддаї адааддаща 120 сонсодсссо діасадойца ста 143 -2105» 69 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 69 тТастасдасс аїдсісассс дідссдасдс дссоюдсаїюд діссссадїсс сддсіддаас 60 дсдіссісда аадададада іададсасад садасаддда дасадддаїд даададаададс 120 днсдсссда їасадонос їад 143 -2105 70 «2115 142 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 70 асіасдассд ідсісасссд Ідссдасодсу ссдідсаїдо іссссдіссс дасіддаасо 60 сдіссісдда ададададаї ададсасадс адасадддад асадддаща ааддацдсад 120 псосссдої асадоносі ад 142 -2105 71 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) 60 «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція
«4005 71 саддаддсдс ддассдсії саюаїс9до сдсассассс Іддідаїсодс дсасадосід 60
Іссассаїсс дпааддссда сдіддідсс аідсщдсадад дсдасассої сіссдадацд 120 ддсдсасаса асдадсідаї ддс 143 «2105 72 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 72 іссаїсдасі ссадаїсід сддсіссне адсдссаїсі іІсдсосіасаї ссісадсдсс 60 дюсісадсо іпіасіасдс дссддасссяа сдаїасащда адсосдадаї содсаааайас 120 дсіассідс ісаїсоддсаї діє 143 -2105 73 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 73 дссіасаїсс їІсадсоссаї дсісадсдіс їасіасасоас сддасссосяа діасаюааяд 60 сдсдадаїсд спаааїасід сіассідсіс аїсддсащі ссіссдсддс асідсідне 120 аасасддідс адсасадіції сід 143 «210» 74
Зо «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Тїєаштгте «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 74 сідднсдас дсддасдада асоассадсоас асасаїддсс дссаддсіад сасюдасодс 60 ссадаасоїд спсіссдсса ісддддассау саїсіссдіс аісдіссада асісддсодсі 120 чаюсідо дссідсассо сда 143 «-2105 75 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 75 садаасдідс дсіссдссаї сддддассос аїсіссдіса іІсдіссадаа сісддсосід 60 адсідаа спідсассодс дддонсдіс сіссадіддс дссісдсосі соїосіссіс 120 дссдїднес сасісдісаї 999 143 «-2105 76 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 76 саддаддсдс ддассдсії саюаїс9до сдсассассс Іддідаїсодс дсасадосід 60
Іссассаїсс даааддссда сдіддіддсс аідсідсаду дсдасассої сіссдадацд 120 бо ддсдсасасд асдадсідаї ддс 143
-2105 77 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 77 іссаїсдасі ссадаїсід сддсіссійс адсодссаїсі Ісдосіасаї ссісадсосс 60 дюсісадсо ідіасіасдс дссддассся сдаїасащда адсосдадаї содсаааайас 120 дсіассідс ісаїсоддсаї діє 143 -2105 78 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 78 дссіасаїсс їІсадсоссаї дсісадсдіс їасіасасоас сддасссосяа діасаюааяд 60 сдсдадаїсд ссаааїасід сіассідсіс аїсоддсаїйді ссіссдсддс дсідсюне 120 аасасддідс адсасадіції сід 143 «2105 79 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 79 сідднсдас дсддасдада асоассадсоас асасаїддсс дссаддсіад сасюдасодс 60 ссадаасаїд сісіссдсса ісддддассу саїсіссдіс аїсдїіссада асісддсодсі 120 чаюсідо дссідсассо сда 143 -2105» 80 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 80
Зо садаасдідс дсіссдссаї сддддассодс аїсіссдіса Ісдіссадаа сісддсосід 60 адсідаща саїдсассос дддонсдіс сіссадіддс дссісососі содідсіссіс 120 дссдїднес сасісдісаї 999 143 -210» 81 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 81 саддаддсдс ддассдсії саюаїсо9до сдсассассс Іддідаїсодс дсасадосід 60
Іссассаїсс дсаадассда сдіддодсс аідсдсада дсдасассадії сіссдадацд 120 ддсдсасаса асдадсідаї ддс 143 -2105 82 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 82 іссаїсдасі ссадаїсід сддсіссійс адсодссаїсі Ісдосіасаї ссісадсосс 60 дюсісадсо ісіасіасдс дссддасссд сддіасаїда адсодсдадаї сдсаааатас 120 дсіассідс ісаїсоддсаї діє 143 -2105» 83 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 83 дссіасаїсс їІсадсоссаї дсісадсдіс їасіасасоас сддасссосяа діасаюааяд 60 сдсдадаїсд сааааїасід сіассідсіс аїсддсащі ссіссдсддс асідсідне 120 аасасддідс адсасадіції сід 143 «210» 84 «2115 143 «2125» ДНК 60 «213» 7/ва тауз
«400» 84 сідднсдас дсддасдада асоассадсоас асасаїддсс дссаддсіад сасюдасодс 60 ссадаасаоїд содсіссдсса ісддддассау саїсіссдіс аісдіссада асісддсодсі 120 чашюсідо дссідсассо сод9 143 -2105» 85 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «4005» 85 садаасдідс дсіссдссаї сддддассос аїсіссдіса іІсдіссадаа сісддсосід 60 адсідаща ссідсассоас дадайсодіс сіссадідас одссісдсасі саїосіссіс 120 дссдїднес сасісдісаї 999 143 -2105» 86 «2115 143 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (12)...(1 7) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 86 пдссіадса саїдссідсс айдассдас юсісадіда дзаадчіюданс аонаїдсід 60 пдасадіаї аппппппіаї агагадіадс ссідіадай ШИнНсад асааааааачд 120 аадаадааса адагдаацдіє щдс 143 -2105» 87 «2115 148 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220»
Зо «221» тівс Теайшге «222» (16)...(177) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 87 садссідсс айдассдас ідсісадіда даадідане адноїдсід Ндасадіаї 60 адаїадацаї аїаїаппдіа дсссщіада НШШІс адасаааааа адаадаадаа 120 сдадащдаад ісідсаанс даннод 148 -2105» 88 «2115 142 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (66)...(69) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 88 саасодсссас Іссісаїса Ісааасіссс сдасдасіас дасасдсадад іссдісссадї 60 агадсппппії адсісасіад сідсасідсс аснсісісу сндсісссс сассоносі 120 дссіднасі сіссааїсса сі 142 -2105» 89 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(76) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 89 шШеїададі нНааадсна іспадаага ааідсаїсії їадсіасдад асаассіаас 60 псадунай ппппппді шасі сісіснсіс асааагасіа щайасодіс 120 бо Шасадсда істщша іссааа 146
2105» 90 «2115 146 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(1 7) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 90 шШеїададі нНааадсна іспадаага ааідсаїсії їадсіасдад асаассіаас 60 псаднай дноний нщШасні сісіснсїс асаааїасіа данасадіс 120
Шасадсда істщша! Іссааа 146 -2105» 91 -2115105 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (60)...(61) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 91 айссааасс іаааааса ідсасісасі сіаааадсдс ааадддадса іспищши 6О0 псссссаїса іІсідсасдса дссішсії Носісащі сасда 105 «2105» 92 «2115 181 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште
Зо «222» (63)...(111) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 92
Ісдаїосіда сісіддідса дсоадисіас дадсссасодї ссдддсасої асіссіддас 60 ддплппппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп псааддасаої 120
З5 дсдсаадіас аассідс9доа сдсідсдаса сдідааосо додаїассдс аддадссвдії 180 с 181 -2105» 93 -2115 185 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (51)...0135) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 93 адаасасдда сісасасісс саїаасіаїйа асюаснода іІсаїдансс пппппппппп 6бО ппппплпппп ппплиппппп пппипппппп пппппппплп пппппппппп пппппппппп 120 ппппплппппп пппппайії айаасааїйї сааншаї папйаана сдісюдасо 180 аддазд 185 «210» 94 «2115 140 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Теайшге «222» (52)...(69) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 94 ссассдісад ддааїаадас Нанації анаасааїйї саанщшаї (ппппппппп 60 бо пппппппппі айаайасо ісіддасдад дадіасідаї Пашдаю ададасаща 120 садіссаадії сааасісой 140 -2105» 95 «2115 711 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (66)...(644) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 95 асщаадаоід щіадсадс дісаацдісаї ссаїссоуйе сасіссасіс асісаїдсадї 60 сдсдсппппп пппппппппп ппплпплппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 120 ппппплпппп ппплиппппп пплпипппппп пппппппплп пппппппппп пппппппппп 180 ппппплпппп ппплиппппп пплипппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 240 ппппплпппп ппплиппппп ппилипппппп ппппппппли пппппппппп плппппппппп 300 ппппплпппп ппплиппппп пппипппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 36о ппппплпппп ппплиппппп пплипппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 420 ппппплпппп ппплиппппп пплипппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 480 ппппплпппп ппплиппппп ппилипппппп пппиппппппп плппппппппп пиппппппппп 540 ппппплпппп ппплиппппп ппипипппппп пппппппппп пппппппппп пппппппппп 600 ппппплпппп ппплипппппп пппппппппп пипппппппп ппппасісід сасісдідсс 660
Ідсссдддас їааадсша діадсіадсс ісадаїсада їасіднседі а 711 -2105» 96 «2115 114 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (68)...(80) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 96 дсасісадда сісдсадсда дадааші Нааїсаадс сіаааайса сшсодаса 60 ааїсдааппп пппппппппп сіасісаїаа азайаасса дадассщш ісдс 114 2105» 97 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(71) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 97
Надсосаї! ааісідадада ідіссадне дсндснос сааїсдссаї Ідссаїсдса 60 асаасааїас пісдссаасі дссанодсід ддїадасіад їасадіадса опадаадаа 120 дссіссасід їасайосаї ї 141 -2105» 98 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (13)...(7 3) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 98
Надсосаї! ааісідадада ідіссаднсе дснпдснос сааїісдссаї їдссаїсодса 60 асаасааїгас Цподссаасі дссайосід даїадасіад їасадіадса дпадаадаа 120 дссіссасід їасайосаї ї 141 2105» 99 «2115 144 бо «2125» ДНК
«213» 7/ва тауз «221» тівзс їєаште «222» (12)...(1 3) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 99 ссаїссісії ІснпусНи сищшасії Істдаїсо ддасідщша дісаїаса 60
Тасансасд сппададсад аададсіадс їаадсіададї дадідідссії дсаасоасада 120 асааадаааа сіашона ссід 144 «2105100 «2115 138 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (10)...(70) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 100 1дідісідіс сассссадсі сідсіасіс їаснасіас осіасіа дідаїадаоді 60 аддіаїснп сагааасіді їанагааас щісаїсіда дааадададс садісааасс 120 садсідсід спацші 138 «2105 101 «2115 142 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (10)...(70) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція
Зо «4005 101
Існасаїаа асіднана їааасідіса іІсідадааад ададссадіс ааасссаїдс 60 тдсідснап ІШааїсас щісааа!дд садасаддса додсацдісщо Наднаайа 120 асаїсіддда аддошааї са 142 «2105102 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (10)...(70) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 102 ддсаддсадо саддсацдісї дднаднаа іаасаїсідд даадддша аїсааассаа 60 аїсаааїсап асдаааїсіа даддссасаї дададддас саїащдіасі діасіадсаї 120 аасіадсддс тадаїщшай і 141 -2105103 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(71) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 103 сааассаааї саааїісадас дааа!сіада ддссасаїда даддодсса їашіасіодї 60 асіадсаїаа піадсддсіа даїшайца даасасддас іІсасасіссс аїіаасіаїаа 120 сідасноаї саданссі ї 141 «2105» 104 «2115 143 бо «2125» ДНК
«213» 7/ва тауз «221» тівзс їєаште «222» (12)...(12) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 104 тасщіасіа дсаїаасіад сдасіадай Напйадаас асддасісас асісссаїаа 60 сіаїаасіда спідаїсаї дайссцос саадсаащс іІсдсадссс адсаїдсаї 120 саїсссідді сааасісааа сас 143 2105105 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівс Тїєаште «222» (11)...(71) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005» 105 саїсаїсссі даїсааасіс ааасасісіс сассдісаду дааіаадасі айаїша 60
Наасаайс паншаїй їіайаанас дісюдасда ддадіасюд шашоаї 120 дададасаїд дсадіссаад 1 141 -2105 106 «2115 141 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(71) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція
Зо «4005 106 аасасісісс ассдісадду ааїаадасії анаїшаї іаасаайса айшаш 6о ацйаанасду псюдасдад дадчіасідадї нашодаїйд ададасаїдо садіссааді 120 сааасісдії дісідасса 1 141 «2105 107 «2115 139 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (11)...(71) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «4005 107 дддааїаада спайцай тапаасааї ісаанша Шайаай асдісіддас 60 даддадіасі пашащшо адададаса іддсадісса адісааасіс ашнаїстюа 120 ссаддасдаї дадассда 139 -2105 108 «2115 134 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220» «221» тівзс їєаште «222» (68)...(68) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 108 шащшодаї дададасаїд дсадіссаад іІсааасісді наїсщасс аїддсдаюа 60 дассдапід садандада адсодсдодссі дсадсісісс дддадсада адсадсосаї 120 сдссаїсдсс сдсу 134 2105109 «2115 141 бо «2125» ДНК
«213» 7/ва тауз «221» тівзс їєаште «222» (65)...(174) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «400» 109 дісдіасаю іднсадіса Шссдісса Насіасіас дассдідсіс асссдідссо 60 асдспппппп ппппдссодід саїдаїсссс дісссдасід даасодсдісс Ісддаадада 120 дадаїададс асадсадаса 9 141 «2105 110 «2115 579 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 110 саддсссдіа іаїддсссад дсаасщад ссдасддаас саддссасса аїагсадіад 60 дссіссааїйї аїдаансіс саїаіїасасу юдіссащі асідаїсс аддайаасі 120 дассіссаа ашддсаї їасдандда ансіадасі пДшейне сНссодаді 180
Іссдсосааїс Ісдсіадсід ааасдасосс даїсідддад дсодссдсса ссасааасдс 240
Іссаїсдсса дісаїсасос саїсдаюдсс дадсіасіаї дддоссдіда ісісоссдії 300 дссдасоасії щассшодс сдсассіада сойосаадо іІсдасдсаас аадссааїсд 360 адасідсад9 їащдідаїса ддааасасіс сайдіни песщшасі їдсааанос 420 ааїсдатадд сааащдайц аснаїаааа стіааадаша юпнаднаа сіссааїс 480
Таааіасаїа донНаацняо сааганаїйа іааазаадд ссіссасійї дідішоса 540 ссаддссааа аїааасісад діасдоддссі дсдісдсдс 579 «2105 111 «2115 4187 «2125» ДНК «213» 7/ва тауз «220»
Зо «221» тівс Теайшге «222» (2308)...(2310) «223» п дорівнює а, с, 9, Її, делеція або інсерція «220» «221» тівзс їєаште «222» (2308)...(2310) «223» Інсерція додаткової послідовності невизначеного розміру «4005 111 щааадсодда сіасдонас їассойссод сідщассоа аісісносо їагасіссса 60 сдасісдсас їасіссдіаї (діасдсасс асіссаасда саїадідідс дсассасіса 120 аддасссаді ссісісддю сссадіїсаї діаасіаа їаїдсасіаї даднаїсаа 180 тТасадаїаді їаднсаїсяа іїайсацйсі асадіаїс адсснсене діссіасад 240 сааїссію|о ісісассійс сасаїсаа!д дсісасіссс сасіссссіс сдаїдасісс 300 їстдаюасао адсісдісді Іссадсассс дсносоупна іссааадсаї Ісссаїссдс 360 садсасоайсе сідісдіссї сдасаддаї даддддаасі аїдддсааю одсдаїдсне 420 шоааїсід сосісддааа айсддссіс ассадссаїд нНсунейце сассссаїас 480 сощдассдіс сюдіщдасід дсдсадаїа дайссідіа Ндссаасід даїссісасе 540 асадісісса аддодсадісії сдасаїсаїс сдісдсдасс дсааїдасас сисісісід 600 дасасосса іІсдаадассі дЯшсаадас аасдаасне адсаїдсідї діассноаа 660 дссдадсідс дісссідса дсааддсдас Подісдащюа аїдссіасід сассаадна 720 аадсдісісуд ссдаїсаасі Ісдсдасаїс ддссаїссся ісіссдаасс садісадаї 780 сісаасснс Нсдсдодсі сааіссааад іассосіасяо іІсаадсссді даїсассісс 840 ааднсссад сдсасассії саїдадсодсі сдаїссцсс іІсаїдснда ддаддссадс 900 аїсдаасасад ащшісоссді Ідаддссасс сасдсасіда сідісасаса даїдасісд 960 їссадіосід Несіссаїс дсаїснсї ддсассадда асаасіссіс сіссіссаас 1020 асдссасдсс ддасааїсд сисаасосі ддіадсассі сссайсіас сааїсодаїсі 1080 даїсасаддс дсддісдсдо саасоддсодаді судчдасосі Ісаасаасса дісіддасса 1140 ддасадсад дісісааісс адддсааддс адачнсада саддсаааї дссшссадї 1200 дсасссддад саддсойнсі дддассасодс ссдссунсс аассісадса адссаддса 1260 дссіаїсаїс адссассісс Ідсаїсідсс ддсассіїсд асаасадсдс ісшадсао 1320 бо дсасідсадо сідссдсаді Іссаасісаї ссдсссааса снсдасід діаснсдас 1380 ассддідсодї сдісдсасаї дісдіснсс ссідаїаасі Носасссіс Пеоссісіс 1440 сссішсді сносаїаас адідддіааї ддідсссадс тассюйнас асаїсаїдса 1500 сасасаїсса Неосіасідс сасісіссі сисадйнас ашдайцдісі їашссссд 1560 їсасісонпа аааашоді йсіднсдс сдісНасіс дідаїааїаа ющшсессай 1620 даацшодасс споїддні Псіаїсаад даїснссії ссааадсода дайсіссда 1680 дщдададса адосоаїсі сіаїссасіс сдісцсссс ассадсас ісісасідсі 1740
Іссісдаща сдісдсіаїд дсаїсадсда сідддісаїс сіддасаасс адісассісс 1800 саїаіншаа ааїсссідіс Шсааїйці аагааадсід адсісайс сідсіссісі 1860
Ідісдайцоо одсааасаїас їадацассі Шсдіціїї сідааісасо Нсацшн 1920 ссішсаас їадісанс адасдісіда асаїсіссії онаїаона Нсосддаїаї 1980 аааїацаю йайшсі ддадайаї асасацнаїс Шоддадсаї сссссіссдс 2040 аасааа!сід асацншсс їасіднада осайсаїаї слашднса їасісаайс 2100 сассісссіа Пепдсдії їісадасюаї аасоадід999 аагадацйс їасідсіад 2160 содсснене щісаїсісі ддсасссаа сіасдісні сндіссаїа сасаїсссад 2220 сааааіддда аадсщадад ааїаснсос асідісааід апдссідсяо їасасіасіа 2280 аїссагадід садсіссісї сдсаснппп асодссаїсаї сдоссассаа ісасссдасі 2340 саїссааща ідасісдідс асдсдсаддо аїсіссаадс сіаасссдаа діасдссіс 2400 дюассасод адасааїаїс дссдайссії сдсадсонс дсассдсіді сааадаїссс 2460 санддіа сідсаадаа діссдаац даїдсасідс аадссаасса саснодасі 2520 сцдісісіс доссіссада ідсісддаїс аїсассддса ааддадісії саадсасаад 2580 адааїссад асддсасссі сдсосдаїас ааддсасодй дддісдісєсд дадісаас 2640 садсоддсссду ддіщаш сдадаадасо Нсісдссдо аїсаадсс ддссасдай 2700 сдіассудс дасодсіі дусіасісас аасюдссад сісассаасі дасцвісісс 2760 аасоасцшесс іІссасддсаа ссінсаадаа саддщіаса дісадсаасс сасідддні 2820 дндаїссса дссодсссада ідасдісідс сідсісісса оддісосіста ддісіссадї 2880 саддсассас дадсаїддії ссадсуше дісдадсасу асаїсссі сддснсай 2940 сааісдаадд ссдайсаїс дсіснсаїу їаїсассасс аїддсдадас адснати з000 сісісіасу Ісдасдасаї даїсстсї дссісдасас дісаїсіддї ссадсаїдіє 3060 аїсдсдсдіс їіасасдащс снсасідід ааддаащо доссіднса ссайнсїс 3120
Зо додсаїсоадсо йсдасоддаа ссдсассддс Пейссісі сісааддаса діаїдсідаа 3180 даїсіссісу адсдідсаду ааїдасдаас дсааассід Кодссасссс Ідссдасасс 3240 саасадаадод саїссдеюдад сдаюддсагїа сідсісдаса асодссасійс аїассдіаді 3300 аїсдісддсд сссідсадіа сндасдаїс асссдіссд9 асанодссіа сассоідсад 3360 саддідідіс іссасадса сдсдссдс9да дасдїдсаїс ісассаїдсі саадсдіай 3420 сіссддіаса Ісааддодсас саїссасіс додсаїссадс їдсдсасідс сісдссіїсд 3480 асдаїсасід саїасіссда сдссдасідуд дсаддсідсс ссдасасасод осасісіаса 3540
Ісддашсі дсаїснеоїї сддсаасісс сісдісісаї ддісдісіаа асдасадасс 3600 ассадісісіс ддіссадсдс адаадсідад іаісддосса ісдссаасдс саїсдссдаа 3660 тдсіссіддс йсдссассі ссшсідад сідсшаса додаїссссіс адсаасадід 3720 дсансідса асаасаїсіс Нсддідїас аїддсасодса аїсссдіса ісаїсадсодс 3780 асіаадсаїа іІсдадсідда саїссацші дідсадддааа аддісодссаї їдатдадчно 3840 саюйнасодс асайсссад Ідсдсдасаа аїсдсада!д шіїсассаа аддістассії 3900
Ісддсасці Ісаасдасії сададасадс сісіссдіса ссаасдсдас сдісдадасі 3960 дсаддадоаді дзааадсддас їасдунасі ассоайссас дідассо99да ісіснодсаї 4020 айасісссас дасісдсасі асіссдіайн діасдсасса сіссаасддс аїаашіодсао 4080 сассасісаа ддасссадіс сісісдддс ссаднсаїу іааїсіазаї аїдсасіагд 4140 аодцаїсааї асадаїадії адісаїсої айсансіа садасдад 4187 «2105112 «2115 21 «212» ДНК «213» синтетична «4005 112 саїссднНсс асіссасіса с 21 «2105 113 «2115 28 «212» ДНК «213» синтетична «4005 113 аїсідаддсі адсіасіааа дсшадс 28 (510) «2105 114
«2115» 23 «212» ДНК «213» синтетична «4005» 114 ддадодссаа діаїаїссія даї 23 «2105 115 «211516 «212» ДНК «213» синтетична «4005 115 їсадсадіса сдсасі 16 «2105 116 «211515 «212» ДНК «213» синтетична «4005 116 аддсссдіаї аддс 15 «2105117 «211518 «212» ДНК «213» 7/ва тауз «4005 117 аасаансса пшШанц 18 «2105 118 «2115 85 «212» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 118 пдссаадса аїдсісдсаї дсссадсаї осаїсаїссс Юдісааасі сааасасісі 60
Зо ссассдісад ддааїаадас Чаї 85 «2105 119 «2115 13 «212» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 119 ссіддаасад 919 13 «2105» 120 «2115 10 «212» ДНК «213» 7/ва тауз «400» 120 дссдідссда 10

Claims (13)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб селекції рослини або насіння кукурудзи, який включає: а) проведення маркерного аналізу для виявлення в популяції рослин або насіння кукурудзи рослини або насіння кукурудзи, що містить алель укороченості в поліморфному локусі, причому вказаний алель укороченості містить тимідин (Т) в позиції 72 ЗЕО ІЮ МО: 7; і р) селекцію вказаної рослини або насіння кукурудзи, що містить вказаний алель укороченості; де вказаний маркерний аналіз включає застосування зонда, що містить 5ЕО ІЮО МО: 25, або праймерів, які вибирають з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 23 та 24.
2. Спосіб за п. 1, де вказана відібрана рослина або насіння є гібридним.
3. Спосіб за п. 1 або 2, де висота вказаної відібраної рослини у стадії зрілості є зменшеною на 10-70 95 порівняно з контрольною рослиною, що не містить вказаного алеля укороченості.
4. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де врожайність вказаної вибраної рослини дорівнює або перевищує врожайність контрольної рослини, що не містить вказаного алеля укороченості.
5. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де вказана відібрана рослина вимагає для початку цвітіння на 5-25 95 одиниць тепла менше, ніж контрольна невкорочена рослина.
6. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де відібрана рослина досягає відносної зрілості на 10-45 95 днів раніше, ніж досягає відносної зрілості контрольна невкорочена рослина.
7. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де вказаний алель укороченості є прогностичним для ознаки укороченості з точністю щонайменше 50 95.
8. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, де вказана відібрана рослина кукурудзи містить два або більше алелів укороченості, які вибирають з групи, яка складається з 5БЕО ІЮО МО: 5-8, 11-22 та 86-95.
9. Спосіб створення популяції рослин кукурудзи, які містять щонайменше один алель, пов'язаний з ознакою укороченості, причому вказаний спосіб включає стадії: а) генотипування першої популяції рослин кукурудзи, причому вказана популяція містить алель укороченості в поліморфному локусі, причому вказаний алель укороченості містить тимідин (Т) в позиції 72 5ЕО ІЮ МО: 7; р) селекції із вказаної першої популяції однієї або більше рослин кукурудзи, що містять вказаний алель укороченості; і с) одержання з указаних відібраних рослин кукурудзи другої популяції, із створенням таким чином популяції рослин кукурудзи, що містять вказаний алель укороченості.
10. Спосіб за п. 9, де вказана стадія (а) включає маркерний аналіз.
11. Спосіб за п. 9 або 10, де вказана стадія (а) включає застосування одного або більше праймерів, вибраних з групи, що складається із зЕО ІЮ МО: 23 і 24.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, де вказана стадія (а) включає застосування зонда, що містить БЕО ІЮ МО: 25.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 9-12, де вказана відібрана рослина кукурудзи зі стадії (Б) містить два або більше алелів укороченості, які вибирають з групи, яка складається з 5БЕО ІЮО МО: 5-8, 11-22 та 86-95.
UAA201711563A 2015-04-28 2016-04-27 Спосіб одержання вкорочених рослин кукурудзи UA126271C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562153831P 2015-04-28 2015-04-28
US201562180430P 2015-06-16 2015-06-16
PCT/US2016/029492 WO2016176286A1 (en) 2015-04-28 2016-04-27 Methods and compositions for producing brachytic corn plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126271C2 true UA126271C2 (uk) 2022-09-14

Family

ID=57199643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201711563A UA126271C2 (uk) 2015-04-28 2016-04-27 Спосіб одержання вкорочених рослин кукурудзи

Country Status (12)

Country Link
US (3) US10472684B2 (uk)
EP (2) EP3289087B1 (uk)
CN (2) CN107849570B (uk)
BR (1) BR112017023275B1 (uk)
CA (1) CA2982495A1 (uk)
HU (1) HUE053541T2 (uk)
MX (1) MX2017013872A (uk)
PL (1) PL3289087T3 (uk)
RU (1) RU2745987C2 (uk)
UA (1) UA126271C2 (uk)
WO (1) WO2016176286A1 (uk)
ZA (1) ZA201706734B (uk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10472684B2 (en) * 2015-04-28 2019-11-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for producing brachytic corn plants
BR112019012819A2 (pt) * 2016-12-22 2019-11-26 Monsanto Technology Llc manipulação de cultura com base em edição de genoma e produção de plantas braquíticas
CA3069014A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for stature modification in plants
UA128478C2 (uk) * 2018-02-15 2024-07-24 Монсанто Текнолоджі Елелсі Вирощування кукурудзи за допомогою напівкарликових систем
CA3090007A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Improved methods for hybrid corn seed production
US20220039320A1 (en) * 2018-12-12 2022-02-10 Monsanto Technology Llc Delayed harvest of short stature corn plants
CN110092821B (zh) * 2019-05-30 2021-02-09 中国农业科学院生物技术研究所 OsABCB1蛋白及其编码基因和应用
CN110951906B (zh) * 2019-12-11 2024-07-16 中国农业科学院作物科学研究所 高代回交分子轮回选择(mrsab)育种方法i--一种显性早穗不降产材料的培育及利用方法
CN112795692B (zh) * 2021-03-24 2022-02-18 湖南农业大学 与玉米株高连锁的分子标记及其应用
CN114223534A (zh) * 2021-12-10 2022-03-25 鹤壁市农业科学院(浚县农业科学研究所) 一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法
CN114107547B (zh) * 2021-12-10 2024-02-23 广东省科学院南繁种业研究所 玉米果穗苞叶剑叶长度相关的snp标记及其应用
CN116548300B (zh) * 2023-06-26 2023-12-19 中国农业科学院生物技术研究所 一种改良玉米耐密产量的方法及其应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5217863A (en) 1988-02-04 1993-06-08 Medical Research Council Detection of mutations in nucleic acids
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5762876A (en) 1991-03-05 1998-06-09 Molecular Tool, Inc. Automatic genotype determination
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
US5616464A (en) 1994-12-27 1997-04-01 Naxcor Nucleic acid sequence detection employing amplification probes
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5547781A (en) 1994-03-02 1996-08-20 Micron Communications, Inc. Button-type battery with improved separator and gasket construction
IL124967A (en) 1995-12-18 2000-07-26 Univ Washington Method for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer
CA2255774C (en) 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6090558A (en) 1997-09-19 2000-07-18 Genetrace Systems, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
DE19824280B4 (de) 1998-05-29 2004-08-19 Bruker Daltonik Gmbh Mutationsanalyse mittels Massenspektrometrie
US6613509B1 (en) 1999-03-22 2003-09-02 Regents Of The University Of California Determination of base (nucleotide) composition in DNA oligomers by mass spectrometry
ATE369431T1 (de) * 1999-11-12 2007-08-15 Pioneer Hi Bred Int Gene und verfahren zur wachstumsmanipulation
US7250252B2 (en) 1999-12-30 2007-07-31 David Aaron Katz Amplification based polymorphism detection
US6913879B1 (en) 2000-07-10 2005-07-05 Telechem International Inc. Microarray method of genotyping multiple samples at multiple LOCI
US6799122B2 (en) 2001-08-31 2004-09-28 Conagra Grocery Products Company Method for identifying polymorphic markers in a population
US7297485B2 (en) 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
EP1992706B1 (en) 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7282355B2 (en) 2002-03-13 2007-10-16 Syngenta Participations Ag Nucleic acid detection method
WO2004013346A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Orchid Biosciences, Inc. Methods and compositions for genotyping
US7166779B1 (en) 2003-03-07 2007-01-23 Monsanto Technology, L.L.C. Plants and seeds of variety I294213
US6996476B2 (en) 2003-11-07 2006-02-07 University Of North Carolina At Charlotte Methods and systems for gene expression array analysis
US7703238B2 (en) 2004-08-26 2010-04-27 Monsanto Technology Llc Methods of seed breeding using high throughput nondestructive seed sampling
US7591101B2 (en) 2004-08-26 2009-09-22 Monsanto Technology Llc Automated seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds
US7211717B1 (en) 2005-04-04 2007-05-01 Monsanto Technology, L.L.C. Plants and seeds of corn variety I285291
US8319066B2 (en) 2010-05-09 2012-11-27 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV995128
US10117411B2 (en) * 2010-10-06 2018-11-06 Dow Agrosciences Llc Maize cytoplasmic male sterility (CMS) C-type restorer RF4 gene, molecular markers and their use
US8969254B2 (en) * 2010-12-16 2015-03-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Oligonucleotide array for tissue typing
US8581076B2 (en) 2011-05-03 2013-11-12 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV760185
CN102373278B (zh) * 2011-10-28 2013-06-19 中国农业大学 与玉米株高性状相关的snp位点
WO2014152759A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Monsanto Technology Llc Methods of creating fungi tolerant corn plants and compositions thereof
US10472684B2 (en) * 2015-04-28 2019-11-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for producing brachytic corn plants

Also Published As

Publication number Publication date
CN107849570B (zh) 2022-02-15
ZA201706734B (en) 2023-04-26
US20200040409A1 (en) 2020-02-06
HUE053541T2 (hu) 2021-07-28
EP3289087A1 (en) 2018-03-07
EP3889274A2 (en) 2021-10-06
US20160319375A1 (en) 2016-11-03
RU2017141079A (ru) 2019-05-28
CA2982495A1 (en) 2016-11-03
CN107849570A (zh) 2018-03-27
WO2016176286A1 (en) 2016-11-03
EP3289087A4 (en) 2019-02-13
EP3289087B1 (en) 2021-02-24
RU2745987C2 (ru) 2021-04-05
PL3289087T3 (pl) 2021-11-02
RU2017141079A3 (uk) 2019-08-22
MX2017013872A (es) 2018-03-12
BR112017023275A2 (pt) 2018-07-17
US20220162713A1 (en) 2022-05-26
EP3889274A3 (en) 2022-01-19
US11214842B2 (en) 2022-01-04
CN114574612A (zh) 2022-06-03
BR112017023275B1 (pt) 2023-11-21
US10472684B2 (en) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11214842B2 (en) Methods and compositions for producing brachytic corn plants
US10415101B2 (en) Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
US12065706B2 (en) Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof
US11219174B2 (en) Methods for producing corn plants with northern leaf blight resistance and compositions thereof
US10767189B2 (en) Methods for producing cotton plants with enhanced drought tolerance and compositions thereof
US11851669B2 (en) Maize plants with improved disease resistance
KR20210114936A (ko) 개선된 내병성을 갖는 옥수수 식물
US20230068022A1 (en) Methods and compositions for producing corn plants with resistance to late wilt
WO2022208489A1 (en) Semi-determinate or determinate growth habit trait in cucurbita