CN114223534A - 一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，该选育方法的具体操作步骤如下：利用郑58、昌7‑2、浚9058、92‑8以及RIL88通过回交转育方法群体回交三代后自交获得BC3F2，采用InDel‑220单株检测籽粒基因型，利用InDel‑220标记辅助选择，选择扩增出220bp带型的纯合籽粒种植，田间鉴定农艺性状，重点观测株高性状，通过种质资源一致性分析40对引物，对改良的矮秆郑58、浚9058、昌7‑2、92‑8进行背景检测，确定改良材料的恢复率，获得稳定遗传的4类材料；通过回交转育方法，利用InDel‑220标记辅助选择，选育出矮化的浚单20和郑单958新组合，该研究为选育矮秆抗倒伏育种材料和品种提供基础研究方法。

Description

一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法
技术领域
本发明涉及玉米选育技术领域，尤其涉及一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法。
背景技术
玉米株高是产量和其他重要农艺性状直接和间接的密切相关因素，自上世纪30年代至近期，玉米单产的增加主要靠遗传改良和化肥的投入使用，但这种影响正逐年减小，种植密度的增加成为最有潜力的增产手段，增加种植密度最关键的条件是选择株高合适的材料，效力温和的矮秆基因是株高遗传改良的最具潜力的遗传资源，迄今为止,已报道玉米矮秆基因有60多个，大部分为隐性基因，有dwarf-1(d1)、d2、d3、d5、br1、br2、rd1、rd2等，具有显性遗传效应的为D8、D9、D11、Mpl1和D(t)；不同矮秆基因所引起的表达效应有所不同，其中br2在降低株高的同时，还会增加茎粗和发育根系。
以玉米自交系87-1背景下的综3单片段代换系矮秆材料为基础，将株高主效基因QTL-qph1-4进行了精细定位，目标片段在矮秆基因br2附近，同时利用图位克隆技术克隆了一个控制株高性状的QTL-qph1，并将其靶定在矮秆基因br2的第5个外显子序列上，同时进一步对定位到的QPH1基因进行鉴定和功能分析，验证了调控株高的功能位点SNP5259，围绕br2作用机理机制、玉米矮秆变异材料开展了研究，但基于矮秆基因br2序列开发共显性功能标记开发和改良材料的育种价值评价利用较少。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，通过回交转育方法，利用InDel-220标记辅助选择，选育出矮化的浚单20和郑单958新组合，为选育矮秆抗倒伏育种材料和品种提供基础研究方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，该选育方法的具体操作步骤如下：
利用郑58、昌7-2、浚9058、92-8以及RIL88通过回交转育方法群体回交三代后自交获得BC3F2，采用InDel-220单株检测籽粒基因型，利用InDel-220标记辅助选择，选择扩增出220bp带型的纯合籽粒种植，田间鉴定农艺性状，重点观测株高性状，通过种质资源一致性分析40对引物，对改良的矮秆郑58、浚9058、昌7-2、92-8进行背景检测，确定改良材料的恢复率，获得稳定遗传的4类材料。
优选的，所述回交转育方法的具体操作步骤如下：
郑58和RIL88杂交后的子一代与郑58进行杂交；
昌7-2和RIL88杂交后的子一代与昌7-2进行杂交；
浚9058和RIL88杂交后的子一代与浚9058进行杂交；
92-8和RIL88杂交后的子一代与92-8进行杂交。
优选的，所述利用InDel-220标记辅助选择的具体操作步骤如下：
采用DNAMAN软件比对查找高亲和低亲br2扩增序列的核苷酸突变位点，根据序列差异设计特异性引物，开发分子标记，利用设计的引物，扩增矮秆自交系RIL88和高秆自交系材料，判定开发标记鉴定矮秆的有效性，扩大检测群体，经过检测株高鉴定的202份玉米自交系，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较标记基因型在植株高低自交系之间的带型分布，利用卡平方独立性测验分析标记与株高的相关性，其中采用磁珠法提取DNA。
优选的，扩增反应体系和程序的具体操作步骤如下：
标记初步验证扩增采用10μL反应体系，标记大量检测采用5μL反应体系，5μL体系中含有1μL DNA，40μg/μL、2.5μL 2×TaqMIX酶、0.1μL Primer1，40μM、0.1μL Primer2，40μM、1.3μL ddH2O，10μL反应体系按比例增加各组分；
PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性45s，退火50s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后加入2μL 6×loading buffer 95℃变性5min，立即取出放在冰水混合物中1min后低温保存。
本发明的有益效果是：基于玉米矮秆突变体RIL88表达基因br2序列，依据高矮材料基因外显子序列多态性开发出功能标记InDel-220，进一步采用经过株高鉴定的202份玉米自交系验证分子标记的有效性，通过回交转育方法，利用InDel-220标记辅助选择，选育出矮化的浚单20和郑单958新组合，为选育矮秆抗倒伏育种材料和品种提供基础研究方法。
附图说明
图1为本发明采用InDel-220引物扩增玉米自交系基因组DNA的电泳图谱；
图2为本发明引物InDel-220扩增高低亲本在第3外显子的序列比对图；
图3为本发明引物InDel-220扩增自交系的电泳图谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面给出具体实施例。
一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，该选育方法的具体操作步骤如下：
利用郑58、昌7-2、浚9058、92-8以及RIL88通过回交转育方法群体回交三代后自交获得BC3F2，采用InDel-220单株检测籽粒基因型，利用InDel-220标记辅助选择，选择扩增出220bp带型的纯合籽粒种植，田间鉴定农艺性状，重点观测株高性状，通过种质资源一致性分析40对引物，对改良的矮秆郑58、浚9058、昌7-2、92-8进行背景检测，确定改良材料的恢复率，获得稳定遗传的4类材料。
回交转育方法的具体操作步骤如下：
郑58和RIL88杂交后的子一代与郑58进行杂交；
昌7-2和RIL88杂交后的子一代与昌7-2进行杂交；
浚9058和RIL88杂交后的子一代与浚9058进行杂交；
92-8和RIL88杂交后的子一代与92-8进行杂交。
利用InDel-220标记辅助选择的具体操作步骤如下：
采用DNAMAN软件比对查找高亲和低亲br2扩增序列的核苷酸突变位点，根据序列差异设计特异性引物，开发分子标记，利用设计的引物，扩增矮秆自交系RIL88和高秆自交系材料，判定开发标记鉴定矮秆的有效性，扩大检测群体，经过检测株高鉴定的202份玉米自交系，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较标记基因型在植株高低自交系之间的带型分布，利用卡平方独立性测验分析标记与株高的相关性，其中采用磁珠法提取DNA，扩增反应体系和程序的具体操作步骤如下：标记初步验证扩增采用10μL反应体系，标记大量检测采用5μL反应体系，5μL体系中含有1μLDNA，40μg/μL、2.5μL 2×TaqMIX酶、0.1μL Primer1，40μM、0.1μL Primer2，40μM、1.3μLddH2O，10μL反应体系按比例增加各组分；
PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性45s，退火50s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后加入2μL 6×loading buffer 95℃变性5min，立即取出放在冰水混合物中1min后低温保存。
株高鉴定标准为矮秆玉米并非越矮越好，一般是株高在0.9m～1.2m或更低为矮秆自交系，杂交种株高1.5m～1.8m，称为矮秆杂交种。
参见图1和图2，玉米矮秆基因br2在高矮亲本中序列差异比较
分析玉米矮秆基因br2在高矮亲本中序列多态性，高亲序列含有8137个核苷酸序列，低亲中含有8100个核苷酸序列，发现包含5个外显子和6个内含子，依据高低亲本序列保守功能域对应的核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计引物，根据第3个外显子跨越在低亲序列中10个核苷酸插入设计扩增引物InDel-220；
InDel-220：F5'TTCCGCATCATCGAC3'，
R5'ACACCACCGTGCTCTT 3'。
采用引物InDel-220扩增矮秆自交系RIL88和高低亲自交系基因组DNA，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示，在矮秆突变体RIL88和低亲自交系中扩增出220bp片段，在高亲亲本中扩增出210bp片段，引物InDel-220在高低亲本中具有多态性。
参见图3，玉米矮秆功能标记验证
用引物InDel-220扩增90份玉米自交系，在21份矮秆自交系中，有18份扩增出220bp片段，3份扩增出210bp片段，分析18份扩增出220bp片段自交系遗传背景，大多数含有综3、沈5003、掖478血缘的矮秆自交系，3份扩增出210bp片段自交系为矮秆白玉米、黑玉米和郑58；在69份高秆自交系中，有68份扩增出210bp片段，1份扩增出杂合片段，为良玉88母本与永优1573母本二环系改良，其中a:220bp，b:210bp，c:杂合。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，其特征在于，该选育方法的具体操作步骤如下：
利用郑58、昌7-2、浚9058、92-8以及RIL88通过回交转育方法群体回交三代后自交获得BC3F2，采用InDel-220单株检测籽粒基因型，利用InDel-220标记辅助选择，选择扩增出220bp带型的纯合籽粒种植，田间鉴定农艺性状，重点观测株高性状，通过种质资源一致性分析40对引物，对改良的矮秆郑58、浚9058、昌7-2、92-8进行背景检测，确定改良材料的恢复率，获得稳定遗传的4类材料。
2.根据权利要求1所述的一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，其特征在于，所述回交转育方法的具体操作步骤如下：
郑58和RIL88杂交后的子一代与郑58进行杂交；
昌7-2和RIL88杂交后的子一代与昌7-2进行杂交；
浚9058和RIL88杂交后的子一代与浚9058进行杂交；
92-8和RIL88杂交后的子一代与92-8进行杂交。
3.根据权利要求1所述的一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，其特征在于，InDel-220功能标记开发具体操作步骤如下：
采用DNAMAN软件比对查找高亲和低亲br2扩增序列的核苷酸突变位点，根据序列差异设计特异性引物，开发分子标记，利用设计的引物，扩增矮秆自交系RIL88和高秆自交系材料，判定开发标记鉴定矮秆的有效性，扩大检测群体，经过检测株高鉴定的202份玉米自交系，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较标记基因型在植株高低自交系之间的带型分布，利用卡平方独立性测验分析标记与株高的相关性，其中采用磁珠法提取DNA。
4.根据权利要求3所述的一种通过功能标记的玉米矮秆选育方法，其特征在于，扩增体系和程序的具体操作步骤如下：
标记初步验证扩增采用10μL反应体系，标记大量检测采用5μL反应体系，5μL体系中含有1μL DNA，40μg/μL、2.5μL 2×TaqMIX酶、0.1μL Primer1，40μM、0.1μL Primer2，40μM、1.3μL ddH2O，10μL反应体系按比例增加各组分；
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