CN114672584B - 分子标记引物对、耐旱型甘蓝型油菜鉴定方法和育种方法 - Google Patents

分子标记引物对、耐旱型甘蓝型油菜鉴定方法和育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种分子标记引物对、耐旱型甘蓝型油菜鉴定方法和育种方法，所述分子标记引物对为dCAPS标记引物对，和/或，基于巢式PCR的位点特异性标记的外引物对和内引物对。利用前述分子标记引物对对甘蓝型油菜的DNA进行PCR扩增，电泳检测，根据电泳条带的显示结果鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性，将鉴定出的纯合耐旱型甘蓝型油菜用于油菜新品种育种。本发明基于全基因组关联分析、单倍型分析、启动子截短和GUS活性检测技术，开发靶向明确的位点特异性标记和dCAPS标记，本发明提供的巢式PCR标记特异性高，可区分出耐旱性更强的Hap4材料。

Description

分子标记引物对、耐旱型甘蓝型油菜鉴定方法和育种方法
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及筛选甘蓝型油菜耐旱材料的分子标记组合，以及使用所述分子标记组合筛选甘蓝型油菜耐旱材料的应用，以及利用所述标记组合筛选目标株系进行育种的方法。
背景技术
油菜是世界上最重要的油料作物之一，我国是世界上第一大油菜生产国，每年种植面积在7百万公顷以上，产量和面积约占世界30％以上。作为主要的食用植物油来源和重要的饲用蛋白来源，油菜生产在保障我国食用植物油供应中起着重要作用。我国种植的油菜主要为甘蓝型油菜，其株体较大，生育期长，整个生育期对水分需求量大。干旱胁迫是全球农业生产中最严重的一种环境胁迫，它主要通过影响油菜的播种期、出苗期、开花期来制约油菜的生长情况和产量。
作物抗旱性属多基因控制的复杂数量性状，抗旱性表型鉴定指标难以确定，且易受环境因素影响。
通过传统育种手段提高作物耐旱性，其周期长、进展慢，效果不显著。利用分子育种手段可以大大加速育种进程，提高育种效率。
现有技术中，油菜抗旱QTL定位研究取得了一定的进展，大量抗旱相关的重要关键基因已经被鉴定和克隆，并通过基因工程手段成功转入甘蓝型油菜中，取得了预期的效果。因为普通公众对转基因食品仍然存在疑虑，所以转基因品种并没有在大田和生产实践中得到应用和推广。
因此，利用甘蓝型油菜丰富的遗传资源，挖掘耐旱性相关的分子标记，通过分子标记辅助选择来改良作物的抗旱性，有助于培育抗旱新品种。
在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题中的一个技术问题：
1、甘蓝型油菜抗旱分子机制和育种研究进展缓慢，远远落后于水稻、玉米等其他作物。作为异源多倍体，甘蓝型油菜基因组大、杂合度高、基因组内具有高度重复序列。目前公开报道的与耐旱性相关的分子标记较少，且这些标记大部分不能直接靶向目标基因，基因的分离重组易造成标记信息的丢失，导致对目标性状的选择造成一定的困难。
2、甘蓝型油菜A亚基因组和C亚基因组高度同源，常规分子标记难以区分扩增产物的来源。
3、发明人在开发出了能够鉴定出耐旱材料的dCAPS标记的基础上，进一步研究发现所述dCAPS标记不能区分Hap4和Hap1材料。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种能够鉴定出甘蓝型油菜品种中耐旱型材料的分子标记引物对，该分析标记引物对特异性高。
本发明的第二目的在于提供一种鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法。
本发明的第三目的在于提供一种耐旱型甘蓝型油菜育种方法。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种用于鉴定甘蓝型油菜耐旱性的分子标记引物对，所述分子标记引物对为dCAPS标记引物对，碱基序列如下：
SWU_YA7dCAPSF：CTACCCATATCCAGATCCTTACTACAGACGTAC；
SWU_YA7dCAPSR：CTTTGCTCTGGATTGCCTACGTCTCAGTA。
和/或，还包括基于巢式PCR的位点特异性标记的外引物对和内引物对。
根据本发明用于鉴定甘蓝型油菜耐旱性的分子标记引物组合的一个实施方式，所述外引物对的碱基序列如下：
正向外引物SWU_YA7F：GTAGAGGTAGACCCGTAGAAAGCCG；
反向外引物SWU_YA7R：GACTCATGAGCAGCTTTAAATGTCC。
根据本发明用于鉴定甘蓝型油菜耐旱性的分子标记引物组合的一个实施方式，所述内引物对包括第一内引物对和第二内引物对；
第一内引物对碱基序列如下：
第一正向内引物SWU_H3F：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第一反向内引物SWU_H3R：CAGAATTATCAAAATCCAAT；
第二内引物对碱基序列如下：
第二正向内引物SWU_H4F：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第二反向内引物SWU_H4R：CAGAATTATCAAAATCCCAC。
本发明还提供了一种基于前述分子标记引物对鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法，包括如下步骤：
S1.1提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株DNA；
S1.2使用所述dCAPS标记引物对，进行第一PCR扩增，得第一PCR扩增产物；
S1.3用限制性内切酶酶切所述第一PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；
S1.4将S1.3酶切所得片段进行第一电泳检测；
第一电泳检测条带以高带呈现的甘蓝型油菜品种为耐旱品种；
第一电泳检测条带以低带呈现的甘蓝型油菜品种为不耐旱品种。
进一步地，第一PCR扩增具体操作如下：
第一PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 25μL，10μM正向引物SWU_YA7dCAPSF和10μM反向引物SWU_YA7dCAPSR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至50μL；
第一PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
根据本发明鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法的一个实施方式，所述限制性内切酶为限制性内切酶Pfl23II。
进一步地，酶切的具体操作如下：
酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，第一PCR扩增产物10μL，Pfl23II限制性内切酶2μL，ddH2O补齐至20μL，37℃酶切反应15min。
进一步地，第一电泳检测的具体操作为：
取5μL酶切产物在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为120V，45分钟。
本发明还提供了一种基于前述分子标记引物对鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法，包括如下步骤：
S2.1步骤S1.4后提取耐旱品种DNA；或者，重新提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株DNA；
S2.2利用所述外引物对对所述S2.1提取的DNA进行第二PCR扩增，得第二PCR扩增产物；
S2.3取第二PCR扩增产物，加ddH2O稀释后作为第三PCR扩增模板，利用所述内引物对对所述模板进行第三PCR扩增，得第三PCR扩增产物；
S2.4将所述第三PCR扩增产物进行第二电泳检测，检查第二电泳条带；
经S1鉴定为耐旱品种，且检查S2.4第二电泳条带：
第一内引物对无条带且第二内引物对有条带，甘蓝型油菜品种为耐旱品种；
第一内引物对有条带且第二内引物对无条带，甘蓝型油菜品种为不耐旱或低抗品种。
进一步地，第二PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的外引物SWU_YA7F/R各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第二PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。
进一步地，第三PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的第一正向内引物SWU_H3F或第二正向内引物SWU_H4F和10μM的第一反向内引物SWU_H3R或第二反向内引物SWU_H4R各1μL，稀释1000倍的所述第二PCR扩增产物1μL，ddH2O补齐至25μL；
第三PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
进一步地，第二电泳检测具体操作如下：
取5μL所述第三PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130V，20分钟。
本发明还提供了一种耐旱型甘蓝型油菜育种方法，利用前述鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法选择出BnaA9.NF-YA7基因中的SNP基因型为胞嘧啶(C)同时启动子中靠近翻译起始位点的CCAAT-box缺失的甘蓝型油菜，即为筛选出的目标株系，对所述目标株系执行回交转育程序。
根据本发明耐旱型甘蓝型油菜育种方法的一个实施方式，利用所述分子标记引物组合在甘蓝型油菜苗期鉴定植株的基因型，选取纯合子基因型耐旱型植株，执行回交转育程序。
与现有技术相比，上述技术方案具有如下优点：
a)本发明基于全基因组关联分析、单倍型分析、启动子截短和GUS活性检测技术，开发靶向明确的位点特异性标记和dCAPS标记。单一的dCAPS标记能鉴定出耐旱的材料，但不能区分Hap4和Hap1材料。Hap1和Hap4都是相对耐旱品种，但Hap4的耐旱性整体强于Hap1。
b)本发明提供的巢式PCR标记特异性高：第一反向内引物SWU_H3R的序列唯一比对到A09染色体上，而第二反向内引物SWU_H4R的序列与C05染色体上的序列一致，常规PCR检测会呈假阳性。正向外引物SWU_YA7F的序列经blast比对，在Darmor、中双11和Tapidor等甘蓝型油菜参考基因组上的位置唯一。经第二PCR扩增后会特异得到A09染色体上的片段，第三PCR扩增中第二反向内引物SWU_H4R则在A09染色体上特异识别变异的CCAAT-box，避免了常规PCR扩增出同源序列(C05染色体上的序列)。
c)通过基于巢式PCR的位点特异性标记和dCAPS标记相结合的形式可准确靶向目标序列，为今后甘蓝型油菜耐旱种质资源的筛选和分子标记辅助选育耐旱、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。
d)本发明针对特定基因开发基因靶向的位点特异性标记和dCAPS标记，以标记组合的策略对育种材料进行低世代的标记选择，有助于在低世代对育种材料中的耐旱优异基因聚集，降低高世代育种选择工作量，缩小育种规模，缩短育种年限。
e)本发明提供的分子标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子。利用本标记在甘蓝型油菜苗期就可以鉴定植株的基因型，省去回交渗入过程中每代自交的步骤。
f)该分子标记组合可以根据PCR产物或酶切产物条带特征即可判断耐旱性强弱，无需测序或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作，检测的准确率较高，且具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。
g)本发明提供的一种分子标记引物组合具有重要的应用价值，利用此标记组合可以进行精准的耐旱分子标记辅助选择育种、可以提高基因聚合育种中的应用效率，大大加快甘蓝型油菜耐旱分子育种的进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是候选基因关联分析结果。
图1中，a-b为候选基因关联分析；c为本发明涉及基因的LD分析；d为本发明涉及基因的单倍型分析；e-i为不同单倍型间耐旱性差异的表型验证。
图2是启动子截短分析。
图2中，a为两种单倍型启动子在正常和渗透胁迫下的GUS染色和GUS酶活测定，b为启动子截短分析结果。
图3是dCAPS标记扩增部分代表性品种的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图4是不同材料间CCAAT-box及其侧翼序列比对结果。
图5是基于巢式PCR的位点特异性标记扩增部分代表性品种的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图5中，上半部分为第一内引物对SWU_H3F+SWU_H3R的PCR扩增产物的凝胶电泳图；下半部分为第二内引物对SWU_H4F+SWU_H4R的PCR扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1
本发明是基于全基因组关联分析、单倍型分析、启动子截短和GUS活性检测技术，开发靶向明确的耐旱相关位点特异性标记和dCAPS标记，通过该组合标记的形式为今后甘蓝型油菜耐旱种质资源的筛选和分子标记辅助选育耐旱、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。
本实施例中，对分子标记的流程进行详细描述，这些描述使本领域技术人员能够特别容易理解本发明的技术构思和所采用的技术手段。
1、BnaA9.NF-YA7响应干旱胁迫
发明人在前期的研究中，利用我国油菜育种和科研单位共同收集的520份资源材料进行了干旱和盐胁迫下种子的发芽率(GP)和发芽指数(GI)调查统计，结合60K芯片分析获得的基因型数据对GP和GI进行了全基因组关联分析。
后续分析中，发明人在A09上显著位点附近检测到一个重要的候选基因BnaA9.NF-YA7(基因ID：BnaA09g26040D)。
为进一步了解BnaA9.NF-YA7基因是否存在与甘蓝型油菜耐旱性差异有关的遗传变异，发明人选取前期所用群体中的181份材料进一步分析。基于181份材料全基因组重测序结果，在BnaA9.NF-YA7基因内部及启动子区域(起始密码子上游2kb)共检测到18个SNP。利用这些SNP数据和PEG处理下的表型数据GP和GI进行关联分析，结果显示在不同的分析模型中，第三个外显子上的SNP与干旱胁迫下种子的GP和GI显著相关，参见图1中a、b部分。同时，在对这18个SNP进行连锁不平衡(LD)分析时发现，该SNP与基因内部SNP的LD值较低，与启动子区域的SNP的LD值较高，参见图1中c部分。
根据重测序检测到的18个SNP，发明人进行了单倍型分析，共获得5个主要的单倍型(Hap,Haplotype)，如图1中d部分所示。比较这些单倍型在干旱胁迫下的GP和GI发现，Hap4的GP和GI要显著高于Hap3和Hap5(p<0.05)，Hap1仅次于Hap4，而Hap2属于中间类型，参见图1中e、f部分。
根据上述结果，发明人利用PEG模拟胁迫，随机选取不同单倍型的材料进行验证，结果表明在20％的PEG处理下(渗透势-1.2MPa)，不同单倍型材料的GP与GI与前期研究结果一致，Hap4的种子GP和GI均最高，其次为Hap1，而Hap3和Hap5单倍型材料在PEG处理下的GP和GI均较低，参见图1中g、h。此外，在苗期连续干旱处理3周后，Hap4和Hap1单倍型材料较其它三种单倍型材料表现出更强的耐旱性，如图1中i所示。
进一步分析基因型发现，极端表型的两种单倍型Hap3和Hap4的差异主要集中在基因内的10个SNP上。其中在第三个外显子上的SNP能够准确的将五种单倍型分为耐旱和不耐旱两种不同类型。为验证该SNP位点真实存在，发明人克隆了Hap3和Hap4不同株系的BnaA9.NF-YA7基因CDS序列，序列比对结果显示，Hap3和Hap4的不同株系间只存在重测序检测到的三个SNP差异。
进一步蛋白序列分析表明，第三个外显子上的SNP的变异导致BnaA9.NF-YA7氨基酸序列的第63个氨基酸在Hap2、Hap3和Hap5为甲硫氨酸(M)，而Hap1和Hap4的第63位为异亮氨酸(I)。
利用Chimera软件对两种类型的BnaA9.NF-YA7蛋白进行三维结构预测，结果显示非核心保守区的氨基酸变异对蛋白质三维空间结构无明显影响。表达模式分析发现，BnaA9.NF-YA7受干旱胁迫诱导显著上调表达，且极端单倍型之间基因表达量存在差异，Hap3材料的表达量明显高于Hap4材料。
上述结果表明，BnaA9.NF-YA7响应干旱胁迫，其基因内存在与甘蓝型油菜耐旱差异相关的遗传变异。
2、启动子截短及GUS酶活测定
由于Hap3材料和Hap4材料之间存在较大的耐旱性差异，发明人推测其干旱胁迫下的表达量差异与启动子有关。
启动子测序结果发现两个单倍型间的启动子序列存在较大差异，将两个单倍型的启动子分别连接GUS报告基因，遗传转化拟南芥后进行GUS染色观察。结果发现：两个单倍型间的GUS染色结果和GUS酶活存在明显差异(图2a)。
上述结果证实了发明人的推测，单倍型间的耐旱性差异与启动子序列差异有关。
为进一步明确导致这种差异的变异位点，发明人进行了启动子截短分析。经过一系列截短，结合GUS染色和GUS酶活测定表明CCAAT-box和motif_sequence为BnaA9.NF-YA7启动子的核心启动元件，而ABRE是重要的调控元件(图2b)。进一步比较两个单倍型间这三个元件的差异发现，只有CCAAT-box元件在Hap3和Hap4之间存在差异，Hap4单倍型的CCAAT-box存在两个SNP的变异，导致该元件缺失。进一步扩大范围比较了所有五种单倍型的代表材料，均只在Hap4材料的启动子中检测到CCAAT-box的缺失。
上述结果表明，第三个外显子上的SNP和启动子中CCAAT元件同时变异可能是Hap4材料耐旱性强于其他单倍型材料的原因。
3、基于巢式PCR的位点特异性标记和dCAPS标记开发
利用重测序获得的BnaA9.NF-YA7在不同品种间的序列差异，发明人在该基因编码区的第189个碱基处发现存在SNP(G/C)，且该SNP会导致第63个氨基酸由甲硫氨酸(M)变为异亮氨酸(I)，进一步扩增不同品种发现耐旱性较差的品种在该SNP位点基因型为G，耐旱性较强的Hap4和Hap1在该SNP位点基因型为C。该SNP位点处不存在限制内切酶酶切位点，无法开发CAPS标记，因此发明人利用dCAPS Finder 2.0网站(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计dCAPS标记。
提取该SNP位点上下游各30bp序列导入WT序列框，然后手动将该序列中SNP位点的G改为C后导入Mutant序列框，选择错配碱基数目为1，进行引物设计，获得的20条引物中没有常见的限制性内切酶。选择错配碱基数目设为2，再次进行引物设计，共获得74条引物信息及其相应的限制性内切酶。
发明人选取限制性内切酶Pfl23II作为开发对象，引入两个错配碱基C形成Pfl23II酶切位点CGTACG，获得SWU_YA7dCAPSF引物序列(序列表第1号序列：CTACCCATATCCAGATCCTTACTACAGACGTAC)；在该SNP位点下游100～300bp处设计SWU_YA7dCAPSR引物(序列表第2号序列：CTTTGCTCTGGATTGCCTACGTCTCAGTA)。该引物对即为本发明开发的dCAPS标记。
利用dCAPS标记进一步筛分甘蓝型油菜耐旱性材料的具体操作如下。
利用该dCAPS标记，从我国油菜育种和科研单位共同收集的520份资源材料中选取部分有代表性的品种分别进行第一PCR扩增，用限制性内切酶Pfl23II酶切第一PCR扩增产物进行酶切扩增多态性分析。具体品种名及单倍型见表1。
表1本实施例所用代表性品种名称及其单倍型和耐旱性信息
Figure BDA0003610579090000081
Figure BDA0003610579090000091
注：Ⅰ-强耐旱型，Ⅱ-耐旱型，Ⅲ-中间型，Ⅳ-干旱敏感型，Ⅴ-干旱极敏感型。
所述第一PCR扩增具体操作如下：
第一PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 25μL，10μM正向引物SWU_YA7dCAPSF和10μM反向引物SWU_YA7dCAPSR各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至50μL；
第一PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
第一PCR扩增反应产物用限制性内切酶Pfl23II酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer2μL，第一PCR扩增产物10μL，NdeI限制性内切酶2μL，ddH2O补齐至20μL，37℃酶切反应15min。
取5μL酶切产物在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为120V，45分钟。
第一电泳检测结果如图3所示，所述SNP位点基因型为C的品种(耐旱)PCR扩增产物经Pfl23II酶切后为单一的144bp片段，电泳检测条带以高带(图3的第1-5、17-21泳道)呈现；基因型为G的品种PCR扩增产物经Pfl23II酶切后为单一的约110bp片段，电泳检测条带以低带(图3的第6-12、14-16、22-25泳道)呈现。
上述结果表明dCAPS标记具有很高的特异性和辨识度以及较广的适用性，其能够清晰地将耐旱性较强的甘蓝型油菜品种(Hap1和Hap4材料)与干旱敏感的品种区别开，具有很高的特异性和辨识度。
发明人在继续完成本发明的过程中发现，单一的dCAPS标记只能鉴定出较耐旱的材料，但不能区分Hap4和Hap1材料。
基于此，发明人利用系列实验获得启动子上的核心序列差异，进一步扩增不同单倍型的种质资源材料发现CCAAT-box的变异只存在于Hap4材料中。图4展示了在不同单倍型不同材料间CCAAT及其侧翼序列的比对结果，存在两个SNP变异的CCAAT-box元件为本发明位点特异性标记的核心位置。
由于甘蓝型油菜属于异源四倍体，A亚基因组和C亚基因组存在较高的同源，分析比较发现BnaA9.NF-YA7的启动子序列与BnaC5.NF-YA7的启动子序列同源性较高，且Hap4的CCAAT元件变异后与BnaC5.NF-YA7的启动子序列一致。
在设计常规位点特异性PCR标记区分Hap1和Hap4材料失败的基础上，为准确鉴别该变异位点，避免C05染色体上同源序列的干扰，发明人设计了基于巢式PCR的位点特异性标记。
根据CCAAT-box位点信息，结合A09和C05染色体序列在该区域的比对结果，通过引物设计软件Primer Premier5设计特异扩增A09染色体区域的外引物，引物对碱基序列如下：
SWU_YA7F(序列表第3号序列):GTAGAGGTAGACCCGTAGAAAGCCG；
SWU_YA7R(序列表第4号序列):GACTCATGAGCAGCTTTAAATGTCC。
基于CCAAT-box中存在的两个SNP信息，特异的将内引物的3’端放在变异位点上，分别设计Hap3(正常位点)和Hap4(突变位点)的内引物，引物对碱基序列如下：
第一正向内引物SWU_H3F(序列表第5号序列)：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第一反向内引物SWU_H3R(序列表第6号序列)：CAGAATTATCAAAATCCAAT；
第二正向内引物SWU_H4F(序列表第7号序列)：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第二反向内引物SWU_H4R(序列表第8号序列)：CAGAATTATCAAAATCCCAC。
上述引物对即为本发明开发的基于巢式PCR的位点特异性标记。
利用该位点特异性标记筛分甘蓝型油菜耐旱材料的具体操作如下。
利用所述标记外引物对表1所述代表性品种DNA进行第二PCR扩增，利用第二PCR扩增产物稀释1000倍做模板，所述标记内引物对进行第三PCR扩增，对第三PCR扩增产物进行扩增多态性分析。
所述第二PCR扩增具体操作如下：
第二PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的外引物SWU_YA7F/R各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第二PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。
所述第三PCR扩增具体操作如下：
第三PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的正向内引物SWU_H3F或SWU_H4F和10μM的反向内引物SWU_H3R或SWU_H4R各1μL，稀释1000倍的上述第二PCR扩增产物1μL，ddH2O补齐至25μL；
第三PCR反应程序：94℃预变性1min30s；94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。
取5μL第三PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行第二电泳检测，电泳条件为130V，20分钟。
第二电泳检测结果如图5所示：以SWU_H3F+SWU_H3R引物对进行第三PCR扩增，不携带所述CCAAT-box的品种(即耐旱品种)扩增无带，第二电泳检测条带以空白(图5上半部分的第17-21泳道)呈现，携带所述CCAAT-box的品种(即干旱敏感或低抗品种)扩增产物大小为431bp，第二电泳检测以单一带(图5上半部分的第1-12、14-16、22-25泳道)呈现；以SWU_H4F+SWU_H4R引物对进行第三PCR扩增，不携带所述CCAAT-box的品种(即耐旱品种)扩增产物大小为431bp，第二电泳检测条带单一条带(图5下半部分的第17-21泳道)呈现，携带所述CCAAT-box的品种(即干旱敏感或低抗品种)扩增无带，第二电泳检测以空白(图5上半部分的第1-12、14-16、22-25泳道)呈现。
利用dCAPS标记引物鉴定出甘蓝型油菜品种为耐旱品种，且基于巢式PCR的位点特异性标记鉴定甘蓝型油菜品种也为耐旱品种，判断该甘蓝型油菜品种为基因型为Hap4的耐旱品种。
上述结果表明基于巢式PCR的位点特异性标记能够清晰地将Hap4材料中的强耐旱品种与其他单倍型材料区别开，具有很高的特异性和辨识度。
上述结果表明位点特异性标记和dCAPS标记的组合具有很高的特异性和辨识度以及较广的适用性，其能够清晰地将耐旱的甘蓝型油菜品种与干旱敏感的品种区别开。利用本发明所述的位点特异性标记和dCAPS标记按本发明方法检测，可准确预测杂交后代的耐旱性水平，大大提高甘蓝型油菜耐旱材料的选择效率。
本发明分子标记是基于基因内部的SNP位点开发的，本发明甘蓝型油菜材料筛分方法是通过检测甘蓝型油菜基因组中BnaA9.NF-YA7基因编码序列第189个碱基处的SNP基因型以及启动子中CCAAT-box的SNP基因型实现的。
利用该标记组合进行育种，选择出BnaA9.NF-YA7基因中的SNP基因型为C，同时启动子区域的CCAAT-box缺失的甘蓝型油菜材料，即为筛选出的目标株系，对该目标株系进行育种，执行回交转育程序，即完成所述的提高甘蓝型油菜耐旱性的分子标记育种。在回交转育程序中，选取纯合子基因型耐旱型或强耐旱型植株回交，获得耐旱型或强耐旱型回交后代，最后通过自交获得目标材料。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure RE-IDA0003670606710000011
Figure RE-IDA0003670606710000021

Claims (5)

1.一种用于鉴定甘蓝型油菜耐旱性的分子标记引物组，其特征在于，所述分子标记引物组包括dCAPS标记引物对，碱基序列如下：
SWU_YA7dCAPSF：CTACCCATATCCAGATCCTTACTACAGACGTAC；
SWU_YA7dCAPSR：CTTTGCTCTGGATTGCCTACGTCTCAGTA；
还包括基于巢式PCR的位点特异性标记的外引物对和内引物对；
所述外引物对的碱基序列如下：
正向外引物SWU_YA7F：GTAGAGGTAGACCCGTAGAAAGCCG；
反向外引物SWU_YA7R：GACTCATGAGCAGCTTTAAATGTCC；
所述内引物对包括第一内引物对和第二内引物对；
第一内引物对碱基序列如下：
第一正向内引物SWU_H3F：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第一反向内引物SWU_H3R：CAGAATTATCAAAATCCAAT；
第二内引物对碱基序列如下：
第二正向内引物SWU_H4F：GTAGCGGGTAGAGGTAGAC；
第二反向内引物SWU_H4R：CAGAATTATCAAAATCCCAC。
2.一种基于权利要求1所述分子标记引物组鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.1 提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株DNA；
S1.2 使用权利要求1所述dCAPS标记引物对，进行第一PCR扩增，得第一PCR扩增产物；
S1.3 用限制性内切酶酶切所述第一PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；
S1.4 将S1.3酶切所得片段进行第一电泳检测；
第一电泳检测条带以高带呈现的甘蓝型油菜品种为耐旱品种；
第一电泳检测条带以低带呈现的甘蓝型油菜品种为不耐旱品种；
S2.1 步骤S1.4后提取耐旱品种DNA；或者，重新提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株DNA，
S2.2 利用所述外引物对对所述S2.1提取的DNA进行第二PCR扩增，得第二PCR扩增产物；
S2.3 取第二PCR扩增产物，加ddH2O稀释后作为第三PCR扩增模板，利用所述内引物对对所述模板进行第三PCR扩增，得第三PCR扩增产物；
S2.4 将所述第三PCR扩增产物进行第二电泳检测，检查第二电泳条带；
经S1鉴定为耐旱品种，且检查S2.4第二电泳条带：
第一内引物对无条带且第二内引物对有条带，甘蓝型油菜品种为耐旱品种；
第一内引物对有条带且第二内引物对无条带，甘蓝型油菜品种为不耐旱或低抗品种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为限制性内切酶Pfl23II。
4.一种耐旱型甘蓝型油菜育种方法，其特征在于，利用权利要求2所述方法选择出BnaA9.NF-YA7基因中的SNP基因型为胞嘧啶（C）同时启动子中靠近翻译起始位点的CCAAT-box缺失的甘蓝型油菜，即为筛选出的目标株系，对所述目标株系执行回交转育程序。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用所述分子标记引物组在甘蓝型油菜苗期鉴定植株的基因型，选取纯合子基因型耐旱型或强耐旱型植株，执行回交转育程序。
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