CN109337998A - 与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记及其应用，标记核苷酸序列为：InDel6正向引物5′‑TGTGGACGTGACACGCTT‑3′、反向引物5′‑TCAGCCTTCGTCCACAGAC‑3′；SSR229正向引物5′‑GGGTCTTTCGCTGAATAACACT‑3′、反向引物5′‑CAACCCTCACTACTAAAGCCGA‑3′。本发明还公开了上述标记在玉米株高分子标记辅助选择育种中的应用。具体方法是：(1)采用分子标记，对BC、F2群体株进行基因型鉴定；(2)根据(1)中基因型鉴定的结果，进行高秆、矮秆分类，结合表型结果进行基因型鉴定的验证。本发明的分子标记表现稳定，检测简易，不需酶切，电泳条带清晰，实验成本低廉，提高了玉米株型改良的效率，加快了玉米理想株型育种的进程。

Description

与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及与玉米株高紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是我国第一大粮食作物，在我国能源与粮食安全中占有举足轻重的位置，株高影响到玉米的抗倒性、光合效能、收获指数，与玉米产量密切相关，因此，在玉米育种实践与种质资源改良工作中，株高性状具有重要的价值。

玉米株高具有复杂的遗传基础，连锁作图、关联分析等方法被用于玉米株高的研究，一方面，连锁作图和关联分析的方法被用来发掘影响株高的靶点，另一方面，矮秆突变体被用来解析株高调控的机制。尽管有一些调控玉米株高的基因被定位与克隆，例如qPH3.1、br2等，尚未见InDel6和SSR229分子标记用于玉米株高辅助选择育种的研究报道。因此，开发与玉米株高基因相关的InDel6和SSR229标记，可以为玉米株型改良与育种工作提供理论参考与实践素材。

发明内容

本发明提供了两个与玉米株高紧密连锁的分子标记，分别为InDel6和SSR229标记。

本发明还分别提供了一对用于检测与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229两个分子标记的引物，包括InDel6的正向引物5′-TGTGGACGTGACACGCTT-3′和反向引物

5′-TCAGCCTTCGTCCACAGAC-3′；SSR229的正向引物

5′-GGGTCTTTCGCTGAATAACACT-3′和反向引物5′-CAACCCTCACTACTAAAGCCGA-3′。

本发明还提供了一种用于检测与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229分子标记的筛选方法，通过采用玉米55K SNP芯片，在亲本、混池间筛选多态性分子标记；根据玉米重测序的结果，开发InDel标记InDel6、SSR标记SSR229，并在玉米株型改良育种中进行运用，从而加速玉米理想株型品种(品系)的选育进程。同时，发展的分子标记也为玉米株高基因克隆、种质改良创新、理想株型新品种选育提供了理论参考与实践素材。为实现上述目的，本发明采用的具体步骤如下：

(1)对高秆和矮秆高世代回交群体BC6进行株高的表型鉴定；

(2)采用玉米55K SNP芯片、集团分离分析BSA的方法，对混池、单株DNA进行基因型检测，完成玉米株高基因的初步定位；

(3)根据基因初步定位的结果，基于玉米基因组重测序的结果，在初步定位的基因区域开发InDel、SSR标记，并设计对应的InDel、SSR引物；

(4)利用设计的InDel、SSR引物，筛选在两个亲本、高秆和矮秆混池间呈现多态性的引物，利用多态性的引物对BC、F2群体进行基因型鉴定；

(5)根据InDel、SSR分子标记基因型鉴定的结果，鉴定交换单株，分析所发展分子标记与株高基因的连锁程度，发掘紧密连锁的分子标记。

本发明利用上述技术措施，最终获得与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记，对应玉米参考基因组物理图谱的位置分别是：InDel6位于十号染色体的122642049 bp，SSR229位于十号染色体的122789702 bp。InDel6引物序列为F：5′-TGTGGACGTGACACGCTT-3′，R：

5′-TCAGCCTTCGTCCACAGAC-3′；SSR229引物序列为F：

5′-GGGTCTTTCGCTGAATAACACT-3′，R：5′-CAACCCTCACTACTAAAGCCGA-3′。

本发明另一个目的是鉴定玉米株高分子标记InDel6和SSR229在玉米理想株型育种中的应用。

本发明提供的方法，具体方法是：

(1)利用发展的InDel、SSR分子标记，对BC、F₂群体每个株系进行基因型鉴定。

(2)利用上述(1)中BC、F₂群体基因型鉴定的结果，根据鉴定结果，对单株进行高秆、矮秆分类，对表型分析的结果进行鉴定和验证。

本发明的有益效果：

本发明的分子标记InDel6和SSR229表现稳定，检测简易，不需酶切，电泳条带清晰，实验成本低廉，提高了玉米株型改良的效率，加快了玉米理想株型育种的进程。

本发明的标记与控制玉米株高的基因紧密连锁，有利于玉米株高基因的克隆与功能验证。

本发明设计的引物InDel6和SSR229扩增稳定、灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1是SSR标记umc2350检测BC群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳图显示，标记umc2350在BC群体高秆单株、矮秆单株间呈现多态性。

图2是SSR标记umc1697检测BC群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图3是SSR标记SSR51、SSR229检测BC群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图4是SSR标记SSR-Z60检测BC群体单株(高秆单株、矮秆单株)的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图5是InDel标记InDel6检测BC群体高秆池、矮秆池的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图6是InDel标记InDel6检测120份高秆材料、矮秆材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图7是SSR标记SSR229检测120份高秆材料、矮秆材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

具体实施方式

实施例1

一、基因定位群体的构建

1、BC群体的构建

玉米自交系Mo17(母本)，是玉米育种实践与基础研究的骨干自交系，属于玉米Lancaster种质，非Reid群，株高正常，约170cm，自交系Mo17的基因组已经测序。

玉米矮秆材料DNT06(父本)，株高矮化，约100cm，花粉育性正常。矮秆材料DNT06的矮秆性状在多个年份、多个地点(扬州、三亚、北京)进行了鉴定，矮秆性状表现稳定，不受年份与环境的影响。

本发明实施案例利用这两个亲本配置F₁，F₁后代与矮秆材料DNT06回交产生BC₁代。然后在回交后代群体中，选择株高正常的植株作为母本，矮秆材料DNT06作为父本，连续回交多个世代，获得高世代回交群体BC₆。

二、玉米株高基因的初步定位

1、玉米基因组DNA的提取

使用改良的SDS法提取亲本及分离群体BC、F₂的基因组DNA。

2、SNP芯片检测亲本、混池、分离群体单株基因型

采用玉米55K SNP芯片、集团分离分析BSA的方法，对亲本、混池、分离群体单株DNA进行基因型检测。玉米55K SNP芯片的开发：从广泛应用的56K SNP芯片(MaizeSNP50)中挑选出20K SNP标记；从欧洲600K玉米芯片(600K Axion Maize Genotyping Array)挑选出在基因组上均匀分布的10K SNP标记；从全基因组RNA-seq数据挑选出10K SNP标记；从大规模DNA重测序和RNA-seq数据中筛选出热带特有的15K SNP标记。

3、玉米株高基因初步定位

根据双亲、后代分离群体基因型检测、表型鉴定的结果，对玉米株高相关基因进行初步定位。将基因定位于SNP标记AX-91828920和SNP标记AX-91830391之间，两者均位于玉米第10号染色体。

4、InDel、SSR分子标记的开发及多态性标记筛选

基于基因初步定位的结果，在初定位SNP分子标记AX-91828920和AX-91830391之间，根据MaizeGDB，获得16对SSR引物，将基因定位于分子标记umc2350(图1)和umc1697之间(图2)；亲本Mo17的基因组序列已经测定，通过比较亲本Mo17和玉米参考基因组B73的序列，在初定位分子标记umc2350和umc1697之间，共设计了238对SSR引物。引物设计原则：长度18-22bp，目标条带长度150-200bp。PCR扩增体系：0.5μl DNA模板，1μl 10×PCR buffer(含Mg²⁺)，0.2mM dNTPs，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物，0.5U Taq酶，加ddH₂O至10μl。PCR反应循环：94℃预变性1min；94℃变性30s，55-58℃(根据引物的Tm值微调)退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，15℃保存。使用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，SSR引物SSRS1、SSR229、SSR-Z60在亲本间具有多态。亲本间有多态性的引物SSR51、SSR229、SSR-Z60检测分离群体中的高秆、矮秆单株，进行验证，结果在分离群体单株中呈现与亲本检测一致的差异条带(图3，图4)。根据上述定位的结果设计14对InDel标记，1对标记InDel6、InDel12在亲本间具有多态(图5)。

三、玉米株高基因的精细定位

利用上述多态性SSR、InDel标记检测BC群体，分析BC群体的基因型，结合表型数据，最终将玉米株高基因精细定位到分子标记InDel6和SSR229之间，物理距离约148kb。玉米株高基因精细定位的结果，为后续株高基因的克隆奠定了基础。

实施例2

应用株高紧密连锁InDel6和SSR229标记检测多份高秆、矮秆材料

(1)选取58份高秆材料、62份矮秆材料。

(2)分别提取120份材料基因组DNA，使用InDel6和SSR229标记进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。InDel6在58份高秆材料、62份矮秆材料的结果，基因型与表现型一致(如图6)。SSR229在58份高秆材料、62份矮秆材料的结果，基因型与表现型一致(如图7)。

(3)上述两个InDel6和SSR229标记可以将高秆材料与矮秆材料区分开。

Claims (5)

1.与玉米株高紧密连锁的InDel6和SSR229标记，其特征在于，两个标记的名称分别为InDel6和SSR229。

2.一对用于检测如权利要求1所述的InDel6和SSR229标记的引物，其特征在于，包括InDel6的引物对：

正向引物5′-TGTGGACGTGACACGCTT-3′，

反向引物5′-TCAGCCTTCGTCCACAGAC-3′，

SSR229的引物对：

正向引物5′-GGGTCTTTCGCTGAATAACACT-3′，

反向引物5′-CAACCCTCACTACTAAAGCCGA-3′。

3.一种如权利要求1所述的InDel6和SSR229分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对高秆和矮秆高世代回交群体BC₆进行株高的表型鉴定；

(2)采用玉米55K SNP芯片、集团分离分析BSA的方法，对混池、单株DNA进行基因型检测，完成玉米株高基因的初步SNP定位；

(3)根据基因初步定位的结果，结合玉米重测序的结果，在初步定位的基因区域开发InDel标记InDel6、SSR标记SSR229，并设计对应的InDel引物InDel6、SSR引物SSR229；

(4)利用设计的InDel、SSR引物，筛选在两个亲本、高秆和矮秆混池间呈现多态性的引物，利用多态性的引物对BC、F₂群体进行基因型鉴定；

(5)根据InDel、SSR分子标记基因型鉴定的结果，鉴定交换单株，分析所发展分子标记与株高基因的连锁程度，发掘紧密连锁的分子标记。

4.如权利要求1所述的InDel6、SSR229标记在玉米株高分子标记辅助育种中的应用。

5.如权利要求4所述的InDel6、SSR229标记在玉米株高分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用发展的分子标记，对BC、F₂群体每个株系进行基因型鉴定；

(2)利用上述(1)中BC、F₂群体基因型鉴定的结果，根据鉴定结果，对单株进行高秆、矮秆分类，对表型分析的结果进行鉴定和验证。