CN104152450B - 与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel‑MLO1，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。本发明的InDel分子标记具有高稳定性，可以简便、快速、高通量的应用于黄瓜苗期白粉病抗性单株的辅助筛选；根据SEQ ID NO.5与SEQ ID No.6所示，由插入/缺失突变造成的抗性候选基因DNA长度的差异，还可以设计多对共显性的InDel标记作为白粉病抗性筛选的分子标记。本发明的InDel标记为白粉病抗性的分子标记辅助育种奠定了基础，这将大大加快黄瓜白粉病抗性分子育种的进程。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术，具体涉及与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生草本蔓生攀缘植物。原产喜马拉雅山南麓的印度北部地区，我国已有2000多年的栽培历史，是黄瓜的次生起源中心。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一，其作为重要的蔬菜作物历来备受育种家的重视。
近年，随着设施栽培面积的不断扩大，可以反季节栽培，周年生产，黄瓜产量大幅度增加，满足了市场的需求。但是，由于从露地生产到设施栽培，条件发生了改变，尤其南方地区高温多湿气候，在提高产量和品质的同时，病害随之加重，其中白粉病是最为严重的病害之一。黄瓜白粉病是由专性寄生菌(Podosphaera xanthii)引起的真菌病害，可在黄瓜整个生育期得病，尤其在生长中后期发病严重，使植株提早拉秧，造成严重的经济损失。大量增施农药，不但导致环境污染、农药残留、食品安全等问题，而且还会导致白粉病菌产生新的小种抗性，从而增加防治难度和种植户生产成本。要从根本上解决这些问题，必须从源头做起，培育优质抗病黄瓜新品种，以满足种植者和消费者的需求，保护生态环境。
常规的抗性育种费时费力，需要经历多代回交和杂交的过程；病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大；黄瓜白粉病抗性一般为隐性，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入；这些都增加了培育黄瓜抗病品种的难度。分子育种可以大大加速抗病育种进程，显著缩短育种周期。现代生物技术的迅猛发展，为抗病育种开辟了新的途径，利用生物技术培育抗病品种已成为目前的热点。分子育种的前提是获得相关性状的功能基因或与其紧密连锁的分子标记。利用分子标记分析体系，在遗传群体上鉴定抗病遗传规律，定位和克隆白粉病抗性基因，研究其功能和抗性的分子调控机制，可以为黄瓜抗性基因的分子标记辅助育种及分子设计育种提供理论依据。利用与抗病基因紧密连锁或共分离的分子标记，开展分子标记辅助选择育种，可将多个抗病基因整合到一个品种，显著提高育种效率，缩短育种时间，而且大幅度提高了抗病的力度和持久性，这对于培育出满足种植者需求的黄瓜抗病新品种具有重要意义。
虽然黄瓜白粉病的发生比较普遍和严重，但是关于其抗性基因定位和克隆的研究较为薄弱，目前仅仅停留在主效基因/QTL定位的初级阶段，尚未找到与白粉病抗性基因/QTL共分离的标记，更不用说基因的分离及抗病机理的深入研究。由于很多研究揭示黄瓜白粉病抗性由多个隐性基因控制，因此诸多育种工作者对其进行了QTL分析。Sakata等利用97株的黄瓜抗感重组自交系群体，在2006年首次定位了黄瓜白粉病抗性的QTL，检测到6个与温度相关的QTL，其中一个在LGII上的主效QTL在20℃和26℃下均表现出抗性。Liu等(2008a)利用构建的黄瓜F2:3家系进行了QTL定位，共检测到5个白粉病抗性QTL，分布于连锁群1、2、5上，单个QTL的贡献率介于3.4％～45％之间；同时，通过重组自交系共检测到4个白粉病抗性QTL，分别位于连锁群1、2、4、6上，单个QTL的贡献率介于5.2％～21.0％之间(Liuet al.，2008b)。沈丽平(2009)以高抗白粉病黄瓜品种JIN5和高感白粉病黄瓜品种D8构建的F2群体检测到位于第3连锁群上控制黄瓜白粉病抗性的2个QTL，贡献率为7.6％和13.5％。张圣平等(2011)利用抗感亲本组合的F2和F2:3家系共检测到4个白粉病抗性的QTL。Fukino等(2013)以重组自交系为研究对象，在染色体1、3、4、5、6上共检测到9个QTL，单个QTL的贡献率介于5％～44％之间，其中4个位点的效应得到了证实。He等(2013)利用F2:3家系对黄瓜下胚轴、子叶和真叶的白粉抗性同时进行了QTL分析，检测到6个QTL，分别位于1、3、4、5号染色体上，其中2个主效QTL位于5号染色体的40cM的区间内，下胚轴抗性QTL对黄瓜白粉抗性起到了最重要的作用。
上述多数研究表明，黄瓜白粉病抗性是多个基因控制的复杂性状，而且抗性基因的作用方式表现为隐性遗传，这些因素无疑地增加了其精细定位与克隆的难度。由于黄瓜白粉病对黄瓜生产影响很大，虽然对黄瓜白粉病抗性基因的定位研究较多，但是还没有精细定位及基因克隆的相关报道。目前已获得的连锁标记遗传距离较远，不利于分子标记辅助育种的开展，阻碍了抗病品种分子育种的进程。因此，寻找与黄瓜白粉病抗性基因/QTL紧密连锁、共分离的分子标记，对其进行精细定位与克隆，这不仅为其抗病分子育种提供良好的技术支撑，也为揭开黄瓜白粉病抗性的分子机制奠定基础。
发明内容
本发明的目的，在于克服黄瓜白粉病抗性育种难度大的问题，提供一个基于黄瓜白粉病抗性候选基因开发的与白粉主效基因/QTL共分离的共显性InDel分子标记，并且此标记利用琼脂糖凝胶电泳可以清晰的显示出差异，方便应用于白粉病抗性分子辅助育种。本发明找到一个控制黄瓜白粉病抗性的候选基因CsMLO1，并通过生物信息学、测序比对等分析得到了初步确认。通过亲本间测序发现抗病亲本中的一个1449bp的插入突变造成了CsMLO1的功能缺失，从而导致了其抗病性状。利用此插入/缺失突变，我们开发了一个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的InDel分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
本发明是通过以下技术方案实现的：一个与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel-MLO1，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离。
所述InDel-MLO1由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物扩增得到。
所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述感病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列；两者之间存在一个1449bp的插入/缺失突变造成了基因的功能丧失，根据此插入/缺失突变，可以设计多个诸如InDel-MLO1与白粉病抗性共分离的共显性InDel分子标记。
上述SEQ ID NO.1为InDel-MLO1在抗病亲本扩增的序列，由2213个核苷酸组成；SEQ ID NO.2为InDel-MLO1在感病亲本扩增的序列，由764个核苷酸组成。经过来自世界各地的抗病、感病自交系的分子检测分析，抗病自交系均扩增出2213bp大小的条带，而感病自交系均扩增出764bp大小的条带。通过回交分离群体分析，此标记与白粉病抗性主效QTL共分离。因此，此共显性的InDel标记有利于白粉病抗性育种的分子标记辅助体系的建立，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
上述上游引物和下游引物由上海生工合成。
本发明在白粉病抗性主效基因/QTL进行精细定位的基础上，通过对候选区间的一个候选基因进行分析，找到一个控制黄瓜白粉病抗性的候选基因CsMLO1，由序列表中SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成，分别由抗病亲本和感病亲本对候选基因测序获得；通过生物信息学、测序比对等分析，此候选基因得到了初步确认。通过序列比对发现抗病亲本中的一个1449bp的插入突变造成了CsMLO1的功能缺失，从而导致了其抗病性状。利用此插入/缺失突变，我们开发了一个与黄瓜白粉病抗性主效QTL共分离的InDel分子标记InDel-MLO1，并且可以根据此插入/缺失突变设计多个诸如InDel-MLO1与白粉病抗性共分离的共显性InDel分子标记。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：传统的抗性育种费时费力，需要通过多代回交和杂交的过程。病害发生需要专门的病圃进行接种鉴定，且受环境影响较大。黄瓜白粉病抗性一般为隐性，回交育种过程中需要每代自交以确认隐性抗性的渗入。由于白粉病菌为专性活体寄生真菌，且抗性鉴定时容易导致育种单株的死亡，这些因素都增加了白粉病抗性育种的周期和难度。本发明的共分离InDel分子标记为共显性，能够区分纯合子和杂合子，在黄瓜苗期即可鉴定植株的基因型，省去了回交渗入过程中每代自交的步骤；此InDel标记条带差异大，用0.8％琼脂糖凝胶电泳即可清晰地区分基因型，用它来跟踪抗性基因，既准确又省时省力，可用于黄瓜白粉病抗性的分子标记辅助育种，加速黄瓜白粉病抗性育种的进程。同时此共分离标记将促进白粉病抗性QTL/基因的分离，为白粉病抗性形成的分子机制的深入研究奠定基础。
附图说明
图1是候选基因CsMLO1与其同源基因的氨基酸序列系统发育进化树分析。大麦、拟南芥、番茄、豌豆、玉米、甜瓜的白粉抗性同源基因与CsMLO1聚类在一起。
图2是分子标记InDel-MLO1在不同的抗、感自交系的琼脂糖凝胶电泳效果。抗病自交系都为2213bp大小的条带，感病自交系都为764bp大小的条带；M代表Marker DL2000。
图3是分子标记InDel-MLO1在回交分离群体的琼脂糖凝胶电泳效果。图中所示，S05为感病亲本，S1003为抗病亲本，F1代表杂交一代；R和S分别代表回交分离群体中随机挑选的抗病和感病植株的检测结果；M代表Marker DL2000。
具体实施方式
一、黄瓜白粉病抗性候选基因的鉴定
1、白粉病抗性候选基因的确定
根据黄瓜抗、感组合的F2群体进行BSA和初步的QTL分析得出，在第五染色体的长臂末端找到一个主效QTL pm5.1。为了精细定位并克隆这个主效QTL，以抗病亲本S1003为受体亲本，感病亲本S05为供体亲本，结合MAS通过多代回交后自交，我们构建了仅主效QTLpm5.1区域分离的回交群体BC3F1，BC2F2。通过对这2个回交分离群体进行白粉病抗性鉴定分析发现，此抗性QTL已经转化为单盂德尔因子，即单基因控制，且抗病为隐性遗传。通过主效QTL区域开发的分子标记对回交分离群体的1077个单株进行连锁分析，结果将抗病基因精细定位到SSR标记UW065021与UW065094之间。这两个标记同时存在于已经公布的黄瓜品种9330基因组序列Scaffold000038和黄瓜品种Gy14基因组序列Scaffold02978中(http:// cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gy14-9930/index.html)，物理距离分别为164kb和170kb。
通过Gy14的基因组网站(http://www.phytozome.net/cucumber.php)和9930的基因组网站(http://cucumber.genomics.org.cn)对候选区间的基因进行预测分析，并通过FGENESH(http://sunl.softberry.com)进行验证。通过这些基因的功能注释，我们发现一个编码跨膜蛋白的负调控基因CsMLO1。其在拟南芥和大麦中的同源基因赋予了其白粉病的光谱、持久抗性；其在番茄、豌豆、甜瓜、玉米中的同源基因同样赋予了白粉病的抗性。在其它候选基因的功能注释中未发现与白粉病抗性有任何关联。因此，我们初步认为CsMLO1为白粉病抗性的候选基因。
2、候选基因CsMLO1的测序分析
为确认CsMLO1为白粉病抗性的候选基因，我们对多个抗、感白粉病的黄瓜自交系进行了测序分析。其中抗病自交系有：S1003、S06、S02、WI2757、Gy14、SB-2和83G；感病自交系有：S05、53、Truelemon和Straight Eight。
利用9930和Gy14中CsMLO1的同源参考序列设计测序引物，保证每个测序引物的扩增序列有100-150bp的重叠，用于DNA片段的拼接。利用Takara公司的高保真长片段扩增酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行PCR扩增，产品号为Code No.R050A。PCR的反应体系为：基因组DNA 10 ng，引物0.2μmol/L，200μmol/L dNTPs，1×缓冲液，1.25 U GXL DNA聚合酶，总反应体系为50μL。扩增程序为：30-35cycles，98℃10s；60℃15s；68℃2min。在PCR产物中加入goldview荧光染料3ul，4℃下放置10min让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收；其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat.No.SK1132。将回收产物与测序引物一并送到上海桑尼生物有限公司进行相关序列的测定。
根据测序结果显示，抗病自交系CsMLO1的等位基因序列都为SEQ ID NO.5所示的5413bp的序列，而感病自交系CsMLO1的等位基因序列都为SEQ ID NO.6所示的3966bp的序列。通过FGENESH(http://sunl.softberry.com)对CsMLO1进行基因预测，这个基因具有15个外显子，14个内含子。利用DNAMAN软件对抗、感序列进行比对，我们发现在第11个外显子上，抗病序列有一个1449bp的大片段插入造成了基因的突变并导致此基因功能的丧失，这与白粉病的隐性抗性遗传模式相对应。这种情况与大麦和拟南芥中的MLO基因类似，其感病基因的功能丧失导致了隐性的抗病表型。因此，这进一步证实了CsMLO1为黄瓜白粉病的抗性基因。
3、系统发育进化树分析验证
为进一步确认CsMLO1为白粉病抗性的候选基因，我们使用NCBI网站的BLAST搜索引擎(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对CsMLO1同源基因的氨基酸序列进行了搜索，找到了大麦、拟南芥、番茄、豌豆、甜瓜、玉米的同源氨基酸序列。使用DNAMAN软件进行了系统发育进化树分析，步骤如下：使用蛋白比对功能，采用默认参数，先进行氨基酸序列的多序列比对；在比对结果出来后使用Phylogenetic Tree功能分析系统发育进化树，参数使用Observed diverggency和toss gaps。通过系统发育进化树分析发现，我们找到的白粉病抗性候选基因CsMLO1与大麦、拟南芥、番茄、豌豆、玉米、甜瓜的白粉抗性同源基因聚类在一起(参见图1)。在单子叶植物大麦、玉米和双子叶植物拟南芥、番茄，豌豆中，CsMLO1的这些同源基因都对白粉病起到了高抗甚至免疫的抗性。由于进化上的同源性和功能保守性，CsMLO1作为其在双子叶植物黄瓜的同源基因可能也对白粉病抗性起到至关重要的作用，这对CsMLO1作为黄瓜白粉病的抗性候选基因提供了进一步的证据。
二、基于黄瓜白粉病抗性候选基因的InDel标记的开发与鉴定
1、多个抗、感自交系的验证
根据前述不同亲本测序的结果，白粉病抗、感自交系CsMLO1的等位基因存在1449bp的插入/缺失突变，我们根据此突变设计了InDel标记来进一步确认CsMLO1为白粉病抗性基因。根据这个插入/缺失突变，我们利用Primer3.0引物设计软件在突变的两侧设计正反向引物。为了使得设计的InDel标记成为共显性标记，在琼脂糖凝胶电泳分析时可以清晰地区分抗、感差异条带以及纯合子和杂合子，又不至于使差异太大或太小，我们尽量让抗性亲本的扩增条带在2000-2500bp，从而感病亲本的扩增条带在550-1050bp。这样设计出来的标记在琼脂糖凝胶电泳的条带就为共显性，条带差异也容易统计、区分。根据此原则，我们成功设计了一个InDel标记，命名为InDel-MLO1。由于片段较长，我们使用的长片段扩增酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR的反应体系为：基因组DNA5ng，引物0.2μmol/L，200μmol/L dNTPs，1×缓冲液，0.25 U GXLDNA聚合酶，总反应体系为10μL。扩增程序为：30cycles，98℃10s；60℃15s；68℃150s。扩增后的PCR产物加入2ul6×荧光上样缓冲液，混匀后使用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，100V电压，12min，然后进行凝胶紫外成像。
利用此InDel标记技术，我们对包括定位亲本在内的来自世界不同地区的抗、感自交系进行了电泳分析验证。其中抗病自交系有：中国的S1003、S95，以色列的S06、S02，欧洲的H35、SB-2，美洲的WI2757、Gy14、83G，韩国的M3，共10个抗病黄瓜自交系；感病自交系有：中国的S1001、S52、S110、316、Gl、gl、S51，以色列的S05，韩国的M12，美洲的53、Truelemon，野生型黄瓜Hardwikia，共12个感病黄瓜自交系。结果显示，在抗病自交系中只扩增出来2213bp大的片段，而感病自交系只扩增出来764bp小的片段(参见图2)，因此，这个InDel标记可以用来筛选不同的抗、感品种。
2、群体共分离验证
为了证明InDel标记InDel-MLO1是否与白粉病抗性基因存在连锁关系，我们利用1109株的回交分离群体对此标记进行了群体连锁分析验证。结果显示，在群体中与抗病亲本有一致带型的单株表现为抗病，与感病亲本有一致带型的植株为感病，杂合带型的植株也为感病(参见图3)。此结果说明：此标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子；标记与白粉病抗性共分离。
如图3所示，电泳条带清晰稳定，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳12min即可显示出片段差异。所以，此InDel标记具有稳定、快速和使用方便的优点，同时可以清晰地区分纯合子和杂合子。本发明的分子标记可应用于黄瓜苗期白粉病抗、感单株的辅助筛选，为白粉病抗性的分子标记辅助育种奠定了基础，这将大大加快黄瓜白粉病抗性分子育种的进程。
此外，根据抗、感自交系CsMLO1等位基因的1449bp的插入/缺失突变，我们还可以由CsMLO1的基因序列在突变位点的两侧设计更多的共显性标记或者显性标记，用于分子标记辅助育种。
Claims (2)
1.一个与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel-MLO1，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQID NO.1所示的核苷酸序列片段与抗病基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与感病基因共分离；
所述抗病基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述感病基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
由候选基因在多个黄瓜抗病自交系中测序得到SEQ ID NO.5所示序列，由候选基因在多个黄瓜感病自交系中测序得到SEQ ID NO.6所示序列；两者之间存在一个1449bp的插入/缺失突变造成了基因的功能丧失，根据此插入/缺失突变，还可以设计多个诸如InDel-MLO1与白粉病抗性共分离的共显性InDel分子标记。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜白粉病抗性主效基因共分离的InDel分子标记，其特征在于，所述InDel-MLO1由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物扩增得到。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Nie Jingtao Inventor after: Cai Run Inventor after: Qu Meiling Inventor after: Chen Long Inventor after: Pan Junsong Inventor after: He Huanle Inventor before: Nie Jingtao Inventor before: Cai Run Inventor before: Pan Junsong Inventor before: He Huanle Inventor before: Qu Meiling |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: NIE JINGTAO CAI RUN PAN JUNSONG HE HUANLE QU MEILING TO: NIE JINGTAO CAI RUN QU MEILING CHEN LONG PAN JUNSONG HE HUANLE |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170315 Termination date: 20190819 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |