CN108913809A - 抗稻瘟病基因Pid3-A4的InDel分子标记物、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病功能基因Pid3‑A4的InDel分子标记物，包括InDel分子标记物PA4‑C，InDel分子标记物PA4‑C用于从水稻材料中鉴定并筛选出在编码区前1815位碱基处存在一段9bp缺失的功能基因Pid3‑A4的水稻材料；9bp缺失序列为：CCCTGAAGA。通过该功能性分子标记可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有Pid3‑A4功能基因以及其纯合状态，可应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，获得含Pid3‑A4功能基因的抗稻瘟病水稻品种。

Description

抗稻瘟病基因Pid3-A4的InDel分子标记物、检测方法及应用

技术领域

本发明涉及水稻抗稻瘟病基因筛选领域，特别地，涉及一种抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物。此外，本发明还涉及一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的检测方法及应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病是影响水稻产量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达10％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。相较于化学防治稻瘟病，推广含有抗病基因的水稻品种是既经济又环保的。但由于单一抗性基因通常会因为大面积种植，3～5年时间就丧失抗性，因此聚合更多的抗病基因，或者有针对性配置含有对应的抗病基因的水稻品种是目前应对稻瘟病危害的主要手段。

分子标记辅助选择以其简单可靠的操作性，对稻瘟病基因的应用发挥了重要作用。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的30个左右，主要包括Pib、Pi-ta、Pi9、Piz-t、Pi2、Pid2、Pi36、Pi37、Rbr2、Pik-m、Pi5、Pid3、Pi21、Pit、Pb1、Pish、Pik-p、Pik、Pia、Pi54、Pi25、Pi1、Pi50、Pi54rh，Pigm等(国家水稻数据库中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。

抗稻瘟病基因Pid3最初是通过比较籼稻和粳稻全基因组编码NBS-LRR蛋白基因等位间假基因化差异，利用假基因化标记在地谷中克隆的(Shang J.,et al.Identificationofa new rice blast resistance gene,Pid3,by genomewide comparison of pairednucleotide-binding site--leucine-rich repeat genes andtheirpseudogeneallelesbetweenthe two sequencedrice genomes.Genetics,2009,182(4):1303-1311)。利用同源克隆策略，从普通野生稻A4中克隆了具有不同抗谱的同源基因Pid3-A4(Lv etal.,Functional analysis of Pid3-A4,an ortholog of rice blast resistance genePid3revealed by allele mining in common wild rice.Phytopathology,2013,103(6):594-599.)。

研究表明Pid3-A4基因相较于Pid3基因，其抗谱更广，特别是对四川地区的稻瘟病菌菌株表现出更好的抗性，因此其在水稻生产上具有重要的利用价值。目前尽管Pid3基因有一些通过分子标记的利用(董瑞霞等，分子标记辅助选择改良水稻不育系臻达A及其杂交种的稻瘟病抗性.植物遗传资源学报,2017,18(03):573-586.)，但针对Pid3-A4基因的分子标记还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种稻瘟病基因Pid3-A4的InDel分子标记物、检测方法及应用，以解决现有技术中分子标记检测程序复杂，准确率低，成本高，只适用于特定亲本间杂交后代的辅助检测的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，包括InDel分子标记物PA4-C，InDel分子标记物PA4-C用于从水稻材料中鉴定并筛选出在编码区前1815位碱基处存在一段9bp缺失的功能基因Pid3-A4的水稻材料；9bp缺失序列为：CCCTGAAGA。

进一步地，InDel分子标记物PA4-C包括引物PA4-CF和引物PA4-CR，其序列分别为：引物PA4-CF：CACATGTGCTAATGGTGGATTAAAC，引物PA4-CR：AGCCGTGTAATTAGGTAGGTCA。

根据本发明的另一方面，还提供了一种检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法，利用上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物对抗稻瘟病功能基因Pid3-A4进行检测。

进一步地，包括以下步骤：提取水稻样品基因组DNA；利用InDel分子标记物PA4-C对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，PCR扩增产物为一条212bp标记片段，标志水稻样品基因组存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4，其它不含Pid3-A4功能基因的水稻样品扩增出一条221bp标记片段。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，InDel分子标记物的用于鉴定水稻植株染色体中的Pid3-A4基因是纯合型还是杂合型。

进一步地，包括以下步骤：提取水稻植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C对水稻植株的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测；PCR扩增产物是212bp的单一标记片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为纯合型；PCR扩增产物是包含一个212bp片段和一个221bp片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为杂合型。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在特定亲本选育抗稻瘟病水稻中的应用，包括以下步骤：将携带稻瘟病功能基因Pid3-A4的水稻抗稻瘟病品种或其衍生系与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；提取获得群体中单个植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在种质资源选育抗稻瘟病水稻中的应用，包括以下步骤：将供试水稻材料的单个植株提取基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，InDel分子标记物用于水稻聚合多抗病基因材料育种。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，通过比较水稻抗稻瘟病Pid3-A4功能基因和其他等位基因间的DNA序列，在Pid3-A4功能基因启动子区确定了一个特有的缺失多态性，并开发了基于PA4-C引物组合PA4-CF/PA4-CR的功能标记。通过该功能性分子标记可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有Pid3-A4功能基因以及其纯合状态，可应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，获得含Pid3-A4功能基因的抗稻瘟病水稻品种。

2、本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，标记位于Pid3-A4基因编码区前1815位置，在遗传上与Pid3-A4抗病性呈共分离，选择效率达到100％。

3、本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物是一种共显示标记，准确性高、重复性好，并且能够区分出杂合体和纯合体，可以快速获得具有纯合Pid3-A4功能基因的抗稻瘟病水稻植株。

4、本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，具有选择目标明确，选择效率高以及节约成本的优势。在常规水稻抗病育种中，一般是根据育种材料在苗期或抽穗期所表现出来的抗瘟性状进行选择，其受环境影响较大，不同年份间差别也较大，筛选鉴定的可靠性低。常规方法应用于聚合多抗病基因材料育种尤其受限制。其原因在于不同抗病基因间存在一定的抗谱重叠性，常规表型筛选到的材料并不一定同时聚合多抗性基因。本发明提供的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，可以在苗期取样，提取水稻植株DNA，通过PCR快速鉴定出携带Pid3-A4功能基因单株，能够有效控制育种群体规模，显著节约育种筛选成本。通过结合应用其它抗病基因标记，Pid3-A4功能分子标记还能应用于水稻聚合多抗病基因育种，提高水稻抗稻瘟病株系选择效率。

5、本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，不仅可以准确应用于分子标记辅助选择，同时对种质资源中含有Pid3-A4基因的材料筛选也具有更高的准确性，适用范围更广。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明优选实施例的部分水稻品种Pid3-A4等位基因编码区后的序列分析；

图2是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记位点示意图；

图3是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C的PCR扩增后的电泳示意图；

图4是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C检测中国水稻材料示意图；以及

图5是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C检测美国水稻材料示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

图1是本发明优选实施例的部分水稻品种Pid3-A4等位基因编码区后的序列分析；图1是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记位点示意图；图2是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C的PCR扩增后的电泳示意图；图3是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C检测中国水稻材料示意图；图4是本发明优选实施例的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物PA4-C检测美国水稻材料示意图。

如图2所示，本发明的优选实施例提供了一种抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，包括InDel分子标记物PA4-C，InDel分子标记物PA4-C用于从水稻材料中鉴定并筛选出在编码区前1815位碱基处存在一段9bp缺失的功能基因Pid3-A4的水稻材料；9bp缺失序列为：CCCTGAAGA，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，通过比较水稻抗稻瘟病Pid3-A4功能基因和其他等位基因间的DNA序列，在Pid3-A4功能基因启动子区确定了一个特有的缺失多态性，并开发了基于PA4-C引物组合PA4-CF/PA4-CR的功能标记。通过该功能性分子标记可以准确检测不同水稻品种的基因组中是否含有Pid3-A4功能基因以及其纯合状态，可应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，获得含Pid3-A4功能基因的抗稻瘟病水稻品种。

上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，标记位于Pid3-A4基因编码区前1815位置，在遗传上与Pid3-A4抗病性呈共分离，选择效率达到100％。

上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物是一种共显示标记，准确性高、重复性好，并且能够区分出杂合体和纯合体，可以快速获得具有纯合Pid3-A4功能基因的抗稻瘟病水稻植株。

上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，具有选择目标明确，选择效率高以及节约成本的优势。在常规水稻抗病育种中，一般是根据育种材料在苗期或抽穗期所表现出来的抗瘟性状进行选择，其受环境影响较大，不同年份间差别也较大，筛选鉴定的可靠性低。常规方法应用于聚合多抗病基因材料育种尤其受限制。其原因在于不同抗病基因间存在一定的抗谱重叠性，常规表型筛选到的材料并不一定同时聚合多抗性基因。本发明提供的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，可以在苗期取样，提取水稻植株DNA，通过PCR快速鉴定出携带Pid3-A4功能基因单株，能够有效控制育种群体规模，显著节约育种筛选成本。通过结合应用其它抗病基因标记，Pid3-A4功能分子标记还能应用于水稻聚合多抗病基因育种，提高水稻抗稻瘟病株系选择效率。

上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，不仅可以准确应用于分子标记辅助选择，同时对种质资源中含有Pid3-A4基因的材料筛选也具有更高的准确性，适用范围更广。

从数据库Rice SNP-Seek Database(http://snp-seek.irri.org/)和RiceVariation Map v2.0(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/)中下载Pid3基因(LOC_Os06g22460)编码区及前后2000bp包含的所有SNP和InDel信息。通过分析2621份水稻材料中Pid3位点序列变异，发现该位点基因编码区不含有插入/缺失突变，只存在少许SNP变异。因此把目标区段扩展到Pid3基因编码区周围序列，Pid3基因编码序列物理位置为水稻第6号染色体上13055253～13058027。通过序列对比，在Pid3编码区5’端起始密码子前1815位碱基处发现Pid3-A4功能基因与其他等位基因相比，存在一段9bp的缺失，9bp缺失序列为：CCCTGAAGA。统计发现在鉴定出来的9份Pid3-A4单倍型中，都含有这一缺失片段，然而在所有其他单倍型材料中都不存在这一缺失，基于这一缺失变异可以设计Pid3-A4功能基因特异的InDel分子标记。

本实施例中，InDel分子标记物PA4-C包括引物PA4-CF和引物PA4-CR，其序列分别为：

引物PA4-CF：CACATGTGCTAATGGTGGATTAAAC，如SEQ ID NO：1所示，

引物PA4-CR：AGCCGTGTAATTAGGTAGGTCA，如SEQ ID NO：2所示。

根据上述Pid3-A4功能基因编码区上游与其他等位基因相应位点分析结果，设计了一对特异性引物组合引物PA4-CF和引物PA4-CR，引物PA4-CF：CACATGTGCTAATGGTGGATTAAAC，引物PA4-CR：AGCCGTGTAATTAGGTAGGTCA。PA4-CF/PA4-CR引物组合特异性对应Pid3-A4功能基因编码区前1653～1873序列，扩增片段包括了Pid3-A4功能基因编码区前1815位碱基处的特异性缺失位点。

根据本发明的另一方面，还提供了一种检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法，利用上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物对抗稻瘟病功能基因Pid3-A4进行检测。相比于现有Pid3-A4基因相关分子标记，上述检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法更简便、准确、经济。筛选出更容易利用的携带Pid3-A4基因的抗病供体材料，为Pid3-A4基因的利用奠定了基础。

如图1和图2所示，本实施例中，包括以下步骤：提取水稻样品基因组DNA；利用InDel分子标记物PA4-C对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，PCR扩增产物为一条212bp标记片段，标志水稻品基因组存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4，其它不含Pid3-A4功能基因的水稻样品扩增出一条221bp标记片段。PCR反应体系：含50ng/μL基因组DNA2μL，5μmol/L前后引物各1μL，2×PCRMix 10μL，灭菌双蒸补足至20μL；PCR反应条件如下：94℃下预变性5min；94℃下20s，57℃下20s，72℃下20S，共35个循环；72℃下再延伸5min。反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。测试结果表明，含有Pid3-A4功能基因的地谷样本显示一条212bp条带，携带其他Pid3等位基因品种的样本显示一条221bp的条带，两者差异可以在3.5％琼脂糖凝胶中明显区分开。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，InDel分子标记物的用于鉴定水稻植株染色体中的Pid3-A4基因是纯合型还是杂合型。上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物是一种共显示标记，准确性高、重复性好，并且能够区分出杂合体和纯合体，可以快速获得具有纯合Pid3-A4功能基因的抗稻瘟病水稻植株。

本实施例中，包括以下步骤：提取水稻植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C对水稻植株的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测；扩增产物是212bp的单一标记片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为纯合型；扩增产物是包含一个212bp片段和一个221bp片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为杂合型。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在特定亲本选育抗稻瘟病水稻中的应用，包括以下步骤：将携带稻瘟病功能基因Pid3-A4的水稻抗稻瘟病品种或其衍生系与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；提取获得群体中单个植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物可以广泛的应用到特定亲本选育抗稻瘟病水稻中。优选地，筛选普通野生稻A4和特定水稻材料中相应等位基因的分子标记。应用于筛选水稻杂交转育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的选育效率，有效控制育种群体规模，显著节约育种筛选的成本，获得含Pid3功能基因的康稻瘟病水稻品种。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在种质资源选育抗稻瘟病水稻中的应用，包括以下步骤：将供试水稻材料的单个植株提取基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。

如图4和图5所示，利用PA4-CF/PA4-CR引物组合对30个我国水稻育种常用亲本材料：黄华占、蜀恢527、蜀恢498、R900、远恢2号、华占、绵恢725、明恢63、丰源A、天丰A、炳1A、五丰A、粤泰A、C815S、Y58S、深08S、培矮64S、隆科638S、广占63-4S、金23A、珍汕97A、威20A、桂99、CDR22、辐恢838、IR24、空育130、稻花香2号、合江19号、武运粳7号)和189份美国水稻微核心种质资源(Hongru,Wang,Filipe,Garrett,Vieira,Yunhua,Xiao,Zhikang,Wang,Rasmus.The Power of Inbreeding:NGS-Based GWAS of Rice Reveals ConvergentEvolution during Rice Domestication.Molecular Plant,2016,9(7):975-985.)基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增的反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。测试结果表明，在我国30份常用水稻材料中未能检测到Pid3-A4基因的存在，在美国微核心种质311100中含有Pid3-A4功能基因。

根据本发明的另一方面，还提供了一种包括上述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，InDel分子标记物用于水稻聚合多抗病基因材料育种。提高水稻抗稻瘟病株系选择效率。

实施例

(1)Pid3的功能基因序列标记性结构筛选

从数据库Rice SNP-Seek Database(http://snp-seek.irri.org/)和RiceVariation Map v2.0(http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/)中下载Pid3基因(LOC_Os06g22460)编码区及前后2000bp包含的所有SNP和InDel信息。

如图1和图2所示，通过分析2621份水稻材料中Pid3位点序列变异，发现该位点基因编码区不含有插入/缺失突变，只存在少许SNP变异。因此把目标区段扩展到Pid3基因编码区周围序列，Pid3基因编码序列物理位置为水稻第6号染色体上13055253～13058027。通过序列对比，在Pid3编码区5’端起始密码子前1815位碱基处发现Pid3-A4功能基因与其他等位基因相比，存在一段9bp的缺失，9bp缺失序列为：CCCTGAAGA。统计发现在鉴定出来的9份Pid3-A4单倍型中，都含有这一缺失片段，然而在所有其他单倍型材料中都不存在这一缺失，基于这一缺失变异可以设计Pid3-A4功能基因特异的InDel分子标记。

(2)抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的制备

依据上述Pid3-A4功能基因特异的InDel分子标记，设计了抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，包括引物PA4-CF和引物PA4-CR，其序列分别为：

引物PA4-CF：CACATGTGCTAATGGTGGATTAAAC

引物PA4-CR：AGCCGTGTAATTAGGTAGGTCA。

(3)建立检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法

收集供试水稻材料幼嫩叶片，利用CTAB法提取野生稻A4、地谷、93-11、日本晴幼嫩叶片的基因组DNA进行PCR扩增；

PCR反应体系：含50ng/μL基因组DNA2μL，5μmol/L引物PA4-CF和引物PA4-CR各1μL，2×PCR Mix10μL，灭菌双蒸补足至20μL；PCR反应条件如下：94℃下预变性5min；94℃下20s，57℃下20s，72℃下20s，共35个循环；72℃下再延伸5min。PCR反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

如图3所示，在3.5％琼脂糖凝胶中明显区分开，含有Pid3-A4单倍型水稻材料野生稻A4中扩增出一条212bp的核苷酸片段1，而其他含有Pid3其他的等位基因的单倍型的地谷、93-11、和日本晴中扩增出一条221bp的核苷酸片段2，序列如下所示：

片段1：212bp

agccgtgtaattaggtaggtcacccatctagttttaattagacaaccaaccctatttagtttgcgaaataaaaatttttgggtgtcacgtcggacgtttgataggatgtcggaagggttttcggacacgaataaaaaaactaatttcataactcgcttggaaaccgcgagacgaatcttttgagcctaattaatccaccattagcacatgtg

片段2：221bp:

cacatgtgctaatggtggattaattaggcccaaaagattcgtcttgcggtttccaagcgagttatgaaattagtttttttattcgtgtccgaaaacccttccgacatcctatcaaacgtccgacgtgacacccaaaaatttttatttcgcgaactaaacaggccctgaagagttggttgtctaattaaaactagatgggtgacctacctaattacacggct

验证试验

(1)选择水稻材料

采用30个我国水稻育种常用亲本材料：黄华占、蜀恢527、蜀恢498、R900、远恢2号、华占、绵恢725、明恢63、丰源A、天丰A、炳1A、五丰A、粤泰A、C815S、Y58S、深08S、培矮64S、隆科638S、广占63-4S、金23A、珍汕97A、威20A、桂99、CDR22、辐恢838、IR24、空育130、稻花香2号、合江19号、武运粳7号和189份美国水稻微核心种质资源(Hongru,Wang,Filipe,Garrett,Vieira,Yunhua,Xiao,Zhikang,Wang,Rasmus.The Power of Inbreeding:NGS-Based GWAS of Rice Reveals Convergent Evolution during RiceDomestication.Molecular Plant,2016,9(7):975-985.)的材料，提取基因组DNA。

(2)InDel分子标记物的PCR扩增及电泳鉴定

InDel分子标记物的PCR扩增与实施例中(3)操作相同。

Pid3等位基因编码区扩增及测序：PCR反应体系含50ng/pL基因组DNA2μL，5μmol/L前后引物各1μL，引物序列如下所示：

引物Pid3SF：AGTAACACCCAAGGATAGGATAG，如SEQ ID NO：4所示，

引物Pid3SR：GAACGACAAGTGCGACATGATTG，如SEQ ID NO：5所示；

高保真酶KOD缓冲液及dNTP。PCR反应条件如下：94℃下预变性5min；94℃下30s，57℃下30s，68℃下3min，共30个循环。反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离后送擎科公司测序。

Pid3等位基因表达分析：与InDel分子标记物的PCR扩增操作相似，选择内参基因为ACTIN，扩增反应26个循环，Pid3等位基因RT-PCR检测循环数为34，所用引物序列如下所示：

引物Pid3CF：TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC，如SEQ ID NO：6所示，

引物Pid3CR：ACGTCACAAATCATTCGCTC，如SEQ ID NO：7所示。

如图4所示，对我国常用的30份水稻育种材料检测结果显示，在我国30份常用水稻材料中未能检测到Pid3-A4基因的存在，与Pid3-A4基因来自普通野生稻，在栽培稻中极少存在的情况相吻合。

如图5所示，对美国水稻微核心种质(USDARice Minicore Collection)中的189份材料进行了检测，结果显示，PA4-C在189份微核心种质中只检测到一份材料311100存在缺失，表明311100中含有Pid3-A4功能基因。说明Pid3-A4基因在美国微核心种质中也是极少分布的。限于篇幅，仅提供部分核心种质资源的电泳结果图5。

对筛选的水稻材料：311100中Pid3等位编码序列进行了克隆测序；结果显示311100中的Pid3等位基因与Pid3-A4单倍型序列完全相同，说明建立检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法是准确的。

图3泳道：M、marker，1-4分别为核心种植材料野生稻A4，地谷，93-11，日本晴。

图4泳道：M、marker，A4、野生稻A4，Digu、地谷，1-15分别为核心种植材料黄华占，蜀恢527，蜀恢498、R900，远恢2号，华占，绵恢725，明恢63，丰源A，天丰A，炳1A，五丰A，粵泰A，C815S，Y58S。

图5泳道：M、marker，A4、野生稻A4，Digu、地谷，美国水稻核心种植材料。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 抗稻瘟病基因Pid3-A4的InDel分子标记物、检测方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacatgtgct aatggtggat taaac 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccgtgtaa ttaggtaggt ca 22

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

ccctgaaga 9

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtaacaccc aaggatagga tag 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaacgacaag tgcgacatga ttg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactactcat ggaagctagt tctc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgtcacaaa tcattcgctc 20

Claims (9)

1.一种抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，其特征在于，

包括InDel分子标记物PA4-C，所述InDel分子标记物PA4-C用于从水稻材料中鉴定并筛选出在编码区前1815位碱基处存在一段9bp缺失的功能基因Pid3-A4的水稻材料；

所述9bp缺失序列为：CCCTGAAGA。

2.根据权利要求1所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物，其特征在于，

所述InDel分子标记物PA4-C包括引物PA4-CF和引物PA4-CR，其序列分别为：

引物PA4-CF：CACATGTGCTAATGGTGGATTAAAC，

引物PA4-CR：AGCCGTGTAATTAGGTAGGTCA。

3.一种检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物对抗稻瘟病功能基因Pid3-A4进行检测。

4.根据权利要求3所述的检测抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取水稻样品基因组DNA；

利用InDel分子标记物PA4-C对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增产物进行电泳检测，所述PCR扩增产物为一条212bp标记片段，标志所述水稻样品基因组存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4，其它不含Pid3-A4功能基因的水稻样品扩增出一条221bp标记片段。

5.一种权利要求1或2所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，其特征在于，所述InDel分子标记物的用于鉴定水稻植株染色体中的Pid3-A4基因是纯合型还是杂合型。

6.根据权利要求5所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的的应用，其特征在于，包括以下步骤：

提取水稻植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C对所述水稻植株的基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增产物进行电泳检测；

所述PCR扩增产物是212bp的单一标记片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为纯合型；

所述PCR扩增产物是包含一个212bp片段和一个221bp片段，标志着水稻植株染色体中的Pid3-A4基因为杂合型。

7.一种权利要求1或2所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在特定亲本选育抗稻瘟病水稻中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将携带稻瘟病功能基因Pid3-A4的水稻抗稻瘟病品种或其衍生系与其他水稻品种杂交或回交并繁衍后代群体；

提取获得群体中单个植株的基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，所述PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。

8.一种权利要求1或2所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物在种质资源选育抗稻瘟病水稻中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将供试水稻材料的单个植株提取基因组DNA，用InDel分子标记物PA4-C进行PCR扩增，所述PCR扩增出一个212bp的标记片段，标志检测水稻植株存在抗稻瘟病功能基因Pid3-A4。

9.一种权利要求1或2所述的抗稻瘟病功能基因Pid3-A4的InDel分子标记物的应用，其特征在于，InDel分子标记物用于水稻聚合多抗病基因材料育种。