CN113789403A - 一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的技术体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族(Pid‑2,Pid‑3,Pid‑4)等位基因的技术体系。该技术体系由3套自成体系的“功能性单倍型‑抗病等位基因”等二级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定。该技术体系可用于稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的鉴定及挖掘，具有系统而严谨的包容性及可比较性，可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理布局并延长其使用寿命。

Description

一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因 家族等位基因的技术体系

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，更具体地，涉及一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族(Pid-2,Pid-3,Pid-4)等位基因的技术体系。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是水稻生产最严重的障碍之一，每年都造成大量的粮食损失。从环境保护及农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗病育种依赖于对育种材料抗性表型的直接鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差。特别地，抗病基因之间由于基因互作而发生抗谱重叠、覆盖等问题，同类目标基因聚合的表型直接选择效率很低甚或不可能。随着分子标记鉴定技术的发展，其准确、可靠且不受环境影响等优点使该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在植物育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记，对目标基因进行选择可靠性高，由此大大加快了育种工作的目的性及效率。

一般地，在寄主植物抗病基因与病原菌无毒基因漫长的‘军备竞赛’过程中，抗病基因以进化成本最低的“复等位基因家族”(multiple-allele family)或“基因簇”(genecluster)的形式，产生新的抗病特异性才能跟上无毒基因快速变异的步伐。也就是说，在病原菌长期而强烈的选择压力下，上述‘基因家族’一般地产生功能性/非功能性的单倍型(haplotype)分化；如果是在育种计划中长期使用的广谱持久抗性‘基因家族’，在功能性单倍型中会进一步分化为具有不同抗病特异性的等位基因(allele；Zhai et al.2011,NewPhytologist,189:321-334)。

在上述“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级进化历程中都存在明显而清晰的核苷酸多态性，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)以及多核苷酸多态性【即基因组分化区域(diverged genomic region)，以及插入/缺失，(Insertion/Deletion,InDel)】。在此，将功能基因内部的核苷酸多态性统称为功能性核苷酸多态性。由此一方面，不同抗源品种鉴定到的抗病基因经常聚集于同一基因家族中，另一方面，广谱持久抗源品种通常在多个基因家族中同时存在功能性的抗病基因。以稻瘟病抗病基因为例，在目前报道的100余个主效基因中，据信至少40％是已知基因的等位基因甚或同一基因；这些基因主要聚集于水稻染色体1(Pi37家族)，2(Pib家族)，6(Pi2/Pi9以及Pid家族)，8(Pi36家族)，9(Pii家族)，11(Pik家族)以及12(Pita家族)等基因家族中(Sharma et al.2012,Agricultural Research,1:37-52；Liu and Wang 2016,National Science Review,3:295-308)。

如上所述，位于染色体6着丝粒附件约7Mb区域的Pid基因家族，其中包含Pid-2,Pid-3,Pid-4等3个基因(下同)，是在全球水稻，特别是籼稻抗病育种计划中应用最广泛的抗源之一(Chen et al.2006,The Plant Journal,46:794-804；Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311；Chen et al.2018,Journal of Genetics and Genomics,45:663-672)。为了把上述广泛利用的抗源基因利用于水稻抗病育种计划中，科研工作者先后开发了一系列的分子标记【Pid2-specific^GT2058AT/GC (Chen et al.2006,The PlantJournal,46:794-804)；Pid3-specific^C2209T,Pid3-dCAPS1^T2209C,Pid3-dCAPS2^C2209T (Shanget al.2009,Genetics,182:1303-1311；Promchuay et al.2017,Journal of AdvancedAgricultural Technologies,4:209-214)；Pid4-GAP(Chen et al.2018,Journal ofGenetics and Genomics,45:663-672)】以提高其利用效率(下划线为所用标记)。

源于广西广谱持久抗病地方品种地谷的Pid基因家族是在中国水稻抗病育种计划中，被南北稻作区长期且广泛利用的抗源(Chen et al.2006,The Plant Journal,46:794-804；Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311；Chen et al.2018,Journal ofGenetics and Genomics,45:663-672)，在稻瘟病菌持续而强烈的选择压力下，在“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级进化层面都产生了复杂而多样的变异。但是，这些研究成果都没有形成具有可操作性的、能广泛应用于生产实践的技术体系。换言之，上述报道的5个分子标记都是针对特定基因的特定位点而零散开发的，因此不具有清晰的可比性及逻辑性，更不具有包容性。对于复杂的基因组区域、复杂的基因家族而言，由此产生3个突出而现实的问题是：(1)任何没有基于其进化层次而设计的分子标记都难以鉴别在复杂的基因组区域、复杂的基因家族容易产生测序错误等问题；(2)任何没有基于其进化层次而设计的分子标记都难以避免因分子标记的技术局限性而产生标记假阳性的问题(特定片段/位点相同并不代表供试品种就含有与目标基因完全一致的基因)；(3)任何没有基于其进化层次而设计的分子标记都难以构成一个具有包容性及可比性的技术体系而在复杂基因家族中不断地挖掘、鉴定并命名新基因，以及鉴别在复杂基因家族中容易产生的“同名异质基因”以及“真假目标基因”等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族(Pid-2,Pid-3,Pid-4)等位基因的技术体系。该技术体系由3套自成体系的“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定。具体包括：

(1)本发明的第二目的是提供一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系。其中包括：

(a)提供Pid-2基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法。

(b)提供Pid-2基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-DIG的特异性分子标记及其鉴定方法。

(c)提供Pid-2基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-ZS的特异性分子标记及其鉴定方法。

(d)提供上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的应用及实例。

(e)利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。

(2)本发明的第三目的是提供一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系。其中包括：

(f)提供Pid-3基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法。

(g)提供Pid-3基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-DIG的特异性分子标记及其鉴定方法。

(h)提供Pid-3基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-TTP的特异性分子标记及其鉴定方法。

(i)提供Pid-3基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-ZS的特异性分子标记及其鉴定方法。

(j)提供上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的应用及实例。

(k)利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。

(3)本发明的第四目的是提供一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系。其中包括：

(l)提供Pid-4基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法。

(m)提供Pid-4基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-DIG的特异性分子标记及其鉴定方法。

(n)提供Pid-4基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-NPB的特异性分子标记及其鉴定方法。

(o)提供Pid-4基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-SN的特异性分子标记及其鉴定方法。

(p)利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid4抗病等位基因家族的技术体系从目标基因未知的稻种资源中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pid4-CO的应用及实例。

(q)提供上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的应用及实例。

(r)利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。

本发明实现上述目的的技术方案同权利要求书和具体实施例中所记载。

本发明提供的技术体系可用于稻瘟病Pid抗病基因家族(Pid-2,Pid-3,Pid-4)等位基因的鉴定及挖掘，具有系统而严谨的包容性及可比较性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理布局并延长其使用寿命。

附图说明

图1.一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族(Pid-2,Pid-3,Pid-4)等位基因之技术体系开发及应用的路线图。

图2.Pid-2抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

2a.已克隆的Pid2-DIG【供体品种地谷(Digu)；Chen et al.2006,The PlantJournal,46:794-804】在美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)的基因登录号(GenBank)为：FJ915121.1；为了便于序列比对分析，加入了9个推测为功能基因携带者的测序参考品种蜀恢498(Shuhui 498)，特特普(Tetep),93-11,CO39,明恢63(Minghui 63,MH),珍汕97(Zhenshan 97,ZS),Tadukan,IR8,IR64；以及5个推测为非功能基因携带者的测序参考品种日本晴(Nipponbare,NPB),Koshihikari,沈农265(Shennong 265),绥粳18(Suijing 18,SJ18),一见钟情(Hitomebore,HTM)相应的基因组序列；

2b.所有已经验证的单倍型及目标基因的特异性SNP都已经编号(按标记使用顺序)并绿色标注(详见图2～5)。

SNP及标记编号说明：由于本发明将三套技术体系合并一组，因此编号以目标基因为前缀而编号，如d2-1,d3-2,d4-1，如此类推；我方标记，绿色标示；他方标记(比较标记)，浅蓝色标示(全文同)。

特别地，由于上述15条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图3～5全面地了解Pid-2抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

图3.Pid-2抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用

3a～b:2个单倍型特异性的最优SNP；

3c:2个最优的单倍型特异性标记【#d2-1,Pid2-F/N^C1022T,#d2-2,Pid2-F/N^A1383G；皆为：上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】对8个Pid-2参考品种的鉴定实例；其中，

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Tetep；CK3,CO39；CK4,Zhenshan 97；CK5,Tadukan；

非功能性单倍型品种：CK6,Nipponbare；CK7,Koshihikari；CK8,Shennong265；M,DL-500；

标记说明I：F/N，功能性(functional)/非功能性(non-functional)；C1022T，位于1022位点的SNP(下同)。

参考品种说明：三套技术体系所用的参考品种相同，但是编号因目标基因而异，因此以目标基因为前缀而命名，如Pid-2参考品种，如此类推。

图4.Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-DIG特异性分子标记的开发及应用

4a:1个Pid2-DIG特异性的最优SNP；

4b:1个Pid2-DIG特异性标记【#d2-3,Pid2-DIG^T2058C(上带，目标基因；下带，非目标基因)】对8个Pid-2参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK1,Digu(Pid2-DIG)；

非目标基因品种：CK2,Tetep(Pid2-ZS)；CK3,CO39(Pid2-ZS)；CK4,Zhenshan 97(Pid2-ZS)；CK5,Tadukan(Pid2-ZS)；CK6,Nipponbare(Pid2-Null)；CK7,Koshihikari(Pid2-Null)；CK8,Shennong265(Pid2-Null)。

标记说明II：基因符号为斜体，表示目标基因；基因符号为正体，表示标记；以Pid2-DIG^T2058C为例，意为目标基因Pid2-DIG之特异性标记，上标则为其特异性SNP，如此类推；

特别地，同一套参考品种的信息，如非必要，以下恕不赘述。

图5.Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-ZS特异性分子标记的开发及应用

5a:1个Pid2-ZS特异性的最优SNP；

5b:1个Pid2-ZS特异性标记【#d2-4,Pid2-ZS^A555G(上带，目标基因；下带，

非目标基因)】对8个Pid-2参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK2,Tetep(Pid2-ZS)；CK3,CO39(Pid2-ZS)；CK4,Zhenshan97(Pid2-ZS)；CK5,Tadukan(Pid2-ZS)；

非目标基因品种：其余4个Pid-2参考品种。

图6.本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例

6a1～3:本发明之技术体系对8个Pid-2参考品种的鉴定，结果表明，CK1～5为功能性单倍型品种，CK6～8为非功能性单倍型品种；其中，CK1为Pid2-DIG携带者；CK2～5为Pid2-ZS携带者；

6b:他方标记技术(#d2-5；Chen et al.2006,The Plant Journal,46:794-804)对8个Pid-2参考品种的鉴定，结果表明，与本发明的#d2-3标记相似，能够鉴别Pid2-DIG携带者，但是不能鉴别Pid2-ZS携带者；技术上，我方#d2-3标记为精确的小片段标记，检测方式更加简易、快捷。

结论：本发明之技术体系具有无比的优越性。

8个Pid-2参考品种的信息如上所述。

图7.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例。其中，

7a:2个Pid-2功能性单倍型特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV1～30,CV43,CV45,CV50,CV52等34个品种为功能性单倍型品种；CV31～42,CV44,CV46～49,CV51,CV53～60等26个品种为非功能性单倍型品种；

7b:1个Pid2-DIG功能特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV1,CV3,CV9～10,CV12～13,CV20～22,CV24,CV29,CV45,CV50,CV52等14个品种为Pid2-DIG携带者；

7c:1个Pid2-ZS功能特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV2,CV4～5,CV7～8,CV11,CV15～19,CV23,CV25～28,CV30,CV43等18个品种为Pid2-ZS携带者；

7a～c:综合上述结果，CV6,CV14等2个供试品种呈现与所有2个Pid-2抗病等位基因都不同的基因型，由此推断为新型Pid-2抗病等位基因的携带者(紫色)；

其中，6个资源鉴定参考品种为，CK1,Digu(Pid2-DIG)；CK2,Tetep(Pid2-ZS)；CK3,ZS97(Pid2-ZS)；CK4,Nipponbare(Pid2-Null)；CK5,Shennong265(Pid2-Null)；CK6,CO39(Pid2-ZS)(下同，恕不赘述)；

特别地，单倍型与等位基因的检测分别以独立的色彩标示(下同)。

图8.Pid-3抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

8a:已克隆的Pid3-DIG【供体品种地谷(Digu)；Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311】之GenBank：FJ745364.1；为了便于序列比对分析，加入了9个推测为功能基因携带者的测序参考品种特特普(Tetep),Tadukan,CO39,93-11,明恢63(Minghui 63,MH),珍汕97(Zhenshan 97,ZS),蜀恢498(Shuhui 498)，IR8,IR64；以及5个推测为非功能基因携带者的测序参考品种日本晴(Nipponbare,NPB),一见钟情(Hitomebore,HTM),绥粳18(Suijing18,SJ18),沈农265(Shennong265),Koshihikari相应的基因组序列；

8b:所有已经验证的单倍型及目标基因的特异性SNP都已经编号(详见图8～12)。

特别地，由于上述15条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图9～12全面地了解Pid-3抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

图9.Pid-3抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用

9a～b:2个单倍型特异性的最优SNP；

9c:2个最优的单倍型特异性标记【#d3-1,Pid3-F/N^G2009A,#d3-2,Pid3-F/N^C2209T；皆为：上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】对8个Pid-3参考品种的鉴定实例；其中，

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Tetep；CK3,Tadukan；CK4,Zhenshan97；CK5,CO39；

非功能性单倍型品种：CK6,Nipponbare；CK7,Shennong 265；CK8,Koshihikari。

图10.Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-DIG特异性分子标记的开发及应用

10a～b:2个Pid3-DIG特异性的最优SNP；

10c:2个Pid3-DIG特异性标【#d3-3,Pid3-DIG^G775A,#d3-4,Pid3-DIG^G2695A；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因】对8个Pid-3参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK1,Digu(Pid3-DIG)；

非目标基因品种：CK2,Tetep(Pid3-TTP)；CK3,Tadukan(Pid3-TTP)；CK4,Zhenshan97(Pid3-ZS)；CK5,CO39(Pid3-ZS)；CK6,Nipponbare(Pid3-Null)；CK7,Shennong265(Pid3-Null)；CK8,Koshihikari(Pid3-Null)。

图11.Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-TTP特异性分子标记的开发及应用

11a～b:2个Pid3-TTP特异性的最优SNP；

11c:2个Pid3-TTP特异性标记【#d3-5,Pid3-TTP^C1136T,#d3-6,Pid3-TTP^C1623G；

皆为：上带，目标基因；下带，非目标基因】对8个Pid-3参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK2,Tetep(Pid3-TTP)；CK3,Tadukan(Pid3-TTP)；

非目标基因品种：其余6个Pid-3参考品种。

图12.Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-ZS特异性分子标记的开发及应用

12a:2个Pid3-ZS特异性的最优SNP；

12b:2个Pid3-ZS特异性标记【#d3-7,Pid3-ZS^G477A；上带，目标基因；下带，非目标基因；#d3-8,Pid3-ZS^C525T；上带，非目标基因；下带，目标基因】对8个Pid-3参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK4,Zhenshan 97(Pid3-ZS)；CK5,CO39(Pid3-ZS)；

非目标基因品种：其余6个Pid-3参考品种。

图13.本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例

13a1～4:本发明之技术体系对8个Pid-3参考品种的鉴定，结果表明，CK1～5为功能性单倍型品种，CK6～8为非功能性单倍型品种；其中，CK1为Pid3-DIG携带者；CK2～3为Pid3-TTP携带者；CK4～5为Pid3-ZS携带者；

13b1:他方标记技术I(Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311)对8个Pid-3参考品种的鉴定，结果表明，与本发明之#d3-2标记相似，可以鉴别功能性/非功能性单倍型品种，但是不能进一步鉴别3个抗病等位基因；

13b2:他方标记技术II(Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311；Promchuayet al.2017,Journal of Advanced Agricultural Technologies,4:209-214)对8个Pid-3参考品种的鉴定，结果表明，#d3-10及#d3-11与#d3-9标记一样，都是针对同一SNP，因此也与本发明之#d3-2标记相似，可以鉴别功能性/非功能性单倍型品种，但是不能进一步鉴别3个抗病等位基因；

结论：他方标记技术仅仅针对同一SNP，由此产生“同名异质”基因的问题。因此，本发明之技术体系具有无比的优越性。

图14.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例。其中，

14a:2个Pid-3单倍型特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV1～30,CV43,CV45,CV50,CV52等34个品种为功能性单倍型品种；CV31～42,CV44,CV46～49,CV51,CV53～60等26个品种为非功能性单倍型品种；

14b:2个Pid3-DIG特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV1,CV12,CV45等3个品种为Pid3-DIG携带者；

14c:2个Pid3-TTP特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV2等1个品种为Pid3-TTP携带者；

14d:2个Pid3-ZS特异性最优标记对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV3～11,CV13，CV15～30,CV43,CV50,CV52等29个品种为Pid3-ZS携带者；

14a～d:综合上述结果，CV14呈现与所有3个Pid-3抗病等位基因都不同的基因型，由此推断为新型Pid-3抗病等位基因的携带者(紫色)；

其中，6个资源鉴定参考品种如上所述。

图15.Pid-4抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

15a:已克隆的Pid4-DIG【供体品种地谷(Digu)；Chen et al.2018,Journal ofGenetics and Genomics,45:663-672】之GenBank：MG839283.1；为了便于序列比对分析，加入了6个推测为功能基因携带者的测序参考品种，蜀恢498(Shuhui498)，绥粳18(Suijing18,SJ18),日本晴(Nipponbare,NPB),Koshihikari,一见钟情(Hitomebore,HTM),沈农265(Shennong 265),以及6个推测为非功能基因携带者的测序参考品种，特特普(Tetep),珍汕97(Zhenshan 97,ZS),93-11,明恢63(Minghui63,MH),IR8,IR64相应的基因组序列；

15b:所有已经验证的单倍型及目标基因的特异性SNP都已经编号(详见图15～19)。

特别地，由于上述13条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图16～19全面地了解Pid-4抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

图16.Pid-4抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用

16a～b:2个单倍型特异性的最优SNP；

16c:2个最优的单倍型特异性标记【#d4-1,Pid4-F/N^C1217G；上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)；#d4-2,Pid4-F/N^A1452G；上带，功能性单倍型(红色)；下带，非功能性单倍型(黑色)】对8个Pid-3参考品种的鉴定实例；其中，

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Nipponbare；CK3,Koshihikari；CK4,CO39；CK5,Shennong 265；

非功能性单倍型品种：CK6,Tadukan；CK7,Tetep；CK8,Zhenshan 97。

图17.Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-DIG特异性分子标记的开发及应用

17a～b:2个Pid4-DIG特异性的最优SNP；

17c:2个Pid4-DIG特异性标记【#d4-3,Pid4-DIG^A1149T,#d4-4,Pid4-DIG^A1898G；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因】对8个Pid-4参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK1,Digu(Pid4-DIG)；

非目标基因品种：CK2,Nipponbare(Pid4-NPB)；CK3,Koshihikari(Pid4-NPB)；CK4,CO39(Pid4-CO)；CK5,Shennong 265(Pid4-SN)；CK6,Tadukan(Pid4-Null)；CK7,Tetep(Pid4-Null)；CK8,Zhenshan 97(Pid4-Null)；

特别地，CK1及CK4对应Pid4-DIG^A1149T的基因型相同，因此，2个Pid4-DIG特异性标记都是目标基因之基因型时才能推断为目标基因携带者。

图18.Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-NPB特异性分子标记的开发及应用

18a～b:2个Pid4-NPB特异性的最优SNP；

18c:2个Pid4-NPB特异性标记【#d4-5,Pid4-NPB^G1362A,#d4-6,Pid4-NPB^C1554A；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因】对8个Pid-4参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK2,Nipponbare(Pid4-NPB)；CK3,Koshihikari(Pid4-NPB)；

非目标基因品种：其余6个Pid-4参考品种。

图19.Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-SN特异性分子标记的开发及应用

19a:2个Pid4-SN特异性的最优SNP组合；

19b:2个Pid4-SN特异性标记组合【#d4-7,Pid4-SN^T1841A；上带，目标基因；下带，非目标基因；#d4-8,Pid4-SN/CO^C2250G；上带，目标基因；下带，非目标基因】对8个Pid-4参考品种的鉴定实例，其中，

目标基因品种：CK5,Shennong 265(Pid4-SN)；

非目标基因品种：其余7个Pid-4参考品种。

图20.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病家族等位基因的技术体系从测序不完整的参考品种CO39中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pib-CO的应用及实例

20a:参考品种CO39之目标基因分别位于2个contig(CO39_1(LQHE01001432.1)和CO39_2(LQHE01041962.1)的末端而导致其目标基因序列不完整；

20b:2个Pid-4功能性单倍型特异性最优标记(#d4-1，上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型；#d4-2，上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型)对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，CK4(CO39)为功能性单倍型品种；

20c:2个Pid4-DIG功能特异性最优标记(#d4-3及#d4-4；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因)对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，虽然CK1与CK4于标记Pid4-DIG^A1149T的基因型相同，但是于标记Pid4-DIG^A898G的基因型不同，因此，CK4为非Pid4-DIG携带者；

20d:2个Pid4-NPB功能特异性最优标记(#d4-5及#d4-6；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因)对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，CK4为非Pid4-NPB携带者；

20e:2个Pid4-SN功能特异性最优标记组合(#d4-7及#d4-8；皆为：上带，目标基因；下带，非目标基因)对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，虽然CK4与CK5于标记Pid4-SN/CO^C2259G的基因型相同，但是于标记Pid4-SN^T1841A的基因型不同，因此，CK4为非Pid4-SN携带者；

综合20a～e的结果推断，CK4(CO39)含有新型的Pid4抗病等位基因Pid4-CO。

图21.本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例

21a1～4:本发明之技术体系对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，CK1～5为功能性单倍型品种，CK6～8为非功能性单倍型品种；其中，CK1为Pid4-DIG携带者；CK2～3为Pid4-NPB携带者；CK4为Pid4-CO携带者；CK5为Pid3-SN携带者；

21b:他方标记(Chen et al.2018,Journal of Genetics and Genomics,45:663-672)对8个Pid-4参考品种的鉴定，结果表明，CK1与CK5的基因型相同而为一组，CK2～3及CK5～8之2种基因型则为另外2组。由此既分不清目标基因Pid3-DIG与Pid4-SN的携带者，也分不清Pid4-NPB与Pid3-CO的携带者；

结论：本发明之技术体系具有无比的优越性

图22.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例。其中，

22a:2个Pid-4功能性单倍型特异性最优标记【#d4-1，上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)；#d4-2，上带，功能性单倍型(红色)；下带，非功能性单倍型(黑色)】对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV2,CV3,CV8～12,CV14,CV20-～21,CV29～44,CV46～51,CV53～CV60等40个品种为功能性单倍型品种；CV1,CV3,CV5～7,CV3,CV5～19,CV22～28,CV45,CV52等20个品种为非功能性单倍型品种；

22b:2个Pid4-DIG功能特异性最优标记【#d4-3及#d4-4；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因(红色)】对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV9等1个品种为Pid4-DIG携带者；

22c:2个Pid4-NPB功能特异性最优标记【#d4-5及#d4-6；皆为：上带，非目标基因；下带，目标基因(蓝色)】对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV31,CV34～35,CV39,CV47,CV53～54,CV58～60等11个品种为Pid4-NPB携带者；

22d:2个Pid4-SN功能特异性最优标记组合【#d4-7及#d4-8；皆为：上带，目标基因(绿色)；下带，非目标基因】对60个供试品种的鉴定，结果表明，CV2,CV12,CV14,CV32～33,CV40～41,CV44,CV46,CV48～49,CV51等14个品种为Pid4-SN携带者；

22a～d:综合上述结果，发现CV4,CV8,CV11,CV43,CV56～57等6个品种呈现与CK6完全相同的基因型，由此推断为Pid4-CO携带者；同样地，CV10,CV20～21,CV29～30,CV42,CV50,CV55等8个品种呈现与所有4个Pid-4抗病等位基因都不同的基因型，由此推断为新型Pid-4抗病等位基因的携带者(紫色)；

其中，6个资源鉴定参考品种如上所述。

图23.本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的技术体系之二级标记。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为可从商业途径得到的试剂和材料。

在实施例中所用的所有水稻品种：8个第一套参考品种(Pid-2参考品种，Pid-3参考品种，Pid-4参考品种)及6个第二套参考品种(资源鉴定参考品种)(如上所述)；以及供试品种CV1～60皆为申请人实验室收集、保存，并在本研究领域中常用且已在包括但不限于上述文献中公开【Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321-334,https://nph.onlinelibrary.wiley.com；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics125:1047-1055,https://www.springer.com/journal/122；叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)；附件图表可在各自杂志网站获得】。

本发明开发及应用的技术路线图如图1所示。

实施例1:稻瘟病Pid-2抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图2～5)

一、实验方法

利用已克隆的Pid2-DIG(GenBank FJ915121.1)的基因组序列(ATG～TGA)，从上述NCBI等公共数据库中检索并下载另外9个推测为功能基因携带者的测序参考品种，蜀恢498(Shuhui 498)，特特普(Tetep),93-11,CO39,明恢63(Minghui63,MH),珍汕97(Zhenshan97,ZS),Tadukan,IR8,IR64；为了便于序列比对分析，加入了5个推测为非功能基因携带者的测序参考品种，日本晴(Nipponbare,NPB),Koshihikari,沈农265(Shennong 265),绥粳18(Suijing 18,SJ18),一见钟情(Hitomebore,HTM)相应的基因组序列。

各个基因ATG～TAG的范围参考NCBI注释。

通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

二、实验结果

序列比较结果如图2～6所示，结果表明：

(1)Pid-2抗病基因家族的序列虽然分化变异不大，但是存在明显的功能性单倍型(上述10个抗病参考品种之10条参考序列)与非功能性单倍型(上述5个感病参考品种之5条参考序列)的基因组分化(典型位置如图3之标记#d2-1及#d2-2所示)；

(2)上述Pid-2抗病基因家族之功能基因之间则存在各自特异性SNP(典型位置如标记图4～5之标记#d2-3～#d2-4所示)；

此外，由于上述15条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图3～5全面地了解Pid-2抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

实施例2：Pid-2抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图3)

一、实验方法

此实施例的实验方法主要参考申请人已发表的论文(Yuan et al.2011,TheorAppl Genet 122:1017-1028；Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321-334；Hua etal.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047-1055)。

【以下参考文献与上述的相同，恕不赘述】。

简述之：

(1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述Pid-2抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为单倍型特异性分子标记Pid2-F/N^C1022T(#d2-1标记)及Pid2-F/N^A383G(#d2-2标记)。简言之，根据CAPS及dCAPS(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences；Neff et al.2002,Trends in Genetics18:613-615)标记的设计原理，先利用在线软件dCAPSFinder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行CAPS及dCAPS标记的引物设计；然后利用引物设计软件Primer Primer 5.0进行标记设计的确认；

【以下分子标记及引物设计程序与上述的相同，恕不赘述】。

引物序列如下：

对于#d2-1标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

SEQ ID NO.1(Pid2-F/N^C1022T-F；5’-3’)：

ACAGTTCCGGCAGACTCTTGTGACAT；

SEQ ID NO.2(Pid2-F/N^C1022T-R；5’-3’)：

AGTTTGCAAACGAGCCGAGGGTC。

对于#d2-2标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

SEQ ID NO.3(Pid2-F/N^A383G-F；5’-3’)：

GGAATACAACTCGTTTCGCATCT；

SEQ ID NO.4(Pid2-F/N^A383G-R；5’-3’)：

CTATGATAGCCAAAGTTACGCG。

(2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述2组引物对上述8个Pid-2参考品种进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

【以下PCR扩增体系与上述的相同，恕不赘述】

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行30～40个循环(一般为35循环，视检测对象可适当调整)的PCR扩增【94℃变性30sec，退火30sec(#d2-1/62℃，#d2-2/56℃)，72℃延伸25～30sec(视检测对象可适当调整)】，最后72℃延伸5min，PCR产物置于4℃冰箱保存备用。

【除了退火温度之外，以下PCR扩增条件与上述的相同，恕不赘述】

取出上述PCR产物，分别利用限制性内切酶Taq I(#d2-1)及Mlu I(#d2-2)进行酶切，反应体系(10.0μL)如下：

在37℃条件下酶切5小时后，向上述每管酶切产物中加入10μL 10x loading并混匀，按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍照、记录。

【以下PCR扩增产物酶切体系(酶切温度一般为37℃，特别标注除外)及分子标记检测程序与上述的相同，恕不赘述】

二、实验结果

各个分子标记的大小如图3所示，结果表明，8个Pid-2参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Tetep；CK3,CO39；CK4,Zhenshan 97；CK5,Tadukan；

非功能性单倍型品种：CK6,Nipponbare；CK7,Koshihikari；CK8,Shennong265。

实施例3：Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-DIG特异性分子标记的开发及应用(图4)

一、实验方法

(1)Pid2-DIG特异性分子标记的设计：根据上述Pid-2抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的1个SNP设计为Pid2-DIG特异性分子标记Pid2-DIG^T2058C(#d2-3标记)；

引物序列如下：

对于#d2-3标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.5(Pid2-DIG^T2058C-F；5’-3’)：

AGTTGATGACCAGGGAGCAGA；

SEQ ID NO.6(Pid2-DIG^T2058C-R；5’-3’)：

CCTTCCTCCAGCTTCTTGAA。

(2)Pid2-DIG特异性分子标记的检测：利用上述一对引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d2-3/58℃)，对8个Pid-2参考品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，利用限制性内切酶Hha I，按照上述实验程序进行酶切并进行电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图4所示，结果表明，Pid2-DIG特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK1,Digu(Pid2-DIG)；

非目标基因品种：其余7个Pid-2参考品种。

实施例4：Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-ZS特异性分子标记的开发及应用(图5)

一、实验方法

(1)Pid2-ZS特异性分子标记的设计：根据上述Pid-2抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的1个SNP设计为Pid2-ZS特异性分子标记Pid2-ZS^A555G(#d2-4标记)；

引物序列如下：

对于#d2-4标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.7(Pid2-ZS^A555G-F；5’-3’)：

GCCACCTCTATGCAACTACTG；

SEQ ID NO.8(Pid2-ZS^A555G-R；5’-3’)：

ACCAGACAGAAGAGTGTCTGC。

(2)Pid2-ZS特异性分子标记的检测：利用上述一对引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d2-4/53℃)，对8个Pid-2参考品种进行PCR扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。

取出上述PCR产物，利用限制性内切酶Hpa I，按照上述实验程序进行酶切并进行电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图5所示，结果表明，Pid2-ZS特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK2,Tetep(Pid2-ZS)；CK3,CO39(Pid2-ZS)；CK4,Zhenshan97(Pid2-ZS)；CK5,Tadukan(Pid2-ZS)；

非目标基因品种：其余4个Pid-2参考品种。

实施例5：本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例(图6)

(1)如上所述，虽然稻瘟病Pid-2抗病基因家族是在全球水稻抗病育种计划中应用最广泛的广谱持久抗源之一，但是，迄今开发、应用的分子标记仅一个Pid2-specific^GT2058AT/GC(Chen et al.2006,The Plant Journal,46:794-804)；

SEQ ID NO.44(Pid2-specific^GT2058AT/GC-F；5’-3’)

TTGGCTATCATAGGCGTCC；

SEQ ID NO.45(Pid2-specific^GT2058AT/GC-R；5’-3’)

ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA。

(2)以上述标记作为他方标记技术，以8个Pid-2参考品种为检测对象进行鉴定比较(图6)。结果表明，本发明之技术体系与他方标记技术相比,具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

(a)首先，利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(图6a1)。在该实例中，在供试的8个Pid-2参考品种中，CK1～5被鉴定为功能性单倍型品种，CK6～8则为非功能性单倍型品种。这是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

(b)在此基础上，利用二级标记进行抗病等位基因分析，为各个抗病等位基因的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(图6a2～3)。在该实例中，分别为2个抗病等位基因(Pid2-DIG,Pid2-ZS)遴选了1个最优的特异性标记，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。这也是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一。具体之：

我方技术体系:如上所述，本发明之技术体系由一套“功能性单倍型-抗病等位基因”等4个二级检测标记组成，由此在清晰地鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，精准地鉴别2个抗病等位基因(Pid2-DIG,Pid2-ZS)。

他方标记技术:对8个Pid-2参考品种的鉴定，结果表明，与本发明的#d2-3标记相似，能够鉴别Pid2-DIG携带者，但是不能鉴别Pid2-ZS携带者，由此产生的问题是，Pid2-ZS携带者把误判为非功能性目标基因携带者。

结论：本发明之技术体系具有无法比拟的创新性、严谨性及有益效果。

实施例6：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例(图7)

一、实验方法

(1)本发明之Pid-2技术体系由“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级检测标记之4个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而后续的各个抗病等位基因的检测则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图3～5；实施例2～4)，恕不赘述(下同)。

特别地，原则上非功能性单倍型供试品种可以排除于后续的抗病等位基因检测。在本案例中为了保持检测效果的整齐可比性，供试品种群体整体保留而进行了抗病等位基因的检测。

(2)利用上述技术体系对60个随机选择的稻种资源【CV1～60；Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321-334；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047-1055；叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)】进行Pid-2抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

上述6个目标基因确定的资源鉴定参考品种作为对照也参加了试验。

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆技术(Zhai et al.2011,NewPhytologist,189:321-334；Hua et al.2012,Theor Appl Genet 125:1047-1055)，分离克隆新型的抗病等位基因、测序并登录于GenBank。

特别地，按照GenBank的规则，所有被登录的基因序列都进行了基因注释(annotation)，以保证其完整性及可通读性，因而是功能性基因。

二、实验结果

(1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，60个供试品种被分类为(图7a；红色标示，功能性单倍型；黑色标示，非功能性单倍型)：

功能性单倍型品种：CV1～30,CV43,CV45,CV50,CV52等34个品种；

非功能性单倍型品种：CV31～42,CV44,CV46～49,CV51,CV53～60等26个品种。

(2)在基于2个二级标记的抗病等位基因检测中，34个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

目标基因Pid2-DIG携带品种(图7b；红色标示)：CV1,CV3,CV9～10,CV12～13,CV20～22,CV24,CV29,CV45,CV50,CV52等14个品种；

目标基因Pid2-ZS携带品种(图7c；蓝色标示)：CV2,CV4～5,CV7～8,CV11,CV15～19,CV23,CV25～28,CV30,CV43等18个品种；

未知新型抗病等位基因Pid2-SBL携带品种(图7a～c；紫色标示)：CV6等1个品种(该品种的基因型与Pid2-DIG及Pid2-DIG携带品种的皆不相同)；

未知新型抗病等位基因Pid2-CKN携带品种(图7a～c；紫色标示)：CV14等1个品种(该品种的基因型与Pid2-DIG，Pid2-DIG及Pid2-SBL携带品种的皆不相同)；

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆方法，分别以CV6(Sanbaili)及CV14(Chikenuo)为DNA模板，分离克隆了Pid2-SBL(GenBank MZ570866)及Pid2-CKN(GenBankMZ570866)等2个新型的抗病等位基因

该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在60个目标基因未知的种质资源中，首先挖掘出34个功能性单倍型品种；在此基础上，鉴别出2个确定的目标基因Pid2-DIG，Pid2-ZS，外加2个新型的抗病等位基因Pid2-SBL,Pid2-CKN。

实施例7:稻瘟病Pid-3抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图8～12)

一、实验方法

利用已克隆的Pid3-DIG(GenBank FJ745364.1)的基因组序列(ATG～TGA)，从上述NCBI等公共数据库中检索并下载另外9个推测为功能基因携带者的测序参考品种，特特普(Tetep),Tadukan,CO39,93-11,明恢63(Minghui 63,MH),珍汕97(Zhenshan 97,ZS),蜀恢498(Shuhui 498)，IR8,IR64；为了便于序列比对分析，加入了5个推测为非功能基因携带者的测序参考品种，日本晴(Nipponbare,NPB),一见钟情(Hitomebore,HTM),绥粳18(Suijing18,SJ18),沈农265(Shennong265),Koshihikari相应的基因组序列。

各个基因ATG～TAG的范围参考NCBI注释。

通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

二、实验结果

序列比较结果如图8～12所示，结果表明：

(1)Pid-3抗病基因家族的序列虽然分化变异不大，但是存在明显的功能性单倍型(上述10个抗病参考品种之10条参考序列)与非功能性单倍型(上述5个感病参考品种之5条参考序列)的基因组分化(典型位置如图9之标记#d3-1及#d3-2所示)；

(2)上述Pid-3抗病基因家族之等位基因之间则存在各自特异性SNP(典型位置如标记图10～12之标记#d3-3～#d3-8所示)；

此外，由于上述15条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图9～12全面地了解Pid-3抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

实施例8：Pid-3抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图9)

一、实验方法

(1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述Pid-3抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为单倍型特异性分子标记Pid3-F/N^G2009A(#d3-1标记)及Pid3-F/N^C2209T(#d3-2标记)，引物序列如下：

对于#d3-1标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

SEQ ID NO.9(Pid3-F/N^G2009A-F；5’-3’)：

GCAGTCGTTGTTTCTAAGCAATTTG；

SEQ ID NO.10(Pid3-F/N^G2009A-R；5’-3’)：

CACAAGAGAGCCTAGGTGATGAAC。

对于#d3-2标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

SEQ ID NO.11(Pid3-F/N^C2209T-F；5’-3’)：

AAGGTGCGAAGTTGCCATTGT；

SEQ ID NO.12(Pid3-F/N^C2209T-R；5’-3’)：

CGTGAGGTTATTCAGATTGCTTACAG。

(2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d3-1/58℃，#d3-2/62℃)，对下述8个Pid-3参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Bsl I(#d3-1)及BamHI(#d3-2)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

特别地，Bsl I的酶切温度为55℃

二、实验结果

各个分子标记的大小如图9所示，结果表明，8个Pid-3参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Tetep；CK3,Tadukan；CK4,Zhenshan97；CK5,CO39；

非功能性单倍型品种：CK6,Nipponbare；CK7,Shennong 265；CK8,Koshihikari。

实施例9：Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-DIG特异性分子标记的开发及应用(图10)

一、实验方法

(1)Pid3-DIG特异性分子标记的设计：根据上述Pid-3抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为Pid3-DIG特异性分子标记Pid3-DIG^G775A(#d3-3标记)及Pid3-DIG^G2695A(#d3-4标记)；引物序列如下：

对于#d3-3标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.13(Pid3-DIG^G775A-F；5’-3’)：

AAGAGTTTCGCAAGAATGATCGG；

SEQ ID NO.14(Pid3-DIG^G775A-R；5’-3’)：

CATTCCATACATCATCTAGGACAAGG。

对于#d3-4标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.15(Pid3-DIG^G2695A-F；5’-3’)：

ATCTGAAGTTCCTGCTCTGTCCAA；

SEQ ID NO.16(Pid3-DIG^G2695A-R；5’-3’)：

ACGTCACAAATCATTCGCTCT。

(2)Pid3-DIG特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d3-3/56℃，#d3-4/58℃)，对下述8个Pid-3参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Bsr I(#d3-3)及HpyLI(#d3-4)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

特别地，Bsr I的酶切温度为65℃。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图10所示，结果表明，2个Pid3-DIG特异性分子标记皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK1,Digu(Pid3-DIG)；

非目标基因品种：其余7个Pid-3参考品种。

实施例10：Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-TTP特异性分子标记的开发及应用(图11)

一、实验方法

(1)Pid3-TTP功能特异性分子标记的设计：根据上述Pid-3抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为Pid3-TTP特异性分子标记Pid3-TTP^C1136T(#d3-5标记)及Pid3-TTP^C1623G(#d3-6标记)；引物序列如下：

对于#d3-5标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.17(Pid3-TTP^C1136T-F；5’-3’)：

AATGAGATAAGGAATTGTCCGCCG；

SEQ ID NO.18(Pid3-TTP^C1136T-R；5’-3’)：

AATGACAGAAGGCGTCCAATGTGC。

对于#d3-6标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.19(Pid3-TTP^C1623G-F；5’-3’)：

AGCACGCCGTTTATCAACTCA；

SEQ ID NO.20(Pid3-TTP^C1623G-R；5’-3’)：

GGTAATGACTGAAGCGAACTG。

(2)Pid3-TTP特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d3-5/57℃，#d3-6/60℃)，对上述8个Pid-3参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Apa I(#d3-5)及Dde I(#d3-6)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图11所示，结果表明，2个Pid3-TTP特异性分子标记皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK2,Tetep(Pid3-TTP)；CK3,Tadukan(Pid3-TTP)；

非目标基因品种：其余6个Pid-3参考品种。

实施例11：Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-ZS特异性分子标记的开发及应用(图12)

一、实验方法

(1)Pid3-ZS特异性分子标记的设计：根据上述Pid-3抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为Pid3-ZS特异性分子标记Pid3-ZS^G477A(#d3-7标记)及Pid3-ZS^C525T(#d3-8标记)；引物序列如下：

对于#d3-7标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.21(Pid3-ZS^G477A-dF；5’-3’)：

GAYRGCGGGAAGGAGGAGCTT；

SEQ ID NO.22(Pid3-ZS^G477A-R；5’-3’)：

CACACTGACCACCATGCGGC。

特别地，为了确保在基因型分化区域PCR扩增成功，#d3-8标记使用了,简并引物(degenerate primer,dF)策略(dFvs R)，其中，y＝c/t,r＝a/g。

对于#d3-8标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.23(Pid3-ZS^C525T-F；5’-3’)：

CAAGAGGGAGGATGAGCTTGC；

SEQ ID NO.24(Pid3-ZS^C525T-R；5’-3’)：

CCGTCTTGCCGATTCCAC。

(2)Pid3-ZS特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d3-7/60℃，#d3-8/62℃)，对上述8个Pid-3参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Mse I(#d3-7)及Hpa I(#d3-8)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图2所示，结果表明，2个Pid3-ZS特异性分子标记皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK4,Zhenshan 97(Pid3-ZS)；CK5,CO39(Pid3-ZS)；

非目标基因品种：其余6个Pid-3参考品种。

实施例12：本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例(图13)

(1)如上所述，虽然稻瘟病Pid-3抗病基因家族也是在全球水稻抗病育种计划中应用最广泛的广谱持久抗源之一，但是，迄今开发、应用的3个分子标记都仅仅针对一个SNP(C2209T；Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311；Promchuay et al.2017,Journalof Advanced Agricultural Technologies,4:209-214)；

(2)以上述2篇文献的标记作为他方标记技术I,II，以上述8个Pid-3参考品种为检测对象进行鉴定比较(图13)。结果表明，本发明之技术体系与他方标记技术相比,具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

(a)首先，利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(图13a1)。在该实例中，在供试的8个Pid-3参考品种中，CK1～5被鉴定为功能性单倍型品种，CK6～8则为非功能性单倍型品种。这是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

(b)在此基础上，利用二级标记进行抗病等位基因分析，为各个抗病等位基因的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(图13a2～4)。在该实例中，分别为3个抗病等位基因(Pid3-DIG,Pid2-TTP,Pid3-ZS)遴选了3对最优的特异性标记组合，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。这也是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一。具体之：

我方技术体系:如上所述，本发明之技术体系由一套“功能性单倍型-抗病等位基因”等8个二级检测标记组成，由此在清晰地鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，精准地鉴别3个抗病等位基因(Pid3-DIG,Pid2-TTP,Pid3-ZS)。

他方标记技术I:该标记Pid3-specific^C2209T(Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311)对8个Pid-3参考品种的鉴定，结果表明，与本发明之#d3-2标记相似，可以鉴别功能性/非功能性单倍型品种，但是不能进一步鉴别3个抗病等位基因；

SEQ ID NO.46(Pid3-specific^C2209T-F；5’-3’)

TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC；

SEQ ID NO.47(Pid3-specific^C2209T-R；5’-3’)

ACGTCACAAATCATTCGCTC。

他方标记技术II:该标记组合Pid3-dCAPS1^T2209C与Pid3-dCAPS2^C2209T互为鉴证同一SNP的基因型(Shang et al.2009,Genetics,182:1303-1311；Promchuay et al.2017,Journal of Advanced Agricultural Technologies,4:209-214)，对8个Pid-3参考品种的鉴定结果表明，#d3-10及#d3-11与#d3-9标记一样，都是针对同一SNP，因此也与本发明之#d3-2标记相似，可以鉴别功能性/非功能性单倍型品种，但是不能进一步鉴别3个抗病等位基因；

SEQ ID NO.48(Pid3-dCAPS1^T2209C-F；5’-3’

TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC；

SEQ ID NO.49(Pid3-dCAPS1^T2209C-R；5’-3’

GCAGCACTTCTTGACTACTGTCTGT。

SEQ ID NO.50(Pid3-dCAPS2^C2209T-F；5’-3’)

TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC；

SEQ ID NO.51(Pid3-dCAPS2^C2209T-R；5’-3’)

AGCACTTCTTG ACTACTGTCTGCCT。

结论：他方标记技术仅仅针对同一SNP，由此产生“同名异质基因”的问题。因此，本发明之技术体系具有无比的创新性、严谨性及有益效果。

实施例13：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例(图14)

一、实验方法

(1)本发明之Pid-3技术体系由“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级检测标记之8个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而后续的各个抗病等位基因的检测则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图9～12；实施例8～11)，恕不赘述。

特别地，原则上非功能性单倍型供试品种可以排除于后续的抗病等位基因检测。在本案例中为了保持检测效果的整齐可比性，供试品种群体整体保留而进行了抗病等位基因的检测。

(2)利用该技术体系对上述60个随机选择的稻种资源进行Pid-3抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

上述6个目标基因确定的资源鉴定参考品种作为对照也参加了试验。

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆技术，分离克隆新型的抗病等位基因、测序并登录于GenBank。

二、实验结果

(1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，60个供试品种被分类为(图14a；红色标示，功能性单倍型；黑色标示，非功能性单倍型)：

功能性单倍型品种：CV1～30,CV43,CV45,CV50,CV52等34个品种；

非功能性单倍型品种：CV31～42,CV44,CV46～49,CV51,CV53～60等26个品种。

(2)在基于2个二级标记的抗病等位基因检测中，34个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

目标基因Pid3-DIG携带品种(图14b；红色标示)：CV1,CV12,CV45等3个品种；

目标基因Pid3-TTP携带品种(图14c；蓝色标示)：CV2等1个品种；

目标基因Pid3-ZS携带品种(图14d；绿色标示)：CV3～11,CV13，CV15～30,CV43,CV50,CV52等29个品种；

未知新型抗病等位基因Pid3-CKN携带品种(图14a～d；紫色标示)：CV14等1个品种(该品种的基因型与Pid3-DIG，Pid3-TTP及Pid3-ZS携带品种的皆不相同)；

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆方法，以CV14(Chikenuo)为DNA模板，分离克隆了Pid3-CKN(GenBank MZ570866)等1个新型的抗病等位基因

该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在60个目标基因未知的种质资源中，首先挖掘出34个功能性单倍型品种；在此基础上，鉴别出3个确定的目标基因Pid3-DIG，Pid3-TTP，Pid3-ZS，外加1个新型的抗病等位基因Pid3-CKN。

实施例14:稻瘟病Pid-4抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图15～19)

一、实验方法

利用已克隆的Pid4-DIG(GenBank MG839283.1)的基因组序列(ATG～TGA)，从上述NCBI等公共数据库中检索并下载另外6个推测为功能基因携带者的测序参考品种，蜀恢498(Shuhui 498)，绥粳18(Suijing 18,SJ18),日本晴(Nipponbare,NPB),Koshihikari,一见钟情(Hitomebore,HTM),沈农265(Shennong 265)；为了便于序列比对分析，加入了6个推测为非功能基因携带者的测序参考品种，特特普(Tetep),珍汕97(Zhenshan 97,ZS),93-11,明恢63(Minghui 63,MH),IR8,IR64相应的基因组序列。

各个基因ATG～TAG的范围参考NCBI注释。

通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

二、实验结果

序列比较结果如图15～19所示，结果表明：

(1)Pid-4抗病基因家族的序列虽然呈现中度的分化变异，但是存在明显的功能性单倍型(上述7个抗病参考品种之7条参考序列)与非功能性单倍型(上述6个感病参考品种之6条参考序列)的基因组分化(典型位置如图16之标记#d4-1及#d4-2所示)；

(2)上述Pid-4抗病基因家族之等位基因之间则存在各自特异性SNP(典型位置如标记图17～19之标记#d4-3～#d4-8所示)；

同样地，由于上述13条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图16～19全面地了解Pid-4抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

实施例15：Pid-4抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图16)

一、实验方法

(1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述Pid-4抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为单倍型特异性分子标记Pid4-F/N^C1217G(#d4-1标记)及Pid4-F/N^A1452G(#d4-2标记)，引物序列如下：

对于#d4-1标记【上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)】：

SEQ ID NO.25(Pid4-F/N^C1217G-F；5’-3’)：

CATAATTCAAAACTGTGCTTATCCCT；

SEQ ID NO.26(Pid4-F/N^C1217G-R；5’-3’)：

CCTCATAACTTTTATTTGATTTTCTCA。

对于#d4-2标记【上带，功能性单倍型(红色)；下带，非功能性单倍型(黑色)】：

SEQ ID NO.27(Pid4-F/N^A1452G-F；5’-3’)：

GCAGCTATCTTCAGGGCTCAT；

SEQ ID NO.28(Pid4-F/N^A1452G-R；5’-3’)：

GCTAAGGTACAGAAAACATGGCT。

(2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d4-1/57℃，#d4-2/60℃)，对下述8个Pid-4参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶MnlI(#d4-1)及BspHI(#d4-2)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图16所示，结果表明，8个Pid-4参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

功能性单倍型品种：CK1,Digu；CK2,Nipponbare；CK3,Koshihikari；CK4,CO39；CK5,Shennong 265；

非功能性单倍型品种：CK6,Tadukan；CK7,Tetep；CK8,Zhenshan 97。

实施例16：Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-DIG特异性分子标记的开发及应用(图17)

一、实验方法

(1)Pid4-DIG特异性分子标记的设计：根据上述Pid-4抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为Pid4-DIG特异性分子标记Pid4-DIG^A1149T(#d4-3标记)及Pid4-DIG^A1898G(#d4-4标记)；引物序列如下：

对于#d4-3标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.29(Pid4-DIG^A1149T-F；5’-3’)：

TTAATGAATCTGTTTTTCCTGACTCTAG；

SEQ ID NO.30(PID4-DIG^A1149T-R；5’-3’)：

GATTTTCTCAGCAGCAAATGTTTAGC。

对于#d4-4标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.31(Pid4-DIG^A1898G-dF；5’-3’)：

GGGAGACAGGAKTCAWACCTAAGC；

SEQ ID NO.32(Pid4-DIG^A1898G-R1；5’-3’)：

GAGCATCCTTAGCTGTGGTGAAC；

SEQ ID NO.33(Pid4-DIG^A1898G-R2；5’-3’)：

GATCATCCTTAGTTGGGACGGAC。

特别地，为了确保在基因型分化区域PCR扩增成功，#d4-4标记同时使用了,简并引物(dF)及多引物(dFvs R1,R2)策略，其中，k＝g/t,w＝a/t。

(2)Pid4-DIG特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d4-3/53℃，#d4-4/62℃)，对上述8个Pid-4参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Xba I(#d4-3)及Bsr I(#d4-4)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

特别地，Bsr I的酶切温度为65℃。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图17所示，结果表明，Pid4-DIG^A1149T标记可将目标基因Pid4-DIG及Pid4-CO(下述)区分于该基因家族其他已知的功能基因，以及非功能基因：Pid4-DIG^A1898G标记则可将目标基因Pid3-DIG区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因。因此只有2个Pid4-DIG特异性标记的基因型一致时，才能被判断为Pid4-DIG携带者：

目标基因品种：CK1,Digu(Pid4-DIG)；

非目标基因品种：其余7个Pid-4参考品种。

实施例17：Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-NPB特异性分子标记的开发及应用(图18)

一、实验方法

(1)Pid4-NPB功能特异性分子标记的设计：根据上述Pid-4抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP设计为Pid4-NPB特异性分子标记Pid4-NPB^G1362A(#d4-5标记)及Pid4-NPB^C1554A(#d4-6标记)；引物序列如下：

对于#d4-5标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.34(Pid4-NPB^G1362A-F；5’-3’)：

AGGCTGAGAAGGTGTTTGATA；

SEQ ID NO.35(Pid4-NPB^G1362A-R；5’-3’)：

GAAGATAGCTGCAGAGACAGT。

对于#d4-6标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

SEQ ID NO.36(Pid4-NPB^C1554A-F1；5’-3’)：

TTTCTGTACCTTAGCATTTTCCG；

SEQ ID NO.37(Pid4-NPB^C1554A-F2；5’-3’)：

TTTCTGTATCTTAGCGTTTTCCG；

SEQ ID NO.38(Pid4-NPB^C1554A-R；5’-3’)：

CAACATCCTCCATAGCCATTCCA。

特别地，为了确保在基因型分化区域PCR扩增成功，#d4-6使用了多引物(F1,F2vsR)策略。

(2)Pid4-NPB特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d4-5/59℃，#d4-6/53℃)，对上述8个Pid-4参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，利用限制性内切酶Aci I(#d4-5及#d4-6)进行酶切、电泳检测、拍照、记录。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图18所示，结果表明，2个Pid4-NPB特异性分子标记皆可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

目标基因品种：CK2,Nipponbare(Pid4-NPB)；CK3,Koshihikari(Pid4-NPB)；非目标基因品种：其余6个Pid-4参考品种。

实施例18：Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-SN特异性分子标记的开发及应用(图19)

一、实验方法

(1)Pid4-SN功能特异性分子标记的设计：根据上述Pid-4抗病基因家族序列的比对结果，选择最优的2个SNP组合设计为Pid4-SN特异性分子标记Pid4-SN^T1841A(#d4-7标记)及Pid4-SN/CO^C2250G(#d4-8标记)；引物序列如下：

对于#d4-7标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.39(Pid4-SN^T1841A-F；5’-3’)：

CATCAATAGAAGCATGATTCAACC；

SEQ ID NO.40(Pid4-SN^T1841A-R；5’-3’)：

TCCTGTCTCCCATCAATAGAAAG。

对于#d4-8标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

SEQ ID NO.41(Pid4-SN/CO^C2250G-F1；5’-3’)：

GTCACTTCGAATTTACTACCCGTGG；

SEQ ID NO.42(Pid4-SN/CO^C2250G-F2；5’-3’)：

GATACTCCGATTTCAATATCTATGG；

SEQ ID NO.43(Pid4-SN/CO^C2250G-dR；5’-3’)：

GGAACTCYGCCACCACCWSCGA。

特别地，为了确保在基因型分化区域PCR扩增成功，#d4-8标记同时使用了,简并引物(dR)及多引物(F1,F2 vs dR)策略，其中，y＝c/t,w＝a/t,s＝c/g。

(2)Pid4-SN特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR扩增体系(退火温度：#d4-7/57℃，#d4-8/56℃)，对上述8个Pid-4参考品种进行PCR扩增；取出PCR产物，分别利用限制性内切酶Hph I(#d4-7)，Apa I(#d4-8)进行酶切、电泳检测、拍照、记录；

特别地，Apa I的酶切温度为25℃。

二、实验结果

各个分子标记的大小如图18所示，结果表明，Pid4-SN^T1841A标记可将目标基因Pid4-SN区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因；而Pid4-SN/CO^C2250G标记可将目标基因Pid4-SN及Pid4-CO区分于该基因家族其他已知的功能基因，以及非功能基因。因此，只有2个标记的基因型都是目标基因时，才能被判断为Pid4-SN携带者：

目标基因品种：CK5,Shennong 265(Pid4-SN)；

非目标基因品种：其余7个Pid-4参考品种。

实施例19：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病家族等位基因的技术体系从测序不完整的参考品种CO39中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pib-CO的应用及实例(图20)

(1)参考品种CO39之目标基因分别位于2个contig(CO39_1(LQHE01001432.1)和CO39_2(LQHE01041962.1)的末端，由此导致其目标基因序列不完整而不能推断其是否含有Pid-4抗病家族等位基因(图20a)；

(2)利用本发明之Pid-4技术体系对上述8个Pid-4参考品种进行系统而严谨的检测(实验程序如上所述)，即可以鉴别该品种是否含有Pid-4抗病家族等位基因。具体之：

(a)2个Pid-4功能性单倍型特异性最优标记对8个Pid-4参考品种的鉴定结果表明，CK4(CO39)为功能性单倍型品种(图20b)；

(b)2个Pid4-DIG特异性最优标记对8个Pid-4参考品种的鉴定结果表明，虽然CK1与CK4于标记Pid4-DIG^A1149T的基因型相同，但是于标记Pid4-DIG^A898G的基因型不同，因此，CK4为非Pid4-DIG携带者(图20c)；

(c)2个Pid4-NPB特异性最优标记对8个Pid-4参考品种的鉴定结果表明，CK4为非Pid4-NPB携带者(图20d)；

(d)2个Pid4-SN特异性最优标记组合对8个Pid-4参考品种的鉴定结果表明，虽然CK4与CK5于标记Pid4-SN/CO^C2259G的基因型相同，但是于标记Pid4-SN^T1841A的基因型不同，因此，CK4为非Pid4-SN携带者(图20e)；

综合20a～e的结果推断，CK4(CO39)含有新型的Pid4抗病等位基因Pid4-CO。

结论：本发明之技术体系具有无比的包容性、严谨性及有益效果。

实施例20：本发明之一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例(图21)

(1)如上所述，虽然稻瘟病Pid-4抗病基因家族也是在全球水稻抗病育种计划中应用最广泛的广谱持久抗源之一，但是，迄今开发、应用的分子标记仅有一个Pid4-GAP^{Indel (-1020)}(Chen et al.2018,Journal of Genetics and Genomics,45:663-672)；

SEQ ID NO.52(Pid4-GAP^Indel(-1020)-F；5’-3’)

CCGCATCTCCTCCTTCCTCT；

SEQ ID NO.53(Pid4-GAP^Indel(-1020)-R；5’-3’)

AGAGATCTCGCTGTTCAGTC。

(2)以上述标记作为他方标记技术，以上述8个Pid-4参考品种为检测对象进行鉴定比较(图21)。结果表明，本发明之技术体系与他方标记技术相比,具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

(a)首先，利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(图21a1)。在该实例中，在供试的8个Pid-4参考品种中，CK1～5被鉴定为功能性单倍型品种，CK6～8则为非功能性单倍型品种。这是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

(b)在此基础上，利用二级标记进行抗病等位基因分析，为各个抗病等位基因的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(图21a2～4)。在该实例中，分别为3个抗病等位基因(Pid4-DIG,Pid4-NPB,Pid4-SN)遴选了3对最优的特异性标记组合，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。这也是他方标记技术所无法比拟的有益效果之一。具体之：

我方技术体系:如上所述，本发明之技术体系由一套“功能性单倍型-抗病等位基因”等8个二级检测标记组成，由此在清晰地鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，精准地鉴别3个抗病等位基因(Pid4-DIG,Pid4-NPB,Pid4-SN)。

他方标记技术:该标记Pid4-GAP^Indel(-1020)对8个Pid-4参考品种的鉴定结果表明，CK1与CK5的基因型相同而为一组，CK2～3及CK5～8之2种基因型则为另外2组。由此既分不清目标基因Pid3-DIG与Pid4-SN的携带者，也分不清Pid4-NPB与Pid3-CO的携带者；

结论：他方标记技术仅仅针对目标基因编码区以外的1个Indel，无法鉴别Pid-4抗病基因家族之任何等位基因。因此，本发明之技术体系具有无比的创新性、严谨性及有益效果。

实施例21：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系从未知目标基因的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例(图22～23)

一、实验方法

(1)本发明之Pid-4技术体系由“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级检测标记之8个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而后续的各个抗病等位基因的检测则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图16～19；实施例15～18)，恕不赘述。

特别地，原则上非功能性单倍型供试品种可以排除于后续的抗病等位基因检测。在本案例中为了保持检测效果的整齐可比性，供试品种群体整体保留而进行了抗病等位基因的检测。

(2)利用该技术体系对上述60个随机选择的稻种资源进行Pid-4抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

上述6个目标基因确定的资源鉴定参考品种作为对照也参加了试验。

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆技术，分离克隆新型的抗病等位基因、测序并登录于GenBank。

二、实验结果

(1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，60个供试品种被分类为(图22a；红色标示，功能性单倍型；黑色标示，非功能性单倍型)：

功能性单倍型品种：CV2,CV3,CV8～12,CV14,CV20～21,CV29～44,CV46～51,CV53～CV60等40个品种；

非功能性单倍型品种：CV1,CV3,CV5～7,CV3,CV5～19,CV22～28,CV45,CV52等20个品种。

(2)在基于2个二级标记的抗病等位基因检测中，34个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

目标基因Pid4-DIG携带品种(图22b；红色标示)：CV9等1个品种；

目标基因Pid4-NPB携带品种(图22c；蓝色标示)：CV31,CV34～35,CV39,CV47,CV53～54,CV58～60等11个品种；

目标基因Pid4-SN携带品种(图22d；绿色标示)：CV2,CV12,CV14,CV32～33,CV40～41,CV44,CV46,CV48～49,CV51等14个品种；

新型抗病等位基因Pid4-CO携带品种(图22a～d；浅红色标示)：CV4,CV8,CV11,CV43,CV56～57等6个品种(这些品种的基因型与Pid4-CO携带品种CK6的相同)；

未知新型抗病等位基因Pid4-SYZ携带品种(图22a～d；紫色标示)：CV10等1个品种(该品种的基因型与Pid4-DIG，Pid4-NPB，Pid4-SN及Pid4-CO携带品种的皆不相同)；

未知新型抗病等位基因Pid4-TFB携带品种(图22a～d；紫色标示)：CV20～21,CV29等3个品种(该品种的基因型与Pid4-DIG，Pid4-NPB，Pid4-SN，Pid4-CO及Pid4-SYZ携带品种的皆不相同)；

未知新型抗病等位基因Pid4-LHZ携带品种(图22a～d；紫色标示)：CV42,CV50,CV55等3个品种(该品种的基因型与Pid4-DIG，Pid4-NPB，Pid4-SN，Pid4-CO，Pid4-SYZ及Pid4-TFB携带品种的皆不相同)；

(3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆方法，以CV10(Shuyazhan,SYZ),CV29(Tianfeng B,TFB),CV42(Laohuzhong,LHZ)为DNA模板，分离克隆了Pid4-SYZ(WT)(GenBankMZ983616),Pid4-TFB(WT)(GenBank MZ983619),Pid4-LHZ(GenBank MZ983615)等3个新型的抗病等位基因。

该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在60个目标基因未知的种质资源中，首先挖掘出40个功能性单倍型品种；在此基础上，鉴别出3个确定的目标基因Pid4-DIG，Pid4-NPB，Pid4-SN，外加4个新型的抗病等位基因Pid4-CO,Pid4-SYZ,Pid4-TFB,Pid4-LHZ。

上述实例从不同角度实证了本发明之技术体系具有包容性且精准鉴别并挖掘Pid抗病基因家族等位基因的非凡能力及效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的

技术体系

<130>

<160> 53

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 标记Pid2-F/NC1022T-F

<400> 1

acagttccgg cagactcttg tgacat 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid2-F/NC1022T-R

<400> 2

agtttgcaaa cgagccgagg gtc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid2-F/NA1383G-F

<400> 3

ggaatacaac tcgtttcgca tct 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 标记Pid2-F/NA1383G-R

<400> 4

ctatgatagc caaagttacg cg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid2-DIGT2058C-F

<400> 5

agttgatgac cagggagcag a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 标记Pid2-DIGT2058C-R

<400> 6

ccttcctcca gcttcttgaa 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid2-ZSA555G-F

<400> 7

gccacctcta tgcaactact g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid2-ZSA555G-R

<400> 8

accagacaga agagtgtctg c 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 标记Pid3-F/NG2009A-F

<400> 9

gcagtcgttg tttctaagca atttg 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-F/NG2009A-R

<400> 10

cacaagagag cctaggtgat gaac 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-F/NC2209T-F

<400> 11

aaggtgcgaa gttgccattg t 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 标记Pid3-F/NC2209T-R

<400> 12

cgtgaggtta ttcagattgc ttacag 26

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid3-DIGG775A-F

<400> 13

aagagtttcg caagaatgat cgg 23

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 标记Pid3-DIGG775A-R

<400> 14

cattccatac atcatctagg acaagg 26

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-DIGG2695A-F

<400> 15

atctgaagtt cctgctctgt ccaa 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-DIGG2695A-R

<400> 16

acgtcacaaa tcattcgctc t 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-TTPC1136T-F

<400> 17

aatgagataa ggaattgtcc gccg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-TTPC1136T-R

<400> 18

aatgacagaa ggcgtccaat gtgc 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-TTPC1623G-F

<400> 19

agcacgccgt ttatcaactc a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-TTPC1623G-R

<400> 20

ggtaatgact gaagcgaact g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-ZSG477A-dF

<400> 21

gayrgcggga aggaggagct t 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 标记Pid3-ZSG477A-R

<400> 22

cacactgacc accatgcggc 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid3-ZSC525T-F

<400> 23

caagagggag gatgagcttg c 21

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 标记Pid3-ZSC525T-R

<400> 24

ccgtcttgcc gattccac 18

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 标记Pid4-F/NC1217G-F

<400> 25

cataattcaa aactgtgctt atccct 26

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 标记Pid4-F/NC1217G-R

<400> 26

cctcataact tttatttgat tttctca 27

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid4-F/NA1452G-F

<400> 27

gcagctatct tcagggctca t 21

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-F/NA1452G-R

<400> 28

gctaaggtac agaaaacatg gct 23

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 标记Pid4-DIGA1149T-F

<400> 29

ttaatgaatc tgtttttcct gactctag 28

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 标记Pid4-DIGA1149T-R

<400> 30

gattttctca gcagcaaatg tttagc 26

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid4-DIGA1898G-dF

<400> 31

gggagacagg aktcawacct aagc 24

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-DIGA1898G-R1

<400> 32

gagcatcctt agctgtggtg aac 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-DIGA1898G-R2

<400> 33

gatcatcctt agttgggacg gac 23

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid4-NPBG1362A-F

<400> 34

aggctgagaa ggtgtttgat a 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid4-NPBG1362A-R

<400> 35

gaagatagct gcagagacag t 21

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-NPBC1554A-F1

<400> 36

tttctgtacc ttagcatttt ccg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-NPBC1554A-F2

<400> 37

tttctgtatc ttagcgtttt ccg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-NPBC1554A-R

<400> 38

caacatcctc catagccatt cca 23

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid4-SNT1841A-F

<400> 39

catcaataga agcatgattc aacc 24

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 标记Pid4-SNT1841A-R

<400> 40

tcctgtctcc catcaataga aag 23

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 标记Pid4-SN/COC2250G-F1

<400> 41

gtcacttcga atttactacc cgtgg 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 标记Pid4-SN/COC2250G-F2

<400> 42

gatactccga tttcaatatc tatgg 25

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 标记Pid4-SN/COC2250G-dR

<400> 43

ggaactcygc caccaccwsc ga 22

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 标记Pid2-specificGT2058AT/GC-F

<400> 44

ttggctatca taggcgtcc 19

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 标记Pid2-specificGT2058AT/GC-R

<400> 45

atttgaaggc gtttgcgtag a 21

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-specificC2209T-F

<400> 46

tactactcat ggaagctagt tctc 24

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 标记Pid3-specificC2209T-R

<400> 47

acgtcacaaa tcattcgctc 20

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-dCAPS1T2209C-F

<400> 48

tactactcat ggaagctagt tctc 24

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 标记Pid3-dCAPS1T2209C-R

<400> 49

gcagcacttc ttgactactg tctgt 25

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 标记Pid3-dCAPS2C2209T-F

<400> 50

tactactcat ggaagctagt tctc 24

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 标记Pid3-dCAPS2C2209T-R

<400> 51

agcacttctt gactactgtc tgcct 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 标记Pid4-GAPIndel(-1020)-F

<400> 52

ccgcatctcc tccttcctct 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 标记Pid4-GAPIndel(-1020)-R

<400> 53

agagatctcg ctgttcagtc 20

Claims (6)

1.一组三套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因的技术体系，所述稻瘟病Pid抗病基因家族等位基因包括Pid-2,Pid-3,Pid-4，其特征在于，该技术体系由3套自成体系的“功能性单倍型-抗病等位基因”等二级检测标记组成，并各自逐级推进；供试品种是否携带目标基因由各套技术体系检测的综合结果而独立决定；

具体地，所述技术体系包含：

(1)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-2抗病基因家族等位基因的技术体系包含：

(a)Pid-2基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；原则上，在后续的检测中，非功能性品种可被排除；

(b)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-DIG的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计1个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid2-DIG基因携带者应该属于Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2-DIG参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid2-DIG；

(c)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-ZS的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计1个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid2-ZS基因携带者应该属于Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记之基因型与Pid2-ZS参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid2-ZS；

(2)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-3抗病基因家族等位基因的技术体系包含：

(d)Pid-3基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；原则上，在后续的检测中，非功能性品种可被排除；

(e)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-DIG的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid3-DIG基因携带者应该属于Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3-DIG参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3-DIG；

(f)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-TTP的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid3-TTP基因携带者应该属于Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3-TTP参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3-TTP；

(g)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-ZS的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid3-ZS基因携带者应该属于Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid3-ZS参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid3-ZS；

(3)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病Pid-4抗病基因家族等位基因的技术体系包含：

(h)Pid-4基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过该家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；原则上，在后续的检测中，非功能性品种可被排除；

(i)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-DIG的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid4-DIG基因携带者应该属于Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4-DIG参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4-DIG；

(j)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-NPB的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid4-NPB基因携带者应该属于Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4-NPB参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4-NPB；

(k)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-SN的检测程序：

通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个最优的特异性分子标记组合；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pid4-SN基因携带者应该属于Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型与Pid4-SN参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因Pid4-SN。

2.根据权利要求1所述技术体系，其特征在于：

(a)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid2-F/N^C1022T及Pid2-F/N^A1383G；其序列分别为SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示；

(b)中最优的目标基因Pid2-DIG特异性分子标记为Pid2-DIG^T2058C；其序列为SEQ IDNO.5～6所示；

(c)中最优的目标基因Pid2-ZS特异性分子标记为Pid2-ZS^A555G；其序列为SEQ ID NO.7～8所示；

(d)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid3-F/N^G2009A及Pid3-F/N^C2209T；其序列分别为SEQ ID NO.9～10和SEQ ID NO.11～12所示；

(e)中最优的目标基因Pid3-DIG特异性分子标记为Pid3-DIG^G775A及Pid3-DIG^G2695A；其序列分别为SEQ ID NO.13～14和SEQ ID NO.15～16所示；

(f)中最优的目标基因Pid3-TTP特异性分子标记为Pid3-TTP^C1136T及Pid3-TTP^C1623G；其序列分别为SEQ ID NO.17～18和SEQ ID NO.19～20所示；

(g)中最优的目标基因Pid3-ZS特异性分子标记为Pid3-ZS^G477A及Pid3-ZS^C525T；其序列分别为SEQ ID NO.21～22和SEQ ID NO.23～24所示；

(h)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为Pid4-F/N^C1217G及Pid4-F/N^A1452G；其序列分别为SEQ ID NO.25～26和SEQ ID NO.27～28所示；

(i)中最优的目标基因Pid4-DIG特异性分子标记为Pid4-DIG^A1149T及Pid4-DIG^A1898G；其序列分别为SEQ ID NO.29～30和SEQ ID NO.31～33所示；

(j)中最优的目标基因Pid4-NPB特异性分子标记为Pid4-NPB^G1362A及Pid4-NPB^C1554A；其序列分别为SEQ ID NO.34～35和SEQ ID NO.36～38所示；

(k)中最优的目标基因Pid4-SN特异性分子标记组合为Pid4-SN^T1841A及Pid4-SN/CO^C2250G；其序列分别为SEQ ID NO.39～40和SEQ ID NO.41～43所示；

其中，标记说明：F/N，功能性(functional)/非功能性(non-functional)；C1022T，意为#1022位点之SNP；基因符号为斜体，表示目标基因；基因符号为正体，表示目标基因之特异性标记，其中大写字符为目标基因供体品种之缩写，如DIG，意为Digu；特异性标记的PCR引物序列一般为正反各1条序列，少数位于基因组分化区域的标记其PCR引物序列则为3条序列。

3.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在上述3个复杂的稻瘟病Pid抗病基因家族中对功能基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘，包括但不限于如下5个目标基因：

稻瘟病Pid-2抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid2-ZS(曾用名：Pid2-TTP)，序列如GenBank MZ570869所示；

稻瘟病Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-TTP，序列如GenBankMZ570870所示；

稻瘟病Pid-3抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid3-ZS(曾用名：Pid3-MH)，序列如GenBank MZ570872所示；

稻瘟病Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-NPB，序列如GenBankMZ983617所示；

稻瘟病Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pid4-SN，序列如GenBankMZ983618所示。

4.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在测序不完整的参考品种中鉴定该基因家族的已知功能基因，以及挖掘包括但不限于1个新型的目标基因：稻瘟病Pid-4抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pid4-CO；

抗病等位基因Pid4-CO的序列如GenBank MZ570873所示。

5.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在目标基因未知的种质资源中鉴定该基因家族的已知目标基因，以及挖掘包括但不限于6个稻瘟病Pid抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因；

抗病等位基因Pid2-CKN的序列如GenBankMZ983612所示；

抗病等位基因Pid2-SBL的序列如GenBank MZ983613所示；

抗病等位基因Pid3-CKN的序列如GenBank MZ983614所示；

抗病等位基因Pid4-LHZ的序列如GenBank MZ983615所示；

抗病等位基因Pid4-SYZ(WT)的序列如GenBank MZ983616所示；

抗病等位基因Pid4-TFB(WT)的序列如GenBank MZ983619所示。

6.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于精准甄别在该基因家族中因测序错误而普遍存在的真假基因组分化区域及SNP以及真假目标基因。

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