CN102703443A - 稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记及其方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记及其方法与应用。该分子标记由Pia-1FNP和Pia-2FNP组成。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列与Pia-1及Pia-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其他感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-1功能特异性的1处STS，以及Pia-2功能特异性的1处SNP；通过引物设计，分别得到SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，对水稻总DNA进行扩增，分别通过直接电泳检测以及特异性酶切之后电泳检测，得到Pia功能特异性分子标记Pia-1FNP和Pia-2FNP，二者组合则可准确地检测功能性的Pia。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。

Description

稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记及其方法与应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP及其方法与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌（Magnapothe oryzae）引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。

水稻稻瘟病抗病基因Pia被定位于第11染色体短臂端（Zeng et al.2011.Characterization and fine mapping of the rice blast resistance gene Pia.ScienceChina Life Sciences 54:372-378）上，并已成功地被克隆（Okuyama et al.2011.Amultifaceted genomics approach allows the isolationof the rice Pia-blast resistancegene consisting of two adjacent NBS-LRR protein genes.Plant Journal 66:467-479）。研究表明，Pia基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类型的抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含该基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为A型；当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型（基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同）。

Pia所具有的独特抗谱（Zeng et al.2011.Characterization and fine mapping ofthe rice blast resistance gene Pia.Science China Life Sciences 54:372-378），使之可以广泛地应用于稻瘟病抗性育种计划中。因此，为了加快Pia在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pia与其他功能基因的聚合育种、以及转基因育种等，开发出准确有效的Pia功能特异性分子标记显得尤其重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP。

本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法。

本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP，它由Pia-1FNP和Pia-2FNP组合而成，分别由引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以及SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，前者直接电泳检测，后者则经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记；

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1（5’-3’）：CTTTTGAGCTTGATTGGTCTGC；

SEQ ID NO.2（5’-3’）：CTATTGCACCAGAGGGACCAG；

SEQ ID NO.3（5’-3’）：GCGCCGCCACAAGGTTG；

SEQ ID NO.4（5’-3’）：CGTCACCAAGCTGGTACCTCTAG；

所述的水稻品种为Aichi Asahi；

所述稻瘟病抗性基因Pia包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pia-1和Pia-2；

所述的特异性酶切指的是Xba I酶切；

所述的稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列与Pia-1及Pia-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-1功能特异性的1处序列标签位点（sequence-tagged site，STS），以及Pia-2功能特异性的1处单碱基差异（single nucleotide polymorphism，SNP）；再通过引物设计分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，分别对水稻基因组DNA进行扩增、酶切，分别得到Pia功能特异性分子标记Pia-1FNP和Pia-2FNP，二者组合为Pia功能特异性分子标记PiaFNP。

优选的，所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法，包括以下步骤：

（1）通过常规PCR法扩增，获得多个A型及N型水稻品种的Pia等位基因的编码区DNA序列；

（2）利用多序列比对软件工具（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），将步骤（1）所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pia-1抗性基因所特异的STS，该STS位于Pia-1之C末端区域；Pia-2抗性基因所特异的SNP，该SNP位于Pia-2之CC区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

（3）根据步骤（2）所得到的1处STS及SNP，分别设计出引物对SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；并用这2组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物A和扩增产物B；前者直接电泳检测，后者则经特异性酶切之后电泳检测，然后比较验证，分别获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段Pia-1FNP和Pia-2FNP；

（4）对步骤（3）所获得的分子标记分别在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pia抗性基因的功能特异性的分子标记PiaFNP（由Pia-1FNP和Pia-2FNP组合而成）。

更优选的，

步骤（1）所述的水稻品种为Aichi Asahi和Fukunishiki，以及2个水稻亚种的参考品种Nipponbare和93-11（全基因组已经测序并公开于http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

步骤（2）中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对；

步骤（3）中所述的扩增产物A的大小为116bp，即水稻品种为A型；所述的扩增产物A的大小为125bp，即水稻品种为N型；

步骤（3）中所述的扩增产物B酶切后的大小为142bp，即水稻品种为N型；所述的扩增产物B酶切后为123bp，即水稻品种为A型；

步骤（3）中在Pia-1的STS上下游60～100bp处分别设计引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，在Pia-2的SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO.4，而在其上游100～200bp处设计功能特异性上游引物SEQ IDNO.3；

步骤（3）所述的PCR扩增反应，其中Pia-1FNP的PCR扩增反应体系如下：

Pia-1FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、65℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，取适量样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，3小时。扩增所得到的PCR产物分别为116bp和125bp，前者即为抗性基因Pia-1的功能特异性分子标记Pia-1FNP。

步骤（3）所述的PCR扩增反应，其中Pia-2FNP的PCR扩增反应体系如下：

Pia-2FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、53℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶Xba I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，3小时。扩增所得到的PCR产物为142bp，能够被酶切的（酶切后为123bp）即为抗性基因Pia-2的功能特异性分子标记Pia-2FNP。

所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的Pia功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pia在水稻种质资源中以及育种后代中的鉴定，特别是等位基因之间的鉴别，且不受环境以及人为因素的影响。因此，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到重要的作用。

附图说明

图1是具有功能特异性STS的水稻稻瘟病抗性基因Pia的组成基因之一Pia-1与1个Pia等位基因及2个感病等位基因的氨基酸序列比对图；黑色方框表示由Pia-1FNP造成的功能特异性的序列标签位点。

图2是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pia的组成基因之一Pia-2与1个Pia等位基因及2个感病等位基因的氨基酸序列比对图；黑色方框表示由Pia-2FNP造成的功能特异性氨基酸的改变。

图3是验证图，其中：

图A是Pia功能特异性分子标记Pia-1FNP在8个水稻品种中的验证；

图B是Pia功能特异性分子标记Pia-2FNP在8个水稻品种中的验证；

其中，泳道1为抗性基因供体品种Aichi Asahi(Pia)；泳道2为抗病品种C101LAC(Pia)；泳道3为抗病品种C101A51(Pia)；泳道4为抗病品种C101PKT(Pia)；泳道5为感病品种Nipponbare；泳道6为感病品种Shin 2；泳道7为抗病品种BL 1(Pib)；泳道8为抗病品种Fukunishiki(Pib)；泳道DL2000为DNAladder。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：Pia等位基因编码区序列的比对及STS和SNP的鉴定

通过常规的PCR扩增（Yuan et al.2011.The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes.Theor ApplGenet 122:1017-1028）、测序（上海英骏生物技术有限公司，广州分公司），从2个水稻品种Aichi Asahi和Fukunishiki（Zeng et al.2011.Characterization and finemapping of the rice blast resistance gene Pia.Science China 54:372-378）中获得相应的Pia等位基因编码区DNA序列[Pia-1(AB604622)，Pia-2(AB604627)，已经公开于http://www.ncbi.nlm.nih.gov]，以及2个水稻亚种的参考品种Nipponbare和93-11的Pia等位基因编码区DNA序列（直接从http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得）。

利用多序列比对软件工具（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），通过对这些序列翻译后的蛋白质序列（Pia-1来自Aichi Asahi，Pia1-93来自93-11，Pia1-NP来自Nipponbare，Pia1-Fu来自Fukunishiki），进行比对分析，鉴定到Pia-1抗性基因所特异的1个STS（抗性基因存在3个氨基酸的缺失，而感病等位基因则不存在缺失）（图1），该处缺失可以将Pia-1与感病等位基因区分开。同样的方法分析Pia-2（Pia-2是来自Aichi Asahi，Pia1-93来自93-11，Pia2-NP来自Nipponbare，Pia2-Fu来自Fukunishiki）。在第422位点处，Pia-2编码的第141位氨基酸为亮氨酸（L），而感病等位基因在该位点则编码组氨酸（H），因此，存在于Pia-2 cDNA第422位点的功能特异性SNP可以将Pia-2与感病等位基因区分开（图2）。

实施例2：Pia功能特异性分子标记及其引物设计与检测

根据STS标记的设计原理（Olson et al.A common language for physicalmapping of the human genome.Science 29:1434-1435），在上述STS上游60～100bp处设计功能特异性上游引物Pia-1FNP-F，如SEQ ID NO.1所示；在上述STS下游60～100bp处设计功能特异性下游引物Pia-1FNP-R，如SEQ ID NO.2所示。

根据dCAPS标记的设计原理（Neff et al.2002.Web-based primer design forthe single nucleotide polymorphism analysis.Trends in Genetics 18:613-615），在上述SNP上游100～200bp处设计功能特异性上游引物Pia-2FNP-F，如SEQ IDNO.3所示；在上述SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物Pia-2FNP-R，如SEQ ID NO.4所示。通过这2组引物对携带有Pia基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增，分别得到扩增产物A和扩增产物B；然后分别对扩增产物进行直接电泳，或酶切后电泳，比较验证，分别得到与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段Pia-1FNP和Pia-2FNP。

Pia-1FNP的PCR扩增反应体系如下：

Pia-1FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、65℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，取适量样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，3小时，扩增所得到的PCR产物为116bp和125bp，前者即为抗性基因Pia-1的功能特异性分子标记。

步骤（3）所述的PCR扩增反应，其中Pia-2FNP的PCR扩增反应体系如下：

Pia-2FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、53℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶Xba I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，3小时。扩增所得到的PCR产物为142bp，酶切后为123bp，后者（能够被酶切的）即为抗性基因Pia-2的功能特异性分子标记。

实施例3：抗性基因Pia功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用

采集含有不同的稻瘟病抗性基因的8个水稻品种[分别为：Aichi Asahi、C101LAC、C101A51、C101PKT、Nipponbare、Shin 2、BL 1及Fukunishiki (Zenget al.2011.Characterization and fine mapping of the rice blast resistance gene Pia.Science China 54:372-378)的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例2中描述的Pia-1FNP和Pia-2FNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pia功能特异性的分子标记分别进行PCR扩增、酶切及电泳检测。电泳结果分别如图A和图B所示，可见，含有抗性基因Pia的品种（泳道1～4）和不含有抗性基因Pia的品种（泳道5～8）能被成功鉴定区别。

如附图说明的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pia功能特异性分子标记可在鉴别Pia基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP，其特征在于：它由Pia-1FNP和Pia-2FNP组合而成；分别为通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列；Pia-1FNP直接通过电泳检测，Pia-2FNP则经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记；

所述引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-CTTTTGAGCTTGATTGGTCTGC；

SEQ ID NO.2：5’-CTATTGCACCAGAGGGACCAG；

SEQ ID NO.3：5’-GCGCCGCCACAAGGTTG；

SEQ ID NO.4：5’-CGTCACCAAGCTGGTACCTCTAG。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP，其特征在于：所述的水稻为水稻品种Aichi Asahi。

3.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pia包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pia-1和Pia-2。

4.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP，其特征在于：所述的特异性酶切为Xba I酶切。

5.根据权利要求1～3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记的检测方法，其特征在于：通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pia的等位基因序列与Pia-1和Pia-2序列做比对的方法，分析得到能区别于感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia功能特异性的1处STS及1处SNP，再通过引物设计分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，对水稻DNA扩增分别得到Pia功能特异性分子标记Pia-1FNP和Pia-2FNP。

6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的方法，其特征在于包含了以下步骤：

（1）通过常规PCR法扩增，获得多个A型和N型水稻品种的Pia等位基因的编码区DNA序列；

（2）利用多序列比对软件工具，将步骤（1）所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pia-1抗性基因所特异的3处氨基酸缺失，该缺失位于Pia-1 C末端区域；得到Pia-2抗性基因所特异的1处单碱基差异，该差异位于Pia-1 CC区域；

（3）根据步骤（2）所得到的序列差异及标记设计原理，设计出引物对SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；并用这2组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物A和扩增产物B；前者直接电泳检测，后者则经特异性酶切之后电泳检测，然后比较验证，分别获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段Pia-1FNP和Pia-2FNP；

（4）对步骤（3）所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pia抗性基因的功能特异性的分子标记PiaFNP。

7.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述的水稻品种包括Aichi Asahi、9311、Nipponbare及Fukunishiki。

8.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述的扩增产物A的PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液2μl、2.5mM dNTP 1.6μl、10μM引物SEQ ID NO.10.5μl、10μM引物SEQ ID NO.20.5μl、5U/μl TaqDNA聚合酶0.1μl、50ng/μl DNA模板1μl、双蒸水补至20μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃3分钟；94℃30秒、65℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃5分钟；10℃保存；

步骤（3）中所述的Pia-2FNP PCR的反应体系如下：10×PCR缓冲液2μl、2.5mM dNTP 1.6μl、10μM引物SEQ ID NO.3 0.5μl、10μM引物SEQ ID NO.40.5μl、5U/μl TaqDNA聚合酶0.1μl、50ng/μl DNA模板1μl、双蒸水补至20μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃3分钟；94℃30秒、53℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；10℃保存；

Pia-1FNP的PCR扩增反应温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、65℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃5分钟；10℃保存。

9.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的检测方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的Pia-2FNP为利用限制性内切酶Xba I对所述的扩增产物B酶切得到的产物，其反应体系如下：10×酶切缓冲液1.2μl、PCR扩增产物5μl、Xba I酶0.5μl，双蒸水补至12μl。

10.权利要求1～4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP的应用，其特征在于：利用所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaFNP在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。

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