CN102304528A - 稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7及其应用。所述稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）新无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7具有SEQ ID No.1所示的带有启动子的DNA序列，具有SEQ ID No.2所示的cDNA序列。所述基因在自然界中存在3个SNP单元型。本发明还涉及了根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物培育抗病品种；根据该基因序列产生的特异性分子标记在田间稻瘟病菌群体监测中的应用；以及根据监测的结果指导抗病品种合理布局中的应用。

Description

稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7及其应用。 

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是全世界数十亿人口赖以生存的重要粮食作物和重要的工业原料，同时也是多种病虫害的宿主（Normile, 2008）。由病原真菌Magnapothe oryzae (无性态：Pyricularia oryzae Sacc.) 引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，每年都造成10~30%的水稻产量损失（Baker et al.，1997）。而且该菌还能够侵染麦类、谷类等50多种禾本科植物。 

从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，使得抗病品种的抗性不稳定；以致抗病品种的感病化问题一直没有得到解决。稻瘟病菌菌株能否在特定品种上侵染、致病是由该病原菌菌株的无毒基因的产物与寄主植物的抗病基因产物之间的互作决定的。因此，对无毒基因产物结构的分析与研究，是了解病原菌小种和寄主品种专化性互作的生化基础，从病原菌无毒基因着手, 可望阐释稻瘟病菌与水稻的互作关系, 以及病原菌的致病机理，从而，为稻瘟病抗病育种打下坚实的基础,对于植物病害的预防和控制具有重要的指导意义。 

稻瘟病菌与水稻的相互关系是符合“基因对基因”假说的（Flor, 1947; Silue et al., 2000; Bryan et al., 2000; Orbach et al. 2000）。也就是说，抗病品种的感病化是由于原来与抗病品种所持的抗病基因对应的、稻瘟病菌所具有的无毒基因向致病性方向发生了突变而导致的(Kiyosawa 1966; Joosten et al., 1994; Zeigler et al., 1994; Bryan et al., 2000; Orbach et al. 2000)。因此，理论上分析，要想从根本上解决抗病品种的感病化问题，就必须把焦点集中在抗病基因和无毒基因上，以分子生物学手段为先导，结合植物遗传育种学、植物病理学、以及微生物学的基础理论与技术来深入研究它们各自的作用机制，以及两者之间的相互作用。毋庸质疑，这些研究一旦获得突破将使人们深刻地了解植物与病原菌之间存在的基因对基因关系的实质，继而为其防治提供全新的理论与途径（Wit, 1992; Bryan et al., 2000; Orbach et al. 2000）。 

迄今，已克隆的9个稻瘟病菌无毒基因根据其功能可以分为两类。 

第一类无毒基因编码种间特异性的激发子。这一类包括了对弯叶画眉草表现非致病特异性的PWL（pathogenicity on weeping lovegrass）基因家族。在这个基因家族中，PWL2首先通过染色体步移的方法被克隆到，该基因起着阻止稻瘟病菌株侵染弯叶画眉草（Eragrostis curvula）的作用（Sweigard et al., 1995）。用PWL2转化对弯叶画眉草有致病性的野生型菌株，转化子失去了弯叶画眉草的致病性，却完全保留了对其它寄主的致病性。这说明PWL2尽管是一个决定寄主范围的基因，但其功能与经典定义的无毒基因是一样的。PWL2编码富含甘氨酸的亲水性蛋白，内含一个信号肽。 

稻瘟菌中第二类无毒基因为通常意义上的无毒基因，即编码品种特异性（专化性）的激发子。这一类基因包括AVR-Pita（以前称AVR2-YAMO），ACE1、 AVR1-CO39、AvrPiz-t、AvrPia、AvrPii及AvrPik/km/kp。但这3个基因在稻瘟病菌生长发育方面具有什么样的功能还有待于进一步的研究。 

       尽管到目前为止，随着分子生物学的快速发展，大约已经有40 个稻瘟病菌无毒基因完成了染色体的初步定位，但已被克隆的无毒基因却只有9 个（Liu et al.，2010）。在这9 个稻瘟病菌无毒基因中，PWL1（Kang et al.，1995）和PWL2 (Sweigard et al.，1995) 都是控制稻瘟病菌对弯叶画眉草的致病性，具有强烈的寄主特异性；而另外7 个无毒基因AVR-Pita（Orbachet al.，2000）、AVR1-CO39（Farman and Leong，1998）、ACE1（B?hnert et al.，2004）、AvrPiz-t（Liet al.，2009）、AVR-Pia、AvrPii和AvrPik/km/kp（Yoshidaet al.，2009）均来源于水稻，控制稻瘟病菌对水稻的致病性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7，进一步地，提供包含调控这个基因的启动子的DNA片段。 

本发明的另一个目的是提供所述稻瘟病菌无毒基因所编码的蛋白质。 

本发明的另一个目的是提供所述含有上述无毒基因的载体。 

本发明的另一个目的是提供所述载体转化的转基因菌株。 

本发明提供一种稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7，其具有SEQ ID No. 1所示的带有启动子的DNA序列；具有SEQ ID No. 2所示的cDNA序列。 

本发明同时提供所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7编码的蛋白质，其具有SEQ ID No. 3所示序列。 

本发明提供所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的应用，将含有该基因的菌株与其他菌株遗传杂交而生产具有所述稻瘟病菌无毒基因的菌株；或将所述稻瘟病菌无毒基因与相应的抗病基因共同组装于同一载体上并遗传转化水稻品种，培育新的抗病品种； 

本发明同时提供所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的核苷酸序列产生的特异性的分子标记。

利用所述分子标记监测田间稻瘟病群体小种的变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局。 

本发明还提供所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的载体。所述载体应用于生产所述无毒基因的等基因（或近等基因）菌株，即通过转基因技术，将该基因遗传转化到毒性菌株中；或将该载体与相应的抗病基因的载体共同转化到水稻品种中，培育新的抗病品种。 

       本发明从稻瘟病菌菌株CHL346中分离得到AvrPik/kp/km/kh/7基因，该基因赋予稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）对水稻产生特异性（专化性）的非致病性反应（Feng et al., 2007, Chinese Science Bulletin 52: 903-911）。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的带有启动子的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的cDNA序列，或者基本上相当于SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO.2所示的DNA序列，其编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，结构如附图6B所示；该基因编码的蛋白的N末端含有21个氨基酸组成的信号肽。 

       所分离、克隆的AvrPik/kp/km/kh/7无毒基因在自然界中存在3 个SNP单元型；且这3个单元型的基因编码的3 种蛋白之间存在非同义替换关系。应当理解，在不影响蛋白活性的前提下（不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种替换、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。对AvrPik/kp/km/kh/7基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。对该基因的编码区的单个核苷酸位点进行定点突变，可能会导致基因无毒性功能的丧失或改变。    本发明同样包括将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和侵入植株的不同时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子、构巢曲霉trpC启动子等（冯淑杰 2005，华南农业大学博士论文；Li et al. 2010, Molecular Plant-Microbe Interactions 23: 317-331）。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变该基因的表达。其中环境条件包含植株的生长状况，温度，湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、附着胞形成、侵染钉分化和侵染菌丝扩展等。 

       根据本发明提供的AvrPik/kp/km/kh/7基因序列信息（SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2），本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与AvrPik/kp/km/kh/7等同的基因：（1）通过数据库检索获得；（2）以AvrPik/kp/km/kh/7基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；（3）根据AvrPik/kp/km/kh/7基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；（4）在AvrPik/kp/km/kh/7基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5）用化学合成的方法获得该基因。 

本发明提供的稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7具有重要的应用价值。应用之一是根据该基因的结构及其功能来设计新型农药的分子靶点。 

应用之二是将所述的AvrPik/kp/km/kh/7基因序列连接到任何一种转化载体，用任何一种转化方法将AvrPik/kp/km/kh/7无毒基因和相应的抗病基因Pik/kp/km/kh/7共价导入水稻或其他植物细胞。也就是说，将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下，而将相应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原菌的定殖和扩展。由于这种工程植物是基于寄主抗病反应后各种防卫反应的综合表达和作用，因此，这种新型的抗性是稳定而持久的。 

本发明提供的无毒基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP（单核苷酸多态）、SSR（简单序列重复多态）、RFLP（限制性内切酶长度多态）、CAPS（切割扩增片段多态）。用这些标记可监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该无毒基因在田间自然群体中的分布情况。有助于基于无毒基因标记的稻瘟病菌的群体遗传学研究；也有助于水稻品种的抗病性鉴定和稻瘟病菌小种的鉴定；还有助于抗病品种的合理布局和轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生。 

发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的无毒性的转基因菌株，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的菌株。也可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的菌株。 

本发明的有益效果是： 

本发明获得一种新的稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7，基于所述基因的结构及其应用试验结果，设计新型农药的分子靶点；通过转基因技术，将所述基因遗传转化到毒性菌株中，以生产所述基因的等基因（或近等基因）菌株，这些菌株可广泛应用于农药开发、稻瘟病菌小种监测，以及理论研究方面；建立基于所述基因的序列开发的分子标记的稻瘟病菌自然群体致病性变异的分子检测体系，了解和把握所述基因在田间自然群体中的分布及其动态变化规律，以此来指导各个地区水稻抗稻瘟病育种以及品种合理布局和轮换，以便提高育种效率，更有效地控制稻瘟病的发生；利用所述基因的序列及其编码的产物，通过生物化学等手段，找到与之特异性互作的寄主植物（如水稻等）的蛋白质，由此了解和揭示稻瘟病菌小种与水稻等品种间特异性互作的分子机理，以此来设计稻瘟病防治的新策略。

附图说明

图1为本发明采用的稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7 的克隆及其功能研究的技术路线图； 

图2稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7 的整合电子物理图谱；

图2a. AvrPik/kp/km/kh/7 位点调整后的电子物理图谱（Feng et al. 2007），其中位于supercontig 2.17的分子标记ASP-CO39, CAG2, MS1-21, MS1-25, MS1-15由于稻瘟病菌基因组序列新、旧版本的差异以及异常重组体的存在而被移动，水平线上侧括号中的数值代表对应连锁标记位点的重组体数；水平线下数值为根据参考菌株70-15的旧版本序列推测的物理距离（kb）；TEL，端粒；

图2b. 稻瘟病基因组第1染色体的旧版本重叠群图，其中supercontig 2.17 在新版本中已被分散于不同的染色体上；

图2c. 稻瘟病基因组第1染色体的新版本重叠群图。水平线上侧的数值为根据参考菌株70-15的新版本序列推测的物理距离；*由日本研究者克隆的AvrPik/kp/km 的位置 (Yoshida et al. 2009)；

图3 AvrPik/kp/km/kh/7 基因功能获得性及功能丧失性转化子的PCR检测结果图； 图3a. AvrPik/kp/km/kh/7 基因功能获得性转化子基于HPH 基因的分子检测；M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（受体菌株CHL688）；2：阳性对照（转化载体pBHT2）；3：阴性对照（H₂O）；4~12：转化子菌株；

图4  AvrPik/kp/km/kh/7 基因功能丧失性转化子（RNAi）基于基因及载体特异引物的分子检测；M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（供体菌株CHL346）；2：阳性对照（转化载体pSilent-1）；3：阴性对照（H₂O）；4~17：转化子菌株；

图5 AvrPik/kp/km/kh/7 基因基于同源重组基因置换的原理及其转化子的验证；A：基于同源重组基因置换原理的示意图；B：基因置换转化子基于三重PCR技术的分子验证；M：DNA分子量标记，DL2000；D：供体菌株（CHL346）； V：敲除载体（pGKO2-AvrPi7）； 1~10：敲除转化子；

图6稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 的基因结构及其蛋白序列；图4A.基因结构图及其自然界存在的3个SNP单元型；图4B. 推导的蛋白序列图，下划线部分为信号肽；

图7为AvrPik/kp/km/kh/7 基因定点突变 (MK3, C 1565 G) 转化子菌株基于HPH基因的分子检测；M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（受体菌株CHL724）；2：阳性对照（载体pBHT2）； 3：阴性对照（H2O）； 4～18：转化子菌株；

图8 为基于Southern 杂交技术验证不同转化事件的转基因菌株的T-DNA插入拷贝数；各个菌株的基因组DNA以 EcoRI 酶切之后，以1.4-kb 的潮霉素抗性基因（HPH）片段为探针进行Southern 杂交；图中：CHL346和CHL1962为供体菌株；CHL688和CHL724为受体菌株；前缀为WK-，WKI-，MK- 和WKK-分别代表为功能获得性转化子，基于RNAi 的功能丧失性转化子，基于定点突变的功能丧失性转化子，以及基于基因置换的功能丧失性转化子（详见表1，2）；

图9基于实时定量RT-PCR技术分析AvrPik/kp/km/kh/7 基因在不同遗传背景、不同发育阶段的表达特征；图9A. 功能获得性转化子与供体及受体菌株的比较；图9B. 基于RNAi的功能丧失性转化子与供体及受体菌株的比较；图9C. 基于定点突变的功能丧失性转化子与供体及受体菌株的比较；Myc：菌丝体；Con：分生孢子; GT：发芽管；App：早期的附着胞； Map：成熟的附着胞； 

图10利用GFP标记分析AvrPik/kp/km/kh/7 基因在稻瘟病菌不同发育阶段的时空表达；上图: 以RP27为启动子的GFP构建体作为对照；中、下图：分别为以RP27 和目的基因本身的启动子构建的目的基因与GFP融合的构建体。DIC：光学显微观察；GFP：GFP荧光观察；Merged：光学与荧光观察叠加；

图11基于稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 的SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）标记的稻瘟病菌株的鉴定；每个SNP的基因型1：PCR 产物不能被相应的内切酶酶切；基因型2：PCR 产物能被相应的内切酶部分地酶切；基因型3：PCR 产物能被相应的内切酶完全地酶切；由此，7个菌株（A—G）的AvrPik/kp/km/kh/7的基因型由3个SNP的基因型组合而成：A：111 (EHL0338)；B：112 (EHL0856)； C：123 (EHL0472)；D：211 (EHL0979)；E：212 (CHL2384)；F；223 (EHL0486)；G：311 (CHL2446)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，我们阐述了AvrPik/kp/km/kh/7基因的分离克隆、功能特征、分子鉴定以及应用，分离的AvrPik/kp/km/kh/7基因能够与适当的载体连接，转入菌株中，使该菌株对含有特异性互作的抗病基因的植物产生无毒性。 

实施例1：稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的克隆方法及电子物理图谱的构建

先前的定位研究表明AvrPi7基因位点最终被界定在标记MS1-21和MS1-22 之间的75 kb区段内，这些与目标基因紧密连锁的标记分别着陆于参考菌株70-15旧版本的基因组序列的超重叠群 supcontig 2.17上（Feng et al. 2007, Chinese Science Bulletin. 2007, 52: 903-911）。2008年7月，稻瘟病菌全基因组序列最新的6.0版数据库的公布（http://www.broad.mit.edu/ annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html），使得稻瘟病菌的全基因组序列得到了补充和完善。因此，本发明根据稻瘟病菌基因组序列新、旧版本的差异以及异常重组体的存在，将位于supercontig 2.17上的分子标记ASP-CO39, CAG2, MS1-21, MS1-25, MS1-15移去，如附图2a所示；根据参考菌株70-15最新版本的序列，重新构建了稻瘟病菌基因组第1染色体的重叠群图，并据此推测出各个标记之间的物理距离，如附图2 c所示（Feng et al. 2007）。日本研究者Yoshida等（2009, Plant Cell 21: 1573-1591）克隆了稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km, 通过生物信息学分析 (bioinformation analysis, BIA), 利用稻瘟病菌数据库软件BLASTN（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/Blast.html）将该无毒基因簇着陆于最新版的超重叠群6.29上，与端粒2的距离是10 kb。因此，本发明以稻瘟病菌70-15的最新版的全基因组序列信息为基础，通过生物信息学手段，把二者的物理位置进行整合，并由此构建了目的区域的重叠群图，如附图2 c所示。附图2中， a. AvrPik/kp/km/kh/7 位点调整后的电子物理图谱（Feng et al. 2007），其中位于supercontig 2.17的分子标记ASP-CO39, CAG2, MS1-21, MS1-25, MS1-15由于稻瘟病菌基因组序列新、旧版本的差异以及异常重组体的存在而被移动。水平线上侧括号中的数值代表对应连锁标记位点的重组体数；水平线下数值为根据参考菌株70-15的旧版本序列推测的物理距离（kb）；TEL，端粒。b. 稻瘟病基因组第1染色体的旧版本重叠群图，其中supercontig 2.17 在新版本中已被分散于不同的染色体上。c. 稻瘟病基因组第1染色体的新版本重叠群图。水平线上侧的数值为根据参考菌株70-15的新版本序列推测的物理距离。*由日本研究者克隆的AvrPik/kp/km 的位置 (Yoshida et al. 2009)。

实施例2：稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7候选基因的预测注释及序列分析

       为了确定AvrPik/kp/km/kh/7的候选基因，本发明利用菌株70-15的参考序列，利用2个基因注释系统Broad Magnaporthe grisea Database Browse Regions （http:// www. broad.mit.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/Regions.html）和Softberry FGENESH 2.6（http://www.softberry.com/berry.phtml）对目的基因区域进行了基因预测及注释分析和总结，初步确定了AvrPik/kp/km/kh/7的候选无毒基因为编码的蛋白具有N末端分泌信号肽的候选基因，再通过以下的基因功能互补实验确认其功能。

实施例3：稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的转化与转化子的无毒性鉴定

利用高保真（high fidelity, HF）PCR技术从供体菌株CHL346基因组DNA中扩增了（PCR扩增条件为：预变性98℃ 30 sec，然后是98℃ 10 sec，63℃ 15 sec，72℃ 1 min，扩增35个循环，最后72℃延伸10 min。）该候选基因的大约2.1 kb的片段，并将其克隆至双元转化载体pBHt2上，然后导入了农杆菌菌株C58C1（吴毅歆等，2008，植物保护学报，35: 421-426；Mullins et al. 2001, Phytopathology 91:173-180；Khang et al. 2007, Methods in Molecular Biology 344: 403-420）。然后，通过农杆菌介导的稻瘟病菌遗传转化法，将该基因分别导入强毒性受体菌株CHL688及CHL724中，进行了基于遗传互补的功能获得性实验（冯淑杰 2005； Li et al. 2009, Molecular Plant-Microbe Interactions 22: 411-420）。

利用转化载体中的潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）标记对转化子进行了PCR检测（冯淑杰 2005； Li et al. 2009）。检测结果证明目的基因片段已经被成功地导入无毒性转化子中，如附图3所示。 

附图3中，a. AvrPik/kp/km/kh/7 基因功能获得性转化子基于HPH 基因的分子检测。M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（受体菌株CHL688）；2：阳性对照（转化载体pBHT2）；3：阴性对照（H₂O）；4～12：转化子菌株。 

本发明对各个转化事件获得的转化菌株利用一套稻瘟病抗病单基因系鉴别品种进行了致病性鉴定，表1所示稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 的功能获得及丧失性分析。表1中，^a与稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7 特异性互作的5个抗病基因 (Pik, Pik-p, Pik-m, Pik-h, 和 Pi7)，以及非特异性互作的3个抗病基因 (Pi5, Pii, 和 Pia) 的单基因系被选作致病性鉴定；A，无毒；V，有毒。^b 4个构建体（AvrPik-25，CHL1962-1，RNAi-5和AvrPik-K4）分别通过载体 pBTH2，pBTH2，pSilent-2 和pGK02遗传转化到各自的受体菌株中。* RNA干涉失败的转化子被选作对照。 

结果表明，大多数的转化菌株在毒性菌株CHL688与CHL724的遗传背景下，表现了与无毒基因供体菌株CHL346相同的无毒性。由此证明了候选基因具有对5个抗病基因 (Pik, Pik-p, Pik-m, Pik-h 和 Pi7)的无毒性功能，因此，命名为无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7。而这些转化子菌株对与之非特异性互作的3个抗病基因 (Pi5, Pii, Pia)的毒性则没有改变（与受体菌株CHL688和CHL724的相同）。 

  

实施例4：稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7基于RNAi以及基于knock out的功能丧失性实验

为了进一步确认AvrPik/kp/km/kh/7的功能，申请人进行了基于RNAi的功能丧失性实验，技术路线如附图1所示。即基于PEG介导的稻瘟病菌原生质体转化法，将携带有AvrPik/kp/km/kh/7基因ORF的RNAi载体（pSilent-1）导入菌株CHL346的原生质体中，以期沉默该供体菌株中的AvrPik/kp/km/kh/7基因。并对获得的转化子进行了基于基因及载体特异引物的PCR检测；结果表明在大部分的转化子中检测到了携带有AvrPik/kp/km/kh/7基因ORF的RNAi载体，如附图4所示，AvrPik/kp/km/kh/7 基因功能丧失性转化子（RNAi）基于基因及载体特异引物的分子检测。M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（供体菌株CHL346）；2：阳性对照（转化载体pSilent-1）；3：阴性对照（H₂O）；4～17：转化子菌株。

   本发明进一步地对供体菌株CHL346中的AvrPik/kp/km/kh/7基因进行了基于同源重组基因置换的knock out（基因敲除）功能丧失性实验，技术路线如附图1所示。即基于农杆菌介导的稻瘟病菌遗传转化法（冯淑杰 2005； Li et al. 2009），将AvrPik/kp/km/kh/7基因的敲除构建体（pGKO2-AvrPi7）导入菌株CHL346的分生孢子中（Khang et al. 2007），见附图5A所示，以期基于同源重组的策略敲除受体菌株CHL346中的AvrPik/kp/km/kh/7基因。随后，对基因置换转化子进行了基于三重PCR技术的分子验证，结果表明，获得的10个敲除转化子都是同源重组的转化子，菌株CHL346中的AvrPik/kp/km/kh/7基因已被成功地替换，如附图5B所示。AvrPik/kp/km/kh/7 基因基于同源重组基因置换的原理及其转化子的验证。A：基于同源重组基因置换原理的示意图；B：基因置换转化子基于三重PCR技术的分子验证。M：DNA分子量标记，DL2000；D：供体菌株（CHL346）； V：敲除载体（pGKO2-AvrPi7）； 1～10：敲除转化子。 

为了确认上述RNA干涉菌株及敲除菌株中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的功能是否已丧失，申请人对这些转化子进行了致病性鉴定（鉴定方法参见Pan et al. 2003, Acta Bot Sin 45: 871-877）。结果表明，与RNA干涉失败的转化子相比，RNA干涉成功的转化子中的AvrPik/kp/km/kh/7基因功能完全丧失。而敲除转化子丧失了对特异性互作的3个抗病基因 (Pik, Pik-p, Pi7) 的无毒性，但仍然保留了对特异性互作的2个抗病基因 (Pik-m, Pik-h) 的无毒性，部分实验数据见表1所示。而这些转化子菌株对与之非特异性互作的3个抗病基因 (Pi5, Pii, Pia) 的毒性则没有改变（与受体菌株CHL346的相同）。 

实施例5：AvrPik/kp/km/kh/7基因的序列及结构

采用移步法对AvrPik/kp/km/kh/7的DNA序列进行了测定。并用DNAStar软件进行该基因ORF的预测。序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别是AvrPik/kp/km/kh/7的DNA和cDNA序列。AvrPik/kp/km/kh/7基因DNA长度为2184 bp，其全长cDNA为679 bp，含有一个342 bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为165 bp和173 bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框只有1个外显子没有内含子，见附图5 A。同时，采用移步法对本实验室保存的多个稻瘟病菌田间菌株（CHL1962、CHL42等）的AvrPik/kp/km/kh/7基因进行了克隆、测序，然后，利用基因MegAlign软件进行多序列比对。结果表明，该无毒基因在自然界中存在3 个SNP单元型，且这些SNP位点均位于基因的编码区，附图6为稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 的基因结构及其蛋白序列。附图6A.基因结构图及其自然界存在的3个SNP单元型，附图6B推导的蛋白序列图，下划线部分为信号肽。

实施例6：AvrPik/kp/km/kh/7无毒蛋白的序列及结构

AvrPik/kp/km/kh/7基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID No. 3所示。无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7编码1个由113个氨基酸残基组成的蛋白多肽。运用SignalP-v3.0、Protcomp-v6.0、TMHMM-v2.0、GPI等生物信息学网站对该基因编码的蛋白进行结构分析，结果表明该基因编码的蛋白具有分泌蛋白的特征，其N末端1-21 个氨基酸区域是信号肽区域，见附图6B。

实施例7：AvrPik/kp/km/kh/7基因基于SNP位点的定点突变分析实验

AvrPik/kp/km/kh/7基因的序列如SEQ ID No. 1所示，经过序列分析比较，发现无毒菌株CHL346的DNA序列的第1562、1565、1569个碱基分别为C、C、G，而另一个无毒菌株CHL1962则是A、C、G，有毒菌株CHL42则是A、G、A。这3个SNP（单核苷酸多肽性）位点，最终导致了相应的氨基酸的不同，无毒菌株CHL346这3 个位点处对应的氨基酸分别是组氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）; 无毒菌株CHL1962这3 个位点处对应的氨基酸分别是天冬酰胺（Asn）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）; 有毒菌株CHL42这3 个位点处对应的氨基酸分别是天冬酰胺（Asn）、丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）。因此，根据无毒菌株这3个SNP位点的序列，利用TaKaRa MutanBEST Kit定点突变试剂盒，分别针对每个SNP位点设计2对5’端邻近、3’端方向相反的引物，且在正向引物中导入变异点（定点突变的原则是把无毒野生型蛋白突变为有毒型蛋白以及第三方蛋白；按照试剂盒的说明书操作）。引物序列如下：

AvrPi7-Mut-F1：TTCGAC A AC G CTG A TATTCCTG，

AvrPi7-Mut-R1：AAAAGTTAGGGTCTCGCTCTCG；

AvrPi7-Mut-F2：TTCGAC T ACCCTGGTATTCCTGT，

AvrPi7-Mut-R1：AAAAGTTAGGGTCTCGCTCTCG；

AvrPi7-Mut-F3：CCTAACTTTTTCGACCAC G CTG，

AvrPi7-Mut-R2：GGGTCTCGCTCTCGACTTAGGT；

AvrPi7-Mut-F4：CCTAACTTTTTCGACCAC A CTG，

AvrPi7-Mut-R2：GGGTCTCGCTCTCGACTTAGGT；

AvrPi7-Mut-F5：TTCGACCACCCTG A TATTCCTG， 

AvrPi7-Mut-R1：AAAAGTTAGGGTCTCGCTCTCG；

AvrPi7-Mut-F6：TTCGACCACCCTG C TATTCCTG，

AvrPi7-Mut-R1：AAAAGTTAGGGTCTCGCTCTCG。

通过Phusion^TM聚合酶（购自New England BioLabs公司）进行PCR扩增（PCR扩增条件为：预变性98℃ 30 sec，然后是98℃ 10 sec，63℃ 15 sec，72℃ 2 min 30 sec，72℃ 5 min，扩增35个循环，最后72℃延伸10 min），利用PCR扩增的碱基错配，将无毒菌株CHL346的1562处的C分别突变A和T；1565处的C分别突变为G和A；1569处的G分别突变为A和C。对PCR产物进行回收，并用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒对回收产物进行末端平滑及5’端磷酸化反应。最后将获得的含有突变位点的6个片段克隆到pBHT2载体上，并进行遗传转化及功能互补验证（Mullins et al. 2001；Khang et al. 2007）。在进行毒性（致病性）鉴定之前，对所有6个定点突变事件的转化子都进行了基于潮霉素基因（HPH）标记的分子鉴定，结果见表2。附图7为AvrPik/kp/km/kh/7 基因定点突变 (MK3, C 1565 G) 转化子菌株基于HPH基因的分子检测。M：DNA分子量标记，DL2000；1：阴性对照（受体菌株CHL724）；2：阳性对照（载体pBHT2）； 3：阴性对照（H₂O）； 4～18：转化子菌株。附图5仅显示对MK3（C 1565 G）转化事件进行分子鉴定的结果。检测结果证明，已经突变的目的基因片段已经被导入转化子中。 

利用一套稻瘟病抗病单基因系鉴别品种对这6 个定点突变转化事件的转基因菌株进行了鉴定，表2 为稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 基于SNP 位点的定点突变分析。表2表明，在毒性菌株CHL724的遗传背景下，无毒性菌株CHL346中的AvrPik/kp/km/kh/7基因经过定点突变之后，MK2-16部分地丧失了对特异性互作的3个抗病基因 (Pik, Pik-p, Pik-h) 的无毒性，但仍然保留了对特异性互作的2个抗病基因 (Pik-m, Pi7) 的无毒性；而其余5个定点突变菌株则完全丧失了对特异性互作的5个抗病基因 (Pik, Pik-p, Pik-m, Pik-h, 和 Pi7) 的无毒性。而这些转化子菌株对与之非特异性互作的3个抗病基因 (Pi5, Pii, Pia)的毒性则没有改变（与受体菌株的相同）。 

实施例8：Southern杂交技术实验验证不同转化事件的转基因菌株的T-DNA插入拷贝数

利用常规的CTAB法从野生型菌株（非转基因菌株）以及不同转化事件中选择的代表性转基因菌株的菌丝体中提取大量的基因组DNA，见附图8所示，并用EcoRⅠ酶切各个菌株的基因组DNA, 随后，以1.4 kb的潮霉素抗性基因（HPH）片段为探针进行Southern杂交（以验证野生型以及转基因菌株中T-DNA的插入拷贝数。Southern杂交根据Roche公司的地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书操作（DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Kit I）。结果表明，除了基于RNAi的功能丧失性转化子WKI13的T-DNA是多拷贝插入之外，其他的功能获得性转化子、基于定点突变的功能丧失性转化子以及基于基因置换的功能丧失性转化子中的T-DNA都是单拷贝插入的，结果见附图8所示基于Southern 杂交技术验证不同转化事件的转基因菌株的T-DNA插入拷贝数。各个菌株的基因组DNA以 EcoRI 酶切之后，以1.4-kb 的潮霉素抗性基因（HPH）片段为探针进行Southern 杂交 。图中：CHL346和CHL1962为供体菌株；CHL688和CHL724为受体菌株；前缀为WK-，WKI-，MK- 和WKK-分别代表为功能获得性转化子，基于RNAi 的功能丧失性转化子，基于定点突变的功能丧失性转化子，以及基于基因置换的功能丧失性转化子，详见表1和表2所示。

实施例9：AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达特性分析实验

利用实时定量RT-PCR技术对AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达模式进行了分析。选择无毒菌株CHL346、毒性菌株CHL724、功能获得性转化子WK77、基于RNAi的功能丧失性转化子WKI13以及基于定点突变的功能丧失性转化子MK1-16与MK2-16为代表菌株，（附图9），分别采集菌丝体、分生孢子、发芽管、早期的附着胞及成熟的附着胞，利用TRIzol R试剂盒提取其总RNA（按照试剂盒的说明书操作），利用反转录试剂盒SuperScript^TM Reverse Transcriptase III进行反转录cDNA第一条链的合成（按照试剂盒的说明书操作）。RT-PCR引物的核苷酸序列如下：

RT-F: 5’ ACGTCAAGATGCTGGAACCTG 3’;

RT-R: 5’ CCCCAAAACAATCCAACCTG 3’ 。

定量RT-PCR使用CFX96 Real-time PCR检测系统和SYBR Premix Ex Taq试剂盒（宝生物公司），操作按照试剂盒说明进行。结果见附图9所示基于实时定量RT-PCR技术分析AvrPik/kp/km/kh/7 基因在不同遗传背景、不同发育阶段的表达特征；Myc：菌丝体；Con：分生孢子; GT：发芽管；App：早期的附着胞； Map：成熟的附着胞。附图9A为转化子WK77与其供体（CHL346）及受体菌株（CHL724）中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平的比较，结果表明受体菌株CHL724成熟的附着胞中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平最低。附图9B为RNA干涉转化子WKI-13与其无毒性受体菌株（CHL346）以及毒性对照菌株（CHL724）中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平的比较，结果表明无毒性菌株CHL346成熟的附着胞中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平最高，而其干涉转化子WKI-13成熟的附着胞中的该基因的表达水平与毒性对照菌株（CHL724）的相当。附图9C为2个定点突变转化子MK1-16、MK2-16与其无毒性野生型菌株（CHL346）以及毒性受体菌株（CHL724）中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平的比较，结果表明无毒性野生型菌株CHL346成熟的附着胞中的AvrPik/kp/km/kh/7基因的表达水平最高，而其定点突变转化子MK1-16、MK2-16成熟附着胞中的该基因的表达水平与其毒性受体菌株CHL724的相当。 

这些结果一致表明，无毒基因在无毒性菌株（包括功能获得性转化子菌株）与毒性菌株（包括各种功能性丧失性转化子菌株）之间在早期的附着胞阶段开始存在明显的差异，前者表达水平高，后者表达水平低。 

实施例10: 利用GFP标记分析AvrPik/kp/km/kh/7 基因在稻瘟病菌不同发育阶段的时空表达

利用GFP标记对AvrPik/kp/km/kh/7 基因在稻瘟病菌不同发育阶段的时空表达进行了分析。AvrPik/kp/km/kh/7基因GFP融合表达载体的构建原理是：首先，分别将RP27-eGFP-term与eGFP-term的eGFP表达盒组装到pBHT2-AscI载体上，构建pBHT2-RP27-eGFP-term与pBHT2-eGFP-term载体。其次，将AvrPik/kp/km/kh/7基因的ORF融合到eGFP基因的前端，即利用菌株CHL346的基因组DNA作模板，用Phusion^TM高保真酶扩增出AvrPik/kp/km/kh/7基因的ORF片段。将其连接到上述载pBHT2-RP27-eGFP-term上，从而构建了稻瘟病菌强组成型启动子启动的pBHT2-RP27-AvrPi7-eGFP载体。再次，将包含自身启动子的AvrPik/kp/km/kh/7基因的ORF融合到eGFP基因的前端，利用菌株CHL346的基因组DNA作模板，用Phusion^TM高保真酶扩增出包含自身启动子的AvrPik/kp/km/kh/7基因的ORF片段，并将其连接到上述载pBHT2-eGFP-term上，构建成AvrPik/kp/km/kh/7基因自身启动子启动的pBHT2-Native promoter-AvrPi7-GFP载体。

基于农杆菌介导的遗传转化法，上述2 个eGFP融合蛋白构建体及对照空载体（pBHT2-RP27-eGFP-term）被转入稻瘟病菌毒性菌株CHL688中。随后，对阳性转化子的分生孢子进行培养，并选取0 h和8 h这2 个时间段，观察从分生孢子萌发到形成附着胞阶段的AvrPik/kp/km/kh/7基因表达情况。结果表明，目的基因在初期集中分布于一个孢子中两端最活跃的细胞；8 h 之后，则慢慢地转移到附着胞中。附图10为利用GFP标记分析AvrPik/kp/km/kh/7 基因在稻瘟病菌不同发育阶段的时空表达。附图10中包括A图（0h）和B图（8h）；A和B图中的上图：以RP27为启动子的GFP构建体作为对照；A和B图中的中、下图：分别为以RP27 和目的基因本身的启动子构建的目的基因与GFP融合的构建体。DIC：光学显微观察；GFP：GFP荧光观察；Merged：光学与荧光观察叠加。 

实施例11：AvrPik/kp/km/kh/7基因的SNP标记在稻瘟病菌群体遗传学研究中的应用

   如实施例7所述，在自然界中AvrPik/kp/km/kh/7基因存在3个SNP单元型，利用这3 个位点分别开发如下SNP标记：

AvrPi7-SNP-1 (AvrPi7-SNP-1F: GAGACCCTAACTTTTTCGGC，AvrPi7-SNP-1R: CCAACCTGGAGGGAAGTCG，扩增产物用限制性内切酶HaeШ酶切)；

AvrPi7-SNP-2 (AvrPi7-SNP-2F: ACCCTAACTTTTTCGACCGC，AvrPi7-SNP-1R: CCAACCTGGAGGGAAGTCG，扩增产物用限制性内切酶HhaI酶切) ；

AvrPi7-SNP-3 (AvrPi7-SNP-3F: CACATTCCTTCTCACTTTGG，AvrPi7-SNP-3R: CCAAAAACATTCGGGTACAGGAAGA，扩增产物用限制性内切酶HhaI酶切)。

3对SNP引物结合既可以确认AvrPik/kp/km/kh/7基因在自然界中存在的3个SNP单元型（扩增产物的酶切效果不同），又可以用于鉴定来自不同地区的稻瘟病菌菌株的鉴定，附图11为基于稻瘟病菌无毒基因 AvrPik/kp/km/kh/7 的SNP标记的稻瘟病菌株的鉴定。每个SNP的基因型1：PCR 产物不能被相应的内切酶酶切；基因型2：PCR 产物能被相应的内切酶部分地酶切；基因型3：PCR 产物能被相应的内切酶完全地酶切。由此，7个菌株（A—G）的AvrPik/kp/km/kh/7的基因型由3个SNP的基因型组合而成：A：111 (EHL0338，湖南)；B：112 (EHL0856，黑龙江)； C：123 (EHL0472，辽宁)；D：211 (EHL0979，湖南)；E：212 (CHL2384，广东)；F；223 (EHL0486，辽宁)；G：311 (CHL2446，广东)。本实施例在附图11仅提供上述7个代表菌株（A—G）由AvrPik/kp/km/kh/7的3个SNP的基因型组合而成的基因型，仅仅为了说明通过3个SNP的鉴定，并不作为本发明实现的技术依赖。采用本发明方法可以对任何来源的菌株（包括稻瘟病菌，但不限于稻瘟病菌）进行基因型鉴定，本发明为基于无毒基因标记的稻瘟病菌的群体遗传学研究提供重要技术基础，为从基因水平上监测田间稻瘟病群体小种变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局提供新的技术方案。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7及其应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.2

 

<210>  1

<211> 2184

<212>  DNA

<213>  稻梨孢属稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae (无性态：Pyricularia oryzae Sacc.)）

 

 

<220>

<221>  5'UTR

<222>  (1262)..(1427)

 

<220>

<221>  gene

<222>  (1427)..(1768)

 

<220>

<221>  exon

<222>  (1427)..(1768)

 

<220>

<221>  3'UTR

<222>  (1768)..(1941)

 

 

<400>  1

aaaaggaata aggcggacct ctctgattca ataacgactt tactgaaagc tcaaaacgct  60

gcgaatcgga tagaaataat cgtgatttga atggcggcta cacccacgtg ggacattgtg  120

agaattttgg aagcttggag ggctaaagca gagtgtaaat actccgttgt tttcagctag  180

atgatttgaa cttggcttat tttactttta aattgacatt tttcgaaacc ttttattctc  240

cacgtgcacg acaaacagga tgggattacg cccggcgcac atcaacagcg aaagttcaac  300

attaaacttc ggcgcatgtg acaccggcaa tatttgtgcc taaggtaaac aaaaacatcg  360

aaattgaagt tagtctatag gatggtggat ccatccgata ctatggtttg ttgtcataga  420

acgaaaataa aatcttgcag ccgtattaac caaaacttac actagttaca ctatttaggt  480

cgcagacatc gttgctgcaa acaactgcca acagttagga actcctctat ctctcaccaa  540

accaaaacag agctccgttc tcagaaagtc catcattatc acgtaatact ttttgtttct  600

ttgtcgtttg ctaccctttc ttttcctgta tcctgctgct aactccattc atttgctcct  660

tgttagttcc ccctatggct ccgaatggta cagatagtct cgattcagaa gttaggcatt  720

cctgtcctcc ctttggttgg agtcgggcnc ctcttygcgt tattgtcggt tacagtcctg  780

atcattattg gctgccagcc gccctttgtt attcgtattt ctatttttgg gtgtcgcggg  840

atgaaggtat ttcaatttaa atcttttgcg gcattacatg ttaaatttac tcataatgca  900

agcatataaa tgtgtattaa tagttgaacg actgcttttc ttttgtttac gcggtgaatt  960

attnaaggtt ctattgttac attattggct gccagccgcc ctttgttatt cgtatttcta  1020

tttttgggtg tcgcgggatg aaggcatttc aatttaaatc ttttgcggca ttaaatgtta  1080

aatttactca taatgcaagc atataaatgt gtattaatag tcgaacgact gcttttcttt  1140

tgtttacgcg atgaattatt gaaggttcta ttattatgca ggaaagtatt ttgaataatt  1200

aacttgtaat taggtgaatg caagtaaaag tgaaggtcac ggtttgaaga gggggcggat  1260

aatataaatg gccctcgtaa aatccaattc caatttattc aactgccact ctgcacacat  1320

caacagtctt tcaattttcg ccttcccatt tttaaacata ctttttaaca ttttacagac  1380

tcttctttaa ctttgtttgc aaaagacatt attttgaaaa gtcaatatgc gtgttaccac  1440

ttttaacaca ttccttctca ctttgggaac tgtcgctgtc gtcaatgccg aaacgggcaa  1500

caaatatata gaaaaacgcg ctatcgacct aagtcgagag cgagacccta actttttcga  1560

ccaccctggt attcctgtac ccgaatgttt ttggtttatg tttaaaaaca acgtacgtca  1620

agatgctgga acctgttaca gctcttggaa aatggacatg aaagttggtc caaactgggt  1680

ccatattaaa tcagacgata attgcaattt gtcgggcgac ttccctccag gttggattgt  1740

tttggggaaa aaaaggcccg gcttttaaat taaaaggaaa tcacagttaa ggcaacgtag  1800

ggaggtttga cgaggtttac gcttggttga cggctcataa gataatgcat gggcgccttg  1860

cttataaaga aattcggtaa aatccattat tttaaaacct agttagaaca atggaattat  1940

tacgaaagcg ctgctacaaa aataaaactg caacatgcga gattttaaca taacagcccc  2000

gcagcctcac tattgcaagt gcagcggcaa ttagaaaatc agaaatacta acaaatcaaa  2060

aattttcacc ctgggcacca ctcgacggcc cgcgcccgcg cgcggcggcg gggcggtgga  2120

ccgcacccct attggacgcc gtccccctgt taaaatccag acgcaaatgg tccttttact  2180

gtttccgacc tacgacctat atca                                         2184

 

 

<210>  2

<211> 679

<212>  DNA

<213>  稻梨孢属稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae (无性态：Pyricularia oryzae Sacc.)）

 

 

<400>  2

tataaatggc cctcgtaaaa tccaattcca atttattcaa ctgccactct gcacacatca  60

acagtctttc aattttcgcc ttcccatttt taaacatact ttttaacatt ttacagactc  120

ttctttaact ttgtttgcaa aagacattat tttgaaaagt caatatgcgt gttaccactt  180

ttaacacatt ccttctcact ttgggaactg tcgctgtcgt caatgccgaa acgggcaaca  240

aatatataga aaaacgcgct atcgacctaa gtcgagagcg agaccctaac tttttcgacc  300

accctggtat tcctgtaccc gaatgttttt ggtttatgtt taaaaacaac gtacgtcaag  360

atgctggaac ctgttacagc tcttggaaaa tggacatgaa agttggtcca aactgggtcc  420

atattaaatc agacgataat tgcaatttgt cgggcgactt ccctccaggt tggattgttt  480

tggggaaaaa aaggcccggc ttttaaatta aaaggaaatc acagttaagg caacgtaggg  540

aggtttgacg aggtttacgc ttggttgacg gctcataaga taatgcatgg gcgccttgct  600

tataaagaaa ttcggtaaaa tccattattt taaaacctag ttagaacaat ggaattatta  660

cgaaagcgct gctacaaaa

 

 

<210>  3

<211> 113

<212>  PRT

<213>  稻梨孢属稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae. (无性态：Pyricularia oryzae Sacc.)）

 

 

<220>

<221>  signal peptide

<222>  (1)..(21)

 

 

<400>  3

 

Met Arg Val Thr Thr Phe Asn Thr Phe Leu Leu Thr Leu Gly Thr Val Ala

1                5                  10                   15   

 

Val Val Asn Ala Glu Thr Gly Asn Lys Tyr Ile Glu Lys Arg Ala Ile Asp

 

        20                  25                  30     

Leu Ser Arg Glu Arg Asp Pro Asn Phe Phe Asp His Pro Gly Ile Pro Val

35                  40                  45                  50

Pro Glu Cys Phe Trp Phe Met Phe Lys Asn Asn Val Arg Gln Asp Ala Gly

            55                  60                  65

Thr Cys Tyr Ser Ser Trp Lys Met Asp Met Lys Val Gly Pro Asn Trp Val

    70                  75                  80                  85

His Ile Lys Ser Asp Asp Asn Cys Asn Leu Ser Gly Asp Phe Pro Pro Gly

                90                  95                  100

Trp Ile Val Leu Gly Lys Lys Arg Pro Gly Pro

        105                 110

 

 

 

 

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F1

 

<400>  4

ttcgacaacg ctgatattcc tg                                              22

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R1

 

<400>  5

aaaagttagg gtctcgctct cg                                              22

 

 

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F2

 

<400>  6

ttcgactacc ctggtattcc tgt                                             23

 

 

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R1

 

<400>  7

aaaagttagg gtctcgctct cg                                              22

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F3

 

<400>  8

cctaactttt tcgaccacgc tg                                              22

 

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R2

 

<400>  9

gggtctcgct ctcgacttag gt                                              22

 

 

<210>  10

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F4

 

<400>  10

cctaactttt tcgaccacac tg                                              22

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R2

 

<400>  11

gggtctcgct ctcgacttag gt                                              22

 

 

<210>  12

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F5

 

<400>  12

ttcgaccacc ctgatattcc tg                                              22

 

 

<210>  13

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R1

 

<400>  13

aaaagttagg gtctcgctct cg                                              22

 

 

<210>  14

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-F6

 

<400>  14

ttcgaccacc ctgctattcc tg                                              22

 

 

<210>  15

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-Mut-R1

 

<400>  15

aaaagttagg gtctcgctct cg                                              22

 

 

<210>  16

<211>  21

<212>  DNA

<213>  引物RT-F

 

<400>  16

acgtcaagat gctggaacct g                                               21

 

 

<210>  17

<211>  20

<212>  DNA

<213>  引物RT-R

 

<400>  17

ccccaaaaca atccaacctg                                                 20

 

 

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-1F

 

<400>  18

gagaccctaa ctttttcggc                                                 20

 

 

<210>  19

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-1R

 

<400>  19

ccaacctgga gggaagtcg                                                  19

 

 

<210>  20

<211>  20

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-2F

 

<400>  20

accctaactt tttcgaccgc                                                 20

 

 

<210>  21

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-1R

 

<400>  21

ccaacctgga gggaagtcg                                                  19

 

 

<210>  22

<211>  20

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-3F

 

<400>  22

cacattcctt ctcactttgg                                                 20

 

 

<210>  23

<211>  25

<212>  DNA

<213>  引物AvrPi7-SNP-3R

 

<400>  23

ccaaaaacat tcgggtacag gaaga                                           25

Claims (9)

1.一种稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7，其特征在于具有SEQ ID No. 1所示的带有启动子的DNA序列；具有SEQ ID No. 2所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7编码的蛋白质，其特征在于具有SEQ ID No. 3所示序列。

3.一种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的应用，其特征在于应用于生产无毒菌株。

4.一种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的应用，其特征在于将所述基因与相应的抗病基因共价导入水稻培育抗病品种。

5.一种权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的核苷酸序列产生的特异性的分子标记。

6.一种权利要求5所述分子标记的应用，其特征在于利用所述的分子标记监测田间稻瘟病群体小种的变异及其动态变化规律。

7.一种含有权利要求1所述稻瘟病菌无毒基因AvrPik/kp/km/kh/7的载体。

8.一种权利要求7所述载体的应用，其特征在于应用于生产所述无毒基因的等基因或近等基因菌株。

9.一种权利要求7所述载体的应用，其特征在于与相应的抗病基因的载体共价导入水稻培育抗病品种。

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