CN104356213B - 稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用。所述无毒基因具有SEQ ID NO：1所示的带有启动子的DNA序列或SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。基于所述基因的结构及其应用试验结果，可以设计新型农药的分子靶点；将该基因和相应的抗病基因共价导入水稻等寄主植物可以培育抗病新品种；根据该基因序列产生的特异性分子标记可应用于田间稻瘟病菌群体监测；所得到的监测结果也可用于指导抗病品种合理布局；所述基因具有广泛的应用价值，对于水稻生产和育种等研究具有重大意义。

Description

稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用。
背景技术
水稻（Oryza sativa L.）是全世界数十亿人口赖以生存的重要粮食作物和重要的工业原料，同时也是多种病虫害的宿主。由病原真菌Magnapothe oryzae引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一，每年都造成10～30%的水稻产量损失。而且该菌还能够侵染麦类、谷类等50多种禾本科植物。
从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，使得抗病品种的抗性不稳定，以致抗病品种的感病化问题一直没有得到解决。稻瘟病菌菌株能否在特定品种上侵染、致病是由该病原菌菌株的无毒基因的产物与寄主植物的抗病基因产物之间的互作决定的。因此，对无毒基因产物结构的分析与研究，是了解病原菌小种和寄主品种专化性互作的生化基础。从病原菌无毒基因着手,可望阐释稻瘟病菌与水稻的互作关系，以及病原菌的致病机理，从而为稻瘟病抗病育种打下坚实的基础，对于植物病害的预防和控制具有重要的指导意义。
迄今，已克隆的9个稻瘟病菌无毒基因根据其功能可以分为两类。第一类无毒基因编码种间特异性的激发子。这一类包括了对弯叶画眉草（Eragrostis curvula）表现非致病特异性的PWL（pathogenicity on weeping lovegrass）基因家族。在这个基因家族中，PWL2首先通过图位克隆的方法被分离、克隆，该基因起着阻止稻瘟病菌株侵染弯叶画眉草的作用（Sweigard et al. 1995, Plant Cell 7: 1221-1233）。用PWL2转化对弯叶画眉草有致病性的野生型菌株，转化子失去了弯叶画眉草的致病性，却完全保留了对其它寄主的致病性。这说明PWL2尽管是一个决定寄主范围的基因，但其功能与经典定义的无毒基因是一样的。PWL2编码富含甘氨酸的亲水性蛋白，内含一个信号肽。
第二类无毒基因为通常意义上的无毒基因，即编码品种特异性（专化性）的激发子。这一类基因包括AVR-Pita （以前称AVR2-YAMO），ACE1、 AVR1-CO39、 AvrPiz-t、AvrPia、AvrPii及AvrPik/km/kp。但这3个基因在稻瘟病菌生长发育方面具有什么样的功能还有待于进一步的研究。
尽管到目前为止，随着分子生物学的快速发展，大约已经有40个稻瘟病菌无毒基因完成了染色体的初步定位，但已被克隆的无毒基因却只有9个。在这9 个稻瘟病菌无毒基因中，PWL1（Kang et al. 1995, Molecular Plant-Microbe Interactions 8: 939-948）和PWL2 (前出，Sweigard et al. 1995) 都是控制稻瘟病菌对弯叶画眉草的致病性，具有强烈的寄主特异性；而另外7 个无毒基因AVR-Pita（Orbachet al. 2000, Plant Cell 18:167-187）、AVR1-CO39（Farman and Leong 1998, Genetics 150: 1049-1058）、ACE1（Böhnert et al. 2004, Plant Cell 16: 2499-2513）、AvrPiz-t（Li et al. 2009,Molecular Plant-Microbe Interactions 22: 411-420）、AVR-Pia、AvrPii和AvrPik/km/ kp（Yoshida et al. 2009, Plant Cell 21: 1573-1591）均来源于水稻，控制稻瘟病菌对水稻的致病性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中对稻瘟病无毒基因研究的缺陷，提供一种新的稻瘟病菌无毒基因AvrPib。
本发明的第二个目的是提供上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib所编码的蛋白质。
本发明的第三个目的是提供含有上述无毒基因AvrPib的载体。
本发明的第四个目的是提供含有上述载体的重组体。
本发明的第五个目的是提供上述基因在培育植物新品种中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述基因在制备植物分子农药中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种稻瘟病菌无毒基因AvrPib，其具有SEQ ID NO：1所示的带有启动子的DNA序列或SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。
上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：3所示序列。
本发明从稻瘟病菌菌株CHL42中分离得到AvrPib基因，该基因赋予稻瘟病菌对含有抗病基因Pib的水稻品种产生特异性（专化性）的非致病性反应。其中，所述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是AvrPib的基因组DNA和cDNA序列。AvrPib基因组DNA长度为2618 bp，其全长cDNA为637 bp，含有一个225 bp的开放阅读框，5’和3’非翻译区分别为322 bp和90bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放阅读框只有1个外显子而没有内含子（图3a）。该基因编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，结构如图3a所示；该基因编码的蛋白的N末端含有22个氨基酸组成的信号肽。
所分离、克隆的无毒基因AvrPib在自然界中存在若干个SNP单元型，且这些单元型编码的蛋白之间存在非同义替换关系。因此，应当理解，在不影响蛋白活性的前提下（不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列进行各种替换、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列、功能片段和/或突变体。
含有上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib的载体。
含有上述基因或载体的重组体。该重组体可以是将无毒基因AvrPib以任一种方法与任一种载体相结合形成的重组体。
根据本发明提供的AvrPib基因序列信息（SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2），本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与AvrPib等同的基因：（1）通过数据库检索获得；（2）以AvrPib基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；（3）根据AvrPib基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；（4）在AvrPib基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5）用化学合成的方法获得该基因。
本发明能够进一步提供或应用利用上述稻瘟病菌无毒基因AvrPib的DNA片段获得的无毒性的转基因菌株，以及利用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的菌株。也可以利用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的菌株中。
本发明提供的稻瘟病菌无毒基因AvrPib具有重要的应用价值：
应用之一是根据该基因的结构及其功能来设计新型农药的分子靶点，可用于制备植物分子农药。
应用之二是培育植物抗病新品种，具体地，将所述的AvrPib基因序列连接到任何一种转化载体，用任何一种转化方法将AvrPib无毒基因和相应的抗病基因Pib共价导入水稻或其他植物细胞。也就是说，将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下，而将相应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原菌的定殖和扩展。由于这种工程植物是基于寄主抗病反应后各种防卫反应的综合表达和作用，因此，这种新型的抗性是稳定而持久的。
对AvrPib基因进行修饰或改造，可改变或增加基因的某种功能。对该基因的编码区的单个核苷酸位点进行定点突变，可能会导致基因无毒性功能的丧失或改变。本发明同样包括将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下侵入植株的不同时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子、构巢曲霉trpC启动子等（冯淑杰 2005，华南农业大学博士论文；Li et al., 2010,Molecular Plant-Microbe Interactions 23: 317-331）。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，侵入植株的不同时期都可以改变该基因的表达。其中环境条件包含植株的生长状况，温度，湿度等，侵入植株的不同时期包括孢子萌发、附着胞形成、侵染钉分化和侵染菌丝扩展等。
优选地，上述植物可以是禾本科植物，如水稻。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的稻瘟病菌无毒基因AvrPib，所述基因由菌株CHL42通过图位克隆的方法获得，所述无毒基因具有广泛的应用价值：基于所述基因的结构及其应用试验结果，可以设计新型农药的分子靶点；通过转基因技术，将本发明所述基因遗传转化到毒性菌株中，以生产所述基因的等基因（或近等基因）菌株，这些菌株可广泛应用于农药开发、稻瘟病菌小种监测，以及理论研究等方面；利用所述基因的序列及其编码的产物，通过生物化学等手段，找到与之特异性互作的寄主植物（如水稻等）的蛋白质，由此了解和揭示稻瘟病菌小种与水稻等品种间特异性互作的分子机理，以此来设计稻瘟病综合防治的新策略。
附图说明
图1为本发明采用的稻瘟病菌无毒基因AvrPib的克隆及其功能研究的技术路线图；
图2为稻瘟病菌无毒基因AvrPib的图位克隆图；其中图a为AvrPib位点的遗传图谱；连锁标记下数值为重组体／配子体；水平线下数值为标记之间的相对遗传距离（cM）；图b为AvrPib位点的电子物理图谱；水平线下数值为根据参考菌株70-15的基因组序列（http://www.broad.mit.edu）推测的物理距离（kb）；图c为AvrPib位点的重叠群图；图d为AvrPib的候选基因及精细电子物理图谱；图e为AvrPib候选基因的克隆及其遗传转化；
图3为AvrPib的基因结构、蛋白质序列以及突变体；其中图a为AvrPib的基因结构图；图b为AvrPib的蛋白序列图，下划线部分为信号肽；图c为AvrPib 的基于PCR技术的定点突变（左）及缺失突变（右）示意图；F1/R1，F2/R2分别为PCR引物；图d为AvrPib突变体的结构示意图及其致病性鉴定结果；Pib为AvrPib的对应抗病基因，Pi2及Pi3为AvrPib的非对应抗病基因，以检测二者的特异性互作关系；供体菌株（CHL42）及受体菌株（CHL724）作为对照也用于致病性鉴定；R：抗病性（无毒性）；S：感病性（有毒性）；MS：中度感病性（中度有毒性）；
图4为AvrPib作图群体的亲本菌株（CHL42，CHL357）、遗传转化受体菌株（CHL724）以及突变体菌株（Mab系列）在水稻品种 IRBLb-B（含Pib基因）上的表型鉴定图；无菌水作为接种物对照也用于致病性鉴定；
图5为AvrPib的特异性分子标记及其检测图；其中图a为AvrPib特异性分子标记PCR引物的设计示意图；AvrPib的编码区用黑框表示，各个引物的相对位置标示于水平线下；图b为基于标记AvrPibF1/R1的基因型（左）、基于标记AvrPibF2/R2的基因型（中），以及基于2个标记的整合基因型（右）；M1：DNA分子量标记，DL2000；M2：DNA分子量标记，DL15000；8个菌株（a-h）有关AvrPib的“表型／基因型”最终由各个菌株对水稻品种IRBLb-B（Pib）的致病型及整合基因型决定，a：V/1 (CHL2600)；b：V/1 (CHL2626)；c：V/2 (EHL0348)；d：A/3(CHL2345)；e：V/4 (EHL0342)；f：V/1 (CHL2549)；g：V/3 (EHL0964)； h: V/0 (EHL0370)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，阐述了AvrPib基因的分离克隆、功能特征、分子鉴定以及应用，分离的AvrPib基因能够与适当的载体连接，转入菌株中，使该菌株对含有特异性互作的抗病基因Pib的植物产生无毒性。
本发明采用的技术路线如图1所示。
实施例1 稻瘟病菌无毒基因AvrPib的图位克隆
（1）AvrPib位点遗传图谱的构建
为了发掘和鉴定稻瘟病菌无毒基因AvrPib，利用由稻瘟病菌株CHL357（交配型MAT1-1；对含有Pib的水稻品种IRBLb-B表现有毒性; Hua et al. 2012, Theor ApplGenet 125: 1047-1055）和 CHL42 (交配型MAT1-2；对IRBLb-B表现无毒性; Zhai et al.2014, Plos One 9: e98067) 杂交得到的83个后代子囊孢子菌株接种水稻品种IRBLb-B（Kobayashi et al. 2007, JARQ 41: 31-37），结果表明，这个作图群体中无毒性（非致病性）菌株与有毒性（致病性）菌株分别为41和42株，其分离比符合1:1。由此推断，CHL42所表现的对水稻品种IRBLb-B的无毒性是由一对显性基因控制的。
为了快速地确定无毒基因的染色体位置，利用参考菌株75-10的参考序列（reference sequence），开发并构建了由121个微卫星标记（SSR, simple rsequencerepeat）组成的遗传图谱（Feng et al. 2007, Chinese Science Bulletin 52: 3346-3354）。然后，通过混合群体分离分析法（bulked-segregant analysis, BSA），筛选了全部121个SSR标记，得到了7个与无毒基因连锁的SSR标记（MS6-24，MS6-3，MS6-7，MS6-10，MS6-17，MS3-5，MS3-26）。SSR标记序列如下：
MS6-24F：GCGAGTTTACAGGTTTAGCA
MS6-24R：TTTGGGGCTAATAACAGACC
Ms6-3F：CCACATCGCAGCCTCACTTG
Ms6-3R：CCAGTCGGTTCCAGGTCTTG
Ms6-7F：CCAAGGCACCAGCACAGACC
Ms6-7R：CAGAAGATGCCTCGGAGATC
Ms6-10F：CAGAAGATGCCTCGGAGATC
Ms6-10R：GCAGGGCCCACTACACATGT
Ms6-17F：CAAGAATGCAGAGAACCACAG
Ms6-17R：GTTTTCCGCTGTGTAAATAGA
Ms3-5F：gagtttgagaccttgcgatt
Ms3-5R：ggcggcaagtcgctgaagg
Ms3-26F：GAAGGCGACAAGTGGCAGT
Ms3-26R：CTCGTCTGGTATCAGTTGCC
结果表明，该无毒基因位点被定位在第6染色体上。为了进一步确认该无毒基因的位置，分别在SSR标记MS6-17—MS3-5，以及MS3-26右侧开发了1个和3个新标记进行连锁分析。结果表明，该无毒基因位点被确定于SSR标记MS3-5—MS3-26之间，遗传距离为3.6 cM（厘摩；图2a）。
（2）AvrPib位点电子物理图谱的构建：为了构建该位点的物理图谱，将上述连锁标记通过生物信息学分析，利用稻瘟病菌数据库软件BLASTN （http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/Blast.html）着陆于参考菌株70-15的基因组序列（http://www.broad.mit.edu）上。结果表明，AvrPib位点被物理定位在大约33 kb的区域内（图2b）。
（3）AvrPib位点重叠群的构建：根据上述连锁标记锚定的参考菌株70-15的BAC文库（http://www.broad.mit.edu），由此构建了AvrPib位点的重叠群（图2c）。
（4）AvrPib候选基因的预测以及精细电子物理图谱的构建：
为了确定AvrPib的候选基因，利用菌株70-15的参考序列，通过2个基因注释系统Broad Magnaporthe grisea Database（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/Regions.html）和Softberry FGENESH 2.6（http:// www.softberry.com/berry.phtml）对目的基因区域进行基因预测及注释分析。结果表明，其间存在3个编码分泌蛋白的基因。为了进一步确定候选基因，其间开发了1个SSR标记（MS6-34），以及3个候选无毒基因标记（candidate avirulence gene，CAG）进行了连锁分析。结果表明，这4个标记皆与AvrPib位点完全共分离（无重组体）（图2d）。因此，对3个候选基因都进行了遗传互补分析（下述）。
（5）AvrPib候选基因的克隆及其遗传转化：
根据参考菌株70-15序列设计3个候选基因的PCR引物:
b1F: TTGGCGCGCCCGTTTGGTTACGTTCACCCTTG；
b1R: TAGGCGCGCCTCGACTACATCCCCATGACGC；
b2F: TTGGCGCGCCGCCATCAACGAGACCACAGCCCAC；
b2R: TTGGCGCGCCACTGCGGGAATGCCGACAATGCGAG；
b3F: ATGGCGCGCCCGTTTGGTTACGTTCACCCTTG；
b3R: TAGGCGCGCC ACTGCGGGAATGCCGACAATGCGAG；
下划线为用于连接双元转化载体pBHt2的限制性内切酶Asc I的作用序列。
然后，利用高保真（high fidelity, HF）PCR技术从供体菌株CHL42基因组DNA中扩增了3个候选基因的片段，其中，b1和b2分别包含2个候选基因；b3则包含中间的1个候选基因。
PCR扩增的体系如下：
PCR扩增条件为：预变性98℃ 30 sec，变性98℃ 10 sec，退火64℃ 15 sec，延伸72℃（b1：2 min；b2：2 min 50 sec；b3：1 min 10 sec），扩增35个循环，最后72℃延伸5min。
然后，将各个候选基因克隆至双元转化载体pBHt2上，导入了农杆菌菌株C58C1（Mullins et al. 2001, Phytopathology 91: 173-180；Khang et al. 2007, Methodsin Molecular Biology 344: 403-420; Wu et al., 2014, Molecular Plant-MicrobeInteractions 27: 759-769）。然后，通过常规的农杆菌介导的稻瘟病菌遗传转化法，将各个候选基因导入强毒性的受体菌株CHL724中，进行了基于遗传互补的功能获得性实验（Huaet al. 2012, Theor Appl Genet 125: 1047-1055；Li et al. 2009, Molecular Plant-Microbe Interactions 22: 411-420; 前出，Wu et al. 2014）。获得的转化子菌株通过常规的稻瘟病鉴定技术，对含有其对应的抗病基因Pib的水稻品种IRBLb-B进行致病性鉴定（Pan et al. 1996, Phytopathology 86: 1071-1075）。A，无毒性；V，有毒性。结果表明，3个候选基因由来的转化菌株在毒性菌株CHL724的遗传背景下，表现了与无毒基因供体菌株CHL42相同的无毒性。由此说明，3个候选基因共同拥有的基因b3就是无毒基因AvrPib（图2e）。
实施例2AvrPib的基因结构、蛋白质序列以及突变体
（1）AvrPib基因结构的推定：采用移步法对AvrPib的DNA序列进行了测定，并利用DNAStar等软件进行该基因编码区的预测。其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是AvrPib的基因组DNA和cDNA序列。AvrPib基因组DNA长度为2618 bp，其全长cDNA为637 bp，含有一个225 bp的开放阅读框，5’和3’非翻译区分别为322 bp和90 bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框只有1个外显子而没有内含子（图3a）。
（2）AvrPib蛋白质序列的推定：利用DNAStar等软件对AvrPib基因编码的蛋白序列进行了预测，结果如SEQ ID NO：3所示。AvrPib编码1个由75个氨基酸残基组成的蛋白多肽。运用SignalP-v3.0、Protcomp-v6.0、TMHMM-v2.0、GPI等生物信息学分析工具对该基因编码的蛋白进行结构分析，结果表明该基因编码的蛋白具有分泌蛋白的特征，其N末端1-22个氨基酸区域是信号肽区域（下划线；图3b）。同时，采用相同的技术手段对本实验室保存的多个稻瘟病菌田间菌株（CHL2345、CHL2386等；张树林，2014，华南农业大学硕士学位论文; 前出，Wu et al. 2014）的AvrPib基因进行了克隆、测序，然后，利用基因MegAlign软件进行多序列比对。结果表明，该无毒基因在自然界中存在多个SNP单元型，其中A37、T38是2个易变的SNP位点。下一步将主要针对其信号肽区域进行突变分析，以进一步确认其功能。
（3）AvrPib基于PCR技术的突变分析：利用TaKaRa MutanBEST Kit定点突变试剂盒，针对#37及＃38的SNP位点，以及整个信号肽区域，分别设计5’端邻近、3’端方向相反的引物，且在正向引物中导入目的SNP（图3c之左图）或去除目的区段（图3c之右图），以把无毒野生型蛋白突变为有毒型蛋白以及第三方蛋白（括号内字母），或使其缺失目的氨基酸（以Δ表示）。引物序列（下划线为SNP）如下：
AvrPib-Mab1-F: TTTTGCGATGCAAGCTCTCGGTAT
AvrPib-Mab1-R: AAGGCGATAGTGATAAAAGTGG
AvrPib-Mab3-F: TAGTGCGATGCAAGCTCTCGGTAT
AvrPib-Mab3-R: AAGGCGATAGTGATAAAAGTGG
AvrPib-Mab5-F: CTTTTGTGCGATGCAAGCTCT
AvrPib-Mab5-R: GCGATAGTGATAAAAGTGGTT
AvrPib-Mab7-F: CTTTCGTGCGATGCAAGCTCT
AvrPib-Mab7-R: GCGATAGTGATAAAAGTGGTT
AvrPib-Mab9-F: TTTTATCACTATCGCCTTTTGC
AvrPib-Mab9-R: GTGGTTGAGGAACGCATAAT
AvrPib-Mab12-F: ACACAGGTTACTATCTTGAAGAAGGGT
AvrPib-Mab12-R: AATGGCAACTAATTTAATTGTATA
具体实验按照试剂盒的说明书操作。
PCR扩增的体系如下：
PCR扩增条件为：预变性98℃ 30 sec，变性98℃ 10 sec，退火64℃ 15 sec，延伸72℃ 1 min 40 sec，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min。
对PCR产物进行回收，并用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒对回收产物进行末端平滑及5’端磷酸化反应。最后将获得的含有突变位点的片段克隆到pBHT2载体上，经过测序确认的各种突变体，以及它们的供体菌株及受体菌株的基因型如图3d所示。
然后，按照上述方法进行遗传转化及功能互补验证。为了确认突变体的功能特异性，在上述水稻品种IRBLb-B的基础上，加上了与AvrPib非对应的抗病基因Pi2 (IRBLz5-CA; 前出Kobayashi et al. 2006)，Pi3 (IRBL3-CP4；前出Kobayashi et al. 2006)，一起进行了致病性鉴定。结果表明，突变体Mab1-11及Mab3-3的无毒性减弱，使其与供体菌株不一样，对Pib的反应型变为中度感病性（MS）；突变体Mab5-5的无毒性没有变化，使其与供体菌株一样，对Pib的反应型仍为抗病性（R）；突变体Mab7-2，Mab9-15及Mab12-8的无毒性丧失，使其与受体菌株一样，对Pib的反应型变为感病性（S）。另一方面，所有供试的突变体菌株对与AvrPib非对应的抗病基因Pi2及Pi3的表现皆与其受体菌株一致，由此表明AvrPib对Pib具有特异性（图3d）。以上的结果进一步确认了AvrPib的功能。
上述代表菌株在水稻品种IRBLb-B的表型如图4所示。无菌水作为接种物对照也参加了致病性鉴定。
实施例3 AvrPib的特异性分子标记在稻瘟病菌群体监测中的应用
（1）AvrPib特异性分子标记的设计：利用实施例2获得的AvrPib基因组DNA序列（SEQ ID NO： 1）对AvrPib位点两旁的基因组序列进行了比对分析。结果表明，其两旁的基因组序列特异性高且变异性大，特别是其5’上游区域有转座子（Pot2, Pot3）的插入会导致其功能丧失。因此，在其编码区及其两侧设计2对引物（AvrPibF1/R1; AvrPibF2/R2），作为其特异性分子标记（图5a）。
引物序列如下：
AvrPibF1: GGACAAGGGAGGCAAATCTAAC
AvrPibR1: ATGCCGACAATGCGAGGTAT
AvrPibF2: TGGAGAAGACTTTGATGC
AvrPibR2: GAACGCATAATGGCAACTA
（2）AvrPib特异性分子标记在稻瘟病菌群体监测中的应用：从中国稻瘟病菌群体中随机选择8个菌株，编号为a～h（对IRBLb-B的致病型如图5b所示），分别利用上述2对引物进行基于PCR扩增产物的基因型的分型。
PCR扩增的体系如下：
PCR扩增条件为：预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 sec，退火(AvrPibF1/R1：62℃30 sec；AvrPibF2/R2：60℃ 30 sec)，延伸72℃(AvrPibF1/R1：3 min 20 sec；AvrPibF2/R2：2 min 20 sec)，扩增35个循环，最后72℃延伸5 min。
在此，阿拉伯数字代表不同的带型（基因型），即“0”、“1”、“2”、“3”、“4”分别表示没有条带、高带、中带、低带、双带（图5b）。由于个别菌株基于上述2对引物的基因型不一致（图5b之左、中图），因此，各个菌株的基因型根据有条带为优先的原则由二者整合而成（图5b之右图）。分子标记获得的基因型与稻瘟病致病型的对应关系：高带：在分子标记检测的区域有转座子Pot2/3插入到AvrPib中；低带：分子标记检测的区域与AvrPib对应的区域一致或仅有SNP差异；双带：表示有高带型和低带型，其中高带型在AvrPib的CDS或上游有Pot2/3插入，低带型在AvrPib的CDS区有SNP或SNPs。
结合利用上述常规的稻瘟病鉴定技术而获得的各个菌株的表型，编号为a～h的8个菌株的表型／基因型确定为a：V/1 (CHL2600)；b：V/1 (CHL2626)； c：V/2 (EHL0348)；d：A/3 (CHL2345)；e：V/4 (EHL0342)；f：V/1 (CHL2549)；g：V/3 (EHL0964); h: V/0(EHL0370)（前出，张树林，2014；前出，Wu et al. 2014）。其中，M1：DNA分子量标记，DL2000；M2：DNA分子量标记，DL15000。
本实施例在图5仅提供上述8个代表菌株（a～h）由AvrPib的2个特异性分子标记组合而成的基因型，仅仅是为了说明通过2个特异性分子标记的鉴定，并不作为本发明实现的技术依赖。采用本发明方法可以对任何来源的菌株（包括稻瘟病菌，但不限于稻瘟病菌）进行基因型鉴定，本发明为基于无毒基因标记的稻瘟病菌的群体遗传学研究提供重要技术基础，为从基因水平上监测田间稻瘟病群体小种变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局提供新的技术方案。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 稻瘟病菌无毒基因AvrPib及其应用
<130>
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2618
<212> DNA
<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPib
<400> 1
tgccgtccca cttcgtcatg cacacactaa catccggcaa acaagtgcca aaaaaaactt 60
catattgaat gttaggctcc ttttgttgag cggcgtaaag ttgtccgaaa aaagaggcgc 120
tggtgaaaag gaaaaggttg aaataagtgt attgcatcgt gatcgaaagg ttcaagtttg 180
aagtagttgt aagaatatta atatacgttt ggtgtgttgg atttatttgt agtaatatct 240
tgcgtttgag ataataaaag gaataaaagc gattgttgag atgggaaacc cttggtataa 300
ataagttacg attgaaaatt ttatcctgaa aataaataga tttttgcacg ggatatgtgt 360
gcgcgatcag atcgggtata tatttatagg ttcactgcgg gaatgccgac aatgcgaggt 420
atacgctgct ataaatacta gcaattataa atttaaaccg gttctgacct atttctattc 480
ctatctacga ctcggaaggg ccgcataatg taattaaaga gtgacattgc agaagctatg 540
cgtctatgag cgagctgacg aggcatcgat ggatgcgctg tgttattccc tgtcgctccg 600
caagaagtac ccacccataa cccagtagct ccaggaacgg acggcctatc gcatgtttat 660
attgagaatt tcaaattata tatgcatata taagctataa ttacacggcg ggctagctat 720
ggaactttga gttttaaaaa taaattttga aattcaaaga taggaagttt tcatgcattg 780
tttaaaattt gaatagcttt gatattatat aaatacctcg ttgtttttaa gaatctaata 840
ttagtaagat tctatttttg gagaagactt tgatgcaaat ggagttgcta ttagttaata 900
gttaataata taaaaaagta aaatatttat aagtaaacgg tcttccgttt tgtttaacaa 960
tttcgaaccc aacacaactc attccaattc attaacaaca aagaatctaa agtcgcatac 1020
tataacactc caaccaatat aacacctttt ccaatttcta cttttctatt attattttac 1080
ttttgcttcg aggtaaaaag tccttcccat taccctatta ctacaaataa cctgctaatt 1140
tatacaatta aattagttgc cattatgcgt tcctcaacca cttttatcac tatcgccttt 1200
attgcgatgc aagctctcgg tattgcggcc acacaggtta ctatcttgaa gaagggtgaa 1260
agaattactt gggtagaagt tccaaagggg gaatccagag aatttaacat ccgtggaaaa 1320
tattttactg ttagtgtgtc ggacgacggt acacccagta tttctggcag caaatatacc 1380
gtggaataaa acatttggcc ttcggtaaca ttggaacttt tctctacagt tttctttttc 1440
agatctagct agcattctct acgttagtac cacaataaaa gctgagagtt ttttttcccg 1500
aatttaaatc gtaaggaact tagaaaaacc aaacttaact ttgtaccttg ggcaagaata 1560
atatggctgg atggttattg cgattaaaga caaaagtgag atgaccattt caggggcctg 1620
cttatttctg ggacacccgg tctagtctag tgtgagttac gtgcagcatc gcacgtgagt 1680
tatcgattca attgatgaat tgaagtcata aacctccatt ccaacaaacc ggttagattt 1740
gcctcccttg tccccatcgc tccgacccat gtattgcaag cggtcggtaa gcacgtgtta 1800
tgtctgttct cctagcccgc gccacgcagg ccatgccgag gccttccttg atggtaacac 1860
atcttcgttc ttgggccctc aggcccaatt gctcgcaggc accacccccg acctcgcagc 1920
tcattctccc tctgactttt gtcgctagcg aggtagttag tcatggacaa atcctatttt 1980
gttgatgtga attccaaggt tctcccggtc tcggtgttta tacctgcccg cgtgtccagt 2040
cgatacctca tcgggccaca tgtctttcgc tagccgtttt gttgattccg ccaattcggg 2100
tataaaccag tctgagctgc cagacagaca agttttggat gatgcttcac ttcttgatgc 2160
atggcatggt attactcgca ttgcagccca ctgagaacac tttaagaaga aaaagagacc 2220
tcgcgtaatc ggcgtcatgc tttacaaata gtctctacgt ttaccatcga gtggttatcg 2280
ttgtagacaa agaacaccgg ctagtagata tcctggcgcc accgagatac aaaacgctac 2340
cctccattaa actcaacatg tcatttcccg agaacaggag aattgcgtct tcgcaccaca 2400
tgctaaatac gacaatttca attttcaaat gagaaatttc cagcatatgt tagtacggaa 2460
ggggaaaagc cggagagttt cgtatacaaa tatgaagcgt atactatata tatatatata 2520
gactaactat cgctcatatt ggaattttat tgtaaaaggc aaaggaatga agtgttttta 2580
tcaaagccaa ataagtcaag ggtgaacgta accaaacg 2618
<210> 2
<211> 637
<212> DNA
<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPib的cDNA序列
<400> 2
agtaagattc tatttttgga gaagactttg atgcaaatgg agttgctatt agttaatagt 60
taataatata aaaaagtaaa atatttataa gtaaacggtc ttccgttttg tttaacaatt 120
tcgaacccaa cacaactcat tccaattcat taacaacaaa gaatctaaag tcgcatacta 180
taacactcca accaatataa caccttttcc aatttctact tttctattat tattttactt 240
ttgcttcgag gtaaaaagtc cttcccatta ccctattact acaaataacc tgctaattta 300
tacaattaaa ttagttgcca ttatgcgttc ctcaaccact tttatcacta tcgcctttat 360
tgcgatgcaa gctctcggta ttgcggccac acaggttact atcttgaaga agggtgaaag 420
aattacttgg gtagaagttc caaaggggga atccagagaa tttaacatcc gtggaaaata 480
ttttactgtt agtgtgtcgg acgacggtac acccagtatt tctggcagca aatataccgt 540
ggaataaaac atttggcctt cggtaacatt ggaacttttc tctacagttt tctttttcag 600
atctagctag cattctctac gttagtacca caataaa 637
<210> 3
<211> 74
<212> PRT
<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPib蛋白
<400> 3
Met Arg Ser Ser Thr Thr Phe Ile Thr Ile Ala Phe Ile Ala Met Gln
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ile Ala Ala Thr Gln Val Thr Ile Leu Lys Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Ile Thr Trp Val Glu Val Pro Lys Gly Glu Ser Arg Glu Phe Asn
35 40 45
Ile Arg Gly Lys Tyr Phe Thr Val Ser Val Ser Asp Asp Gly Thr Pro
50 55 60
Ser Ile Ser Gly Ser Lys Tyr Thr Val Glu
65 70
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> MS6-24F
<400> 4
gcgagtttac aggtttagca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> MS6-24R
<400> 5
tttggggcta ataacagacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-3F
<400> 6
ccacatcgca gcctcacttg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-3R
<400> 7
ccagtcggtt ccaggtcttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-7F
<400> 8
ccaaggcacc agcacagacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-7R
<400> 9
cagaagatgc ctcggagatc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-10F
<400> 10
cagaagatgc ctcggagatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms6-10R
<400> 11
gcagggccca ctacacatgt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Ms6-17F
<400> 12
caagaatgca gagaaccaca g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Ms6-17R
<400> 13
gttttccgct gtgtaaatag a 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms3-5F
<400> 14
gagtttgaga ccttgcgatt 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Ms3-5R
<400> 15
ggcggcaagt cgctgaagg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Ms3-26F
<400> 16
gaaggcgaca agtggcagt 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Ms3-26R
<400> 17
ctcgtctggt atcagttgcc 20
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> b1F
<400> 18
ttggcgcgcc cgtttggtta cgttcaccct tg 32
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> b1R
<400> 19
taggcgcgcc tcgactacat ccccatgacg c 31
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> b2F
<400> 20
ttggcgcgcc gccatcaacg agaccacagc ccac 34
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> b2R
<400> 21
ttggcgcgcc actgcgggaa tgccgacaat gcgag 35
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> b3F
<400> 22
atggcgcgcc cgtttggtta cgttcaccct tg 32
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> b3R
<400> 23
taggcgcgcc actgcgggaa tgccgacaat gcgag 35
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab1-F
<400> 24
ttttgcgatg caagctctcg gtat 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab1-R
<400> 25
aaggcgatag tgataaaagt gg 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab3-F
<400> 26
tagtgcgatg caagctctcg gtat 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab3-R
<400> 27
aaggcgatag tgataaaagt gg 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab5-F
<400> 28
cttttgtgcg atgcaagctc t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab5-R
<400> 29
gcgatagtga taaaagtggt t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab7-F
<400> 30
ctttcgtgcg atgcaagctc t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab7-R
<400> 31
gcgatagtga taaaagtggt t 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab9-F
<400> 32
ttttatcact atcgcctttt gc 22
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab9-R
<400> 33
gtggttgagg aacgcataat 20
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab12-F
<400> 34
acacaggtta ctatcttgaa gaagggt 27
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> AvrPib-Mab12-R
<400> 35
aatggcaact aatttaattg tata 24
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> AvrPibF1
<400> 36
ggacaaggga ggcaaatcta ac 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> AvrPibR1
<400> 37
atgccgacaa tgcgaggtat 20
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> AvrPibF2
<400> 38
tggagaagac tttgatgc 18
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> AvrPibR2
<400> 39
gaacgcataa tggcaacta 19

Claims (5)

1.SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示稻瘟病菌无毒基因AvrPib和相应的抗病基因Pib共同导入植物细胞在制备植物分子农药中的应用。
2.SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示稻瘟病菌无毒基因AvrPib和相应的抗病基因Pib共同导入植物细胞在培育植物抗病新品种中的应用。
3.SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示稻瘟病菌无毒基因AvrPib在培育植物抗病新品种中的应用，其特征在于，将所述基因或含所述基因的载体和相应的抗病基因Pib共同导入植物细胞中培育抗病新品种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科作物。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，将所述的AvrPib基因序列连接到转化载体，用转化方法将AvrPib无毒基因和相应的抗病基因Pib共同导入水稻或其他植物细胞，即将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下，而将相应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原菌的定殖和扩展。
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