BR112014027503B1 - Moléculas de dna do evento do milho mon 87411, sonda de dna, pares de moléculas de dna, microrganismo, bem como métodos para detectar a presença de um segmento de dna diagnóstico para o evento, para a produção de uma planta de milho tolerante ao herbicida glifosato, para controlar o crescimento de ervas daninhas em um campo, para proteção de um campo de plantas de milho, e para a produção de uma commodity de milho - Google Patents
Moléculas de dna do evento do milho mon 87411, sonda de dna, pares de moléculas de dna, microrganismo, bem como métodos para detectar a presença de um segmento de dna diagnóstico para o evento, para a produção de uma planta de milho tolerante ao herbicida glifosato, para controlar o crescimento de ervas daninhas em um campo, para proteção de um campo de plantas de milho, e para a produção de uma commodity de milho Download PDFInfo
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Abstract
EVENTO DO MILHO MON 87411. A presente invenção refere-se ao evento de milho MON 87411, e plantas, células de plantas, sementes, partes de plantas, e commodities compreendendo o evento MON 87411. A invenção também proporciona polinucleotídeos específicos para o evento MON 87411 e plantas, células de plantas, sementes, partes de plantas, e commodities compreendendo polinucleotídeos específicos para o evento MON 87411. A invenção também fornece métodos relacionados ao evento MON 87411.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório dos Estados Unidos N° 61/644368, depositado em 8 de maio de 2012, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[002] A sequência de listagem contida no arquivo chamado “MONS308WO_ST25.txt”, que é de 230 kilobytes (tamanho medido no Microsoft Windows®) e foi criada em 06 de maio de 2013, está arquivado em anexo por submissão eletrônica e é incorporada por referência aqui.
[003] A invenção refere-se ao evento transgênico de Zea mays MON 87411. O evento proporciona modos de ação dupla para resistência à infestação de larva da raiz do milho e tolerância ao herbicida glifosato. A invenção também se refere a plantas, partes de plantas, sementes de plantas, células de plantas, produtos agrícolas, e métodos relacionados com o evento MON 87411 e fornece moléculas de nucleotídeos que são únicas para o evento e foram criadas em conexão com a inserção de DNA no genoma transgênico de uma planta Zea mays.
[004] O milho (Zea mays) é uma cultura importante em muitas áreas do mundo, e os métodos de biotecnologia têm sido aplicados a esta cultura, a fim de produzir milho com traços desejáveis. A expressão de um transgene de resistência a insetos e/ou tolerância a herbicidas em uma planta pode conferir os traços desejáveis de resistência a insetos e/ou de tolerância a herbicida na planta, mas a expressão dos referidos transgenes pode ser influenciada por muitos fatores diferentes, incluindo a orientação e a composição das cassetes* dirigindo a expressão de genes individuais transferidos para o cromossoma da planta, e a localização cromossômica e o resultado genômico de inserção do transgene. Por exemplo, pode haver variação no nível e no padrão de expressão do transgene entre os eventos individuais, que são, do contrário, idênticos, exceto para o local de inserção cromossômico do transgene. Também pode haver diferenças fenotípicas ou agronômicas indesejáveis entre alguns eventos. Por conseguinte, é frequentemente necessário produzir e analisar um grande número de eventos de transformação de plantas individuais, a fim de selecionar um evento tendo propriedades superiores em relação ao traço desejável e a características fenotípicas e agrícolas ideais necessárias para torná-lo adequado para fins comerciais. Tal seleção muitas vezes requer caracterização molecular extensa, bem como ensaios de estufa e de campo com muitos eventos ao longo de vários anos, em vários locais, e sob uma variedade de condições para que uma quantidade significativa de dados agronômicos, fenotípicos e moleculares possam ser coletados. Os dados e as observações resultantes devem ser analisados por equipes de cientistas e engenheiros agrônomos, com o objetivo de selecionar um evento comercialmente adequado. Uma vez selecionado, tal evento pode então ser usado para a introgressão do traço desejável em outras origens genéticas utilizando métodos de cultura de plantas, e, portanto, produzindo um número de diferentes variedades de plantas que contêm o traço desejado e são adequadamente adaptadas às condições específicas de crescimento locais.
[005] Para fazer uma planta transgênica contendo um único evento de transformação, uma porção de uma construção de DNA recombinante é transferida para o genoma de uma célula de milho, e as células de milho são subsequentemente cultivadas em uma planta. Uma célula de milho para a qual o evento é inicialmente transferido é regenerada para produzir a geração de R0. A planta R0 e as plantas progênies da planta R0 podem ser testadas por qualquer traço(s) desejado(s), mas a eficácia do evento pode ser influenciada por fatores cis e/ou de trans em relação ao local de integração no evento de transformação. O fenótipo conferido pelo evento pode também ser influenciado pelo tamanho e design da construção do DNA, que pode variar de acordo com a combinação dos elementos genéticos em uma cassete de expressão, número de transgenes, número de cassetes de expressão, e configuração de tais elementos e tal cassetes. Identificar um evento com características desejáveis pode ser ainda mais complicado por fatores como desenvolvimento da planta, padrões diurnos, temporais ou espaciais de expressão do transgene; ou por fatores extrínsecos, como, por exemplo, condições de crescimento da planta ambiental, disponibilidade de água, disponibilidade de nitrogênio, calor ou stress. Assim, a capacidade de obter um evento que confere um conjunto desejado de traços fenotípicos não é facilmente previsível.
[006] Os inventores identificaram um evento de milho transgênico MON 87411 com propriedades e desempenho superiores em comparação com plantas de milho transgênico existentes e a novos eventos construídos em paralelo. O evento de milho MON 87411 contém três cassetes de expressão ligados que conferem coletivamente os traços de resistência à larva da raiz do milho e a tolerância ao herbicida glifosato para células de milho, tecidos de milho, sementes de milho e plantas de milho contendo o evento transgênico MON 87411. O evento de milho MON 87411 oferece dois modos de ação contra as espécies de pragas da larva da raiz do milho (incluindo Diabrotica spp., especialmente quando a praga é Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR) ou complexo de Brazilian Corn Rootworm(BCR), constituído por Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa), ou Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn rootworm, SCR)). Modos duplos de ação fornecem redundância e reduzem significativamente a probabilidade de desenvolvimento de resistência aos traços de controle de pragas.
[007] O evento MON 87411 é caracterizado por segmentos únicos específicos de DNA, que são úteis na detecção da presença do evento em uma amostra. Uma amostra refere-se a uma composição que é tanto DNA de milho substancialmente puro ou uma composição que contém o DNA de milho. Em qualquer caso, a amostra é uma amostra biológica, isto é, ela contém materiais biológicos, incluindo, mas não limitado ao DNA obtido ou derivado, diretamente ou indiretamente, do genoma de evento de milho MON 87411. “Diretamente” refere-se à capacidade de um especialista obter diretamente o DNA do genoma do milho ao quebrar as células de milho (ou pela obtenção de amostras de milho que contenham células de milho quebradas) e expondo o genoma de DNA para efeitos de detecção. “Indiretamente” refere-se à capacidade de um especialista obter o DNA alvo ou de referência, isto é, um novo e único segmento de junção descrito aqui como sendo diagnóstico para a presença do evento MON 87411 em uma amostra específica, por outros meios que não a via direta, quebrando de células de milho ou pela obtenção de uma amostra de milho que contém células de milho quebradas. Tais meios indiretos incluem, mas não estão limitados a, amplificação de um segmento de DNA que contém a sequência de DNA alvo por uma sonda particular concebida para se ligar com especificidade à sequência alvo, ou a amplificação de um segmento de DNA que pode ser medido e caracterizado, isto é, medido por separação de outros segmentos de DNA por meio de alguma matriz eficiente, tais como um gel de agarose ou acrilamida, ou outros semelhantes, ou caracterizados por análise de sequência direta do amplicon ou a clonagem do amplicon em um vetor e sequenciação direta do amplicon inserido presente dentro de tal vetor. Alternativamente, um segmento de DNA que corresponde à posição dentro do cromossomo de milho para o qual o DNA transgênico foi inserido no cromossomo de milho, e que pode ser utilizado para definir o evento MON 87411, pode ser clonado por diversos meios e, então, identificado e caracterizado pela sua presença em uma amostra específica ou em um genoma do milho específico. Esses segmentos de DNA são referidos como segmentos ou sequências de junção, e podem ser de qualquer comprimento do DNA inserido e do DNA do cromossomo do milho adjacente (flanqueamento), desde que o ponto de junção entre o DNA introduzido e o genoma do milho seja incluído no segmento. A SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 21 e o complemento inverso de cada um destes são representativos de tais segmentos.
[008] As sequências específicas identificadas aqui podem estar presentes unicamente no evento MON 87411, ou a construção compreendida nele e a identificação dessas sequências, quer por análise de sequência direta, através da detecção de sondas ligadas a estas sequências, ou através da observação do tamanho e talvez da composição de amplicons específicos aqui descritos, quando presentes em um germoplasma ou genoma de milho específico e/ou presente em uma amostra biológica específica contendo o DNA de milho, são diagnósticos para a presença do evento MON 87411, ou a construção compreendida nele, em tal amostra. Sabe-se que os segmentos genômicos flanqueandos (isto é, os segmentos do genoma do milho de sequência de DNA adjacentes ao DNA transgênico inserido) estão sujeitos a uma ligeira variação e, como tal, a limitação de pelo menos 99% ou mais de identidade são com referência a essas anomalias ou polimorfismos do genoma do milho para o genoma do milho. Segmentos de nucleotídeos que são completamente complementares ao longo do seu comprimento em comparação com as sequências de diagnóstico específicas mencionadas aqui se destinam a estar dentro do escopo da presente invenção.
[009] A posição dos segmentos de nucleotídeos da presente invenção em relação uma a outra e no interior do genoma do milho é ilustrada na Figura 3 e a sequência de nucleotídeos de cada um deles é ilustrada como estabelecida em SEQ ID NO: 1. Os segmentos de nucleotídeos que caracterizam o evento MON 87411 e que são de diagnóstico para a presença do evento MON 87411, ou a construção compreendida nele, em uma amostra, incluem SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Estas presenças de uma, ou duas, ou mais destas sequências de nucleotídeos em uma amostra, quando esta amostra contém tecido de milho e, portanto, o DNA de milho, são diagnósticos para a presença do evento MON 87411, ou a construção compreendida nele.
[010] Pretende-se com o uso da palavra “derivado”, que uma molécula de DNA específica está no genoma de uma planta de milho, ou é capaz de ser detectada em DNA de plantas de milho. “Capaz de ser detectado” se refere à capacidade de um determinado segmento de DNA a ser amplificado e o seu tamanho e ou sua sequência caracterizada ou determinada pela análise de sequência de DNA, e também pode se referir a capacidade de uma sonda para se ligar especificamente ao segmento de DNA específico, ou seja, o segmento de DNA alvo, e a subsequente capacidade para detectar a ligação da sonda ao alvo. O segmento de DNA ou o segmento de DNA alvo específico da presente invenção está presente dentro do milho que contém a inserção do evento MON 87411.
[011] Em relação ao milho, entende-se que as células de milho, as semente de milho, as partes de plantas de milho e as plantas de milho estão dentro do escopo da presente invenção, desde que cada modalidade contenha uma quantidade detectável de DNA que corresponde a qualquer um, dois, ou mais segmentos que são descritos aqui como sendo diagnóstico para a presença do DNA de milho do evento MON 87411. As partes de plantas de milho incluem células, pólen, óvulos, vagens; flores e partes de flores, como sabugo, seda e borla; tecido da raiz, tecido do caule e tecido de folha. Os produtos de commodities que são feitos a partir de milho, em que uma quantidade detectável dos segmentos de DNA descritos aqui como sendo diagnósticos para a presença do evento MON 87411, estão dentro do escopo da invenção. Tais produtos de commodities podem incluir sementes de milho inteiras ou processadas, alimentos para animais contendo milho ou subprodutos de milho, óleo de milho, farinha de milho, amido de milho, flocos de milho, farelo de milho e biomassa de milho e restolho e produtos combustíveis e subprodutos combustíveis quando feitos a partir de milho ou de plantas de milho e partes de plantas.
[012] O DNA do evento de milho MON 87411 está tipicamente presente em cada célula e em cada cromossomo da planta do milho, de sementes de milho e de tecidos de milho contendo o evento. À medida que o genoma do milho é transmitido à progênie de uma forma mendeliana, se uma planta de milho fosse homozigota, cada progênie da planta e da célula de milho conteria o DNA do evento em cada um dos cromossomas parentais gerados para a descendência progênie do(s) pai(s). No entanto, se o genoma do milho contendo o DNA do evento MON 87411 for um pai heterozigótico ou híbrido, então apenas cinquenta porcento do pólen e cinquenta porcento dos óvulos envolvidos no acasalamento dos pais híbridos irá conter o DNA do evento de milho MON 87411, resultando em uma população mista de progênie que contêm o DNA do evento MON 87411, e a percentagem de tal progênie resultante de tais cruzamentos com esses híbridos pode variar de cerca de cinquenta e cerca de setenta e cinco porcento tendo o DNA do evento MON 87411 transmitido a tal progenitura.
[013] As moléculas de DNA da presente invenção podem ser únicas para o DNA inserido no evento de milho MON 87411 ou as duas junções entre o DNA transgênico inserido e o genoma de DNA do milho, que é adjacente a uma das extremidades do DNA inserido. Estas moléculas, quando presentes em uma amostra específica analisada pelos métodos descritos no presente documento utilizando as sondas, iniciadores e, em alguns casos, por meio de análise de sequência de DNA, podem ser diagnóstico para a presença de uma quantidade de milho do evento MON 87411 nesta amostra. Tais moléculas de DNA únicas para o DNA do evento de milho MON 87411 podem ser identificadas e caracterizadas por um número de formas, incluindo através da utilização de moléculas de ácido nucleico das sondas concebidas para se ligarem especificamente a moléculas de DNA únicas seguidas de detecção da ligação de tais sondas para o DNA único, e por métodos de amplificação térmica que usam, pelo menos, duas moléculas de DNA diferentes que atuam como sondas, mas a sequência de tais moléculas podem ser um pouco menos específica do que as sondas descritas acima. O perito na técnica entende que o contato de um DNA alvo específico com uma sonda ou um iniciador sob condições de hibridação adequadas resultará na ligação da sonda ou do iniciador para o segmento de DNA de destino.
[014] As moléculas de DNA da presente invenção, que são segmentos alvo de DNA, são capazes de amplificação e, quando detectadas como um ou mais amplicons do comprimento representado obtido por métodos de amplificação de uma amostra específica, podem de diagnósticos para a presença de evento MON 87411, ou a construção compreendida nele, em tal amostra. Tais moléculas de DNA ou segmentos de polinucleotídeos têm as sequências de nucleotídeos como apresentado em cada uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, e são melhores definidas aqui e nos exemplos a seguir. As moléculas de iniciadores e/ou sondas podem ser fornecidas na forma de kit, junto com os reagentes necessários, incluindo os controles, e embaladas em conjunto com instruções de utilização.
[015] As moléculas de DNA recombinante da presente invenção são consideradas como estando dentro do escopo da presente invenção quando presentes dentro ou derivadas de um microorganismo. Um micro-organismo pretende incluir qualquer célula microscópica, procariota ou eucariota ou de outra forma que contenha o DNA dentro de um genoma ou um cromossomo ou uma estrutura de DNA extra-cromossomal mais comumente referido como um plasmídeo ou um vetor. Os organismos microscópicos incluem bactérias (procariotas) e células correspondentes a formas superiores de vida (eucariotas), que estão sob o alcance visual do ser humano médio, tipicamente abaixo de cinquenta mícrons cúbicos e mais geralmente abaixo de dez mícrons cúbicos. As bactérias são microorganismos microscópicos comuns que, mais provavelmente do que não, pode conter um vetor ou plasmídeo contendo um ou mais ou todos os segmentos de DNA novos da presente invenção, incluindo cada uma das respectivas cassetes de expressão presentes, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1. As células vegetais e em particular as células de plantas de milho estão dentro do escopo da invenção, desde que estas contenham qualquer um, dois, ou mais ou todos os segmentos de DNA novos da presente invenção.
[016] As sondas para a utilização na presente invenção são tipicamente caracterizadas como moléculas de DNA ou segmentos de polinucleotídeos de comprimento suficiente para funcionar sob condições de hibridação rigorosas, tal como definido aqui, para se ligar com um determinado segmento de DNA alvo, ou seja, um segmento único de DNA presente dentro, e diagnosticado para a presença, do DNA do evento MON 87741 em uma amostra. Tal sonda pode ser concebida para se ligar apenas a uma única ligação ou outra sequência nova presente apenas no DNA do evento do milho MON 87411, ou a dois ou mais tais segmentos de junção únicos. Em qualquer caso, a detecção da ligação de tal sonda a uma molécula de DNA em uma amostra específica suspeita de conter o DNA de milho é diagnosticada para a presença de evento de milho MON 87411 na amostra.
[017] Os iniciadores são tipicamente fornecidos como pares de diferentes segmentos de oligonucleotídeos ou de polinucleotídeos para o uso em uma reação de amplificação térmica que amplifica um segmento específico de DNA alvo. Cada iniciador do par é concebido para se ligar a um segmento específico de DNA, dentro ou perto de um segmento de DNA de interesse para a amplificação. Os iniciadores se ligam de tal maneira que, então, estes atuam como regiões localizadas de polimerização de sequência de ácido nucleico resultando na produção de um ou mais amplicons (segmentos alvo amplificados de DNA). Na presente invenção, a utilização de iniciadores concebidos para se ligarem a segmentos únicos do DNA do evento de milho MON 87411 em uma amostra biológica específica e amplificar os amplicons específicos que contenham um ou mais dos segmentos de junção descritos aqui, e a detecção e ou a caracterização de tais amplicons após a conclusão ou a interrupção da reação da polimerase, é diagnóstico para a presença do evento de milho MON 87411 na amostra específica. O especialista na técnica é bem familiarizado com o método de amplificação e nenhuma descrição das especificidades de amplificação é necessária aqui.
[018] As plantas de milho, as células de plantas de milho, os tecidos de plantas de milho e as sementes de milho são insensíveis as aplicações de herbicidas glifosato devido a expressão de uma enzima CP4 EPSPS insensível ao glifosato a partir de um promotor de arroz Rcc3 em uma cassete de expressão na extremidade distal 3' como apresentada na SEQ ID NO: 1. Tal semente pode ser plantada em um campo. Vários dias após a germinação e o aparecimento de brotos, uma quantidade eficaz de herbicida glifosato para o controle de ervas daninhas pode ser aplicada, que irá eliminar substancialmente todas as ervas daninhas no campo, mas vai permitir a continuação do crescimento e do desenvolvimento de plantas de milho contendo o DNA do evento de milho MON 87411. As plantas também são resistentes à infestação por larvas da raiz do milho de todas as espécies conhecidas de larvas da raiz de Diabrotica, incluindo, mas não se limitando a, Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR) ou complexo de Brazilian Corn Rootworm(BCR), constituído por Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa), ou Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn rootworm, SCR)). A resistência a espécies Diabrotica surge em ligação com a expressão de dois segmentos de DNA diferentes que são operativamente e covalentemente ligados dentro do DNA transgênico inserido: um dsRNA é transcrito a partir da cassete de expressão na extremidade proximal 5' do DNA transgênica inserido como descrito na SEQ ID NO: 1 e como ilustrado na Figura 1 pela posição de [G] SEQ ID NO: 12, e objetiva a supressão de um gene essencial em larvas da raiz do milho; e uma proteína tóxica Cry3Bb para coleópteros é expressada a partir de uma cassete de expressão (aproximadamente centrada na SEQ ID NO: 1, tal como mostrado na Figura 1 pela posição de [H] SEQ ID NO: 14) centrada entre a cassete de expressão dsRNA[G] e a cassete na extremidade distal 3' do DNA transgênico inserido como descrito em SEQ ID NO: 1 (uma cassete de expressão de tolerância ao glifosato, ilustrada na Figura 1 por [I] SEQ ID NO: 16). Os alvos dsRNA para a supressão de um gene ortólogo de levedura referidos como snf7 e é expressado a partir de um promotor de CAMV e35S, enquanto que a proteína Cry3Bb é expressa a partir de um promotor PIIG de Zea mays. O dsRNA e a proteína Cry3Bb são agentes tóxicos para as espécies de larvas da raiz do milho.
[019] Os promotores que dirigem a expressão dos agentes tóxicos de dsRNA e Cry3Bb são posicionados de forma divergente de modo a que a expressão do de cada promotor do respectivo agente tóxico seja afastada de um ponto centrado entre os dois promotores, isto é, a transcrição de cada cassete de expressão procede em sentidos opostos e não convergem. A cassete de expressão de CP4 EPSPS tolerância ao glifosato é a jusante de, isto é, próximo do terminal 3' como apresentado na SEQ ID NO: 1 e 3' distal para a cassete que dirige a expressão da proteína Cry3Bb. As cassetes que dirigem a expressão de Cry3Bb e EPSPS produzem as respectivas proteínas utilizando um conjunto de orientação da transcrição, Cry3Bb a montante do EPSPS, e transcrito com a mesma orientação, mas cada um a partir dos respectivos promotores separados. Deixando a cassete de expressão do dsRNA e a cassete de tolerância ao glifosato intacta e posicionado nas extremidades distais do segmento de DNA pretendido para inserção no genoma do milho, outras construções variantes foram produzidas em que a orientação da cassete de Cry3Bb foi invertida ou revertida em relação ao desenho presente no DNA do evento MON 87411. Estas construções variantes utilizaram o promotor PIIG de Zea mays ou um promotor Rcc3 de arroz para dirigir a expressão de Cry3Bb.
[020] Os acontecimentos transgênicos contendo apenas estas construções/orientações variantes da cassete de expressão de Cry3Bb foram comparados com o evento MON 87411 e com os eventos comerciais atualmente disponíveis MON863 (contendo apenas uma cassete de expressão de Cry3Bb), MON88017 (contendo uma cassete de expressão de Cry3Bb operativamente ligada a uma cassete de expressão CP4 EPSPS) e DAS-59122-7 (contendo três cassetes de expressão ligadas operacionalmente, duas expressando em conjunto os dois componentes da toxina Bt Cry34 e Cry35 junto com um gene que confere tolerância ao glufosinato). Os resultados como ilustrados abaixo nos exemplos mostram que o evento MON 87411 exibiu propriedades superiores para a expressão dirigida para a raiz da proteína Cry3Bb e a pluralidade de eventos transgênicos produzidos usando a construção usada para gerar o evento MON 87411 foram cada um mais provável de exibir o controle de eficácia de larvas da raiz do milho do que os eventos produzidos com outras construções.
[021] As plantas de milho da presente invenção e suas partes, incluindo as sementes, cada uma contendo o DNA correspondente ao evento MON 87411, estão dentro do escopo da presente invenção. Tais plantas são resistentes à infestação por larva da raiz do milho e são insensíveis a aplicações de herbicida glifosato. Tais plantas incluem os híbridos que contenham apenas um alelo de MON 87411, isto é, um genoma caracterizado como heterozigótico com referência ao local correspondente ao DNA do evento MON 87411. Esses híbridos são produzidos através de cruzamentos com germoplasma desejável para assegurar vigor híbrido e outras propriedades agrícolas desejáveis de milho. Os híbridos podem ser produzidos por qualquer número de métodos, mas um método preferido tira vantagem de um primeiro pai congênito (homozigoto) que contém o alelo específico do evento MON 87411 em ambos os cromossomas ao locus no qual está inserido o DNA do evento MON 87411, e cruzando o primeiro inato, junto com um segundo inato que não contêm o DNA do MON 87411. Ambas as variedades inatas parentais terão uma ou mais propriedades desejáveis vantajosas na semente da progênie, isto é, a semente híbrida.
[022] A propriedade transgênica ou o alelo que confere algum traço adicional a uma planta que contém o DNA do evento MON 87411 é particularmente desejável. Tais alelos transgênicos incluem outros eventos transgênicos que conferem resistência à larva da raiz do milho, incluindo, mas não limitados a, eventos tais como DAS-59122-7; MIR604; e 5307. Cada um desses eventos proporciona um agente tóxico da larva da raiz suplementar (DAS-59122-7 fornece PS149B1 (Cry34/Cry35) exibindo propriedades tóxicas de larva da raiz e tolerância a herbicida glufosinato; MIR604 fornece um Cry3Aa modificado exibindo propriedades tóxicas de larva da raiz; o evento 5307 fornece o gene FR8a exibindo propriedades tóxicas de larva da raiz). Fornecendo traços adicionais de resistência à larva da raiz, tais como estes, podem diminuir a probabilidade de desenvolvimento de resistência a qualquer um dos agentes tóxicos da larva da raiz do milho fornecido. Outros traços desejáveis incluem resistência ao estresse ou à produção ou traços tolerantes, traços de fixação de nitrogênio, traços que modulam a utilização de água, a resistência a infestação por fungos, a resistência a herbicidas, tais como dicamba (MON 87427), glufosinato, e semelhantes, assim como a resistência à infestações de lepidópteros. Os traços de resistência à infestação de lepidópteros têm sido fornecidos na técnica e incluem os eventos transgênicos de milho (e respectivas proteínas ativas de lepidópteros) MON810 (Cry1Ab), MON 89034 (Cry1A.105 e Cry2Ab); TC1507 (Cry1Ac e Cry1Fa); DAS-06275-8, também conhecido como TC-6275 (Cry1Fa e bar (fornecendo tolerância ao glufosinato)); MIR162 (Vip3Aa), Bt176 (Cry1Ab); e BT11 (Cry1Ab). Uma alternativa para fornecer qualquer combinação ou todos esses traços em uma única planta, especialmente os traços de resistência a insetos correspondentes aos traços do evento MON 87411, os outros traços listados resistência de larva da raiz, ou os traços de resistência aos lepidópteros, seria fornecer estes em várias combinações de misturas de sementes, em que determinadas sementes na mistura contenham os traços de MON 87411, e alguma combinação de apenas os traços de resistência aos coleópteros listados e agem em conjunto abaixo do solo para evitar infestações de larva da raiz de milho, enquanto outra semente na mistura contém apenas os traços de resistência ao lepidóptero e conferem resistência a infestações de leptidópteros de milho acima do solo. Desta forma, a semente na mistura fornece refúgio para a outra, isto é, a semente e as plantas protegidas de coleópteros atuam como um refúgio para as plantas que confere resistência aos lepidópteros, e vice-versa.
[023] Tipicamente, no entanto, esses traços seriam fornecidos em alguma combinação ou embalagem de traços na qual os traços de MON 87411 seriam fornecidos em conjunto em uma única planta por meio de cruzamento com um ou mais traços de resistência a lepidópteros para fornecer uma embalagem completa de resistência a pragas para a colheita no campo, e uma pequena percentagem da semente (talvez entre 1 e 20 porcento, ou qualquer número entre incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 porcento) teria os traços apenas para tolerância a herbicida e não teria nenhum traço de proteção de pragas e seria plantada no campo em uma mistura aleatória com a semente com traços de resistência a pragas ou como um suporte de estrutura (em separado) de culturas agiria como um refúgio tanto para as pragas que atacam as plantas de milho acima do solo como as pragas que atacam as plantas de milho abaixo do solo.
[024] A construção inserida no evento MON 87411 proporciona vantagens particulares em relação à cassete de expressão de EPSPS. Em primeiro lugar, a presença desta cassete proporciona a facilidade de seleção de eventos transgênicos em que a construção foi inserida. Em segundo lugar, a cassete proporciona o controle de ervas daninhas em um campo no qual a semente correspondente ao evento MON 87411 foi plantada. O campo que contém tais plantas de MON 87411 pode ser pulverizado com uma quantidade eficaz de glifosato para controlar o crescimento de semanas no campo que é susceptível ao glifosato. Para ervas daninhas que não são suscetíveis ao glifosato. Como mencionado acima, outros fenômenos transgênicos que proporcionam a tolerância a outros herbicidas, tais como ao dicamba ou ao glufosinato, podem ser cruzados em um único híbrido junto com o evento MON 87411, proporcionando assim um meio eficaz para o controle de ervas daninhas em um campo pela aplicação de dois ou mais herbicidas de glifosato, dicamba ou glufosinato, como a probabilidade de que as ervas daninhas estariam presentes, as quais exibem tolerância para dois ou mais destes herbicidas, seria improvável, e em tal caso, o cultivo de milho consistiria de híbridos que apresentam resistência a tais aplicações de combinações de herbicidas.
[025] A Figura 1 é uma representação esquemática da inserção transgênica no genoma de evento de milho MON 87411: [A] representa a SEQ ID NO: 1, que é a sequência contígua da inserção de DNA transgênico integrada no genoma de milho e LH244 e DNA genômico 5' e de 3' que flanqueia o DNA inserido; [B] e [C] correspondem às posições relativas das SEQ ID NOs: 2 e 3, que formam as sequências de junção do DNA transgene/genômico 5 'e 3' do evento MON 87411, respectivamente; [D] representa a SEQ ID NO: 4, que é a sequência da inserção de DNA transgênico integrado no genoma, resultando no evento MON 87411; [E] corresponde às posições relativas da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, cada uma abrangendo a junção d 5' que entre as extremidades terminais do DNA transgênico inserido e o DNA genômico de flanqueamento; [F] corresponde às posições relativas da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, cada uma abrangendo a junção 3’ entre as extremidades terminais do DNA transgênico inserido e o DNA genômico de flanqueamento; [G], [H] e [I] representam, respectivamente, as três cassetes de expressão diferentes, correspondentes à construção de DNA transgênico inserido no genoma da planta de milho resultante de um evento MON 87411; [J] e [K] representam os iniciadores de oligonucleotídeos, as sondas de oligonucleotídeos, e os amplicons de DNA correspondentes as junções do evento MON 87411.
[026] A Figura 2 ilustra onze diferentes construções de DNA, (417, 416, 418, 419, 402, 403, 404, 423, 405, 406, e 890) modificadas para expressar até três cassetes diferentes, incluindo duas cassetes de protetor incorporado a planta (PIP), visando uma larva de WCR, e uma única cassete de tolerância a herbicidas. As duas cassetes de PIP incluem (a) uma cassete de expressão para uma repetição invertida de Dv_Snf7o 240-mer, e (b) uma cassete de expressão para uma proteína Cry3Bb. Cada uma das construções ilustradas compreende estas cassetes de expressão de forma e orientação variáveis. As construções 405 e 406 não contêm cassete de tolerância a herbicidas e a construção 890 compreende apenas uma única cassete de expressão para uma repetição invertida de Dv_Snf7o 240- mer. As três construções compreendem um total de dezesseis elementos genéticos da Borda Esquerda (LB) até a Borda Direita (RB): [1] LB; [2] UTR Ps.RbcS2-E9 3'; [3] gene repetição invertida 240-mer Dv_Snf7o; [4] íntron DnaK do milho; [5] líder CaMV 35S; [6] promotor eCaMV 35S; [7] promotor PIIG do milho; [8] líder Lhcb1 do trigo; [9] íntron Act1 do arroz; [10] Cry3Bb ORF; [11] UTR Hsp17 3' do trigo; [12] TubA (promotor, líder, íntron) do arroz; [13] CTP; [14] CP4 EPSPS; [15] UTR Tuba 3' do arroz; e [16] RB.
[027] Figura 3 [A] - [N] e [aa] - [mm] ilustram os elementos ligados operacionalmente e o genoma de milho de flanqueamento e a sua posição em relação uns aos outros uma vez que estes são apresentados na posição de inserção de DNA transgênico no genoma do milho do evento MON87411. As seguintes descrições de identificam a composição, a função e a posição de cada um dos elementos, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1.
[028] [A] posição de nucleotídeo 1-500 como apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde ao DNA do genoma de milho adjacente ao DNA transgênico inserido no evento de milho MON87411, que neste caso é arbitrariamente designado como a extremidade 5' do DNA transgênico inserido.
[029] [B] posição de nucleotídeos 807-1439, conforme apresentado na SEQ ID NO: 1, corresponde à sequência de complemento inverso de um sinal de poliadenilação e de terminação da transcrição 3' da ribulose bisfosfato carboxilase de Pisum sativum com subunidade pequena E9.
[030] [C] posição de nucleotídeos 1469-2098 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência de complemento inverso concebida para ser expressada como uma molécula de RNA que se dobra em 240 nucleotídeos de dsRNA e uma estrutura em gancho de 150 nucleotídeos que é concebido para atingir a supressão o ortólogo da espécie Diabrotica de um gene de levedura que codifica uma proteína Snf7 quando fornecida na dieta de uma espécie Diabrotica. Um primeiro segmento de 240 de nucleotídeos correspondente a uma parte do gene ortólogo snf7 da Diabrotica é proporcionado na posição de nucleotídeo 1469-1708 como apresentado na SEQ ID NO: 1, um segundo segmento de 240 nucleotídeo correspondendo ao complemento inverso do primeiro segmento é apresentado na posição do nucleotídeo 1850 - 2098, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, e o primeiro e o segundo segmentos são operativamente ligados por um espaçador de 150 nucleotídeos na posição de nucleotídeo 1709-1858 como apresentado na SEQ ID NO: 1.
[031] [D] a posição de nucleotídeos 2135-2938 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência de complemento inverso de um intron derivado de um gene dnaK de Zea mays.
[032] [E] a posição de nucleotídeos 2839-3298 como apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde ao complemento inverso de uma sequência do promotor 35S melhorado do vírus do mosaico da couve-flor e uma sequência líder não traduzida 5'. Este promotor, o líder não traduzido associado, o elemento íntron [D] e a terminação da transcrição e o elemento de poliadenilação [B], regulam a expressão do elemento [C] em células de plantas de milho.
[033] [F] a posição de nucleotídeos 3586-4534 como apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência de promotor derivada de um gene de proteína induzida por impedância física de Zea mays (Zm.PIIG). Este promotor, o líder não traduzido associado [L], o elemento do intron [H] e a terminação da transcrição e o elemento de poliadenilação [J] regulam a expressão do elemento [I]. Este promotor é orientado em relação ao promotor [E] de tal forma que cada promotor ([E], [F]) conduzirá a expressão divergente dos seus respectivos elementos ([C] e [I]) (ver as setas de bloco na figura 2, onde as setas são representativas dos respectivos promotores ([e] e [F]) no sentido indicado de expressão a partir do promotor respectivo).
[034] [G] a posição de nucleotídeos 4541-4601 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência líder 5' não traduzida derivada de um gene b1 do complexo captador de luz do Triticum aestivum (Ta.Lhcb1).
[035] [H] a posição de nucleotídeos 4618-5097 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência de íntron derivada de um gene Actina-1 de Oryza sativa (Os.Act1).
[036] [I] a posição de nucleotídeos 5107-7068 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína tóxica da larva da raiz do milho Cry3Bb (Cry3Bb). A proteína codificada Cry3Bb é pesticida quando fornecida na dieta de uma espécie Diabrotica (larva da raiz do milho).
[037] [J] a posição de nucleotídeos 7088-7297 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência do sinal de poliadenilação e de terminação da transcrição de uma proteína de choque térmico 17 de Triticum aestivum (HSP17).
[038] [K] a posição de nucleotídeos 7346-9526 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência de intronlíder-promotor- contígua derivada de um gene alfa tubulina-3 de Oryza sativa (tubA-3). Este promotor, com o líder e intron associado, e a terminação da transcrição e o elemento de poliadenilação [M], regulam a expressão do elemento [L].
[039] [L] a posição de nucleotídeos 9531-11126 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência de um peptídeo de direcionamento citoplasmático de Arabidopsis thaliana (CTP, a partir de posições de nucleotídeos 9531-9758), e uma sequência de um EPSPS derivado de Agrobacterium CP4 (a partir da posição de nucleotídeos 9759-11126). Quando esta sequência é transcrita e traduzida na proteína em uma célula da planta de milho, o CTP está ligado operativamente ao EPSPS. Quando expressado em células de planta de milho, compreendendo o evento MON87411, este CTP-EPSPS fornece tolerância ao herbicida glifosato.
[040] [M] a posição de nucleotídeos 11134-11715 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência do sinal de poliadenilação e de terminação da transcrição de um gene alfa tubulina-3 (tubA-3) de Oryza sativa.
[041] [N] a posição de nucleotídeos 11749-12248 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde ao DNA do genoma do milho adjacente ao DNA transgênico inserido no evento de milho MON87411, que neste caso é arbitrariamente designado como a extremidade 3' do DNA transgênico inserido.
[042] [aa] a posição de nucleotídeos 501-806 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde à porção da sequência de borda esquerda da octopina de Agrobacterium tumefaciens de construção 417 adjacente para o genoma na extremidade 5' arbitrariamente atribuída do DNA transgênico inserido dentro do genoma do milho para formar o evento final MON 87411. A extremidade 5’ de [aa] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [A] para formar a junção única 5' do genoma de milho/ DNA transgênico inserido englobado pela SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 21. A extremidade 3' do elemento [aa] está ligada à extremidade 5' do elemento [B] para formar uma única junção dentro do DNA transgênico inserido que é englobado pela SEQ ID NO: 41.
[043] [bb] a posição de nucleotídeos 1440-1468 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [B] e [C]. A extremidade 5’ de [bb] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [B], e a extremidade 3' do elemento [bb] é ligada à extremidade 5' do elemento [C] para formar uma única junção englobada pela SEQ ID NO: 42, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[044] [cc] a posição de nucleotídeos 2099-2134 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [C] e [D]. A extremidade 5' [cc] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [C], e a extremidade 3' do elemento [cc] está ligada à extremidade 5' do elemento [D] para formar uma única junção englobada pela SEQ ID NO: 43, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[045] [ee] a posição de nucleotídeos 3299-3585 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [E] e [F]. A extremidade 5' de [ee] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 está ligado à extremidade 3' do elemento de [E], e a extremidade 3 'do elemento [ee] está ligado ao extremo 5' do elemento [F] para formar uma única junção englobada pela SEQ ID NO: 44, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[046] [ff] a posição de nucleotídeos 4535-4540 conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [F] e [L]. A extremidade 5’ de [ff], conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 está ligada à extremidade 3' do elemento [F], e a extremidade 3' do elemento [ff] está ligada à extremidade 5' do elemento [G] para formar uma única junção, englobada pela SEQ ID NO: 45, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[047] [gg] a posição de nucleotídeos 4602-4617 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [G] e [H]. A extremidade 5' de [gg] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 está ligada à extremidade 3' do elemento [G], e a extremidade 3' do elemento [gg] está ligada à extremidade 5' do elemento [H] para formar uma junção englobada pela SEQ ID NO: 46, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411, mas que não é única para o evento MON 87411.
[048] [hh] a posição de nucleotídeos 5098-5106 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [H] e [I]. A extremidade 5’ de [hh] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [H], e a extremidade 3' do elemento [hh] está ligado à extremidade 5' do elemento [I] para formar uma junção englobada pela SEQ ID NO: 47, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411, mas que não é a única do evento MON 87411.
[049] [ii] a posição de nucleotídeos 7069-7087 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [I] e [J]. A extremidade 5’ de [ii] conforme apresentado na SEQ ID NO: 1 está ligada à extremidade 3' do elemento [I], e a extremidade 3' do elemento [ii] está ligada à extremidade 5' do elemento [J] para formar uma junção englobada pela SEQ ID NO: 48 dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON87411, mas que não é a única do evento MON 87411.
[050] [jj] a posição de nucleotídeos 7298-7345 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência interveniente entre os elementos [J] e [K]. A extremidade 5' de [jj] conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [J], e a extremidade 3' do elemento [jj] está ligada à extremidade 5' do elemento [K] para formar uma única junção englobada pela SEQ ID NO: 49 dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[051] [kk] a posição de nucleotídeos 9527-9530 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [K] e [L]. A extremidade 5' de [kk] conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 está ligada à extremidade 3' do elemento [K], e a extremidade 3' do elemento [kk] está ligada à extremidade 5' do elemento [L] para formar uma única junção, englobada pela SEQ ID NO: 50, dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[052] [ll] a posição de nucleotídeos 11127-11133 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma sequência interveniente entre os elementos [L] e [M]. A extremidade 5' de [ll] conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [L], e a extremidade 3' do elemento [ll] está ligada à extremidade 5' do elemento [M] para formar uma única junção englobada pela SEQ ID NO: 51 dentro do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411.
[053] [mm] a posição de nucleotídeos 11716-11748 conforme apresentada na SEQ ID NO: 1 corresponde a uma porção de sequência de borda direita nopalina de Agrobacterium tumefaciens da construção adjacente 417 para o genoma na extremidade 3’ arbitrariamente atribuída do DNA transgênico inserido no genoma do milho para formar o evento MON 87411. A extremidade 5’ de [mm] conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1 é ligada à extremidade 3' do elemento [M], e a extremidade 3' do elemento [mm] está ligada à extremidade 5' do elemento [N] para formar um único DNA transgênico inserido/ junção do genoma de milho englobados pela SEQ ID NO: 52.
[054] Figura 4 Ilustração da orientação da cassete para vetores testados para mostrar maior eficácia dos promotores divergentes dirigindo a expressão de agentes tóxicos da larva da raiz do milho em relação aos vetores com orientação em conjunto de promotores dirigindo a expressão de agentes tóxicos da larva da raiz do milho.
[055] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA genômico 5' que flanqueia (adjacente a) o DNA transgênico inserido (500 nucleotídeos), o DNA transgênico inserido (11.248 nucleotídeos), e um segmento de DNA genômico 3' que flanqueia (adjacente a) o DNA transgênico inserido (500 nucleotídeos) no evento MON 87411.
[056] SEQ ID NO: 2 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA genômico 5' adjacente ao DNA transgênico inserido (500 nucleotídeos), e a borda de DNA transgênico inserido remanescente (263 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[057] SEQ ID NO: 3 é uma sequência da junção de nucleotídeos de evento MON 87411, e representa de 5' a 3', a margem de DNA transgênico remanescente inserido (15 nucleotídeos), e um segmento de DNA genômico 3' adjacente ao DNA genômico inserido (500 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[058] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa o DNA genômico inserido (11.248 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[059] SEQ ID NO: 5 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA genômico 5' adjacente ao DNA transgênico inserido (50 nucleotídeos), e a borda de DNA transgênico inserido remanescente (263 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[060] SEQ ID NO: 6 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA genômico 5' adjacente ao DNA transgênico inserido (110 nucleotídeos), e a borda de DNA transgênico inserido remanescente (263 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[061] SEQ ID NO: 7 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA genômico 5' adjacente ao DNA transgênico inserido (145 nucleotídeos), e a borda de DNA transgênico inserido remanescente (263 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[062] SEQ ID NO: 8 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA transgênico inserido (83 nucleotídeos), e um segmento de DNA genômico 3' adjacente ao DNA transgênico inserido (34 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[063] SEQ ID NO: 9 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA transgênico inserido (83 nucleotídeos), e um segmento de DNA genômico 3' adjacente ao DNA transgênico inserido (90 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[064] SEQ ID NO: 10 é uma sequência da junção de nucleotídeos do evento MON 87411, e representa de 5' a 3', um segmento de DNA transgênico inserido (83 nucleotídeos), e um segmento de DNA genômico 3' adjacente ao DNA transgênico inserido (255 nucleotídeos) do evento MON 87411.
[065] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de Diabrotica virgifera virgifera (larva da WCR) que codifica uma subunidade complexa ESCRT-III que é ortóloga a levedura Snf7.
[066] SEQ ID NO: 12 é uma sequência de nucleotídeos que representa a cadeia anti-sentido de uma cassete de expressão de DNA que inclui um gene recombinante modificado para expressar uma molécula de RNA de repetição invertida. Os segmentos de DNA de repetição invertida correspondem às posições 663 a 902 às posições 1292 a 1053. As sequências de DNA de repetição invertida correspondem à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, da posição de nucleotídeos 151-390.
[067] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de ribonucleotídeo transcrita a partir do DNA, como descrito em SEQ ID NO: 12.
[068] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de nucleotídeos que representa a cadeia de sentido de uma cassete de expressão de DNA que inclui um gene recombinante modificado para codificar e expressar uma proteína Cry3Bb tóxica da larva da raiz do milho.
[069] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de tradução de aminoácidos de um polinucleotídeo correspondente às posições 15223480 da SEQ ID NO: 14, e que representa uma proteína tóxica Cry3Bb da larva da raiz do milho.
[070] SEQ ID NO: 16 é uma sequência de nucleotídeos que representa a cadeia de sentido de uma cassete de expressão de DNA que inclui um gene recombinante modificado para codificar e expressar uma proteína 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS).
[071] SEQ ID NO: 17 é uma sequência de tradução de aminoácidos de um polinucleotídeo correspondente às posições 2186 a 3781 da SEQ ID NO: 16, e que representa uma proteína de EPSPS que apresenta insensibilidade ao herbicida glifosato.
[072] SEQ ID NO: 18 é uma sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ27011, e é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 462-490 da SEQ ID NO: 1.
[073] SEQ ID NO: 19 é uma sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo sintético designado por PB3552, e é idêntico ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 502-515 da SEQ ID NO: 1. PB3552 pode ser 5' marcado com uma porção de 6-carboxifluoresceína (6-FAM™) e 3' marcado com uma porção quencher para utilização em combinação com um par de iniciadores de amplificação térmica, por exemplo, SQ27011 e SQ9085, e capaz de ser utilizado em método de amplificação de DNA TAQMAN® para detectar a presença do DNA do evento MON 87411 em uma amostra biológica que contém o DNA do evento de milho MON 87411.
[074] SEQ ID NO: 20 é uma sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ9085, e é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 516-541 da SEQ ID NO: 1.
[075] SEQ ID NO: 21 é uma sequência de nucleotídeos de evento MON 87411, e corresponde às posições 462-541 da SEQ ID NO: 1. Um aplicon exibindo esta sequência pode ser produzido com um par de iniciadores de amplificação térmicos, por exemplo, SQ27011 e SQ9085.
[076] SEQ ID NO: 22 é uma sequência de nucleotídeos de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ27066, e é idêntico à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11710-11728 da SEQ ID NO: 1.
[077] SEQ ID NO: 23 é uma sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo sintético designado por PB11300, e é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11731-11755 da SEQ ID NO: 1. PB11300 pode ser 5' marcado com uma porção de 6-carboxifluoresceína (6-FAM™) e 3' marcado com uma porção quencher. Marcado desta forma, PB11300 pode ser usado em combinação com um par de iniciadores de PCR, por exemplo, SQ27066 e SQ26977, para detectar eventos MON 87411 num ensaio de TaqMan®.
[078] SEQ ID NO: 24 é uma sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ26977, e é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11.756-11.784 da SEQ ID NO: 1.
[079] SEQ ID NO: 25 é uma sequência de nucleotídeos de evento MON 87411, e corresponde às posições 11710-11784 da SEQ ID NO: 1. Um amplicon exibindo esta sequência pode ser amplificado com um par de iniciadores, por exemplo, SQ27066 e SQ26977, e é diagnóstico do evento MON 87411.
[080] SEQ ID NO: 26 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 417.
[081] SEQ ID NO: 27 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 416.
[082] SEQ ID NO: 28 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 418.
[083] SEQ ID NO: 29 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 419.
[084] SEQ ID NO: 30 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 402.
[085] SEQ ID NO: 31 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 403.
[086] SEQ ID NO: 32 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 404.
[087] SEQ ID NO: 33 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 423.
[088] SEQ ID NO: 34 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 405.
[089] SEQ ID NO: 35 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 406.
[090] SEQ ID NO: 36 é uma sequência de nucleotídeos que representa a construção do DNA # 890.
[091] SEQ ID NO: 37 é uma sequência de nucleotídeos da planta de milho LH244 representando o alelo de tipo selvagem do evento MON 87411. Um amplicon exibindo esta sequência de nucleotídeos pode ser produzido com um par de iniciadores de PCR, por exemplo, SQ27011 e SQ26977, e é diagnóstico do alelo de tipo selvagem do evento MON 87411.
[092] SEQ ID NO: 38 é uma sequência de nucleotídeos de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ20221.
[093] SEQ ID NO: 39 é uma sequência de nucleotídeos de um oligonucleotídeo sintético designado por PB10065. PB10065 pode ser 5' marcado com VIC™ e 3' marcado com uma porção quencher. Marcado desta forma, PB10065 pode ser usado em combinação com um par de iniciadores de PCR, por exemplo, SQ10065 e SQ20222, para detectar a presença de um segmento de um gene endógeno de milho em um ensaio TaqMan®.
[094] SEQ ID NO: 40 é uma sequência de nucleotídeos de um oligonucleotídeo sintético designado por SQ20222.
[095] SEQ ID NOs: 41-52 são sequências de nucleotídeos de regiões da SEQ ID NO: 1, em que cada SEQ ID NO: compreende uma junção formada pela sequência de intervenção e a expressão de cassetes de elementos tal como detalhado na breve descrição para a Figura 3.
[096] Os inventores identificaram um evento de milho transgênico MON 87411 com propriedades e desempenho superiores em comparação com plantas de milho transgênico existentes. O evento de milho MON 87411 contém três cassetes de expressão operacionalmente ligadas que conferem coletivamente os traços de resistência à larva da raiz do milho e de tolerância do herbicida glifosato a células de milho, tecidos de milho, sementes de milho e plantas de milho contendo o evento transgênico MON 87411. O evento de milho MON 87411 fornece dois modos de ação para espécies de pragas da larva da raiz do milho (incluindo Diabrotica spp., especialmente quando a praga é Diabrotica virgifera virgifera (Western Corn Rootworm WCR), Diabrotica barberi (Northern Corn Rootworm, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Mexican Corn rootworm, MCR), Diabrotica balteata (Brazilian Corn Rootworm (BZR) ou complexo de Brazilian Corn Rootworm(BCR), constituído por Diabrotica viridula e Diabrotica speciosa), ou Diabrotica undecimpunctata howardii (Southern Corn rootworm, SCR)). Outros eventos de milho transgênico foram referenciados na técnica que fornecem várias modalidades conferidas individualmente, tais como MON863 (conferindo o traço de resistência às larvas da raiz do milho, pela expressão de uma proteína toxina inseticida Cry3Bb), ou os eventos de milho transgênico proporcionam dois ou mais traços, tais como o evento do milho MON88017 (conferindo o traço de resistência às larvas da raiz do milho, pela expressão de uma proteína toxina inseticida Cry3Bb e o traço de resistência ao herbicida glifosato, pela expressão de um EPSPS insensível ao glifosato) e o evento de milho DAS 59122-7 (conferindo o traço de resistência às larvas da raiz do milho pela expressão de uma toxina binária PS149B1 de Bacillus thuringiensis, também conhecida como Cry34/Cry35, e o traço de tolerância ao herbicida glufosinato). Outra técnica revela a combinação pelo cruzamento dos traços conferidos pelos eventos de milho MON88017 ou DAS 59122-7 com um evento de milho transgênico que confere o traço de resistência à larva da raiz do milho resultante da expressão de um dsRNA alvo para a supressão de um gene da larva da raiz do milho essencial para sobrevivência das larvas da raiz do milho (US 7.943.819). Inerente a tais combinações são os problemas associados com a necessidade de criação destes traços múltiplos localizados em múltiplos locais diferentes e em vários cromossomos no genoma do milho juntos em uma única planta de milho e mantendo esses traços como os híbridos em dezenas, se não centenas, de diferentes variedades de germoplasma de milho. A solução para estes problemas seria incluir combinações destes traços em conjunto num único local. Os presentes inventores proporcionam tal solução para o problema na forma do evento de milho MON 87411, que combina três cassetes de expressão ligadas covalentemente em conjunto em um único local no genoma do milho, estas cassetes de expressão conferem os traços de resistência à larva da raiz do milho e tolerância do herbicida glifosato às células de milho, aos tecidos de milho, às sementes de milho e às plantas de milho que contêm o evento transgênico MON87411. Uso do evento de milho MON 87411 fornece grandes benefícios para os produtores de milho: a) proteção contra perdas econômicas devido às larvas da raiz do milho, fornecendo dois modos de ação diferentes de resistência à larva da raiz do milho, e b) a capacidade de aplicar o glifosato contendo herbicidas agrícolas para a colheita de milho para controle das ervas daninhas de largo espectro. Adicionalmente, os transgenes que codificam a larva da raiz do milho e os traços tolerantes ao glifosato são ligados no mesmo segmento de DNA e ocorrem em um único local do genoma de MON 87411, proporcionando uma melhoria da eficiência de reprodução e permitindo o uso de marcadores moleculares para controlar o transgene inserido nas populações reprodutoras e suas progênies.
[097] O evento de milho MON 87411 foi produzido por um processo de transformação mediado por Agrobacterium de uma linhagem de milho endogâmica com a construção de plasmídeo pMON120417. Esta construção de plasmídeo contém as cassetes de expressão de plantas com ligações com os elementos genéticos reguladores necessários para a expressão em células de plantas de milho de uma proteína CP4 EPSPS, bem como uma proteína Cry3Bb e um dsRNA alvo para a supressão de um gene essencial para as células de larvas da raiz do milho quando as células do milho contendo o evento de milho MON 87411 são fornecidas na dieta destas larvas das raízes do milho. Células de milho foram regeneradas em plantas de milho intactas e plantas individuais foram selecionadas a partir da população de plantas que mostrou integridade das cassetes de expressão das plantas e resistência ao glifosato e danos de alimentação das larvas da raiz do milho. Uma planta de milho que contenha no seu genoma as cassetes de expressão da planta ligada presente no evento do milho MON 87411 é um aspecto da presente invenção.
[098] O DNA do plasmídeo inserido no genoma do evento de milho MON 87411 foi caracterizado por análises moleculares detalhadas. Estas análises foram: o número de inserção (número de sítios de integração dentro do genoma do milho), o número de cópias (número de cópias de T-DNA dentro de um locus), e a integridade do DNA transgênico inserido. A construção do plasmídeo contendo as três cassetes de expressão ligadas inseridas no genoma do milho que dá origem ao evento MON 87411 contém vários segmentos (sequências de junção entre os elementos usados para fabricar ou construir as várias cassetes de expressão) que não são conhecidos por aparecerem naturalmente no genoma do milho nem em outros vetores ou eventos transgênicos de milho ou de outro modo (por exemplo, sequências como apresentadas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52). Além disso, o processo de transformação que origina o DNA transgênico inserido no evento MON 87411 é caracterizado aqui como uma inserção dentro de um único local no genoma do milho, resultando em duas novas sequências de locais ou de junção entre o DNA inserido e o DNA do genoma do milho (sequências de junção adicional), que são de comprimento suficiente para ser únicos apenas para o genoma do milho que compreende o evento MON 87411. Estas sequências de junção são úteis para detectar a presença do DNA do evento MON 87411 em células, tecido, semente e planta de milho ou produtos de planta (commodities). Os pares de sondas e de iniciadores moleculares de DNA são descritos neste documento desenvolvidos para uso na identificação da presença de desses vários segmentos de junção em amostras biológicas contendo ou suspeitando conter células, semente, partes de planta ou tecido de planta de milho que contêm o DNA do evento MON 87411. Os dados mostram que o evento MON 87411 contém uma única inserção de T- DNA com uma cópia de DNA transgênico inserido. Nenhum elemento adicional do vetor de transformação pMON120714 diferente de porções de regiões de borda direita e esquerda de Agrobacterium tumefaciens utilizadas para a transferência de DNA transgênico a partir do plasmídeo de transformação de plantas para o genoma do milho tem sido identificado no evento MON 87411. Finalmente, a amplificação térmica produzindo amplicons específicos de diagnóstico para a presença de tal DNA do evento MON 87411 em uma amostra e análises de sequência de DNA foram realizadas para determinar as junções do genoma inserção-planta arbitrariamente atribuídas 3' e 5', confirma a organização dos elementos dentro da inserção, e determina a sequência completa de DNA do DNA transgene inserido no evento de plantas de milho MON 87411 (SEQ ID NO: 1).
[099] Dezenas de eventos transgênicos foram produzidos utilizando a construção usada para produzir o evento transgênico MON 87411, e diferentes construções foram produzidas e utilizadas para produzir muitas dezenas de outros eventos transgênicos de milho, que foram comparados com o MON 87411 e eventos semelhantes. Todos estes eventos foram testados quanto à eficácia para controlar as larvas da raiz do milho em bioensaios de dieta em que os tecidos do evento da planta de milho transgênico foram fornecidos na dieta de larvas de larva de raiz de milho. Determinou-se que a orientação da expressão das duas cassetes de expressão diferentes responsáveis por conferir os traços de resistência à larva da raiz do milho para os vários eventos foi crítica para a eficácia dos eventos em proporcionar o controle da larva da raiz do milho quando foram fornecidas células de eventos de milho que expressam esses traços de resistência na dieta das larvas da raiz do milho. Dois promotores diferentes, CAMV e35S e Zm.PIIG, foram observados para proporcionar eficácia surpreendente e superior dos eventos de milho que contêm cassetes de expressão que expressam o protetor dsRNA da larva da raiz do milho a partir do promotor e35S e a proteína tóxica Cry3Bb da larva da raiz do milho de um promotor Zm.PIIG que era adjacente ao e divergente do promotor e35S. Quando esses promotores estavam nessa orientação particular as proporções melhoradas significativamente de eventos transgênicos que exibem eficácia foram obtidas.
[0100] A menos que de outro modo indicado aqui, os termos são para ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos especialistas na técnica relevante. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem também ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edição, SpringerVerlag: Nova Iorque, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nova Iorque, 1994. Tal como utilizado aqui, o termo "milho" significa Zea mays e inclui todas as variedades de plantas que podem ser cruzadas com plantas de milho compreendendo MON 87411. Tal como utilizado aqui, o termo "compreendendo" significa "incluindo, mas não limitado a".
[0101] A presente invenção proporciona plantas transgênicas que foram transformadas com uma construção de DNA que contém, pelo menos, três cassetes de expressão; uma primeira cassete de expressão que expressa uma quantidade tóxica da larva da raiz do milho de um dsRNA concebido para suprimir um gene essencial da larva da raiz do milho ortólogo a um gene de levedura snf7, uma segunda cassete de expressão expressa quantidades tóxicas da larva da raiz do milho de delta-endotoxina Cry3Bb, e uma terceira cassete de expressão que expressa uma enzima de tolerância ao glifosato CP4 EPSPS, que é insensível a inibição do glifosato. As plantas de milho transformadas de acordo com os métodos e com a construção de DNA divulgados aqui são resistentes a CRW e tolerante a aplicações de herbicida glifosato. Os traços agronômicos ligados proporcionam facilidade na manutenção desses traços juntos em uma população reprodutora, e apresentam maior eficácia contra a larva de raiz do milho do que as plantas que contêm apenas um único gene de inibição da larva da raiz do milho ou que contêm os mesmos genes de inibição de larva da raiz de milho (Cry3Bb e dsRNA) que são combinados como uma pilha de reprodução.
[0102] Uma "planta" transgênica é produzida pela transformação de uma célula vegetal com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido polinucleico que inclui um transgene de interesse; regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da célula da planta, e a seleção de uma planta em particular caracterizada pela inserção no genoma de um local específico. O termo "evento" refere-se à planta transformante original e progenitura do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também inclui a progênie produzida por um cruzamento entre o evento e a outra planta em que a progênie inclui o DNA heterólogo. Mesmo depois de repetidos cruzamentos a um pai recorrente, o DNA inserido e o DNA genômico flanqueando a partir do evento pai transformado está presente na progênie do cruzamento no mesmo local cromossômico. O termo "evento" também se refere ao DNA a partir do transformante original incluído no DNA inserido, e flanqueando a sequência genômica imediatamente adjacente ao DNA inserido, que seria esperado para ser transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progênie resultante de autopolinização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. A presente invenção está relacionada ao evento transgênico, a planta de milho compreendendo MON 87411, sua progênie, e composições de DNA contidas neles.
[0103] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado ao qual está ligado um marcador convencional detectável ou uma molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente de quimioluminescência ou enzima. Tal sonda é complementar a uma cadeia de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, a uma cadeia de DNA genômico de MON 87411 ou a partir de uma planta MON 87411 ou a partir de uma amostra que inclui o DNA de MON 87411. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não apenas os ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também as poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser utilizados para detectar a presença da referida sequência de DNA alvo.
[0104] Iniciadores de DNA são ácidos polinucleicos isolados que são emparelhados com uma cadeia de DNA alvo complementar por hibridização de ácido nucleico para formar um híbrido entre o iniciador e a cadeia de DNA alvo, depois estendidos ao longo da cadeia de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma polimerase de DNA. Um par de iniciadores de DNA ou um conjunto de iniciadores de DNA da presente invenção referem-se a dois iniciadores de DNA úteis para a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácidos polinucleicos.
[0105] As sondas de DNA e os iniciadores de DNA são geralmente 11 polinucleotídeos ou mais de comprimento, muitas vezes 18 polinucleotídeos ou mais, os polinucleotídeos de 24 ou mais, ou 30 ou mais polinucleotídeos. Tais sondas e iniciadores são selecionados para ter um comprimento suficiente para se hibridizar especificamente a uma sequência alvo, sob condições de hibridação de elevado rigor. De preferência, as sondas e os iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de sequência completa com a sequência alvo, embora as sondas que diferem da sequência alvo que retêm a capacidade para hibridizar com sequências alvo podem ser concebidas por meio de métodos convencionais.
[0106] Os iniciadores e as sondas baseados no DNA genômico de flanqueamento e as sequências inseridas descritas aqui podem ser usadas para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências de DNA descritas, por métodos convencionais, por exemplo, por re- clonagem e sequenciação de tais moléculas de DNA.
[0107] As sondas e os iniciadores de ácido nucleico da presente invenção se hibridizam em condições rigorosas com uma molécula de DNA alvo. Qualquer método de amplificação ou de hibridização de ácido nucleico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA a partir de uma planta transgênica de uma amostra. As moléculas de ácidos polinucleicos, também referidas a segmentos de ácidos nucleicos ou os seus fragmentos, são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico, sob determinadas circunstâncias. Tal como utilizado aqui, duas moléculas de ácidos polinucleicos são referidas como sendo capaz de se hibridizar especificamente uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de cadeia dupla anti-paralela. Uma molécula de ácido nucleico é referida como o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se elas apresentarem complementaridade completa. Tal como utilizado aqui, as moléculas apresentam "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são "minimamente complementares" se puderem se hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma a outra sob pelo menos convencionais condições de "baixa exigência". Do mesmo modo, as moléculas são "complementares" se puderem se hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma com a outra sob condições convencionais de “rigor elevado”. As condições de rigor convencionais são descritas por Sambrook et al, 1989, e por Haymes et al, In:Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Os desvios de complementaridade completa, portanto, são permitidos, desde que esses desvios não excluam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de cadeia dupla. Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou uma sonda, ela só precisa de ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de cadeia dupla estável sob as concentrações de solventes e de sal particulares empregadas.
[0108] Conforme usado aqui, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que se hibrida especificamente com o complemento da sequência de ácido nucleico a qual está sendo comparada, sob condições de elevado rigor. As condições de rigor adequadas que promovem a hibridização do DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C, seguido de uma lavagem de 2,0 x SSC a 50° C, são conhecidas pelos especialistas na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada a partir de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50° C a um elevado rigor de cerca de 0,2 x SSC a 50° C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixo rigor em temperatura ambiente, cerca de 22° C, para condições de elevado rigor a cerca de 65° C. Tanto a temperatura como o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Em uma modalidade preferida, um ácido polinucleico da presente invenção irá se hibridar especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucleico apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 21, 25, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 ou 52, ou os seus complementos ou fragmentos sob condições moderadamente rigorosas, por exemplo, a cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65° C. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção irá se hibridar especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucleico apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 21, 25, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 ou 52 ou complementos ou fragmentos sob condições de elevado rigor. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção, tem a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 7, ou da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 10; ou SEQ ID NO: 12, ou SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 42, ou SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 45, ou SEQ ID NO: 49, ou SEQ ID NO: 50, ou SEQ ID NO: 51, ou SEQ ID NO: 52 ou os seus complementos ou fragmentos de qualquer um. A hibridização da sonda da molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer número de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, estes podem incluir, mas não estão limitados a, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, marcadores com base em anticorpos e marcadores quimioluminescentes.
[0109] No que se refere à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciadores de amplificação particular, "condições rigorosas" são condições que permitem que o par de iniciadores se hibridize somente com a sequência de ácido nucleico alvo para a qual um iniciador tendo a correspondente sequência do tipo selvagem (ou o seu complemento) se ligaria e preferivelmente para produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.
[0110] O termo "específico para (uma sequência alvo)" indica que uma sonda ou um iniciador se hibrida sob condições de hibridização rigorosas apenas para a sequência alvo em uma amostra, compreendendo a sequência alvo.
[0111] Tal como usado aqui, "DNA amplificado" ou "amplicon" refere-se ao produto do método de amplificação de ácido polinucleico dirigido a uma molécula de ácido polinucleico alvo que é parte de um molde de ácido polinucleico. Por exemplo, para determinar se uma planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém o DNA genômico de planta transgênica a partir de uma planta de milho, compreendendo MON 87411 da presente invenção, o DNA que é extraído de uma amostra de tecido de planta de milho pode ser submetido a um método de amplificação de ácido polinucleico utilizando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado de uma sequência de DNA no genoma de uma planta compreendendo MON 87411 adjacente ao local de inserção do DNA heterólogo inserido (DNA transgene), e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA da planta de MON 87411. O amplicon de diagnóstico é de um comprimento e tem uma sequência de DNA que também é diagnóstico para o DNA genômico da planta. O amplicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combinado do par de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeos, de preferência mais cerca de cinquenta pares de bases de nucleotídeos, mais de preferência mais cerca de 250 pares de bases de nucleotídeos, e ainda mais de preferência mais cerca de 450 pares de bases de nucleotídeos ou mais. Em alternativa, um par de iniciadores pode ser derivado a partir de sequência genômica de ambos os lados do DNA heterólogo inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui toda a sequência de polinucleotídeos inserida (por exemplo, um iniciador para a frente isolado da parte genômica da SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso isolado da porção genômico da SEQ ID NO: 1 que amplifica uma molécula de DNA compreendendo a sequência de junção identificada aqui no genoma do evento MON 87411). Um membro de um par de iniciadores derivados da sequência genômica da planta adjacente ao DNA transgênico inserido está localizado a uma distância da sequência de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de bases de nucleotídeos até cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica do DNA.
[0112] A amplificação do ácido polinucleico pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido polinucleico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Os métodos de amplificação conhecidos na técnica são descritos, inter alia, na Patente dos EUA 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, São Diego, 1990. Os métodos de amplificação de PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb (quilobases) de DNA genômico até 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl Acad. Sci. EUA 91: 5695-5699, 1994). Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA, podem ser utilizados na prática da presente invenção. A sequência da inserção do DNA heterólogo ou a sequência do DNA genômico de flanqueamento a partir de evento MON 87411 pode ser verificada (e corrigida, se necessário) através da amplificação de tais moléculas de DNA do evento MON 87411 compreendendo sementes ou plantas cultivadas a partir das sementes depositadas com o n° de acesso ATCC PTA-12669, utilizando iniciadores derivados das sequências fornecidas aqui, seguido por sequenciação de DNA convencional do amplicon por PCR ou fragmentos de DNA clonados destes.
[0113] Os kits de detecção de DNA que se baseiam em métodos de amplificação de DNA contêm as moléculas de iniciadores de DNA que se hibridizam especificamente com um DNA alvo e amplificam um amplicon de diagnóstico de acordo com as condições de reação apropriadas. O kit pode fornecer um método de detecção com base em gel de agarose ou qualquer número de métodos de detecção do amplicon de diagnóstico que são conhecidos na técnica. Um kit que contém os iniciadores de DNA que são homólogos ou complementares a qualquer porção da região genômica do milho como descrito na SEQ ID NO: 1 e com qualquer porção do DNA transgênico inserido como descrito na SEQ ID NO: 1 é um objeto da invenção. Moléculas de DNA úteis como iniciadores de DNA podem ser selecionadas da sequência de DNA transgene/genômico divulgada de MON 87411 (SEQ ID NO: 1) por aqueles especialistas na técnica da amplificação de DNA.
[0114] O amplicon de diagnóstico produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Tal método é Análise de Bit Genética (Nikiforov et al., Nucleic Acid Res. 22: 41674175, 1994) em que um oligonucleotídeo de DNA é concebido que se sobrepõe à sequência de DNA genômico flanqueadora adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em poços de uma placa de microtitulação. Após a PCR da região de interesse (usando um iniciador da sequência inserida e outro na sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto de PCR de cadeia simples pode ser hibridado com o oligonucleotídeo imobilizado e serve como um modelo para uma reação de extensão de uma única base usando uma polimerase de DNA e trifosfatos de didesoxinucleotídeos marcados (ddNTPs) específicos para a base seguinte esperada. A leitura pode ser fluorescente ou à base de ELISA. Um sinal indica a presença da sequência genômica/transgene devido a amplificação bem sucedida, hibridação e extensão de uma única base.
[0115] Outro método é a técnica de pirossequência como descrito por Winge (Innov Pharma Técnico 00:... 18-24, 2000). Neste método um oligonucleotídeo foi concebido, o qual se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e a junção do DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto de PCR de cadeia simples a partir da região de interesse (um iniciador da sequência inserida e outro na sequência genômica flanqueada) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5'fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e os resultados de incorporação de um sinal de luz que é medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência genômica/transgenes devido à amplificação bem sucedida, hibridação, e extensão única ou multi-base.
[0116] A polarização de fluorescência como descrito por Chen, et al., (Genome Res. 9: 492-498, 1999) é um método que pode ser utilizado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando este método um oligonucleotídeo é concebido, o qual sobrepõe o flanqueameto genômico e a junção do DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibridizado para o produto de PCR de cadeia simples a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genômico flanqueada) e incubado na presença de uma polimerase de DNA e um ddNTP marcado com fluorescência. A extensão de base única resulta em incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da sequência genômica/transgene devido a amplificação bem sucedida, hibridação e extensão de uma única base.
[0117] TaqMan® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, uma sonda oligonucleotídeo FRET é projetada para se sobrepor a junção do DNA inserido e genômico flanqueado. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador em uma sequência de DNA inserido e um na sequência genômica flanqueadora) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridação da sonda FRET resulta na clivagem e liberação do grupo fluorescente distante da porção de resfriamento rápido da sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica/transgene devido à amplificação e à hibridação bem sucedida.
[0118] Beacons moleculares têm sido descritos para utilização na detecção de sequência, tal como descrito em Tyangi, et al. (Nature Biotech.14: 303-308, 1996). Resumidamente, uma sonda oligonucleotídeo FRET é projetada para se sobrepor à junção do DNA inserido e genômico flanqueado. A estrutura única da sonda FRET resulta em ela contendo a estrutura secundária que mantém as metades fluorescentes e resfriadas em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador em uma sequência de DNA inserido e um na sequência genômica flanqueadora) são submetidos a ciclos na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação por PCR bem-sucedida, a hibridização da sonda FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e a separação espacial das metades fluorescentes e resfriadas. Resulta em um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção de flanqueamento/transgene devido à amplificação e à hibridação bem- sucedida.
[0119] Os kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos a partir das composições descritas aqui e dos métodos bem conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação do DNA de milho do evento MON 87411 em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para a criação de plantas de milho que contêm o DNA do MON 87411. Um kit contém moléculas de DNA, que são úteis como iniciadores ou sondas e que são homólogos ou complementares, pelo menos, as porções pertinentes da SEQ ID NO: 1, como descrito aqui. As moléculas de DNA podem ser utilizadas em métodos de amplificação de DNA (PCR) ou como sondas em métodos de hibridização de ácidos polinucleicos, ou seja, análise Southern, análise Northern.
[0120] As sequências de junção podem ser representadas por uma sequência a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Por exemplo, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 8. Alternativamente, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9. Alternativamente, as sequências de junção podem ser arbitrariamente representadas pelas sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 10. Estes nucleotídeos estão ligados por ligação fosfodiéster e no evento de milho MON 87411 estão presentes como parte do genoma da célula vegetal recombinante. A identificação de uma ou mais das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52 em uma amostra derivada de uma planta de milho, semente ou parte da planta é determinante para que o DNA fosse obtido a partir de eventos de milho MON 87411 e é um diagnóstico para a presença de uma amostra contendo o DNA a partir de eventos de milho MON 87411. A invenção proporciona assim uma molécula de DNA que contém, pelo menos, uma das sequências de nucleotídeos fornecidas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Qualquer segmento de DNA derivado do evento de milho transgênico MON 87411, que é suficiente para incluir pelo menos uma das sequências fornecidas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52, está dentro do escopo da invenção. Além disso, qualquer polinucleotídeo que compreende uma sequência complementar para qualquer das sequências descritas neste parágrafo está no escopo da invenção.
[0121] A presente invenção fornece moléculas de DNA exemplificativas que podem ser utilizadas quer como iniciadores ou sondas para a detecção da presença de DNA derivado de uma planta de milho, compreendendo o DNA do evento MON 87411 em uma amostra. Tais iniciadores ou sondas são específicos para uma sequência de ácido nucleico alvo e, como tal, são úteis para a identificação da sequência de ácido nucleico do evento de milho MON 87411 pelos métodos da invenção descritos aqui.
[0122] O "iniciador" é tipicamente, um polinucleotídeo isolado altamente purificado, que é projetado para o uso em métodos específicos de recozimento ou de hibridização que envolvem amplificação térmica. Um par de iniciadores pode ser utilizado com o DNA modelo, tal como uma amostra de DNA genômico de milho, em uma amplificação térmica, tal como a reação em cadeia da polimerase (PCR), para produzir um amplicon, em que o amplicon produzido a partir de tal reação terá uma sequência de DNA que corresponde à sequência do DNA modelo localizado entre os dois locais onde os iniciadores se hibridizam ao modelo. Tal como aqui utilizado, um "amplicon" é um pedaço ou um fragmento de DNA que foi sintetizado utilizando técnicas de amplificação. Um amplicon da invenção compreende pelo menos uma das sequências fornecidas como SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 25. Um iniciador é tipicamente desenhado para se hibridizar a um filamento de DNA alvo complementar, para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, e a presença do iniciador é um ponto de reconhecimento por uma polimerase para iniciar a extensão do iniciador (isto é, a polimerização de nucleotídeos adicionais em uma molécula de nucleotídeo alongada), utilizando como modelo o filamento de DNA alvo. Os pares de iniciadores, tal como utilizado na presente invenção, pretendem se referir à utilização de dois iniciadores ligando filamentos opostos de um segmento de nucleotídeo de filamento duplo com a finalidade de amplificar linearmente o segmento de polinucleotídeo entre as posições alvo para a ligação de cada um dos membros individuais do par do iniciador, normalmente em uma reação de amplificação térmica ou outros métodos de amplificação de ácido nucleico convencionais. Um par de iniciadores úteis para esta aplicação deve compreender uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA que é diferente da primeira molécula de DNA, e em que cada um é de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA para funcionar como iniciadores de DNA que, quando utilizado em conjunto em uma reação de amplificação térmica com modelo de DNA derivado de evento de milho MON 87411, para produzir um amplicon de diagnóstico para o DNA do evento de milho MON 87411 em uma amostra. Exemplos de moléculas de DNA úteis como iniciadores são fornecidas como SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, ou SEQ ID NO: 24.
[0123] Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado que é complementar a um filamento de um ácido nucleico alvo. As sondas incluem não apenas os ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos, mas também as poliamidas e outros materiais de sondas que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e a detecção de tal ligação pode ser útil no diagnóstico, discriminando, determinando, detectando, ou confirmando a presença dessa sequência de DNA alvo em uma amostra específica. Uma sonda pode ser ligada a um marcador detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente de quimioluminescência ou enzima. Exemplos de moléculas de DNA úteis como sondas são fornecidas como SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 23.
[0124] As sondas e os iniciadores podem ter uma identidade de sequência completa com a sequência alvo, embora os iniciadores e as sondas que diferem da sequência alvo que retém a capacidade para hibridizar preferencialmente com as sequências alvo podem ser concebidas por meio de métodos convencionais. Para uma molécula de ácido nucleico servir como um iniciador ou uma sonda ela só precisa ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações de solventes e de sal particulares empregadas. Qualquer método convencional de hibridização ou de amplificação de ácido nucleico pode ser usado para identificar a presença de DNA transgênico do evento de milho MON 87411 em uma amostra. As sondas e os iniciadores têm geralmente pelo menos cerca de 11 nucleotídeos, pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, ou pelo menos cerca de 30 nucleotídeos ou mais de comprimento. Tais sondas e iniciadores se hibridizam especificamente com uma sequência de DNA alvo, sob condições de hibridização rigorosas. Condições de rigor convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
[0125] Qualquer número de métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica pode ser usado para isolar e manipular uma molécula de DNA, ou seu fragmento, divulgado na presente invenção, incluindo os métodos de amplificação térmicos. As moléculas de DNA ou os seus fragmentos também podem ser obtidos através de outras técnicas, tais como através da síntese direta do fragmento por meios químicos, como é comumente praticado utilizando um sintetizador de oligonucleotídeos automatizado.
[0126] As moléculas de DNA e as correspondentes sequências de nucleotídeos fornecidas aqui são, portanto, úteis para, entre outras coisas, identificar eventos de milho MON 87411, selecionar variedades de plantas ou híbridos compreendendo o evento de milho MON 87411, detectando a presença do DNA derivado do evento de milho transgênico MON 87411 em uma amostra, e monitorando as amostras para a presença e/ou ausência do evento de milho MON 87411 ou partes de plantas derivadas de plantas de milho que compreendem o evento MON 87411.
[0127] A invenção proporciona plantas de milho, progênies, sementes, células de plantas, partes de plantas (tais como pólen, óvulos, tecido de espiga ou de seda, tecido de borla, tecido da raiz, tecido do caule e tecido da folha), e commodities. Estas plantas, progênies, sementes, células de plantas, partes de plantas e commodities contêm uma quantidade detectável de um polinucleotídeo da invenção, isto é, tal como um polinucleotídeo tendo pelo menos uma das sequências fornecidas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. As plantas, as progênies, as sementes, as células de plantas e as partes de plantas da presente invenção também podem conter um ou mais transgenes adicionais. Tal transgene adicional pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou molécula de RNA que confere um traço desejável incluindo, mas não limitado a, um aumento da resistência aos insetos, aumento da eficiência de utilização de água, aumento da performance de rendimento, aumento da resistência à seca, aumento da qualidade da semente, melhoria da qualidade nutricional e/ou um aumento da tolerância a herbicidas, em que o traço desejável é medido em relação a uma planta de milho sem tal transgene adicional.
[0128] A invenção proporciona plantas de milho, progênies, sementes, células de plantas e parte de planta, tais como pólen, óvulos, tecido de espiga e de seda, tecido de borla, tecido de raiz ou do caule, e folhas derivadas de uma planta de milho transgênico que compreende o evento MON 87411. Uma amostra representante de sementes de milho compreendendo o evento MON 87411 foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC). O depositário ATCC atribuiu a Designação de Depósito de Patente PTA-12669 ao evento MON 87411 compreendendo a semente.
[0129] A invenção fornece um microrganismo que compreende uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 presente no seu genoma. Um exemplo de tal microrganismo é uma célula de planta transgênica. Os microrganismos, tais como uma célula de planta da invenção, são úteis em muitas aplicações industriais, incluindo, mas não se limitando a: (i) utilização como instrumento de pesquisa para a investigação científica ou pesquisa industrial; (ii) utilização em cultura para a produção de carboidratos, lipídeos, ácidos nucleicos ou produtos de proteínas endógenos ou recombinantes, ou moléculas pequenas que podem ser utilizados para posterior investigação científica ou como produtos industriais; e (iii) utilização com técnicas de cultura de tecidos de plantas modernas para a produção de plantas transgênicas ou culturas de tecidos de plantas que podem ser utilizadas para a investigação ou a produção agrícola. A produção e a utilização de microrganismos, tais como células de plantas transgênicas, que utilizam técnicas microbiológicas modernas e intervenção humana para produzir um microrganismo único artificial. Neste processo, o DNA recombinante é inserido no genoma de uma célula de planta para criar uma célula de planta transgênica que é separada e única de células de plantas que ocorrem naturalmente. Esta célula de planta transgênica, em seguida, pode ser cultivada tanto como células de bactérias e de levedura, usando técnicas de microbiologia modernas e podem existir em um estado indiferenciado unicelular. A composição genética nova ou alterada da célula de planta transgênica e o fenótipo é um efeito técnico criado pela integração do DNA heterólogo no genoma da célula. Os microrganismos da invenção, tais como as células de plantas transgênicas, incluem (i) métodos de produção de células transgênicas através da integração do DNA recombinante no genoma da célula e, em seguida, utilizando esta célula para derivar células adicionais que possuam o mesmo DNA heterólogo; (ii) métodos de cultura de células que contêm o DNA recombinante usando técnicas de microbiologia modernas; (iii) métodos de produção e purificação de carboidratos, lipídeos, ácidos nucleicos ou produtos de proteína endógenos ou recombinantes de células cultivadas; e (iv) métodos de utilização de técnicas de cultura de tecidos de plantas modernas com as células de plantas transgênicas para produzir plantas transgênicas ou culturas de tecidos de plantas transgênicas.
[0130] As plantas da invenção podem passar ao longo do DNA do evento, incluindo o transgene, para a progênie. Tal como utilizado aqui, "progênie" inclui qualquer planta, semente, célula de planta e/ou parte de planta regenerável compreendendo o DNA derivado de uma planta ancestral e/ou compreendendo uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. As plantas, progênies e sementes podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para o transgene. A progênie pode ser cultivada a partir de sementes produzidas por um evento de milho MON 87411 contendo a planta e/ou a partir de sementes produzidas por plantas fertilizadas com pólen a partir de um evento de milho MON 87411 contendo a planta.
[0131] As plantas progênies podem ser auto-polinizadas (também conhecido como "selfing") para gerar uma verdadeira linhagem de plantas, ou seja, as plantas homozigóticas para o transgene. A “selfing” da progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes adicionais exógenos.
[0132] Alternativamente, as plantas progênies podem ser cruzadas de forma exogâmica, por exemplo, selecionadas com outra planta não relacionada, para produzir uma semente ou planta variada ou híbrida. A outra planta não relacionada pode ser transgênica ou não transgênica. Uma semente ou planta variada ou híbrida da invenção pode, assim, ser obtida por cruzamento de um primeiro progenitor que não possua o DNA específico e único do evento de milho MON 87411 com um segundo progenitor compreendendo o evento de milho MON 87411, resultando em um híbrido compreendendo o DNA específico e único do evento de milho MON 87411. Cada parente pode ser um híbrido ou um endocruzamento/variedade, enquanto o cruzamento ou a seleção resulta em uma planta ou semente da invenção, ou seja, uma semente tendo pelo menos um alelo contendo o DNA do evento de milho MON 87411 e/ou uma molécula de DNA tendo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Duas plantas transgênicas diferentes podem, assim, ser cruzadas para produzir descendentes híbridos que contêm dois genes exógenos adicionados independentemente segregados. Por exemplo, o evento MON 87411 do milho contendo a resistência à infestação da larva da raiz do milho e a tolerância ao glifosato pode ser cruzado com diversas plantas de milho transgênico para produzir uma planta híbrida ou pura que tem as características de ambos os pais transgênicos. Um exemplo disto seria um cruzamento do evento MON 87411 contendo a resistência à infestação da larva da raiz do milho a tolerância ao glifosato, com uma planta de milho tendo uma ou mais características adicionais, tais como a tolerância a herbicidas e/ou controle de insetos, resultando em uma planta progênie ou semente que é resistentes à infestação de larva da raiz do milho e tolerantes ao glifosato e tem pelo menos um ou mais traços adicionais. O retrocruzamento a uma planta parental e cruzamento exogâmico com uma planta não transgênica também são contemplados, tal como é a propagação vegetativa. As descrições dos outros métodos de cruzamento que são comumente usados para diferentes traços e culturas podem ser encontradas em uma das várias referências, por exemplo, Fehr, em Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
[0133] A invenção fornece uma parte da planta, que é derivada de plantas de milho compreendendo o evento MON 87411. Conforme usado aqui, uma "parte de planta" refere-se a qualquer parte de uma planta que é composta de material derivado de uma planta de milho, compreendendo o evento 87411. As partes de plantas incluem, mas não estão limitadas a, pólen, óvulos, espigas ou seda, borla, tecidos de raiz ou de caule, fibras e folhas. As partes da planta podem ser viáveis, inviáveis, regeneráveis e/ou não regeneráveis.
[0134] A invenção fornece commodities derivadas de plantas de milho compreendendo o evento MON 87411 e que contém uma quantidade detectável de um ácido nucleico específico para o evento MON 87411. Tal como utilizado aqui, uma "commodity" refere-se a qualquer composição ou produto que contém o material derivado de uma planta de milho, de sementes de milho inteiras ou processadas, uma ou mais células de plantas e/ou partes de plantas que contêm o DNA do evento de milho MON 87411. As commodities podem ser vendidas para os consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. As commodities não viáveis incluem, mas não estão limitadas a, sementes de milho não viáveis; sementes de milho processados, partes de sementes de milho, e partes de plantas de milho; sementes de milho e partes de plantas de milho processadas para alimentação e para alimento, óleo, farelo, farinha, flocos, amido, biomassa e combustíveis. Commodities viáveis incluem, mas não estão limitados a, sementes de milho, plantas de milho e células de plantas de milho. As plantas de milho compreendendo o evento MON 87411 podem ser assim utilizadas para a fabricação de qualquer commodity tipicamente adquirida a partir do milho. Qualquer commodity que é derivada de plantas de milho contendo o DNA do evento de milho MON 87411 que contém, pelo menos, uma quantidade detectável de uma ou mais moléculas de DNA específicas e únicas, a presença da qual é determinante do evento de milho MON 87411, e, especificamente, pode conter um quantidade detectável de um polinucleotídeo compreendendo uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Qualquer método padrão para a detecção de moléculas de nucleotídeos pode ser utilizado, incluindo os métodos de detecção descritos aqui. Uma commodity está dentro do escopo da invenção, se houver qualquer quantidade detectável de uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência de diagnóstico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 na commodity.
[0135] As plantas, progênies, sementes, células de plantas, partes de plantas (como o pólen, óvulos, espiga ou seda, borla, tecido da raiz ou do caule e folhas) e commodities da invenção são úteis para, entre outras coisas, crescerem as plantas para fins de produção de sementes e/ou partes de plantas compreendendo o evento de milho MON 87411 para fins agrícolas, produzindo a progênie compreendendo o evento de milho MON 87411 para fins de reprodução e pesquisa de plantas, uso com técnicas microbiológicas para aplicações industriais e de pesquisa e venda aos consumidores.
[0136] A invenção proporciona métodos para controlar ervas daninhas e métodos para a produção de plantas usando herbicida glifosato e evento de milho MON 87411. Um método para o controle de ervas daninhas em um campo é fornecido e consiste no plantio do evento de milho MON 87411 contendo plantas variadas ou híbridas em um campo e aplicando uma dose eficaz de herbicida glifosato no campo com o objetivo de controlar as ervas daninhas no campo sem ferir as plantas contendo MON 87411. Tal aplicação do herbicida glifosato pode ser de pré-surgimento, ou seja, em qualquer momento após o MON 87411 contendo a semente é plantado e antes do MON 87411 contendo plantas surge, ou pós-surgimento, ou seja, em qualquer momento após MON 87411 contendo plantas surgem. Outro método para controlar as ervas daninhas em um campo também é fornecido e consiste na aplicação de uma dose eficaz do herbicida glifosato para controlar as ervas daninhas em um campo e, em seguida, a plantação de plantas de milho compreendendo o evento MON 87411 no campo. Essa aplicação do herbicida glifosato seria de pré-plantio, ou seja, antes do MON 87411 contendo a semente ser plantado, e pode ser feito a qualquer tempo pré-plantio, incluindo, mas não limitado a, cerca de 14 dias pré-plantio a cerca de 1 dia de pré- plantio. A invenção também fornece um método para a produção da semente de milho, essencialmente livre de sementes de ervas daninhas pela plantação de sementes de uma planta de milho tolerante ao glifosato compreendendo o MON 87411 em um campo, aplicando uma dose eficaz de pós-surgimento do herbicida glifosato suficiente para matar as ervas daninhas no campo, e colhendo as sementes do campo. Uma dose eficaz de herbicida glifosato para uso no campo deve consistir de um intervalo de cerca de 10-5 kg/m2 a cerca de 0,00071734474 kg/m2 (0,125 libras a cerca de 6,4 libras por acre) de glifosato durante um período de cultivo. Em uma modalidade, um total de cerca de 0,000168127673 kg/m2 (1,5 libras por acre) de glifosato é aplicado ao longo de um período de cultivo. Múltiplas aplicações de glifosato podem ser utilizadas ao longo de um período de cultivo, por exemplo, duas aplicações (como uma aplicação de pré- plantio e uma aplicação pós-surgimento ou uma aplicação pré- surgimento e uma aplicação pós-surgimento) ou três aplicações (como uma aplicação pré-plantio, uma aplicação pré-surgimento e uma aplicação pós-surgimento).
[0137] São fornecidos métodos para a produção de uma planta de milho tolerante ao herbicida e a insetos compreendendo as sequências de DNA específicas e únicas do evento MON 87411 da presente invenção. As plantas transgênicas utilizadas nestes métodos podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para o transgene. As plantas progênies produzidas por estes métodos podem ser plantas variadas ou híbridas; podem ser cultivadas a partir de sementes produzidas por um evento de milho MON 87411 contendo a planta e/ou a partir de sementes produzidas por plantas fertilizadas com pólen a partir de um evento de milho MON 87411 contendo a planta; e podem ser homozigóticas ou heterozigóticas para o transgene. As plantas progênies podem ser subsequentemente auto-polinizadas para gerar uma verdadeira linhagem de plantas, ou seja, as plantas homozigóticas para o transgene, ou, alternativamente, podem ser exogâmicas, por exemplo, selecionada com outra planta não relacionada, para produzir uma planta ou uma semente variada ou híbrida.
[0138] São fornecidos métodos para a detecção da presença de DNA derivado de uma célula, um tecido, uma semente ou uma planta de milho compreendendo o evento de milho MON 87411 em uma amostra. Um método consiste em (i) extração de uma amostra de DNA a partir de pelo menos uma célula, um tecido, uma semente ou uma planta de milho, (ii) colocando a amostra de DNA em contato com, pelo menos, um iniciador que é capaz de produzir a sequência de DNA específica para o DNA do evento MON 87411 em condições adequadas para a sequenciação de DNA, (iii) realizando uma reação de sequenciação de DNA, e, em seguida, (iv), confirmando que a sequência de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeos específica para o evento MON 87411, ou a construção compreendida nela, tal como uma selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Outro método consiste em (i) extração de uma amostra de DNA a partir de pelo menos uma célula, um tecido, uma semente ou uma planta de milho, (ii) colocar a amostra de DNA em contacto com um par de iniciadores que é capaz de produzir um amplicon a partir de DNA do evento MON 87411, sob condições adequadas para amplificação de DNA, (iii) realizar uma reação de amplificação de DNA, e em seguida (iv) detectar a molécula do amplicon e/ou conformando que a sequência de nucleotídeos do amplicon compreende uma sequência de nucleotídeos específica para o evento MON 87411, tal como um selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25. O amplicon deve ser aquele que é específico para o evento MON 87411, tal como um amplicon que compreende a SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 25. A detecção de uma sequência de nucleotídeos específica para o evento MON 87411 no amplicon é determinante e/ou diagnóstico para a presença do DNA específico do evento de milho MON 87411 na amostra. Um exemplo de um par de iniciadores que é capaz de produzir um amplicon do DNA do evento MON 87411, sob condições adequadas para amplificação do DNA é fornecido na SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20, e SEQ ID NO: 22. Outros pares de iniciadores podem ser facilmente concebidos por um especialista na técnica e produziriam um amplicon contendo a SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 25, em que um par de iniciadores compreende, pelo menos, um iniciador na região genômica flanqueando a inserção e um segundo iniciador na inserção. Outro método para detectar a presença do DNA derivado de uma célula, um tecido, uma semente ou uma planta de milho compreendendo o evento de milho MON 87411 em uma amostra consiste de (i) extração de uma amostra de DNA a partir de pelo menos uma célula, um tecido, uma semente ou uma planta de milho, (ii) colocar a amostra de DNA em contacto com uma sonda específica de DNA para o evento MON 87411, (iii) deixar que uma sonda e a amostra de DNA hibridizar sob condições de hibridização rigorosa e, então, (iv) detectar a hibridação entre a sonda e a amostra do DNA alvo. Um exemplo da sequência de uma sonda de DNA que é específico para o DNA do evento MON 87411 é fornecido como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23. Outras sondas podem ser prontamente concebidas por um especialista na técnica e compreenderiam pelo menos um fragmento de DNA genômico que flanqueia a inserção e pelo menos um fragmento de DNA inserido, tais sequências proporcionadas em, mas não limitadas a, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25. A detecção de hibridização da sonda com a amostra de DNA é diagnóstico para a presença do DNA específico do evento de milho MON 87411 na amostra. A ausência de hibridização é alternativamente diagnóstico da ausência de DNA específico de eventos de milho MON 87411 na amostra.
[0139] Os kits de detecção de DNA fornecidos são úteis para a identificação do DNA do evento de milho MON 87411 em uma amostra e também podem ser aplicados a métodos para a criação de plantas de milho que contêm o DNA do evento adequado. Tais kits contêm os iniciadores de DNA e/ou sondas que compreendem os fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Um exemplo de tal kit compreende, pelo menos, uma molécula de DNA de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 para funcionar como uma sonda de DNA útil para a detecção da presença e/ou da ausência de DNA derivada a partir de plantas de milho transgênico compreendendo o evento MON 87411 em uma amostra. O DNA derivado de plantas de milho transgênico compreendendo o evento MON 87411 compreenderia uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52. Uma molécula de DNA suficiente para ser utilizada como uma sonda de DNA fornecida é útil para a determinação, a detecção ou o diagnóstico da presença e/ou da ausência do DNA do evento de milho MON 87411, em uma amostra é fornecida como SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 23. Outras sondas podem ser prontamente concebidas por um especialista na técnica e devem incluir um número suficiente de ácidos nucleicos contíguos, incluindo pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, pelo menos 30, pelo menos 31, pelo menos 32, pelo menos 33, pelo menos 34, pelo menos 35, pelo menos 36, pelo menos 37, pelo menos 38, pelo menos 39, ou pelo menos 40 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 e ser suficientemente únicas para o DNA do evento de milho MON 87411, a fim de identificar o DNA derivado do evento. Outro tipo de kit compreende um par de iniciadores úteis para a produção de um amplicon útil para a detecção da presença e/ou da ausência de DNA derivado de evento de milho transgênico MON 87411 em uma amostra. Tal kit empregaria um método compreendendo o contato de uma amostra de DNA alvo com um par de iniciadores tal como descrito aqui, em seguida, realizando uma reação de amplificação de ácido nucleico suficiente para produzir um amplicon que compreende uma molécula de DNA possuindo pelo menos uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25, e, em seguida, detectando a presença e/ou a ausência do amplicon. Tal método também pode incluir a sequenciação do amplicon, ou um fragmento do mesmo, que seria determinante, isto é, diagnóstico para a presença do DNA específico do evento de milho MON 87411 na amostra do DNA alvo. Outros pares de iniciadores podem ser prontamente concebidos por um especialista na técnica e devem compreender um número suficiente de ácidos nucleicos contíguos, incluindo pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, ou pelo menos 30 nucleotídeos contíguos de sequências proporcionadas em, mas não se limitadas a, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 e ser suficientemente únicos para o DNA do evento de milho MON 87411, a fim de identificar o DNA derivado do evento.
[0140] Os kits e os métodos de detecção da invenção são úteis para, entre outras coisas, identificar o evento de milho MON 87411, selecionando variedades de plantas ou híbridos compreendendo o evento de milho MON 87411, detectando a presença de DNA derivado de plantas de milho transgênico compreendendo o evento MON 87411 em uma amostra, monitorando as amostras para a presença e/ou a ausência de plantas de milho que compreendem o evento MON 87411 ou partes de plantas derivadas de plantas de milho que compreendem o evento MON 87411.
[0141] A sequência da inserção do DNA heterólogo, sequências de junção, sequências de flanqueamento do evento de milho MON 87411 podem ser verificadas (e corrigidas, se necessário) através da amplificação tais sequências a partir do evento utilizando iniciadores derivados das sequências proporcionadas aqui seguido por sequenciação de DNA convencional do amplicon ou do DNA clonado.
[0142] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar os exemplos de certas preferidas da invenção. Deve ser entendido pelos especialistas na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam as abordagens que os inventores descobriram que funcionam bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo exemplos de modos preferidos para a sua prática. No entanto, os especialistas na técnica devem entender, à luz da presente descrição, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda assim obtenham um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da invenção.
[0143] Um depósito de uma amostra representativa da semente de milho compreendendo o evento MON 87411 foi feito em 14 de março de 2012 de acordo com o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC) com endereço em 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA, CEP 20110, e atribuído o No. de Acesso ATCC PTA-12669. O acesso aos depósitos estará disponível durante a pendência do pedido ao Comissário de Patentes e Marcas Registradas e pessoas determinadas pelo Comissário para ter direito aos mesmos mediante pedido. Após a emissão da patente, todas as restrições sobre a disponibilidade para o público serão irrevogavelmente removidas. O depósito será mantido no depositário durante um período de 30 anos, ou 5 anos após o último pedido, ou para a vida efetiva da patente, o que for maior, e vai ser substituído, conforme necessário, durante esse período.
[0144] Este exemplo descreve a criação e a seleção de uma construção designada 417 e da engenharia e da avaliação de diferentes construções de DNA. A Tabela 1 tabula estas construções de DNA por critérios de teste e resultados.
[0145] As construções de DNA foram modificadas para expressar um protetor incorporado à planta (PIP) baseado no RNA no milho, objetivando a WCR. Variações da cópia do RNA foram testadas para diferentes genes alvo de WCR (Grupo 1), diferentes comprimentos de RNA (Grupo 2), com ou sem carreador de RNA neutro (Grupo 2), diferentes estruturas secundárias (Grupo 4), e diferentes segmentos alvo de Dv_Snf7o (Grupos 2 e 3). Variações sobre múltiplos transgenes também foram testadas, por exemplo, a cópia de RNA + uma proteína ativa do WCR (Grupos 3 e 5), e duas cópias de RNA objetivando dois WCR alvo (Grupos 1 e 4). Variações sobre o número e configuração das cassetes de expressão e os elementos utilizados também foram testadas (todos os grupos). TABELA 1. Quarenta e cinco construções de DNA foram estavelmente transformadas em plantas de milho. Foram avaliadas plantas progênies de múltiplos eventos de transformação por construção de DNA.
[0146] Utilizando as construções de DNA do Grupo 2 como um exemplo, 7 construções de DNA foram modificados para testar o alvo de diferentes comprimentos de Dv_Snf7o (a partir de 27 até 429 nt de comprimento). Cada construção de DNA foi produzida, células de plantas transformadas, plantas obtidas e endogamias avaliadas em bioensaios de eficácia de câmara de crescimento. Os resultados mostraram uma correlação entre o comprimento da repetição invertida de RNA (IR) e atividade de WCR (Tabela 2, colunas (B) e (H)). TABELA 2. Correlação entre o comprimento de IR e a atividade de WCR
[0147] A coluna (B) mostra os comprimentos variáveis do RNA Dv_Snf7o alvo modificado para expressar uma estrutura secundária do RNA de repetição invertida (IR) em plantas de milho. A coluna (C) mostra o número de embriões de milho que foram modificados. A coluna (D) mostra o número de embriões de milho que se desenvolveram em brotos. A coluna (E) mostra o número de plantas de milho regeneradas (designados como geração R0) viáveis no solo. A coluna (F) mostra o número de plantas R0 esperadas para abrigar uma única cópia de DNA inserido no evento de transformação. A coluna (G) mostra o número de plantas R0 que foram esperadas para abrigar um único evento de transformação, e que produziu sementes suficientes para o bioensaio câmara de crescimento de planta múltipla. A coluna (H) mostra os resultados de estudos de câmara de crescimento de plantas destinadas a avaliar a atividade de WCR. "+++++", indica que a média de RDR foi inferior a 0,5 RDR. "++" indica que média de RDR estava entre 0,5 RDR e 2,0 RDR. "-" significa que a média de RDR foi de cerca de 2,0 RDR, que era comparável com os controles negativos em estudos de eficácia de câmara de crescimento.
[0148] f o mesmo 27-mer como na construção de DNA # 474, mas incorporado em um 150-mer IR neutro. Para avaliar a atividade de WCR no crescimento das plantas em câmaras de crescimento, 6 a 8 plantas para cada 10-20 eventos por construção foram cultivadas em vasos de turfa. As plantas foram testadas quanto à presença do DNA inserido e para a expressão do(s) transgene(s) em ambos os tecidos foliares e radiculares. As plantas que confirmaram a expressão do transgene, em seguida, foram transplantadas para vasos maiores infestados com ovos de WCR. As linhagens de milho não transgênicas LH59 e LH244 foram incluídas como controles negativos. As plantas contendo o evento MON 88017 (expressando Cry3Bb) foram incluídas como controles positivos. Danos às raízes das plantas de milho em crescimento foram avaliados após 4 semanas. Classificações de dano à raiz (RDR) foram avaliadas em uma escala de três pontos, com 0 RDR tendo nenhum dano na raiz e 3 RDR tendo o máximo de dano na raiz.
[0149] Os resultados do estudo guiaram o desenho das construções de DNA do Grupo 5 para conter (a) uma cassete de expressão para um 240-mer Dv_Snf7o IR, e (b) uma cassete de expressão para uma proteína Cry3Bb (Figura 2). O 240-mer Dv_Snf7o IR foi selecionado porque (a) as plantas expressando o 240-mer Dv_Snf7o IR idêntico foram repetidamente bem sucedidas na inibição da atividade CRW (Grupos 2-4), (b) os segmentos maiores do que 100 nt de comprimento diminuíram a probabilidade de desenvolvimento de resistência ao WCR, e (c) os segmentos maiores do que 240 nt tornariam mais difícil transferir intacto para o genoma do milho. As construções de DNA foram concebidas para testar diferentes elementos genéticos de regulação em cada cassete de expressão e as diferentes configurações de cada cassete de expressão da construção de DNA. As construções de DNA do Grupo 5 também incluíram as construções com e sem as cassetes de expressão de tolerância ao glifosato; e uma construção de controle do grupo 3 que expressa apenas o 240-mer Dv_Snf7o IR. Cada construção de DNA foi concebida, as células de plantas transformadas, as plantas obtidas e as endogamias avaliadas em bioensaios de eficácia de câmara de crescimento (Tabela 3 (C) através de (H)). Tabela 3. Números da produção da planta a partir da transformação das construções do DNA do Grupo 5 Coluna (A) lista as construções de DNA testadas na fase 5 (ver também a figura 2 para a decomposição dos elementos genéticos). Coluna (B) mostra a combinação do transgene. Coluna (C) mostra o número de embriões de milho que foram modificados. Coluna (D) exibe o número de embriões de milho que se desenvolveram em brotos. Coluna (E) exibe o número de plantas de milho regeneradas (designadas como geração R0) viáveis no solo. Coluna (F) mostra o número de plantas R0 esperadas para abrigar um único evento de transformação. Coluna (G) mostra o número de plantas R0 esperadas para abrigar um único evento de transformação, e que produziram semente suficiente para posterior teste de planta múltipla. Coluna (H) resume o desempenho de plantas infestadas com WCR (ver parágrafo seguinte para mais detalhes).
[0150] Como mostrado na Tabela 3, coluna (H), "+++++" descreve as construções de DNA que, em média, fornece a expressão do gene sustentada mais elevada de plantas transgênicas em todo o seu desenvolvimento, a maioria da inibição a WCR durante o desenvolvimento, e a maioria da inibição a WCR em gerações auto- fertilizadas e com hibridização cruzada. "++++" Descreve as construções de DNA que, em média, fornece inibição a WCR para as plantas transgênicas, mas a expressão do gene mais baixa quando comparada com as plantas "+++++". "+++" descreve as construções de DNA que, em média, fornecem inibição a WCR inferior às plantas transgênicas, quando comparado com as plantas "++++" e "+++++". Portanto, a construção de DNA # 417 foi avançada para análise posterior. Esta construção tem dezesseis elementos genéticos organizados em três cassetes de expressão da Borda esquerda (LB) a Borda direita (RB). A construção é mostrada na Figura 2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 26. Os componentes do vetor são os seguintes:
[0151] [1] LB: Corresponde ao complemento inverso das posições 1 a 442 da SEQ ID NO: 26. Este elemento representa a sequência da Borda Esquerda do octopina de Agrobacterium tumefaciens.
[0152] [2] Ps.RbcS2-E9 3' UTR: Corresponde ao complemento inverso de posições 486 a 1118 de SEQ ID NO: 26. Representa região não traduzida 3' (UTR) da cópia do gene da ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase da subunidade pequena E9 (rbcS-E9) de Pisum sativum (ervilha).
[0153] [3] gene da repetição invertida 240-mer Dv_Snf7o: Corresponde ao complemento inverso das posições 1148 a 1777 da SEQ ID NO: 26. Este gene transcreve o RNA contendo dois segmentos de ribonucleotídeos 240-mer que se alinham de forma idêntica uns com os outros de forma de complemento inversa, separados por um segmento de neutro de 150 ribonucleotídeos, e formando um RNA de repetição invertida (IR). A sequência do segmento de 240 pb se alinha a um gene WCR ortólogo para levedura Snf7.
[0154] [4] Íntron DnaK do milho: Corresponde ao complemento inverso das posições 1814 a 2617 da SEQ ID NO: 26. Este elemento é constituído por 10 nucleotídeos de éxon 1, íntron 1 e 11 nucleotídeos do éxons 2 do gene 70 da proteína de choque térmico a partir de Zea mays (milho). Os 11 nucleotídeos do éxon 2 foram modificados para remover um resíduo de metionina de iniciação.
[0155] [5] líder CaMV 35S: Corresponde ao complemento inverso das posições 2618-2626 da SEQ ID NO: 26. Representa a região 5' não traduzida (UTR) da cópia de RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), com início na posição +1 do início da transcrição do RNAm do gene.
[0156] [6] promotor eCaMV 35S: Corresponde ao complemento inverso das posições 2627-3238 da SEQ ID NO: 26. Representa o promotor de RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) que contém uma duplicação da região -90 a -350.
[0157] [7] promotor do milho PIIG: Corresponde às posições 3265 4213 da SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa o promotor do gene da proteína induzida por impedância física (PIIG) a partir de Zea mays.
[0158] [8] líder de trigo Lhcb1: Corresponde às posições 4220 4280 da SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa a região 5' não traduzida (UTR) do gene b1 do complexo captador de luz (Lhcb1) a partir de Triticum aestivum (trigo).
[0159] [9] Íntron do arroz Act1: Corresponde às posições 4297 4776 da SEQ ID NO: 26. Consiste de uma sequência contígua de 12 nucleotídeos de éxon 1, íntron 1 e 7 nucleótidos de éxon 2 do gene da actina 1 (Act1) de Oryza sativa (arroz).
[0160] [10] Cry3Bb ORF: Corresponde às posições 4786-6747 da SEQ ID NO: 26. Representa a região de codificação de uma proteína Cry3B pesticida de ocorrência não natural modificada para apresentar modificações H231R, S311L, N313T, E317K e Q349R, em comparação com o gene de codificação da proteína Cry3Bb Bt. A sequência de nucleotídeos se alinha com a sequência do gene de Cry3Bb contido no evento MON 88017.
[0161] [11] Hsp17 3' UTR de trigo: Corresponde às posições 6767 6976 da SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa a 3' UTR do gene 17 (HSP17) da proteína de choque térmico de Triticum aestivum (trigo).
[0162] [12] Tuba do arroz (promotor, líder, íntron): Corresponde às posições 7025-9205 da SEQ ID NO: 26. Representa o promotor contígua, líder, íntron e quatro nucleotídeos do éxon 2 do gene alfa tubulina (TubA-3) de Oryza sativa (arroz).
[0163] [13] CTP: Corresponde às posições 9210-9437 da SEQ ID NO: 26. Representa região codificadora modificada que codifica o CTP N-terminal a partir da 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de A. thaliana. Este elemento difere do gene nativo (número de acesso GenBank X06613) no último códon GAG (ácido glutâmico) por modificação à TGC (cisteína).
[0164] [14] CP4 EPSPS: Corresponde às posições 9.438-10.805 da SEQ ID NO: 26. Representa a região codificadora modificada de EPSPS de Agrobacterium CP4. Difere do gene nativo de Agrobacterium no segundo códon pela modificação da codificação da serina à CTT (leucina) e quatro substituições silenciosas.
[0165] [15] TubA 3' UTR do arroz: Corresponde às posições 10.813-11.394 da SEQ ID NO: 26. Representa a região 3' não traduzida (UTR) de um gene da alfa tubulina (TubA-3) de Oryza sativa (arroz).
[0166] [16] RB: Corresponde às posições 11413-11743 da SEQ ID NO: 26. Representa a sequência de borda direita da nopalina de A. tumefaciens.
[0167] Este exemplo descreve a transformação e seleção do evento MON 87411, dentre uma pluralidade de acontecimentos transgênicos.
[0168] Os embriões foram extraídos das sementes do milho da linhagem LH244, e inoculados com a construção recombinante do DNA # 417 que abriga a Agrobacterium. Os embriões co-culturados foram transferidos para meio de seleção e de crescimento para gerar o tecido caloso transgênico com brotos em desenvolvimento. Os brotos em desenvolvimento foram transferidos para o meio de enraizamento para o desenvolvimento em plântulas. As plântulas foram regeneradas em plantas inteiras R0 no solo. As plantas R0 recuperadas desta maneira foram rastreadas para uma única cópia de DNA de construção introduzido. Como mostrado na Tabela 3, os eventos de cópia única putativos foram fornecidos em 71 transformantes R0 únicos. Cada transformante R0 foi colocado sob condições de viveiro para a produção de semente progênie R1. 44 eventos avançaram. Pelo menos oito sementes R1 produzidas por cada uma das 44 plantas R0 foram plantadas no solo e as plantas R1 foram cultivadas para produzir sementes R2. Uma única planta R1 por evento foi selecionada para continuar cada linhagem contendo cada evento separado, e a semente da única planta R1 foi aumentada para testes subsequentes por (a) auto-fertilização (R3,4,...,N), e (b) fertilização cruzada com outras linhagens de milho, por exemplo, a linhagem de milho 93IDI3. As plantas que representam os eventos de transformação da construção do DNA # 890 (linha 11 da Tabela 3) também foram regeneradas para servir como controles comparativos para ensaios de campo subsequentes descritos abaixo e neste exemplo.
[0169] Dos 44 eventos, 25 eventos foram escolhidos para avançar com base em um fenótipo incluindo a expressão Cry3Bb. As plantas R1 representando estes 25 eventos foram ainda avaliadas quanto à inibição de WCR nos métodos de eficácia da câmara de crescimento descritos no Exemplo 1, e para o número de cópias de vários elementos genéticos do DNA inserido. Dezessete eventos dos 25 eventos foram levados adiante, uma vez que quatro eventos exibiram mais do que uma cópia do elemento genético Ps.RbcS2-E9 3' UTR, e as plantas R1 representando quatro outros eventos exibiram classificações de danos de raiz superiores a 0,8 RDR.
[0170] As plantas progênies compreendendo os 17 eventos restantes, ou seja, "A", MON 87411, e "C" a "Q", foram ainda analisadas em paralelo para desempenho molecular e em campo (ver Tabelas 4 e 5). TABELA 4. Análise molecular de 17 eventos transgênicos abrigando o DNA inserido a partir do vetor de transformação do DNA #417
“-” indica que o evento não cumpriu os critérios moleculares da análise molecular correspondente. "+" Indica que o evento cumpriu os critérios moleculares da análise molecular correspondente. "ND" indica que os dados não estavam disponíveis.
[0171] Os eventos foram rastreados para os segmentos da espinha dorsal do DNA do vetor de transformação de Agrobacterium e para o número de cópia único de todas as porções da inserção do DNA pretendida (Tabela 4, colunas (A) e (B)). Sete eventos (MON 87411, A, C, D, E, F e G) foram analisados para a sequência do DNA inserido que é idêntico ao vetor de transformação # 417, com a exceção de variações no local da fenda na borda esquerda e direita da agrobactéria que ocorrem durante a inserção agro-mediada, o evento D falhou esta análise da sequência (Tabela 4, coluna (C)). Estes sete eventos também foram avaliados quanto à expressão da planta sustentada da proteína Cry3Bb e Dv_Snf7o IR ARN ao longo do desenvolvimento da planta e várias gerações, e todos os sete eventos cumpriram os critérios de passagem para a expressão sustentada de plantas (Tabela 4, Coluna (D)). Cada um dos sete eventos foi analisado por características genômicas do sítio de inserção (isto é, do sítio de inserção neutro), tais como o deslocamento de DNA, duplicações e repetitividade, proximidade a um gene endógeno, interrupção de um gene endógeno, e a proximidade a QTLs e traços de biotecnologia, os eventos E, F e G falharam esta análise (Tabela 4, Coluna (F)). As análises de Northern Blot foram realizadas em tecido de planta que contém os eventos MON 87411, A, C, e D para determinar se os tamanhos esperados das duas cópias de RNA que codifica Cry3Bb, ou produzindo o Dv_Snf7o IR RNA, estavam presentes no RNA a partir dos eventos, e todos os eventos avaliados passaram nesse critério (Tabela 4, coluna (G)).
[0172] Estes 17 eventos foram avaliados em ensaios de campo agronômicos, de eficácia de insetos e de eficácia da tolerância ao glifosato, os resultados são resumidos na Tabela 5. Os cabeçalhos das colunas da Tabela 5 descrevem o tipo de ensaio de campo ("Agronômico", "Inseto", ou "glifosato"), os controles para os quais os eventos estavam sendo comparados/contrastados estão listados, e endocruzamento genético usado para gerar o evento híbrido também está na lista. Os ensaios de campo resumidos nas colunas (A) a (C) foram plantados um ano antes dos ensaios de campo resumidos nas colunas (D) a (H), e dois anos antes dos ensaios de campo resumidos na coluna (I). TABELA 5. Resultados para os ensaios de campo agronômicos, de eficácia ao inseto e eficácia ao glifosato de eventos gerados com o vetor de transformação #417
[0173] Os eventos foram comparados com o(s) controle(s) em cada ensaio de campo. Os dados para cada ensaio de campo foram calculados por parcelas replicadas através de vários locais. LH244 é o controle para a linhagem de transformação. O vetor de DNA "# 890" foi usado para produzir eventos que expressam apenas o 240-mer Dv_Snf7o IR. O evento comercial, MON 88017, que proporciona a resistência a coleópteros e tolerância ao glifosato para as plantas de milho foi utilizado como um controle. O "RN endogâmico" especifica a progênie da Na geração. Os eventos híbridos avaliados nos ensaios de campo foram cultivados a partir de sementes colhidas de um cruzamento com um dos pais do evento sob avaliação (MON 87411, ou de A a Q), e um dos pais, como indicado na Tabela 5 (coluna C, G ou H) . Especificamente, na Tabela 5, a coluna R2 endogâmico X 93IDI3 especifica que um R2 endogâmico do evento sob avaliação foi cruzado com a linhagem de milho endogâmico 93IDI3 para fazer a semente híbrida. Do mesmo modo, na Tabela 5, colunas G e H, R4 endogâmico X MON 89034 especifica uma progênie endogâmica R4 do evento sob avaliação foi cruzado com uma planta que contém o evento MON 89034 para produzir a semente híbrida. "NA" indica que os dados para este evento de teste não estavam disponíveis. "=" Representa equivalência de traço em relação aos controles. "-" Representa uma ocorrência do traço em comparação aos controles. "+" Representa um aumento no desempenho em comparação aos controles. "RDR" é classificação de danos na raiz. "Φ" representa que os estudos contemporâneos de estufa mostraram que o evento aplicável exibiu fenotípicos fora do padrão em plantas cultivadas no viveiro. "f representa que os estudos contemporâneos de estufa mostraram que o evento aplicável não forneceu eficácia ao WCR.
[0174] Os ensaios de campo agronômicos foram realizados em vários locais da América do Norte e da América do Sul, os resultados foram calculados em todos os locais, como resumido na Tabela 5, colunas A, B, D e I. Para estes ensaios de campo agronômicos, os grãos de milho foram plantados em blocos completos randomizados (RCB) concebidos em lotes triplicados por evento por localização. Cada lote replicado foi constituído de 100 grãos. A manutenção do ensaio foi projetada para otimizar a produção de grãos e eliminar a pressão natural de WCR. Uma ou mais das seguintes classificações de ensaio de campo agronômico padrão foram coletadas: unidades de grau para 50% de polinização (GDU), escore do produtor (BR), vigor das plântulas (SDV), hospedagem do talo (STLC), hospedagem da raiz (RTLC), altura da espiga de plantas maduras (EHT), altura da planta de plantas maduras (PHT), umidade de grãos (MST), e teste de peso de grãos (TWT), fenotípicos fora do padrão e rendimento de grãos. Ambos os eventos endogâmicos e híbridos foram avaliados e os resultados estão resumidos na Tabela 5, colunas A, B, D, e I. Os controles adequados foram incluídos nos lotes em triplicado por controle por local. As classificações foram calculadas por lote em todos os locais. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias separadas com a diferença menos significativa no nível de 5% de probabilidade (LSD (0,05)).
[0175] Os resultados de ensaios de campo de eficácia aos insetos que incluíam análises para danos de WCR calculados em vários locais da América do Norte estão resumidos na Tabela 5, colunas C e H. Para estes ensaios de campo de eficácia, os grãos de milho foram plantados em um design RCB em lotes triplicados por evento por local; cada lote replicado foi constituído de 25 grãos. Os eventos de teste foram apresentados em plantas híbridas. Controles apropriados foram incluídos nos lotes triplicados por controle por localização. Quando os lotes de milho chegaram a sua fase de crescimento V2, 5 plantas por lote foram infestadas com ovos de WCR a uma taxa de 3.330 ovos por planta. Durante a fase de crescimento V10, as raízes das cinco plantas infestadas por lote foram desenterradas, lavadas e avaliadas para danos de alimentação com base em uma classificação de dano à raiz (RDR) de 0 a 3, com 0 RDR não tendo nenhum dano à raiz e 3 RDR tendo o máximo de dano à raiz. RDRS para eventos de teste e as plantas de controle foram calculados por planta em todos os lotes em todos os locais. Plantas de controle negativo de cada ensaio de campo de eficácia ao inseto exibiram respectivas RDRS médias de 1,7 e 1,5 RDR. Verificações comerciais de cada teste de campo de eficácia ao inseto exibiram respectivos RDRS médios de 0,25 e 0,20 RDR. As plantas contendo eventos de construções de DNA # 890 exibiram uma variedade de RDRS de cerca de 0,35 a 0,50 RDR. Os eventos de construções de DNA # 417 forneceram consistentemente plantas com pontuações médias de RDR menos do que o limiar de dano econômico de 0,25 RDR.
[0176] Os resultados de ensaios de campo de eficácia que avaliam a tolerância vegetativa para tratamentos com herbicida glifosato foram realizados em vários locais da América do Norte e encontram-se resumidos na Tabela 5, colunas F e G. Para estes ensaios de campo de eficácia, o regime de aplicação do glifosato utilizado para o ensaio específico está apresentado na Tabela 6 (correspondente a Tabela 5, coluna F) e na Tabela 7 (correspondente a Tabela 5, coluna G). TABELA 6. Tratamentos de ensaio de campo com herbicida “lbs ae” significa equivalente ácido em libras. “A” significa acre. Tabela 7. Tratamentos de ensaio de campo com herbicida
“lbs ae” significa equivalente ácido em libras. “A” significa acre.
[0177] Cada lote de 100 plantas foi avaliado por dano à colheita 7 a 10 dias após a última aplicação de spray de cada tratamento. As avaliações dos danos à colheita incluíram clorose, malformação e menor altura média das plantas, todos indicam uma menor tolerância ao herbicida glifosato. Cada lote foi também avaliado para PHT, EHT, dias para 50% de polinização (D50P), dias para 50% de surgimento de seda (D50S), TWT, MST e rendimento. Eventos foram fornecidos como plantas endogâmico e plantas híbridas e comparados ao evento MON 88017. Os eventos "A", MON 87411, "D", "E" e "G" foram equivalentes ao evento MON 88017 em relação ao dano à colheita, PHT, EHT, D50P, D50S, TWT, MST e avaliações de rendimento. Com base nestes resultados, juntos com a vantagem significativa de RDR do evento MON87411 em comparação com outros eventos e para o evento comercial MON88017, o evento MON 87411 foi selecionado.
[0178] Este exemplo descreve a caracterização molecular do evento MON 87411. A amostra de tecidos foliares foi coletada a partir de uma planta (R0) MON87411. A sequenciação do DNA genômico correspondendo ao local de inserção transgênica no evento MON 87411 foi obtido e não foram observadas diferenças em relação à sequência no vetor de transformação correspondente ao vetor # 417.
[0179] As sequências de flanqueamento foram mapeadas para as sequências de referência do genoma do milho, incluindo o genoma de referência B73 do milho (Ref B73). O evento MON 87411 foi determinado como sendo fisicamente localizado no cromossomo 9. A sequência de flanqueamento terminando na junção borda esquerda/ inserção do DNA corresponde à posição ZM_B73_CR09:39261797. A sequência de flanqueamento terminando na junção borda direita/ inserção do DNA corresponde à posição ZM_B73_CR09:39261915. As sequências de flanqueamento para o evento MON 87411 foram analisadas para duplicações de genoma, repetições e genes endógenos. Nenhum caso foi detectado.
[0180] A análise da sequência do DNA inserido no evento MON 87411 confirmou que apenas 263 nucleotídeos da borda esquerda de Agrobacterium (arbitrariamente definida como a extremidade 5' da inserção), e apenas 15 nucleotídeos da borda direita de Agrobacterium (arbitrariamente definida como a extremidade 3' da inserção) foram retidos no DNA inserido no local de inserção genômico de evento MON 87411.
[0181] Uma análise comparativa da sequência genômica que flanqueia o DNA inserido do evento MON 87411 e a região genômica correspondente do local de inserção no alelo de tipo selvagem de LH244 foi conduzida. Esta análise determinou que um segmento de 118 pares de base do DNA genômico LH244 foi deslocado pelo DNA inserido do vetor de transformação # 417 no processo de geração de evento MON 87411.
[0182] Este exemplo descreve os métodos que são úteis na identificação da presença de DNA derivado do evento MON 87411 em uma amostra de milho. Um par de iniciadores e uma sonda foram concebidos com a finalidade de identificar a junção única formada entre o DNA genômico e a extremidade 5' arbitrariamente atribuída do DNA inserido do evento MON 87411 (isto é, a junção à esquerda) e englobada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 21. A sequência do oligonucleotídeo iniciador forward SQ27011 (SEQ ID NO: 18) é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 462 a 490 da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, posições 107 a 135 da SEQ ID NO: 7, posições 72 a 100 da SEQ ID NO: 6, posições 12 a 40 da SEQ ID NO: 5 e posições 1 a 29 da SEQ ID NO: 21. A sequência do oligonucleotídeo iniciador reverso SQ9085 (SEQ ID NO: 20) é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 516 a 541 por meio da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, posições 161 a 186 da SEQ ID NO: 7, posições 126 a 151 da SEQ ID NO: 6, posições 66 a 91 da SEQ ID NO: 5, posições 16 a 41 da SEQ ID NO: 4 e posições 55 a 80 da SEQ ID NO: 21. A sequência da sonda oligonucleotídeo PB3552 (SEQ ID NO: 19) é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 502 a 515 da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, posições 147 a 160 da SEQ ID NO: 7, posições 112 a 125 da SEQ ID NO: 6, posições 52 a 65 da SEQ ID NO: 5, posições 2 a 15 de SEQ ID NO: 4, e posições 41 a 54 da SEQ ID NO: 21. Os iniciadores de PCR SQ27011 (SEQ ID NO: 18) e SQ9085 (SEQ ID NO: 20) amplificam um amplicon de 79 nucleotídeos do DNA genômico/ inserção único na junção esquerda do evento MON 87411. Este mesmo par de iniciadores com a sonda PB3552 (SEQ ID NO: 19), que foi marcado por fluorescência (ou seja, um marcador fluorescente 6FAM™), pode ser utilizado em um ensaio endpoint TaqMan® PCR para identificar a presença de DNA derivado do evento MON 87411 em uma amostra.
[0183] Um par de iniciadores e uma sonda foram concebidos com a finalidade de identificar a única junção formada entre o DNA genômico e a extremidade 3’ arbitrariamente atribuída do DNA inserido do evento MON 87411 (isto é, a junção direita) 3 e englobado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 25. A sequência do oligonucleotídeo iniciador forward SQ27066 (SEQ ID NO: 22) é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11710 a 11728 da SEQ ID NO: 1, posições 11210 a 11228 da SEQ ID NO: 4, posições 45 a 63 da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 e posições 1 a 19 da SEQ ID NO: 25. A sequência do oligonucleotídeo iniciador inverso SQ26977 (SEQ ID NO: 24) é idêntica ao complemento inverso da sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11756 a 11784 da SEQ ID NO: 1, posições 91 a 117 da SEQ ID NO: 8, posições 91 a 119 da SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, posições 23 a 51 da SEQ ID NO: 3, e posições 47 a 75 da SEQ ID NO: 25. A sequência da sonda oligonucleotídica PB11300 (SEQ ID NO: 23) é idêntica à sequência de nucleotídeos correspondendo às posições 11731 a 11755 da SEQ ID NO: 1, posições 11231 a 11248 da SEQ ID NO: 4, posições 66 a 90 da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, posições 1 a 22 da SEQ ID NO: 3, e posições 22 a 46 da SEQ ID NO: 25. Os iniciadores de PCR SQ27066 (SEQ ID NO: 22) e SQ26977 (SEQ ID NO: 24) amplificam um amplicon de 75 nucleotídeos do DNA único genômico/ inserido na junção direita do evento MON 87411. Este mesmo par de iniciadores com a sonda PB11300 (SEQ ID NO: 23), que foi marcado por fluorescência (ou seja, um marcador fluorescente 6FAM™), pode ser utilizado em um ensaio de endpoint TaqMan® PCR para identificar a presença do DNA derivado do evento MON 87411 em uma amostra.
[0184] Além de SQ27011, SQ9085, PB3552, SQ27066, SQ26977, e PB11300, deve ser evidente para os especialistas na técnica que outros iniciadores e/ou sondas podem ser concebidos para amplificar e/ou se hibridizar com sequências dentro da SEQ ID NO: 1, que são únicas para, e úteis para, a detecção da presença de DNA derivado do evento MON 87411 em uma amostra.
[0185] Com base na análise molecular e de sequência, os ensaios de PCR para os ensaios de identificação de eventos foram desenvolvidos para o evento MON 87411. Seguindo as práticas de laboratório de biologia molecular padrão, os parâmetros de ensaio de PCR padrão ou ensaio TaqMan® PCR foram otimizados com cada conjunto de pares de iniciadores e sondas (por exemplo, sondas marcadas com um marcador fluorescente tal como 6FAM™) utilizado para detectar a presença de DNA derivado do evento MON87411 em uma amostra (SQ27011, SQ9085 e/ou PB3552, ou SQ27066, SQ26977, e/ou PB11300). Geralmente, os parâmetros que foram otimizados incluíram concentração de iniciador e sonda, quantidade de DNA modelo e parâmetros de ciclos de amplificação de PCR. Um controle para a reação de PCR incluiu iniciadores (SQ20221 (SEQ ID NO: 38) e SQ20222 (SEQ ID NO: 40)) e/ou da sonda (PB10065 (SEQ ID NO: 39)) (sonda marcada com um marcador fluorescente, tal como VIC™), que são específicos para um controle interno, gene de cópia única no genoma do milho. Um perito na técnica saberá como conceber outros iniciadores de PCR específicos para um gene de cópia única no genoma do milho que pode ser utilizado para amplificar um amplicon para ser utilizado como uma sonda de controle interno, ou como um controle interno em um ensaio de PCR (por exemplo, TaqMan®). O DNA foi extraído a partir de tecido de folha para cada um dos seguintes: [1] amostra de folha a ser analisada; [2] controle negativo (DNA de milho não transgênico); [3] controle de água negativo (nenhum modelo); e [4] DNA de controle positivo de MON 87411. A detecção dos amplicons a partir de um ensaio de PCR convencional seria a visualização por eletroforese em gel de DNA, e para um ensaio de TaqMan® PCR por detecção de fluorescência.
[0186] Um ensaio de zigosidade é útil para determinar se uma planta compreendendo um evento é homozigótica para o evento de DNA; que compreende o DNA exógeno no mesmo local em cada cromossomo de um par cromossômico; ou heterozigótica para um evento de DNA, que compreende o DNA exógeno em apenas um cromossomo de um par cromossômico; ou é nulo para o DNA do evento, que é do tipo selvagem. A zigosidade de uma planta de milho contendo o evento MON87411 pode ser determinada por amplificação térmica (PCR) ou por métodos de endpoint TaqMan®. Por exemplo, para a amplificação por PCR, o par de iniciadores SQ27011 (SEQ ID NO: 18) e SQ26977 (SEQ ID NO: 22) se hibridiza dentro do DNA genômico flanqueando a inserção do evento MON87411. Este par de iniciador vai gerar um amplicon que tem 11.323 nucleotídeos de comprimento quando o DNA derivado do evento MON 87411 está presente na amostra. Este mesmo par de iniciador vai gerar um amplicon que tem apenas cerca de 150 nucleotídeos de comprimento, quando o DNA de milho na amostra não é derivado do evento MON 87411. Em eletroforese em gel de DNA, uma única banda de 11323 pb é indicativa de que o DNA na amostra é de um evento MON87411 homozigoto, uma única banda de cerca de 150 pb é indicativa de que o DNA na amostra não é do evento MON 87411, e a presença de ambos a banda de 11323 pb e a banda de cerca de 150 pb é indicativa de que o DNA na amostra é de uma planta de milho heterozigota para o evento MON 87411.
[0187] Um ensaio TaqMan® pode ser desenvolvido para determinar a zigosidade de um evento MON87411 contendo a planta de milho. Para este ensaio, três ou quatro iniciadores e duas sondas, seriam concebidas em que [1] um primeiro par de iniciadores e uma primeira sonda são específicos para a detecção da presença do DNA do evento MON87411 em uma amostra, e [2] um segundo par de iniciadores, diferente do primeiro par de iniciadores, e uma segunda sonda, diferente da primeira sonda, são específicos para detectar a presença de DNA de milho do tipo selvagem (ou seja, amostra não contendo o evento MON87411). Em um TaqMan®, ou ensaio semelhante, um sinal fluorescente só a partir da primeira sonda é indicativo e diagnóstico para uma planta homozigótica para o evento MON87411; um sinal fluorescente tanto da primeira sonda como da segunda sonda é indicativo e diagnóstico para uma planta heterozigótica para o evento MON87411; e um sinal de fluorescência apenas a partir da segunda sonda é indicativo e diagnóstico para uma planta que é homozigótica para o alelo do tipo selvagem (ou seja, é nula para o evento MON87411).
[0188] Este exemplo descreve a proteção superior da planta que compreende o evento MON87411 do dano da larva da raiz do milho quando comparado com os produtos comerciais atuais (MON 88017 e DAS-59122-7) e plantas de controle negativo. Ensaios de campo de eficácia foram realizados comparando 135 plantas cada de evento MON 87411, MON 88017, DAS-59122-7, e os controles negativos. As classificações de dano à raiz (RDR) foram coletadas, e as plantas percentuais com um RDR menor do que o nível de dano econômico (0,25 RDR) são mostradas na Tabela 8.
[0189] A Tabela 8 mostra que apenas cerca de 4% de plantas contendo o evento MON 87411 exibiram RDRS maiores do que o limite econômico de 0,25 RDR. Em contraste, 22% das plantas disponíveis comercialmente contendo MON 88017 exibiram RDRS maiores do que o limiar econômico de 0,25 RDR. E, 20% das plantas disponíveis comercialmente contendo DAS-59122-7 exibiram RDRS maiores do que o limiar econômico de 0,25 RDR. E 96% das plantas de controle negativo exibiram RDRS maiores do que o limiar econômico de 0,25 RDR. A conclusão a partir destes dados é que o evento MON 87411 é claramente superior em proporcionar proteção contra danos da larva da raiz do milho em comparação com os produtos comerciais MON 88071 e DAS-59122-7, e um controle negativo. TABELA 8. Resultados de teste de campo com eficácia a porcentagem aproximada de plantas que exibiam <0,25 RDR.
[0190] O ensaio incluiu 135 plantas para cada evento testado.
[0191] Ensaios de estufa de eficácia foram realizados para testar o desempenho do evento MON 87411 com pressão extrema de infestação de larva da raiz do milho. Neste ensaio os seguintes eventos foram avaliados: o evento MON 87411, um evento de transformação com vetor do DNA # 890 expressando apenas o dsRNA; MON 88017; DAS-59122-7; e controle negativo. Para estes ensaios de eficácia de alta pressão, as plantas de milho em avaliação foram cultivadas em vasos em estufa. Pressão extrema de infestação foi alcançada pela infestação sequencial de cada vaso de plantas com cerca de 2.000 ovos de WCR por vaso em sua fase de crescimento V2, e, em quatro mais tempos ocorrendo em 1 a 1-1/2 semanas de intervalo, com cerca de 1.000 ovos de WCR por vaso por infestação para um total de aproximadamente 6.000 ovos de WCR adicionados a cada pote. As raízes das plantas foram retiradas, lavadas e avaliadas por RDR em sua fase de crescimento VT. As raízes de todas as treze (N = 13) plantas de controle negativo exibiram dano máximo de raiz, ou uma RDR absoluta de 3 RDR. Estes resultados ilustram que o evento MON 87411 é mais superior aos outros eventos de milho disponíveis para controlar a larva da raiz do milho (Tabela 9). TABELA 9. Avaliação de danos à raiz (RDR), sob pressão de infestação alta da larva da raiz do milho. (N = o número de plantas avaliadas).
[0192] Uma medida da eficácia de eventos transgênicos da larva da raiz do milho é pela determinação do surgimento de besouros adultos do solo dos vasos de plantas cultivadas em estufa. Para determinar o surgimento do besouro adulto da raiz do milho do solo de plantas do evento MON 87411 cultivadas em vasos, de 10 a 15 plantas foram germinadas em vasos contendo solo infestado com ovos de WCR, semelhante ao descrito acima. Durante todo o período de crescimento, cada planta de milho foi coberta com saco de rede para conter qualquer besouro adulto emergente.
[0193] As contagens de besouros adultos acima do solo foram feitas em 6, 12, e 18 semanas após o surgimento das plantas, e no final do ensaio, as raízes foram avaliadas para RDR. As plantas contendo o evento MON 87411 foram comparadas com plantas de controle negativo, e outros eventos transgênicos de proteção à larva da raiz do milho. Os resultados foram que um número significativamente menor de besouros foi observado a emergir a partir dos solos em que as plantas do evento MON 87411 foram plantadas em comparação com os outros eventos transgênicos de proteção à larva da raiz milho, ilustrando as propriedades superiores do evento MON 87411 para proteger contra danos da larva da raiz do milho.
[0194] Este exemplo ilustra que a orientação da expressão de dois promotores diferentes em uma célula de milho, cada uma dirigindo a expressão de uma agente tóxico diferente da larva da raiz do milho, pode resultar em razões significativamente melhoradas de eventos transgênicos que exibem eficácia quando fornecidos na dieta de larvas da raiz do milho.
[0195] As células de milho foram transformadas com um dos quatro vetores de transformação diferentes de plantas, pMON120417, pMON120434, pMON120416 ou pMON120419 e eventos transgênicos foram obtidos, regenerados em plantas transgênicas de milho.
[0196] Com referência à Figura 4, todos os vetores de transformação de plantas contêm três cassetes de expressão 1, 2, e 3, delimitados em uma extremidade por uma borda esquerda de Agrobacterium (LB), e na extremidade oposta por uma borda direita de Agrobacterium (RB). Um dsRNA tóxico da larva da raiz do milho é expressado a partir da cassete 1 em todos os quatro vetores a partir de um promotor 35S (e35S) do vírus do mosaico da couve-flor melhorado. Uma proteína da toxina da larva da raiz do milho, Cry3Bb, nos vetores pMON120417, pMON120434 é expressada a partir da cassete 2 de um promotor Zm.PIIG. Uma proteína da toxina da larva da raiz do milho, Cry3Bb, nos vetores pMON120416, pMON120419 é expressada a partir da cassete 2 de um promotor Os.Rcc3. Em todos os quatro vetores, uma proteína, que confere tolerância ao herbicida glifosato, CTP-EPSPS CP4, é expressada a partir da cassete 3 de um promotor Os.TubA3. Em todos os quatro vetores, a cassete 1 e a cassete 3 estão na mesma orientação relativa. Com referência à Figura 4, as setas largas indicam a direção de expressão a partir do promotor em cada uma das respectivas cassetes.
[0197] A orientação relativa da cassete em dois vetores pMON120417 e pMON120434 é invertida, tal como ilustrado pelas setas de bloco (Figura 4), indicando a direção da expressão a partir do promotor. A expressão da proteína da toxina da larva da raiz do milho Cry3Bb em pMON120417 a partir de cassete 2 é divergente da direção de expressão do dsRNA tóxico da larva da raiz do milho expressada a partir da cassete 1. A expressão da proteína toxina da larva da raiz do milho Cry3Bb em pMON120434 a partir da cassete 2 está na mesma orientação que a expressão do dsRNA tóxico da larva da raiz do milho da cassete 1.
[0198] A orientação relativa da cassete em dois pMON120416 e pMON120419 é invertida, tal como ilustrado pelas setas de bloco (Figura 4), indicando a direção da expressão a partir do promotor. A expressão da proteína da toxina da larva da raiz do milho Cry3Bb em pMON120416 a partir da cassete 2 é divergente da direção da expressão do dsRNA tóxico da larva da raiz do milho expressado a partir da cassete 1. A expressão da proteína da toxina da larva da raiz do milho Cry3Bb em pMON120419 a partir de cassete 2 está na mesma orientação que a expressão do dsRNA tóxico da larva da raiz do milho da cassete 1.
[0199] Como pode ser visto a partir da Tabela 10, quando o tecido de plantas de milho transgênico foi fornecido na dieta das espécies de Diabrotica da larva da raiz do milho, as plantas geradas por transformação com a construção pMON120417 ou pMON120416 (expressão divergente dos componentes tóxicos da larva da raiz do milho) foram mais eficaz com relação à atividade pesticida, quando comparadas com plantas geradas por transformação com a construção pMON120434 ou pMON120419 (em tandem ou mesma orientação de expressão) (Tabela 10). A razão de eventos eficazes gerados a partir da transformação utilizando os vetores pMON120417 e pMON120416, em comparação com a razão de eventos eficazes dos vetores pMON120416 e pMON120419, foi significativamente maior, como mostrado pelos dados na Tabela 10. Por exemplo, para os eventos gerados pelo vetor pMON120417 com a expressão dirigida do promotor divergente dos componentes tóxicos da larva da raiz de milho, 11 de 43 eventos, ou quase 25% dos eventos exibiram controle eficaz da larva da raiz do. Em contraste, não houve eventos eficazes obtidos para os eventos gerados a partir do vetor pMON120434 com a expressão dirigida do promotor na orientação tandem dos componentes tóxicos da larva da raiz do milho. Para eventos gerados a partir do vetor pMON120416 com a expressão dirigida do promotor divergente dos componentes tóxicos da larva da raiz do milho, 17 de 27 eventos, ou cerca de 63% dos eventos exibiram controlo eficaz da larva da raiz do milho. Em contraste, há apenas cerca de 18,5% de eventos eficazes obtidos para os eventos gerados a partir do vetor pMON120419 com a expressão dirigida do promotor na orientação tandem dos componentes tóxicos da larva da raiz do milho. Estes dados demonstram o número significativamente melhorado de eventos eficazes, e proporções melhoradas de eventos transgênicos exibindo eficácia, quando as plantas de milho transgênico são geradas a partir de um vetor de transformação de plantas com dois promotores diferentes cada um dirigindo a expressão em direções divergentes de dois agentes tóxicos da larva da raiz do milho diferentes, e as plantas de milho transgênicas são fornecidas na dieta de larvas da raiz do milho. Tabela 10. Resultados que mostram o número de eventos R0 e o número de eventos eficazes obtidos a partir de quatro vetores de transformação de plantas.
[0200] Para produzir plantas de milho ou partes de plantas do mesmo que compreendem propriedades melhoradas agronômicas, inseticidas ou herbicidas, as plantas de milho contendo o evento MON 87411 podem ser cruzadas com plantas de milho contendo potencialmente qualquer outro evento de milho ou uma combinação destes e fenótipos avaliados para determinar as propriedades resultantes das plantas progênies. Como um exemplo não limitativo, MON 87411 pode ser cruzado com plantas de milho, incluindo uma ou mais combinações, dos seguintes: DAS-59122-7; MIR604; MON 89034; MON 87411; MON 87427; TC1507; 5307; DAS-06275-8; Bt176; BT11; e MIR162.
Claims (20)
1. Molécula de DNA recombinante detectável em uma amostra contendo o DNA de milho, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da referida molécula é: (a) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; ou (b) uma sequência de nucleotídeos totalmente complementar reverso a (a), em que a presença de tal molécula de DNA é diagnóstico para o DNA do evento de milho MON 87411 na referida amostra, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
2. Molécula de DNA recombinante detectável em uma amostra contendo o DNA de milho, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da referida molécula é uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou o seu complemento reverso completo, em que a presença de tal molécula de DNA é diagnóstico para o DNA do evento de milho MON 87411 na referida amostra, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA- 12669.
3. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de DNA é derivada do evento de milho MON 87411, uma amostra representativa de sementes compreendendo o evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o No. de Acesso ATCC PTA-12669.
4. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida amostra compreende uma planta de milho, uma célula de planta de milho, uma semente de milho, uma planta de milho progênie, uma parte da planta de milho ou um commodity de milho.
5. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos da referida molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 1.
6. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA recombinante está inserida no DNA de milho.
7. Sonda de DNA, caracterizada pelo fato de que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 23.
8. Par de moléculas de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA diferente da primeira molécula de DNA, em que cada referida primeira e segunda moléculas de DNA compreende um segmento de polinucleotídeo de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 para funcionar como iniciadores de DNA quando utilizados em conjunto em uma reação de amplificação com uma amostra contendo o DNA modelo do evento de milho MON 87411 para produzir um amplicon de diagnóstico para o referido DNA do evento de milho MON 87411 na referida amostra, em que o amplicon compreende a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
9. Par de moléculas de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA diferente da primeira molécula de DNA, em que cada referida primeira e segunda moléculas de DNA compreende um segmento de polinucleotídeo de comprimento suficiente de nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 para funcionar como iniciadores de DNA, quando utilizados em conjunto em uma reação de amplificação com uma amostra contendo o DNA modelo do evento de milho MON 87411 para produzir um amplicon de diagnóstico para o DNA compreendendo a referida construção na referida amostra, em que o referido amplicon compreende a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
10. Método para detectar a presença de um segmento de DNA diagnóstico para o evento de milho MON 87411 em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a referida amostra com a molécula de DNA como definida na reivindicação 7; (b) submeter a referida amostra e a referida molécula de DNA a condições rigorosas de hibridização; e (c) detectar a hibridização da referida molécula de DNA para o referido segmento de DNA de diagnóstico para o evento de milho MON 87411, em que a referida etapa de detecção é diagnóstico para a presença da referida molécula do evento de milho MON87411 na referida amostra, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
11. Método para detectar a presença de um segmento de DNA diagnóstico para o evento de milho MON 87411 em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a referida amostra com o par de moléculas de DNA como definido na reivindicação 8; (b) realizar uma reação de amplificação suficiente para produzir um amplicon de DNA; e (c) detectar a presença do referido amplicon de DNA na referida reação, em que o referido amplicon de DNA compreende a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 25, em que a referida detecção da presença do referido amplicon é diagnóstico para a presença do DNA do evento de milho MON 87411 na referida amostra, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
12. Método para detectar a presença de um segmento de DNA diagnóstico para a construção compreendida dentro do evento de milho MON 87411 em uma amostra, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a referida amostra com o par de moléculas de DNA como definido na reivindicação 9; (b) realizar uma reação de amplificação suficiente para produzir um amplicon do DNA; e (c) detectar a presença do referido amplicon de DNA na referida reação, em que o referido amplicon de DNA compreende a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52, em que a referida detecção da presença do referido amplicon é diagnóstico para a presença da referida construção compreendida dentro do DNA do evento de milho MON 87311 na referida amostra, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
13. Método para a produção de uma planta de milho tolerante ao herbicida glifosato, caracterizado pelo fato de que compreende o evento de milho MON 87411 no genoma da referida planta de milho, em que a referida planta de milho é uma planta de milho endogâmica homozigótica para o evento MON 87411, ou é uma progênie híbrida F1 de pelo menos uma planta de milho pai compreendendo o evento MON87411, em que uma amostra representativa da semente compreendendo o evento de milho MON 87411 foi depositada sob o número de acesso ATCC PTA-12669, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA- 12669.
14. Método para a produção de uma commodity de milho caracterizado pelo fato de que compreende (a) obter a planta de milho ou parte da planta de milho compreendendo uma molécula de polinucleotídeo recombinante compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; e (b) produzir uma commodity de milho a partir da planta de milho recombinante, ou parte da planta de milho do mesmo, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA- 12669.
15. Método para controlar o crescimento de ervas daninhas em um campo, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de plantas de milho compreendendo o evento MON 87411 em um campo, e o tratamento do referido campo com uma quantidade eficaz de glifosato para controlar o crescimento de ervas daninhas, em que uma amostra representativa da semente compreendendo o evento de milho MON 87411 foi depositada sob o número de acesso ATCC PTA- 12669, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida quantidade eficaz de glifosato é de 10-5 kg/m2 a 0,00071734474 kg/m2 (0,125 libras a 6,4 libras por acre).
17. Microrganismo, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade detectável de molécula de DNA recombinante como definida na reivindicação 1 ou 2, em que o microrganismo é uma bactéria.
18. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) o polinucleotídeo recombinante conforme estabelecido na SEQ ID NO: 12; e (b) o polinucleotídeo recombinante conforme estabelecido na SEQ ID NO: 14; e (c) o polinucleotídeo recombinante conforme estabelecido na SEQ ID NO: 16, em que as referidas sequências polinucleotídicas recombinantes estão ligadas entre si por ligação fosfodiéster, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
19. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que é definida como compreendendo a SEQ ID NO: 4.
20. Método para proteção de um campo de plantas de milho, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo em um campo de plantas de milho compreendidas entre 50 a 100 por cento de plantas de milho compreendendo o evento de milho MON 87411, em que uma amostra representativa da semente compreendendo o evento de milho MON 87411 foi depositada sob o número de acesso ATCC PTA-12669, uma amostra representativa de semente compreendendo evento de milho MON 87411 tendo sido depositada sob o N° de Acesso ATCC PTA-12669.
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| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 08/05/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |