ES2903185T3 - Evento de maíz MON 87411 - Google Patents
Evento de maíz MON 87411 Download PDFInfo
- Publication number
- ES2903185T3 ES2903185T3 ES17170125T ES17170125T ES2903185T3 ES 2903185 T3 ES2903185 T3 ES 2903185T3 ES 17170125 T ES17170125 T ES 17170125T ES 17170125 T ES17170125 T ES 17170125T ES 2903185 T3 ES2903185 T3 ES 2903185T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- dna
- mon
- maize
- event
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims abstract description 365
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 302
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims abstract description 110
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims abstract description 110
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 355
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 192
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 192
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 156
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 151
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 224
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 136
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 53
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 45
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 45
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 38
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 38
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 33
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 13
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 131
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 103
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 40
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 38
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 37
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 36
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 28
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 24
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 18
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 18
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 17
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 16
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 16
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 15
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 230000008653 root damage Effects 0.000 description 12
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 11
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 11
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 10
- 241000489975 Diabrotica Species 0.000 description 10
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 9
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 9
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 9
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 9
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 241000381325 Diabrotica virgifera zeae Species 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 8
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 7
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 7
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 4
- 101000987816 Triticum aestivum 16.9 kDa class I heat shock protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241001529600 Diabrotica balteata Species 0.000 description 3
- 241000916731 Diabrotica speciosa Species 0.000 description 3
- 241000489973 Diabrotica undecimpunctata Species 0.000 description 3
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 3
- 241000916730 Diabrotica viridula Species 0.000 description 3
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101150067387 SNF7 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101100114760 Bacillus thuringiensis cry3Bb gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 2
- 101100495892 Dictyostelium discoideum chmp4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 101100332089 Mus musculus Dnmbp gene Proteins 0.000 description 2
- 101100366079 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) vsp-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 102100028968 Tubulin alpha-1A chain Human genes 0.000 description 2
- 101710108834 Tubulin alpha-1A chain Proteins 0.000 description 2
- 101710193110 Tubulin alpha-3 chain Proteins 0.000 description 2
- IBEDDHUHZBDXGB-OEJISELMSA-N Tubulysin A Chemical compound N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N(COC(=O)CC(C)C)[C@H](C[C@@H](OC(C)=O)C=1SC=C(N=1)C(=O)N[C@H](C[C@H](C)C(O)=O)CC=1C=CC(O)=CC=1)C(C)C)C(=O)[C@H]1CCCCN1C IBEDDHUHZBDXGB-OEJISELMSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- -1 at least 15 Chemical class 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108091040857 miR-604 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DLMYFMLKORXJPO-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[(triphenylmethyl)thio]propanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(SCC(N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 DLMYFMLKORXJPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000006770 Endosomal Sorting Complexes Required for Transport Human genes 0.000 description 1
- 108010086672 Endosomal Sorting Complexes Required for Transport Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 101150082398 cry3Bb gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091088140 miR162 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN de maíz, en la que la secuencia de nucleótidos de dicha molécula se: (a) selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 o; (b) es una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a (a), en la que la presencia de tal molécula de ADN es diagnóstica para la construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
Description
DESCRIPCIÓN
Evento de maíz MON 87411
Campo
La memoria descriptiva se refiere al evento de Zea mays transgénico MON 87411. El evento proporciona dos modos de acción para la resistencia a las infestaciones de gusanos de la raíz del maíz y la tolerancia al herbicida glifosato. La memoria descriptiva también se refiere a plantas, partes de plantas, semillas de plantas, células vegetales, productos agrícolas y procedimientos relacionados con el evento m On 87411 y proporciona moléculas de nucleótidos que son únicas para el evento y se crearon en relación con la inserción de ADN transgénico en el genoma de una planta de Zea mays.
Antecedentes de la invención
El maíz (Zea mays) es un cultivo importante en muchas áreas del mundo y los procedimientos de biotecnología se han aplicado a este cultivo para producir maíz con rasgos deseables. La expresión de un transgén de resistencia a insectos o tolerancia a herbicidas en una planta puede conferir los rasgos deseables de resistencia a insectos y / o tolerancia a herbicidas en la planta, pero la expresión de dichos transgenes puede estar influenciada por muchos factores diferentes, incluida la orientación y la composición de los casetes. impulsando la expresión de los genes individuales transferidos al cromosoma de la planta, y la ubicación cromosómica y el resultado genómico de la inserción del transgén. Por ejemplo, puede haber variación en el nivel y el patrón de expresión transgénica entre eventos individuales que de otro modo son idénticos, excepto por el sitio de inserción cromosómica del transgén. También puede haber diferencias fenotípicas o agronómicas indeseables entre algunos eventos. Por lo tanto, a menudo es necesario producir y analizar una gran cantidad de eventos de transformación de plantas individuales para seleccionar un evento que tenga propiedades superiores en relación con el rasgo deseable y las características fenotípicas y agrícolas óptimas necesarias para que sea adecuado para fines comerciales. Dicha selección a menudo requiere una caracterización molecular extensa, así como ensayos en invernadero y de campo con muchos eventos durante varios años, en múltiples ubicaciones y en diversas condiciones para que se pueda recolectar una cantidad significativa de datos agronómicos, fenotípicos y moleculares. Los datos y las observaciones resultantes deben ser analizados por equipos de científicos y agrónomos con el objetivo de seleccionar un evento comercialmente adecuado. Una vez seleccionado, un evento de este tipo puede usarse para introducir el rasgo deseable en otros orígenes genéticos utilizando procedimientos de fitomejoramiento y, por lo tanto, producir diversas variedades de cultivos diferentes que contienen el rasgo deseable y se adaptan adecuadamente a las condiciones de crecimiento locales específicas.
Para producir una planta transgénica que contenga un único evento de transformación, una porción de una construcción de ADN recombinante se transfiere al genoma de una célula de maíz y la célula de maíz se cultiva posteriormente en una planta. Una célula de maíz a la que se transfiere inicialmente el evento se regenera para producir la generación R0. La planta R0 y las plantas descendencia de la planta R0 pueden probarse para detectar cualquier rasgo deseado, pero la efectividad del evento puede verse afectada por factores cis y / o trans relativos al sitio de integración en el evento de transformación. El fenotipo conferido por el evento también puede verse afectado por el tamaño y el diseño de la construcción de ADN, que pueden variar según la combinación de elementos genéticos en un casete de expresión, el número de transgenes, el número de casetes de expresión y la configuración de dichos elementos y tales casetes. La identificación de un evento con rasgos deseables puede complicarse aún más por factores tales como el desarrollo de las plantas, los patrones diurnos, temporales o espaciales de la expresión del transgén; por factores extrínsecos, por ejemplo, las condiciones ambientales de crecimiento de la planta, la disponibilidad de agua, la disponibilidad de nitrógeno, el calor o el estrés. Así, la capacidad de obtener un evento que confiera un conjunto deseable de rasgos fenotípicos no es fácilmente predecible.
Sumario de la invención
Los inventores han identificado un evento de maíz transgénico MON 87411 que presenta propiedades y rendimiento superiores en comparación a las plantas de maíz transgénicas existentes y a nuevos eventos construidos en paralelo. El evento de maíz MON 87411 contiene tres casetes de expresión unidos que confieren colectivamente los rasgos de resistencia al gusano de la raíz del maíz y tolerancia al herbicida glifosato a las células de maíz, los tejidos de maíz, las semillas de maíz y las plantas de maíz que contienen el evento transgénico MON 87411. El evento de maíz MON 87411 proporciona dos modos de acción contra las especies de plagas del gusano de la raíz del maíz (incluyendo Diabrotica spp, especialmente cuando la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR, forma siglada de Western Corn Rootworm), Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte, NCR, forma siglada de Northern Corn Rootworm), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano, MCR, forma siglada de Mexican Corn Rootworm), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño (BZR, forma siglada de Brazilian Corn Rootworm) o complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño (BCR, forma siglada de Brazilian Corn Rootworm complex) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa) o Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, SCR, forma silgada de Southern Corn Rootworm)). Los modos de acción dobles proporcionan redundancia y reducen significativamente la probabilidad de desarrollo de resistencia a los rasgos de control de plagas.
El evento MON 87411 se caracteriza por segmentos de ADN únicos y específicos que son útiles para detectar la presencia del evento en una muestra. Una muestra pretende hacer referencia a una composición que es ADN de maíz sustancialmente puro o a una composición que contiene ADN de maíz. En cualquiera de los dos casos, la muestra es una muestra biológica, es decir, contiene materiales biológicos, incluidos, pero sin limitación, ADN obtenido o derivado, directa o indirectamente, del genoma del evento de maíz MON 87411. "Directamente" se refiere a la capacidad del experto en la materia de obtener directamente el ADN del genoma del maíz fracturando células de maíz (u obteniendo muestras de maíz que contengan células de maíz fracturadas) y exponiendo el ADN genómico con fines de detección. "Indirectamente" se refiere a la capacidad del experto en la materia de obtener el ADN diana o de referencia específico, es decir, un segmento de unión nuevo y exclusivo descrito en el presente documento como diagnóstico de la presencia del evento MON 87411 en una muestra particular, por medios distintos a la fractura directa de células de maíz o a la obtención de una muestra de maíz que contenga células de maíz fracturadas. Dichos medios indirectos incluyen, pero sin limitación, la amplificación de un segmento de ADN que contenga la secuencia de ADN que es el objetivo de una sonda particular diseñada para unirse con especificidad a la secuencia diana, o la amplificación de un segmento de ADN que pueda medirse y caracterizarse, es decir, medirse mediante la separación de otros segmentos de ADN a través de alguna matriz eficaz, tal como un gel de agarosa o acrilamida o similar, o caracterizarse por análisis de secuencia directo del amplicón o la clonación del amplicón en un vector y la secuenciación directa del amplicón insertado presente en tal vector. Alternativamente, un segmento de ADN correspondiente a la posición dentro del cromosoma de maíz en la que se insertó el ADN transgénico en el cromosoma de maíz y que puede utilizarse para definir el evento MON 87411 puede clonarse por diversos medios y luego identificarse y caracterizarse por su presencia en una muestra o en un genoma de maíz particular. Dichos segmentos de ADN se denominan segmentos o secuencias de unión, y pueden ser de cualquier longitud de ADN insertado y de ADN de cromosoma de maíz adyacente (flanqueante) siempre que el punto de unión entre el ADN insertado y el genoma del maíz esté incluido en el segmento de la SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 21 y la complementaria inversa de cada uno de ellos sea representativo de tales segmentos.
Las secuencias específicas identificadas en el presente documento pueden estar presentes exclusivamente en el evento MON 87411, o la construcción comprendida en él, y la identificación de estas secuencias, ya sea mediante el análisis directo de secuencias, la detección de sondas unidas a tales secuencias o mediante la observación del tamaño y quizás la composición de amplicones particulares descritos en el presente documento, cuando están presentes en un germoplasma o genoma de maíz particular y/o en una muestra biológica particular que contenga ADN de maíz, es diagnóstica de la presencia del evento MON 87411, o de la construcción comprendida en él, en tal muestra. Se sabe que los segmentos genómicos flanqueantes (es decir, los segmentos de genoma del maíz de la secuencia de ADN adyacente al ADN transgénico insertado) están sujetos a una ligera variabilidad y, como tal, la limitación de al menos el 99 % o más de identidad es con referencia a tales anomalías o polimorfismos de genoma de maíz a genoma de maíz. Los segmentos nucleotídicos que son completamente complementarios en toda su longitud en comparación con las secuencias de diagnóstico particulares a las que se hace referencia en el presente documento están destinados a estar dentro del ámbito de la presente invención.
La posición de los segmentos nucleotídicos de la presente invención entre sí y dentro del genoma del maíz se ilustra en la Figura 3 y la secuencia de nucleótidos de cada uno se ilustra como se expone en la SEQ ID NO: 1.
El uso de la palabra "derivada" se refiere a que una molécula de ADN particular está en el genoma de la planta de maíz, o que es capaz de ser detectada en el ADN de la planta de maíz. "Capaz de ser detectado" se refiere a la capacidad de un segmento de ADN particular de ser amplificado y su tamaño y o secuencia caracterizados o dilucidados por el análisis de secuencias de ADN, y también puede referirse a la capacidad de una sonda de unirse específicamente al segmento de ADN particular, es decir, al segmento de ADN diana, y a la posterior capacidad de detectar la unión de la sonda a la diana. El segmento de ADN particular o segmento de ADN diana de la presente invención está presente en el maíz que contiene el evento de inserción MON 87411.
El ADN del evento de maíz MON 87411 está presente normalmente en cada célula y en cada cromosoma de la planta de maíz, la semilla de maíz y los tejidos de maíz que contienen el evento. Como el genoma de maíz se transmite a la descendencia de forma mendeliana, si una planta de maíz fuera homocigótica, cada planta y célula de maíz de la descendencia contendría el ADN del evento en cada uno de los cromosomas parentales generados en la descendencia a partir del progenitor (o progenitores). Sin embargo, si el genoma de maíz que contiene el ADN del evento MON 87411 es un progenitor heterocigótico o híbrido, entonces sólo el cincuenta por ciento del polen y el cincuenta por ciento de los óvulos implicados en el apareamiento a partir de progenitores híbridos contendrán el ADN del evento de maíz MON 87411, dando como resultado una población mixta de la descendencia que contiene el ADN del evento MON 87411, y el porcentaje de tal descendencia que surge de tales cruces con híbridos que tenga el ADN del evento MON 87411 transmitido a tal descendencia puede variar de aproximadamente el cincuenta a aproximadamente el setenta y cinco por ciento.
Las plantas de maíz, las células de las plantas de maíz, los tejidos de las plantas de maíz y las semillas de maíz son insensibles a las aplicaciones de herbicida de glifosato debido a la expresión de una enzima CP4 EPSPS insensible al glifosato a partir de un promotor Rcc3 de arroz en un casete de expresión en el extremo distal 3' como se expone en la SEQ ID NO: 1. Dicha semilla puede sembrarse en un campo. Varios días después de la germinación y la aparición de los brotes, puede aplicarse una cantidad eficaz para controlar las malas hierbas de herbicida de glifosato, lo que eliminará sustancialmente todas las malas hierbas del campo, pero permitirá el crecimiento y el desarrollo continuos
de las plantas de maíz que contienen el ADN del evento MON 87411. Las plantas también son resistentes a la infestación por gusanos de la raíz del maíz de todas las especies conocidas de gusanos de la raíz Diabrotica, incluyendo pero sin limitación, Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR), Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte, NCR), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano, MCR), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño (BZR) o complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño (BCR) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa), y Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, SCR). La resistencia a las especies de Diabrotica surge en relación con la expresión de dos segmentos de ADN diferentes que están unidos operativa y covalentemente dentro del ADN transgénico insertado: un ARNbc se transcribe a partir del casete de expresión en el extremo 5' proximal del ADN transgénico insertado como se expone en la SEQ ID NO: 1 y como se ilustra en la Figura 1 por la posición de [G] la SEQ ID NO: 12, y se dirige a la supresión de un gen esencial en los gusanos de la raíz del maíz; y una proteína Cry3Bb tóxica para coleópteros se expresa a partir de un casete de expresión (aproximadamente centrado en la SEQ ID NO: 1 como se muestra en la Figura 1 por la posición de [H] la SEQ ID NO: 14) centrado entre el casete que expresa el ARNbc [G] y el casete en el extremo 3' distal del ADN transgénico insertado, como se expones en la SEQ ID NO: 1 (un casete de expresión de tolerancia a glifosato ilustrado en la Figura 1 por [I] la SEQ ID NO: 16). El ARNbc se dirige a la supresión de un gen ortólogo de levadura denominado snf7 y se expresa a partir del un promotor e35S de CAMV, mientras que la proteína Cry3Bb se expresa a partir de un promotor PIIG de Zea mays. El ARNbc y la proteína Cry3Bb son agentes tóxicos para las especies de gusanos de la raíz del maíz.
Los promotores que impulsan la expresión de los agentes tóxicos ARNbc y Cry3Bb están colocados de forma divergente, de modo que la expresión a partir de cada promotor del agente tóxico respectivo se aleja de un punto centrado entre los dos promotores, es decir, la transcripción de cada casete de expresión procede en direcciones opuestas y no converge. El casete de expresión de CP4 EPSPS de tolerancia al glifosato se encuentra corriente abajo, es decir, proximal al extremo 3' como se expone en la SEQ ID NO: 1 y 3' distal con respecto al casete que impulsa la expresión de la proteína Cry3Bb. Los casetes que impulsan la expresión de Cry3Bb y EPSPS producen sus respectivas proteínas utilizando una orientación de transcripción en tándem, Cry3Bb corriente arriba de la EPSPS y se transcriben en la misma orientación, pero cada uno a partir de sus respectivos promotores por separado. Dejando el casete de expresión de ARNbc y el casete de tolerancia al glifosato intactos y colocados en los extremos distales del segmento de ADN destinado a la inserción en el genoma de maíz, se produjeron otras construcciones variantes en que la orientación del casete de Cry3Bb estaba invertida u opuesta con respecto al diseño presente en el ADN del evento MON 87411. Estas construcciones variantes utilizaron el promotor PIIG de Zea mays o un promotor Rcc3 de arroz para impulsar la expresión de Cry3Bb.
Los eventos transgénicos que contenían sólo estas construcciones/orientaciones variantes del casete de expresión de Cry3Bb se compararon con el evento MON 87411 y con los eventos comerciales actualmente disponibles MON863 (que contiene sólo un casete de expresión de Cry3Bb), MON88017 (que contiene un casete de expresión de Cry3Bb unido operativamente con un casete de expresión de CP4 EPSPS) y DAS-59122-7 (que contiene tres casetes de expresión unidos operativamente, dos que expresan en tándem los componentes dobles de la toxina Bt Cry34 y Cry35 junto con un gen que confiere tolerancia al glufosinato). Los resultados, como se ilustra a continuación en los ejemplos, muestran que el evento MON 87411 presentó propiedades superiores para la expresión dirigida en la raíz de la proteína Cry3Bb y la pluralidad de eventos transgénicos producidos utilizando la construcción utilizada para generar el evento MON 87411 fueron cada uno más propensos que otros eventos producidos con otras construcciones a presentar un control eficaz de los gusanos de la raíz del maíz.
Las plantas de maíz descritas en el presente documento y las partes de las mismas, incluidas las semillas, contienen cada una el ADN correspondiente al evento MON 87411.
Dichas plantas son resistentes a la infestación del gusano de la raíz del maíz y son insensibles a las aplicaciones del herbicida glifosato. Dichas plantas incluyen híbridos que contienen sólo un alelo de MON 87411, es decir, un genoma caracterizado como heterocigótico con referencia al locus correspondiente al ADN del evento MON 87411. Dichos híbridos se producen mediante reproducción con germoplasma deseable para garantizar el vigor híbrido y otras propiedades agrícolas deseables del maíz. Los híbridos pueden producirse por varios procedimientos, pero un procedimiento preferido es el que aprovecha un primer progenitor endogámico (homocigótico) que contiene el alelo específico del evento MON 87411 en ambos cromosomas en el locus en que se inserta el ADN del evento MON 87411, y reproduciendo el primer endogámico junto con un segundo endogámico que no contiene el ADN MON 87411. Ambas variedades endogámicas parentales tendrán una o más propiedades ventajosas deseables en la semilla de descendencia, es decir, la semilla híbrida.
Es particularmente deseable una propiedad o alelo transgénico que confiera algún rasgo adicional a una planta que contenga el ADN del evento m On 87411. Dichos alelos transgénicos incluyen otros eventos transgénicos que confieren resistencia al gusano de la raíz del maíz, incluidos, pero sin limitación, eventos tales como DAS-59122-7; MIR604 y 5307. Cada uno de estos eventos proporciona un agente tóxico complementario para el gusano de la raíz del maíz (DAS-59122-7 proporciona PS149B1 (Cry34/Cry35) que presenta propiedades tóxicas para el gusano de la raíz y tolerancia al herbicida glufosinato; MIR604 proporciona una Cry3Aa modificada que presenta propiedades tóxicas para el gusano de la raíz; el evento 5307 proporciona el gen de FR8a que presenta propiedades tóxicas para el gusano de la raíz). La provisión de rasgos adicionales de resistencia al gusano de la raíz del maíz, tales como estos, puede disminuir la probabilidad de desarrollo de resistencia a uno cualquiera de los agentes tóxicos del gusano de la
raíz del maíz proporcionados. Otros rasgos deseables incluyen rasgos de rendimiento y de resistencia o tolerancia al estrés, rasgos de fijación de nitrógeno, rasgos que modulan el uso del agua, resistencia a la infestación fúngica, resistencia a herbicidas tales como dicamba (MON 87427), glufosinato y similares, así como la resistencia a las infestaciones de lepidópteros. Los rasgos de resistencia a la infestación por lepidópteros se han proporcionado en la técnica e incluyen los eventos de maíz transgénico (y las respectivas proteínas activas para lepidópteros) MON810 (Cry1Ab), Mo N 89034 (Cry1A.105 y Cry2Ab); TC1507 (Cry1Ac y Cry1Fa); DAS-06275-8 también conocido como Tc -6275 (Cry1Fa y bar (que proporciona tolerancia al glufosinato)); MIR162 (Vip3Aa), BT176 (Cry1Ab) y BT11 (Cry1Ab). Una alternativa para proporcionar cualquier combinación o todos estos rasgos en una única planta, en particular los rasgos de resistencia a insectos correspondientes al evento MON 87411, los otros rasgos de resistencia al gusano de la raíz del maíz enumerados o los rasgos de resistencia a los lepidópteros, sería proporcionarlos en diversas combinaciones de mezclas de semillas, en que determinadas semillas de la mezcla contienen los rasgos de MON 87411 y alguna combinación de solo los rasgos de resistencia a los coleópteros enumerados y que actúen conjuntamente bajo el suelo para prevenir las infestaciones de gusanos de la raíz del maíz, mientras que otras semillas de la mezcla contienen únicamente los rasgos de resistencia a los lepidópteros y confieren resistencia a las infestaciones de lepidópteros del maíz por encima del suelo. De este modo, las semillas de la mezcla se refugian unas a otras, es decir, las semillas y plantas protegidas contra los coleópteros actúan como refugio para las plantas que confieren resistencia a los lepidópteros, y viceversa. Sin embargo, normalmente estos rasgos se proporcionarían en alguna combinación o paquete de rasgos en que los rasgos de MON 87411 se proporcionarían juntos en una única planta mediante reproducción con uno o más de los rasgos de resistencia a los lepidópteros para proporcionar un paquete completo de resistencia a plagas al cultivo en el campo, y un pequeño porcentaje de la semilla (quizás entre el 1 y el 20 por ciento o cualquier número intermedio, incluyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19 por ciento) tendría sólo rasgos para la tolerancia a herbicida y carecería de cualquier rasgo de protección contra plagas y se plantaría en el campo en una mezcla aleatoria con la semilla con rasgos de resistencia a plagas o como una plantación estructurada (separada) de cultivos que actuaría como refugio tanto para las plagas que atacan a las plantas de maíz por encima del suelo como para las plagas que atacan a las plantas de maíz por debajo del suelo.
La construcción insertada en el evento MON 87411 proporciona ventajas particulares con respecto al casete de expresión de EPSPS. En primer lugar, la presencia de este casete facilita la selección de los eventos transgénicos en los que se ha insertado la construcción. En segundo lugar, el casete proporciona control de las malas hierbas en un campo en que se han plantado semillas correspondientes al evento MON 87411. El campo que contiene tales plantas de MON 87411 puede rociarse con una cantidad eficaz de glifosato para controlar el crecimiento de malas hierbas en el campo que son susceptibles al glifosato. Para las malas hierbas que no son susceptibles al glifosato. Como se ha señalado anteriormente, otros eventos transgénicos que proporcionan tolerancia a otros herbicidas, tales como a dicamba o a glufosinato, pueden criarse en un único híbrido junto con el evento MON 87411, proporcionando así un medio eficaz para controlar las malas hierbas en un campo mediante la aplicación de dos o más de los herbicidas glifosato, dicamba o glufosinato, ya que la probabilidad de que estén presente malas hierbas que presenten tolerancia a dos o más de estos herbicidas sería improbable y, en tal caso, el cultivo de maíz consistiría en híbridos que presenten resistencia a tales aplicaciones de combinaciones de herbicidas.
La invención proporciona una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN, en la que la secuencia de nucleótidos de dicha molécula se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO/. 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 o una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a (a), en la que la presencia de dicha molécula de ADN es diagnóstica para la construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ADN que comprende un segmento polinucleotídico de longitud suficiente para funcionar como una sonda de ADN que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la construcción comprendida dentro del evento de maíz m On 87411 en una muestra, en la que dicha sonda hibrida específicamente en dichas condiciones con uno o más segmentos de unión de diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 como se expone en la SEQ ID NO: 26, y en la que la detección de la hibridación de dicha sonda de ADN en dichas condiciones de hibridación es diagnóstica para la construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
La invención también proporciona un par de moléculas de ADN que comprenden una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, en el que dichas primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una un segmento de polinucleótido de longitud suficiente de los nucleótidos contiguos de la SEQ ID n O: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una muestra que contiene la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 como ADN de molde para producir un amplicón diagnóstico para el ADN que comprende dicha construcción en dicha muestra, en el que dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52.
En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de detección dela presencia de un segmento de ADN diagnóstico de la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 en una muestra, comprendiendo
el procedimiento poner en contacto dicha muestra con la molécula de ADN de sonda como se ha descrito en el presente documento, someter dicha muestra y dicha molécula de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y detectar la hibridación de dicha molécula de ADN con dicho segmento de ADN diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411, en la que dicha etapa de detección es diagnóstica para la presencia de dicha construcción comprendida dentro de la molécula del evento de maíz MON87411 en dicha muestra
La invención también proporciona un procedimiento de detección de la presencia de un segmento de ADN diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 en una muestra, comprendiendo el procedimiento poner en contacto dicha muestra con las moléculas de ADN como se describe en el presente documento, realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN; y detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción, en el que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, Se Q ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, en el que dicha detección de la presencia de dicho amplicón es diagnóstica para la presencia de dicha construcción comprendida dentro del ADN del evento MON 87411 de maíz en dicha muestra.
La invención también proporciona una planta de maíz o parte de planta de maíz de la misma que comprende la molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.
La invención proporciona además una planta de maíz o parte de planta de maíz de la misma que comprende ADN funcional como molde cuando se analiza en un procedimiento de amplificación de ADN, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho ADN se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 o una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a las mismas, en el que la realización de dicho procedimiento de amplificación de ADN utilizando dicho molde produce un amplicón diagnóstico para la presencia de la construcción comprendida en el evento MON 87411, en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de maíz MON87411 se ha depositado con el N.° de referencia de la ATCC PTA-12669.
La invención proporciona además un procedimiento para la protección del rendimiento de plantas de maíz que comprende cultivar las plantas de maíz descritas en el presente documento en un campo, y tratar dicho campo que comprende dichas plantas de maíz con una cantidad eficaz de glifosato para controlar el crecimiento de las malas hierbas.
Es también un objeto de la invención proporcionar un microorganismo que comprenda una cantidad detectable de la molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática del inserto transgénico en el genoma del evento de maíz MON 87411: [A] representa la SEQ ID NO: 1, que es la secuencia contigua del inserto de ADN transgénico integrado en el genoma del maíz LH244 y 5' y 3' del ADN genómico que flanquea el ADN insertado; [B] y [C] corresponden a las posiciones relativas de las s Eq ID NO: 2 y 3, que forman las secuencias de unión del transgén/ADN genómico en 5' y 3' del evento MON 87411, respectivamente; [D] representa la SEQ ID NO: 4, que es la secuencia del inserto de a Dn transgénico integrado en el genoma que resulta en el evento MON 87411; [E] corresponde a las posiciones relativas de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, abarcando cada una la unión 5' entre los extremos terminales del ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante; [F] corresponde a las posiciones relativas de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, abarcando cada una la unión 3' entre los extremos terminales del ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante; [G], [H] e [I] representan, respectivamente, los tres casetes de expresión diferentes correspondientes a la construcción de ADN transgénico insertada en el genoma de la planta de maíz que da como resultado el evento MON 87411; [J] y [K] representan cebadores oligonucleotídicos, sondas de oligonucleótidos y amplicones de ADN correspondientes a las uniones del evento MON 87411.
La Figura 2 ilustra once construcciones de ADN diferentes, (417, 416, 418, 419, 402, 403, 404, 423, 405, 406 y 890) diseñadas para expresar hasta tres casetes distintos, incluyendo dos casetes protectores incorporados en la planta (PIP), dirigidos al gusano de la raíz del maíz occidental (WCR) y un solo casete de tolerancia a herbicidas. Los dos casetes PIP incluyen (a) un casete de expresión para una repetición invertida Dv_Snf7o 240 unidades, y (b) un casete de expresión para una proteína Cry3Bb. Cada una de las construcciones representadas comprende estos casetes de expresión en orden y orientación variables. Las construcciones 405 y 406 no contienen casete de tolerancia a herbicidas y la construcción 890 comprende solo un casete de expresión único para una repetición invertida Dv_Snf7o 240 unidades. Las tres construcciones comprenden un total de dieciséis elementos genéticos desde el borde izquierdo (LB) hasta el borde derecho (RB): [1] LB; [2] Ps.RbcS2-E9 3' UTR; [3] Dv_Snf7o de 240 unidades, gen de repetición invertida:; [4] Intrón DnaK de maíz; [5] líder 35S de CaMV; [6] promotor 35S de eCaMV;
[7] promotor PIIG de maíz; [8] Líder Lhcb1 de trigo; [9] Intrón Act1 de arroz; [10] ORF de cry3Bb; [11] 3' UTR Hsp17 de trigo; [12] TubA de ratón (promotor, líder, intrón); [13] CTP; [14] CP4 EPSPS; [15] 3' UTR TubA de arroz; y [16] RB.
La figura 3 [A] -[N] y [aa] -[mm] ilustran los elementos operablemente unidos y el genoma de maíz que flanquea
y su posición entre sí, ya que se presentan dentro de la posición de inserción de ADN transgénico en el genoma del evento de maíz MON 87411. Las siguientes descripciones identifican la composición, la función y la posición para cada uno de los elementos como se expone en SEQ ID NO: 1.
[A] La posición de nucleótido 1-500 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde al ADN del genoma de maíz adyacente al ADN transgénico insertado en el evento de maíz MON 87411, que en este caso se asigna arbitrariamente como el extremo 5' del ADN insertado transgénico.
[B] La posición de nucleótido 807-1439 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia complementaria inversa de una subunidad pequeña E9 ribulosa bis fosfato carboxilasa en 3' de la terminación de la transcripción de Pisum sativum y señal de poliadenilación.
[C] La posición de nucleótidos 1469-2098 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia complementaria inversa diseñada para expresarse como una molécula de ARN que se pliega en una estructura de horquilla ARNbc de 240 nucleótidos y 150 nucleótidos que está diseñada para apuntar a la supresión del ortólogo de especies de Diabrotica de un gen de levadura que codifica una proteína Snf7 cuando se proporciona en la dieta de una especie de Diabrotica. Se proporciona un primer segmento de 240 nucleótidos correspondiente a una porción del gen ortólogo de snf7 de Diabrotica en la posición de nucleótidos 1469 - 1708 como se expone en la SEQ ID NO: 1, un segundo segmento de 240 nucleótidos correspondiente a la complementaria inversa del primer segmento se establece en la posición de nucleótidos 1850-2098 como se expone en la SEQ ID NO: 1, y el primer y el segundo segmento están operablemente unidos por un espaciador de 150 nucleótidos en el nucleótido posición 1709-1858 como se expone en la SEQ ID NO: 1.
[D] La posición de nucleótido 2135-2938 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia complementaria inversa de un intrón derivado de un gen dnaK de Zea mays.
[E] La posición de nucleótidos 2839-3298 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia complementaria inversa de una secuencia del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y una secuencia líder en 5' sin traducir. Este promotor, la secuencia líder no traducida asociada, el elemento intrón [D] y el elemento de terminación de la transcripción y de poliadenilación [B] regulan la expresión del elemento [C] en las células de las plantas de maíz.
[F] La posición de nucleótidos 3586-4534 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia promotora derivada de un gen de proteína inducida por impedancia física de Zea mays (Zm.PIIG). Este promotor, la secuencia líder no traducida asociada [G], el elemento intrón [H] y el elemento de terminación de la transcripción y de poliadenilación [J] regulan la expresión del elemento [I]. Este promotor está orientado en relación con el promotor [E] de modo que cada promotor ([E] y [F]) generará una expresión divergente de sus elementos respectivos ([C] e [I]) (véanse las flechas de bloque en la Figura 2 donde las flechas son representativas de los respectivos promotores ([E] y [F]) en la dirección de expresión indicada desde el promotor respectivo).
[G] La posición de nucleótidos 4541-4601 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia líder en 5' no traducida derivada de un gen del complejo b1 de recogida de luz de Triticum aestivum (Ta.Lhcbl).
[H] La posición de nucleótidos 4618-5097 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intrónica derivada de un gen de actina-1 de Oryza sativa (Os.Act1).
[I] La posición de nucleótido 5107-7068 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína tóxica del gusano de la raíz del maíz Cry3Bb (cry3Bb). La proteína Cry3Bb codificada es pesticida cuando se proporciona en la dieta de una especie de Diabrotica (gusano de la raíz del maíz).
[J] La posición de nucleótido 7088-7297 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de una terminación de transcripción y señal de poliadenilación de la proteína de choque térmico de Triticum aestivum 17 (HSP17).
[K] La posición de nucleótidos 7346-9526 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia contigua de promotor-líder-intrón derivada de un gen de alfa tubulina-3 de Oryza sativa (TubA-3). Este promotor, con el líder e intrón asociados, y la terminación de la transcripción y el elemento de poliadenilación [M] regulan la expresión del elemento [L].
[L] La posición de nucleótidos 9531-11126 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de un péptido de dirección citoplasmática de Arabidopsis thaliana (CTP; de la posición de nucleótidos 9531-9758), y una secuencia de un EPSPS derivado de Agrobacterium CP4 (de la posición de nucleótidos 9759-11126). Cuando esta secuencia se transcribe y traduce en proteína en una célula de planta de maíz, el CTP está operativamente unido al EPSPS. Cuando se expresa en células de plantas de maíz que comprenden el evento MON 87411, este CTP-EPSPS proporciona tolerancia al herbicida glifosato.
[M] La posición de nucleótidos 11134-11715 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de una terminación de la transcripción del gen Oryza sativa alfa tubulina-3 (TubA-3) y la señal de poliadenilación.
[N] La posición de nucleótido 11749-12248 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde al ADN del genoma de maíz adyacente al ADN transgénico insertado en el evento de maíz MON 87411, que en este caso se asigna arbitrariamente como el extremo 3' del ADN insertado transgénico.
[aa] La posición de nucleótido 501-806 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la porción de la secuencia del borde izquierdo de octopina de Agrobacterium tumefaciens de la construcción 417 adyacente al genoma en el extremo 5 'asignado arbitrariamente del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para
formar el evento MON 87411. El extremo 5' de [aa] como se expone en la SEQ ID NO: 1 está unida al extremo 3' del elemento [A] para formar la unión de ADN transgénico insertado en 5'/genoma de maíz abarcado por la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 21. El extremo 3 'del elemento [aa] está unido al extremo 5' del elemento [B] para formar una unión única dentro del ADN insertado transgénicamente que está englobada por la SEQ ID n O: 41.
[bb] La posición de nucleótidos 1440-1468 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [B] y [C]. El extremo 5' de [kk] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [K], y el extremo 3' del elemento [kk] está unido al extremo 5' del elemento [ C] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 42, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411.
[cc] La posición de nucleótidos 2099-2134 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [C] y [D]. El extremo 5' de [cc] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [C], y el extremo 3' del elemento [cc] está unido al extremo 5' del elemento [D] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 43, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411.
[ee] La posición de nucleótido 3299-3585 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [E] y [F]. El extremo 5' de [ee] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [E], y el extremo 3' del elemento [ee] está unido al extremo 5' del elemento [ F] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 44, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411.
[ff] La posición de nucleótido 4535-4540 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [F] y [G]. El extremo 5' de [ff] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [F], y el extremo 3' del elemento [ff] está unido al extremo 5' del elemento [G] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 45, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411. [gg] La posición de nucleótido 4602-4617 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [G] y [H]. El extremo 5' de [gg] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [G], y el extremo 3' del elemento [gg] está unido al extremo 5' del elemento [H] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 46, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411, pero que no es exclusivo del evento MON 87411.
[hh] La posición de nucleótido 5098-5106 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [H] e [I]. El extremo 5' de [hh] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [H], y el extremo 3' del elemento [hh] está unido al extremo 5' del elemento [H] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 47, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411, pero que no es exclusivo del evento MON 87411.
[ii] La posición de nucleótido 7069-7087 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [I] y [J]. El extremo 5 'de [ii] como se expone en la SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento
[I] y el extremo 3' del elemento [ii] está unido al extremo 5' del elemento [J] para formar una unión, abarcado por la SEQ ID NO: 48, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411, pero que no es exclusivo del evento MON 87411.
[jj] La posición de nucleótido 7298-7345 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [J] y [K]. El extremo 5' de [jj] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [J] y el extremo 3' del elemento [jj] está unido al extremo 5' del elemento [K] para formar una unión, abarcado por la SEQ ID NO: 49, dentro del a Dn transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411. [kk] La posición de nucleótido 9527-9530 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [K] y [L]. El extremo 5' de [kk] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [K], y el extremo 3' del elemento [kk] está unido al extremo 5' del elemento [L] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 50, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento m On 87411.
[II] La posición de nucleótido 11127-11133 como se expone en SEQ ID NO: 1 corresponde a una secuencia intermedia entre los elementos [L] y [M]. El extremo 5' de [ll] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [L], y el extremo 3' del elemento [ll] está unido al extremo 5' del elemento [M] para formar una unión única, abarcado por la SEQ ID NO: 51, dentro del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411.
[mm] La posición de nucleótido 11716-11748 como se expone en la SEQ ID NO: 1 corresponde a la porción de la secuencia del borde izquierdo de nopalina de Agrobacterium tumefaciens de la construcción 417 adyacente al genoma en el extremo 3 'asignado arbitrariamente del ADN transgénico insertado en el genoma del maíz para formar el evento MON 87411. El extremo 5' de [mm] como se expone en SEQ ID NO: 1 está unido al extremo 3' del elemento [M], y el extremo 3' del elemento [mm] está unido al extremo 5' del elemento [N] para formar una unión única de ADn transgénico insertado/genoma de maíz abarcado por la SEQ ID NO: 52.
Figura 4 La ilustración de la orientación del casete para los vectores probados para mostrar una mayor eficacia de los promotores divergentes que impulsan la expresión de los agentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz en comparación con los vectores con una orientación en tándem de los promotores que impulsan la expresión de los agentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos del evento MON 87411 y representa de 5' a 3', un segmento del ADN genómico 5' que flanquea (adyacente a) el ADN transgénico insertado (500 nucleótidos), el ADN transgénico insertado (11.248 nucleótidos) y un segmento del ADN genómico 3' que flanquea (adyacente a) el ADN transgénico insertado (500 nucleótidos) en el evento MON 87411.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento del ADN genómico '5 adyacente al ADN transgénico insertado (500 nucleótidos), y el remanente del borde del ADN transgénico insertado (263 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', el remanente de ADN transgénico insertado (15 nucleótidos) y un segmento del ADN genómico de 3' adyacente al ADN genómico insertado (500 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 4 es una secuencia de nucleótidos del evento MON 87411 y representa el ADN genómico insertado (11248 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 5 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento del ADN genómico 5' adyacente al ADN transgénico insertado (50 nucleótidos), y el remanente del borde del ADN transgénico insertado (263 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 6 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento del ADN genómico 5' adyacente al ADN transgénico insertado (110 nucleótidos), y el remanente del borde del ADN transgénico insertado (263 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 7 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento del ADN genómico 5' adyacente al ADN transgénico insertado (145 nucleótidos), y el remanente del borde del ADN transgénico insertado (263 nucleótidos) del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 8 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento de ADN transgénico insertado (83 nucleótidos) y un segmento del ADN genómico de 3' adyacente al ADN genómico insertado (34 nucleótidos) del evento Mo N 87411.
SEQ ID NO: 9 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento de ADN transgénico insertado (83 nucleótidos) y un segmento del ADN genómico de 3' adyacente al ADN genómico insertado (90 nucleótidos) del evento Mo N 87411.
SEQ ID NO: 10 es una secuencia de unión de nucleótidos del evento MON 87411, y representa de 5' a 3', un segmento de ADN transgénico insertado (83 nucleótidos) y un segmento del ADN genómico de 3' adyacente al ADN genómico insertado (255 nucleótidos) del evento m On 87411.
SEQ ID NO: 11 es una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADNc de Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) que codifica una subunidad del complejo ESCRT-III que es ortóloga a la levadura Snf7.
SEQ ID NO: 12 es una secuencia de nucleótidos que representa la cadena antisentido de un casete de expresión de ADN que incluye un gen recombinante diseñado para expresar una molécula de ARN repetida invertida. Los segmentos de ADN repetidos invertidos corresponden a las posiciones 663 a 902 y a las posiciones 1292 a 1053. Las secuencias de ADN repetidas invertidas corresponden a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 desde la posición de nucleótidos 151-390.
SEQ ID NO: 13 es una secuencia de ribonucleótidos transcrita desde el ADN como se expone en la SEQ ID NO: 12.
SEQ ID NO: 14 es una secuencia de nucleótidos que representa la cadena sentido de un casete de expresión de ADN que incluye un gen recombinante diseñado para codificar y expresar una proteína Cry3Bb tóxica del gusano de la raíz del maíz.
SEQ ID NO: 15 es una traducción de la secuencia de aminoácidos de un polinucleótido correspondiente a las posiciones 1522 - 3480 de la SEQ ID NO: 14 y que representa una proteína Cry3Bb tóxica del gusano de la raíz del maíz.
SEQ ID NO: 16 es una secuencia de nucleótidos que representa la cadena de sentido de un casete de expresión de ADN que incluye un gen recombinante diseñado para codificar y expresar una proteína 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS).
SEQ ID NO: 17 es una traducción de la secuencia de aminoácidos de un polinucleótido correspondiente a las posiciones 2186 a 3781 de la SEQ ID NO: 16 y que representa una proteína EPSPS que exhibe insensibilidad al herbicida glifosato.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ27011, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 462 - 490 de la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 19 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado PB3552, y es idéntico al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 502 - 515 de la SEQ ID NO: 1. PB3552 puede marcarse en 5' con un resto de 6-carboxifluoresceína (6-FAM™) y marcarse en 3' con un resto inactivador para su uso en combinación con un par de cebadores de amplificación térmica, por ejemplo, SQ27011 y SQ9085, y capaz de usarse en el procedimiento de amplificación de ADN TAQMAN® para detectar la presencia de ADN del evento MON 87411 en una muestra biológica que contiene ADN del evento de maíz MON 87411.
SEQ ID NO: 20 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ9085, y es idéntico al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 516 - 541 de la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 21 es una secuencia de nucleótidos del evento MON 87411, y corresponde a las posiciones 462 - 541 de la SEQ ID NO: 1. Se puede producir un amplicón que exhibe esta secuencia con un par de cebadores de amplificación térmica, por ejemplo, SQ27011 y SQ9085.
SEQ ID NO: 22 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ27066, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 11710 - 11728 de la SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 23 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado PB11300, y es idéntica a la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 11731 - 11755 de la SEQ ID NO: 1. PB11300 puede marcarse en 5' con un resto de 6-carboxifluoresceína (6-FAM™) y marcarse en 3' con un resto inactivador. Marcado de esta manera, PB11300 se puede usar en combinación con un par de cebadores de PCR, por ejemplo, SQ27066 y SQ26977, para detectar el evento MON 87411 en un ensayo TAQMAN®.
SEQ ID NO: 24 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ26977, y es idéntico al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 11756 - 11784 de la SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 25 es una secuencia de nucleótidos del evento MON 87411, y corresponde a las posiciones 11710 -11784 de la SEQ ID NO: 1. Se puede amplificar un amplicón que exhibe esta secuencia con un par de cebadores, por ejemplo, SQ27066 y SQ26977, y es diagnóstico del evento MON 87411.
del evento MON 87411. Se puede producir un amplicón que exhibe esta secuencia de nucleótidos con un par de cebadores de PCR, por ejemplo, SQ27011 y SQ26977, y es diagnóstico del alelo de tipo salvaje del evento MON 87411.
SEQ ID NO: 38 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ20221.
SEQ ID NO: 39 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado PB10065. PB10065 puede marcarse en 5' con VIC™ y marcarse en 3' con un resto inactivador. Marcado de esta manera, PB 10065 se puede usar en combinación con un par de cebadores de PCR, por ejemplo, SQ10065 y SQ20222, para detectar la presencia de un segmento de un gen endógeno del maíz en un ensayo TAQMAN®.
SEQ ID NO: 40 es una secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido sintético denominado SQ20222.
SEQ ID NO: 41-52 son secuencias de nucleótidos de las regiones de la SEQ ID NO: 1, donde cada SEQ ID NO: abarca una unión formada por la secuencia intermedia y los elementos del casete de expresión como se detalla en la breve descripción de la Figura 3.
Descripción detallada
Los inventores han identificado un evento de maíz transgénico MON 87411 que exhibe propiedades y rendimiento superiores en comparación con las plantas de maíz transgénicas existentes. El evento de maíz MON 87411 contiene tres casetes de expresión operablemente unidos que confieren colectivamente los rasgos de resistencia al gusano de la raíz del maíz y la tolerancia al herbicida glifosato a las células de maíz, tejidos de maíz, semillas de maíz y plantas de maíz que contienen el evento transgénico MON 87411. El evento de maíz MON 87411 proporciona dos modos de acción contra las especies de plagas del gusano de la raíz del maíz (incluida Diabrotica spp., especialmente cuando la plaga es Diabrotica virgifera virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental, WCR), Diabrotica barben (gusano de la raíz del maíz del norte, NCR), Diabrotica virgifera zeae (gusano de la raíz del maíz mexicano, MCR), Diabrotica balteata (gusano de la raíz del maíz brasileño (BZR) o complejo del gusano de la raíz del maíz brasileño (BCR) que consiste en Diabrotica viridula y Diabrotica speciosa), o Diabrotica undecimpunctata howardii (gusano de la raíz del maíz del sur, SCR). Se han referenciado otros eventos de maíz transgénico en la técnica que proporcionan diversas realizaciones conferidas individualmente, tal como MON863 (que confiere el rasgo de resistencia a los gusanos de la raíz del maíz mediante la expresión de una proteína de toxina insecticida Cry3Bb), o eventos transgénicos del maíz que proporcionan dos o más rasgos como el evento de maíz MON88017 (que confiere el rasgo de resistencia a los gusanos de la raíz del maíz mediante la expresión de un La proteína de la toxina insecticida Cry3Bb y el rasgo de resistencia al herbicida glifosato mediante la expresión de un EPSPS insensible al glifosato) y el evento de maíz DAS 59122-7 (que confiere el rasgo de resistencia a los gusanos de raíz del maíz mediante la expresión de una toxina binaria PS149B1 de Bacillus thuringiensis, también conocida como Cry34 / Cry35, y el rasgo de tolerancia al herbicida glufosinato). Otra técnica desvela la combinación mediante la reproducción de los rasgos conferidos por los eventos de maíz MON88017 o DAS 59122-7 con un evento de maíz transgénico que confiere el rasgo de resistencia al gusano de la raíz del maíz resultante de la expresión de un ARNbc dirigido a la supresión de un gen del gusano de la raíz del maíz esencial para la supervivencia de los gusanos de raíz (documento US 7,943,819). Inherentes a tales combinaciones están los problemas asociados con la necesidad de reproducir estos múltiples rasgos ubicados en
múltiples loci diferentes y en múltiples cromosomas dentro del genoma del maíz juntos en una sola planta de maíz y mantener esos rasgos como híbridos en docenas, si no cientos de germoplasma de maíz diferente variedades. La solución para tales problemas sería incluir combinaciones de estos rasgos en un solo lugar. Los inventores del presente documento proporcionan una de esas soluciones al problema en forma del evento de maíz MON 87411, que combina tres casetes de expresión unidos covalentemente en un solo locus dentro del genoma del maíz, estos casetes de expresión que confieren los rasgos de resistencia al gusano de la raíz del maíz y la tolerancia al herbicida glifosato a las células de maíz, tejidos de maíz, semillas de maíz y plantas de maíz que contienen el evento transgénico MON 87411. El uso del evento de maíz MON 87411 brinda grandes beneficios a los productores de maíz: a) protección contra pérdidas económicas debido a las larvas del gusano de la raíz del maíz al proporcionar dos modos diferentes de acción de resistencia al gusano de la raíz del maíz, y b) la capacidad de aplicar herbicidas agrícolas que contienen glifosato al cultivo de maíz para un control de amplio espectro de las malezas. Adicionalmente, los transgenes que codifican los rasgos tolerantes al gusano de la raíz del maíz y al glifosato están unidos en el mismo segmento de ADN y ocurren en un solo locus en el genoma de MON 87411, proporcionando una mejora de la eficiencia reproductiva y permite el uso de marcadores moleculares para rastrear el inserto transgénico en las poblaciones reproductoras y su descendencia.
El evento de maíz MON 87411 se produjo mediante un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium de una línea de maíz endogámica con la construcción del plásmido pMON120417. Esta construcción de plásmido contiene los casetes de expresión de plantas vinculados con los elementos genéticos reguladores necesarios para la expresión en células de plantas de maíz de una proteína CP4 EPSPS, así como una proteína Cry3Bb y un ARNbc dirigido a la supresión de un gen esencial en las células de los gusanos de la raíz del maíz cuando se proporcionan células de maíz que contienen el evento de maíz MON 87411 en la dieta de dichos gusanos de la raíz del maíz. Las células de maíz se regeneraron en plantas de maíz intactas y se seleccionaron plantas individuales de la población de plantas que mostraron integridad de los casetes de expresión de plantas y resistencia al daño por alimentación de las larvas de glifosato y gusanos de raíz de maíz. Una planta de maíz que contiene en su genoma los casetes de expresión de plantas unidos presentes en el evento de maíz MON 87411 es un aspecto descrito en el presente documento.
El ADN plasmídico insertado en el genoma del evento de maíz MON 87411 se caracterizó por análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: el número de inserto (número de sitios de integración dentro del genoma del maíz), el número de copia (el número de copias del ADN-T dentro de un locus) y la integridad del ADN transgénico insertado. La construcción del plásmido que contiene los tres casetes de expresión unidos insertados en el genoma del maíz que da lugar al evento MON 87411 contiene múltiples segmentos (secuencias de unión entre los elementos utilizados para construir o construir los varios casetes de expresión) que no se sabe que aparecen naturalmente en el genoma del maíz. ni en otros vectores o eventos transgénicos de maíz o de otro tipo (por ejemplo, secuencias como se expone en las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52). Además, el evento de transformación que dio lugar al ADN transgénico insertado en el evento MON 87411 se caracteriza en el presente documento como una inserción en un solo locus en el genoma del maíz, dando como resultado dos nuevos loci o secuencias de unión entre el ADN insertado y el ADN del genoma del maíz (secuencias de unión adicionales) que son de longitud suficiente para ser únicos solo para un genoma de maíz que comprende el evento MON 87411. Estas secuencias de unión son útiles para detectar la presencia del evento de ADN MON 87411 en células de maíz, tejido, semillas y plantas o productos vegetales (productos básicos). Las sondas moleculares de ADN y los pares de cebadores se describen en el presente documento que se han desarrollado para su uso en la identificación de la presencia de estos diversos segmentos de unión en muestras biológicas que contienen o se sospecha que contienen células de maíz, semilla, partes de plantas o tejidos vegetales que contienen ADN del evento m On 87411. Los datos muestran que el evento MON 87411 contiene una única inserción de ADN-T con una copia del ADN transgénico insertado. En el evento MON 87411, no se han identificado elementos adicionales del vector de transformación pMON120714 que no sean porciones de las regiones fronterizas izquierda y derecha de Agrobacterium tumefaciens utilizadas para la transferencia de ADN transgénico desde el plásmido de transformación de la planta al genoma del maíz. Por último, se realizaron amplificación térmica que produce amplicones diagnósticos específicos para la presencia de dicho ADN del evento MON 87411 en una muestra, y análisis de secuencia de ADN para determinar las uniones de genoma insertado en la planta asignadas arbitrariamente en 5' y 3', confirmar la organización de los elementos dentro del inserto y determinar la secuencia completa de ADN del ADN transgénico insertado en el evento MON 87411 de la planta de maíz (SEQ ID NO: 1).
Se produjeron docenas de eventos transgénicos usando la construcción utilizada para producir el evento transgénico MON 87411, y se produjeron diferentes construcciones y se usaron para producir muchas docenas de otros eventos de maíz transgénico que se compararon con el MON 87411 y eventos similares. La eficacia de todos estos eventos se probó para controlar los gusanos de la raíz del maíz en bioensayos de dieta en los que se proporcionaron tejidos transgénicos de eventos de plantas de maíz en la dieta de larvas de gusanos de la raíz del maíz. Se determinó que la orientación de la expresión de los dos casetes de expresión diferentes, responsables de conferir los rasgos de resistencia al gusano de la raíz del maíz a los diversos eventos era crítica para la eficacia de los eventos en el control del gusano de la raíz del maíz cuando se proporcionaron las células del evento de maíz que expresaban estos rasgos de resistencia. en la dieta de las larvas del gusano de la raíz del maíz. Dos promotores diferentes, e35S de CAMV y Zm.PIIG, se observó que proporcionaban una eficacia sorprendente y superior de los eventos de maíz que contenían casetes de expresión que expresaban el protector del gusano de la raíz del maíz ARNbc del promotor e35S y la
proteína tóxica del gusano de la raíz del maíz Cry3Bb de un promotor Zm.PIIG adyacente y divergente del promotor e35S. Cuando estos promotores estaban en esta orientación particular, se obtuvieron proporciones significativamente mejoradas de eventos transgénicos que exhibían eficacia.
A menos que se indique lo contrario en el presente documento, los términos han de entenderse de acuerdo con la utilización convencional por los expertos habituales en la materia pertinente. También se pueden encontrar definiciones de términos comunes en biología molecular en Rieger y col., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Tal como se usa en el presente documento, el término "maíz" significa Zea mays e incluye todas las variedades de plantas que pueden criarse con plantas de maíz que comprenden MON 87411. Tal como se usa en el presente documento, el término "que comprende" significa "que incluye, pero no se limita a".
La presente memoria descriptiva proporciona plantas transgénicas que se han transformado con una construcción de ADN que contiene al menos tres casetes de expresión; un primer casete de expresión que expresa una cantidad tóxica del gusano de la raíz del maíz de un ARNbc diseñado para suprimir un gen esencial del gusano de la raíz del maíz ortólogo a un gen snf7 de levadura, un segundo casete de expresión expresa cantidades tóxicas del gusano de la raíz del maíz de delta-endotoxina Cry3Bb, y un tercer casete de expresión que expresa una enzima de tolerancia al glifosato CP4 EPSPS que es insensible a la inhibición del glifosato. Las plantas de maíz transformadas de acuerdo con los procedimientos y con la construcción de ADN desvelada en el presente documento son resistentes a CRW y tolerantes a las aplicaciones del herbicida glifosato. Los rasgos agronómicos relacionados proporcionan facilidad para mantener estos rasgos juntos en una población reproductora y exhiben una mayor eficacia contra el gusano de la raíz del maíz que las plantas que contienen un solo gen de inhibición del gusano de la raíz del maíz o que contienen los mismos genes de inhibición del gusano de la raíz del maíz (Cry3Bb y ARNbc) que se combinan como un material de reproducción.
Una "planta" transgénica se produce mediante la transformación de una célula vegetal con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido polinucleico que incluye un transgén de interés; regeneración de una población de plantas resultante de la inserción del transgén en el genoma de la célula vegetal y selección de una planta en particular caracterizada por la inserción en una ubicación concreta del genoma. El término "evento" se refiere a la planta transformante original y a la descendencia del transformante, que incluyen el ADN heterólogo. El término "evento" también incluye la descendencia producida por un cruce sexual entre el evento y otra planta en la que la descendencia incluye el ADN heterólogo. Incluso después de varios retrocruzamientos con un padre recurrente, el ADN insertado y el a Dn genómico flanqueante del evento parental transformado está presente en la descendencia del cruce en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también se refiere al ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado, que se esperaría que se transfiriera a una descendencia que recibe el ADN insertado, incluido el transgén de interés como resultado de un cruce sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el transformante original y la descendencia resultante de la autofecundación) y un línea parental que no contiene el ADN insertado. La presente memoria descriptiva se refiere al evento transgénico, la planta de maíz que comprende MON 87411, la descendencia de la misma y a composiciones de ADN contenidas en la misma.
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al que está unido un marcador convencional detectable o molécula indicadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Dicha sonda es complementaria a una cadena de un ácido nucleico diana, es decir, a una cadena de ADN genómico de MON 87411 ya sea de una planta de MON 87411 o de una muestra que incluye ADN de MON 87411. Las sondas como se describen en el presente documento incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y pueden usarse para detectar la presencia de esa secuencia de a Dn objetivo.
Los cebadores de ADN son ácidos polinucleicos aislados que se hibridan con una cadena de ADN objetivo complementaria por hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, a continuación, se extienden a lo largo de la cadena de ADN objetivo mediante una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Un par de cebadores de ADN o un conjunto de cebadores de ADN descritos en el presente documento se refieren a dos cebadores de ADN útiles para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos convencionales de amplificación de ácido polinucleico.
Las sondas de ADN y los cebadores de ADN son generalmente de 11 polinucleótidos o más de longitud, a menudo de 18 polinucleótidos o más, 24 polinucleótidos o más o 30 polinucleótidos o más. Tales sondas y cebadores se seleccionan para que tengan la longitud suficiente para hibridar específicamente con una secuencia diana en condiciones de hibridación de alta rigurosidad. Preferentemente, las sondas y los cebadores desvelados en el presente documento tienen una similitud de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque las sondas que difieren de la secuencia objetivo que retienen la capacidad de hibridar con las secuencias objetivo pueden diseñarse mediante procedimientos convencionales.
Los cebadores y las sondas basadosen el ADN genómico flanqueante y las secuencias de inserción desveladas en el presente documento pueden usarse para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las secuencias de ADN
desveladas por procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante re-clonación y secuenciación de tales moléculas de ADN.
Las sondas y cebadores de ácido nucleico desvelados en el presente documento hibridan en condiciones estrictas con una molécula de ADN diana. Cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico se puede usar para identificar la presencia de ADN a partir de una planta transgénica en una muestra. Las moléculas de ácido polinucleico, también denominadas segmentos de ácido nucleico, o fragmentos de los mismos, son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en determinadas circunstancias. Tal como se usa en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido polinucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenario antiparalelo. Se dice que una molécula de ácido nucleico es la "complementaria" de otra molécula de ácido nucleico si exhiben una complementariedad completa. Tal como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas exhiben una "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar entre sí con una estabilidad suficiente como para permitirles que permanezcan hibridadas entre sí en, al menos, condiciones de "rigurosidad baja". Análogamente, se dice que dos moléculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sí con una estabilidad suficiente como para que puedan permanecer hibridadas entre sí en condiciones convencionales de "rigurosidad alta". Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en Sambrook y col., 1989, y Haymes y col., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), Por lo tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que tales desviaciones no impidan por completo la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, solo tiene que ser suficientemente complementaria en su secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones de disolvente y de sales concretas usadas.
Tal como se usa en el presente documento, una secuencia sustancialmente homóloga es una secuencia de ácido nucleico que hibridará específicamente con la complementaria de la secuencia de ácido nucleico con la que se está comparando en condiciones de rigurosidad alta. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C, son conocidas por los expertos en la técnica o pueden ser encontrado en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar de una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C a una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 C. Tanto la temperatura como la sal pueden variar, o bien la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras se cambia la otra variable.
Un ácido polinucleico como se describe en el presente documento hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico establecidas en las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 o 52, o con complementarias de las mismas, o con fragmentos de cualquiera, en condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo, a aproximadamente 2,0 x SSC y a aproximadamente a 65 °C. Un ácido nucleico como se describe en el presente documento hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico establecidas en las SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 o 52 o complementarias o fragmentos de cualquiera en condiciones de alta rigurosidad. Una molécula de ácido nucleico marcadora desvelada en el presente documento tiene la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14, O SEQ ID NO: 16, o SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 42, o SEQ ID NO: 43, o SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 45, o SEQ ID NO: 49, o SEQ ID NO: 50, o SEQ ID NO: 51, o SEQ ID NO: 52 o complementarias de las mismas o fragmentos de cualquiera. La hibridación de la sonda a la molécula de ADN objetivo se puede detectar por cualquier número de procedimientos conocidos por los expertos en la materia, estos pueden incluir, aunque no de forma limitativa, marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos, marcadores a base de anticuerpos y marcadores quimioluminiscentes.
Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, mediante PCR) usando un par de cebadores de amplificación concretos, las "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores hibride solo con la secuencia de ácido nucleico objetivo a la que se uniría un cebador que tiene la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complementaria), y preferentemente, para producir un producto de amplificación único, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de ADN.
La expresión "específico de (una secuencia diana)" indica que una sonda o cebador hibrida en condiciones de hibridación rigurosas únicamente con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Tal como se usa en el presente documento, "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto del procedimiento de amplificación de ácido polinucleico dirigido a una molécula de ácido polinucleico objetivo que es parte de un molde de ácido polinucleico. Por ejemplo, para determinar si una planta de maíz resultante de un cruce sexual contiene ADN genómico de una planta transgénica de una planta de maíz que comprende MON 87411 como se describe en el presente documento, el ADN que se extrae de una muestra de tejido de planta de maíz puede someterse a un procedimiento de amplificación de ácido polinucleico usando un par de cebadores que incluye un cebador derivado de una secuencia de a Dn en el genoma de una planta que comprende MON 87411 adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado (ADN transgénico) y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para
producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN de la planta MON 87411. El amplicón de diagnóstico tiene una longitud y tiene una secuencia de ADN que también es diagnóstica para el ADN genómico de la planta, El amplicón puede variar en longitud desde la longitud combinada del par de cebadores más un par de bases nucleotídicas, preferentemente más aproximadamente cincuenta pares de bases nucleotídicas, más preferentemente más aproximadamente doscientos cincuenta pares de bases nucleotídicas, e incluso más preferentemente más aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares de bases nucleotídicas o más. Como alternativa, se puede derivar un par de cebadores de la secuencia genómica en ambos lados del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que incluya la secuencia completa de polinucleótidos insertada (por ejemplo, un cebador directo aislado de la porción genómica de la SEQ ID NO: 1 y un cebador inverso aislado de la porción genómica de la SEQ ID NO: 1 que amplifica una molécula de ADN que comprende una secuencia de unión identificada en el presente documento en el genoma del evento MON 87411). Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta adyacente al ADN transgénico insertado se encuentra a una distancia de la secuencia de ADN insertada, esta distancia puede variar desde un par de bases nucleotídicas hasta aproximadamente veinte mil pares de bases nucleotídicas. El uso del término "amplicón" excluye específicamente dímeros de cebadores que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica del ADN.
La amplificación de ácido polinucleico puede lograrse mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácido polinucleico conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos de amplificación son conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en las patentes de Estados Unidos n.° 4.683.195 y 4.683.202 y en los protocolos de PCR: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990. Se han desarrollado procedimientos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 kb (kilobase) de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN bacteriófago (Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Estos procedimientos, además de otros procedimientos conocidos en la técnica de amplificación del ADN, se pueden usar.
La secuencia del inserto de ADN heterólogo o la secuencia de ADN genómico flanqueante del evento MON 87411 puede verificarse (y corregirse si es necesario) amplificando tales moléculas de a Dn del evento MON 87411 que comprende semillas o plantas cultivadas a partir de la semilla depositada en la ATCC que tiene el número de referencia. PTA-12669, usando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en el presente documento, seguido de secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o fragmentos de ADN clonados del mismo.
Los kits de detección de ADN que se basan en procedimientos de amplificación de ADN contienen moléculas de cebador de ADN que hibridan específicamente con un ADN objetivo y amplifican un amplicón diagnóstico en las condiciones de reacción apropiadas. El kit puede proporcionar un procedimiento de detección basado en gel de agarosa o cualquier número de procedimientos para detectar el amplicón diagnóstico que se conocen en la técnica. Un kit puede contener cebadores de ADN que son homólogos o complementarios a cualquier porción de la región genómica del maíz como se expone en SEQ ID NO: 1 y a cualquier porción del ADN transgénico insertado como se expone en la SEQ ID NO: 1. Las moléculas de ADN útiles como cebadores de ADN pueden seleccionarse de la secuencia de ADN transgénico / genómico desvelada de MON 87411 (SEQ ID NO: 1) por los expertos en la técnica de amplificación de ADN.
El amplicón diagnóstico producido mediante estos procedimientos se puede detectar mediante una pluralidad de técnicas. Uno de estos procedimientos es en Análisis Genético de un bit (Nikiforov, y col. Nucleic Acids Res. 22:4167-4175, 1994), en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que solapa tanto la secuencia de ADN genómica flanqueante adyacente como la secuencia de ADN insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Después de la PCR de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un producto de PCR monocatenario puede hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de base única usando una ADN polimerasa y didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basarse en un ELISA. Una señal indica la presencia de la secuencia transgénica / genómica debido a una amplificación satisfactoria, hibridación y extensión de base única.
Otro procedimiento es la técnica de pirosecuenciación descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este procedimiento se diseña un oligonucleótido que solapa el a Dn genómico adyacente y la unión del ADN del inserto. El oligonucleótido hibrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5'-fosfosulfato y luciferina. Los DNTP se agregan individualmente y la incorporación da como resultado una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia transgénica / genómica debido a una amplificación satisfactoria, hibridación y extensión de una o varias bases.
La polarización de fluorescencia según lo descrito por Chen, y col., (Genome Res. 9:492-498, 1999) es un procedimiento que se puede usar para detectar el amplicón como se describe en el presente documento. Usando este procedimiento se diseña un oligonucleótido que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. El oligonucleótido hibrida con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de una sola base tiene como resultado la incorporación del ddNTP. La
incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorímetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia transgénica / genómica debido a una amplificación satisfactoria, hibridación y extensión de base única.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un procedimiento de detección y cuantificación de la presencia de una secuencia de ADN y se entiende completamente en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y Dntp. La hibridación de la sonda FRET tiene como resultado la escisión y liberación del resto fluorescente lejos del resto de inactivación en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia transgénica / genómica debido a la amplificación e hibridación satisfactorias.
Se han descrito balizas moleculares para su uso en la detección de secuencia, como se describe en Tyangi, y col. (Nature Biotech. 14: 303-308, 1996) Brevemente, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que solapa la unión entre el ADN genómico flanqueante y el insertado. La estructura única de la sonda FRET tiene como resultado que contiene una estructura secundaria que conserva los restos fluorescente y de inactivación muy cercanos. La sonda FRET y los cebadores para PCR (un cebador en la secuencia de ADN insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y Dntp. Después de la amplificación satisfactoria mediante PCR, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia objetivo da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de inactivación. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia del inserto transgénico/flanqueante del transgén debido a una amplificación, hibridación satisfactorios.
Los kits de detección de ADN pueden desarrollarse usando las composiciones desveladas en el presente documento y los procedimientos bien conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits son útiles para identificar el ADN del evento de maíz MON 87411 en una muestra y se pueden aplicar a los procedimientos para reproducir plantas de maíz que contienen ADN del MON 87411. Un kit contiene moléculas de a Dn que son útiles como cebadores o sondas y que son homólogas o complementarias al menos a las porciones aplicables de SEQ ID NO: 1, como se describe en el presente documento. Las moléculas de ADN pueden usarse en procedimientos de amplificación de ADN (PCR) o como sondas en procedimientos de hibridación de ácido polinucleico, es decir, análisis Southern, análisis Northern.
Las secuencias de unión pueden estar representadas por una secuencia del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52.
Estos nucleótidos están unidos mediante un enlace fosfodiéster y en el evento de maíz MON 87411 están presentes como parte del genoma de la célula vegetal recombinante. La identificación de una o más SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52 en una muestra derivada de una planta de maíz, semilla o parte de la planta es determinante de que el ADN se obtuvo del evento de maíz MON 87411 y es diagnóstica de la presencia en una muestra que contiene ADN del evento de maíz MON 87411. Por lo tanto, la memoria descriptiva proporciona una molécula de ADN que contiene al menos una de las secuencias de nucleótidos proporcionadas como SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. Se desvela en el presente documento cualquier segmento de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON 87411 que sea suficiente para incluir al menos una de las secuencias proporcionadas como SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. Además, se desvela en el presente documento cualquier polinucleótido que comprenda una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo.
La proporciona moléculas de ADN de ejemplo que pueden usarse como cebadores o sondas para detectar la presencia de ADN derivado de una planta de maíz que comprende el ADN del evento MON 87411 en una muestra. Tales cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico diana y, como tales, son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento de maíz MON 87411 mediante los procedimientos de la invención descritos en el presente documento.
Un "cebador" es típicamente un polinucleótido aislado altamente purificado que está diseñado para su uso en procedimientos de unión o hibridación específicos que implican amplificación térmica. Se pueden usar un par de cebadores con ADN molde, tal como una muestra de ADN genómico de maíz, en una amplificación térmica, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, donde el amplicón producido a partir de dicha reacción tendría una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN molde localizada entre los dos sitios donde los cebadores hibridaron con el molde. Tal como se usa en el presente documento, un "amplicón" es una pieza o fragmento de ADN que se ha sintetizado mediante técnicas de amplificación. Un cebador está típicamente diseñado para hibridar con una cadena de ADN diana complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para comenzar la extensión del cebador (es decir, la polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula de nucleótidos en alargamiento) utilizando como molde la cadena de ADN diana. Con pares de cebadores se pretende
hacer referencia al uso de dos cebadores que se unen a cadenas opuestas de un segmento de nucleótidos bicatenario con el fin de amplificar linealmente el segmento de polinucleótidos entre las posiciones seleccionadas para la unión por los miembros individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmica u otros procedimientos convencionales de amplificación de ácido nucleico. Un par de cebadores útil para esta aplicación debe comprender una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN, y en la que ambas tienen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN para funcionar como cebadores de ADN que, cuando se usan juntos en una reacción de amplificación térmica con molde de ADN derivado del evento de maíz MON 87411, para producir un diagnóstico de amplicón para el evento de maíz MON 87411 ADN en una muestra.
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado que es complementario a una cadena de un ácido nucleico diana. Las sondas incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y la detección de dicha unión puede ser útil en el diagnóstico, discriminación, determinación, detección o confirmación de la presencia de esa secuencia de ADN objetivo en una muestra en particular. Una sonda puede estar unida a un marcador detectable convencional o molécula indicadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima.
Las sondas y los cebadores pueden tener identidad de secuencia completa con la secuencia objetivo, aunque los cebadores y las sondas que difieren de la secuencia objetivo que retienen la capacidad de hibridar, preferentemente, con las secuencias objetivo pueden diseñarse mediante procedimientos convencionales. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, solo tiene que ser suficientemente complementaria en su secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones de disolvente y de sales concretas usadas. Se puede usar cualquier procedimiento convencional de hibridación o amplificación de ácido nucleico para identificar la presencia de a Dn transgénico del evento de maíz MON 87411 en una muestra. Las sondas y los cebadores tienen, generalmente, al menos aproximadamente 11 nucleótidos, al menos aproximadamente 18 nucleótidos, al menos aproximadamente 24 nucleótidos o al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia de ADN objetivo en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en Sambrook y col., 1989, y Haymes y col., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
Se puede usar cualquiera de numerosos procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, desvelada en la memoria descriptiva, incluidos los procedimientos de amplificación térmica. Las moléculas de ADN, o fragmentos de las mismas, también pueden obtenerse por otras técnicas tales como por síntesis directamente del fragmento por medios químicos, como se practica comúnmente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.
Por lo tanto, las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en el presente documento son útiles para, entre otras cosas, identificar l evento de maíz MON 87411, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento de maíz MON 87411, detectar la presencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON 87411 en una muestra y monitorizar las muestras para detectar la presencia y / o ausencia del evento de maíz MON 87411 o partes de plantas derivadas de plantas de maíz que comprenden el evento MON 87411.
La memoria descriptiva proporciona plantas de maíz, descendencia, semillas, células vegetales, partes de plantas (tales como polen, óvulo, espigas o tejido de seda, tejido de la panícula, tejido de la raíz, tejido del tallo y tejido de la hoja). Estas plantas, descendencia, semillas, células vegetales, partes de plantas contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la invención, es decir, tal como un polinucleótido que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. Las plantas, descendencia, semillas, células vegetales y partes la planta de la invención también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén adicional puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifique una proteína o molécula de ARN que confiera un rasgo deseable que incluya, aunque sin limitaciones, una mayor resistencia a los insectos, mayor eficiencia en el uso del agua, mayor función de rendimiento, mayor resistencia a la sequía, mayor calidad de la semilla, mejor calidad nutricional y / o mayor tolerancia a los herbicidas, en el que el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de maíz que carece de dicho transgén adicional.
La memoria descriptiva proporciona plantas de maíz, descendencia, semillas, células vegetales y partes de la planta, tal como polen, óvulo, espigas o tejido de seda, tejido de la panícula, tejido de la raíz o el tallo, y hojas derivadas de una planta de maíz transgénico que comprende el evento MON 87411. Una muestra representativa de semilla de maíz que comprende el evento MON 87411 se ha depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El depositario de la ATCC ha asignado la designación de depósito de patente PTA-12669 al evento MON 87411 que comprende semilla.
La memoria descriptiva proporciona un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID n O: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 presente en su genoma. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula vegetal transgénica. Los
microorganismos, tal como una célula vegetal de la memoria descriptiva, son útiles en muchas aplicaciones industriales, incluyendo, pero sin limitaciones: (i) utilizar como herramienta de investigación para investigación científica o investigación industrial; (ii) utilizar en cultivo para producir carbohidratos endógenos o recombinantes, lípido, ácido nucleico o productos proteicos o moléculas pequeñas que pueden usarse para investigaciones científicas posteriores o como productos industriales; y (iii) usar con técnicas modernos de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales que luego puedan usarse para investigación o producción agrícola. La producción y el uso de microorganismos, tales como las células vegetales transgénicas, utilizan técnicas microbiológicas modernas y la intervención humana para producir un microorganismo artificial único. En este procedimiento, el ADN recombinante se inserta en el genoma de una célula vegetal para crear una célula vegetal transgénica que es independiente y única respecto a las células vegetales naturales. Esta célula vegetal transgénica se puede cultivar de manera muy parecida a las bacterias y las células de levadura utilizando técnicas modernas de microbiología y puede existir en estado unicelular indiferenciado. La composición genética y el fenotipo nuevo o alterado de la célula vegetal transgénica es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Los microorganismos de la memoria descriptiva, tales como las células vegetales transgénicas, incluyen (i) procedimientos para producir células transgénicas integrando el ADN recombinante en el genoma de la célula y luego usando esta célula para derivar células adicionales que poseen el mismo ADN heterólogo; (ii) procedimientos de cultivo de células que contienen ADN recombinante utilizando técnicas modernas de microbiología; (iii) procedimientos para producir y purificar productos endógenos o recombinantes de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteicos de células cultivadas; y (iv) procedimientos de uso de técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales con células vegetales transgénicas para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales transgénicos.
Las plantas como se describe en el presente documento pueden transmitir el evento ADN, incluyendo el transgén, a la descendencia. Tal como se usa en el presente documento, "descendencia" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y / o parte de planta regenerable que comprende el evento de ADN derivado de una planta ancestral y / o que comprende una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Las plantas, la descendencia y las semillas pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. La descendencia se puede cultivar a partir de semillas producidas por una planta que contiene un evento de maíz MON 87411 y / o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene un evento de maíz MON 87411.
Las plantas de la descendencia pueden autopolinizarse (también conocidas como "autofecundación") para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén. La autofecundación de la descendencia adecuada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos añadidos.
Como alternativa, las plantas de descendencia pueden cruzarse, por ejemplo, reproducirse con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. La otra planta no relacionada puede ser transgénica o no transgénica. Por lo tanto, una semilla o planta varietal o híbrida se puede derivar cruzando un primer progenitor que carezca del ADN específico y único del evento de maíz MON 87411 con un segundo progenitor que comprenda el evento de maíz MON 87411, lo que da como resultado un híbrido que comprende el ADN específico y único del evento de maíz MON 87411. Cada progenitor puede ser híbrido o endogámico / varietal, siempre y cuando el cruce o la reproducción den como resultado una planta o semilla, es decir, una semilla que tiene al menos un alelo que contiene el a Dn del evento de maíz MON 87411 y / o una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Por lo tanto, se pueden cruzar dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia híbrida que contenga dos genes exógenos añadidos que segregan de forma independiente. Por ejemplo, el evento de maíz MON 87411 que contiene resistencia a las infestaciones por el gusano de la raíz del maíz y tolerancia al glifosato se puede cruzar con diferentes plantas de maíz transgénicas para producir una planta híbrida o endogámica que tiene las características de ambos progenitores transgénicos. Un ejemplo de esto sería un cruce del evento MON 87411 que contiene resistencia a las infestaciones de gusanos de la raíz del maíz y tolerancia al glifosato con una planta de maíz que tiene uno o más rasgos adicionales, tales como la tolerancia a los herbicidas y / o el control de insectos, lo que da como resultado una planta o semilla de la descendencia que es resistente a las infestaciones por los gusanos de la raíz del maíz y tolerante al glifosato y tiene al menos uno o más rasgos adicionales. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, como es la propagación vegetativa. Pueden encontrarse descripciones de otros procedimientos reproductivos que se usan habitualmente para los diferentes rasgos y cultivos en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987). La memoria descriptiva describe una parte de planta que deriva de plantas de maíz que comprenden el evento MON 87411. Tal como se usa en el presente documento, una "parte de planta" hace referencia a cualquier parte de una planta que está compuesta por material derivado de una planta de maíz que comprende el evento MON 87411. Las partes de la planta incluyen, pero sin limitaciones, polen, óvulo, espiga o seda, panícula, tejido de la raíz o el tallo, fibras y hojas. Las partes de plantas pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.
Las plantas, descendencia, semillas, células vegetales, partes de plantas (tales como polen, óvulo, espiga o seda,
panícula, tejido de la raíz o el tallo, y hojas) como se describe en el presente documento, por tanto, útiles para, entre otras cosas, cultivar plantas con el fin de producir semillas y/o partes de plantas que comprenden el evento de maíz MON 87411 para fines agrícolas, produciendo una descendencia que comprende el evento de maíz MON 87411 con fines de reproducción e investigación de plantas, usar con técnicas microbiológicas para aplicaciones industriales y de investigación y la venta a los consumidores.
La memoria descriptiva proporciona procedimientos para controlar malas hierbas y procedimientos para producir plantas usando herbicida glifosato y el evento de maíz MON 87411. Se proporciona un procedimiento para controlar malas hierbas en un campo y que consiste en sembrar la variedad que contiene el evento MON 87411 o plantas híbridas en un campo y aplicar una dosis herbicidamente eficaz de glifosato al campo con el fin de controlar las malas hierbas en el campo sin dañar las plantas que contienen MON 87411. Dicha aplicación del herbicida glifosato puede ser antes de la emergencia, es decir, cualquier momento después de sembrar la semilla que contiene MON 87411 y antes de que emerja las plantas que contienen MON 87411, o tras la emergencia, es decir, cualquier momento después de la emergencia de las plantas que contienen MON 87411. También se proporciona otro procedimiento para controlar malas hierbas en el campo y que consiste en aplicar una dosis eficaz de herbicida glifosato para controlar las malas hierbas en un campo y, después, sembrar plantas de maíz que comprenden el evento MON 87411 en el campo. Dicha aplicación del herbicida glifosato sería antes de la siembra, es decir, antes de sembrar la semilla que contiene MON 87411 y podría realizarse en cualquier momento antes de la siembra, incluyendo, aunque no de forma limitativa, aproximadamente 14 días antes de la siembra a aproximadamente 1 día antes de la siembra. La memoria descriptiva también proporciona un procedimiento para producir semillas de maíz esencialmente libres de semillas de malas hierbas sembrando semillas de planta de maíz tolerante al glifosato que comprende MON 87411 en un campo, aplicar al campo una dosis eficaz posterior a la emergencia de herbicida glifosato suficiente para matar las malas hierbas y recoger la semilla del campo. Una dosis eficaz de herbicida de glifosato para su uso en el campo debe consistir en un rango de aproximadamente 0,125 libras por acre a aproximadamente 6,4 libras por acre de glifosato durante una estación de crecimiento. En una realización, se aplica un total de aproximadamente 1,5 libras por acre de glifosato durante una estación de crecimiento. Se pueden usar múltiples aplicaciones de glifosato durante una estación de crecimiento, por ejemplo, dos aplicaciones (como una aplicación previa a la siembra y una aplicación posterior a la emergencia o una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia) o tres aplicaciones (como una aplicación previa a la siembra, una aplicación previa a la emergencia y una aplicación posterior a la emergencia).
Se proporcionan procedimientos para producir una planta de maíz tolerante a insectos y herbicidas que comprende las secuencias de ADN específicas y únicas para el evento MON 87411 de la memoria descriptiva. Las plantas transgénicas utilizadas en estos procedimientos pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de descendencia producidas por estos procedimientos pueden ser plantas varietales o híbridas; pueden cultivarse a partir de semillas producidas por una planta que contiene un evento de maíz MON 87411 y / o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contiene un evento de maíz MON 87411; y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de la descendencia se pueden autopolinizar posteriormente para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén o, alternativamente, pueden cruzarse, por ejemplo, reproducirse con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida.
Se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de ADN derivado de una célula de maíz. tejido, semillas o plantas que comprenden el evento de maíz MON 87411 en una muestra. Un procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de maíz, tejido, semilla o planta, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con al menos un cebador que es capaz de producir una secuencia de ADN específica para el ADN del evento MON 87411 en condiciones apropiadas para la secuenciación del ADN, (iii) realizar una reacción de secuenciación de ADN, y luego (iv) confirmar que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 87411, o la construcción comprendida en ella, tal como una seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Otro procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula de maíz, tejido, semilla o planta, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón a partir del ADN del evento MON 87411 en condiciones apropiadas para la amplificación del ADN, (iii) realizar una reacción de amplificación de ADN, y luego (iv) detectar la molécula de amplicón y / o confirmar que la secuencia de nucleótidos del amplicón comprende una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 87411 El amplicón debe ser uno específico para el evento MON 87411
La detección de una secuencia de nucleótidos específica para el evento MON 87411 en el amplicón es determinante y/o diagnóstica para la presencia del ADN específico del evento del maíz MON 87411 en la muestra.
Se proporcionan kits de detección de ADN que son útiles para la identificación del ADN del evento MON 87411 en una muestra y también se pueden aplicar a procedimientos de cultivo de plantas de maíz que contienen el ADN del evento adecuado. Dichos kits contienen cebadores y / o sondas de ADN que comprenden fragmentos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Un ejemplo de un kit de este tipo comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de ] SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 para funcionar como una sonda de ADN útil para detectar la presencia y / o ausencia de ADN derivado de plantas de maíz transgénicas que comprenden el evento MON 87411 en una muestra. El ADN derivado de plantas de maíz transgénicas que comprende el evento MON 87411 comprendería una molécula de ADN que tiene al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente otras sondas y deben comprender un número suficiente de ácidos nucleicos contiguos, incluyendo al menos 15, al menos un 16, al menos un 17, al menos un 18, al menos un 19, al menos un 20, al menos un 21, al menos un 22, al menos un 23, al menos un 24, al menos un 25, al menos un 26, al menos un 27, al menos un 28, al menos un 29, al menos un 30, al menos un 31, al menos un 32, al menos un 33, al menos un 34, al menos un 35, al menos un 36, al menos un 37, al menos un 38, al menos 39, o al menos 40 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 y ser lo suficientemente único para el ADN del evento de maíz MON 87411 para identificar el ADN derivado del evento. Otro tipo de kit comprende un par de cebadores útil para producir un amplicón útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN derivado del evento de maíz transgénico MON 87411 en una muestra. Tal procedimiento también puede incluir secuenciar el amplicón o un fragmento del mismo, que sería determinante, es decir, diagnóstico, de la presencia de ADN específico del evento específico de maíz MON 87411 en la muestra de ADN objetivo. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores y deben comprender un número suficiente de ácidos nucleicos contiguos, incluyendo al menos 15, al menos un 16, al menos un 17, al menos un 18, al menos un 19, al menos un 20, al menos un 21, al menos un 22, al menos un 23, al menos un 24, al menos un 25, al menos un 26, al menos un 27, al menos un 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de secuencias proporcionadas en, pero sin limitaciones, la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 y ser lo suficientemente único para el ADN del evento de maíz MON 87411 para identificar el ADN derivado del evento.
Los kits y procedimientos de detección descritos en el presente documento son útiles para, entre otras cosas, identificar 1 evento de maíz MON 87411, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento de maíz MON 87411, detectar la presencia de ADN derivado de las plantas de maíz transgénicas que comprenden el evento MON 87411 en una muestra y monitorizar las muestras para detectar la presencia y / o ausencia de plantas de maíz que comprenden el evento MON 87411 o partes de plantas derivadas de plantas de maíz que comprenden el evento m On 87411.
La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o secuencias flanqueantes del evento de maíz MON 87411 se pueden verificar (y corregir en caso necesario) mediante amplificación de dichas secuencias desde el evento usando los cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en el presente documento, seguidas de secuenciación de ADN estándar del amplicón de o del ADN clonado.
INFORMACIÓN DE LOS DEPÓSITOS
El 14 de marzo de 2012 se realizó un depósito de una muestra representativa de semilla de maíz que comprende el evento MON 87411, de acuerdo con el Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que tiene la dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, Estados Unidos, código postal 20110 y número de referencia en la ATCC asignado PTA-12669. El acceso a los depósitos estará disponible durante la tramitación de la solicitud ante el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas y las personas que el Comisionado determine que tienen derecho a solicitarlos. Tras la emisión de la patente, todas las restricciones sobre la disponibilidad al público se eliminarán irrevocablemente. El depósito se mantendrá en el depositario durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vigencia de la patente, lo que sea más largo y se reemplazará según sea necesario durante ese período.
Ejemplos
Ejemplo 1
Este ejemplo describe el diseño y la selección de una construcción designada 417 y la ingeniería y evaluación de diferentes construcciones de ADN. La Tabla 1 tabula estas construcciones de ADN por criterios de prueba y resultados.
Las construcciones de ADN se diseñaron para expresar un protector basado en plantas (PIP) basado en ARN en maíz, dirigido al gusano de la raíz del maíz occidental (WCR). Las variaciones del transcrito de ARN se probaron para diferentes genes objetivo del WCR (Grupo 1), diferentes longitudes de ARN (Grupo 2), con o sin portador de ARN neutro (Grupo 2), diferentes estructuras secundarias (Grupo 4) y diferentes segmentos objetivo de Dv_Snf7o (Grupos 2 y 3). También se probaron variaciones en múltiples transgenes, por ejemplo, el transcrito de ARN una proteína activa de WCR (Grupos 3 y 5), y dos transcritos de ARN dirigidos a dos objetivos de WCR (Grupos 1 y 4). También se probaron las variaciones en el número y la configuración de los casetes de expresión y los elementos utilizados (todos los grupos).
TABLA 1. Cuarenta y cinco construcciones de ADN se transformaron de manera estable en plantas de maíz. Se v l r n^ l l n n n i m li l v n r n f rm i n r n r i n ADN.
Usando las construcciones de ADN del Grupo 2 como ejemplo, se diseñaron 7 construcciones de ADN para probar el
direccionamiento de varias longitudes de Dv_Snf7o (desde 27 hasta 429 nt de longitud). Cada construcción de ADN se produjo, las células vegetales se transformaron, las plantas se obtuvieron y las endogamias se evaluaron en bioensayos de eficacia de la cámara de crecimiento. Los resultados mostraron una correlación entre la longitud del ARN repetido invertido (IR) y la actividad del WCR (Tabla 2, columnas (B) y (H)).
TABLA 2. Correlación entre la lon itud del IR la actividad del WCR.
La columna (B) muestra las longitudes variables del ARN objetivo Dv_Snf7o diseñado para expresarse como una estructura secundaria de ARN repetido (IR) invertido en plantas de maíz. La columna (C) muestra el número de embriones de maíz que se transformaron. La columna (D) muestra el número de embriones de maíz que desarrollaron brotes. La columna (E) muestra el número de plantas de maíz regeneradas (designadas como generación R0) viables en el suelo. La columna (F) muestra el número de plantas R0 que se espera alberguen una sola copia del inserto de ADN en el evento de transformación. La columna (G) muestra el número de plantas R0 que se esperaba que albergaran un solo evento de transformación y que produjeron suficiente semilla para el bioensayo de la cámara de crecimiento de múltiples plantas. La columna (H) muestra los resultados de los estudios de la cámara de crecimiento de la planta diseñados para evaluar la actividad del WCR. "+++++" indica que la RDR promedio fue menor que 0,5 RDR. "++" indica que la RDR promedio estaba entre 0,5 RDR y 2,0 RDR. "-" indica que la RDR promedio fue menor que 2,0 RDR, lo que era comparable a los controles negativos en los estudios de eficacia en la cámara de crecimiento.
f el mismo 27 unidades que en la construcción de ADN n.° 474 pero incluido en un IR neutro de 150 unidades. Para evaluar la actividad del WCRC en plantas cultivadas en cámaras de crecimiento, Se cultivaron de 6 a 8 plantas por cada 10-20 eventos por construcción en macetas de turba. Las plantas se analizaron para detectar la presencia del inserto de ADN y la expresión del transgén o los transgenes en los tejidos de las hojas y de las raíces. Las plantas que se confirmó que tenían expresión del transgén se trasplantaron luego a macetas más grandes infestadas con huevos del WCR. Las líneas de maíz no transgénicas LH59 y LH244 se incluyeron como controles negativos. Las plantas que contenían el evento MON 88017 (que expresa Cry3Bb) se incluyeron como controles positivos. El daño a la raíz de las plantas de maíz en crecimiento se evaluó después de 4 semanas. Las clasificaciones del daño a la raíz (RDR) se evaluaron en una escala de tres puntos, siendo 0 RDR sin daño en la raíz y 3 RDR con el daño máximo de la raíz.
Los resultados del estudio guiaron el diseño de las construcciones de ADN del Grupo 5 para que contuvieran (a) un casete de expresión para un Dv_Snf7o IR de 240 unidades y (b) un casete de expresión para una proteína Cry3Bb (Figura 2). El Dv_Snf7o IR de 240 unidades se seleccionó porque (a) las plantas que expresan el Dv_Snf7o IR de 240 unidades idéntico tuvieron éxito repetidamente en la inhibición de la actividad del CRW (Grupos 2-4), (b) los segmentos mayores de 100 nt de longitud disminuyen la probabilidad de desarrollo de resistencia al WCR y (c) los segmentos mayores de 240 nt harían más difícil la transferencia intacta al genoma del maíz. Las construcciones de ADN se diseñaron para probar diferentes elementos genéticos reguladores en cada casete de expresión y diferentes configuraciones de cada casete de expresión en la construcción de ADN. Las construcciones de ADN del Grupo 5 también incluyeron construcciones con y sin casetes de expresión de tolerancia al glifosato; y una construcción de control del grupo 3 que expresaba solo el IR Dv_Snf7o de 240 unidades. Cada construcción de ADN se diseñó, las células vegetales se transformaron, las plantas se obtuvieron y las endogamias se evaluaron en bioensayos de eficacia de la cámara de crecimiento (Tabla 3) (C) a (H)).
Tal como se muestra en la Tabla 3, columna (H), "+++++" describe construcciones de ADN que, en promedio, proporcionaron la expresión génica sostenida más alta a las plantas transgénicas durante su desarrollo, la mayor parte de la inhibición del WCR durante el desarrollo y la mayor parte de la inhibición del WCR en generaciones autofertilizadas e híbridas cruzadas. "++++" describe construcciones de ADN que, en promedio, proporcionaron inhibición del WCR a las plantas transgénicas pero menor expresión génica en comparación con las plantas "+++++". "+++" describe construcciones de ADN que, en promedio, proporcionaron una inhibición del WCR más baja a las plantas transgénicas en comparación con las plantas "++++" y "+++++". Por lo tanto, la construcción de ADN n.° 417 se avanzó para su posterior análisis. Esta construcción tiene dieciséis elementos genéticos organizados en tres casetes de expresión desde el borde izquierdo (LB) hasta el borde derecho (RB). La construcción se muestra en la Figura 2 y la secuencia dada en SEQ ID NO: 26. Los componentes del vector son los siguientes:
[1 LB: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 1 a 442 de la SEQ ID NO: 26. Este elemento representa la secuencia del borde izquierdo de octopina de Agrobacterium tumefaciens.
[2] Ps.RbcS2-E9 3' UTR: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 486 a 1118 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región 3' no traducida (UTR) del transcrito del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa E9 (rbcS-E9) de Pisum sativum (guisante).
[3] Gen de repetición invertida Dv_Snf7o de 240 unidades: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 1148 a 1777 de la SEQ ID NO: 26. Este gen transcribe ARN que contiene dos segmentos de ribonucleótidos de 240 unidades que se alinean de forma idéntica entre sí en forma de complementaria inversa, separados por un segmento neutro de 150 ribonucleótidos y que forman un ARN repetido invertido (IR). La secuencia del segmento de 240 pb se alinea con un gen ortólogo del WCR a la levadura Snf7.
[4] Intrón DnaK de maíz: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 1814 a 2617 de la SEQ ID NO: 26. Este elemento consiste en 10 nucleótidos del exón 1, intrón 1 y 11 nucleótidos del exón 2 del gen 70 de la proteína de choque térmico de Zea mays (maíz). Los 11 nucleótidos del exón 2 se modificaron para eliminar un resto iniciador de metionina.
[5] Líder 35 S del CaMV: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 2618-2626 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región 5' no traducida (UTR) del transcrito de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) que comienza en la posición 1 del inicio transcripcional del ARNm del gen.
[6] Promotor 35S del eCaMV: Corresponde a la complementaria inversa de las posiciones 2627-3238 de la SEQ ID NO: 26. Representa el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) que contiene una duplicación de la región de -90 a -350.
[7] Promotor PIIG de maíz: Corresponde a las posiciones 3265 -4213 de la SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa el promotor del gen de la proteína inducida por impedancia física (PIIG) de Zea mays.
[8] Líder Lhcb1 de trigo: Corresponde a las posiciones 4220 - 4280 de la SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa la región 5' no traducida (UTR) del gen del complejo de captación de luz b1 (Lhcb1) de Triticum aestivum (trigo).
[9] Intrón Act1 de arroz: Corresponde a las posiciones 4297 -4776 de la SEQ ID NO: 26. Consiste en una secuencia contigua de 12 nucleótidos del exón 1, intrón 1 y 7 nucleótidos del exón 2 del gen de Actina 1 (Act1) de Oryza sativa (arroz).
[10] o Rf de Cry3Bb: Corresponde a las posiciones 4786 - 6747 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región de codificación de una proteína Cry3B pesticida de origen no natural diseñada para exhibir modificaciones H231R, S311L, N313T, E317K y Q349R en comparación con el gen codificador de la proteína Bt Cry3Bb nativa. La secuencia de nucleótidos se alinea con la secuencia del gen cry3Bb contenida en el evento MON 88017.
[11] Hsp173' UTR de trigo: Corresponde a las posiciones 6767 -6976 de la SEQ ID NO: 26. Este elemento genético representa la 3' UTR del gen de la proteína 17 de choque térmico (HSP17) de Triticum aestivum (trigo).
[12] TubA de ratón (promotor, líder, intrón): Corresponde a las posiciones 7025 - 9205 de la SEQ ID NO: 26. Representa el promotor contiguo, líder, intrón y 4 nucleótidos del exón 2 del gen de la alfa tubulina (TubA-3) de Oryza sativa (arroz).
[13] CTP: Corresponde a las posiciones 9210 - 9437 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región de codificación diseñada que codifica el CTP N-terminal de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de A. thaliana. Este elemento difiere del gen nativo (N.° de referencia de GenBank X06613) en el último codón GAG (ácido glutámico) por modificación a TGC (cisteína).
[14] CP4 EPSPS: Corresponde a las posiciones 9438 - 10805 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región de codificación diseñada del EPSPS de CP4 de Agrobacterium. Difiere del gen nativo de Agrobacterium en el segundo codón mediante modificación de la codificación de serina a CTT (leucina) y cuatro sustituciones silenciosas.
[15] TubA 3' UTR de arroz: Corresponde a las posiciones 10813 - 11394 de la SEQ ID NO: 26. Representa la región 3' no traducida (UTR) de un gen de la alfa tubulina (TubA-3) de Oryza sativa (arroz).
[16] RB: Corresponde a las posiciones 11413 - 11743 de la SEQ ID NO: 26. Representa la secuencia del borde derecho de nopalina de A. tumefaciens.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la transformación y selección del evento MON 87411 entre una pluralidad de eventos transgénicos.
Los embriones se cortaron de los granos de la línea de maíz LH244 y se inoculó la construcción de ADN n.° 417 que
aloja Agrobacterium recombinante. Los embriones cocultivados se transfirieron a medios de selección y crecimiento para generar tejido de callos transgénico con brotes en desarrollo. Los brotes en desarrollo se transfirieron al medio de enraizamiento para el desarrollo en plántulas. Las plántulas se regeneraron en plantas R0 completas en el suelo. Las plantas R0 recuperadas de esta manera se seleccionaron para obtener una copia única del ADN de construcción introducido. Tal como se muestra en la Tabla 3, supuestos eventos de copia única se proporcionaron en 71 transformantes de R0 únicos. Cada transformante de R0 se colocó en condiciones de vivero para producir la semilla de la descendencia R1. Se avanzaron cuarenta y cuatro eventos. Al menos 8 semillas R1 producidas por cada una de las 44 plantas R0 se plantaron en el suelo y las plantas R1 se cultivaron para producir semillas R2. Se seleccionó una sola planta R1 por evento para continuar cada línea que contenía cada evento por separado y la semilla de la única planta R1 se acumuló para pruebas posteriores mediante (a) autofertilización (R3,4,..,n), y (b) fertilización cruzada con otras líneas de maíz, por ejemplo, línea de maíz 93IDI3. Las plantas que representan eventos de la transformación de la construcción de ADN n.° 890 (fila 11 de la Tabla 3) también se regeneraron para servir como controles comparativos para ensayos de campo posteriores que se describen a continuación y en este ejemplo.
De los 44 eventos, se eligieron 25 eventos para proseguir basándose en un fenotipo que incluye la expresión de Cry3Bb. Las plantas R1 que representan estos 25 eventos se evaluaron adicionalmente para determinar la inhibición del WCR en los procedimientos de eficacia de la cámara de crecimiento descritos en el Ejemplo 1 y para el número de copias de múltiples elementos genéticos del inserto de ADN. Se usaron posteriormente diecisiete eventos de los 25 eventos, ya que cuatro eventos exhibieron más de una copia del elemento genético Ps.RbcS2-E9 3' UTR y las plantas R1 que representan otros 4 eventos exhibieron clasificaciones del daño a la raíz superiores a 0,8 RDR.
Las plantas de descendencia que comprendían los 17 eventos restantes, es decir, "A", MON 87411 y "C" a "Q", se analizaron adicionalmente en paralelo para determinar el rendimiento molecular y en el campo (véanse las Tablas 4 y 5).
TABLA 4. Análisis molecular de 17 eventos de maíz transgénico que albergan inserto de ADN del vector de transformación de ADN n.° 417.
Los eventos se seleccionaron para detectar segmentos de ADN del esqueleto del vector de transformación de Agrobacterium y para un número de copia único de todas las porciones del inserto de ADN deseado (Tabla 4, Columnas (A) y (B)). Siete eventos (MON 87411, A, C, D, E, F y G) se analizaron para determinar la secuencia del ADN insertado que es idéntica al vector de transformación n.° 417, con la excepción de las variaciones en el sitio de la muesca en los bordes izquierdo y derecho de Agrobacterium que se producen durante la inserción mediada por Agro, el evento D falló este análisis de secuencia (Tabla 4, Columna (C)). Estos 7 eventos también se evaluaron para determinar la expresión sostenida de la planta de la proteína Cry3Bb y el ARN de IR Dv_Snf7o durante el desarrollo de la planta y varias generaciones, y los 7 eventos cumplieron los criterios de aprobación para la expresión sostenida de la planta (Tabla 4, Columna (D)). En cada uno de los 7 eventos se analizaron las características del sitio de inserción genómica (es decir, el sitio de inserción neutro), tal como el desplazamiento de ADN, las duplicaciones y la
repetitividad, la proximidad a un gen endógeno, la interrupción de un gen endógeno y la proximidad a QTL y los rasgos biotecnológicos, los eventos E, F y G fallaron este análisis (Tabla 4, Columna (F)). Se realizaron trasferencias Northern en tejidos vegetales que contenían eventos MON 87411, A, C y D para determinar si los tamaños esperados de los dos transcritos de ARN que codifican Cry3Bb, o que producen el a Rn de IR Dv_Snf7o estaban presentes en el ARN de los eventos, y todos los eventos evaluados pasaron este criterio (Tabla 4, Columna (G)).
Estos 17 eventos se evaluaron en ensayos de campo de agronomía, eficacia con insectos y eficacia de tolerancia al glifosato, los resultados se resumen en la Tabla 5. Los encabezados de la columna de la Tabla 5 describen el tipo de ensayo de campo ("Agronomía", "Insecto" o "Glifosato"), se enumeran los controles con los que se compararon / contrastaron los eventos y también se enumera la endogamia genética utilizada para generar el híbrido de eventos. Los ensayos de campo resumidos en las columnas (A) a (C) se plantaron un año natural antes de los ensayos de campo resumidos en las columnas (D) a (H), y dos años antes de los ensayos de campo resumidos en la columna (I).
Los eventos se compararon con los controles en cada ensayo de campo. Los datos para cada ensayo de campo se promediaron mediante parcelas replicadas en múltiples ubicaciones. LH244 es el control para la línea de transformación. El vector de ADN "n.° 890" se usó para producir eventos que expresan solamente el IR Dv_Snf7o de 240 unidades. El evento comercial, MON 88017, que proporciona resistencia a los coleópteros y tolerancia al glifosato para las plantas de maíz se utilizó como control. "Rn endogámica" especifica la descendencia de generación N. Los eventos híbridos evaluados en los ensayos de campo se cultivaron a partir de semillas cosechadas de un cruce con un progenitor del evento bajo evaluación (MON 87411, o A a Q), y un progenitor como se indica en la Tabla 5 (Columna C, G o H). Específicamente, en la Tabla 5, la columna R2 endogámica X 93IDI3 especifica que R2 endogámica del evento bajo evaluación se cruzó con la línea endogámica de maíz 93IDI3 para hacer la semilla híbrida. Análogamente, en la Tabla 5, columnas G y H, R4 endogámica X MON 89034 especifica que una descendencia R4 endogámica Del evento bajo evaluación se cruzó con una planta que contenía el evento MON 89034 para producir la semilla híbrida. "ND" indica que los datos para este evento de prueba no estaban disponibles. "=" representa la equivalencia de rasgos en comparación con los controles. "-" representa una coincidencia de rasgo en comparación con los controles. "+" representa un aumento en el rendimiento en comparación con los controles. "RDR" es la clasificación del daño a la raíz. " t" representa que los estudios contemporáneos de invernadero mostraron que el evento aplicable exhibía tipos fenotípicos fuera de tipo en plantas cultivadas en el vivero. " f" representa que los estudios de invernadero contemporáneos mostraron que el evento aplicable no proporcionó eficacia contra el WCR.
Los ensayos de campo agronómicos se realizaron en múltiples localizaciones de Norteamérica y Sudamérica, los resultados se promediaron en todas las localizaciones. como se resume en la Tabla 5, columnas A, B, D e I. Para estos ensayos de campo agronómicos, los granos de maíz se plantaron en un diseño de bloques completos aleatorios (RCB) en parcelas triplicadas por evento por ubicación. Cada parcela replicada consistió en 100 granos. El mantenimiento de prueba se diseñó para optimizar la producción de granos y eliminar la presión natural del WCR. Se recopilaron una o más de las siguientes clasificaciones de ensayo de campo agronómico estándar: unidades de grado al 50 % de desprendimiento (GDU), puntuación del agricultor (BR), vigor de las plántulas (SDV), encamado de tallos (STLC), encamado de raíces (RTLC), altura de la mazorca de plantas maduras (EHT), altura de la planta de plantas maduras (PHT), humedad del grano (MST) y peso de prueba del grano (TWT), fueras de tipo fenotípico y rendimiento de grano. Se evaluaron tanto los eventos endogámicos como los híbridos y los resultados se resumen en la Tabla 5, columnas A, B, D e I. Se incluyeron controles apropiados en parcelas triplicadas por control por ubicación. Las clasificaciones se promediaron por parcela en todas las localizaciones. Los datos se sometieron a un análisis de la varianza y medias separadas en la diferencia menos significativa al nivel de probabilidad del 5 % (LSD (0,05)).
Los resultados de los ensayos de campo de la eficacia en insectos que incluyeron los análisis del daño por el WCR promediados en múltiples localizaciones de Norteamérica se resumen en la Tabla 5, columnas C y H. Para estos ensayos de campo de eficacia, los granos de maíz se plantaron en un diseño RCB en parcelas triplicadas por evento por ubicación; cada parcela replicada consistió en 25 granos. Los eventos de prueba se presentaron en plantas híbridas. Se incluyeron controles apropiados en parcelas triplicadas por control por ubicación. Cuando las parcelas de maíz alcanzaron su etapa de crecimiento V2, 5 plantas por parcela se infestaron con huevos de WCR a razón de 3.330 huevos por planta. Durante la etapa de crecimiento V10, las raíces de las 5 plantas infestadas por parcela se desenterraron, se lavaron y se evaluaron para determinar el daño a la alimentación basándose en una clasificación del daño a la raíz (RDR) de 0 a 3, siendo 0 RDR sin daño en la raíz y 3 RDR con el daño máximo de la raíz. Las RDR para los eventos de prueba y las plantas de control se promediaron por planta en todas las parcelas en todas las ubicaciones. Las plantas de control negativo de cada ensayo de campo de eficacia de insectos exhibieron RDR promedio respectivo de 1,7 y 1,5 RDR. Las comprobaciones comerciales de cada ensayo de campo de eficacia de insectos exhibieron RDR promedio respectivas de 0,25 y 0,20 RDR. Las plantas que contienen eventos de la construcción de ADN n.° 890 exhibieron un rango de RDR de aproximadamente 0,35 a 0,50 RDR. Los eventos de la construcción de ADN n.° 417 proporcionaron consistentemente a las plantas clasificaciones promedio de RDR menores que el umbral de daño económico de 0,25 RDR.
Los resultados de los ensayos de campo de eficacia que evalúan la tolerancia vegetativa a los tratamientos con herbicida glifosato se realizaron en múltiples ubicaciones en Norteamérica y se resumen en la Tabla 5, columnas F y G. Para estos ensayos de campo de eficacia, el régimen de aplicación de glifosato utilizado para el ensayo específico se presenta en la Tabla 6 (correspondiente a la Tabla 5, columna F) y la Tabla 7 (correspondiente a la Tabla 5, columna G).
TABLA 6. Tratamientos de ensa o de cam o del herbicida.
TABLA 7. Tratamientos de ensa o de cam o del herbicida.
Cada parcela de 100 plantas se clasificó según el daño al cultivo 7-10 días después del último rociado de cada tratamiento. Las clasificaciones de los daños en los cultivos incluyeron clorosis, malformación y menor altura promedia de la planta, todo lo cual indica menor tolerancia al herbicida glifosato. Cada parcela también se clasificó según la PHT, la EHT, los días hasta un 50 % de desprendimiento de polen (D50P), días hasta el 50% de emergencia de seda (D50S), el TWT, el MST y el rendimiento. Los eventos se proporcionaron como plantas endogámicas y plantas híbridas y se compararon con el evento MON 88017. Los eventos "A", MON 87411, "D", "E" y "G" fueron equivalentes al evento MON 88017 en relación con el daño al cultivo, el PHT, la EHT, D50P, D50S, el t W t , la MST y las clasificaciones de rendimiento. Según estos resultados, junto con la importante ventaja de RDR del evento MON 87411 en comparación con otros eventos y con el evento comercial MON88017, se seleccionó el evento MON 87411.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe la caracterización molecular del evento MON 87411. Se tomó una muestra de tejido foliar de una planta MON 87411 (R0). La secuenciación del ADN genómico correspondiente al sitio de inserción transgénico en caso de que se obtuviera MON 87411 y no se observaron diferencias en comparación con la secuencia en el vector de transformación correspondiente al vector n.° 417.
Las secuencias flanqueantes se mapearon a secuencias de referencia del genoma del maíz, incluyendo el genoma de referencia B73 de maíz (Ref B73). Se determinó que el evento MON 87411 estaba ubicado físicamente en el cromosoma 9. La secuencia flanqueante que termina en la unión del ADN del flanco izquierdo / inserto corresponde a la posición ZM_B73_CR09: 39261797. La secuencia flanqueante que termina en la unión de ADN del flanco derecho / inserto corresponde a la posición ZM_B73_CR09: 39261915. Las secuencias flanqueantes para el evento MON 87411 se analizaron para detectar duplicaciones del genoma, repeticiones y genes endógenos. No se detectó ninguna.
El análisis de secuencia del ADN insertado en el evento MON 87411 confirmó que solo 263 nucleótidos del borde izquierdo de Agrobacterium (establecido arbitrariamente como el extremo 5' del inserto), y solo 15 nucleótidos del borde derecho Agrobacterium (establecido arbitrariamente como el extremo 3' del inserto) se retuvo en el ADN insertado en el sitio de inserción genómica del evento MON 87411.
Se realizó un análisis comparativo de la secuencia genómica que flanquea al ADN insertado del evento MON 87411 y la región genómica correspondiente del sitio de inserción en el alelo de tipo salvaje de LH244. Este análisis determinó que un segmento de 118 pares de bases de ADN genómico LH244 fue desplazado por el ADN insertado del vector de transformación n.° 417 en el procedimiento de generación del evento MON 87411.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe procedimientos que son útiles en la identificación de la presencia de ADN derivado del evento MO 87411 en una muestra de maíz. Se diseñaron un par de cebadores y una sonda con el fin de identificar la unión única formada entre el ADN genómico y el extremo 5' asignado arbitrariamente del ADN insertado del evento MON 87411 (es decir, la unión izquierda) y abarcado en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o Se Q ID NO: 21. La secuencia del cebador directo oligonucleotídico SQ27011 (SEQ ID NO: 18) es idéntica a la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 462 a 490 de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID n O: 2, las posiciones 107 a 135 de la SEQ ID NO: 7, las posiciones 72 a 100 de la SEQ ID NO: 6, las posiciones 12 a 40 de la SEQ ID NO: 5 y las posiciones 1 a 29 de la SEQ ID NO: 21. La secuencia del cebador inverso oligonucleotídico SQ9085 (SEQ ID NO: 20) es idéntica a la complementaria inversa de la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 516 a 541 de SEQ ID NO: 1 y Se Q ID NO: 2, las posiciones 161 a 186 de la SEQ ID NO: 7, las posiciones 126 a 151 de la SEQ ID NO: 6, las posiciones 66 a 91 de la SEQ ID NO: 5, las posiciones 16 a 41 de SEQ ID NO: 4 y las posiciones 55 a 80 de la SEQ ID NO: 21. La secuencia de la sonda oligonucleotídica PB3552 (SEQ ID NO: 19) es idéntica a la complementaria inversa de la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 502 a 515 de s Eq ID NO: 1 y SEQ iD NO: 2, las posiciones 147 a 160 de SEQ ID NO: 7, las posiciones 112 a 125 de la SEQ ID NO: 6, las posiciones 52 a 65 de la SeQ ID NO: 5, las posiciones 2 a 15 de la SEQ ID NO: 4 y las posiciones 41 a 54 de la SEQ ID NO: 21. Los cebadores para la PCR SQ27011 (SEQ ID NO: 18) and SQ9085 (SEQ ID NO: 20) amplifican un amplicón de 79 nucleótidos del ADN genómico/inserto único en la unión izquierda del evento MON 87411. Este mismo par de cebadores con la sonda PB3552 (SEQ ID NO: 19), que se ha marcado con fluorescencia (es decir, un marcador fluorescente 6FAM™), se puede usar en el ensayo de PCR de punto final TaqMan® para identificar la presencia de ADN derivado del evento MON 87411 en una muestra.
Se diseñaron un par de cebadores y una sonda con el fin de identificar la unión única formada entre el ADN genómico y el extremo 3' asignado arbitrariamente del ADN insertado del evento MON 87411 (es decir, la unión izquierda) y
abarcado en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 25. La secuencia del cebador directo oligonucleotídico SQ27066 (SEQ ID NO: 22) es idéntica a la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 11710 a 11728 de la Se Q ID NO: 1, las posiciones 11210 a 11228 de la SEQ ID NO: 4, las posiciones 45 a 63 de la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, y las posiciones 1 a 19 de la SEQ ID n O: 25. La secuencia del cebador inverso oligonucleotídico SQ26977 (SEQ ID NO: 24) es idéntica a la complementaria inversa de la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 11756 a 11784 de SEQ ID NO: 1, las posiciones 91 a 117 de la SEQ ID NO: 8, las posiciones 91 a 119 de la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, las posiciones 23 a 51 de la SEQ ID NO: 3 y las posiciones 47 a 75 de la SEQ ID NO: 25. La secuencia de la sonda oligonucleotídica PB11300 (SEQ ID NO: 23) es idéntica a la secuencia nucleotídica correspondiente a las posiciones 11731 a 11755 de la SEQ ID NO: 1, las posiciones 11231 a 11248 de la SEQ ID NO: 4, las posiciones 66 a 90 de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID No : 10, las posiciones 1 a 22 de la SEQ ID NO: 3 y las posiciones 22 a 46 de la SEQ ID NO: 25. Los cebadores para la PCR SQ27066 (SEQ ID NO: 22) y SQ26977 (SEQ ID NO: 24) amplifican un amplicón de 75 nucleótidos del ADN genómico/inserto único en la unión izquierda del evento MON 87411. Este mismo par de cebadores con la sonda PB11300 (SEQ ID NO: 23), que se ha marcado con fluorescencia (es decir, un marcador fluorescente 6FAM™), se puede usar en el ensayo de PCR de punto final TaqMan® para identificar la presencia de ADN derivado del evento MON 87411 en una muestra.
Además de SQ27011, SQ9085, PB3552, SQ27066, SQ26977 y PB11300, debería ser evidente para las personas expertas en la técnica que pueden diseñarse otros cebadores y / o sondas para amplificar y / o hibridar con las secuencias dentro de la SEQ ID NO: 1 que son únicas y útiles para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 87411 en una muestra.
Según análisis moleculares y de secuencia, se desarrollaron ensayos de PCR para los ensayos de identificación de eventos para el evento MON 87411. Siguiendo las prácticas estándar de laboratorio de biología molecular, los parámetros de un ensayo de PCR estándar o un ensayo de PCR TaqMan® se optimizaron con cada conjunto de pares de cebadores y sondas (es decir, sondas marcadas con un marcador fluorescente, tal como 6FAM™) utilizadas para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 87411 en una muestra (SQ27011, SQ9085 y/o PB3552, o SQ27066, SQ26977 y/o PB11300). Generalmente, los parámetros que se optimizaron incluyeron la concentración del cebador y de la sonda, la cantidad de molde de ADN y los parámetros de ciclado de amplificación por PCR. Un control para la reacción de PCR incluyó cebadores (SQ20221 (SEQ ID NO: 38) y SQ20222 (SEQ ID NO: 40)) y / o sonda (PB10065 (SEQ ID NO: 39)) (sonda marcada con un marcador fluorescente, tal como VIC™), que son específicos de un control interno, un gen de copia única en el genoma del maíz. Un experto en la materia sabrá cómo diseñar otros cebadores de PCR específicos para un solo gen de copia en el genoma del maíz que se puede usar para amplificar un amplicón para usarlo como sonda de control interno o como control interno en un ensayo de PCR (por ejemplo, TaqMan®). El ADN se extrajo del tejido foliar para cada uno de los siguientes: [1] la muestra de hoja que se va a analizar; [2] el control negativo (ADN de maíz no transgénico); [3] el control negativo, agua, (no molde); y [4] el ADN de MON 87411 control positivo. La detección de los amplicones de un ensayo de PCR estándar sería la visualización por electroforesis en gel de ADN, y para un ensayo de PCR TaqMan® por detección de fluorescencia.
Un ensayo de cigosidad es útil para determinar si una planta que comprende un evento es homocigota para el ADN del evento; que comprende el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par cromosómico; o heterocigoto para un evento de ADN, que comprende el ADN exógeno en solo un cromosoma de un par cromosómico; o es nula para el ADN del evento, que es de tipo salvaje. La cigosidad de una planta de maíz que contiene el evento MON 87411 puede determinarse por amplificación térmica (PCR) o por procedimientos TaqMan® de punto final. Por ejemplo, para la amplificación por PCR, el par de cebadores SQ27011 (Se Q ID NO: 18) y SQ26977 (SEQ ID NO: 22) se hibridan dentro del ADN genómico que flanquea el inserto del evento MON 87411. Este par de cebadores generará un amplicón que tiene una longitud de 11323 nucleótidos cuando el ADN derivado del evento MON 87411 está presente en la muestra. Este mismo par de cebadores generará un amplicón que solo tiene aproximadamente 150 nucleótidos de largo cuando el ADN de maíz en la muestra no se deriva del evento MON 87411. En la electroforesis en gel del ADN, una sola banda de 11323 pb es indicativa de que el ADN en la muestra es de un evento homocigoto MON 87411, una sola banda de aproximadamente 150 pb es indicativa de que el ADN en la muestra no es de un evento MON 87411, y la presencia de una banda de 11323 pb y una banda de aproximadamente 150 pb es indicativo de que el ADN en la muestra es de una planta de maíz heterocigota para el evento MON 87411.
Se puede desarrollar un ensayo TaqMan® para determinar la cigosidad de una planta de maíz que contiene el evento MON 87411. Para este ensayo, se diseñarían tres o cuatro cebadores y dos sondas donde [1] un primer par de cebadores y una primera sonda son específicos para detectar la presencia del ADN de evento MON 87411 en una muestra y [2] un segundo par de cebadores, diferente del primer par de cebadores, y una segunda sonda, diferente de la primera sonda, son específicos para detectar la presencia de ADN de maíz de tipo salvaje (es decir, muestra que no contiene el evento MON 87411). En un ensayo TaqMan® o similar, una señal fluorescente solo de la primera sonda es indicativa y diagnóstica de una planta homocigota para el evento MON 87411; una señal fluorescente tanto de la primera sonda como de la segunda sonda es indicativa y diagnóstica de una planta heterocigota para el evento MON 87411; y una señal fluorescente solo de la segunda sonda es indicativa y diagnóstica de una planta que es homocigota para el alelo de tipo salvaje (es decir, es nula para el evento MON 87411).
Ejemplo 5
Este ejemplo describe la protección superior de la planta que comprende el evento MON 87411 frente al daño del gusano de la raíz del maíz en comparación con los productos comerciales actuales (MON 88017 y DAS-59122-7) y las plantas de control negativo. Se realizaron ensayos de campo de eficacia comparando 135 plantas de cada evento MON 87411, MON 88017, DAS-59122-7 y los controles negativos. Se recogieron las clasificaciones de daño de la raíz (RDR) y el porcentaje de plantas con una RDR menor que el nivel de daño económico (0,25 RDR) se muestra en la Tabla 8.
La Tabla 8 muestra que solo aproximadamente el 4 % de las plantas que contienen el evento MON 87411 exhibieron RDR mayores que el umbral económico de 0,25 RDR. En cambio, el 22 % de las plantas disponibles comercialmente que contienen MON 88017 exhibieron RDR mayores que el umbral económico de 0,25 RDR. Y, el 20 % de las plantas disponibles comercialmente que contienen DAS-59122-7 exhibieron RDR mayores que el umbral económico de 0,25 RDR. Y, el 96 % de las plantas de control negativo exhibieron RDR mayores que el umbral económico de 0,25 RDR. La conclusión de estos datos es que el evento MON 87411 es claramente superior a la hora de proporcionar protección contra el daño del gusano de la raíz del maíz en comparación con los productos comerciales MON 88071 y DAS-59122-7, y un control negativo.
TABLA 8. Resultados del ensayo de campo de eficacia con el porcentaje aproximado de plantas que exhiben < 0,25
RDR.
Se realizaron ensayos de eficacia en invernadero para evaluar el rendimiento del evento MON 87411 con una presión de infestación extrema del gusano de la raíz de maíz. En este ensayo se evaluaron los siguientes eventos: evento MON 87411, un evento de la transformación con el vector de ADN n.° 890 que expresa solo el ARNbc; MON 88017; DAS-59122-7; y el control negativo. Para estos ensayos de eficacia a alta presión, las plantas de maíz evaluadas se cultivaron en macetas en un invernadero. La presión de infestación extrema se logró mediante la infestación secuencial de cada planta en maceta con aproximadamente 2.000 huevos del WCR por maceta en su etapa de crecimiento V2, y en 4 ocasiones adicionales que ocurren en intervalos de 1 a 1-1 / 2 semanas con aproximadamente 1.000 huevos de WCR por maceta por infestación para un total de aproximadamente 6.000 huevos de WCR añadidos a cada maceta. Las raíces de las plantas se extrajeron, se lavaron y se clasificaron según el RDR en su etapa de crecimiento de TV. Las raíces de las trece plantas de control negativo (N = 13) exhibieron daño máximo a la raíz, o una RDR absoluta de 3 RDR. Estos resultados ilustran que el evento MON 87411 es más superior a otros eventos de maíz disponibles para controlar el gusano de la raíz del maíz (Tabla 9).
TABLA 9. Clasificación de daño de la raíz (RDR) bajo alta presión de infestación del gusano de la raíz del maíz. (N = el número de lantas evaluadas .
Una medida de la eficacia de los eventos transgénicos del gusano de la raíz del maíz es determinar la aparición de escarabajos adultos desde el suelo en macetas de plantas cultivadas en un invernadero. Para determinar la emergencia del escarabajo adulto del gusano de la raíz del maíz del suelo de plantas con el evento MON 87411 cultivadas en macetas, se germinaron de 10 a 15 plantas en macetas que contenían tierra infestada con huevos del WCR, similar a lo descrito anteriormente. Durante el período de crecimiento, cada planta de maíz se cubrió con una bolsa de malla para contener los escarabajos adultos emergentes.
Se hicieron recuentos de escarabajos adultos sobre el suelo a las 6, 12 y 18 semanas después de la emergencia de la planta y al final del ensayo se evaluaron las raíces para determinar la RDR. Las plantas que contenían el evento m On 87411 se compararon con las plantas de control negativo y otros eventos transgénicos protectores del gusano de la raíz del maíz. Los resultados fueron que se observó que emergieron significativamente menos escarabajos de los suelos, en los que se habían sembrado plantas con el evento MON 87411 en comparación con otros eventos transgénicos protectores del gusano de la raíz del maíz, ilustrando las propiedades superiores del evento MON 87411 para proteger contra el daño del gusano de la raíz del maíz.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra que la orientación de expresión de dos promotores diferentes en una célula de maíz, cada expresión conductora de un agente tóxico diferente del gusano de la raíz del maíz puede resultar en relaciones significativamente mejoradas de eventos transgénicos que exhiben eficacia cuando se proporcionan en la dieta de larvas de gusanos de raíz de maíz.
Las células de maíz se transformaron con uno de los cuatro vectores de transformación de plantas diferentes, pMON120417, pMON120434, pMON120416, o pMON120419, y se obtuvieron eventos transgénicos que se regeneraron en plantas de maíz transgénicas.
Con referencia a la figura 4, todos los vectores de transformación de plantas contienen tres casetes de expresión 1,2 y 3, limitados en un extremo por un borde izquierdo de Agrobacterium (LB), y en el extremo opuesto por un borde derecho de Agrobacterium (RB). Un ARNbc tóxico del gusano de la raíz del maíz se expresa a partir del casete 1 en los cuatro vectores desde un promotor mejorado del virus del mosaico de la coliflor 35S (e35S). Una proteína toxina del gusano de la raíz del maíz, Cry3Bb, en los vectores pMON120417, pMON120434 se expresa desde el casete 2 de un promotor Zm.PIIG. Una proteína toxina del gusano de la raíz del maíz, Cry3Bb, en los vectores pMON120416, pMON 120419 se expresa desde el casete 2 de un promotor Os.Rcc3. En los cuatro vectores, una proteína, que confiere tolerancia a herbicida glifosato, CTP-EPSPS CP4, se expresa desde el casete 3 de un promotor Os.TubA3. En los cuatro vectores, el casete 1 y el casete 3 están en la misma orientación relativa. Con referencia a la figura 4, las flechas de bloque indican la dirección de la expresión del promotor en cada uno de los respectivos casetes.
La orientación relativa del casete 2 en los vectores pMON120417 y pMON120434 se invierte, como lo ilustran las flechas de bloque (Figura 4) que indican la dirección de expresión del promotor. La expresión de la proteína de la toxina del gusano de la raíz de maíz Cry3Bb en pMON120417 desde el casete 2 es divergente de la dirección de expresión del ARNbc tóxico del gusano de la raíz de maíz expresado desde el casete 1. La expresión de la proteína de la toxina del gusano de la raíz de maíz Cry3Bb en pMON120434 desde el casete 2 tiene la misma orientación que la expresión del ARNbc tóxico del gusano de la raíz del maíz del casete 1.
La orientación relativa del casete 2 en los vectores pMON120416 y pMON120419 se invierte, como lo ilustran las flechas de bloque (Figura 4) que indican la dirección de expresión del promotor. La expresión de la proteína de la toxina del gusano de la raíz de maíz Cry3Bb en pMON120416 desde el casete 2 es divergente de la dirección de expresión del ARNbc tóxico del gusano de la raíz de maíz expresado desde el casete 1. La expresión de la proteína de la toxina del gusano de la raíz de maíz Cry3Bb en pMON120419 desde el casete 2 tiene la misma orientación que la expresión del ARNbc tóxico del gusano de la raíz del maíz del casete 1.
Como se ve en la Tabla 10, cuando se proporcionó tejido de plantas de maíz transgénicas en la dieta de especies de Diabrotica de gusanos de raíz de maíz, las plantas generadas por transformación con la construcción pMON120417 o pMON120416 (expresión divergente de los componentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz) fueron más eficaces con respecto a la actividad pesticida en comparación con las plantas generadas por transformación con la construcción pMON120434 o pMON120419 (en tándem o con la misma orientación de expresión) (Tabla 10). La relación de eventos eficaces generados a partir de la transformación usando los vectores pMON120417 y pMON120416, en comparación con la proporción de eventos eficaces de los vectores pMON120416 y pMON120419, fue significativamente mayor como lo muestran los datos en la Tabla 10. Por ejemplo, para eventos generados a partir del vector pMON120417 con la expresión dirigida por el promotor divergente de los componentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz, 11 de 43 eventos, o casi el 25 % de los eventos exhibieron un control eficaz del gusano de la raíz. En cambio, no se obtuvieron eventos eficaces para los eventos generados a partir del vector pMON120434 con la expresión dirigida por el promotor en la orientación en tándem de los componentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz. Para eventos generados a partir del vector pMON120416 con la expresión dirigida por el promotor divergente de los componentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz, 17 de 27 eventos, o aproximadamente el 63 % de los eventos exhibieron un control eficaz del gusano de la raíz. En cambio, solo se obtuvieron aproximadamente un 18,5 % de eventos eficaces para eventos generados a partir del vector pMON 120419 con la expresión dirigida por el promotor en la orientación en tándem de los componentes tóxicos del gusano de la raíz del maíz. Estos datos demuestran el número significativamente mejorado de eventos eficaces y mejores proporciones de eventos transgénicos que exhiben eficacia, cuando las plantas de maíz transgénicas se generan a partir de un vector de transformación de plantas con dos promotores diferentes, cada uno impulsando la expresión en direcciones divergentes de dos agentes tóxicos diferentes del gusano de la raíz del maíz, y las plantas de maíz transgénico se proporcionan en la dieta de las larvas de gusano de la raíz del maíz.
Tabla 10. Resultados que muestran el número de eventos R0 y el número de eventos eficaces obtenidos de cuatro
Claims (10)
1. Una molécula de ADN recombinante detectable en una muestra que contiene ADN de maíz, en la que la secuencia de nucleótidos de dicha molécula se:
(a) selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 o;
(b) es una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a (a),
en la que la presencia de tal molécula de ADN es diagnóstica para la construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha muestra comprende una planta de maíz, célula de planta de maíz, semilla de maíz, planta de maíz de descendencia, o parte de planta de maíz.
3. Una molécula de ADN que comprende un segmento de polinucleótido de longitud suficiente para funcionar como una sonda de ADN que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 en una muestra, en la que dicha sonda hibrida específicamente en dichas condiciones con uno o más segmentos de unión de diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 como se expone en la SEQ ID NO: 26, y en la que la detección de la hibridación de dicha sonda de ADN en dichas condiciones de hibridación es diagnóstica para la construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
4. Un par de moléculas de ADN que comprende una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, en el que dichas primera y segunda moléculas de ADN comprenden cada una un segmento de polinucleótido de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o s Eq ID NO: 4 para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una muestra que contiene la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 como ADN de molde para producir un amplicón diagnóstico para el ADN que comprende dicha construcción en dicha muestra, en el que dicho amplicón comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52.
5. Un procedimiento de detección de la presencia de un segmento de ADN diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto dicha muestra con la molécula de ADN de la reivindicación 3;
(b) someter dicha muestra y dicha molécula de ADN a condiciones de hibridación rigurosas; y
(c) detectar la hibridación de dicha molécula de ADN con dicho segmento de ADN diagnóstico para la construcción comprendida dentro el evento de maíz MON 87411,
en el que dicha etapa de detección es diagnóstica para la presencia de dicha construcción comprendida dentro de la molécula del evento de maíz MON87411 en dicha muestra.
6. Un procedimiento de detección de la presencia de un segmento de ADN diagnóstico para la construcción comprendida dentro del evento de maíz MON 87411 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto dicha muestra con el par de moléculas de ADN de la reivindicación 4;
(b) realizar una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón de ADN; y
(c) detectar la presencia de dicho amplicón de ADN en dicha reacción,
en el que dicho amplicón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, en el que dicha detección de la presencia de dicho amplicón es diagnóstica para la presencia de dicha construcción comprendida dentro del ADN del evento de maíz MON 87411 en dicha muestra.
7. Una planta de maíz, o parte de planta de maíz de la misma que comprende la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1 y que comprende el evento de maíz MON 87411.
8. Una planta de maíz, o parte de planta de maíz de la misma que comprende ADN funcional como molde cuando se analiza en un procedimiento de amplificación de ADN, en la que la secuencia de nucleótidos de dicho ADN se:
(a) selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 o;
(b) es una secuencia de nucleótidos completamente complementaria a (a),
en el que la realización de dicho procedimiento de amplificación de ADN utilizando dicho molde produce un amplicón
diagnóstico para la presencia de la construcción comprendida dentro del evento MON 87411, en el que una muestra representativa de semilla que comprende el evento de maíz MON87411 se ha depositado con el N.° de referencia de la ATCC PTA-12669.
9. Un procedimiento para la protección del rendimiento de plantas de maíz que comprende, cultivar las plantas de maíz de la reivindicación 7 en un campo y tratar dicho campo que comprende dichas plantas de maíz con una cantidad eficaz de glifosato para controlar el crecimiento de malas hierbas.
10. Un microorganismo que comprende una cantidad detectable de la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261644368P | 2012-05-08 | 2012-05-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2903185T3 true ES2903185T3 (es) | 2022-03-31 |
Family
ID=49551447
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13787568T Active ES2746748T3 (es) | 2012-05-08 | 2013-05-08 | Evento de maíz MON 87411 |
| ES17170125T Active ES2903185T3 (es) | 2012-05-08 | 2013-05-08 | Evento de maíz MON 87411 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13787568T Active ES2746748T3 (es) | 2012-05-08 | 2013-05-08 | Evento de maíz MON 87411 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US9441240B2 (es) |
| EP (2) | EP2846621B1 (es) |
| JP (1) | JP6315481B2 (es) |
| CN (1) | CN104427861B (es) |
| AR (2) | AR090981A1 (es) |
| BR (1) | BR112014027503B1 (es) |
| CA (1) | CA2872183C (es) |
| CL (1) | CL2014003010A1 (es) |
| CO (1) | CO7151535A2 (es) |
| CR (1) | CR20140557A (es) |
| ES (2) | ES2746748T3 (es) |
| MX (2) | MX371413B (es) |
| RU (1) | RU2648155C2 (es) |
| UA (2) | UA126903C2 (es) |
| UY (1) | UY34799A (es) |
| WO (1) | WO2013169923A2 (es) |
| ZA (1) | ZA201407692B (es) |
Families Citing this family (108)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6315481B2 (ja) | 2012-05-08 | 2018-04-25 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシイベントｍｏｎ８７４１１ |
| US9365863B2 (en) | 2013-05-08 | 2016-06-14 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for deploying a transgenic refuge seed blend |
| BR102014031844A2 (pt) | 2013-12-20 | 2015-10-06 | Dow Agrosciences Llc | ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros |
| KR20160093728A (ko) | 2013-12-20 | 2016-08-08 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 딱정벌레류 해충에 대한 저항성을 부여하는 rnapii-140 핵산 분자 |
| WO2015142571A1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | Monsanto Technology Llc | Transgenic maize event mon 87419 and methods of use thereof |
| BR102015010313A2 (pt) | 2014-05-07 | 2020-12-01 | Dow Agrosciences Llc | Moleculas de ácido nucleico dre4 que conferem resistência a pragas coleópteras |
| US20160194658A1 (en) | 2014-12-22 | 2016-07-07 | Dow Agrosciences Llc | Nucampholin nucleic acid molecules to control coleopteran insect pests |
| US20160264991A1 (en) | 2015-03-13 | 2016-09-15 | Dow Agrosciences Llc | Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests |
| CN104830847B (zh) * | 2015-04-30 | 2019-01-11 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测玉米植物dbn9936的核酸序列及其检测方法 |
| CN104830983B (zh) * | 2015-04-30 | 2019-01-15 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测玉米植物dbn9968的核酸序列及其检测方法 |
| CN104878091B (zh) * | 2015-04-30 | 2019-05-17 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测玉米植物dbn9978的核酸序列及其检测方法 |
| CN104878095B (zh) * | 2015-04-30 | 2018-10-26 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9858的核酸序列及其检测方法 |
| BR102016012010A2 (pt) | 2015-05-29 | 2020-03-24 | Dow Agrosciences Llc | Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica |
| CN105063068A (zh) * | 2015-07-17 | 2015-11-18 | 河南省农业科学院 | 编码突变的epsps基因、其表达载体、表达产物及其应用 |
| EP3347475B1 (en) | 2015-09-11 | 2022-11-16 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| EP3922100A1 (en) | 2015-10-12 | 2021-12-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Biologicals and their use in plants |
| CN105766992B (zh) * | 2016-03-22 | 2018-06-22 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 除草剂耐受性蛋白质的用途 |
| CN105746255B (zh) * | 2016-03-22 | 2019-01-11 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 除草剂耐受性蛋白质的用途 |
| CN110062579B (zh) * | 2016-12-12 | 2023-06-27 | 先正达参股股份有限公司 | 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法 |
| BR112019011293A2 (pt) | 2016-12-19 | 2019-10-08 | Basf Se | compostos de fórmula i, intermediários, composição agroquímica, uso e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
| EP3342780A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-04 | Dow AgroSciences LLC | Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests |
| BR112019015338B1 (pt) | 2017-02-21 | 2023-03-14 | Basf Se | Compostos de fórmula i, composição agroquímica, semente revestida, uso dos compostos e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos |
| CA3056347A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| CN110621669A (zh) | 2017-05-04 | 2019-12-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类 |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US20200190043A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-06-18 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| CN107254526A (zh) * | 2017-06-22 | 2017-10-17 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 转基因玉米mon87411品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| US11076596B2 (en) | 2017-09-18 | 2021-08-03 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| EP3713936B1 (en) | 2017-11-23 | 2021-10-20 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| EP3740070A1 (en) | 2018-01-18 | 2020-11-25 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Alginate encapsulation of fungal microsclerotia |
| WO2019145221A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | BASF Agro B.V. | New agrochemical formulations |
| UA124660C2 (uk) * | 2018-02-02 | 2021-10-20 | Монсанто Текнолоджі Елелсі | Об'єкт кукурудзи mon87429 і спосіб його використання |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| US20200354321A1 (en) | 2018-02-07 | 2020-11-12 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| CN111801014B (zh) | 2018-03-01 | 2022-05-27 | 巴斯夫农业公司 | 氯氟醚菌唑的杀真菌组合物 |
| AU2019261281A1 (en) | 2018-04-27 | 2020-10-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event DP-023211-2 and methods for detection thereof |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| CR20210046A (es) * | 2018-07-30 | 2021-06-10 | Monsanto Technology Llc | Evento transgénico de maíz mon 95379 y métodos para su detección y usos |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| EP3870581B1 (en) | 2018-10-23 | 2023-06-14 | Basf Se | Tricyclic pesticidal compounds |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3893647A1 (en) | 2018-12-14 | 2021-10-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Biologicals and their use in plants |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| CA3122208A1 (en) | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Basf Se | Crystalline forms of 1-(1,2-dimethylpropyl)-n-ethyl-5-methyl-n-pyridazin-4-yl-pyrazole-4-carboxamide |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| US20220202017A1 (en) | 2019-05-29 | 2022-06-30 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| KR20220017940A (ko) | 2019-06-06 | 2022-02-14 | 바스프 에스이 | 살진균 n-(피리드-3-일)카르복사미드 |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
| BR112022020902A2 (pt) * | 2020-04-24 | 2023-01-24 | Monsanto Technology Llc | Evento de milho transgênico mon95275 e métodos para a detecção e seus usos |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP4143167B1 (en) | 2020-04-28 | 2024-05-15 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| WO2022089969A1 (en) | 2020-10-27 | 2022-05-05 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| KR20230121790A (ko) | 2020-12-14 | 2023-08-21 | 바스프 에스이 | 술폭시민 살충제 |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| EP4333616A1 (en) | 2021-05-03 | 2024-03-13 | Basf Se | Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| IL308534A (en) | 2021-05-18 | 2024-01-01 | Basf Se | New converted pyridines as fungicides |
| CA3219311A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Basf Se | New substituted quinolines as fungicides |
| CA3218900A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Wassilios Grammenos | New substituted pyridines as fungicides |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2023011958A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Basf Se | (3-pirydyl)-quinazoline |
| CN117794908A (zh) | 2021-08-02 | 2024-03-29 | 巴斯夫欧洲公司 | (3-喹啉基)-喹唑啉 |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| WO2023156402A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| WO2024028243A1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
| WO2024104818A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| WO2024104815A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| WO2024104822A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted tetrahydrobenzodiazepine as fungicides |
| WO2024104823A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | New substituted tetrahydrobenzoxazepine |
| EP4389210A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-26 | Basf Se | Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests |
| CN116640761B (zh) * | 2023-07-20 | 2023-09-22 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 转基因玉米事件lp018-1及其检测方法 |
| CN116676304B (zh) * | 2023-07-20 | 2023-09-26 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 转基因玉米事件lp016-1及其检测方法 |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US6069298A (en) * | 1993-02-05 | 2000-05-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods and an acetyl CoA carboxylase gene for conferring herbicide tolerance and an alteration in oil content of plants |
| US6648930B2 (en) * | 1999-02-11 | 2003-11-18 | Renessen Llc | Products comprising corn oil and corn meal obtained from high oil corn |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| US6252148B1 (en) | 1999-12-06 | 2001-06-26 | Holden's Foundation Seeds Llc | Inbred corn line LH244 |
| BRPI0100752B1 (pt) * | 2000-06-22 | 2015-10-13 | Monsanto Co | moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna |
| US20060127889A1 (en) | 2000-07-25 | 2006-06-15 | Dotson Stanton B | Method for assessing transgene expression and copy number |
| US9816104B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-11-14 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for deploying a transgenic refuge as a seed blend |
| US7612194B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-11-03 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof |
| UA87808C2 (ru) | 2002-07-29 | 2009-08-25 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | Зерновые растения pv-zmir13 (mon863) и композиции и способы их обнаружения |
| EP1620571B1 (en) | 2003-05-02 | 2015-07-01 | Dow AgroSciences LLC | Corn event tc1507 and methods for detection thereof |
| PL1687435T3 (pl) | 2003-11-17 | 2012-02-29 | Bayer Cropscience Nv | Odporność na owady z użyciem hamowania ekspresji genów |
| WO2005059103A2 (en) | 2003-12-15 | 2005-06-30 | Monsanto Technology Llc | Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof |
| CN102260668B (zh) | 2004-03-25 | 2016-08-10 | 辛根塔参与股份公司 | 玉米事件mir604 |
| CA2562022C (en) | 2004-04-09 | 2016-01-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| AU2005292090B2 (en) | 2004-09-29 | 2011-02-03 | Corteva Agriscience Llc | Corn event DAS-59122-7 and methods for detection thereof |
| US8404927B2 (en) | 2004-12-21 | 2013-03-26 | Monsanto Technology Llc | Double-stranded RNA stabilized in planta |
| US8088976B2 (en) | 2005-02-24 | 2012-01-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof |
| AR053269A1 (es) | 2005-05-16 | 2007-04-25 | Monsanto Technology Llc | Plantas y semillas de maiz con mejoramiento de asparagina y proteina |
| EP3508582B1 (en) | 2005-09-16 | 2021-01-13 | Monsanto Technology LLC | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| US20070259785A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-11-08 | Monsanto Technology Llc | SELECTING AND STABILIZING dsRNA CONSTRUCTS |
| EP2021476B1 (en) | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| AP2726A (en) | 2006-06-03 | 2013-08-31 | Syngenta Participations Ag | Corn event MIR 162 |
| WO2009075860A2 (en) * | 2007-12-12 | 2009-06-18 | Monsanto Technology, Llc | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| US20120005773A1 (en) | 2008-10-01 | 2012-01-05 | Aasen Eric D | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| MX2011006292A (es) | 2008-12-16 | 2011-06-27 | Syngenta Participations Ag | Evento 5307 del maiz. |
| US20110258735A1 (en) | 2008-12-22 | 2011-10-20 | Marie Coffin | Genes and uses for plant enhancement |
| BR112012005592A2 (pt) | 2009-09-15 | 2017-05-02 | Donald Danforth Plant Science Center | geração de sementes oleaginosas produzindo alto poliidroxibutirato. |
| BR112012012404B1 (pt) | 2009-11-23 | 2019-03-06 | Monsanto Technology Llc | "molécula de dna reconbinante de amplicon, sonda de dna, par de moléculas de dna mètodo para detectar a presença de uma molècula de dna e kit de detecçao de dna". |
| KR101355918B1 (ko) | 2010-09-17 | 2014-02-05 | 서울여자대학교 산학협력단 | 유전자 변형 옥수수 ｍｏｎ８６３ 및 ｍｏｎ８１０ 검출용 키트 |
| JP6315481B2 (ja) | 2012-05-08 | 2018-04-25 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシイベントｍｏｎ８７４１１ |
| US9365863B2 (en) | 2013-05-08 | 2016-06-14 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for deploying a transgenic refuge seed blend |
| US20230000278A1 (en) | 2021-07-02 | 2023-01-05 | Ming-Chia Tai | Steam stove |
-
2013
- 2013-05-08 JP JP2015511667A patent/JP6315481B2/ja active Active
- 2013-05-08 CA CA2872183A patent/CA2872183C/en active Active
- 2013-05-08 MX MX2014013700A patent/MX371413B/es active IP Right Grant
- 2013-05-08 WO PCT/US2013/040173 patent/WO2013169923A2/en active Application Filing
- 2013-05-08 UA UAA201812984A patent/UA126903C2/uk unknown
- 2013-05-08 RU RU2014149189A patent/RU2648155C2/ru active
- 2013-05-08 EP EP13787568.8A patent/EP2846621B1/en active Active
- 2013-05-08 EP EP17170125.3A patent/EP3278661B1/en active Active
- 2013-05-08 AR ARP130101584A patent/AR090981A1/es active IP Right Grant
- 2013-05-08 CN CN201380033654.8A patent/CN104427861B/zh active Active
- 2013-05-08 ES ES13787568T patent/ES2746748T3/es active Active
- 2013-05-08 UY UY0001034799A patent/UY34799A/es active IP Right Grant
- 2013-05-08 ES ES17170125T patent/ES2903185T3/es active Active
- 2013-05-08 BR BR112014027503-3A patent/BR112014027503B1/pt active IP Right Grant
- 2013-05-08 US US13/890,027 patent/US9441240B2/en active Active
- 2013-05-08 UA UAA201413078A patent/UA120246C2/uk unknown
-
2014
- 2014-10-22 ZA ZA2014/07692A patent/ZA201407692B/en unknown
- 2014-11-06 CL CL2014003010A patent/CL2014003010A1/es unknown
- 2014-11-10 MX MX2019011997A patent/MX2019011997A/es unknown
- 2014-12-02 CO CO14264578A patent/CO7151535A2/es unknown
- 2014-12-03 CR CR20140557A patent/CR20140557A/es unknown
-
2016
- 2016-07-28 US US15/222,789 patent/US10316330B2/en active Active
-
2019
- 2019-05-06 US US16/404,513 patent/US11414672B2/en active Active
-
2020
- 2020-06-01 AR ARP200101546A patent/AR119062A2/es unknown
-
2021
- 2021-07-23 US US17/384,344 patent/US11859198B2/en active Active
- 2021-07-23 US US17/384,358 patent/US11788099B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-30 US US17/854,421 patent/US20230002783A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11788099B2 (en) | Corn event MON 87411 | |
| ES2869439T3 (es) | Evento transgénico de soja MON87751 y procedimientos para su detección y uso | |
| US7179965B2 (en) | Cry1F and Cry1Ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof | |
| US20200236887A1 (en) | Peronospora resistance in spinacia oleracea | |
| US20200017875A1 (en) | Peronospora resistance in spinacia oleracea | |
| US20190233841A1 (en) | Peronospora resistance in spinacia oleracea | |
| US11603538B2 (en) | Peronospora resistance in Spinacia oleracea | |
| US9365863B2 (en) | Compositions and methods for deploying a transgenic refuge seed blend | |
| CN104718293B (zh) | 大豆事件pDAB9582．816．15．1检测方法 | |
| CN115820630A (zh) | 玉米转化事件ld02的外源插入序列及其应用 | |
| CN115725571A (zh) | 玉米转化事件lg11的核酸序列及其检测方法 | |
| US20140189907A1 (en) | Transgenic cotton plants related to event 281-24-236 and to event 3006-210-23 | |
| BR122020001550B1 (pt) | Moléculas de dna recombinantes detectáveis em uma amostra contendo dna de soja, par de moléculas de dna, micro-organismo, bem como métodos para detecção da presença de um diagnóstico de segmento de dna para o evento de soja mon87751 dna em uma amostra, para proteção de uma planta de soja de pragas de insetos, para produção de uma planta de soja resistente a insetos e para determinação da zigosidade de uma planta de soja ou de semente de soja |