KR101355918B1

KR101355918B1 - 유전자 변형 옥수수 ｍｏｎ８６３ 및 ｍｏｎ８１０ 검출용 키트

Info

Publication number: KR101355918B1
Application number: KR1020100091732A
Authority: KR
Inventors: 최선희; 오용택; 한병돈; 류기현
Original assignee: 서울여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2014-02-05
Also published as: KR20120029733A

Abstract

본 발명은 (a) 유전자 변형 옥수수 MON810, MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 키트; 및 (b) 유전자 변형 옥수수 MON810 및 MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 변형 옥수수 MON810, MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출을 하는데 있어서 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 키트 및 마이크로어레이이다. 또한, 본 발명은 단일 뿐 만 아니라 복합적으로 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 동시에 검출함으로써, 유전자 변형 옥수수 여부의 검출 및 동정하는 시간 및 공정을 줄여줄 뿐 만 아니라 비용 면에서 경제적인 효과를 거둘 수 있는 장점을 가진다.

Description

유전자 변형 옥수수 ＭＯＮ８６３ 및 ＭＯＮ８１０ 검출용 키트{Kits for Detecting Genetically Modified Corn MON863 and MON810}

본 발명은 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 키트에 관한 것이다.

GMO(Genetically Modified Organisms)란 유전자 변형 식품을 뜻한다. 유전 공학 또는 유전자 조작(genetic engineering)이란 한 종으로부터 유전자를 얻은 후에 이를 다른 종에 삽입하는 기술을 뜻하는 것으로 이러한 방식으로 만들어진 생명체를 GMO라고 한다. 1994년 칼진사의 무르지 않는 토마토가 최초로 미국 식품 의약청(FDA)의 승인을 얻어 시판된 이후, 1966년 몬산토사의 유전자 조작 콩이 상업적으로 대규모 재배되기 시작하였다.

GMO는 질병에 강하고 소출량이 많아 식량난을 해소할 수 있다는 장점이 있으나 GMO 식품을 장기간 섭취할 경우에도 인간에 무해하다는 점이 분명하게 검증된 바가 없으며, GMO 품종으로 인해 생태계가 교란되는 등 환경재앙이 발생할 수도 있다는 위험성을 안고 있다. GMO 식품을 보는 시각은 미국과 서유럽 간에 크게 다르다. 유전자 기술이 앞선 미국의 경우 슈퍼마켓에서 팔리는 식품의 절반 이상이 GMO를 함유하고 있으며, 미국 국민들의 절대 다수는 GMO 식품이 안전하다고 신뢰한다. 그러나 서유럽 국가의 환경단체들은 GMO 곡물을 ‘프랑켄슈타인 식품’이라고 부르며 일반 대중도 이를 기피하고 있는 실정이다.

현재 전 세계적으로 유통되고 있는 GM0는 콩, 옥수수, 감자 등 약 50여 개 품목이며, 국내 유통 중인 GM0도 39개 품목이다. 특히 국내에서 시판되고 있는 두부의 82%가 유전자변형 콩이 섞인 원료로 만들어졌다는 발표로 국내에서도 유전자식품의 유해성 여부가 문제가 되었다. 예컨대, 브라질너트(Brazil nut)의 일부 유전자를 콩에 넣어 만든 GMO콩이 알레르기를 일으킨다는 사실이 밝혀져 개발이 중단된 사례가 있었다.

현재 유전자 변형 생물체에 도입된 외부 유전자로는 EPSPS(enolpyruvylshikimate-3-phophate synthase), PAT(Phosphinothricin acetyl transferase) 및 BT(Bacillus thuringiensis)의 cry(crystal 단백질) 계열의 유전자 등이 가장 대표적이다. EPSPS 유전자는 글리포세이트(glyphosate)라는 제초제에, PAT 유전자는 글루포시네이트(gluphosinate)라는 제초제에 내성을 갖도록 하는 유전자이며, cry 계열 유전자는 해충 저항성을 갖도록 하는 유전자이다(Harrison et al., The Journal of Nutrition 126:728-740(1996); Crickmore et al., Microbiology and molecular biology reviews. Sept p.807-813(1998)). 상기 유전자를 포함하는 유전자 변형 생물체에는 글리포세이트/해충 내성 옥수수(Agrobacterium sp. 종 CP4 EPSPS 유전자 + Ochrobactrum anthropi의 glyphosphate oxidoreductase 유전자 포함, 몬산토사), 글리포세이트 내성 면실(Agrobacterium spp. CP4 EPSPS 유전자 포함), 글리포세이트 내성 캐놀라(Agrobacterium spp. CP4 EPSPS 유전자 포함), 글루포시테이트 내성 옥수수(Streptomyces hygroscopicus의 phophinothricin acetyl hydrolase 유전자 포함, Dekalb Genetics Corp.), 글루포시네이트 내성 캐놀라(Streptomyces virodochromogenes의 PAT 유전자 포함, Agevo Inc.), 글로포시네이트 내성 옥수수(Streptomyces virdochromogenes의 PAT 유전자 포함), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, 몬산토사), 해충 내성 감자(cryIII A 유전자 포함, 몬산토사), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, Northrup King), 해충 내성 옥수수(cryIA(b) 유전자 포함, Ciba-Geigy Corp.) 등이 있다.

현재 많이 사용하고 있는 GMO 검사는 효소면역학적 방법(ELISA)과 PCR법으로 크게 나눌 수 있다(Rolf et al., Food Control 10; 391-399(1999)). 또는 유전자 변형 농작물의 경우에는 제초제 처리 등에 의한 생물학적 검정방법도 적용할 수 있다. 효소면역학적 방법은 유전자 변형 작물에 도입된 유전자에 의해 생산되는 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 진단하는 방법이나, 도입된 유전자가 발현되지 않는 기관의 경우에는 진단이 불가능하며, 검출감도가 PCR 검정법에 비해 떨어지고, 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있는 식품류에서의 검출에는 한계를 가지고 있다.

PCR 검정법은 GMO에 도입된 유전자 조절부위 또는 도입 유전자의 단편을 특이적으로 증폭하는 기술로 원료 농산물은 물론 가공품에서도 검정이 가능하며 0.01%까지 검정이 가능하다. 1차적으로 PCR(중합연쇄축합반응)을 이용한 유전자의 단일 검사로서 GMO에 도입된 외부 유전자의 발현을 조절하는 프로모터나 전사종결부에 대한 특이 프라이머로 PCR하여 검정하고 있으며, 1차에서 검출이 된 경우, 2차에서 좀 더 정확한 GMO 포함여부를 확인하기 위해 실시간 PCR(Real time PCR)을 이용한 방법을 사용한다(Wurz et al., Food Control 10; 385-389(1999); Farid et al., Detection of genetically modified organisms in foods. Trends in Biotechnology Vol.20 No5; 215-223(2002)). 그러나, 이 방법은 각각의 GMO 유전자를 확인하기 위해 각각의 탐침을 이용하여 각각의 튜브에서 반응을 시키고 겔 상에서 확인해야 하므로, 많은 양의 검체 유전자와 인력 등이 필요하며, PCR 반응 완료 후 겔 상에서 증폭된 유전자 산물을 구별하기 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별되어야 하는 제약이 있다.

그러나, GMO 중 유전자 변형 옥수수인 MON863 및 MON810을 각각 또는 동시에 특이적이고 정확하게 검출할 수 있는 있는 방법은 아직까지 보고된 바가 없으며, 이에 따라 유전자 변형 옥수수인 MON863 및 MON810을 검출할 수 있는 신규한 검출 방법의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명자들은 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 각각 또는 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, MON810에 도입된 Cry1Ab 유전자의 말단 부분과 옥수수 유전체의 플랭킹 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 MON863에 도입된 whsp 17 유전자의 일부분과 옥수수 유전체의 플랭킹 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 각각의 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 각각 증폭시킨 후 증폭된 중합효소연쇄반응 산물에 각각의 특이적인 프로브를 혼성화를 통하여 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 각각 또는 동시에 특이적으로 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 변형 옥수수 MON810 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유전자 변형 옥수수 MON863 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 변형 옥수수 MON810 검출용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유전자 변형 옥수수 MON863 검출용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 유전자 변형(genetically modified) 옥수수 MON810 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 유전자 변형 옥수수 MON863 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 제1프라이머 세트; 및 (b)서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 제2프라이머 세트를 포함하는 MON863 및 MON810 검출용 멀티플렉스 키트를 제공한다.

본 발명자들은 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 각각 또는 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 키트를 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과, MON810에 도입된 Cry1Ab 유전자의 말단 부분과 옥수수 유전체의 플랭킹 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드와 MON863에 도입된 tahsp 17 유전자의 일부분과 옥수수 유전체의 플랭킹 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 각각의 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 각각 증폭시킨 후 증폭된 중합효소연쇄반응 산물에 각각의 특이적인 프로브를 혼성화를 통하여 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 각각 또는 동시에 특이적으로 검출할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 명세서에서의 표현 “옥수수 MON810”은 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis: Bt)으로부터 유래된 해충에 독성을 나타내는 Bt 단백질인 Cry1Ab 단백질을 생산하는 Cry1Ab 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수를 의미하며, 몬산토사에 의하여 개발되어 YieldGard라는 상표명으로 거래되고 있는 유전자 변형 옥수수이다.

또한, 본 발명의 명세서에서의 표현 “옥수수 MON863”은 해충 저항성을 갖는 옥수수로서, 토양 미생물인 바실러스 투린기엔시스 subsp. 쿠마모토엔시스로부터 딱정벌레목에 특이적인 살충 단백질 델타 내독소 Cry3Bb1 단백질을 생산하는 Cry3Bb1 유전자를 도입하여 옥수수에 막대한 피해를 입히는 옥수수 뿌리 벌레를 치사케 할 수 있는 유전자 변형 옥수수를 의미한다.

본 발명의 명세서에 표현 “후배교배종 이벤트 옥수수”는 유전자 변형된 옥수수들끼리 재교배한 옥수수를 의미한다.

용어 “상보적 또는 상보적인”은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라, RNA 방해 (interference) 기전을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있을 정도의 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. 본 명세서에서 100% 상보성을 표현하는 경우에는 “완전 상보적 (completely complementary)"으로 특별하게 기재된다.

본 발명의 키트에는 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어“상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 완전 상보적(perfectly complementary)으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 올리고뉴클레오타이드 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 올리고뉴클레오타이드 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 키트는 멀티플렉스 PCR 방법을 이용한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 올리고뉴클레오타이드 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 유전자 변형 MON810 검출용 키트는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 유전자 변형 MON863 검출용 키트는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명 MON810 검출용 키트, MON863 검출용 키트 및 MON863 및 MON810 검출용 멀티플렉스 키트는 (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 제3프라이머 세트; (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 제4프라이머 세트; 및 (c) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 제5프라이머 세트를 추가적으로 포함하며, 보다 바람직하게는, 제3프라이머 세트 내지 제5프라이머 세트, 그리고 (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 및 (c) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명에서 이용하는 프라이머 및 프로브의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 프라이머의 길이는 10-50개이며, 보다 바람직하게는 10-40개이고, 보다 더 바람직하게는 15-30개이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 MON810 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 MON863 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브; 및 (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 MON810 및 MON863 검출용 멀티플렉스 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명 마이크로어레이에 있어서, 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다.

본 발명에서 이용 가능한 기질은 당업계에 공지된 다양한 기질을 포함한다. 기질 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 고체 기질은 예를 들어, 실리콘 와퍼, 유리, 석영, 융합 실리카, 금과 같은 금속, 플라스틱 및 중합체[예컨대, 사이클로올레핀 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스틸렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 본 발명에서 이용하는 프라이머로 증폭된 DNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2‘-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바이오칩에 적용될 수 있는 일반적인 설명은, 미국 특허 제5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,412,087, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 및 6,428,752호게 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 바이오센서에 적용될 수 있는 일반적인 내용은, Myska, J. Mol. Recognit, 12:279-284(1999); J. Dubendorfer et al. Journal of Biomedical Optics, 2(4):391-400(1997); 및 O'Brien et al. Biosensors & Bioelectronics, 14:145-154(1999)에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 액상 비드 멀티플렉스 마이크로어레이이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브, (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브, 및 (c) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열 또는 이에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 중 10-100개 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 추가적으로 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 (a) 유전자 변형 옥수수 MON810, MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 키트; 및 (b) 유전자 변형 옥수수 MON810, MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 유전자 변형 옥수수 MON810, MON863 검출용 키트 및 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810 검출을 하는데 있어서 정확성 및 신뢰도가 크게 개선된 키트 및 마이크로어레이이다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 단일 뿐 만 아니라 복합적으로 유전자 변형 옥수수 MON863 및 MON810을 동시에 검출함으로써, 유전자 변형 옥수수 여부의 검출 및 동정하는 시간 및 공정을 줄여줄 뿐 만 아니라 비용 면에서 경제적인 효과를 거둘수 있는 장점을 가진다.

도 1은 유전자변형 옥수수 MON863 및 MON810에 형질 전환된 도입유전자에 대한 모식도와 서열목록 제1서열 및 제2서열의 올리고뉴클레오타이드의 영역을 나타낸 것이다. 패널 (a)는 유전자변형 옥수수 MON810에 형질 전환된 도입유전자에 대한 모식도이며, 패널 (b)는 형질 전환된 도입유전자에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 유전자변형 옥수수에 대한 유전자 검출용 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 실시한 결과이다. 각각의 시료(증류수, 비유전자변형 옥수수 지노믹 DNA, MON810 이벤트 DNA, MON863 지노믹 DNA, 후배교배종 이벤트 MON863 x MON810 지노믹 DNA)들를 주형으로 사용하고, 5가지 종류의 프라이머 세트를 첨가하여 멀티플렉스(PCR)을 실시하였다. 음성적 대조구로 물이 들어간 실험구에서는 어떠한 밴드도 검출되지 않았다. 비형질전환 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자를 검출할 수 있는 밴드만 확인되었다. MON810 이벤트 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S 및 MON810 고유의 염기서열이 확인되었다. MON863 이벤트 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S NOSt, 및 MON863 고유의 염기서열이 검출되었다. 후대교배종 이벤트 옥수수 MON863 x MON810 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S, NOSt, 및 MON810과 MON863 고유의 염기서열이 각각 검출되었다. M은 마커; 1은 음성대조구; 2는 비유전자변형 옥수수; 3은 유전자변형 옥수수 MON810; 4는 유전자변형 옥수수 MON863; 5는 유전자변형 옥수수 MON863 x MON810.
도 3은 유전자변형 옥수수 MON863 x MON810에 대한 유전자 검출용 멀티플렉스 액상 비드 어레이를 실시한 결과이다. 각각의 시료(증류수, 비유전자변형 옥수수 지노믹 DNA, MON810 이벤트 DNA, MON863 지노믹 DNA, 후배교배종 이벤트 MON863 x MON810 지노믹 DNA)들를 주형으로 사용하고, 5가지 종류의 프라이머 세트를 첨가하여, 멀티플렉스 PCR을 실시한 후, 태그가 첨가된 프로브와 비오틴 표지된 dCTP를 이용하여 2차 PCR을 실시하였다. 5종류의 안티태깅 마이크로 스피어(비드)와 혼성화 시킨 후, 비오틴-스트렙타비딘과의 반응을 통한 형광을 측정하였다. 고유한 스펙트럼 어드레스(spectral address)를 가진 태그를 추정하여, 비드의 번호, 즉, 프로브의 종류를 파악할 수 있고, 스트렙타비딘이 발현된 정도로 MFI 수치를 계산하여 그래프화 하였다. MFI의 cut -off 값은 100-150 사이하였으며, 100이하의 값은 반응하지 않은 것으로 판단하였다. 음성적 대조구로 물이 들어간 실험구에서는 어떠한 종류의 비드(프로브)와 형광도 검출되지 않았다. 비형질전환 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자를 검출할 수 있는 프로브만 반응하였다. MON810 이벤트 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S 및 MON810 고유의 염기서열이 검출되었다. MON863 이벤트 옥수수 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S NOSt, 및 MON863 고유의 염기서열이 검출되었다. 후대교배종 이벤트 옥수수 MON863 x MON810 실험구에서는 옥수수 내재유전자인 zein 유전자, 35S, NOSt, 및 MON810과 MON863 고유의 염기서열이 각각 검출되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

1. 프로브 염기서열 제작

GM(Genetically modified) 작물의 제작에 통상적으로 사용되는 35S 프로모터, NOS 터미네이터, MON810 및 MON 863 이벤트 특이적인 염기서열 부분 및 옥수수의 내재 유전자인 zein의 5종류에 대한 프로브를 제작하였다. 이들 프로브의 염기서열을 제작하기 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 유전자 데이터베이스에서 가능한 염기서열 정보를 얻은 후, 그들 간에 높은 상동성을 가지는 부분을 정하여 각각 목표 유전자에 대한 프로브 염기서열을 디자인하였다(표 1). 표 1은 GM 옥수수 검정용 프로브의 염기서열을 나타낸 것이다.

액상 비드 어레이(Liquid bead array)를 실시하기 위하여, 표 1에 제시된 염기서열의 5’ 말단에 고유한 24 개의 염기서열인 태그(tag) 염기서열을 연결하였다(http://www.luminexcorp.com/support/protocols/xtag_protocols.htm). 이 염기서열은 액체 마이크로어레이(liquid micro array)를 수행하기 위하여 사용되는 마이크로비드에 부착된 24개의 고유한 안티-태그 염기서열(anti-tag sequence)에 상보적인 태그 염기서열로서, 이 서열을 프로브 5’말단 부분에 연결하여 액체 비드 어레이에 사용하였다. 태그에 해당하는 염기서열은 총 100개의 비드 안티-태그에 특이적 상보성을 보이는 것(www.luminexcorp.com)으로 이를 이용해 프로브와 반응하는 PCR 산물과 비드와의 혼성화(hybridization) 반응이 일어났는지를 판단할 수 있다(Wilson et al., 2005; Dunbar, 2006).

프로브	염기서열(5’->3’)	태그 염기서열	태그 및 안티-태그 세트 번호
MON810 (서열번호 16)	GAAAGTCCTCGTTCAGGTCG	CTTTTACAATACTTCAATACAATC	20
MON863 (서열번호 17)	TCCGGTCTCCCTATAGAGCA	CTACAAACAAACAAACATTATCAA	28
35S (서열번호 18)	TTGCTTTGAAGACGTGGTG	CTTTAATCTCAATCAATACAAATC	1
NOS (서열번호 19)	CCTAGTTTGCGCGCTATA	TCAACAATCTTTTACAATCAAATC	6
zein (서열번호 20)	CCCTGATGCTGCAGCAACTG	TCAAAATCTCAAATACTCAAATCA	18

2. GM 옥수수로부터 지놈 DNA 추출

위자드 지노믹 DNA 정제 키트(wizard genomic DNA purification kit; Promega, 미국)를 이용하여 비유전자변형 옥수수(ERMBF417A, Sigma-Alfrich, 미국), MON810 이벤트 옥수수(ERMBF413F, Sigma-Alfrich, 미국), MON863 이벤트 옥수수(ERMBF416D, Sigma-Alfrich, 미국) 및 후대교배종 이벤트 MON863 x MON810 옥수수(ERMBF417D, Sigma-Alfrich, 미국)로부터 지놈 DNA를 각각 추출하였다. 키트를 이용하여 각각의 옥수수로부터 지노믹 DNA를 추출하는 방법은 다음과 같다.

우선, 1.5 ㎖ 튜브에 옥수수 커넬 파우더 100 mg을 넣고 액체질소를 이용하여 그라인딩하였다. 그라인딩된 옥수수 포함가 튜브에 600 ㎕ 핵산 라이시스 용액을 첨가한 후 65℃에서 15분 동안 반응시켰다. 그 다음, 반응물이 포함된 튜브에 200 ㎕ 단백질 침전 용액을 첨가하고 20초간 볼택싱(voltexing)한 후 12000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 후 분리된 상층액 600 ㎕을 프래쉬한 1.5 ㎖ 튜브에 옮긴 후, 동량의 이소프로판놀로 혼합하고 12000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 튜브 바닥에 잔존하는 펠릿(pellet)만을 남기고 상층액을 제거하고 100% 에탄올 500 ㎕을 첨가한 후 12000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그 다음, 펠릿만 남기고 상층액을 제거한 후 실온에서 10동안 에어 드라이(air dry)를 하였다. 건조된 튜브에 DNA 수화 용액 100 ㎕을 넣어준 후 65℃에서 30분 동안 인큐베이션 시킨 후 스핀(spin)하여 분리된 상층액을 본 연구를 위한 시료로 이용하기 위하여 보관하였다.

3. 액상 비드 어레이 시스템을 이용한 프로브의 유효성 검정

검정 목표 유전자를 멀티플렉스 PCR을 이용해 동시에 증폭한 후, 표 1의 염기서열을 가지며 5’말단에 고유한 24개의 태그 염기서열을 가지는 프로브를 이용하여 액체 비드 어레이 검정을 실시하였다.

3.1. 멀티플렉스 증합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)

GM 옥수수 두 종류와 그들의 후대교배종 스택 이벤트(stack event)를 대상으로 대상 유전자를 동시에 검정하는 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. MON810의 프라이머는 도입된 Cry1Ab 유전자의 말단 부분과 옥수수 유전체의 플랭킹(flanking) 유전자를 포함하여 증폭하도록 디자인되었으며, MON863의 프라이머는 도입된 유전자의 전사 종결 신호(terminator signal)인 T-tahsp17의 일부분과 옥수수 유전체의 플랭킹 유전자를 포함하여 이벤트 특이적 검출이 가능하도록 제작하였다(Shrestha et al., 2005). 형질전환용 벡터 유래 대상 유전자로서는 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 아그로박테리움 투메파시언스(agrobacterium tumefaciens) 3’NOS 터미네이터 유전자를 이용하였으며, 작물 내재 유전자로 zein 유전자를 이용하였고(표 2; Shrestha et al. (2008), 접근번호. AB303064), 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. PCR 조성은 25 ㎕의 2 x Max Taq Hot start master mix (BioQuest, 대한민국), 10 pmole의 각각의 5세트 프라이머, 20 ng의 주형(template)과 3차 증류수를 최종 50 ㎕로 조성하였다.

프라이머	염기서열(5'->3')	산물 크기(bp)
MON810 F (서열번호 6)	CACCACAGCCACCACTTCT	150
MON810 R (서열번호 7)	AGGAAAAGCTATTGTAAAGCCAAA	150
MON863 F (서열번호 8)	GTAATCGGCTAATCGCCAAC	224
MON863 R (서열번호 9)	GCCAGTTCATTGCGAGTACA	224
35S F (서열번호 10)	GACAGTGGTCCCAAAGATGGAC	115
35S R (서열번호 11)	CCTTACGTCAGTGGAGATATC	115
NOS F (서열번호 12)	CTGTTGCCGGTCTTGCGATG	185
NOS R (서열번호 13)	GCGCGATAATTTATCCTAGTTTG	185
zein F (서열번호 14)	GCTTGCGGAGCTTGATGGCGT	72
zein R (서열번호 15)	GGCATCGTCTGAAGCGGTAAGG	72

PCR은 써멀 사이클러(thermal cycler; MyCycler, BioRad, USA)를 이용하였고, 멀티플렉스 PCR 조건은 95℃ 15분 전처리를 거쳐, 94℃ 30초, 60℃ 1분, 72℃ 1분으로 35 사이클링 하고, 72℃에서 10분간 후처리하였다. 이어 PCR 산물은, 2차 PCR을 통해 프로브와 반응하여 비오틴 표지된 dCTP로 선형 증폭(linear amplifiation)에 사용하였다.

3.2 액체 비드 어레이 제조

3.2.1 비드 조제

24개 안티-태그가 커플링된 비드와의 반응을 위하여, 반응시키고자 하는 비드(FlexMAP beads, Tm Bioscience, Toronto, Canada)를 균일하게 혼합한 후 40 ㎕ (4-5 x 10⁵beads/㎕) 씩을 취하였다. 각각의 비드에 0.1 M MES (N-morpholino-ethanesulfonic acid; pH 4.5 Sigma-Aldrich, 미국) 20 ㎕를 혼합하고 준비된 안티-태그를 2 ㎕씩 덜어서 비드와 섞어 준 후, 10 ㎖/㎖ EDC (Ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma-Aldrich, 미국) 용액 1 ㎕를 넣고 반응시켰다. 비드는 빛에 매우 민감하므로, 어두운 곳에서 약 30분간을 잘 교반하면서 반응시켰고, 다시 새로 만든 10 ㎖/㎖ EDC 용액을 추가로 1 ㎕ 넣고 약 20분간 반응시켰다. 이후 각 튜브에 500 ㎕의 0.02% Tween-20 용액을 넣어서 잘 섞어 주었으며, 각 튜브의 비드를 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 다시 500 ㎕의 0.1% SDS 용액으로 잘 혼합하였다. 각 튜브의 비드를 다시 원심 분리하여 상층액을 걷어주고, 이후 150 ㎕의 TE(pH 8.0) 버퍼에 녹여 잘 섞은 후, 4℃ 암실에서 보관 또는 즉시 실험에 사용하였다.

3.2.2 2차 단일 가닥 PCR과 비오틴 dCTP를 이용한 단일가닥의 형성

2차 단일 가닥 PCR은 멀티플렉스 PCR 단계에서 만들어진 GM 옥수수의 PCR 산물을 주형으로 사용하여, 바이오틴(biotin)-dCTP를 합성기질로 넣어 선형 증폭을 수행하였다. 표지를 위해 PCR 산물 1 ㎕를 사용하였고, 0.5 프로브, 50 uM dATP, dGTP 및 dTTP 믹스(Invitrogen), 20 uM 바이오틴-dCTP (Invitrogen), 7.5 mM Tris HCl(pH 9.0), 0.2 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 2 mM (NH₄)₂SO₄및 Taq 폴리머라아제(Ultratools, 스페인) 1 U로 단일 가닥 선형 증폭을 수행하였다. 2차 단일 가닥 PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 94℃ 에서 30 초, 58℃ 에서 30 초 및 72℃ 에서 1분으로 35 사이클을 수행하였다.

2.2.3 혼성화 반응

2차 연쇄 중합 반응을 마친 산물은 2X TM (0.4M NaCl, 0.2M Tris, 0.16% Triton X-100, pH 8.0) 혼성화 버퍼에 용해시킨 후, 비드와의 혼성화 반응을 95℃ 에서 5분 및 37℃에서 30분 동안 실시하였다. 이 후, 반응물을 96-웰 2 마이크론 필터 플레이트(Millipore, Bedford, USA)에 옮기고, 진공 매니폴드(vacuum manifold)를 이용해 세척한 후, 1X TM 버퍼에 용해시켰다. 2번의 세척 단계를 거친 후, 필터에 흡착된 샘플은 최종적으로 2 ㎍/㎖ 스트렙타아비딘-R-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin; Sigma-Aldrich, USA)을 함유한 1X TM에 용해시킨 후 상온에서 15분간 반응시켰다. 이어서, 루미넥스 200 사이토메터 프로세서(Luminex Corp., Austin, USA)를 이용하여 각 웰 별로 비드를 읽었다. 루미넥스 200은 2개의 레이저를 이용하는데, 한 개는 비드 고유의 스펙트럼 어드레스(spectral address)를 가지는 비드 번호(유전자의 종류)를 다른 한 개는 반응된 피코에리트린의 양(포함된 양)을 계산하여 수치로 나타낸다. 이들 수치는 각각의 도입된 유전자를 대표하는 비드의 MFI (mean fluorescence intensity) 값으로 대변되고, 이를 통해 옥수수의 검정하고자 하는 유전자 등의 종류와 포함 정도를 판정하고자 하였다.

실험결과

1. GM 옥수수의 액상 비드 어레이를 이용한 유전자 검출

두 가지 종류의 Bt(bacillus thuringiensis) 유전자(Cry1Ab 및 Cry3Bb1)를 가진 후대교배종 이벤트 GM 옥수수(MON863 x MON810)와 각각의 유전자가 단일로 도입된 MON810과 MON863 이벤트를 대상으로 검정하고자 하는 유전자가 판별이 되는지를 확인하고자 하였다. 또한, 후대교배종 MON863 x MON810 이벤트에서 단일 이벤트의 결과와 일치하는지를 확인하고자 하였다.

1.1. GM 옥수수에서 멀티플렉스 PCR실시

아가로스 젤 상에서 전기 영동한 결과, 음성 대조구(negative control; 증류수만 포함된 시료)에서는 증폭된 산물을 발견할 수 없었으며, 비유전자변형 옥수수에서는 내재유전자로서 SPS 유전자만 증폭되었다. MON810은 35S 유전자를 보유하고 있는 반면, NOS 터미네이터는 보유하고 있지 않은데, PCR 결과에서도 상동의 결과를 보였다. MON863은 810 이벤트 특이적인 프라이머로는 증폭이 되지 않았고, MON863 이번트 특이적인 프라이머로만 증폭이 되었다. 두 가지 Bt 유전자가 집적된 후대교배종 이벤트 라인에서는 MON863 및 MON810 프라이머를 사용해서 모두 동시에 증폭이 됨을 확인하였다(도 2). 이 멀티플렉스 PCR 산물을 가지고, 각각의 프로브를 이용하여 액체 마이크로어레이를 실시하였다.

1.2. 멀티플렉스 액체 비드 어레이 시스템을 이용한 단일 및 후대교배종 이벤트 GM 작물 검정시험

총 3번의 실험 결과의 평균으로서의 MON810과 MON863 각각의 루미넥스 결과와 MON863 x MON810 후대교배종 이벤트 옥수수의 루미넥스 결과를 표 3과 도 3에 나타내었다. 수치의 유의성 최소치인 컷-오프 값은 150으로 지정하였다. 옥수수 종 특이 유전자 zein 비드와의 반응을 시킨 결과, 음성 대조군을 제외하고는 모든 샘플에서 반응을 하였음을 확인하였고, 35S 검출 비드와의 반응은 음성대조군과 비 GM을 제외하고는 GM 옥수수 모두에서 검출되었음을 확인하였다. NOS 터미네이터 비드와의 반응은 GM 옥수수에서 MON810을 제외하고는 MON863과 MON863 x MON810 후대교배종 이벤트 GM 옥수수에서 검출되었다. 표 3의 멀티플렉스 액체 비드 어레이의 결과를 MFI 값에 대한 표로 나타낸 것이며, 이 값을 이용한 그래프는 도 3에 나타내었다.

시료명	Zein	35S	NOS	MON810	MON863
음성대조구	65	31	61	84	75
비GM 옥수수	4340	36	89	44	45
MON810	3789	5804	37	4392	33
MON863	4124	5571	5022	23	4725
MON863 x MON810	3990	6571	4975	4772	4325

검토

GM 옥수수 MON810, MON863 및 후대교배종인 후대교배종 이벤트 GM 이벤트 MON863 x MON810을 대상으로, 도입된 외래 유전자를 검정하고자 액상 비드 어레이 검정용 프로브를 개발 하였다. 검정용 프로브는 총 5개로 벡터 콘스트럭트 특이적 프로브인 35S 프로모터용과 NOS 터미네이터용, 그리고 옥수수 종에 특이적인 내재유전자인 zein용이 있으며, MON810과 MON863 각각에 대한 이벤트 특이적 프로브를 제조하였다. 제조된 프로브들을 이용하여, 멀티플렉스 PCR 산물을 재료로 프로브와 반응한 2차 PCR 산물을 제조한 마이크로스피어 비드와 혼성화 반응을 시킨 후, 루미넥스 프로세서에서 형광을 체크하여 MFI 값으로 수치화하였다.

결론적으로 본 연구자들에 의하여 제작된 프로브들은 목적하는 유전자에 특이적으로 반응하였으며, 그 외는 크로스 반응을 나타내지 아니하였다. 또한, 단일 검정 결과와 동시다중 검정 결과에서도 결과 반응이 일치하였으며, Taq-맨 프로브 합성에도 이용된다면 실시간(real-time) PCR로 MON863 및 MON810 옥수수의 정량적 검출시 사용될 수 있을 것이다.

참고문헌

1. Dunbar SA (2006) Application of LuminexxMAP^TM technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection. Clin Chim Acta 363, 71-82.

2. Shrestha HK, Hwu KK, Wang SJ, Liu LF, and Chang MC (2008) Simultaneous detection of eight genetically modified maize lines using a combination of event- and construct-specific multiplex-PCR technique. J Agric Food Chem 56, 8962-8968.

3. Wilson WJ, Erler AM, Nasarabadi SL, Skowronski EW, and Imbro PM (2005) A multiplex PCR-coupled liquid bead array for the simultaneous detection of four biothreat agents Mol Cell Probes 19, 137-144.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 세트 및 서열목록 제16서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 프로브를 포함하는 유전자 변형(genetically modified) 옥수수 MON810 검출용 키트.
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서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드로 구성된 제1프라이머 세트 및 서열목록 제16서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제1프로브를 포함하는 유전자 변형 옥수수 MON810 검출용 멀티플렉스 키트.
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제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 키트는 (a) 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드 및 서열목록 제11서열의 뉴클레오타이드로 구성된 제2프라이머 세트; (b) 서열목록 제12서열의 뉴클레오타이드 및 서열목록 제13서열의 뉴클레오타이드로 구성된 제3프라이머 세트; 및 (c) 서열목록 제14서열의 뉴클레오타이드 및 서열목록 제15서열의 뉴클레오타이드로 구성된 제4프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 키트는 (a) 서열목록 제18서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제2프로브; (b) 서열목록 제19서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제3프로브; 및 (c) 서열목록 제20서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제4프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
서열목록 제16서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 프로브 및 (a) 서열목록 제18서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제2프로브, (b) 서열목록 제19서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제3프로브, 및 (c) 서열목록 제20서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제4프로브를 포함하는 유전자 변형 옥수수 MON810 검출용 마이크로어레이.
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서열목록 제16서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제1프로브 및 (a) 서열목록 제18서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제2프로브, (b) 서열목록 제19서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제3프로브, 및 (c) 서열목록 제20서열의 뉴클레오타이드로 이루어진 제4프로브를 포함하는 유전자 변형 옥수수 MON810 검출용 멀티플렉스 마이크로어레이.
제 9 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 액상 비드 멀티플렉스 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
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