CN108841990B

CN108841990B - 一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法

Info

Publication number: CN108841990B
Application number: CN201810793464.0A
Authority: CN
Inventors: 李文静; 刘菲; 周航
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN108841990A

Abstract

本发明公开了一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法，涉及转基因检测技术领域。该检测试剂盒包括下引物对中的一种或多种的组合：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16和SEQ ID NO.17‑18；采用该试剂盒检测转基因油菜品系，具有较高的特异性和灵敏度、检测结果准确可靠。

Description

一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及转基因检测技术领域，具体而言，涉及一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法。

背景技术

转基因作物在解决全世界日益严重的粮食危机的同时，也带来了食品安全和环境安全方面的诸多争议，世界各国都在逐步加强对重要目标食品中转基因油菜品系的监测与标识工作，并制定了相应的管理法规。随着转基因生物种类不断增加，被转入的外源基因的种类也越来越多，今后转基因产品的检测内容将增多，检测任务将越来越繁重。

据报道，1998年全球转基因油菜种植面积为240x10⁴ hm2占全球油菜种植面积的9%，1999年增至280x10⁴hm2，占全球油菜总面积的11%，2000年全球转基因作物面积为4420x10⁴ hm2，占全球作物种植面积的16%。

随着转基因作物在全球商业化种植的迅速发展，转基因食品的安全性也越来越引起争议，目前尚无定论。我国自1993年底正式颁布《基因工程安全管理方法》，对境内开展的基因工程生物实验做出了明确的规定。国务院也在2001年6月颁布《农业转基因生物安全管理条例》，明确要求在我国境内销售的含有转基因成分的产品应该有明确的标识。同时2002年农业部颁布了有关农业转基因生物的安全评价、进口、标识等管理办法和管理程序。

普通定性PCR法检测多指标、多样本时，效率低；巢式PCR法可以显著的提高检测灵敏度，引物设计难度较高，单次仅能检测一个指标，假阳性率高；多重PCR法可以在一个反应中同时扩增多个基因，常规的电泳检测分辨率不高，容易出现假阳性或假阴性结果；荧光定量PCR法检测灵敏度高，并行检测指标少，需要特定检测仪器，成本较高；目前，基因芯片法一般采用玻璃芯片作为固相支持物，杂交点荧光强度作为读出信号，需要特定检测仪器，操作相对复杂，检测成本高。

建立检测转基因油菜品系的膜芯片检测方法，与转基因检测定的传统方法比较，缩短了检测周期，提高了检测灵敏度，能够特异性的区分具有相同农艺性状的转基因大豆品系。该方法的建立，能够实现对转基因大豆品系进行快速、准确检测，满足我国国内以及进出口的农产品与食品中转基因检测与标识的法规需要。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因油菜品系的检测试剂盒，该检测试剂盒能够同时对常见的转基因油菜品系例如RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73等品系进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、操作便捷等特点。

本发明的另一目的在于提供转基因油菜品系的检测方法，该检测方法能够同时对常见的转基因油菜品系例如RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73等品系进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量等特点。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种转基因油菜品系的检测试剂盒，其包括核酸组合，所述核酸组合包括如下用于检测转基因油菜品系的引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的用于检测RF1品系的第一引物对，

包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的用于检测RF2品系的第二引物对，

包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的用于检测RF3品系的第三引物对，

包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的用于检测MS1品系的第四引物对，

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测MS8品系的第五引物对，

包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物的用于检测Topas19/2品系的第六引物对，

包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物的用于检测Oxy235品系的第七引物对，

包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物的用于检测T45品系的第八引物对，

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测RT73/GT73品系的第九引物对。

本发明提供的检测试剂盒中的引物对通过合理的设计，可以使得上述的9种引物对在同一PCR反应体系进行多重PCR，避免非特异性扩增，提高检测的灵敏度和特异性，能够同时对常见的转基因油菜品系RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73等实现检测。

例如使用上述试剂盒的检测方法可以是：以待测油菜样品的总DNA为模板，以上述9对特异性引物组合进行PCR扩增，各对引物的目标序列分别为转基因油菜品系特异性靶序列，同时以多重PCR扩增产物设计得到探针，将各探针固定在膜芯片上，最后将扩增产物与探针杂交后使用显色液显色，并通过肉眼或成像仪观察检测结果。如果样品中有相应的转基因成分则扩增出的PCR产物与对应的探针杂交，并被显色观察，实现检出效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括内参引物对，其包括SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物。

该内参引物对可检测油菜的内源性基因PEP的内参引物对，该内参引物对包括SEQID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.20-28所示的探针中的一种或多种。

各探针对应的扩增产物分别如下：

SEQ ID NO.20为RF1探针，可与第一引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.21为RF2探针，可与第二引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.22为RF3探针，可与第三引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.23为MS1探针，可与第四引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.24为MS8探针，可与第五引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.25为Topas19/2探针，可与第六引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.26为Oxy235探针，可与第七引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.27为T45探针，可与第八引物对的PCR产物杂交；

SEQ ID NO.28为RT73/GT73探针，可与第九引物对的PCR产物杂交。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片上还固定内参探针，其碱基序列如SEQ ID NO.33所示。该内参探针可与内参引物对的PCR产物杂交结合。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.29所示；

所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.30所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.19所示。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合，而不与阴性探针结合。因此，在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

存在于上游引物的5’端或下游引物的5’端的标记物可以使得扩增产物带有相应的标记物，当PCR产物与探针结合后，通过该标记物扩增产物易于与带有对应标记物的催化酶相结合，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置是否有相应的扩增产物，进而可判断样本中的转基因油菜品系类别。

当引物的5’端的标记物为生物素时，则可采用由碱性磷酸酶标记的催化酶（Streptavidin，SA）来进行显色反应。生物素与链霉亲和素具有极高的亲和力，反应呈高度专一性。每个链霉亲和素分子具有4个生物素分子结合位点，因此，链霉亲和素可同时以多价形式结合生物素。生物素标记的引物与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素联合使用，将检测信号级联放大，最后通过显色反应或化学发光可检测。

相应的，当引物的5’端的标记物为异硫氰酸荧光素时，则可采用由异硫氰酸荧光素抗体标记的催化酶来进行显色反应。当引物的5’端的标记物为地高辛，则可采用由地高辛抗体标记的催化酶来进行显色反应。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该检测试剂盒还包括PCR反应组分和配液；

其中，PCR反应组分包括UNG酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR缓冲液中的至少一种。

使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）移除DNA中的尿嘧啶，在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG酶敏感，所以可以在PCR前对新配制的反应体系用UNG酶处理，一定程度上杜绝气溶胶污染。dNTPs作为PCR反应的原料，应用于以原DNA为模板合成新的DNA序列；通过TaqDNA聚合酶的作用，DNA链更容易打开，使反应更容易进行；Mg²⁺作为TaqDNA聚合酶的活化剂，可以激活TaqDNA聚合酶的功能；PCR反应缓冲液，使反应在一个稳定的环境中反应，避免影响TaqDNA聚合酶的活性，进而影响反应的进行。PCR反应缓冲液使得反应顺利的进行。

另外，配液包括去活化液、去活化清洗液、杂交液、杂交清洗液、催化酶液、酶标液、酶标清洗液1、酶标清洗液2、显色液和显色清洗液。

其中，去活化液包括100 mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE和0.1% SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1% SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标清洗液2包括1 M Tris-HCl,pH9.5，5 M NaCl，1 M MgCl₂。

催化酶液为含有碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶，其用链霉亲和素、异硫氰酸荧光素抗体或地高辛抗体标记。在使用时，将催化酶液以合适比例加入到酶标液混合。

SSPE（Saline sodium phosphate EDTA，SSPE）缓冲液是一种常见的核酸杂交缓冲液；SSPE缓冲液包括NaCl、NaH₂PO₄•H₂O（或NaH₂PO₄•2H₂O）和EDTA-Na₂。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800ml蒸馏水溶解17.53g的NaCl，27.6g的NaH₂PO₄•H₂O（或31.2g的NaH₂PO₄•2H₂O）和7.4g的EDTA-Na₂，再用10M的NaOH大约6mL调节pH值至7.4，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

通过使用上述的各种配液，清除杂质，排除干扰，使结果更准确、清晰可靠。

显色液含有被催化酶催化反应进而显色的底物。

当催化酶是碱性磷酸酶时，显色液为碱性磷酸酶的化学显色底物NBT/BCIP，含0.15 mg/mL BCIP，0.30 mg/mL NBT，100 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，pH 9.5）；显色清洗液为双蒸水。

需要说明的是，在其他的一些实施例方案中，碱性磷酸酶也可以用辣根过氧化物酶代替。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，显色液含有的底物是TMB（Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺）、ABTS（2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）和OPD（o-Phenylenediamine、邻苯二胺）中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

或者用，葡萄糖氧化酶代替碱性磷酸酶，底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶（GOD）氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

总之，该检测试剂盒能够同时对常见的转基因油菜品系例如RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73等品系进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、操作便捷等特点。

另一方面，本发明提供了一种转基因油菜品系的检测方法，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有内参引物对和如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测RT73/GT73品系的第九引物对；

每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比大于1。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物（或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.2-1.7。

优选的，在本发明的一些实施方案中，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.5。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应体系还含有内参引物对，该内参引物对包括SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物。内参引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物，其标记物的类型和其他检测引物的类型相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR反应体系还含有用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.19所示。阳性寡核苷酸单链DNA分子的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物，其标记物的类型和其他检测引物的类型相同。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

所述杂交步骤包括：将由所述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.20-28所示的探针中的一种或多种。

将探针负载于膜芯片上，探针与PCR产物杂交，然后通过探针和引物上标记的标记物显色；通过显色反应，可以直接肉眼判定实验结果；方法简单易行。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述膜芯片选自硝酸纤维素膜、尼龙膜和具有三维孔径结构的薄膜中的任意一种。

选用硝酸纤维素膜、尼龙膜或具有三维孔径结构的薄膜中的一种作为支持膜，方便将探针负载于膜上制备膜芯片；如具有三维孔径结构的薄膜可以方便的将探针分子吸附固定在薄膜上，便于后续的反应的进行。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，膜芯片上固定有碱基序列如SEQ IDNO.33所示的内参探针。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，膜芯片上固定有碱基序列如SEQ IDNO.29所示的阳性对照探针和碱基序列如SEQ ID NO.30所示的阴性对照探针。

总之，该检测方法能够同时对常见的转基因油菜品系例如RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73等品系进行检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性好、高通量、结果易于观察等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的各探针固定在膜芯片上的位置示意图；

图2为本发明实施例3中的检测结果；

图3为本发明实施例4中的检测结果；

图4为本发明实施例5中的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例中所用的转基因油菜品系RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73购自深圳卓越生物科技有限公司。

实施例1

本实施例提供的转基因油菜品系的检测试剂盒包括核酸组合和膜芯片，其中，核酸组合包括10种引物对和阳性寡核苷酸单链DNA，各引物对如下：

用于检测RF1品系的第一引物对，扩增片段大小98bp：

其包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；

用于检测RF2品系的第二引物对，扩增片段大小157bp：：

其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；

用于检测RF3品系的第三引物对，扩增片段大小228bp：：

其包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

用于检测MS1品系的第四引物对，扩增片段大小114bp：

其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；

用于检测MS8品系的第五引物对，扩增片段大小106bp：

其包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；

用于检测Topas19/2品系的第六引物对，扩增片段大小110bp：

其包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；

用于检测O xy235品系的第七引物对，扩增片段大小197bp：

其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

用于检测T45品系的第八引物对，扩增片段大小134bp：

其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；

用于检测RT73/GT73品系的第九引物对，扩增片段大小176bp；

其包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物。

另外，针对油菜PEP内源基因的内参引物对包括SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQ ID NO.32所示的下游引物，扩增片段大小123bp。

阳性寡核苷酸单链DNA的碱基序列如SEQ ID NO.19所示。

每个引物对中的下游引物的5’端以及阳性寡核苷酸单链DNA的5’端带有生物素标记。

需要说明的是，在其他的实施例中，核酸组合可以包括第一至第九引物对中的一种或两种或三种或四种或五种或六种或七种或八种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

膜芯片上固定有探针，探针包括12种，各探针的碱基序列（5’-3’）如下：

探针名称	碱基序列	序列标识符
			PEP	5'-GAGATTTTTCCAAGGCTTCAAACTCTTTCATCACATGTCTCTTCTCTTTCCATTGTCTT-3'	SEQ ID NO.33
RF1	5’--CCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGACTG-3'	SEQ ID NO.20
			RF2	5’-CGGCTAAGAGCGAATTTGGCCGGTGAG-3'	SEQ ID NO.21
RF3	5’-AGTAGTAATTGGCATCTTTGATTG-3'	SEQ ID NO.22
			MS1	5’-CATCATCACCTGAGAATTCTCTGG-3'	SEQ ID NO.23
MS8	5’-GGTCGAATCATATTCGTACTGTAG-3'	SEQ ID NO.24
			Topas19/2	5’-CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAGTTC-3'	SEQ ID NO.25
Oxy235	5’-CCGGTTATGAAGCACGGCGTGTCAGC-3'	SEQ ID NO.26
			T45	5’-GACTCCATGGGAATTCATTTACAACTG-3'	SEQ ID NO.27
RT73/GT73	5’-CCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAG-3'	SEQ ID NO.28
			阳性对照探针（PC）	5’-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3'	SEQ ID NO.29
阴性对照探针（NC）	5’-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3'	SEQ ID NO.30

上述12种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在支持膜上的相应位置。在其他的实施例中，探针的固定顺序可与本实施例有所不同。

其中，上述膜芯片制作方法可参考如下方法：

用打印机在膜上打印出表格后把尼龙膜浸泡于50 mL含有0.5%-5%（体积：体积）戊二醛的PBS溶液中，摇床缓慢摆动孵育2小时；随后在PBS中洗膜4次，一次50 mL，每次5分钟；最后将膜放在空气中干燥并密封保存。

同时用0.5M NaHCO₃，pH8.4调整探针（其5’段用氨基修饰）浓度至10μM，将阳性对照探针和阴性对照探针分别稀释到5μM；并将各检测探针、阳性对照探针和阴性对照探针依次点样在尼龙膜上。点好探针的膜芯片放入烘箱中，80℃烘烤2小时备用。

膜芯片的探针位置模式图如图1所示，PEP表示油菜内源基因；RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73分别表示不同的转基因油菜品系，PC表示阳性对照(Positive control)，NC表示阴性对照(Negative control)。

需要说明的是，在其他的实施例中，膜芯片上固定的探针可以是上述12种的一种或多种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

实施例2

采用实施例1的检出试剂盒检测转基因油菜品系的方法，具体如下：

2.1提取待测样本的基因组DNA，并用微量核酸测定仪将DNA溶液稀释至同一质量浓度(60 ng/μL)，得到待测样本的DNA模板。

2.2多重PCR体系和条件

PCR扩增的反应体系：10×PCR Buffer（含Mg²⁺，含UNG酶）:5μL；

dNTP (2.5mM each)：5μL；

带生物素标记的下游引物(20μM)：1.5 μL；上游引物(20μM)：1 μL；（说明：13种引物对（实施例1提供的）都加入，每个引物对的下游引物1.5 μL，上游引物1 μL；

待测样本的DNA模板(50ng/μL)：2 μL；

阳性寡核苷酸DNA((20μM)): 0.01 μL；

加ddH₂O至总体积50 μL。

对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环组成，条件分别为：

UNG酶消化反应：温度37℃，时间5分钟

多重PCR：

预变性：温度95℃，时间10分钟；

变性：温度95℃，时间30秒；

退火：温度55℃，时间15秒；

延伸：温度72℃，时间15秒；

30个循环；

最后延伸：温度72℃，时间5分钟。

2.3膜芯片杂交：

反应结束后，将PCR产物95℃热变性5分钟，冰浴5min以上。取冷却后的PCR产物20μL加入杂交液中，进行膜芯片斑点杂交检测，依次自动完成去活化、去活化清洗、杂交、杂交清洗、酶标、酶标清洗、显色、显色清洗等步骤，进行膜芯片杂交检测。杂交过程如下：

（1）将固定有探针的膜芯片（实施例1提供的膜芯片）放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液（100 mmol/L NaOH）1 mL，37℃孵育8 min；

（2）加入去活化清洗液（2×SSPE，0.1% SDS）1 mL，60℃孵育5 min；

（3）吸除去活化清洗液（2×SSPE，0.1% SDS），加入杂交体系液（将PCR后产物变性后加入杂交液（2×SSPE，0.1% SDS）中混合）1 mL，45℃水平摇床90 rpm孵育45 min；

（4）吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液（2×SSPE，0.5% SDS）1 mL，52 ℃水平摇床90 rpm，震荡清洗5 min，洗涤2次；

（5）吸除杂交清洗液，加入预热好的酶标液（链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（1mg/ml），按1:2000的比例加入到999.5 µL的酶标液（2×SSPE，0.5% SDS）中），42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30 min；

（6）吸除酶标液，加入预热好的酶标清洗液1（2×SSPE，0.5% SDS）1 mL，42℃水平摇床90 rpm，震荡清洗5 min，洗涤2次；

（7）吸除酶标清洗液1，加入预热好的酶标清洗液2（含：0.3 mol/L NaCl，20 mmol/L NaH₂PO₄，20 mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4）1 mL，37℃水平摇床90 rpm，震荡清洗5 min，洗涤2次；

（8）吸除酶标清洗液2，加入显色液（含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰）1 mL，室温静置显色15 min。

（9）吸除显色液，加入去离子水1 mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。

表1 自动杂交仪测定过程

程序	试剂	温度（℃）	时间（min）
				去活化	去活化液	37	8
去活化清洗	去活化清洗液	60	5
				杂交	杂交液	45	45
杂交清洗	杂交清洗液	52	5
				杂交清洗	杂交清洗液	52	5
酶标	酶标液	42	30
				酶标清洗1	酶标清洗液1	42	5
酶标清洗1	酶标清洗液1	42	5
				酶标清洗2	酶标清洗液2	37	5
酶标清洗2	酶标清洗液2	37	5
				显色	显色液	37	15
显色清洗	去离子水	37	5
				显色清洗	去离子水	37	5

其中：去活化液包括100 mmol/L的NaOH，去活化清洗液包括2×SSPE和0.1% SDS；杂交液包括2×SSPE和0.1% SDS；杂交清洗液包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标液包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标清洗液1包括2×SSPE和0.5% SDS；酶标清洗液2包括1 M Tris-HCl,pH9.5，5 M NaCl，1 M MgCl₂。

配制1L的SSPE缓冲液的方法如下：用800ml蒸馏水溶解17.53g的NaCl，27.6g的NaH₂PO₄•H₂O和7.4g的EDTA-Na₂，再用10M的NaOH大约6mL调节pH值至7.4，然后定容至1L，过滤后高压蒸汽灭菌。

显色液为碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BCIP，含0.15 mg/mL BCIP，0.30 mg/mLNBT，100 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，pH 9.5）；显色清洗液为双蒸水。

（10）结果分析：

在实际的样本检测过程中，应当设置空白对照、阴性对照、阳性对照，提高检测结果的准确性。

a）空白对照：使用水作为空白对照样本作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC（阳性质控点）显色，NC（阴性质控点）不显色，其余靶点不显色；

b）阴性对照：使用阴性对照样本作为模板，按上述的检测方法进行检测的结果，PC（阳性质控点）显色，NC（阴性质控点）不显色，内参显色；

c）阳性对照：使用阳性对照样本（含RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73中的一种转基因油菜品系的或多种转基因油菜品系的混合的DNA）作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC（阳性质控点）显色，NC（阴性质控点）不显色，内参显色，相应靶点显色（例如是阳性对照样本含RF1和RF2，则在膜芯片RF1和RF2的靶点区域有显色）；

同时满足以上三个条件的为有效实验，则可根据显色结果判断待测样本是否为常见的转基因油菜品系（RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、Oxy235、T45或RT73/GT73，或其混合）。

需要说明的是：可通过肉眼判读结果，也可采用扫描仪判读结果，以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值，设定各靶标阈值，若信号值大于阈值判定为阳性，小于阈值判定为阴性。

实施例3

分析取RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45或RT73/GT73转基因油菜品系DNA为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图2所示，从图2结果可以看出，每种转基因油菜品系均被检测出，各样本相互之间无交叉反应，说明实施例1的试剂盒具有较好的特异性。

实施例4

按照天根生化科技（北京）有限公司植物基因组DNA提取试剂盒（货号：DP305）的说明提取按质量比（g：g）为：10% RF1+90%非转基因油菜品系、1% RF1+99%非转基因油菜品系、0.1% RF1+99.9%非转基因油菜品系三种混合样品的基因组DNA，以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图3所示，从图3结果可以看出，在RF1样品含量低至0.1%的情况下，膜芯片上的RF1靶区域有显色，而其他靶区域样品靶区域无显色，说明实施例1的试剂盒具有较好的灵敏度。

实施例5

按照天根生化科技（北京）有限公司植物基因组DNA提取试剂盒（货号：DP305）的说明提取非转基因油菜品系样本的基因组DNA，以此为模板，采用实施例1的试剂盒，按实施例2的方法进行检测，结果如图4所示，从图4结果可以看出，除PEP和PC区域以外，其他区域均无显色，符合预期值，说明该实施例1的试剂盒的特异性较好。

本发明实施例提供的检测试剂盒操作简单，得到待检样本，提取DNA，多重PCR扩增，膜芯片杂交就可以检测待检样本中含有的转基因油菜品系例如RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Topas19/2、O xy235、T45、RT73/GT73，具有平行分析和判断的特点；并且可以很方便的加入新的检测品系指标；系统在多重PCR扩增过程中，提高了系统的灵敏度和准确性；试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；试剂盒操作简单；经济实惠，无需特殊的昂贵仪器，适用于转基因油菜品系检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华汉三创生物科技有限公司

<120> 一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcctgtaga cctcaattgc gagc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacgcgactc actcatcatc ctc 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaccatgta cgtaagcgct tacg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggtgagaca atatatcgac g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgataagcgt gcgcatgtct g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcactgtctc cgccaagtct tc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaactattc gggcctaac 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattccatct ttggacttag 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtactcgacg ccgagttcga cgg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcccataaa ccttgaggac gc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagtggctcc ttcaacgttg cg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaccggcgct gatatatgac c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctcaattgc gagctttcta a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtccgacgcg ctgacgacag 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cattgagtcg taagagactc tg 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggacacatga attatgcata tg 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acgctgcgga catctaca 18

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gacacaagct tatacgaagg c 21

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctggtacttt ggacactcgt tcttctcgca ctgctcatta ttgcttctga tctggatgc 59

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctaactttt ggtgtgatga tgctgactg 29

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cggctaagag cgaatttggc cggtgag 27

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agtagtaatt ggcatctttg attg 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catcatcacc tgagaattct ctgg 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggtcgaatca tattcgtact gtag 24

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctccttcaac gttgcggttc tgtcagttc 29

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccggttatga agcacggcgt gtcagc 26

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gactccatgg gaattcattt acaactg 27

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccatcatact cattgctgat ccatgtag 28

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca aagtaccag 59

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggttccttga gaaatgtttt acgggattac ttccatgttt gttggatgat cctattttc 59

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

caactaccaa tacacatcga gtgg 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggtcgagaag tttctttcac gagg 24

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gagatttttc caaggcttca aactctttca tcacatgtct cttctctttc cattgtctt 59

Claims

1.一种转基因油菜品系的检测试剂盒，其特征在于，其包括核酸组合，所述核酸组合如下用于检测转基因油菜品系的引物对：

所述试剂盒还包括膜芯片，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.20-28所示的探针。

2.根据权利要求1所述的转基因油菜品系的检测试剂盒，其特征在于，所述膜芯片上还固定有如下对照探针中的一种或两种：阳性对照探针和阴性对照探针；

所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.29所示；

所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.30所示。

3.根据权利要求2所述的转基因油菜品系的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，该阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.19所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的转基因油菜品系的检测试剂盒，其特征在于，每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。

5.一种转基因油菜品系的检测方法，其特征在于，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

所述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对：

每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物；

在所述PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.20-28所示的探针。

6.根据权利要求5所述的转基因油菜品系的检测方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比大于1。

7.根据权利要求6所述的转基因油菜品系的检测方法，其特征在于，在PCR反应体系中，各引物对中带有所述标记物的引物与未带有所述标记物的引物的摩尔比为1.2-1.7。

8.根据权利要求5所述的转基因油菜品系的检测方法，其特征在于，所述膜芯片具有三维孔径结构的薄膜。

9.根据权利要求8所述的转基因油菜品系的检测方法，其特征在于，所述具有三维孔径结构的薄膜选自硝酸纤维素膜、尼龙膜中的任意一种。