CN102212540A - 同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。构建了同时适于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系特异性检测的通用型标准分子，对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于上述转基因油菜品系的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。
背景技术
近年来，转基因生物技术在农业生产中得到广泛应用，世界各国正在不断完善转基因生物的检测方法研究，加强对转基因原料及其产品的安全监督。其中核酸检测技术已成为转基因生物检测的最主要和常用的方法。在现有技术条件下外源基因是以随机的方式插入作物基因组的，因此每个转基因作物品种中外源插入片段与作物基因组DNA结合位点的边界序列应该是唯一的，根据边界序列设计引物，从而可以鉴定出转基因作物的品系，即品系特异性检测。
然而，不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时均必须使用标准物质(Reference materials)作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。标准分子(Reference molecule)是一种重组质粒分子，其一般包含转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段以及物种特异性片段。由于操作简便、生产成本低、容易获得高纯度和高浓度DNA样品。近年来标准分子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有效途径之一，已作为新型DNA标准物质用于转基因作物检测和定量分析。
目前，全世界已有20多个转基因油菜品系进入商业化种植，其中孟山都公司的抗草甘磷品系RT73(GT73)和拜耳公司的6个抗除草剂品系(MS8×RF3，MS1×RF1，MS1×RF2，Oxy235，Topas19/2和T45)于2004年3月通过我国农业部的安全性评估并获得加工原料进口许可。迄今为止，还没有同时将以上7种转基因油菜品系外源基因构建标准分子的报道。
为了给中国转基因油菜品系监管提供必要的技术支撑，以及为了简化多种转基因油菜品系的检测，有必要开发适于多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。
发明内容
本发明的目的在于提供可满足多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。
在本发明的第一方面，提供一种重组质粒，其包含(较佳地为5’→3’)以下序列片段：MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)；RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)；RF33’端品系特异性序列(RF3-3)；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)；Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)；MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)；RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)；T45 5’端品系特异性序列(T45-5)；Topas19/2 3’端品系特异性序列(Topas)；RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)；Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)；RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。
在另一优选例中，所述的RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)与MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)之间距离大于2000bp；或
所述的RF25’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。
在另一优选例中，所述的MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ ID NO：1所示；
所述的RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO：2所示；所述的RF33’端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO：3所示；所述的MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)如SEQ ID NO：4所示；所述的Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)如SEQ ID NO：5所示；所述的MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO：6所示；所述的RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO：7所示；所述的T455’端品系特异性序列(T45-5)如SEQ ID NO：8所示；所述的Topas19/2 3’端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO：9所示；反向的RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO：10所示；所述的Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)如SEQ IDNO：11所示；或所述的RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)如SEQ ID NO：12所示。
在另一优选例中，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO：13所示；或所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID NO：14所示。
在另一优选例中，所述的重组质粒中还包括来源于动物CDC37的基因片段。
在另一优选例中，所述的来源于动物CDC37的基因片段如SEQ ID NO：15所示。
在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7000-10000bp。
在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7500-8500bp。
在另一优选例中，所述的重组质粒的骨架质粒是pEASY-T3载体。
在本发明的另一方面，提供所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系。
在另一优选例中，所述的标准分子是通用型标准分子。
在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的方法，所述方法包括：以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中相应的转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系或Topas19/2品系特异性序列的存在与否以及存在量；
若待测油菜样品中存在RT73 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有RT73品系；
若待测油菜样品中存在MS1 5’端品系特异性序列以及存在RF1 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS1×RF1品系；
若待测油菜样品中存在MS1 5’端品系特异性序列以及存在RF2 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS1×RF2品系；
若待测油菜样品中存在MS8 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，以及存在RF3 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS8×RF3品系；
若待测油菜样品中存在T45 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有T45品系；
若待测油菜样品中存在Oxy235 5’端品系特异性序列和/或3’端品系特异性序列，则表明该样品含有Oxy235品系；
若待测油菜样品中存在Topas19/2 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有Topas19/2品系。
在另一优选例中，采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中：MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)；RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)；RF3 3’端品系特异性序列(RF3-3)；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)；Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)；MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)；RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)；T45 5’端品系特异性序列(T45-5)；Topas19/2 3’端品系特异性序列(Topas)；RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)；Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)和/或RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)；以及油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜品系的存在与否以及存在量。
在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的试剂盒，含有所述的重组质粒。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：扩增所述的MS1 5’端品系特异性序列、所述的RT73 3’端品系特异性序列、所述的RF3 3’端品系特异性序列、所述的MS8 3’端品系特异性序列、所述的Oxy235 5’端品系特异性序列、所述的MS8 5’端品系特异性序列、所述的RF3 5’端品系特异性序列、所述的T45 5’端品系特异性序列、所述的Topas19/2 3’端品系特异性序列、所述的RF2 5’端品系特异性序列、所述的Oxy235 3’端品系特异性序列、所述的RF1 5’端品系特异性序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自以下的试剂：PCR扩增试剂(如DNA聚合酶)，电泳相关试剂(如琼脂糖)，DNA分子量标记，使用说明书等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、标准分子pCanola9结构示意图和插入序列。其中，MS1-5，MS1品系5’端品系特异性序列；RT73-3，RT73品系3’端品系特异性序列；RF3-3，RF3品系3’端品系特异性序列；MS8-3，MS8品系3’端品系特异性序列；Oxy235-5，Oxy235品系5’端品系特异性序列；MS8-5，MS8品系5’端品系特异性序列；RF3-5，RF3品系5’端品系特异性序列；T45-5，T45品系5’端品系特异性序列；Topas，Topas19/2品系3’端品系特异性序列；RF2-5，RF2品系5’端品系特异性序列；Oxy235-3，Oxy235品系3’端品系特异性序列；RF1-5，RF1品系5’端品系特异性序列；PEP，油菜内标准基因PEP片段；HMG，油菜内标准基因HMG片段；CDC37，一段来源于动物CDC37的基因片段，用于将内标准基因与品系特异性片段间的距离加大。
图2、标准分子普通PCR特异性检测。(A)：以标准分子pCanola9为模板的扩增。(B)：分别以油菜T45，RF1，RF2，RF3，MS1，MS8，Oxy235，Topas19/2品系，转基因玉米BT176，NK603和MON863品系基因组DNA为模板的扩增。(C)：以非转基因油菜基因组DNA为模板的扩增。M：DL2000分子量标记；泳道1：空白对照；泳道2-12：转基因油菜RT73品系，内源片段PEP，内源片段HMG，转基因油菜T45，RF1，RF2，RF3，MS1，MS8，Oxy235和Topas19/2品系特异性序列扩增。泳道13-15：转基因玉米BT176，NK603和MON863品系特异性序列扩增。
图3、标准分子普通PCR检测灵敏度测试。(A)PEP片段；(B)HMG片段；(C)RT73品系特异性片段；(D)T45品系特异性片段；(E)Topas19/2品系特异性片段；(F)Oxy235品系特异性片段；(G)MS1品系特异性片段；(H)MS8品系特异性片段；(I)RF1品系特异性片段；(J)RF2品系特异性片段；(K)RF3品系特异性片段。泳道1为空白对照；泳道2-8分别为50000、5000、500、50、20、10和5拷贝标准分子DNA的扩增；M为DL2000分子量标记。箭头示扩增产物大小。
图4、实时荧光扩增标准曲线图。(A)内源片段PEP实时荧光PCR扩增标准曲线；(B)内源片段HMG实时荧光PCR扩增标准曲线；(C)RT73品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(D)T45品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(E)RF1品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(F)RF2品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(G)RF3品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(H)MS1品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(I)MS8品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(J)Oxy235品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线；(K)Topas19/2品系特异性片段实时荧光PCR扩增标准曲线。
具体实施方式
针对目前转基因油菜产品检测标准物质缺乏的难题，本发明人经过深入的研究，构建了同时适于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系特异性检测的通用型标准分子(即本发明的重组质粒)，其包含以下序列片段：MS1 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；Oxy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；Topas19/23’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；Oxy235 3’端品系特异性序列；RF1 5’端品系特异性序列；油菜内标准基因HMG和PEP片段。对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于上述转基因油菜品系的检测。
特异性序列
为了构建特异性好、稳定性高、灵敏度高、适用性广的通用型标准分子，本发明人经过了反复的研究，找到了合适的基因片段。所述的基因片段是转基因油菜MS15’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；Oxy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；Topas19/23’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；Oxy235 3’端品系特异性序列；RF1 5’端品系特异性序列。较佳地，还克隆了油菜内源标准基因HMG和PEP片段。将上述序列片段共同构建入适当的质粒(载体)中，从而用于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的特异性鉴定。
由于以上的基因片段中，多个片段间同源性很高，如RF1与MS1序列。因此，作为本发明的优选方式，为了防止标准分子作为标准品进行PCR扩增中出现非目标扩增，在标准分子设计中将同源性很高的片段尽量分开，距离在2kb以上，对于无法分开的片段，采用反向插入的方法。因此，更佳地，所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。
作为本发明的优选方式，所述的MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ IDNO：1所示；所述的RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO：2所示；所述的RF3 3’端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO：3所示；所述的MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)如SEQ ID NO：4所示；所述的Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)如SEQ ID NO：5所示；所述的MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO：6所示；所述的RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO：7所示；所述的T45 5’端品系特异性序列(T45-5)如SEQ ID NO：8所示；所述的Topas19/23’端品系特异性序列如SEQ ID NO：9所示；所述的RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO：10(反向序列)所示；所述的Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)如SEQ ID NO：11所示；或所述的RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)如SEQ ID NO：12所示。
本发明人经过大量的试验发现，采用以上SEQ ID NO：1-12所示序列的片段作为检测的目的片段，不仅PCR扩增效果良好，而且检测结果最为准确，其全面地涵盖了转基因油菜各品系检测所需的特异性检测区域，适用性广。
作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
重组质粒
上述的三种序列片段插入到适当的质粒(载体)中，构成重组质粒(重组载体)，作为本发明的标准分子。
所述的重组质粒的骨架质粒可以有多种的选择，可以是一些商业化的质粒。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒的大小约为2000-5000bp；较佳地约为2000-4000bp；较佳地约为2500-4000bp；较佳地约为2500-3500bp。上述的骨架质粒在构建成本发明的重组质粒后，重组质粒的大小范围约在7000-10000bp；较佳地约为7500-8500bp。本发明人在研究中发现，适当大小的重组质粒，稳定性好，PCR扩增效果良好，有利于获得准确、稳定的检测结果。
一些具体的骨架质粒例如但不限于pEASY系列的载体、T系列载体、pUC系列载体、pBR系列载体等。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒是pEASY系列的载体(如pEASY-T3载体)。
以上的序列片段较佳地插入到质粒的多克隆位点中，形成串联的形式。所述的序列片段在载体上的前后次序可以是变化的。只要它们能够被引物识别和扩增。作为本发明的优选方式，同源性较高的序列片段，在重组质粒上的间距大于2000bp；较佳地，RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)与MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)之间距离大于2000bp。作为本发明的另一优选方式，所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中，
作为本发明的最优选方式，所述的序列片段在载体上的次序，从5’→3’端，为MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)；RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)；RF3 3’端品系特异性序列(RF3-3)；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)；Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)；MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)；RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)；T45 5’端品系特异性序列(T45-5)；Topas19/2 3’端品系特异性序列(Topas)；RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)；Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)；RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。
作为本发明的最优选方式，所述的重组质粒中，还包括一段来源于动物CDC37的基因片段，用于将内标准基因与品系特异性片段间的距离加大，从而有利于多重PCR扩增的需要。
检测方法
本发明还提供了一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的方法，所述方法包括：以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中各转基因油菜品系相应的特异性序列的存在与否以及存在量。
在获得了本发明提供的标准分子后，本领域技术人员均了解如何进行待测油菜样品进行检测。以本发明的重组质粒作为标准分子，通常采用聚合酶链反应(PCR)的方法来进行品系的鉴定，也可采用基于核酸的其它检测方法，如芯片检测。
一种检测转基因油菜各品系的方法是：采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中各转基因油菜品系相应的特异性序列以及油菜HMG或PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜或其来源样品中各转基因油菜品系的存在与否以及存在量。利用本发明的标准分子，可以构建出标准曲线，分别计算各种基因片段的量(拷贝数)。聚合酶链反应(PCR)是本领域技术人员公知的技术。
在本发明的实施例中，制备了标准分子pCano1a9，其高度特异于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的检测。本发明的标准分子可很好的替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜各品系及其来源产品品系特异性检测。
试剂盒
本发明还提供了一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的试剂盒，含有所述的重组质粒(通常包含在容器中)。
所述的试剂盒还可含有：扩增所述的MS1 5’端品系特异性序列、所述的RT733’端品系特异性序列、所述的RF3 3’端品系特异性序列、所述的MS8 3’端品系特异性序列、所述的Oxy235 5’端品系特异性序列、所述的MS8 5’端品系特异性序列、所述的RF3 5’端品系特异性序列、所述的T45 5’端品系特异性序列、所述的Topas19/2 3’端品系特异性序列、所述的RF2 5’端品系特异性序列、所述的Oxy2353’端品系特异性序列、所述的RF1 5’端品系特异性序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。以便于进行PCR扩增和/或检测。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、电泳等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、DNA聚合酶、扩增液、杂交液、限制性酶、对照液、洗液、电泳相关试剂(如琼脂糖)、DNA分子量标记等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I、材料与方法
样品
非转基因油菜籽(中国常规品种“秦优7号”)，转基因油菜RT73(参见农业部869号公告-11-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽RT73及其衍生品种定性PCR方法)、MS1×RF1(参见农业部869号公告-4-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MS1、RF1及其衍生品种定性PCR方法)、MS1×RF2(参见农业部869号公告-6-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MS1、RF2及其衍生品种定性PCR方法)、MS8×RF3(参见农业部869号公告-5-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜籽MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法)、T45(参见农业部953号公告-3-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜籽T45及其衍生品种定性PCR方法)、Oxy235(参见农业部953号公告-4-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜籽Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法)和Topas19/2品系(参见农业部1193号公告-2-2009转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topas19/2及其衍生品种定性PCR方法)。
转基因玉米Bt176(参见农业部869号公告-8-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法)，NK603(参见农业部869号公告-13-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法)，MON863(参见农业部869号公告-10-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON863及其衍生品种定性PCR方法)。
试剂
植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，Cat#DP305-02。Axygen质粒DNA小量提取试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司，Cat：#AP-MN-P-50。TakaRa Premix Ex Taq试剂盒，大连宝生物公司，Cat#.D332。Hot StartqPCR Master MixI试剂盒，上海睿诚生物科技有限公司。
100-2000bp ladder DNA Marker：大连宝生物公司。10×Loading Buffer：大连宝生物公司。琼脂糖；TAE(50×)：Fermentias公司。10×Buffer(无MgCl2)：大连宝生物公司。Mg2+溶液(25mM)：大连宝生物公司。dNTP溶液(每种2.5mM)：大连宝生物公司。Taq DNA聚合酶，5单位/μl：大连宝生物公司。超纯水(ddH2O)：大连宝生物公司。引物和探针：上海皓嘉科技发展有限公司合成。配成100μM母液-20℃储存，稀释为终浓度10μM待使用。
植物基因组DNA提取
用冷冻研磨机(美国SPEX公司FREEZER MILL 6850型)将待检测的油菜样品分别研磨成均匀的粉末。使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat：#DP305-02)并按其操作步骤提取样品基因组DNA。具体操作程序如下：
1)用冷冻研磨机将样品在液氮中研磨成均匀的粉末。
2)称取≥100mg研磨好的粉末，迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃恒温震荡孵育器中孵育1个小时。
3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5分钟。
4)将上一步所得上层水相转入一个新离心管中，加入700μL缓冲液GP2，混匀。
5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
7)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
8)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于室温放置5分钟，以晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60-100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
标准分子的构建
设计和研制同时适于转基因油菜RT73、MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45、Oxy235和Topas19/2品系特异性检测的标准分子，使其适用于中国现行国家标准和行业标准的检测要求。鉴于现有检测方法同时涉及转基因作物5’和3’两端邻接区序列，因此标准分子的构建尽量将两端序列均插入载体以满足各种检测方法的要求。
经对检测方法和序列的分析，发现多个片段间同源性很高，如RF1与MS1等序列，为了防止标准分子作为标准品进行PCR扩增中出现非目标扩增，在标准分子设计中将同源性很高的片段尽量分开，距离在2kb以上，对于无法分开的片段，采用反向插入的方法。
标准分子设计包括如下片段：MS1 5’端品系特异性序列、RF1 5’端品系特异性序列、RF2 5’端品系特异性序列、MS8 5’端和3’端品系特异性序列、RF3 5’端和3’端品系特异性序列、Oxy235 5’端和3’端品系特异性序列、T45 5’端品系特异性序列、RT73 3’端和Topas19/2 3’端品系特异性序列，以及油菜内标准基因HMG和PEP片段。
构建步骤如下：
(1)整理中国现行的国家标准和行业标准中转基因油菜RT73、MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45、Oxy235和Topas19/2品系特异性普通PCR和实时荧光PCR检测方法，以及国内外公开刊物上发表的检测方法，主要是引物和探针序列和信息等。
(2)设计标准分子构建用引物，使扩增区域涵盖上述所有标准和文献中涉及的检测引物和探针扩增的区域(见表1)。
(3)利用L1-MS1-F/R、L2-RT73-3-F/R、L3-RF3-3-F/R、L4-MS8-3-F/R以及L6-Oxy235-5-F/R五对引物分别扩增MS1 5’端片段、RT73 3’端片段、RF3 3’端片段、MS8 3’端片段以及Oxy235 5’端序列，再通过重叠PCR方法将MS1/5’-RT73/3’-RF3/3’-MS8/3’-Oxy235/5’五个片段串联起来，利用T/A克隆策略将其插入pEasy-T3载体(购自北京全式金生物技术有限公司)的多克隆位点。
(4)利用快速定点突变技术在载体的1218位点后插入一段依次携带有BglII、PstI和XhoI的序列。
(5)利用表1中的CDC37-BamH1-f/CDC37-BglII-XhoI-r引物扩增CDC37部分序列(933bp)，酶切后与载体经BglII和XhoI酶切后回收片段进行连接，转化。
(6)利用表1中的引物HMG-BamH15’/HMG-3’和PEP-5’/PEP-Sal1-3’分别扩增HMG和PEP片段，进行重叠PCR扩增，得到HMG-PEP串联片段，BamHI和SalI酶切后与载体经BglII和XhoI酶切后回收片段进行连接，转化。
(7)合成引物BXXK-Linker-f/BXXK-Linker-r，在载体的PstI和SalI间插入一段依次带有BglII、XhoI、XbaI和KpnI酶切位点序列(注：插入后SalI位点被破坏)。
(8)利用表1中的引物L12-Oxy235-3-XhoI-f/L12-Oxy235-3-r和L13-RF1-f/L13-RF1-XbaI-r分别扩增Oxy235 3’端和RF1片段，进行重叠PCR构建Oxy235/3’-RF1串联片段，酶切后与载体经XhoI和XbaI酶切位点进行连接，转化。
(9)利用表1中的引物L5-MS8-5-PstI-f/L5-MS8-5-r和L7-RF3-5-F/L7-RF3-BglII-r分别扩增MS8 5’端和RF3 5’端序列，进行重叠PCR以构建MS8/5’-RF3串联片段，酶切后与载体经PstI和BglII酶切后回收片段进行连接，转化。
(10)利用表1中的引物L9-T45-5-f/L9-T45-5-r，L10-Topas-f/L10-Topas-r以及L11-RF2reverse-f/L11-RF2reverse-r分别扩增T45 5’端、Topas19/2 3’端和RF2 5’端序列，其中RF2 5’端序列为反向扩增，再进行重叠PCR以构建T45/5’-Topas-RF2(Reverse)的串联片段，酶切后与载体经BglII和XhoI酶切后回收片段进行连接，转化。
以上构建获得的标准分子分别送英潍捷基(上海)贸易有限公司和鼎安生物技术(上海)有限公司进行质粒全基因测序。
表1、标准分子构建中设计的引物
标准分子质粒菌液制备
配制适用大肠杆菌生长所需的LB培养基。向试管中加入4mL LB培养基和50μL含有标准分子质粒的大肠杆菌菌种。向试管中加入3μL氨苄青霉素钠盐，温和混匀后，将试管斜放于摇床中(37℃、180rpm)培养。12个小时后，获得达对数生长期的标准分子质粒大肠杆菌菌液。
标准分子质粒DNA提取
采用Axygen质粒DNA小量提取试剂盒(Cat#：AP-MN-P-50)，具体操作程序如下：
1)取4mL在LB培养基中过夜的大肠杆菌菌液，12000×g离心1分钟，弃尽上清。
2)加入250μL缓冲液S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不能留有小的菌块。
3)加入250μL缓冲液S2，温和并充分地上下翻转5次混合均匀使得菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5分钟。
4)加入250μL缓冲液S3，温和并充分地上下翻转混合8次，12000×g离心10分钟。
5)吸取上清并转移到制备管中，12000×g离心1分钟，弃尽滤液。
6)将制备管置回离心管，加入500μL缓冲液W1，12000×g离心1分钟，弃尽滤液。
7)将制备管置回离心管，加入700μL缓冲液W2，12000×g离心1分钟，弃尽滤液。
以同样的方法再用700μL缓冲液W2洗涤一次。弃滤液。
8)将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1分钟。
9)将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入80μL Eluent，室温静置1分钟。12000×g离心1分钟。
10)提取得到的DNA保存在-20℃，以防止DNA降解。
DNA浓度的测定
使用核酸蛋白含量测定仪(Eppendorf公司)测定DNA浓度。仪器预热30分钟，选择正确的程序，输入原液和稀释液体积，测试空白液和样品液，仪器直接将测得吸光值经过相关系数换算后得到相应的样品浓度。
普通PCR扩增
(1)引物
通过查阅和整理我国现行的国家标准、行业标准和公开刊物中发表的油菜内标准基因、转基因油菜和转基因玉米品系特异性序列的普通PCR检测方法，获得引物序列和信息，详见表2。其中PEP、HMG为油菜内源标准基因，RT73、RF1、RF2、RF3、T45、MS1、MS8、Oxy235、Topas19/2分别为对应转基因油菜品系特异性检测片段。BT176、NK603和MON863分别对应转基因玉米品系特异性检测片段。
(2)反应体系和条件
采用25μL体系进行PCR反应，包括1×Premix Ex Taq(TakaRa Premix Ex Taq体系)，0.40μM上下游引物，以及5μL DNA模板。反应条件为95℃10min；95℃30s，退火(温度见表3)30s，72℃40s，40个循环；72℃延伸5min。所有反应重复3次，PCR产物利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)普通PCR产物分析
配制琼脂糖凝胶，用1×TAE配制琼脂糖(浓度为2.0％)，凝胶用微波炉蒸煮融化，待降温至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为5‰，倒入电泳槽凝胶板中凝固。取10μL PCR产物，加2μL上样缓冲液点样行电泳，并加入DNA分子标记同时电泳。调节电压至3-5V/cm，电泳30分钟左右。采用凝胶成像系统拍摄电泳图。
表2、标准分子普通PCR选用的引物序列
表3、定性PCR退火温度设置程序
实时荧光PCR扩增
(1)引物与探针
查阅和整理中国现行的国家标准、行业标准和公开刊物中发表的油菜内标准基因、转基因油菜品系特异性实时荧光PCR检测方法，获得引物和探针序列和信息，详见表4。其中PEP和HMG为油菜内源标准基因，RT73、RF1、RF2、RF3、T45、MS1、MS8、Oxy235、Topas19/2分别为对应转基因油菜的品系特异性检测引物和探针。
(2)反应体系和条件
采用Hot Start qPCR Master Mix I试剂盒(上海睿诚生物科技有限公司)和ABPRISM(R)7300定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行实时荧光PCR检测。采用25μL体系，包括1×Hot Start qPCR Master Mix I；0.40μM引物和0.20μM探针(P)；5μL DNA模板。扩增条件为95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，45个循环。
表4、标准分子实时荧光PCR检测选用的引物与探针序列
标准分子适用性鉴定
A、普通PCR适用性鉴定
(1)特异性测试
标准分子pCanola9中包含14个片段，分别对应于MS1 5’端品系特异性序列、RF15’端品系特异性序列、RF2 5’端品系特异性序列、MS8 5’端和3’端品系特异性序列、RF3 5’端和3’端品系特异性序列、Oxy235 5’端和3’端品系特异性序列、T455’端品系特异性序列、RT73 3’端和Topas19/2 3’端品系特异性序列，以及油菜内标准基因HMG和PEP片段，因此标准分子应特异于上述14个片段的检测。
利用中国现行标准中油菜内源基因片段HMG和PEP检测引物，转基因油菜RT73，T45，Oxy235，MS8，MS1，RF1，RF2，RF3和Topas19/2品系检测引物，转基因玉米MON863、BT176和NK603品系检测引物分别扩增标准分子pCanola9 DNA以检测标准分子的特异性。所用的引物序列见表2。扩增序列分别为油菜内源PEP片段(248bp)和HMG片段(219bp)，转基因油菜RT73 3’端品系特异性序列(204bp)，T45品系特异性序列(204bp)，RF1品系特异性序列(200bp)，RF2品系特异性序列(200bp)，RF3品系特异性序列(284bp)，MS1品系特异性序列(194bp)，MS8品系特异性序列(159bp)，Oxy235品系特异性序列(331bp)，Topas19/2品系特异性序列(110bp)；转基因玉米BT176品系特异性序列(570bp)，NK603品系特异性序列(108bp)，MON863品系特异性序列(411bp)。
(2)灵敏度测试
为了鉴定pCanola9用于普通PCR检测的灵敏度，本研究采用TakaRa Premix ExTaq(大连宝生物公司，Cat.D332)和Mastercycler Gradient PCR仪(德国Eppendorf公司)进行PCR扩增。将标准分子DNA稀释至104、103、102、10、4、2和1拷贝/μL，分别扩增油菜内源PEP片段(248bp)和HMG片段(219bp)，转基因油菜RT733’端品系特异性序列(204bp)，转基因油菜T45品系特异性序列(233bp)，RF1品系特异性序列(200bp)，RF2品系特异性序列(200bp)，RF3品系特异性序列(284bp)，MS1品系特异性序列(194bp)，MS8品系特异性序列(159bp)，Oxy235品系特异性序列(331bp)，Topas19/2品系特异性序列(110bp)，确定以标准分子为标准品在普通PCR检测中的LOD值。
B、实时荧光PCR检测适用性鉴定
(1)标准曲线制作
将标准分子pCanola9DNA稀释至106、105、104、103、102和10拷贝/μL。对各目标片段分别进行实时荧光PCR扩增，设3个平行重复，实验重复3次，计算R2和反应效率(E)，制作标准曲线。反应效率E计算公式：E＝10-1/K-1(K为标准曲线斜率)。
(2)LOD和LOQ测试
以4、2和1拷贝/μL标准分子DNA为模板，扩增20次反应检测标准分子各目的片段(PEP、HMG、RT73、T45、RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Oxy235和Topas19/2)用于实时荧光PCR检测的LOD和LOQ。
II.实施例
实施例1、标准分子构建
为了构建适于转基因油菜RT73、MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45、Oxy235和Topas19/2品系特异性检测的通用标准分子，将MS1-5、RT73-3、RF3-3、RF3-5、MS8-3、MS8-5、Oxy235-5、Oxy235-3、RF1-5、T45-5、Topas19/2-3、RF2-5和HMG、PEP等14个特异性序列片段逐步克隆至pEASY-T3载体中，得到pCanola9(图1)，大小约为7921bp。3次质粒全基因测序结果与目标序列一致。
MS1-5(SEQ ID NO：1，299bp)：
GGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGGCATCGCACCGGTGAGTAATATTGTACGGCTAAGAGCGAATTTGGCC TGTAGACCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGGGCCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGAAGAACCTATCCATGAAACTCACAAAAACATC
RT73-3(SEQ ID NO：2，316bp)：
CGACGGATCGTAATTTGTCGTTTTATCAAAATGTACTTTCATTTTATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTTTGAATTGAAAAAGAATTGGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTTCCTTTCCTTGCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTCGTATAAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAGAATCTTGCTGAAGAATTACTCAGAAACAGAGTACTTCAAGGTATTGAACATTCCACATGTGGAAATCGACGGCTA
RF3-3(SEQ ID NO：3，169bp)：
AATATTTAAACTATATTTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCTACAAATTGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAGAAGGCATTTACCTAGGGGTCCAAGTTTTGTACAAATTTCAGGGTTTCTAATTACAAAAAAAAATACTTTTGCATGGTAGTTAACATATTTTTTTAG
MS8-3(SEQ ID NO：4，157bp)：
TGGCCCATAAACCTTGAGGACGCTTTGATCATATTCTATTAACTACAGTACGAATATGATTCGACCTTTGCAATTTTCTCTTCAGTACTCGGCCGTCGAACTCGGCCGTCGAGTACATGGTCGATAAGAAAAGGCAATTTGTAGATGTTAATTCCCA
OXY235-5(SEQ ID NO：5，494bp)：
ACGTGAGCCACTCGAAGGACAAATTGGGCCTTCTGTAGGCCATGTGGTGTGGGTGCATGGTGGTGTTAATTCCCATCTTGAAAGAAATATAGGGATCTCGATAGAGTCGAGACACGTCGAAATAAAGATTTCCGAATTAGAATAATTTGTTTATTGCTTTCGCCTATAAATACGACGGATCGTAATTTGTCGTTTTATCAAAATGTACTTTCATTTTATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTTTGAATTGAAAAAAAATTGGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGAATATATCCTCATCGCCGGTAGAGATAATTTCACGATTCTCTTAATTCAATTCTCTCATCGCCACTGAATGGTTTACTAGATTTGTCGTAGAATTCAGATTTAAATATCCAACTGAATCCCCTGGGCAATTAAGGCTAATCAT
CDC37(SEQ ID NO：15，933bp)：
GATCCATGGTGGACTACAGCGTTTGGGATCACATCGAGGTGTCGGACGATGAGGACGAGACGCACCCCAACATAGACACTGCCAGCCTCTTCCGCTGGCGGCACCAGGCCCGGGTGGAACGCATGGAGCAGTTTCAGAAGGAGAAAGAGGAACTGGACCGGGGCTGCCGGGAGTGCAAGCGCAAGGTAGCCGAGTGCCAGCGCAAGCTGAAGGAGCTGGAAGTGGCTGAGAGCGATGGCCAGGTGGAGCTTGAGCGGCTGAGAGCTGAGGCACAGCAACTGCGCAAGGAGGAGCGGAGCTGGGAGCAGAAGCTGGAAGACATGCGCAAAAAGGAGAAGAACATGCCCTGGAATGTGGACACGCTCAGCAAAGATGGCTTTAGCAAGAGCATGGTCAATACCAAGCCTGAGAAGGCAGAGGAGGACTCAGAGGAGGCAAGGGAGCAGAAACACAAGACCTTCGTTGAAAAATATGAGAAACAGATCAAGCATTTCGGCATGCTCCACCGCTGGGATGACAGCCAGAAATACCTGTCGGACAACGTCCACCTGGTGTGTGAGGAAACGGCCAACTACCTGGTTATCTGGTGCATTGACCTGGAGGTAGAGGAGAAATGTGCACTGATGGAGCAGGTAGCTCACCAGACCATGGTGATGCAGTTTATTCTGGAGCTGGCCAAGAGTCTGAAGGTCGACCCCCGAGCCTGCTTCCGGCAGTTTTCACCAAGATCAAGACCGCTGACCACCAGTACATGGAGGGCTTCAAGTATGAACTGGAAGCCTTTAAGAGCGAGTGCGGGGCCGCGCCAAGCTGCGAATAGAGAAGGCCATGAAGGAATATGAAGAGGAGGAGCGCAAGAAGAGGCTAGGCCCTGGTGGCCTGGACCCCGTGGAGGTCTACGAATCCCTGCCTGAGGAAGATCTTCCGCTCGAG
HMG(SEQ ID NO：13，316bp)：
GATCCCGAAGCCTCAGGGAGAGTCAAGCCACGTGGCGGTCCCGGCTCCTTCCGTTTCCTCGCCGAGGCCTAGAGGTCGTCCTCCCAAGGCGAAAGGACCTTCGTCGGAGGTGGAAACGAAGGTTGCAGCACCGAGTGGTTCCGGGAGGCCACGTGGACGACCACCGAAGAAGCAGAAGACGGAATCCGAGGCGGTTAAAGCCGAGGTTGAACCTGCGGAGGCTCCGGCTGGGGAGCGGAGAGGGCGTGGAAGGCCACCCAAAGCGAAGCCTGCGATGGTGCCTGTTGGTTGCTAAAGTTGACGCTGTAGCAAATCG
PEP(SEQ ID NO：14，312bp)：
CGGCGTTTCAGACATTCCTGAAGACTCTGTCTTCACCAGTGTGGACCAGTTCTTGGAGCCGCTTGAGCTTTGCTACAGGTCGCTATGCGACTGTGGAGACAGACCTATAGCCGATGGAAGCCTGCTAGACTTCTTGCGTCAAGTGTCTACATTTGGTCTGGCCCTTGTGAAGCTCGACATCCGTCAAGAATCCGACCGTCACACCGATGTTTTAGACGCGATCACGCAGCACCTAGGCATAGGTTCTTACAAAGAATGGTCAGAGGACAAGAGACAAGAGTGGCTATTATCCGAGCTGAGTGGGAAAGTCGA
OXY235-3(SEQ ID NO：11，267bp)：
GCGAATTTGGCCTGTAGTCCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGGGCCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGACTGGCAAGTTAATCTAGTTTCCGGTTATGAAGCACGGCGTGTCAGCTGATGGCAAGTTAATCTCCCCGAAGTCGACAAGACTCACACCACCATCTATCGAAGATGGAGCAGAACTGTCGTCAGCGCGTCGGACCTCGCCGTATCCATAGTAGAGTCTTTTAAAACGGGACCTTGTCGGGAT
RF1-5(SEQ ID NO：12，251bp)：
AGCTGTTGTGGGCCTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAATTTCCACCTTCACCTACGATGGGGGGCATCGCACCGGTGAGTAATATTGTACGGCTAAGAGCGAATTTGGCCTGTAGACCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGGGCCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGACTGGGTGAGGATGATGAGTCGCGTGTAGTCACCGGAAAAGATGGAAAAGGGTTCTTCGCCTGCTACTCTAGA
MS8-5(SEQ ID NO：6，224bp)：
CTGCAGACTATATTTCTTTCAAGATGGGAATTAATATCTACAAATTGCCTTTTCTTATCGACCATGTACTCGACGGCCGAGTTCGACGGCCGAGTACTGAAGAGAAAATTGCAAAGGTCGAATCATATTCGTACTGTAGTTAATAGAATATGATCAAAGCGTCCTCAAGGTTTATGGGCCACAGCATCCCACAAGTTTTTAAAATTTGTCCTTCGAGTGGCTCA
RF3-5(SEQ ID NO：7，294bp)：
CAATAACTTTGTTGGGCTTATGGTCGATAAGCGTGCGCATGTCTGATGGTACATGCTAAATGCTATATTTCTGTTTAAAGTGTTAAAATCATTTTCTGATGGAACTAAATCCAGTTTTAAGAGTAACTGACAAGTACAATTAAGCACAACAATAAAATAGTAGTAATTGGCATCTTTGATTGTTAAATATCAAACAATAAAGTTCAAAAAGAAATACCAAACCAATAATGAAGACTTGGCGGAGACAGTGCCGTGCGAAGGTTTTCGGAGGTCCGAGACGAGTTCAAAAGATCT
T45-5(SEQ ID NO：8，366bp)：
AGATCTGAGTCTCCCATTTATTTACGGTCACTATAAATTCTTCACTTGTCACTACAGAGATATATATGACAACACGACAATATGGATTAGAGAAAAGATAAAGAAACCATAAGCAAATCGGTTTATTCTCTACATTACATGAAATCTAAATATCTTGAAGTATTTTGAATGATAAAATAAAGGGTAAAATCAATGGACACATGAATTATGCATATGGAATACAGTTGTAAATGAATTCCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGAC
Topas19/2-3(SEQ ID NO：9，171bp)：
CGGCTCAGTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTAAAACGGCTTGTCCCGCGTCATCGGCGGGGGTCGTAACGTGACTCCCGGTCATATATCAGCGCCGGTCGGCCCCGGGCCTGGGGTGGGATTAAGGCCGAAGGCCCGAACCCATCCTAGTCTACA
RF2-5(SEQ ID NO：10，256bp)(该序列已经转换为反向)：
AGAGCCCAGTTCTTCCCATCTAATAGGGTGAGACAATATATCGACGTATATATAGCTGTGCCAGTACAATATTACTCACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTACTCACCGGTGCGATGCCCCCCATCGTAGGTGAAGGTGGAAATTAATGATCCATCTTGAGACCACAGGCCCACAACAGCTACCAGTTTCCTCAAGGGTCCACCAAAAACGTAAGCGCTTACGTACATGGTCGATAAGAAACTCGAG
实施例2、标准分子用于普通PCR检测的适用性鉴定
1、特异性测试
采用针对十一种转基因油菜品系特异性检测引物和三种转基因玉米品系特异性检测引物(表2)对标准分子pCanola9的特异性进行测试，结果如图2所示。以标准分子DNA为模板的扩增中，可在内标准基因PEP和HMG，转基因油菜RT73，T45，RF1，RF2，RF3，MS1，MS8，Oxy235和Topas19/2品系特异性序列扩增中得到明显目的条带(图2A)；以转基因玉米B T176，NK603和MON863品系特异性检测引物进行扩增时无可见条带产生，而各检测体系对应的阳性对照均有目的条带产生(图2B)，表明基因组DNA可进行PCR扩增。非转基因油菜能在内源基因PEP和HMG检测引物进行扩增时有明显可见条带产生(图2C)。
因此标准分子pCanola9特异于转基因油菜RT73，T45，RF1，RF2，RF3，MS1，MS8，Oxy235和Topas19/2品系的品系特异性检测。
2、检测灵敏度测试
本发明采用TakaRa Premix Ex Taq(大连宝生物公司，Cat.D332)和MastercyclerGradient PCR仪(德国Eppendorf公司)进行PCR扩增。实验结果如图3所示，可扩增目标片段MS1和Topas19/2的最低标准分子DNA拷贝数为5拷贝，相当于100ng油菜基因组DNA中含有约0.005％转基因成分；可扩增目标片段PEP、HMG、RT73、T45、Oxy235、MS8、RF1、RF2的最低标准分子DNA拷贝数为10拷贝，相当于100ng油菜基因组DNA中含有约0.01％转基因成分；可扩增目标片段RF3的最低标准分子DNA拷贝数为20拷贝，相当于100ng油菜基因组DNA中含有约0.02％转基因成分。
3、标准分子用于实时荧光PCR检测的适用性鉴定
A、标准曲线的制作
以10倍梯度稀释的标准分子DNA为模板，对十一个目标片段进行实时荧光PCR扩增，制作标准曲线。结果如图4所示。标准曲线的特征值见表5所示。
针对内标准基因PEP和HMG建立的标准曲线反应效率分别为0.90和0.97；对RT73、T45、RF3品系特异性序列建立的标准曲线反应效率均为1.01；对RF1品系特异性序列建立的标准曲线反应效率为1.12；对RF2品系特异性序列建立的标准曲线反应效率为1.02；对MS1和Topas19/2品系特异性序列建立的标准曲线反应效率为1.00；对MS8品系特异性序列建立的标准曲线反应效率为0.99；对Oxy235品系特异性序列建立的标准曲线反应效率为0.97。十一条标准曲线相关系数R2均大于0.998。
因此，以标准分子DNA为模板针对十一个目标片段建立的标准曲线反应效率在0.90～1.12之间，R2均大于0.998，在可接受范围内。
表5、实时荧光标准曲线方程
B、可重复性测试
以6个浓度的标准分子DNA为模板，对标准分子pCanola9中的十一个目标品系/基因分别进行实时荧光PCR反应间重复性测试，结果如表6所示。
对油菜内标准基因PEP的测试中，三次平行重复间拷贝数的RSDr值介于3.36％至24.87％间，三次反应间拷贝数的RSDR值介于2.26％至13.07％间，均在可接受范围内。
对油菜内标准基因HMG的测试中，RSDr值介于6.53％至23.70％间，RSDR值介于5.63％至15.40％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜RT73品系特异性序列的测试中，RSDr值介于5.99％至16.33％间，RSDR值介于3.82％至12.33％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜T45品系特异性序列的测试中，三次平行重复间拷贝数的RSDr值介于4.50％至8.70％间，三次反应间拷贝数的RSDR值介于2.55％至5.60％间，变异度较小。
对转基因油菜RF1品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中，RSDr值介于7.07％至28.85％间，较大的RSD值(28.85％)出现在以较低浓度(50拷贝)DNA为模板的扩增中，RSDR值介于5.49％至15.17％间。
对转基因油菜RF2品系特异性序列的测试中，RSDr值介于7.44％至23.89％间，RSDR值介于4.38％至13.79％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜RF3品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中，RSDr值介于4.06％至26.04％间，较大的RSD值(26.04％)出现在以较低浓度(50拷贝)DNA为模板的扩增中，三次反应间拷贝数的RSDR值介于5.69％至14.27％间，在可接受范围内。
对转基因油菜MS1品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中RSDr值介于1.32％至22.04％间，RSDR值介于2.18％至13.28％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜MS8品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中RSDr值介于4.75％至23.71％间，RSDR值介于3.09％至13.79％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜Oxy235品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中RSDr值介于1.15％至20.64％间，RSDR值介于2.54％至16.33％间，均在可接受范围内。
对转基因油菜Topas19/2品系特异性序列的实时荧光PCR扩增中RSDr值介于6.10％至17.25％间，RSDR值介于3.49％至13.97％间，均在可接受范围内。
上述相对标准偏差RSD值均在可接受范围内，因此以标准分子DNA为模板对十一个目的片段进行实时荧光PCR扩增的稳定性和重复性好。
表6、实时荧光PCR检测反应间重复性测试
3、LOD和LOQ测试
以标准分子pCanola9为标准品对十一个目的品系/基因在实时荧光PCR扩增中的检测下限和定量下限进行测试，结果见表7所示。
对内标准基因PEP的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板，均得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值分别为2.92和13.89％；以10拷贝DNA为模板，均得到扩增曲线，SD和RSD值分别为2.10和19.98％；以5拷贝DNA为模板，有7次(35％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增内标准基因HMG的LOD和LOQ均为10拷贝。
对内标准基因HMG的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板的20次反应，均得到扩增曲线，SD和RSD值为3.68和18.54％；以10拷贝DNA为模板，有19次(95％)得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为2.45和24.65％；以5拷贝DNA为模板，有5次(25％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增内标准基因HMG的LOD为10拷贝，而为了得到稳定的定量结果，则需要至少20拷贝标准分子DNA。
对RT73品系特异性序列的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板，均得到明显扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为2.42和12.98％；以10拷贝DNA为模板，有19次得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为2.05和21.98％；以5拷贝DNA为模板，有7次(35％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增RT73品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
对T45品系特异性序列的扩增中，以20拷贝和10拷贝标准分子DNA为模板，均得到20次扩增曲线，拷贝数的SD分别为1.99和1.76，RSD值分别为10.09％和17.89％；以5拷贝标准分子DNA为模板，有2次(10％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增T45品系特异性序列的LOD和LOQ均为10拷贝标准分子DNA。
对RF1品系特异性序列的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板，均得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为4.60和18.08％；以10拷贝标准分子DNA为模板的扩增中，有19次得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为3.04和23.89％；以5拷贝标准分子DNA为模板的扩增中，有5次(25％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增RF1品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
对RF2品系特异性序列的扩增中，以20拷贝和10拷贝标准分子DNA为模板，均得到20次扩增曲线，拷贝数的SD值分别为3.94和2.60，RSD值分别为19.97％和26.35％；以5拷贝标准分子DNA为模板，有6次(30％)得到扩增曲线；因此，以标准分子为标准品扩增RF2品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
对RF3品系特异性序列的扩增中，以20拷贝和10拷贝标准分子DNA为模板，均得到20次扩增曲线，检测拷贝数的SD值分别为2.87和1.63，RSD值分别为16.98％和19.25％；以5拷贝标准分子DNA为模板，有10次(50％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增RF3品系特异性序列的LOD和LOQ均为10拷贝标准分子DNA。
对MS1品系特异性序列的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板的20次反应，均得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为3.65和18.98％；以10拷贝标准分子DNA为模板，有19次(95％)得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为2.18和22.63％；以5拷贝标准分子DNA为模板，有13次(65％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增MS1品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
对MS8品系特异性序列的扩增中，以20拷贝和10拷贝标准分子DNA为模板的20次反应，均得到20次扩增曲线，拷贝数的SD值分别为2.46和1.34，RSD值分别为13.09％和14.22％；以5拷贝标准分子DNA为模板的扩增中，有14次得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增MS8品系特异性序列的LOD和LOQ均为10拷贝标准分子DNA。
对Oxy235品系特异性序列的扩增中，以20拷贝标准分子DNA为模板，均得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为2.97和13.89％；以10拷贝标准分子DNA为模板，有19次(95％)得到扩增曲线，拷贝数的SD和RSD值为1.78和16.67％；以5拷贝标准分子DNA为模板的扩增中，有8次(40％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增Oxy235品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
对Topas19/2品系特异性序列的扩增中，以20拷贝和10拷贝标准分子DNA为模板的20次反应，均得到20次扩增曲线，检测拷贝数的SD值分别为2.37和2.70，RSD值分别为11.54％和26.23％；以5拷贝标准分子DNA为模板，有6次(30％)得到扩增曲线。因此，以标准分子为标准品扩增Topas19/2品系特异性序列的LOD和LOQ分别为10和20拷贝标准分子DNA。
综上所述，以标准分子pCanola9为标准品针对十一个目的品系/基因用于实时荧光PCR扩增的绝对检测下限LOD均为10拷贝标准分子DNA。为了得到稳定的定量结果，PEP基因、转基因油菜T45、RF3和MS8品系特异性扩增LOQ为10拷贝标准分子DNA；对HMG基因、转基因油菜RT73、RF1、RF2、MS1、Oxy235和Topas19/2品系特异性检测LOQ为20拷贝标准分子DNA。
表7、标准分子实时荧光PCR反应的LOD和LOQ测试
III.讨论
转基因油菜种植量在转基因作物种植面积上仅次于大豆、玉米和棉花，列第四位。每年我国进口油菜籽和菜粕500万吨以上，因此检测监管尤为重要。近几年我国农业部相继对1种转基因抗草甘磷油菜品系RT73和6个抗除草剂品系(MS8×RF3，MS1×RF1，MS1×RF2，Oxy235，Topas19/2和T45)颁发了转基因生物安全证书允许进口用作加工原料。但经对目前国内外转基因检测标准物质的收集，少有转基因油菜基质标准物质出售，因此极大限制了检测工作的进行。
基于此，本发明充分收集上述7个转基因油菜品系外源插入片段与基因组DNA邻接区序列，并对其进行了系统的分析和比对。同时全面收集了我国现行国家标准、行业标准和国际公开刊物中针对上述7种转基因油菜品系特异性检测方法，构建了一个适用性更广、覆盖更全面的同时适于上述7种转基因油菜品系特异性检测的标准分子pCanola9。本研究将转基因油菜MS1 5’端品系特异性序列、RF1 5’端品系特异性序列、RF2 5’端品系特异性序列、MS8 5’端和3’端品系特异性序列、RF3 5’端和3’端品系特异性序列、Oxy235 5’端和3’端品系特异性序列、T45 5’端品系特异性序列、RT73 5’端和3’端品系特异性序列，以及油菜内标准基因HMG和PEP片段分别克隆到pEASY-T3载体中，使其适于现行标准和公开发布的检测方法要求。
经实验室内部验证，标准分子pCanola9特异于转基因油菜RT73、MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45、Oxy235和Topas19/2品系检测。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中，十一个目标品系/基因的检测下限分别为5拷贝(MS1和Topas19/2)、10拷贝(PEP、HMG、RT73、T45、Oxy235、MS8、RF1、RF2)和20拷贝(RF3)标准分子DNA，分别相当于含有约0.005％、0.01％和0.02％转基因油菜成分(100ng基因组DNA)。以标准分子DNA为模板，对十一个目标品系/基因进行实时荧光PCR扩增，获得的标准曲线反应效率在0.90～1.12之间，相关系数R2值均大于0.998，可重复性好。以标准分子pCanola9为标准品对十一个目的品系/基因在实时荧光PCR扩增中的检测下限均为10拷贝标准分子DNA；LOQ分别为10拷贝PEP基因、转基因油菜T45、RF3和MS8品系特异性序列、20拷贝HMG基因、转基因油菜RT73、RF1、RF2、MS1、Oxy235和Topas19/2品系特异性序列)。
因此，标准分子pCanola9可很好的替代植物来源的阳性标准品用于转基因油菜RT73、MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、T45、Oxy235和Topas19/2及其来源产品品系特异性检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种重组质粒，其特征在于，其包含以下序列片段：MS1 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；Oxy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；Topas19/2 3’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；Oxy235 3’端品系特异性序列；RF1 5’端品系特异性序列；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的RF1 5’端品系特异性序列与MS1 5’端品系特异性序列之间距离大于2000bp；或
所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。
3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，
所述的MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ ID NO：1所示；
所述的RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO：2所示；
所述的RF3 3’端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO：3所示；
所述的MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3)如SEQ ID NO：4所示；
所述的Oxy235 5’端品系特异性序列(OXY235-5)如SEQ ID NO：5所示；
所述的MS8 5’端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO：6所示；
所述的RF3 5’端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO：7所示；
所述的T45 5’端品系特异性序列(T45-5)如SEQ ID NO：8所示；
所述的Topas19/2 3’端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO：9所示；
反向的RF2 5’端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO：10所示；
所述的Oxy235 3’端品系特异性序列(OXY235-3)如SEQ ID NO：11所示；或
所述的RF1 5’端品系特异性序列(RF1-5)如SEQ ID NO：12所示。
4.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，
所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO：13所示；或
所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID NO：14所示。
5.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒中还包括来源于动物CDC37的基因片段。
6.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的大小为7000-10000bp。
7.权利要求1-6任一所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系。
8.一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中相应的转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系或Topas19/2品系特异性序列的存在与否以及存在量；
若待测油菜样品中存在RT73 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有RT73品系；
若待测油菜样品中存在MS1 5’端品系特异性序列以及存在RF1 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS1×RF1品系；
若待测油菜样品中存在MS1 5’端品系特异性序列以及存在RF2 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS1×RF2品系；
若待测油菜样品中存在MS8 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，以及存在RF3 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS8×RF3品系；
若待测油菜样品中存在T45 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有T45品系；
若待测油菜样品中存在Oxy235 5’端品系特异性序列和/或3’端品系特异性序列，则表明该样品含有Oxy235品系；
若待测油菜样品中存在Topas19/2 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有Topas19/2品系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中：
MS1 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；Oxy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；Topas19/2 3’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；Oxy235 3’端品系特异性序列和/或RF1 5’端品系特异性序列；以及
油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段；
将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜品系的存在与否以及存在量。
10.一种检测转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-6任一所述的重组质粒。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20130320 |