CN110894538B - 一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量检测方法 - Google Patents

一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量检测方法，所述试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于检测HMG基因特异性检测，所述第二引物探针组合用于转基因油菜品系MON88302特异性检测；第一引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.1所示，反向引物序列如Seq ID No.2所示，探针序列如Seq ID No.3所示；第二引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.4所示，反向引物序列如Seq ID No.5所示，探针序列如Seq ID No.6所示。该方法特异性强、线性范围宽、灵敏度高，具有重要实际意义。

Description

一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量 检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量检测方法。
背景技术
植物转基因，是将人工分离和修饰过的外源基因导入到需要改良的植物体中，使之产生新的性状，从而达到改良生物的目的。通过转基因技术可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等特性的作物新品种，以减少对农药、化肥和水的依赖，降低农业成本，大幅度地提高单位面积的产量，改善食品的质量，缓解世界粮食短缺的矛盾。自从1994年世界第一例转基因植物商业化以来，转基因作物得到了迅猛发展，并逐步发展成为能够产生巨大社会效益和经济利益的产业。截止2016年，全世界有26个国家的1540万农民种植了29种共1.851亿公顷的转基因作物，相比从1996年的170万公顷，转基因作物耕种面积增长超过110倍，21年间(从1996年至2016年)转基因作物的商业化种植面积累计达到了21亿公顷。根据Cropnosis机构的估计，全球转基因作物的市场价值为158亿美元，占2016年全球商业种子市场450亿美元市值的35％，预计全球已收获的“最终商业产品”的农场出场收入达到1580亿美元。全球共有29种作物313个转基因品系获得了批准和商业化，范围包括主要商业化作物如大豆、玉米、油菜籽、棉花、甜菜、木瓜、茄子和马铃薯，转基因苹果也将在2017年上市。全球约78％的大豆、26％的玉米、24％的油菜和64％的棉花种植的都是转基因产品。美国(7300万公顷)、巴西(4910万公顷)、阿根廷(2382万公顷)和加拿大(1155万公顷)是种植转基因作物最大的国家，占到世界总种植面积的85.1％。中国种植280万公顷转基因作物排在世界第八，主要包括棉花、白杨和木瓜。鉴于转基因技术在提高经济收益及改善人类健康方面有不可低估的潜力，世界很多国家纷纷将现代生物技术列为国家优先发展的重点领域，投入大量的人力、物力和财力扶持生物技术的发展。
油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是我国食用植物油和饲料蛋白的最主要来源，菜籽油产量占到食用油的60％以上，是国产食用植物油的第一大来源，其安全生产关乎国民健康和粮食主权问题。但是，油菜每年因病虫害引起的产量损失高达35％左右，转基因技术是减少病虫危害提高油菜产量和品质的重要途径之一。油菜的转基因研究进展始于1985年，Ooms等首次利用发根农菌转化甘蓝型油菜的子叶片得到转基因油菜，1994年，美国批准了第一例转基因油菜的商业化种植。截止2016年，加拿大、日本、美国、澳大利亚、韩国、智利等6个国家的45个转基因油菜品种已经开始商业化生产，性状主要集中在抗溴苯腈除草剂、高月桂酸含量、抗草甘膦除草剂、抗草胺膦除草剂和育性改变等几大方面。目前国内已经有197多个转基因油菜品系获得农业部批准进行大面积田间生产试验，迄今尚未见到有明显应用前景的产品可作为产业化的首选，与国外相比中国转基因油菜的研发和产业化，还处于明显的劣势地位。
然而由于我国是世界油料消费大国，油料供给长期处于短缺状态，2012-2018年，中国平均每年进口近350万吨油菜籽，占世界油菜籽总进口量的20％，主要进口来源国为加拿大、澳大利亚、蒙古和俄罗斯，进口的油菜籽95％以上都是转基因菜籽，允许进口的品系包括孟山都公司抗草甘磷品系RT73、MON88302和拜耳公司的7个抗除草剂品系(MS8xRF3、MS1xRF1、MS1xRF2、Oxy235、RF3、Topas19/2和T45)，由于中国尚未批准任何一种转基因油菜籽进行商业化种植，这些进口到中国的转基因油菜只能用作加工原料，禁止在中国种植。然而，由于非法转基因油菜籽品系繁多、生产和流通情况复杂，新型转基因品系缺乏统一的检测技术和手段，已经出现非法转基因油菜籽流入我国食品流通领域，使得我国转基因油菜籽的检验监管处于被动应付的局面，引起了国际社会的强烈关注，进而影响了我国非转基因油菜籽的出口贸易。因此，对转基因油菜进行有效的监管，对于保障我国的食用安全、饲用安全和环境安全具有重要的意义。
目前，应用最广的定量检测方法是实时荧光PCR(qPCR)，然而由于其稳定性、准确性差，因此，需要更加精准的检测方法进行替代。微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,DDPCR)，是一种在荧光PCR基础上发展起来的基因定量技术，具体而言，该技术是在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或含一个至数个待检核酸靶分子，或不含待检核酸靶分子；经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。微滴式数字PCR在科学研究方面已经取得了很大的研究进展，其在临床诊断、拷贝数鉴定、绝对定量等方面已经取得了诸多科研成果。Taly等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测直肠癌病人环状DNA的KRAS突变基因，最终实现了包括野生型的多重样品检测。在植物源制品的检测研究中，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR的检测限(Limit ofDetection，LOD)和定量限(Limit of Quantitation，LOQ)，探索了数字PCR在检测方面的可行性和反应条件，文章表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。Morisset等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)检测转基因玉米MON810含量，获得了和定量PCR一致的结果，该结果也间接证明了dPCR技术对于转基因定量检测的贡献。总体而言，dPCR技术目前更多地应用于医学诊断方面，已成为临床应用方面最具潜力的诊断技术之一，并在其它行业取得了突破性研究进展。但是，在转基因检测的研究方面，数字PCR还处于起始阶段，特别是在我国乃至全球各国的标准层面都暂无涉及，这极大制约了数字PCR在实际检测工作上的应用。因此，亟需进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测试剂，该试剂能够实现转基因能够实现转基因油菜品系MON88302的检测。
本发明还提出一种含有试剂的试剂盒及该试剂盒的其他部分应用。
本发明还提出一种针对转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法。
根据本发明的第一方面实施例的检测试剂，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于检测HMG基因特异性检测，所述第二引物探针组合用于转基因油菜品系MON88302特异性检测；
所述第一引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.1所示，反向引物序列如Seq ID No.2所示，探针序列如Seq ID No.3所示；
所述第二引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.4所示，反向引物序列如Seq ID No.5所示，探针序列如Seq ID No.6所示。
根据本发明的一些实施例，所述第一引物探针组合中探针和第二引物探针组合中探针的3′端均标记有荧光淬灭基团，5′端分别标记有不同荧光报告基团；优选地，所述第一引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团HEX，所述第二引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团FAM。
根据本发明第二方面实施例的应用，上述试剂在制备转基因油菜检测试剂盒或检测设备中的应用。
一种转基因油菜检测试剂盒，所述试剂盒中含有上述试剂。
根据本发明第三方面实施例的ddPCR定量检测方法，包括利用上述试剂进行PCR扩增的步骤。
根据本发明的一些实施例，所述方法包括以下步骤：
S1、利用上述试剂配制PCR扩增体系，将所述PCR扩增体系加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；
S2、将微滴进行PCR扩增反应，反应结束后，读取每个微滴的扩增信号；
S3、根据读取的扩增信号，采用软件分析品系MON88302的特异扩增拷贝数占HMG基因特异性扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系MON88302的含量。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中的PCR扩增体系中的组分含量如下2×ddPCR Supermix混合反应液10μL，第一引物探针组合中的正向引物、反向引物、探针及第二引物探针组合中的正向引物、反向引物、探针各1μL，模板DNA 1μL，加双蒸水补足至20μL。
根据本发明的一些实施例，所述PCR扩增体系中，第一引物探针组合和第二引物探针组合中的所有引物浓度分别为900nmol/L；第一引物探针组合和第二引物探针组合中的探针浓度分别为250nmol/L。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S2中PCR扩增反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃10min的酶热失活。
根据本发明实施例的试剂、试剂盒及定量检测方法，至少具有以下有益效果：本发明设计了一组MON88302转基因成分的特异性引物和荧光探针以及一组油菜籽内源基因(HMG)的特异性引物和荧光探针，建立了一套MON88302转基因油菜籽成分定量检测方法体系。本发明方法克服了实时荧光定量PCR的一系列缺点，在不依赖于任何标准物或参照物的情况下，能对样品中的MON88302转基因成分含量进行准确定量，而且特异性强、线性范围宽、灵敏度高，定量检测限可达4.73拷贝/反应，具有非常重要的实际意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中的MON88302转基因油菜籽成分特异性检测的结果分析图；
图2为本发明实施例2中的MON883022及HMG基因数字PCR线性范围拟合标准曲线图；
图3为本发明实施例3中85％含量的MON88302转基因油菜籽数字PCR检测结果图；
图4为本发明实施例3中15％含量的MON88302转基因油菜籽数字PCR检测结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明实施例1为一种转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，包括以下步骤：
S1、利用转基因油菜品系MON88302检测试剂(包括用于检测油菜籽内源基因HMG的引物探针组合和用于检测转基因油菜品系MON88302的引物探针组合，其中，用于检测油菜籽内源基因HMG的引物探针组合中的引物包括：HMG-Y-F1:5’-CGGAGGTGGAGACGAAAGTTGC-3’和HMG-Y-R1:5’-CCTTCCACGCCCTCTCCGCTC-3’，探针序列为：HMG-Y-P1:5’-HEX-CGGAGCCTCCGCAGGTTCAACATC-BHQ1-3’；用于检测转基因油菜品系MON88302的引物探针组合中的引物包括：MON88302-F:5’-CTCAGTATTTGTATTATCAGTTCC-3’和MON88302-R:5’-TTGGATCAGATTGTCGTTTCCCG-3’，探针序列为：MON88302-P:5’-FAM-TCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT-BHQ1--3’)配制PCR扩增体系，将所述PCR扩增体系加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；
S2、将微滴进行PCR扩增反应，反应结束后，读取每个微滴的扩增信号；
S3、根据读取的扩增信号，采用软件分析品系MON88302的特异扩增拷贝数占HMG基因特异性扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系MON88302的含量。
对该方法进行特异性验证，具体如下：
1、仪器、试剂与供试样品
仪器：伯乐QX200微滴数字PCR仪，全自动核酸提取系统，微量分光光度计，超速冷冻离心机。
试剂：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(购自伯乐生物有限公司)。
引物、探针由大连宝生物技术有限公司合成。
供试样品：MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、MON88302、T45、Topas19/2转基因油菜籽标准品。
分别称取各参照样品1.0g，采用改良CTAB磁珠法提取基因组DNA，得到的DNA溶液经微量分光光度计测定后定量至50ng/μL，即为上样模板。
2、反应体系的配制
PCR反应体系总体积为20μL，各组分如下：2×ddPCR Supermix混合反应液10μL，浓度为18μmol/L的引物HMG-Y-F1、HMG-Y-R1、MON88302-F、MON88302-R各1μL，浓度为5μmol/L的探针HMG-Y-P1、MON88302-P各1μL，模板DNA 1μL，加ddH2O补足至20μL；引物的终浓度为900nmol/L，探针的终浓度为250nmol/L。
3、微滴的生成
将充分混匀的反应体系小心地转移至微滴发生卡相应孔中，在每个对应油孔中分别加入70μL Droplet generation oil，盖上橡胶垫后放入微滴发生器中生成油包水的反应微滴。再小心地将反应微滴转移至96孔反应板中，并封好铝膜。
4、反应程序
将装有反应微滴的96孔反应板置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃10min的酶热失活。
5、读数与结果分析
反应结束后，将96孔板放入伯乐QX200微滴数字PCR仪中进行检测，检测结果如图1所示。从图1中可以看出，只有转基因油菜MON88302品系(A01)有扩增曲线，其余7个样品的DNA均未见扩增曲线，结果表明该引物探针对特异性良好。
本发明实施例二为一种转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法的线性范围验证，具体如下：
1、仪器与试剂
仪器：伯乐QX200微滴数字PCR仪，全自动核酸提取系统，微量分光光度计，超速冷冻离心机。
试剂：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(购自伯乐生物有限公司)；引物、探针(同实施例1)。
2、DNA模板的制备
将阳性样品的基因组分别稀释至50、10、2、0.4、0.08、0.016和0.0032ng/μl，将以上梯度稀释组的DNA模板进行数字PCR检测，每个浓度梯度组包含3个平行。
3、反应体系的配制
PCR反应体系总体积为20μL，各组分如下：2×ddPCR Supermix混合反应液10μL，引物HMG-Y-F1、HMG-Y-R1、MON88302-F、MON88302-R各1μL，探针HMG-Y-P1、MON88302-P各1μL，模板DNA 2μL，加ddH2O补足至20μL；引物的终浓度为900nmol/L，探针的终浓度为250nmol/L。
4、微滴的生成
将充分混匀的反应体系小心地转移至微滴发生卡相应孔中，在每个对应油孔中分别加入70μL Droplet generation oil，盖上橡胶垫后放入微滴发生器中生成油包水的反应微滴。再小心地将反应微滴转移至96孔反应板中，并封好铝膜。
5、反应程序
将装有反应微滴的96孔反应板置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃10min的酶热失活。
6、读数与结果分析
反应结束后，将96孔板放入伯乐QX200微滴数字PCR仪中进行检测，检测结果如表1所示，线性范围内的数据拟合标准曲线见图2。
表1油菜MON88302数字PCR标准的线性范围验证
Figure BDA0002287155630000081
由表1及图2可以看出，本发明方案方法在单位体系内参基因拷贝数位于4.73～13805.67的区间内可以呈现出良好的线性，R2为0.9999，所有浓度组的RSD值位于3.30％到15.38％之间，均小于25％；外源MON88302基因拷贝数位于4.53～13487.67的区间内可以呈现出良好的线性，R2接近1，所有浓度组的RSD值位于3.00％到14.71％之间，均小于25％。本方法在内参基因和外源基因拷贝数位于4.73～13487.67时，具有良好的定量能力，MON88302转基因检测方法的定量检测限可达4.73拷贝/反应。
本发明实施例三为一种转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法的准确度和精确度检测实验，具体如下：
1、仪器与试剂
仪器：伯乐QX200微滴数字PCR仪，全自动核酸提取系统，微量分光光度计，超速冷冻离心机。
试剂：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(购自伯乐生物有限公司)；引物、探针(同实施例1)。
2、DNA模板的制备
将阳性样品的基因组用阴性油菜籽分别稀释成85％和15％浓度的MON88302转基因油菜籽DNA，将以上梯度稀释组的DNA模板进行数字PCR检测，每个浓度梯度组包含8个平行。
2、反应体系的配制
PCR反应体系总体积为20μL，各组分如下：2×ddPCR Supermix混合反应液10μL，引物HMG-Y-F1、HMG-Y-R1、MON88302-F、MON88302-R各1μL，探针HMG-Y-P1、MON88302-P各1μL，模板DNA 1μL，加ddH2O补足至20μL；引物的终浓度为900nmol/L，探针的终浓度为250nmol/L。
4、微滴的生成
将充分混匀的反应体系小心地转移至微滴发生卡相应孔中，在每个对应油孔中分别加入70μL Droplet generation oil，盖上橡胶垫后放入微滴发生器中生成油包水的反应微滴。再小心地将反应微滴转移至96孔反应板中，并封好铝膜。
5、反应程序
将装有反应微滴的96孔反应板置于PCR仪中，反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃10min的酶热失活。
6、读数与结果分析
反应结束后，将96孔板放入伯乐QX200微滴数字PCR仪中进行检测，85％浓度的MON88302转基因油菜籽扩增信号图谱如图3所示，15％浓度的MON88302转基因油菜籽扩增信号图谱如图4所示，转基因油菜籽含量结果如表2所示：
表2油菜MON88302数字PCR标准的准确性验证
Figure BDA0002287155630000101
从表2及图3～4中可以看出，对于稀释成85％和15％浓度的MON88302转基因油菜籽DNA，在本实施例反应体系下检测到的拷贝数百分比的平均值分别为83.75％和14.93％，计算得到两种浓度的样品的相对误差分别为19.1％和18.8％，偏差符合要求，即小于25％，因此，本实施例的检测方法可以较准确的对转基因油菜品系MON88302进行绝对定量检测。
本发明方法适用于油菜籽及其产品中的MON883022转基因成分的定量检测，克服了实时荧光PCR定量检测需要依赖标准品的缺陷，在没有任何标准物或参照物的情况下，该方法能通过准确测定MON883022转基因成分和油菜籽内源基因成分的核酸拷贝数，从而计算出转基因成分的含量，实现转基因油菜MON883022品系的精准定量。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 拱北海关技术中心
<120> 一种转基因油菜品系MON88302检测试剂、试剂盒及ddPCR定量检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaggtgga gacgaaagtt gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggatcaga ttgtcgtttc ccg 23
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatcatgtt gtaccacttc aaacact 27

Claims (6)

1.一种转基因油菜品系MON88302检测试剂在制备转基因油菜检测试剂盒或检测设备中的应用，其特征在于：
所述转基因油菜品系MON88302检测试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于检测HMG基因特异性检测，所述第二引物探针组合用于转基因油菜品系MON88302特异性检测；
所述第一引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.1所示，反向引物序列如Seq IDNo.2所示，探针序列如Seq ID No.3所示；
所述第二引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.4所示，反向引物序列如Seq IDNo.5所示，探针序列如Seq ID No.6所示；
所述第一引物探针组合中探针和第二引物探针组合中探针的3′端均标记有荧光淬灭基团，5′端分别标记有不同荧光报告基团；
所述第一引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团HEX，所述第二引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团FAM。
2.一种转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，其特征在于：包括利用转基因油菜品系MON88302检测试剂进行PCR扩增的步骤；
所述转基因油菜品系MON88302检测试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于检测HMG基因特异性检测，所述第二引物探针组合用于转基因油菜品系MON88302特异性检测；
所述第一引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.1所示，反向引物序列如Seq IDNo.2所示，探针序列如Seq ID No.3所示；
所述第二引物探针组合中，正向引物序列如Seq ID No.4所示，反向引物序列如Seq IDNo.5所示，探针序列如Seq ID No.6所示；
所述第一引物探针组合中探针和第二引物探针组合中探针的3′端均标记有荧光淬灭基团，5′端分别标记有不同荧光报告基团；
所述第一引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团HEX，所述第二引物探针组合中探针的5′端均标记有荧光报告基团FAM。
3.根据权利要求2所述的转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
S1、利用所述转基因油菜品系MON88302检测试剂配制PCR扩增体系，将所述PCR扩增体系加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；
S2、将微滴进行PCR扩增反应，反应结束后，读取每个微滴的扩增信号；
S3、根据读取的扩增信号，采用软件分析品系MON88302的特异扩增拷贝数占HMG基因特异性扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系MON88302的含量。
4.根据权利要求3所述的转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1中的PCR扩增体系中的组分含量如下2×ddPCR Supermix混合反应液10μL，第一引物探针组合中的正向引物、反向引物、探针及第二引物探针组合中的正向引物、反向引物、探针各1μL，模板DNA 1 μL，加双蒸水补足至20μL。
5.根据权利要求4所述的转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，其特征在于：所述PCR扩增体系中，第一引物探针组合和第二引物探针组合中的所有引物浓度分别为900nmol/L；第一引物探针组合和第二引物探针组合中的探针浓度分别为250nmol/L。
6.根据权利要求3所述的转基因油菜品系MON88302的ddPCR定量检测方法，其特征在于：所述步骤S2中PCR扩增反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火10s，68℃延伸20s，40个循环；扩增结束后进行98℃ 10min的酶热失活。
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