CN105316345A - 川油36油菜育性恢复基因及纯度和纯合度检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物育种领域，特别是涉及一种川油36油菜育性恢复基因及纯度和纯合度检测方法。川油36油菜育性恢复基因，其碱基序列如SEQ？ID？No：1所示。利用川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法包括：提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQ？ID？No：2和SEQ？ID？No：3所示序列的引物进行PCR，对扩增产物进行电泳检测，并判断待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段。该方法通过特定的引物，对川油36油菜恢复系进行了分子检测，操作方便，结果可靠。主要操作为田间取样、提取基因组总DNA，PCR扩增及电泳检测；能快速、准确地得到检测结果。

Description

川油36油菜育性恢复基因及纯度和纯合度检测方法

技术领域

本发明属于作物育种领域，特别是涉及一种川油36油菜育性恢复基因及纯度和纯合度检测方法。

背景技术

油菜是几种杂种优势利用获得最成功的作物之一。其杂种优势利用的主要途径有：细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育(GMS)和化学杂交剂诱导雄性不育。其中，甘蓝型油菜萝卜胞质不育系(oguraCMS)花药退化，花粉全无，不育性十分稳定、彻底，被公认为目前世界上不育性最稳定、最好的油菜不育材料。

Heyn通过有性杂交将萝蓝中的萝卜恢复基因导入到甘蓝型油菜，获得了育性部分恢复的OguCMS属间杂交种；Pelletier等在原生质体融合的胞质杂种中，获得甘蓝型油菜性状完全恢复株，但恢复基因伴有的萝卜染色体片段与高硫苷基因紧密连锁，并导致恢复材料结实率低、农艺性状差。油菜oguCMS早期由于恢复系的缺乏一直没有得到推广应用。因此，筛选恢复系、保证恢复系种子纯度，研究利用甘蓝型油菜萝卜细胞质不育系，成为油菜育种领域的热点问题和难题。

“川油36”油菜是目前全国唯一一个通过了长江上、中下游审定的油菜品种，优质、高产、栽培广。在此之前，对于川油36油菜恢复系(JR系，父本)的纯度、以及F1代杂交种纯度的鉴定，都是采用传统的方法，即测交、自交、种植观察、育性调查和夏繁鉴定等。具体的，主要体现在以下三种方法：

1)、自交和测交

传统育种过程中，如果要鉴定一批JR恢复系种子的纯度，即要鉴定一批种子中有多少种子含有恢复基因，有多少种子是不含该基因的混杂样，需要将这批种子播种，等到开花时节采集JR系各单株的花粉(并挂牌子、记录)，再分别与不育系进行一对一人工授粉，然后再套袋，收集套袋种子，下一季节种植鉴定，经育性调查后统计单株恢复度和群体恢复株率，最终鉴定出原JR系一批种子中哪些是含有恢复基因的合格样，哪些是不含该基因的杂苗子。如果要鉴定JR系所含有的恢复基因是否为纯合，则需要先对其套袋自交，再将下一代进行测交，这样需要至少2个生长季。

2)、观察，即田间调查

通过有经验的人观察油菜植株的形态特征(例如株型、株高、叶片形状、分枝数、分枝夹角、花期、花瓣颜色等)来判断该植株是否属于某一已知品种(或材料)；然后统计一块地中属于该品种(或材料)的植株数量，计算得出植株或种子的纯度。

3)、夏繁鉴定

所谓夏繁，是为了缩短育种年限，加快良种繁育，许多研究单位在夏季选择能够满足油菜通过低温春化的比较冷凉的高海拔地区，进行加代繁殖，或花期育性鉴定。四川省平原地区甘蓝型油菜育种，除了正季(每年10月至次年5月)外，为了加快繁殖进程和缩短育种周期，通常选择在阿坝州、甘孜州甚至省外高海拔地区进行异地繁殖(5月至9月)，在此过程中行进观察、测量等鉴定。

然而，对于上述所举出的几种油菜恢复系(JR系，父本)的纯度、以及F1代杂交种纯度的鉴定方法中，第1种方法需要对恢复系单株采集花粉，再对不育系单株人工授粉，操作费时、费工；自交或者测交需要1-2个生长季，周期太长，育种进程缓慢。

第2种方法中，利用经验来观察，具有主观性，所以观察得出的结论有时会因人而异；重复性差、不准确，因为外在表型往往受环境(如光照时间、温度、土壤养分等)影响较大，而使得判断不准确；只能观察外在变化，对于一些不易用肉眼观察的指标(如种子含油率、硫苷含量等)则无法考察；此外，还有可能需要等待很长时间，比如对于油菜花期的早迟、花是否可育、花瓣颜色等性状，则必须等待至少4个月才能进行观察，耗时太长，影响育种效率，筛选的准确性也不高。

第3种方法中，需要在每年正季收获种子之后，短时间内进行种子整理、品质分析，然后及时奔赴高海拔地区夏繁种植鉴定，存在选种过程较仓促、很难仔细操作；需要长途跋涉，产生巨额差旅费、运输费、土地租赁费、基地管理费等缺陷；此外，其同样存在生长周期长，耗时太久，在下季杂交种子销售前无法获得纯度检测的可靠结果等缺陷。

综上所述，这些传统方法普遍存在操作费时费工，鉴定周期长，结果具有主观性，不准确等缺陷。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种川油36油菜育性恢复基因，将其应用于川油36油菜恢复系纯度的分子检测中，从而解决现有技术中的检测方法存在的鉴定周期长，结果具有主观性，不准确以及费时费工的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种利用川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系及其后代纯度的方法。该方法通过特定的引物，对川油36油菜恢复系进行了分子检测，操作方便，结果可靠。该方法的主要操作为田间取样、提取基因组总DNA，PCR扩增及电泳检测；整个过程仔细而充分，能快速、准确地得到检测结果。

为了达到以上目的，本发明采取如下技术方案：

川油36油菜育性恢复基因，其碱基序列如SEQIDNo：1所示。

SEQIDNo：1所示为是一个全新的序列，该序列可以认为是川油36油菜育性恢复基因，通过基因检测的手段，检测待测油菜中是否含有该基因片段即可得知恢复系纯度；大大的简化了传统自交和测交检测方法存在的耗时长，结果不准确的缺陷，为检测川油36油菜恢复系纯度的方法提供了新的思路。

一种利用川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，包括如下步骤：

提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的引物进行PCR，对扩增产物进行电泳检测，并判断待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段。

通过特定的引物(SEQIDNo：2和SEQIDNo：3)，可以检测到每个待测植株是否含有该恢复基因；从而可确定该批待测植株的纯度。该方法从田间取样到提取基因组总DNA，再到PCR扩增及电泳检测的周期较短，所以在同样的时间内，操作可以很仔细而充分，能快速、准确地得到实验结果；比起依赖于经验的观察法，更加易于掌握，而且还具有理性化、标准化、可以重复的特征，检测结果不会因人而异，准确客观。

此外，因为DNA序列是植物内在的、必然的、稳定的、遗传上客观存在的特征，所以基于DNA序列和位置的标记技术反应出来的结果不受环境、生长时期、采样部位等的影响，不会由于主观经验因人而异，操作快捷方便，方法易于传授和扩散，结果重复性好。

优选的，所述待检测川油36油菜包括川油36油菜恢复系的种子或植株。

对于一批川油36油菜恢复系，非常适于利用分子检测的方法检测其纯度，结果快速准确。克服了传统的技术中，需要把这批种子都种到地里，等到开花时节采集恢复系各单株的花粉(并挂牌子、记录)，再分别与不育系进行一对一人工授粉，然后再套袋，收集套袋种子，下一季节种植鉴定，经育性调查后统计单株恢复度和群体恢复株率，最终鉴定出原恢复系一批种子纯度而存在的操作繁琐费时的缺陷。

优选的，该方法具体包括：

提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列为恢复基因引物；以SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列为不育基因引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测；

通过电泳检测待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段、不育基因的片段，判断待检测川油36油菜的纯度和纯合度。

对于该检测方法，通过再添加额外的不育基因引物(以SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列)；从而检测样本的纯合度，即通过该特定的引物可以实现样本中恢复基因和不育基因的同时检测，若样本中同时含有恢复基因好不育基因，则可判定样本为杂合，反之，可为纯和不育系或纯和恢复系。也即该方法实现了检测样本纯度和纯合度的同时检测，极大地节约了检测时间。

优选的，所述待检测川油36油菜包括川油36油菜恢复系、所述川油36油菜恢复系与不育系杂交后产生的F1代的种子或植株。

通过该方法，不但可实现待鉴别植株或种子是否含有恢复基因(JR-Rf基因)，进而检测JR(父本)的纯度、纯合度；而且也还可以实现川油36油菜恢复系与不育系杂交后产生的F1代的纯度。该标记操作快捷方便，结果准确可靠。

优选的，所述PCR扩增的过程中，所述恢复基因引物与所述不育基因引物的体积比为9:1。

具体的，在PCR的过程中，由于不育基因引物的特定序列，其具有较强的结合性，因此，需要增大恢复基因引物的加入量，以防止出现恢复基因无法跑出条带的缺陷；因此优选恢复基因引物与所述不育基因引物的体积比为9:1。

优选的，述PCR扩增的反应体系为：

模板DNA1.8-2.2μL；SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列的不育基因引物各0.18-0.22μL；SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的恢复基因引物各1.62-1.98μL；MIX8-10μL；水补至20μL。

上述的反应体系，其模板DNA、引物以及MIX等浓度选择适宜，非常适于目的片段的扩增，便于提高检测结果的准确性。

一种获取所述的川油36油菜育性恢复基因的方法，包括以下步骤：

1)、以川油36油菜恢复系为父本，以不育系做母本进行杂交，得到F1代种子后播种，并将处于花期的F1单株套袋自交，得到F2代种子；

2)、将F2代种子播种，在花期得到可育单株和不可育单株；

3)、分别提取多个所述可育单株、不可育单株的总DNA后进行混合，得到可育混合DNA和不可育混合DNA；

4)、分别以所述可育混合DNA和不可育混合DNA为模板，以SSR引物或SRAP引物进行扩增并将产物进行电泳检测，筛选出可育混合DNA能够扩增出，但不可育混合DNA不能扩增出的片段；

5)、将所述片段测序后，进行比对，筛选得到目标片段，并以如SEQIDNo：6和SEQIDNo：7所示的引物进行扩增，得到全长的川油36油菜育性恢复基因。

该方法通过构建F2代分离群体、提取单株DNA，构建混合池、PCR，筛选标记，分析标记，测序，得到全长等一系列的操作得到恢复基因的序列，该序列经过Blast比对发现，为一全新的序列，利用与JR-Rf连锁的其它标记的分析，得出JR-Rf基因也位于连锁群LinkageGroupN19上，但是该交换片段的大小与oguraCMS恢复系的大小不一致。

优选的，在步骤3)中，具体包括：

分别提取100-150株所述可育单株、不可育单株的总DNA；再分别从可育单株的总DNA以及不可育单株的总DNA中抽取80-120个样本DNA，分别进行混合，得到可育混合DNA和不可育混合DNA。

更具体的，对F2群体(可育单株、不可育单株)进行编号、挂牌和详细记录。摘取其中约150个可育单株的叶片，以及150个不育单株的叶片；对300多个叶片样本分别用CTAB法提取总DNA，得到300多管DNA样本，每一管编号与田间植株及其育性相对应。

用ThermoNanoDrop2000C超微量分光光度计检测DNA样本的质量和浓度，淘汰不合格样本，将合格的DNA溶液经不同程度稀释，使其浓度相同。在可育的DNA样本中，随机抽取100管，每管取10μL，加入一个新的EP管，得到一管1000μL的可育混合DNA；再在不育的DNA样本中，随机抽取100管，每管取10μL，加入一个新的EP管，得到一管1000μL的不可育混合DNA。至此混合池构建完毕。

该方法采用多株采样，克服了单株取样存在特异性而导致所获得混合DNA不具有代表性的缺陷，进一步地为获取恢复基因提供了保障。

优选的，在步骤5)中，所述扩增的反应体系为：

目标片段2μL，dNTP2μL，buffer2μL，上下游引物各1μL，高保真Taq酶0.2μL，ddH₂O11.8μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在以下方面：

1)、提供了一种川油36油菜育性恢复基因，为检测川油36油菜恢复系纯度和纯合度的方法提供了新的检测手段；从而解决现有技术中的检测方法存在的鉴定周期长，结果具有主观性，不准确以及费时费工的技术问题。

2)、该检测方法操作方便，结果可靠；主要操作为田间取样、提取基因组总DNA，PCR扩增及电泳检测；整个过程仔细而充分，能快速、准确地得到检测结果。

3)、该检测方法在实现待测样本纯度和纯合度检测的过程中，不需要长途跋涉到太远的异地，减少了差旅费、运输费等成本；节约时间，且不易造成种子丢失或弄混等；比起依赖于经验的观察法更易于学习和操作。

4)、DNA序列是植物内在的、必然的、稳定的、遗传上客观存在的特征，所以基于DNA序列和位置的标记技术反应出来的结果不受环境、生长时期、采样部位等的影响，不会由于主观经验因人而异，操作快捷方便，方法易于传授和扩散，结果重复性好；而且对植株进行单株定株检测，且(只采叶片)不影响植物继续正常生长。

附图说明

图1为本发明实施例1中可育混合DNA和不可育混合DNA用不同引物进行PCR结果电泳图；

图2为本发明实施例1中的JR-Rf在连锁群上的位置及交换片段的大小示意图；

图3为本发明实施例2中的用于鉴定川油36油菜恢复植株的纯度及纯合性的结果图；

图4为本发明实施例3中的用于鉴定川油36油菜恢复植株的纯度及纯合性的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了川油36油菜育性恢复基因的克隆方法，具体步骤如下：

S11、以川油36油菜恢复系为父本，以不育系做母本进行杂交，得到F1代种子后播种，并将处于花期的F1单株套袋自交，得到F2代种子；

将两个亲本杂交，不育系做母本，川油36油菜恢复系(恢复系JR)做父本，得到F1代种子。

将所有可育F1代种子播种，F1代表型为全部可育，基因型为杂合；在花期将可育的F1单株套袋自交，得到F2代种子。

S12、将F2代种子播种，在花期得到可育单株和不可育单株；

种植F2代群体，花期观察发现，F2代出现了约3:1的性状分离，即可育的单株与不育的单株数量为三比一。至此得到了F2分离群体。

S13、分别提取多个所述可育单株、不可育单株的总DNA后进行混合，得到可育混合DNA和不可育混合DNA；

具体的，该步骤中，对F2群体进行编号、挂牌和详细记录。摘取其中约150个可育单株的叶片，以及150个不育单株的叶片；对300多个叶片样本分别用CTAB法提取总DNA，得到300多管DNA样本，每一管编号与田间植株及其育性相对应。

用ThermoNanoDrop2000C超微量分光光度计检测DNA样本的质量和浓度，淘汰不合格样本，将合格的DNA溶液经不同程度稀释，使其浓度相同。在可育的DNA样本中，随机抽取100管，每管取10μL，加入一个新的EP管，得到一管1000μL的可育混合DNA；再在不育的DNA样本中，随机抽取100管，每管取10μL，得到一管1000μL的不可育混合DNA。

S14、分别以所述可育混合DNA和不可育混合DNA为模板，以SSR引物或SRAP引物进行扩增并将产物进行电泳检测，筛选出可育混合DNA能够扩增出，但不可育混合DNA不能扩增出的片段；

分别以可育混合DNA和不可育混合DNA为模板，用600对SSR引物、400对SRAP引物进行PCR扩增并电泳检测。筛选出可育混合DNA能够扩增出，但不可育混合DNA不能扩增出的片段；具体如图1所示。

S15、将所述片段测序后，进行比对，筛选得到目标片段，并以如SEQIDNo：6和SEQIDNo：7所示的引物进行扩增，得到全长的川油36油菜育性恢复基因。

根据BSA法的原理和上述S14得到的结果，S14所得到的片段都与育性恢复相关；有可能是恢复基因本身，或者也可能是与恢复基因紧密连锁。

为了更明确它们的序列和功能，将其中重复性、稳定性好的片段切胶回收，再送交测序。得到核酸序列后，将其逐个在线提交到NCBIGenbank进行分析比对。

发现，其中A片段(自命名，约为250bp)，所用引物如下：

A-1：5’-ATGCTTCGATCTCGTCCTTT-3’；

A-2：5’-GTAACAACATCAGGGTGGAG-3’)；

与萝卜oguraCMS恢复基因RsRf3-1(GenBank:JX521806.1，全长)的部分片段相似度超90％但又存在差异；与甘蓝型油菜oguraCMS恢复基因PPR-B-L1(GenBank:FJ455099.1，片段)也有较高一致性，但又不完全一样。其它片段多是与A片段连锁，但不编码的基因组DNA片段。

综上，认为A片段是育性恢复的主效基因编码区的一部分，并将该基因暂定名为JR-Rf(目标片段)。

为了得到JR-Rf全长，根据已公布的甘蓝型油菜oguraCMS恢复基因(FJ455099.1)部分片段的序列，用PrimerPremier5等软件，设计(第一外显子全长)引物，序列如下(分别为SEQIDNo：6和SEQIDNo：7)：

Bn-Rf-1:5’-ATGTTGGCTAGGGTTTGCAGAT-3’

Bn-Rf-2:5’-TTAAGCATTGCACTGCCCTTTT-3’；

反应体系(20μL)：

DNA2μL，dNTP2μL，buffer(含Mg²⁺)2μL，上下游引物各1μL，高保真Taq酶0.2μL，ddH₂O11.8μL混合。

按以下程序进行PCR：

预变性94℃for5min；35个循环：94℃for30sec，56℃for30sec，72℃for1min10sec；终延伸72℃for7min；15℃for5min。

经过上述步骤，PCR得到约2017bp的片段，测序。这段序列(命名为JR-Rf)如SEQIDNo：1所示；比较JR-Rf与甘蓝型油菜oguraCMS恢复基因PPR-B-L1(GenBank:FJ455099.1，第一外显子片段)，序列相似性90.93％。进一步用Blast比对发现，JR-Rf的序列是未报道过的，是全新的；如图2所示，利用与JR-Rf连锁的其它标记的分析，得出JR-Rf基因也位于连锁群LinkageGroupN19上，但是该交换片段的大小与oguraCMS恢复系的大小不完全一致。

实施例2

利用川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，包括如下步骤：

提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的引物进行PCR，对扩增产物进行电泳检测，并判断待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段。

引物序列如下：

New-F-1：5’-GGCTAGGGTTTGTGGATTCAA-3’

New-R-1：5’-CAAACTCACTCCTCCAAAACCT-3’；

具体的，PCR的过程中，预变性94℃for5min；35个循环：94℃for30sec，55℃for30sec，72℃for30sec；终延伸72℃for10min；15℃for5min。

对于一批油菜包括川油36油菜恢复系检测样本，结果如图3所示，上部箭头所指的约150bp的片段，则含有恢复基因；纯合恢复系植株只有150bp片段(如图中JR)；杂合恢复基因植株则含有大小两个带(如图中1～4)；纯合不育系植株则只有120bp片段(如图中JA和下部箭头所指)；M:DNAmarkerD2000；JA:JA40(纯合不育性)；JR:JR9(纯合恢复性)；1～4:F1代4个单株(杂合恢复性)。

实施例3

利用川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系后代的方法：

提取待检测川油36油菜(包括川油36油菜恢复系与不育系杂交后产生的F1代的植株)的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列为恢复基因引物；以SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列为不育基因引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测；

所述PCR扩增的反应体系为：

模板DNA2μL；SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列的不育基因引物各0.2μL；SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的恢复基因引物各1.8μL；MIX10μL；水补至20μL；

PCR程序为：

a)94℃for5min；

b)35times：94℃for30sec，50℃for30sec，72℃for45sec；

c)72℃for15min；

d)15℃for5min。

通过电泳检测待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段、不育基因的片段，判断待检测川油36油菜的纯度和纯合度。

对于一批检测样本，结果如图4所示，中间一行箭头所指的约150bp的片段，则含有恢复基因；纯合恢复系植株只有150bp片段(如图4中JR)；F1代杂合恢复基因植株(杂合恢复性)则含有大小两个带(如图4中1～4)；纯合不育系植株则只有120bp片段(如图4中JA，底部箭头所指)；顶部箭头所指为不育基因。

尽管，上文中已通过具体实施案例对本发明做了详尽介绍，但应认识到以上的描述不应被认为是对本发明的限制。在本发明基础上，本领域技术人员可对以上步骤作适当修改和改进，这将是显而易见的。因此，在不偏离本发明的基础上所做的修改和改进，均属于本发明要求保护的范畴。

Claims (10)

1.川油36油菜育性恢复基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNo：1所示。

2.一种利用权利要求1所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的引物进行PCR，对扩增产物进行电泳检测，并判断待检测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段。

3.根据权利要求2所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，所述待检测川油36油菜包括川油36油菜恢复系的种子或植株。

4.根据权利要求2所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，该方法具体包括：

提取待检测川油36油菜的总DNA作为模板DNA，以如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列为恢复基因引物；以SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列为不育基因引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳检测；

通过电泳检测待测川油36油菜是否含有所述油菜育性恢复基因的片段、不育基因的片段，判断待检测川油36油菜的纯度和纯合度。

5.根据权利要求4所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，所述待检测川油36油菜包括川油36油菜恢复系、所述川油36油菜恢复系与不育系杂交后产生的F1代的种子或植株。

6.根据权利要求5所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，所述PCR扩增的过程中，所述恢复基因引物与所述不育基因引物的体积比为9:1。

7.根据权利要求6所述的川油36油菜育性恢复基因检测川油36油菜恢复系纯度的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：

模板DNA1.8-2.2μL；SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示序列的不育基因引物各0.18-0.22μL；SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示序列的恢复基因引物各1.62-1.98μL；MIX8-10μL；水补至20μL。

8.一种获取权利要求1所述的川油36油菜育性恢复基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、以川油36油菜恢复系为父本，以不育系做母本进行杂交，得到F1代种子后播种，并将处于花期的F1单株套袋自交，得到F2代种子；

2)、将F2代种子播种，在花期得到可育单株和不可育单株；

3)、分别提取多个所述可育单株、不可育单株的总DNA后进行混合，得到可育混合DNA和不可育混合DNA；

4)、分别以所述可育混合DNA和不可育混合DNA为模板，以SSR引物或SRAP引物进行扩增并将产物进行电泳检测，筛选出可育混合DNA能够扩增出，但不可育混合DNA不能扩增出的片段；

5)、将所述片段测序后，进行比对，筛选得到目标片段，并以如SEQIDNo：6和SEQIDNo：7所示的引物进行扩增，得到全长的川油36油菜育性恢复基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，具体包括：

分别提取100-150株所述可育单株、不可育单株的总DNA；再分别从可育单株的总DNA以及不可育单株的总DNA中抽取80-120个样本DNA，分别进行混合，得到可育混合DNA和不可育混合DNA。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述扩增的反应体系为：

目标片段2μL，dNTP2μL，buffer2μL，上下游引物各1μL，高保真Taq酶0.2μL，ddH₂O11.8μL。