CN103333953B - 一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，包括：提取待检测种子或其长成的植株样品的基因组DNA；根据雄性核不育基因的功能性单核苷酸多态性位点，设计引物，进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行特性分析，确定样品的基因型，计算得到种子样品的纯度。本发明根据功能基因的功能性单核苷酸多态性位点开发分子标记，任何杂交组合的双亲之间必然存在多态性，在进行杂交种子纯度鉴定时不需要先对双亲进行研究，因此可以直接对所有以本发明涉及的两系不育系为母本的两系杂交组合进行分析。另外，本发明方法通过常规的室内试验，经济，简便，快速，准确鉴定水稻杂交种子纯度。
Description
技术领域
本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法。
背景技术
植物雄性不育特性可由细胞质基因引起，称细胞质雄性不育(CMS)，也可因核基因突变引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其杂种优势利用必须依赖于雄性不育性。在杂交水稻研究和应用之初，使用的雄性不育系都是CMS类型。1973年石明松在湖北晚粳稻品种农垦58群体中发现了自发突变的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitivegenic male sterile，PGMS)株，后来定名为农垦58S(石明松,中国农业科学,1985,2:44-48)，开启了利用光温敏雄性不育特性培育两系法杂交水稻的序幕。
经过几十年的研究，两系不育系根据其对光照长度和温度的敏感性可分为光敏不育(PGMS)、温敏不育(temperature-sensitive genic male sterility,TGMS)和光温敏核不育(P/TGMS)三类(程式华,中国农业科学,1996,29(4):11-16)。PGMS水稻具有长日照条件下抽穗雄性不育，短日照条件下抽穗雄性可育的基本特征，如农垦58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高温条件下抽穗雄性不育，低温条件下抽穗雄性部分可育，如安农S-1(邓华凤等,杂交水稻,1999,14(3):1-3)，广占63S(杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6)，株1S(杨远柱等,杂交水稻,2000,15(2):6-9)等。PGMS和TGMS共同构成了目前生产上大面积应用的两系法杂交稻不育系基因的来源。
系谱分析表明大多早期商业化应用的P/TGMS系主要有3个起源：农垦58S，安农S-1和株1S(斯华敏等,作物学报,2012,38(3):394-407)。此外，不同的育种单位也相继育成了一些光温敏水稻不育系，如琼香1S(郭国强等,杂交水稻,2009,24(1):399-400)，绵9S(王志等,西南农业学报,1999,12(4):11-14)，雁农S(阳花秋等,杂交水稻,1996(1):9-10)等。在农垦58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S(赵海军等,中国水稻科学,2004,18(6):515-521)，而有些则表现为温敏特性如广占63S(杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6)。大量遗传分析表明，PGMS和TGMS都受单隐性基因控制，如安农S-1(Yang等.Planta,2007,225:321-330)，株1S(杨远柱等,中国稻米,2007,(6):17-22)。
在两系杂交稻种子的生产过程中，除与三系杂交稻生产一样需要做好制繁种田的隔离，防止不同制繁种田之间以及与常规生产田的水稻出现花粉污染，造成种子纯度下降外，还需要特别注意避免因与异常天气如温度和日照长度造成不育系育性恢复的问题。为确保杂交种子纯度，一般需要在种子销售前开展种子纯度的田间或分子鉴定。
目前，我国杂交水稻杂种纯度鉴定的方法主要有3种：形态学鉴定法，同工酶和蛋白质电泳鉴定法，分子标记鉴定法。常规鉴定方法是抽样田间小区种植，进行形态观察，但是这种方法费时费力，易受环境影响，不利于种子的商品化销售，因此迫切需求杂种纯度鉴定的简易快速技术。
分子标记鉴定法在一定程度上简化了操作步骤，目前用于杂交水稻种子纯度的分子鉴定主要利用微卫星标记，已经建立起了标准化的通用技术体系(彭锁堂等，中国水稻科学，2003，17(1)：1-5；李召华等，杂交水稻，2006，21(4)：11-14)。但是，这一技术体系需要针对每个组合首先确定双亲的多态性分子标记，日后根据这些多态性标记的杂合性确定是不育系自交种还是杂交F1种子。目前尚未建立起基于PGMS或TGMS基因差异的通用两系杂交种子纯度鉴定方法。
发明内容
本发明提供了一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，通用性强，简单方便，且鉴定结果准确可靠。
一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，包括：
(1)提取待检测种子或其长成的植株样品的基因组DNA；
(2)根据雄性核不育基因的功能性单核苷酸多态性位点，设计引物，进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行特性分析，确定样品的基因型，计算得到种子样品的纯度。
本领域人员可以理解，功能性单核苷酸多态性位点即与表型直接相关的单核苷酸多态性位点，在该位点，单个核苷酸的变异可导致表型发生变化。
待检测种子为两系不育系与可育材料配制杂交组合产生的杂种一代种子，其中两系不育系携带和农垦58S相同的光敏不育基因即携带如SEQID NO.1所示的lncR基因，或者两系不育系携带和广占63S相同的温敏不育基因即携带如SEQ ID NO.2所示的RNaseZ基因。
经对目前已经育成的不同来源的光敏不育水稻材料(表1.1)所做分析，这些材料均携带与农垦58S相同的光敏不育基因。同样，不同来源的温敏不育系均携带与广占63S相同的一个温敏不育基因(表1.2)。因此，本发明的方法均适用于目前所有的两系不育系与可育材料产生的杂种一代种子纯度的鉴定。
表1.1光敏不育系及其系谱
表1.2温敏不育系及其系谱
提取种子样品基因组DNA时，对提取方法没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。
显然的，提取种子样品基因组DNA时，可以直接从种子中提取，也可以在种子萌发形成的植株中提取。
所述特性分析为高分辨率溶解曲线分析或扩增产物酶切片段多态性分析。
对光敏组合杂种进行扩增产物酶切片段多态性分析时，步骤(2)中，所述引物的碱基序列为：
上游引物LR-F：5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；
下游引物LR-R：5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’。
PCR扩增的反应体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物LR-F，0.4μL；10μM的下游引物LR-R，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。
扩增产物采用RsaⅠ进行酶切。
所述酶切的反应体系为：10×T Buffer，1μL；0.1%BSA，1μL；RsaⅠ，0.3μL；PCR扩增产物，5μL；无菌水补足至10μL。
所述酶切的反应条件为：37℃水浴4-12h。
对光敏组合杂种进行高分辨率溶解曲线分析时，步骤(2)中，所述引物的碱基序列为：
上游引物LR-F：5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；
下游引物LR-R：5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’；和
探针引物：5’-GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’。
对光敏组合杂种进行高分辨率溶解曲线分析时，PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，5μL；10μM的上游引物LR-F，0.02μL；10μM的下游引物LR-R，0.2μL；10μM的探针引物，1μL；10×LC green-Plus，1μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水2.78μL；矿物油10-20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
对温敏组合杂种进行扩增产物酶切片段多态性分析时，步骤(2)中，所述引物为两对，其中，
第一对引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F1：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；
下游引物RNZ-R1：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
第二对引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F2：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；
下游引物RNZ-R1：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物，0.4μL；10μM的下游引物，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。
第一对引物的扩增产物采用Hinf I进行酶切，第二对引物的扩增产物采用Sty I进行酶切。
酶切的反应体系为：10×H Buffer，1μL；0.1%BSA，1μL；限制性内切酶，0.3μL；PCR扩增产物，2μL；无菌水补足至10μL。
酶切的反应条件为：37℃水浴4-12h。
对温敏组合杂种进行高分辨率溶解曲线分析时，步骤(2)中，所述引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F3：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；
下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
对温敏组合杂种进行高分辨率溶解曲线分析时，PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，5μL；10μM的上游引物LR-F3，0.2μL；10μM的下游引物LR-R1，0.2μL；10×LC green-Plus，1μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水3.6μL；矿物油10-20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
对种子样品的基因型鉴定完成后，呈现双亲阳性反应的种子占扦样样品的百分比即为种子的杂种纯度。只有呈现双亲阳性反应的种子才是真的杂交种子，单阳性反应和阴性反应的种子均为混杂种子。
与现有技术相比，本发明的有效效果为：
本发明根据功能基因的功能性单核苷酸多态性位点开发分子标记，任何杂交组合的双亲之间必然存在多态性，在进行杂交种子纯度鉴定时不需要先对双亲进行研究，因此可以直接对所有以本发明涉及的两系不育系为母本的两系杂交组合进行分析。
本发明方法通过常规的室内试验，经济，简便，快速，准确鉴定水稻杂交种子纯度。
附图说明
图1为利用CAPS分子标记检测光敏杂交种子纯度的部分酶切电泳图；
其中，M：DNA分子量标准；泳道1：S11；泳道2：DS550；泳道3-14：杂交后代单株；
图2为温敏不育候选基因RNaseZ结构及dCAPS和HRM分子标记引物设计示意图；
其中，黑色方框代表外显子，直线代表内含子；温敏不育突变位点用白色三角标出；箭头代表所设计的分子标记引物位置；并在图下方方框中列出了所修改的碱基位置和类型，以及所形成的限制性内切酶的识别位点；
图3a为利用dCAPS分子标记鉴定11530杂交种子样本纯度的部分酶切电泳图；
图3b为利用dCAPS分子标记鉴定11534杂交种子样本纯度的部分酶切电泳图；
其中，图3a-图3b中，M为DNA分子量标准，条带大小依次为200bp，100bp；1泳道为母本；2泳道为父本；3-31泳道为杂种样本。
图4a为利用高分辨溶解曲线(HRM)鉴定光敏杂交种子纯度的部分样本随温度变化的溶解曲线图；
图4b为利用高分辨溶解曲线(HRM)鉴定光敏杂交种子纯度的部分样本分型的峰图；
其中，图4a-图4b中，绿色为S11(WT)，蓝色为DS550(光敏不育)，灰色为二者的杂种F1代；
图5a为利用高分辨溶解曲线(HRM)鉴定温敏杂交种子纯度的部分样本随温度变化的溶解曲线图；
图5b为利用高分辨溶解曲线(HRM)鉴定温敏杂交种子纯度的部分样本分型的峰图；
其中，图5a-图5b中，绿色为父本，橙色为母本，灰色为二者的杂种F1代。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
实施例1光敏杂交水稻种子纯度鉴定，以DS550衍生的杂交组合为例
Ding等(Ding et al.PNAS,2012,109:2654-2659)和Zhou等(Zhou etal.Cell Research,2012,22:649-660)的研究显示，光敏核雄性不育水稻农垦58S和培矮64S的光敏核雄性不育(PGMS)是由一个编码长链非编码RNA(lncR)基因的第789位碱基C→G的突变引起。
将衍生自农垦58S的光敏不育水稻携带的lncR等位基因定名为lncRg，而非光敏水稻的等位基因定名为lncRc。据此，在Gramene网站(http://www.gramene.org/)下载相应的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，利用Primer Premier5.0软件在突变位点区域附近设计一对PCR引物扩增片段包含C→G的突变位点。
引物的碱基序列为：
上游引物(LR-F)：5’-ATCCCACAAATCCTTTAGCA-3’；
下游引物(LR-R)：5’-CCGTTATAGATAGACCCGAGA-3’；
由于该突变产生了一个内切酶的酶切位点Rsa Ⅰ，因此任何包含该突变位点的扩增片段均可以被Rsa Ⅰ酶切成329bp和85bp两段，而其他水稻材料不能被酶切，从而开发了一个区别lncRg和lncRc等位基因的CAPS分子标记。
如果只出现414bp的特征带，则该水稻种子样品为纯合lncRg型的种子，为光敏不育系(母本)自交种；如果只出现329bp和85bp两条特征带，则该水稻样品为纯合lncRc型的种子，为可育系自交、机械混杂或传粉种；如果出现414bp、329bp和85bp三条特征带，则该水稻样品携带lncg基因的杂合型种子，为真实杂交种子。
2012年12月，购某公司生产的两系杂交稻组合DS550/S11的杂交种子，从中随机取样200粒，三次重复。经验证，母本DS550含有与农垦58S一样的光敏不育基因，因此可用本发明中的方法进行纯度验证。
1、提取单粒种子基因组DNA
(1)将水稻单粒种子置于2.0mL离心管中，同时放入一粒钢珠，用组织碾磨仪磨碎；
(2)每100mg样品加100μL的RNAiso-mate，混匀并10000r/min离心1min；
(3)转移上清至新的2mL离心管中，加入800μL CTAB提取缓冲液(Tris-HCl，100mM，pH8.0；EDTA，20mM，pH8.0；NaCl，500mM；CTAB，2%)，65℃水浴40min，期间摇动3-4次；
(4)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1，v/v)混合液，上下颠倒混匀，10000r/min离心10min；
(5)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃下沉淀30min，10000r/min离心10min；
(6)弃上清液，70%乙醇洗涤1次，10000r/min离心5min；
(7)弃上清液，无水乙醇洗涤1次，自然风干，溶于适量(100-200μL)TE溶液中，-20℃保存。
2、PCR扩增
以提取的水稻种子DNA为模板，采用特异性引物LR-F和LR-R，进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物LR-F，0.4μL；10μM的下游引物LR-R，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。
3、PCR扩增产物酶切与分析
用限制性内切酶Rsa Ⅰ(又称为Afa Ⅰ)对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，染色后拍照成像。
酶切反应体系为：10×T Buffer1μL，0.1%BSA1μL，限制性内切酶0.3μL，PCR产物5μL，无菌水补足至10μL；
酶切反应条件为：37℃水浴4h或过夜反应。
产物经相应的酶切后，电泳进行分析。
经检测，发现三个样本中分别有1粒、2粒和2粒基因型为纯合lncRg型的种子，属于母本自交种子，其余种子均表现为杂合型，即为真杂种(真实杂交种)。由此可知，该组合三个样本的杂交种子的纯度分别为99.5%，99.0%和99.0%，平均为99.17%。部分样本电泳结果见图1。
同时，对该批种子用常规田间鉴定方法进行了分析，结果与实验室分析完全相符。
实施例2利用HRM方法鉴定光敏杂交水稻种子纯度
利用上述实施例1的样本同时运用HRM方法鉴定纯度。
1、水稻种子基因组DNA的提取
方法参见实施例1。
2、PCR扩增
以水稻种子基因组DNA为模板，采用实施例1设计的引物LR-F、LR-R和探针引物(探针引物序列为：5’-GTGCATTGTTTGTGTACCATCCATC-3’)，进行不对称PCR扩增。
用于发展HRM分子标记时，不对称PCR扩增一般在10μl体积中进行，反应液除包括PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶，引物，水稻样品总DNA，无菌水等除常规成分外，还需要在PCR之前加饱和荧光染料(如LC Green)，并用矿物油(Sigma)覆盖反应混合物，另外，为避免影响PCR扩增，也可以在得到扩增产物之后再加饱和荧光染料，PCR的反应体系具体参见表1。
表1用于HRM分子标记的PCR反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| 2×PCR Master Mix | 5 |
| LR-F(10μM) | 0.02 |
| LR-R(10μM) | 0.2 |
| DNA(25ng/μL) | 1 |
| 无菌水 | 2.78 |
| 10×LC green-Plus | 1 |
| 探针引物(10μM) | 1 |
| 矿物油 | 10-20 |
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
将不对称PCR扩增的产物直接在HRM分析仪如LightScanner上进行分析。
参见图4a和图4b，发现HRM分析可将不同基因型的样本进行区分开，图中示出了样本中部分种子的检测结果。对实施例1的的其中一个样本，采用本发明引物，利用HRM分子标记进行分型分析，经检测，发现有1粒基因型为纯合lncRg型的种子，属于母本自交种子，其余种子均表现为杂合型，即为真杂种。由此可知，该组合杂交种子的纯度为99.5%，得到与CAPS分子标记完全一致的结果，表明运用本发明的HRM分析同样有效。
实施例3温敏杂交水稻种子纯度鉴定，以广占63S衍生的杂交组合为例
1、水稻种子温敏雄性核不育基因RNaseZ分型的dCAPS标记
于2011年，构建温敏不育系株1S和野生型08EZ01的杂交F2后代群体，并于田间调查分离比，结果发现在1260个F2单株中有286株完全不育单株，表型分离比符合3：1，说明温敏性状为单隐性基因控制。
在开花期镜检观察取样完全不育的单株549株，用于定位控制株1S温敏不育性状的基因，并构建基因池，利用348对均匀分布于各条染色体上的SSR标记进行初步定位，将温敏不育基因定位于第2号染色体上。之后在该条染色体上发展更多的标记，并利用这549株完全不育的单株进行更加精细的定位，最后将该基因定位于第2号染色体RM12721和RM12735之间。
在定位区间内寻找有可能的候选基因，测序发现位于第2染色体上的RNaseZ(RNZ)水稻同源基因RNZ(LOC_Os02g12290)在不育系和野生型品种中存在差异，温敏不育品种在该基因第1外显子中存在的一个提前终止的突变+70TAG，并且该突变与水稻温敏雄性不育(TGMS)性状完全一致，所有检测的TGMS水稻在该位点均为+70TAG，而正常可育的水稻品种或光敏不育水稻在此位点上要么为+70TCG，要么为+70GCG。据此，我们认为该基因为控制温敏不育的基因，并开发了一组特异性区别上述变异的分子标记。
以下将上述三种RNZ等位基因分别记为RNZTA，RNZTC和RNAGC。
(1)区分RNZTA和RNZTC等位基因的功能性dCAPS分子标记
在Gramene网站(http://www.gramene.org/)下载LOC_Os02g12290的核苷酸序列(如SEQ NO.2)，并利用Primer Premier5.0软件在+70TAG区域附近设计PCR引物，碱基序列为：
上游引物(RNZ-F1)：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；
下游引物(RNZ-R1)：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
由于突变位点处没有任何限制性酶切位点可用，因此在引物RNZ-F1的3’末端引入了一个错配碱基从而形成一个限制性内切酶Hinf I的识别位点(如图2)。
在引入这一错配碱基后扩增的PCR产物，等位基因RNZTA不能被HinfI酶切，等位基因RNZTC含有Hinf I的识别位点，可以被Hinf I酶切成153bp和25bp二段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，携带不同等位基因的水稻种子材料可以容易地加以区分，扩增片段经Hinf I酶切后，只携带RNZTA等位基因的纯合材料只显示178bp的条带；而只携带RNZTC等位基因的纯合材料显示153bp和25bp的条带；而同时携带RNZTA和RNZTC等位基因的杂合材料显示178bp、153bp和25bp三个条带。
(2)区分RNZTA和RNZGC等位基因的功能性dCAPS标记
采用相似的原理利用Primer Premier5.0软件在+70TAG区域附近设计PCR引物，碱基序列为：
上游引物(RNZ-F2)：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；
下游引物(RNZ-R1)：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
引物RNZ-F2是根据突变位点设计的，同样由于突变位点处没有任何限制性酶切位点可用，因此在引物RNZ-F2的3’末端引入一个错配碱基从而形成一个限制性内切酶Sty I的识别位点(如图2)。
在引入这一错配碱基后扩增的PCR产物，等位基因RNZTA不能被Sty I酶切，而等位基因RNZGC含有Sty I的识别位点，可以被Sty I酶切成155bp和23bp二段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，携带不同等位基因的水稻种子材料可以容易地加以区分，扩增片段经Sty I酶切后，只携带等位基因RNZTA的纯合材料只显示178bp的条带；而野生型可育等位基因RNZGC的纯合材料只显示155bp和23bp的条带；而同时携带两种等位基因的杂合材料显示178bp、155bp和23bp三个条带。
2、温敏杂交水稻种子纯度的鉴定
两系杂交种子样本11530和11534系某公司2011年生产的丰两优1号杂交种子，两个样本分别取200粒种子。该两个样本的母本均为广占63S，并验证其与株1S有相同的温敏不育基因。
经检测，首先确定其父本在RNZ突变位点基因型均为GC，因此利用本发明的dCAPS引物RNZ-F2和RNZ-R1扩增，并用Sty I酶切检测分析，其中不育母本扩增产物不能被相应的酶切开，只有单一片段，而可育父本则能被完全切开，而杂交F1代则能被不完全切开，从而形成3条片段。
1)水稻种子基因组DNA的提取
参照实施例1。
2)包含突变位点DNA片段的PCR扩增、酶切和分析
以提取的水稻种子DNA为模板，采用设计的特异性引物RNZ-F2/RNZ-R1进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系见表2。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min。
表2用于dCAPS分子标记的PCR反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| 2×PCR Master Mix | 10 |
| RNZ-F2(10μM) | 0.4 |
| RNZ-R1(10μM) | 0.4 |
| DNA(25ng/μL) | 1 |
| 无菌水 | 8.2 |
| 总计 | 20 |
以RNZ-F2/RNZ-R1为引物得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶StyI进行酶切。
酶切反应体系为：10×H Buffer1μL，0.1%BSA1μL，限制性内切酶0.5μL，PCR扩增产物2μL，无菌水补足至10μL；
酶切反应条件为：37℃水浴4h或过夜反应。
酶切反应结束后，用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳125min后，染色后拍照成像。
结果发现：样本11530没有表现为母本自交种子的纯合RNZTA型，但有9粒为纯合RNZGC型，分析为混杂父本种子或机械混杂的其他种子，其余均表现为杂合型。由此可知，该杂交种的纯度为95.5%。部分酶切检测电泳图如图3a所示。
样本11534有3粒种子表现为母本自交的纯合RNZTA、11粒为纯合RNZGC型(为混杂父本种子或机械混杂的其他种子)、其余均表现为杂合型(真杂种)。由此可知，该杂交种的纯度为93.0%。部分酶切检测电泳图如图3b所示。
2012年在杭州对上述样本进行了田间纯度鉴定，所得结果与实验室鉴定相符。
实施例4利用HRM方法鉴定温敏杂交水稻种子纯度
采用相似的原理利用Primer Premier5.0软件在+70TAG区域附近设计HRM引物，碱基序列为：
上游引物(RNZ-F3)：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；
下游引物(RNZ-R1)：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
引物位置如图2所示，根据HRM分析要求进行PCR扩增，将扩增产物在HRM分析仪(如LightScanner)分析，可以直观地将等位基因RNZTA与其他两种等位基因加以区别。
以实施例3中的11530样本DNA为模板，采用RNZ-F3和RNZ-R1为引物，进行PCR扩增。
用于发展HRM标记时，PCR扩增一般在10μl体积中进行，反应液除包括PCR buffer，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶，正反向引物，水稻样品总DNA，无菌水等常规成分外，还需要在PCR之前加饱和荧光染料(如LC Green)，并用矿物油(Sigma)覆盖反应混合物，另外，为避免影响PCR扩增，也可以在得到扩增产物之后再加饱和荧光染料，PCR的反应体系具体参见表3。
表3用于HRM分子标记的PCR反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| 2×PCR Master Mix | 5 |
| RNZ-F3(10μM) | 0.2 |
| RNZ-R1(10μM) | 0.2 |
| DNA(25ng/μL) | 1 |
| 无菌水 | 3.6 |
| 10×LC green-Plus | 1 |
| 矿物油 | 10-20 |
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
将PCR扩增的产物直接在HRM分析仪(LightScanner)上进行分析，获取温度为93～96℃区段溶解曲线。
由于纯合温敏不育类型RNZTA，纯合可育类型RNZGC以及杂合可育类型均可以明显的分开（如图5a、图5b），因此，试验时，以已知基因型扩增产物的溶解曲线作为对照，将待检测水稻材料的溶解曲线与对照进行对比，如果两条曲线的ΔF值小于0.05，则认为基因型相同，由此确定待检测水稻材料的基因型。
对实施例3的样本11530，利用HRM分子标记进行分型分析，经检测，发现有9粒为纯合RNZGC型的种子，分析为混杂父本种子或机械混杂的其他种子，其余种子均表现为杂合型，即为真杂种。由此可知，该组合杂交种子的纯度为95.5%。得到与dCAPS分子标记完全一致的结果，表明HRM分析同样有效，部分HRM分型结果如图5a和5b所示。
Claims (3)
1.一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，包括：
(1)提取待检测种子或其长成的植株样品的基因组DNA；
(2)根据雄性核不育基因的功能性单核苷酸多态性位点，设计引物，进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行特性分析，确定样品的基因型，计算得到种子样品的纯度；待检测种子为两系不育系与可育材料配制杂交组合产生的杂种一代种子，其中两系不育系携带广占63S相同的温敏不育基因；
所述特性分析为高分辨率溶解曲线分析或扩增产物酶切片段多态性分析；
对温敏组合杂种进行扩增产物酶切片段多态性分析时，步骤(2)中，所述引物为两对，其中，
第一对引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F1：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCGGAG-3’；
下游引物RNZ-R1：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
第二对引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F2：
5’-ACCGCGCCGCCACCGGGTCGGCCCAAG-3’；
下游引物RNZ-R1：
5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’；
对温敏组合杂种进行高分辨率溶解曲线分析时，步骤(2)中，所述引物的碱基序列为：
上游引物RNZ-F3：5’-ATGGCGAACAGCGGCAAGTCA-3’；
下游引物RNZ-R1：5’-TGAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG-3’。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增产物酶切片段多态性分析时，所述PCR扩增的体系为：2×PCR Master Mix，10μL；10μM的上游引物，0.4μL；10μM的下游引物，0.4μL；25ng/μL的DNA，1μL；补充无菌水至20μL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增产物酶切片段多态性分析时，第一对引物的扩增产物采用Hinf I进行酶切，第二对引物的扩增产物采用Sty I进行酶切。
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