CN103798132B - 一种规模化创制小麦异源易位系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种规模化创制小麦异源易位系的方法。本发明的方法包括如下步骤：（1）将普通小麦与部分异源双二倍体杂交得到种子；（2）将种子培育为F1代植株；（3）利用60Co-γ射线辐射F1代植株的花粉，然后授予去雄后的普通小麦，获得种子；（4）将种子进行原位杂交并归类，分别为易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系；含少量外源染色体的异附加系，代替F1代植株进行步骤（3）和（4），依次循环；对于含多条外源染色体的异附加系，代替部分异源双二倍体进行步骤（1）、（2）、（3）和（4），依次循环。小麦异源易位系的规模化创制，提高了中间材料的利用效率，增强了易位系创制的精确度，具有先进性、创新性和实用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种规模化创制小麦异源易位系的方法。
背景技术
小麦的异源种属含有许多与高产、优质、抗逆等性状相关的优良基因。开发和利用这些基因资源，将异源DNA导入小麦栽培品种，从而丰富小麦的种质资源始终是小麦遗传育种的重要课题之一，也是未来小麦改良的必由之路。通过染色体工程将外源DNA转移到小麦遗传背景下开拓了小麦遗传育种工作的新局面，其突出特点是在追踪目标基因的同时追踪其载体-染色体或染色体片段，并在转移外源基因的同时创造育种中可利用的种质材料，基本程序是：种属间杂交→F1、异源双二倍体或部分异源双二倍体→异附加系→异代换系→易位系。其中，易位系以其导人外源染色体小，携带不利基因少等优点，成为小麦染色体工程育种中最重要的材料。传统的染色体工程育种是将（部分）异源双二倍体与普通小麦杂交或回交，需要经过异附加系、异代换系两个基本步骤，才能获得异源易位系，并且效率低、周期长、难以有效跟踪和快速鉴定，因而无法应用于异源易位系的大规模创制。
诱发小麦与其野生近缘种的染色体发生易位，从而将外源基因转移至小麦背景是小麦染色体工程育种中的重要部分，也是培育小麦远缘杂交品种的关键。目前易位系诱导的方法主要包括电离辐射法、组织培养法、杀配子基因法和着丝点融合法。其中电离辐射法因其方法简单，不受亲缘关系远近及染色体位置的影响，逐渐成为诱导外源易位系最常用、有效的方法。花粉辐射是电离辐射法的一种，它具有操作方便，避免产生嵌合体等优点，可采用杂种F1、双二倍体、附加系或代换系刚刚开花的穗进行。目前利用花粉辐射已得到了小麦与大赖草、冰草、中间偃麦草等的易位系。但是，以往花粉辐射的对象多为异附加系和异代换系，致使外源染色体片段的来源比较狭窄，同时辐射处理往往只进行一次，不能对辐射后的非易位材料进行再利用，降低了中间材料的利用效率。
基因组原位杂交（Genomicinsituhybridization,GISH）是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。以外源种质基因组DNA作为探针，小麦受体品种DNA为封阻进行基因组原位杂交分析能够准确鉴定出小麦背景下外源染色质。基因组原位杂交技术的发展，还极大地促进易位系的鉴定工作。通过GISH不仅可以判断易位类型，还能检测易位片段的大小，显示易位断点的确切位置。在以往小麦远缘杂交后代鉴定中，外源基因组探针的标记方法主要采用间接法，即使用生物素或地高辛等非荧光物质标记探针，再通过免疫反应或亲和连接引入荧光物质，来显示杂交位点。尽管间接法GISH能够将杂交信号级联放大，增强灵敏度，但由于该方法步骤繁琐、耗时费力，不适于小麦染色体工程育种中外源遗传物质的规模化鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种规模化创制小麦异源易位系的方法。
本发明提供了一种规模化创制易位系的方法，包括如下步骤：
（1）将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体杂交得到种子；
（2）将步骤（1）得到的种子培育为植株，即为F1代植株；
（3）利用60Co-γ射线辐射所述F1代植株的花粉，然后授予去雄后的普通小麦的植株，获得种子；
（4）将步骤（3）得到的种子进行原位杂交，然后进行归类，分别为易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系；所述易位系存在小麦-长穗偃麦草易位染色体；所述含少量外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1-2条独立存在的长穗偃麦草染色体；所述含多条外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含3-5条独立存在的长穗偃麦草染色体；
对于含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤（3）和所述步骤（4），依次循环；
对于含多条外源染色体的异附加系，代替所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体依次进行所述步骤（1）、所述步骤（2）、所述步骤（3）和所述步骤（4），依次循环。
所述步骤（1）中，所述普通小麦为“长武131”、“密穗小麦”、“石4185”或“京411”。
所述步骤（1）中，所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体为“小偃68”、“小偃784”或“小偃7430”。
所述步骤（3）中，所述普通小麦为“小偃81”。
所述步骤（3）中，所述60Co-γ射线辐射的参数为：辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min。
本发明还保护一种规模化创制易位系的方法，包括如下步骤：
（1）将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体杂交得到种子；
（2）将步骤（1）得到的种子培育为植株，即为F1代植株；
（3）利用60Co-γ射线辐射所述F1代植株的花粉，然后授予去雄后的普通小麦的植株，获得种子；
（4）将步骤（3）得到的种子进行原位杂交，然后进行归类，分别为易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系；所述易位系存在小麦-长穗偃麦草易位染色体；所述含少量外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1-2条独立存在的长穗偃麦草染色体；所述含多条外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含3-5条独立存在的长穗偃麦草染色体；
（5）对于步骤（4）得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤（3）和所述步骤（4），获得易位系和含少量外源染色体的异附加系；
（6）对于步骤（5）得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤（3）和所述步骤（4），获得易位系；
（7）对于步骤（4）得到的含多条外源染色体的异附加系，代替所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体依次进行所述步骤（1）、所述步骤（2）、所述步骤（3）和所述步骤（4），获得含少量外源染色体的异附加系；
（8）对于步骤（7）得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤（3）和所述步骤（4），获得易位系。
所述步骤（1）中，所述普通小麦为“长武131”、“密穗小麦”、“石4185”或“京411”。
所述步骤（1）中，所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体为“小偃68”、“小偃784”或“小偃7430”。
所述步骤（3）中，所述普通小麦为“小偃81”。
所述步骤（3）中，所述60Co-γ射线辐射的参数为：辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min。
以上任一所述方法中，所述原位杂交包括如下步骤：
（1）有丝分裂中期分裂相的制片
①将种子培养至根尖长到1-2厘米，剪取根尖，N2O处理2h；
②取完成步骤①的根尖，用90%（体积比）乙酸水溶液固定10分钟，然后用蒸馏水冲洗；
③取完成步骤②的根尖，将根尖分生组织切下，放入混合酶溶液中，37℃静置40-60分钟；混合酶溶液：溶剂为柠檬酸缓冲液（pH=5.5、50mM柠檬酸钠、50mM的EDTA），溶质及其浓度如下：1g/100ml果胶酶Y-23（日本JapanYakult公司）和2g/100ml纤维素酶OnozukaR-10（日本JapanYakult公司）；
④取完成步骤③的根尖分生组织，用70%（体积比）乙醇水溶液冲洗，捣碎根尖，弃上清，用冰乙醇悬浮细胞，然后滴在载玻片上；
（2）原位杂交分析
①提取长穗偃麦草的基因组DNA，得到DNA浓度为0.143μg/μL的溶液。
②按表1配制体系，15℃孵育2小时；然后13000rpm离心30-40分钟，收集沉淀，依次用70%（体积比）乙醇水溶液和无水乙醇各洗一次，然后加2×SSC-1×TE溶液（含0.3M氯化钠、30mM柠檬酸钠、10mMTris、1mMEDTA的水溶液，pH7.0），得到探针浓度为0.083μg/μL的探针溶液；
③提取提取小麦品种“中国春”的基因组DNA，沸水浴20分钟后立即放置在冰上，得到封阻液，-20℃保存；
④在冰上，将1.4μL步骤②得到的探针溶液（0.083μgDNA/μL）与5.8μL步骤③得到的封阻液（4μgDNA/μL）混合，得到杂交液，探针与封阻的比例约为1∶200（该比例指的是DNA的质量比）；将步骤（1）得到的载玻片放入紫外交联仪（code-No.CL-1000,购自美国UVP公司）中，UV能量为0.125J/cm2，每张载波片上加6μL杂交液，盖上盖玻片，90℃变性5分钟，55℃湿盒内杂交过夜。
⑤完成步骤④后，取出玻片，迅速放入2×SSC溶液中使盖玻片滑落，在载玻片上滴加抗褪色剂（含DAPI，H-1200，购自美国VectorLabs公司），盖上盖玻片后，在荧光显微镜下检测、照相。
本发明还保护一种规模化创制小麦异源易位系的方法，包括如下步骤：将以上任一所述方法得到的易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与普通小麦进行连续回交（具体可回交4次），获得所述普通小麦的遗传背景下的小麦异源易位系。所述回交时，所述普通小麦为“小偃81”、“西农979”或“衡观35”。
本发明中，将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体为起点，将大量的外源染色体片段导入小麦背景下，快速、批量创制小麦异源易位系，为小麦的遗传改良提供了丰富的外源基因库。本发明中，将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体的F1代植株的花粉为辐射对象（利用60Co-γ射线），然后将花粉授予普通小麦，根据外源染色体的存在类型将M1单株分类，针对不同的类型采取不同的育种策略，循环采用花粉辐射、杂交、回交等方法逐步减少异源新种质中外源染色体的数目和大小，获得同一小麦背景的不同易位系，实现小麦异源易位系的规模化创制。本发明中，利用直接法GISH配合多色荧光原位杂交（multi-colorFISH）可以实现小麦远缘杂交后代的规模化鉴定与分析。小麦异源易位系的规模化创制，不仅提高了中间材料的利用效率，而且增强了易位系创制的精确度，是一种技术突破，具有较好的先进性、创新性和实用性。
附图说明
图1为实施例1的流程示意图。
图2为部分异源双二倍体、易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系原位杂交后的照片。
图3为实施例4中异源易位系的基因组原位杂交的结果照片和异源易位系的多色荧光原位杂交的结果照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例中，将长穗偃麦草染色体作为外源染色体。
普通小麦为六倍体，具有42条染色体。长穗偃麦草为十倍体，具有70条染色体。
小麦与长穗偃麦草的部分异源双二倍体中，含6个小麦染色体组（42条染色体）和2个外源染色体组（外源染色体数目不定，12-16条，多为14条），其染色体数目多为56条；其生殖细胞包含3个小麦染色体组（21条染色体）和1个外源染色体组（多为7条），其染色体数目多为28条。“小偃68”、“小偃784”、“小偃7430”均为小麦与长穗偃麦草的部分异源双二倍体。提及“小偃68”、“小偃784”和“小偃7430”的参考文献：钟冠昌,张学勇,张荣琦,陈春环.1991.八倍体小偃麦染色体组分析.遗传学报.18（4）339-343.。“小偃7430”的原位杂交后的照片见图2A。
“长武131”（普通小麦）：参考文献：梁增基.小麦新品种长武131.陕西农业科学.1989（06）.。“密穗小麦”（普通小麦）：参考文献：钟冠昌,张学勇,张荣琦,陈春环.1991.八倍体小偃麦染色体组分析.遗传学报.18（4）339-343.。“石4185”（普通小麦）：购自河南大丰种业有限公司。“京411”（普通小麦）：购自山西省泽州县种子总公司。
“小偃81”，来源于长穗偃麦草和普通小麦的杂交后代，为六倍体，含有42条染色体，因此将其划分为普通小麦。“小偃81”：购自河南省大河种业有限公司。“西农979”（普通小麦）：购自河南裕丰种业有限公司。“衡观35”（普通小麦）：购自河北兰德泽农种业有限公司。
长穗偃麦草：参考文献：钟冠昌,张学勇,张荣琦,陈春环.1991.八倍体小偃麦染色体组分析.遗传学报.18（4）339-343.。
“中国春”（普通小麦）：参考文献：钟冠昌,张学勇,张荣琦,陈春环.1991.八倍体小偃麦染色体组分析.遗传学报.18（4）339-343.。
pAs1如序列表的序列1所示。pHvG38如序列表的序列2所示。pSc119.2如序列表的序列3所示。
实施例1、规模化创制小麦异源易位系
一、规模化创制易位系
将F1代材料作为外源基因组供体，经过花粉辐射获得大量的、丰富的长穗偃麦草染色体的结构变异，然后经常规杂交、连续回交等方法将这些结构变异导入“小偃81”背景下，规模化创制小麦异源新种质。
1、将“长武131”（作为母本；含42条小麦染色体）与“小偃68”（作为父本；含42条小麦染色体和14条外源染色体）杂交得到种子（种子具有42条小麦染色体和7条外源染色体）。
2、将步骤1得到的种子培育为植株（F1代植株），取F1代植株，剪取即将大量开花的植株的麦穗，利用60Co-γ射线辐射诱导染色体发生结构变异（辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min），辐射后立即从麦穗上采集新鲜花粉，给3-4天前已去雄的“小偃81”的麦穗授粉，并套袋隔离，获得的种子即为M0代种子。
3、从步骤2获得的M0代种子中随机抽取120粒，进行原位杂交。
（1）有丝分裂中期分裂相的制片
①N2O处理根尖细胞
选择成熟饱满的M0代种子，放入垫有潮湿滤纸的培养皿中，用水淋湿并保持一定的湿度，在23℃恒温培养箱内培养至根尖长到1-2厘米，剪取根尖，放入湿润的离心管中，盖上盖子后放入N2O气室（压强为1.01Mpa）中处理2h。
②根尖固定
取完成步骤①的根尖，用90%（体积比）乙酸水溶液固定10分钟，然后用蒸馏水冲洗2次（每次5min）。
③酶解
取完成步骤②的根尖，用滤纸将水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入装有20μL混合酶溶液的离心管中，在37℃水浴中静置40-60分钟。
混合酶溶液：溶剂为柠檬酸缓冲液（pH=5.5、50mM柠檬酸钠、50mM的EDTA），溶质及其浓度如下：1g/100ml果胶酶Y-23（日本JapanYakult公司）和2g/100ml纤维素酶OnozukaR-10（日本JapanYakult公司）。
④镜检
取完成步骤③的根尖分生组织，用70%（体积比）乙醇水溶液冲洗2次，余根尖分生组织和约200μL70%（体积比）乙醇水溶液在离心管中，捣碎根尖，低速离心10秒左右，将酒精倒干，加冰乙醇（根据根尖分生组织大小，每个根尖20-40μL）悬浮细胞；将干净的载玻片放入湿盒，将6-7μL细胞悬浮液滴到载玻片上，盖上盒盖，5分钟以后镜检，保存在冰箱中。
（2）原位杂交分析
①提取基因组DNA
采用CTAB法提取长穗偃麦草新鲜叶片的基因组DNA，得到DNA浓度为0.143μg/μL的溶液。
②探针标记
体系见表1。AlexaFluor-488-dUTP（绿光），购自Invitrogen公司。DNA聚合酶Ⅰ，浓度为10U/μL。DNaseⅠ，购自Invitrogen公司，浓度为100mU/μl。dATP、dCTP和dGTP的混合液中，dATP、dCTP和dGTP的浓度均为2mM。10×Nicktranslationbuffer的制备方法：取6.05gTris、0.47gMgCl2，溶于水并用水定容至100ml，用HCl调pH7.8。
表1体系
| 步骤①得到的DNA溶液 | 35μL | |
| 10×Nick translation buffer | 6μL | |
| Alexa Fluor-488-dUTP | 2μL | |
| dATP、dCTP和dGTP的混合液 | 5μL | |
| DNA聚合酶Ⅰ | 10μL | |
| DNaseⅠ | 2μL |
配制好表1所示的体系后，用枪头反复吹打混匀，然后置于金属浴仪（H203-PRO，中国）中15℃孵育2小时；然后13000rpm离心30-40分钟，收集沉淀，依次用70%（体积比）乙醇水溶液和无水乙醇各洗一次，避光晾干；然后加60μL2×SSC-1×TE溶液（含0.3M氯化钠、30mM柠檬酸钠、10mMTris、1mMEDTA的水溶液，pH7.0），得到探针浓度为0.083μg/μL的探针溶液，-20℃保存。
③制备封阻
采用CTAB法提取小麦品种“中国春”的基因组DNA，沸水浴20分钟后立即放置在冰上（高温打断DNA，冰上反应以保证DNA为单链形式），得到封阻液，-20℃保存。
④原位杂交
在冰上，将1.4μL步骤②得到的探针溶液（0.083μgDNA/μL）与5.8μL步骤③得到的封阻液（4μgDNA/μL）混合，得到杂交液，探针与封阻的比例约为1∶200（该比例指的是DNA的质量比）；将步骤（1）得到的载玻片放入紫外交联仪（code-No.CL-1000,购自美国UVP公司）中，UV能量为0.125J/cm2，每张载波片上加6μL杂交液，盖上盖玻片，90℃变性5分钟，55℃湿盒内杂交过夜。
⑤信号检测
完成步骤④后，取出玻片，迅速放入2×SSC溶液中使盖玻片滑落，在载玻片上滴加抗褪色剂（含DAPI，H-1200，购自美国VectorLabs公司），盖上盖玻片后，在荧光显微镜下检测、照相。
4、小麦异源新种质的分类及育种策略
基于步骤三中的信号检测结果，将M1代植株（M1代植株即为培育M0代种子得到的植株）进行归类，分别为易位系（存在小麦-长穗偃麦草易位染色体）、含少量外源染色体的异附加系（不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1-2条独立存在的长穗偃麦草染色体）和含多条外源染色体的异附加系（不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含3-5条独立存在的长穗偃麦草染色体）。某个易位系原位杂交后的照片见图2D。含少量外源染色体的异附加系原位杂交后的照片见图2C。某个含多条外源染色体的异附加系原位杂交后的照片见图2B。
第一次循环：以上步骤1至3为第一次循环，得到19株易位系、70株含少量外源染色体的异附加系和12株含多条外源染色体的异附加系。
第二次循环-1：对于第一次循环中得到的含少量外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取227粒M0代种子进行原位杂交），得到25株易位系和14株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-1：对于第二次循环-1中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取109粒M0代种子进行原位杂交），得到18株易位系。
第二次循环-2：对于第一次循环中得到的含多条外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的部分异源双二倍体依次进行步骤1、步骤2和步骤3（步骤3中抽取111粒M0代种子进行原位杂交），得到42株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-2：对于第二次循环-2中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取65粒M0代种子进行原位杂交），得到9株易位系。
以上步骤的的流程示意图见图1。以上三次循环建库共获得了71个易位系。
实验证明，通过循环辐射，可以获得数量即为庞大的易位系。以三次循环为宜，次数太多会使得材料的育性下降。
二、规模化创制易位系
用“密穗小麦”代替“长武131”，其它同步骤一。
第一次循环：以上步骤1至3为第一次循环（步骤3中抽取20粒M0代种子进行原位杂交），得到4株易位系、13株含少量外源染色体的异附加系和2株含多条外源染色体的异附加系。
第二次循环-1：对于第一次循环中得到的含少量外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取20粒M0代种子进行原位杂交），得到2株易位系和5株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-1：对于第二次循环-1中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取42粒M0代种子进行原位杂交），得到17株易位系。
第二次循环-2：对于第一次循环中得到的含多条外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的部分异源双二倍体依次进行步骤1、步骤2和步骤3（步骤3中抽取23粒M0代种子进行原位杂交），得到8株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-2：对于第二次循环-2中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取43粒M0代种子进行原位杂交），得到6株易位系。
以上三次循环建库共获得了29个易位系。
三、规模化创制以“小偃81”为背景的小麦异源易位系
将步骤一和步骤二中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“小偃81”连续回交4次，即获得“小偃81”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
四、规模化创制以“西农979”为背景的小麦异源易位系
将步骤一和步骤二中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“西农979”连续回交4次，即获得“西农979”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
五、规模化创制以“衡观35”为背景的小麦异源易位系
将步骤一和步骤二中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“衡观35”连续回交4次，即获得“衡观35”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
实施例2、规模化创制小麦异源易位系
一、规模化创制易位系
1、将“石4185”（作为母本；含42条小麦染色体）与“小偃784”（作为父本；含42条小麦染色体和14条外源染色体）杂交得到种子（种子具有42条小麦染色体和7条外源染色体）。
2、将步骤1得到的种子培育为植株（F1代植株），取F1代植株，剪取即将大量开花的植株的麦穗，利用60Co-γ射线辐射诱导染色体发生结构变异（辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min），辐射后立即从麦穗上采集新鲜花粉，给3-4天前已去雄的“小偃81”的麦穗授粉，并套袋隔离，获得的种子即为M0代种子。
3、从步骤2获得的M0代种子中随机抽取37粒，进行原位杂交。
具体方法同实施例1的步骤一的3。
4、获得大量易位系
第一次循环：以上步骤1至3为第一次循环，得到8株易位系、9株含少量外源染色体的异附加系和7株含多条外源染色体的异附加系。
第二次循环-1：对于第一次循环中得到的含少量外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取92粒M0代种子进行原位杂交），得到10株易位系和24株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-1：对于第二次循环-1中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取39粒M0代种子进行原位杂交），得到8株易位系。
第二次循环-2：对于第一次循环中得到的含多条外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的部分异源双二倍体依次进行步骤1、步骤2和步骤3（步骤3中抽取39粒M0代种子进行原位杂交），得到15株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-2：对于第二次循环-2中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取37粒M0代种子进行原位杂交），得到5株易位系。
以上三次循环建库共获得了31个易位系。
二、规模化创制以“小偃81”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“小偃81”连续回交4次，即获得“小偃81”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
三、规模化创制以“西农979”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“西农979”连续回交4次，即获得“西农979”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
四、规模化创制以“衡观35”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“衡观35”连续回交4次，即获得“衡观35”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
实施例3、规模化创制小麦异源易位系
一、规模化创制易位系
1、将“京411”（作为母本；含42条小麦染色体）与”小偃7430”（作为父本；含42条小麦染色体和14条外源染色体）杂交得到种子（种子具有42条小麦染色体和7条外源染色体）。
2、将步骤1得到的种子培育为植株（F1代植株），取F1代植株，剪取即将大量开花的植株的麦穗，利用60Co-γ射线辐射诱导染色体发生结构变异（辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min），辐射后立即从麦穗上采集新鲜花粉，给3-4天前已去雄的“小偃81”的麦穗授粉，并套袋隔离，获得的种子即为M0代种子。
3、从步骤2获得的M0代种子中随机抽取26粒，进行原位杂交。
具体方法同实施例1的步骤一的3。
4、获得大量易位系
第一次循环：以上步骤1至3为第一次循环，得到7株易位系、8株含少量外源染色体的异附加系和4株含多条外源染色体的异附加系。
第二次循环-1：对于第一次循环中得到的含少量外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取63粒M0代种子进行原位杂交），得到7株易位系和17株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-1：对于第二次循环-1中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取204粒M0代种子进行原位杂交），得到32株易位系。
第二次循环-2：对于第一次循环中得到的含多条外源染色体的异附加系，代替第一次循环中的部分异源双二倍体依次进行步骤1、步骤2和步骤3（步骤3中抽取40粒M0代种子进行原位杂交），得到18株含少量外源染色体的异附加系。
第三次循环-2：对于第二次循环-2中得到的含少量外源染色体的异附加系，再次代替第一次循环中的F1代植株依次进行步骤2和步骤3（步骤3中抽取30粒M0代种子进行原位杂交），得到4株易位系。
以上三次循环建库共获得了50个易位系。
二、规模化创制以“小偃81”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“小偃81”连续回交4次，即获得“小偃81”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
三、规模化创制以“西农979”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“西农979”连续回交4次，即获得“西农979”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
四、规模化创制以“衡观35”为背景的小麦异源易位系
将步骤一中得到的各个易位系（如果具有雄性育性则作为父本，如果不具有雄性育性则作为母本）与“衡观35”连续回交4次，即获得“衡观35”遗传背景下的各类小麦异源易位系。
实施例4、对小麦异源易位系进行分析
对各个实施例获得的小麦异源易位系进行顺序基因组原位杂交（GISH）和多色荧光原位杂交（multicolor-FISH），详细分析异源易位染色体片段的大小、易位类型并明确易位系染色体的组成。
1、异源易位系的基因组原位杂交
方法同实施例1的步骤一的3。
某个植株的结果照片见图3A。
2、异源易位系的多色荧光原位杂交
对异源易位系进行多色荧光原位杂交，方法与基因组原位杂交基本相同，不同点在于：使用的探针为Texas（红光）标记的来源于粗山羊草的串联重复序列pAs1和AlexaFluor-488-dUTP（绿光）标记的来源于黑麦的串联重复序列pSc119.2，或使用的探针为Texas（红光）标记的来源于粗山羊草的串联重复序列pAs1和AlexaFluor-488-dUTP（绿光）标记的来源于大麦的串联重复序列pHvG38；不需要加封阻。荧光显微镜镜检时对前次拍照的细胞进行照相。
某个植株的结果照片见图3B。
3、小麦异源易位系的分析
利用基因组原位杂交分析异源易位系中小麦-外源易位染色体的数目、类型、外源易位片段的大小及断点位置。利用荧光原位杂交谱带与中国春小麦（Mukaietal.,1993）的标准谱带进行对比，比较pAs1（红色信号）和pSc119.2（或pHvG38）（绿色信号）的杂交带型，确定易位染色体中小麦染色体片段的来源。综合以上信息，将不同异源易位系编号并永久保存。
以实施例1的步骤一为例：对于含少量外源染色体的异附加系还可以与“小偃81”进行杂交，获得单体异附加系（不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1条独立存在的长穗偃麦草染色体），然后代替F1代植株依次进行步骤2和步骤3；单体异附加系也可以多次与“小偃81”进行回交，子代代替F1代植株依次进行步骤2和步骤3；这样可以得到更大量的易位系材料。其它步骤和其他实施例以此类推。
Claims (10)
1.一种规模化创制易位系的方法，包括如下步骤：
(1)将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体杂交得到种子；
(2)将步骤(1)得到的种子培育为植株，即为F1代植株；
(3)利用60Co-γ射线辐射所述F1代植株的花粉，然后授予去雄后的普通小麦的植株，获得种子；
(4)将步骤(3)得到的种子进行原位杂交，然后进行归类，分别为易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系；所述易位系存在小麦-长穗偃麦草易位染色体；所述含少量外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1-2条独立存在的长穗偃麦草染色体；所述含多条外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含3-5条独立存在的长穗偃麦草染色体；
所述步骤(3)中，所述60Co-γ射线辐射的参数为：辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min；
对于含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤(3)和所述步骤(4)，依次循环，获得易位系；
对于含多条外源染色体的异附加系，代替所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体依次进行所述步骤(1)、所述步骤(2)、所述步骤(3)和所述步骤(4)，依次循环，获得易位系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述普通小麦为“长武131”、“密穗小麦”、“石4185”或“京411”。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体为“小偃68”、“小偃784”或“小偃7430”。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述普通小麦为“小偃81”。
5.一种规模化创制易位系的方法，包括如下步骤：
(1)将普通小麦与小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体杂交得到种子；
(2)将步骤(1)得到的种子培育为植株，即为F1代植株；
(3)利用60Co-γ射线辐射所述F1代植株的花粉，然后授予去雄后的普通小麦的植株，获得种子；所述60Co-γ射线辐射的参数为：辐射吸收总剂量15Gy，剂量率为4.7Gy/min；
(4)将步骤(3)得到的种子进行原位杂交，然后进行归类，分别为易位系、含少量外源染色体的异附加系和含多条外源染色体的异附加系；所述易位系存在小麦-长穗偃麦草易位染色体；所述含少量外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含1-2条独立存在的长穗偃麦草染色体；所述含多条外源染色体的异附加系不存在小麦-长穗偃麦草易位染色体且含3-5条独立存在的长穗偃麦草染色体；
(5)对于步骤(4)得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤(3)和所述步骤(4)，获得易位系和含少量外源染色体的异附加系；
(6)对于步骤(5)得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤(3)和所述步骤(4)，获得易位系；
(7)对于步骤(4)得到的含多条外源染色体的异附加系，代替所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体依次进行所述步骤(1)、所述步骤(2)、所述步骤(3)和所述步骤(4)，获得含少量外源染色体的异附加系；
(8)对于步骤(7)得到的含少量外源染色体的异附加系，代替所述F1代植株依次进行所述步骤(3)和所述步骤(4)，获得易位系。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述普通小麦为“长武131”、“密穗小麦”、“石4185”或“京411”。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述小麦-长穗偃麦草的部分异源双二倍体为“小偃68”、“小偃784”或“小偃7430”。
8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述普通小麦为“小偃81”。
9.一种规模化创制小麦异源易位系的方法，包括如下步骤：将权利要求1至8中任一所述方法得到的易位系与普通小麦进行连续回交，获得所述普通小麦的遗传背景下的小麦异源易位系。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述回交时，所述普通小麦为“小偃81”、“西农979”或“衡观35”。
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