CN116732219A - 一种水曲柳与白蜡种间杂交f1代品种鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，该方法利用SSR分子标记技术筛选出2对可以鉴定父本、母本和杂交F1子代的引物，PCR扩增后用12％非变性聚丙烯酰胺电泳进行检测，在凝胶成像仪中观察显色的凝胶，并拍照，统计父本、母本和F1子代之间的差异条带，即父母本的差异条带在F1子代中都存在，说明F1子代为杂交品种。目前对水曲柳与白蜡杂交子代的鉴定多采用田间生长、生理及抗逆特征等指标进行鉴定，不易判别是否为真杂种，本发明能够准确和易于鉴定水曲柳和白蜡杂交种质成分，确定杂交种纯度，为培育新品种并推广具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及林木遗传育种技术领域，具体涉及一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法。
背景技术
水曲柳(Fraxinus mandshuricaRupr.)别名大叶梣、东北梣，是木犀科(Oleacee)白蜡属(Fraxinus)的高大落叶乔木。水曲柳主要分布于我国北部，与胡桃楸，黄菠萝并称为“三大硬阔”，目前作为国家储备林计划的二级保护树种，是东北地区的主要造林和用材树种，但在生产中还存在着“大小年现象”影响种子产量，有性、无性繁殖效率低、在组培繁殖过程中又存在极易休眠老化等瓶颈问题，严重阻碍了水曲柳无性规模化繁殖的生产，严重限制了水曲柳良种的推广利用。
白蜡树(Fraxinus chinensisRoxb.)为落叶乔木，耐瘠薄干旱，在轻度盐碱地也能生长。植株萌发力强，材理通直，生长迅速，柔软坚韧，供编制各种用具，并有较高药用价值。
在自然界中，林木杂种优势广泛存在，是林木杂交育种的主要研究热点。林木杂交育种具有同时聚合出父本和母本的优良性状的优点，可以通过杂交的手段有目的性的培育出优良的杂交子代，并从中筛选出良种，这样可以极大的扩充林木种质资源。在杂交子代筛选过程中，常常根据表型、抗性、生理生化等指标进行筛选，这需要杂交子代长大之后才可以进行筛选实验，因此，费时、费力还受到时间和环境的限制。
分子标记辅助选育技术是通过与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)广泛分布于真核生物基因组的不同位置，由于SSR位点的重复基元种类和重复次数不同，使其呈现出高度的多态性。现有研究中，SSR分子标记被广泛应用于包括农作物、林木以及草本植物的育种中，如棉花、大豆、小麦和杨树等。国内外对于白蜡和水曲柳单独树种的种质资源研究多侧重于遗传多样性分析，对水曲柳和白蜡杂交种的鉴定上多采用田间实验的方法鉴定，很少用SSR分子标记方法鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，本发明所述所述SSR引物组合可用于水曲柳和白蜡杂交后代的早期鉴定，既提高了水曲柳和白蜡杂交育种效率，又降低了杂交后代株系的管理成本，具有准确性高、操作简便等优点。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)水曲柳和白蜡杂交F1代DNA提取：利用CTAB法或者试剂盒法提取DNA；
(2)水曲柳和白蜡杂交F1代SSR引物合成：设计的SSR分子标记引物由生物公司进行合成；
(3)水曲柳和白蜡杂交F1代PCR扩增：以(1)中提取的DNA为模板，(2)中合成的引物进行PCR扩增；
(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制12％聚丙烯凝胶，将(3)中的PCR产物上样后电泳；
(5)银染、显色、终止：将电泳后的凝胶在染色液中进行染色后放入显色液中，震荡摇晃至Marker出现第一条带后，将胶放入终止液中终止反应，蒸馏水洗2次，每次1min；
(6)观察并统计差异条带：在凝胶成像仪中观察(5)中处理后的凝胶，统计父本、母本和F1子代之间的差异条带，即父母本的差异条带在F1子代中都存在，说明F1子代为杂交品种。上述方案中，步骤(2)所述SSR引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8。
上述方案中，步骤(3)所述PCR扩增的体系为：DNA模板2.0μL、上、下游引物(10umol/L)各1μL、2X PCR MIX 10μL、ddH2O 7μL、共20μL。SSR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、95℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃10min终止反应。
上述方案中，步骤(4)所述电泳条件为：在DYY-6D型电泳仪上进行电泳，电泳缓冲液为1xTBE，电压120v，时间150min左右，电泳缓冲液1xTBE需要提前4℃度预冷16-24h。上述方案中，步骤(5)所述涉及到的溶液为：(Ⅰ)染色液：1gAgNO3溶于800mL超纯水中，定容至1000mL；(Ⅱ)显色液：3gNaOH溶于200mL超纯水，使用前加1mL37％甲醛；(Ⅲ)终止液：5mL冰乙酸、100mL乙醇，加水至1000mL；其中染色液使用前需要提前4℃度预冷16-24h。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，该方法克服了以往获得的水曲柳和白蜡种间杂交品种只在田间实验中通过表型和抗性来筛选，不易判别是否为真杂种，应用本发明能够准确和易于鉴定水曲柳和白蜡杂交种质成分，确定杂交种纯度，为培育新品种并推广具有重要的意义。
附图说明
图1为水曲柳×白蜡种间杂交F1代、母本、父本DNA电泳图，M：Marker，1：父本，2：母本，3-7：杂交F1代。
图2为水曲柳×白蜡种间杂交F1代与母本、父本的SSR扩增多态性比较电泳图，M：Marker，1：父本，2：母本，3-12：杂交F1代。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例：
一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，包括：
(1)水曲柳和白蜡杂交F1代DNA提取：选择6个杂交组合的F1代组培苗，杂交组合编号分别为XD、XF、QD、QF、LD、LF，其中首字母表示水曲柳母本，第二个字母表示白蜡父本，每个杂交组合取100个组培苗的叶片，混合后利用CTAB法或商业的植物DNA提取试剂盒进行DNA的提取，同时提取父本和母本的DNA，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测是否获得DNA；
(2)水曲柳和白蜡杂交F1代SSR引物合成：根据白蜡和水曲柳转录组数据，查找SSR位点并设计SSR分子标记引物，共20对，其中10对来自白蜡，10对来自水曲柳，将引物序列发给生物公司进行引物合成；
(3)水曲柳和白蜡杂交F1代PCR扩增：以(1)中提取的DNA为模板，(2)中合成的引物进行PCR扩增，PCR体系为20μL，包含DNA模板2.0μL、上、下游引物(10umol/L)各1μL、2x PCRMIX 10μL、ddH2O 7μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、95℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃10min终止反应；
(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制12％聚丙烯凝胶，将(3)中的PCR产物上样后电泳，在DYY-6D型电泳仪上进行电泳，电泳缓冲液1xTBE，电压120v，时间150min左右，电泳缓冲液1xTBE提前在4℃预冷16-24h；
(5)银染、显色、终止：将电泳后的凝胶放到盛有100mL超纯水的玻璃器皿中洗胶15s，然后在染色液中染色30min，迅速洗胶一次，时间小于10s，然后在显色液中显色，至Marker出现第一条带后，将胶转入终止液中终止显色5min，再用超纯水洗2次，每次1min；其中染色液为1gAgNO3溶于800mL超纯水中，定容至1000mL，放入4℃温度下预冷16-24h，显色液为3g NaOH溶于200mL超纯水，使用前加1mL37％甲醛，终止液为5ml冰乙酸、100mL乙醇，加水至1000mL；在整个操作过程中都是在水平要摇床上进行，转速90-110转/min；
(6)观察并统计差异条带：在凝胶成像仪中观察显色的凝胶，并拍照，统计父本、母本和F1子代之间的差异条带，即父母本的差异条带在F1子代中都存在，说明F1子代为杂交品种。(7)杂交子代的个体鉴定：根据差异条带分析，选择能够区分父本、母本和F1子代的引物进行杂交子代的个体鉴定，方法与(1)—(6)相同，此时的引物为：
A：扩增SSR分子标记的SSR1引物：
SEQ ID NO:1：SSR01-F：5'-GCCATGGGATCAAGGGTGAA-3'
SEQ ID NO:2：SSR01-R：5'-GGGCCGGAAAGAAGAGGAAC-3'
B：扩增SSR分子标记的SSR2引物：
SEQ ID NO:3：SSR01-F：5'-TCACTGCTTTGGACATCCCC-3'
SEQ ID NO:4：SSR01-R：5'-TCCAAGACTCCAAGGCCAAC-3'
C：扩增SSR分子标记的SSR3引物：
SEQ ID NO:5：SSR01-F：5'-TTGACTCGTGTTTAGGGATGAAT-3'
SEQ ID NO:6：SSR01-R：5'-AGCTCTTGAAGGGAAAATTTGAA-3'
D：扩增SSR分子标记的SSR4引物：
SEQ ID NO:7：SSR01-F：5'-TGAGCAAATGTGAAGACCGTAG-3'
SEQ ID NO:8：SSR01-R：5'-TAATTTCATCCACCAGTTTCCAC-3'
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)水曲柳和白蜡杂交F1代DNA提取：利用CTAB法或者试剂盒法提取DNA；
(2)水曲柳和白蜡杂交F1代SSR引物合成：设计的SSR分子标记引物由生物公司进行合成；
(3)水曲柳和白蜡杂交F1代PCR扩增：以(1)中提取的DNA为模板，(2)中合成的引物进行PCR扩增；
(4)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：配制12％聚丙烯凝胶，将(3)中的PCR产物上样后电泳，在DYY-6D型电泳仪上进行电泳，电泳缓冲液为1xTBE，电压120v，时间150min左右；
(5)银染、显色、终止：将电泳后的凝胶在100mL超纯水中洗15s，放入染色液中进行染色后转入显色液中，90-110转/min震荡摇晃至Marker出现第一条带后，将胶放入终止液中终止反应，蒸馏水洗2次，每次1min，其中染色液：1g AgNO3溶于800ml超纯水中，定容至1000mL；显色液：3gNaOH溶于200mL超纯水，使用前加1ml 37％甲醛；终止液：5ml冰乙酸、100mL乙醇，加水至1000mL；
(6)观察并统计差异条带：在凝胶成像仪中观察(5)中处理后的凝胶，统计父本、母本和F1子代之间的差异条带，即父母本的差异条带在F1子代中都存在，说明F1子代为杂交品种。
2.根据权利要求1所述的一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，其特征在于：步骤(2)中所使用的引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。
3.根据权利要求1所述的一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，其特征在于：步骤(3)中PCR扩增的体系为：DNA模板2.0μL、上、下游引物(10umol/L)各1μL、2xPCR MIX10μL、ddH2O 7μL、共20μL。SSR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、95℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃10min终止反应。
4.根据权利要求1所述的一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，其特征在于：步骤(4)中电泳缓冲液1xTBE使用前在4℃先预冷16-24h。
5.根据权利要求1所述的一种水曲柳与白蜡种间杂交F1代品种鉴定的方法，其特征在于：步骤(5)中染色液使用前在4℃先预冷16-24h。
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2023
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| CN116420620B (zh) * | 2023-04-20 | 2024-01-26 | 东北林业大学 | 一种通过胚挽救获得水曲柳与白蜡种间杂交f1代的方法 |
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