CN101338341B - 不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法，属于分子遗传学领域。对不结球白菜高Vc含量品种‘常州乌塌菜’和低Vc含量品种‘二青’进行RAPD分子标记的筛选，获得与不结球白菜高Vc含量基因连锁的一个标记AW5₅₆₁，对该特异片段进行测序分析，并将其转化为稳定的SCAR标记，即SCAW5₅₃₂。通过本发明提供的分子标记，可有效开展不结球白菜高Vc含量品种的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程。

Description

不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法

一、技术领域

本发明涉及不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法，属于分子生物学领域，涉及不结球白菜高Vc含量系的分子育种，专用于不结球白菜高Vc含量品种的筛选和鉴定。 

二、背景技术

不结球白菜(Brassica campestris.ssp.chinensis.Makino)又名小白菜、青菜、油菜，是我国长江中下游及其以南地区的一种四季栽培的蔬菜，近年来在我国北方也有较大面积的引种栽培和推广。近年来，人们对蔬菜品质的要求越来越高，而Vc是品质性状中的重要指标，因此，高Vc含量成为不结球白菜的重要育种目标。 

张增翠等采用主基因-多基因混合遗传模型分析方法，对不结球白菜常州乌塌菜×矮脚黄、雪克青×矮脚黄两个组合的Vc、可溶性糖含量进行单世代和联合世代遗传分析。结果表明，两组合中Vc含量遗传符合一个主基因和多基因的混合遗传模型，主基因遗传率为52.68％～74.12％。Rousseaux和Sxhauer发现了番茄中控制果实Vc含量的QTL(Rousseaux et al.，2005；Schauer et al.，2006)。 

RAPD标记已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域。本发明采用BSA方法和RAPD技术，筛选与不结球白菜高Vc含量基因紧密连锁的标记，以实现不结球白菜高Vc含量性状的标记辅助育种，加速我国不结球白菜高Vc含量品种的选育进程。 

三、发明内容

技术问题本发明的目的是：筛选出一个或几个与不结球白菜高Vc含量基因紧密连锁的分子标记，这些分子标记用于不结球白菜辅助选择育种和品种鉴定，可大大提高不结球白菜高Vc含量品种的选择鉴定效率。 

技术方案本发明的实施方案如下： 

不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法，其特征在于 

用RAPD标记引物AW5：CTGCTTCGAG 

扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出561bp的片段AW5561，则标志着不结球白菜高Vc含量基因的存在； 

或者用SCAR标记引物SCAW5532 

F：TTCGAGGCTGAAGAG 

R：TTTCGCGTCTACTAATGC 

扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出532bp的片段SCAW5532，则标志着不结球白菜高Vc含量基因的存在。 

有益效果：本发明选用的是不结球白菜高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc含量品种二青为材料开展不结球白菜高Vc含量基因分子标记的筛选。与目前技术相比，其优点是： 

(1)RAPD操作简便、快速、方便，它可以直接对生物基因组DNA多态性进行分析，RAPD引物的设计是随机的，因而无须知道特异位点序列的信息。 

(2)SCAR将退火温度提高到50～60℃，既克服了RAPD的不稳定性，又具有简单、实用、成本低的优点。 

(3)辅助选择方便，节约成本。不结球白菜高Vc含量品种的常规选育方法周期长，成本高，费时又费力。通过本发明筛选出的与不结球白菜高Vc含量基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜高Vc含量系的选择效率，从而加快育种进程。 

(4)本发明提供的分子标记，生产上可用于对不结球白菜高Vc含量品种的纯度鉴定。 

四、附图说明

图1父母本及F₁、F₂代DNA的提取 

泳道1～3分别为W、Q、F₁，泳道4-6为F₂单株。 

图2高、低Vc含量基因池、亲本的多态性筛选 

M为DL2000marker，→代表高、低池间的差异条带。 

图3特异引物的扩增结果 

M为DL2000marker，W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池L为低Vc含量基因池。 

图4连锁标记对高、低Vc含量基因池，父母本，F₂代单株的扩增结果 

M为DL2000marker，W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池，L为低 Vc含量基因池。1-6为高Vc含量单株，8-13为低Vc含量单株。 

图5SCAR标记对高、低Vc含量基因池，父母本，F2代单株的扩增结果M为DL2000marker，W为母本，Q为父本，H为高Vc含量基因池L为低Vc含量基因池，1-7为高Vc含量单株，8-13为低Vc含量单株。图6标记AW5₅₆₁与高Vc含量基因的连锁图 

五、具体实施方式

利用RAPD等分子标记技术寻找与高Vc含量基因连锁的标记，为定位及克隆这些基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。目前国内外未见在不结球白菜高Vc含量基因分子标记方面的报道。 

本发明的实施程序是： 

(一)材料与方法  材料选用不结球白菜高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc含量品种二青(均为公知公用材料，见参考文献宋玉萍等不结球白菜维生素C积累与相关酶活性研究，西北植物学报，2007，27(11))。高Vc含量品种常州乌塌菜、低Vc含量品种二青和杂交F₁代及自交F₂代进行Vc含量测定、分子标记的筛选及连锁分析。 

(二)杂交F₂后代Vc含量的分组和遗传分析 

常州乌塌菜和二青杂种F₁自交获得了F₂群体。测定F₂个体Vc含量后从低到高依次排列，以每百克相差4毫克为一组(表1)，如以0-26(mg/100g)、26-34(mg/100g)和34-42(mg/100g)分为三个Vc含量组，则低Vc含量株有12+36＝48株，高Vc含量株有61+38+20+14＝133株，x²＝0.2231＜3.84，符合3∶1分离比，表明控制不结球白菜Vc含量基因中存在单一位点的主效基因。进一步分析，可将高Vc含量组中分为两组即中Vc含量组中有61+38＝99株，x²＝3.76＜3.84符合1∶2∶1。说明白菜高Vc含量基因中可能存在一个类似于质量性状的显性主效基因。 

表1 

Vc含量(mg/100g)	0	22	26	30	34	38	42
								单株个数	0	12	36	61	38	20	14

(三)分子标记分析主要利用RAPD标记。 

采用CTAB法(见参考文献：M.G.Murray，W.F.Thompson.Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321～4325)，提取(提取方法见参考文献：史公军，侯喜林.不结球白菜RAPD反应体系的优化.江西农业大学学报，2004，26(1)：1～5)高Vc含量品种常州乌塌菜和低Vc含量品种二青及F₁、F₂的单株DNA(见图1)。 

首先用512个特异RAPD引物(由上海英骏生物技术有限公司合成)对不结球白菜的父母本、高低池DNA多态性进行初步分析。PCR反应体系为：在25μL反应体系中，1.9μL dNTP(2.5mmol/L)，2μL Mg²⁺(10mmol/L)，0.2μL Taq E(5U/μL)，1μL DNA(25ng/μL)，1μL 50％甘油，1μL Primer(10μmol/L)，2.5μL 10×Buffer，13μLH₂O。PCR扩增程序为：94℃变性2min，37℃退火30s，72℃延伸50s，2个循环；94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，72℃延伸5min，18个循环；94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，72℃保温5min，25个循环。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测进行拍照，筛选出在不结球白菜高Vc含量基因池和低Vc含量基因池间的多态性片段(见图2)。 

(三)结果与分析 

分子标记筛选结果表明，1个RAPD标记与不结球白菜高Vc含量基因连锁，扩增出(561bp)的片段AW5₅₆₁(见图3、4)。 

该标记引物为AW5 

引物序列CTGCTTCGAG 

即用引物AW5扩增不结球白菜高Vc含量系或育种材料DNA，如果能够扩增出561bp的片段AW5₅₆₁，则标志着不结球白菜高Vc含量基因的存在。通过对不结球白菜高Vc含量品种、低Vc含量品种杂交和自交得到的F₂代181个单株Vc含量测定结果和分子标记图谱数据进行连锁分析(分析软件Joinmap3.0(Stam and VanOoi-jen，1995))，发现所筛选到的标记与不结球白菜高Vc含量基因连锁(见图6)，连锁距离为6.14cM，并将RAPD标记AW5转化为SCAR标记SCAW5₅₃₂(见图5)。筛选到的不结球白菜高Vc含量基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可有效开展不结球白菜高Vc含量品种的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程，生产上可用于对不结球白菜高Vc含量品种的纯度鉴定。 

                            序列表 

<110>南京农业大学 

<120>不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法 

<130>说明书 

<140>00 

<141>2008-06-12 

<160>3 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>10 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<220> 

<221>RAPD标记引物AW5 

<222>(1)..(10) 

<223> 

<400>1 

ctgcttcgag                                        10 

<210>2 

<211>15 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<220> 

<221>SCAR标记引物SCAW5532左端序列 

<222>(1)..(15) 

<223> 

<400>2 

ttcgaggctg aagag                                    15 

<210>3 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<220> 

<221>SCAR标记引物SCAW5532右端序列 

<222>(1)..(18) 

<223> 

<400>3 

tttcgcgtct actaatgc                                  18 

Claims (1)

1.不结球白菜高Vc含量基因的分子标记方法，其特征在于

用RAPD标记引物AW5：CTGCTTCGAG

扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出561bp的片段AW5₅₆₁，则标志着不结球白菜高Vc含量基因的存在；

或者用SCAR标记引物SCAW5₅₃₂

F：TTCGAGGCTGAAGAG

R：TTTCGCGTCTACTAATGC，

扩增不结球白菜DNA，如果能够扩出532bp的片段SCAW5₅₃₂，则标志着不结球白菜高Vc含量基因的存在。

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