CN101117645B - 不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，属于分子生物学领域。用标记引物DBC16扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩出252bp的晚抽薹LB片段，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。本发明对不结球白菜晚抽薹系Y5及早抽薹系P120进行SSR分子标记的筛选，获得不结球白菜晚抽薹基因的一个标记晚抽薹LB。通过本发明提供的分子标记，可有效开展不结球白菜晚抽薹品种的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程，生产上可用于对不结球白菜晚抽薹品种的纯度鉴定。

Description

不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法

一、技术领域

本发明涉及不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，属于分子生物学领域，涉及不结球白菜晚抽薹系的分子育种，专用于不结球白菜晚抽薹基因品种的筛选和鉴定。

二、技术背景

不结球白菜(Brassica campestris.ssp.chinensis.Makino)又名小白菜、青菜、油菜，是我国长江中下游及其以南地区的一种四季栽培的蔬菜，近年来在我国北方也有较大面积的引种栽培和推广。但由于抽薹早，其产量和质量都有明显的下降，因此，晚抽薹成为不结球白菜的重要育种目标。

Hidetoshi等利用分离组群法BSA(bulked segregant analysis)对散叶大白菜的抽薹性状进行QTL鉴定和定位，发现了1个与控制抽薹性状紧密连锁的RAPD标记—RA1255(530bp)，并将该基因定位于BN007-1上。

SSR标记是以SSR多态性为基础的遗传标记，已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域。本发明采用BSA方法和SSR技术，筛选与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的标记，以实现不结球白菜晚抽薹性状的标记辅助育种，加速我国不结球白菜晚抽薹性品种的选育进程。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是：筛选出一个或几个与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的分子标记，这些分子标记用于不结球白菜辅助选择育种和品种鉴定，可大大提高不结球白菜晚抽薹系的选择鉴定效率。

技术方案本发明的实施方案如下：

不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，其特征在于：

用标记引物DBC16，

DBC16+：5’—AAAGTCGTGGGAAGTATCGT—3’，

DBC16—：5’—AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT—3’

扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩增出252bp的晚抽薹LB片段，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。

有益效果：本发明选用的是不结球白菜晚抽薹系和早抽薹系为材料开展不结球白菜晚抽薹分子标记的筛选。与目前技术相比，其优点是：

(1)标记稳定。本研究采用标记稳定的SSR，其标记带型简单，记录的条带一致，还具有实验程序简单等优点。

(2)辅助选择方便，节约成本。不结球白菜晚抽薹系的常规选育方法周期长，成本高，费时又费力。通过本发明筛选出的与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可以实现苗期选择，减少工作量，大大提高不结球白菜晚抽薹系的选择效率，从而加快育种进程。

(3)本发明提供的分子标记，生产上可用于对不结球白菜晚抽薹品种的纯度鉴定。

四、附图说明

图1父母本及F₁、F₂代DNA的提取

泳道1～3分别为P₁、P₂、F₁，泳道4～6为F₂单株。

图2亲本间的多态性筛选

M为分子量marker，A为引物DBC1，B为引物DBC12，C为引物DBC18，→代表亲本间的差异条带。

图3特异引物的扩增结果

M为分子量marker，A为母本，B为父本，C为F₁代。

图4连锁标记对F₂代单株的扩增结果

M为分子量marker，1～18为晚抽薹单株，19～36为早抽薹单株，→代表特异带。

五、具体实施方式

利用SSR等分子标记技术寻找与晚抽薹基因连锁的标记，为定位及克隆这些基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。目前国内外在不结球白菜晚抽薹基因分子标记方面研究较少。

本发明的实施程序是：

(一)材料与方法不结球白菜晚抽薹系Y5，即上海四月慢和早抽薹系P120，即南京矮脚黄，(见参考文献：曹寿椿，李式军.白菜地方品种的初步研究II.主要生物学特性的研究.南京农学院学报，1981，(1)：1～11)，这两个自交系来自南京农业大学白菜课题组。晚抽薹系、早抽薹系和杂交F₁代及自交F₂代148株进行田间抽薹期调查、分子标记的筛选及连锁分析。

(二)分子标记分析主要利用SSR标记。

采用CTAB法(见参考文献：M.G.Murray，W.F.Thompson.Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321～4325)，提取(提取方法见参考文献：史公军，侯喜林.不结球白菜RAPD反应体系的优化.江西农业大学学报，2004，26(1)：1～5)不结球白菜晚抽薹系Y5和早抽薹系P120及F₁、F₂的单株DNA(见图1)。

首先用182对特异引物(引物序列105对来源崔秀敏，侯喜林，董玉秀.ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜SSR引物.园艺学报，2006，33(1)：155～157；引物54对来源Suwabe K，Tsukazaki H，Iketani H et al.Identification of two loci for resistance toclubroot(Plasmodiophora brassicae Woronin)in Brassica rapa L.2003，107:997～1002等，由上海英骏生物技术有限公司合成)对不结球白菜晚抽薹系和早抽薹系的DNA多态性进行初步分析。在PTC-100^TM扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为10μL，其中10×PCR buffer1.0μL，引物(100ng/μL)1.0μL，dNTP(2.5mmol/L)0.8μL，Mg²⁺(25mmol/L)0.8μL，DNA(60ng)0.5μL，Taq酶(2.5U/μL)0.1μL，ddH₂O5.8μL。PCR反应程序为：95℃2min；94℃40S，57℃45S，72℃1min；32个循环；72℃延长7min。PCR产物在8％的的变性聚丙烯酰胺凝胶200V电压电泳2h左右。电泳后，用含10％乙醇、0.5％乙酸200ml的ddH₂O固定12-20min；然后用ddH₂O洗一次，放入200ml0.2％AgNO₃中银染12-20min；用ddH₂O洗两次，倒入200ml(1.5％NaOH+0.4％甲醛+1％NaS₂O₃)ddH₂O中显色10-12min，显色后可进行拍照，筛选出在不结球白菜晚抽薹基因系和早抽薹系间的多态性片段(见图2)。

(三)结果与分析

分子标记筛选结果表明，1个SSR标记与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁，扩增出(252bp)的片段晚抽薹LB(见图3)。

该标记引物为DBC16

DBC16+：5’—AAAGTCGTGGGAAGTATCGT—3’，

DBC16—：5’—AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT—3’

即用引物DBC16扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩增出(252bp)的片段晚抽薹LB，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。通过对不结球白菜晚抽薹系、早抽薹系杂交和自交得到的F₂代148个单株田间调查结果和分子标记图谱数据进行连锁分析(分析软件MAPMAKER(Version3.0))，发现所筛选到的标记与不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁(见图4)，连锁距离为5.7cM。筛选到的不结球白菜晚抽薹基因紧密连锁的分子标记用于辅助选择，可有效开展不结球白菜晚抽薹系的选育，大大提高选择效率，从而加快育种进程，生产上可用于对不结球白菜晚抽薹品种的纯度鉴定。

Claims (1)

1.不结球白菜晚抽薹基因的分子标记方法，其特征在于：

用标记引物DBC16

DBC16+：5’-AAAGTCGTGGGAAGTATCGT-3’，

DBC16-：5’-AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT-3’

扩增不结球白菜晚抽薹系或育种材料DNA，如果能够扩出252bp的晚抽薹片段，则标志着不结球白菜晚抽薹基因的存在。

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