CN113755623B - 一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物及其应用，属于分子生物学技术领域。所述分子标记引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，以不结球白菜DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增该片段，根据目的条带的有无，可筛选出不结球白菜早抽薹品种或材料。本发明提供的分子标记引物，可以快速检测不结球白菜早抽薹的品种和材料，极大的节约时间和资源，大大提高选择效率，从而加快育种进程。

Description

一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物及其应用。
背景技术
不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，又名青菜、小白菜、油菜等，是我国长江中下游及其以南地区的一种四季栽培的蔬菜。不结球白菜质地鲜嫩，营养丰富，深受人们喜爱，在我国蔬菜消费中占有重要地位。花的产生代表着植物由营养生长转变为生殖生长，不结球白菜以营养器官为产品，先期抽薹不仅降低生物产量，还影响其商品性和食用价值，给生产带来巨大的损失。
因此，设计一种专用于不结球白菜早抽薹品种和材料的筛选、鉴定方法极为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物，该组引物可用于不结球白菜早抽薹的筛选和鉴定，快速准确。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物，命名为pF7，其序列为：
pF7F：5’-CGATGGTACGGTGATGTCGT-3’（SEQ ID NO.1），
pF7R：5’-GGTGTTCCGGACCTTAGACA-3’（SEQ ID NO.2）。
上述分子标记引物在鉴定不结球白菜早抽薹品种或材料中的应用。
一种鉴定不结球白菜早抽薹品种或材料的方法，包括以下步骤：
步骤1，提取待鉴定品种或材料的基因组DNA；
步骤2，以步骤1提取的DNA为模板，利用上述分子标记引物pF7对其进行PCR扩增；
步骤3，以步骤2的PCR扩增产物进行电泳分离，获得各样品的带型，如果得到517bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为早抽薹。
进一步地，步骤2中，PCR扩增具体为：在20μL反应体系中，50ng/μL DNA模板1μL、10μM pF7引物各1μL、2× Primer Star 10μL、去离子水7μL；PCR扩增程序为：95℃预变性2min，98℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸30s，72℃后延伸10min，35个循环，4℃保存。
有益效果：
1. 本发明通过使用标记引物pF7，可快速、高效的鉴定不结球白菜早抽薹品种和材料。
2. 本发明辅助选择方便，节约成本。不结球白菜抽薹开花时间品种的常规选育方法周期长，成本高，消耗大量的人力物力，通过本发明，可以实现苗期选择，减少工作量，提高了选择效率。
附图说明
图1为标记引物pF7在不同品种的不结球白菜PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：M为DL2000 Marker，泳道1-6、8-23\24-29、31-33、39为早抽薹品种或材料，泳道7\30、34-38为晚抽薹品种或材料。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供了一组不结球白菜早抽薹分子标记引物，即pF7，以早、晚抽薹等多品种和材料不结球白菜DNA为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增该片段。根据目的条带的有无，可筛选出不结球白菜早抽薹品种和材料。该方法提供了早期检测不结球白菜早抽薹的一对分子标记，可以快速检测不结球白菜早抽薹的品种和材料，极大的节约时间和资源，提高选择效率，从而加快育种进程，助力我国蔬菜产业的发展。
实施例1
本实施提供的一种鉴定不结球白菜早抽薹的方法，包括以下步骤：
步骤1，不结球白菜基因组DNA的提取
根据植物基因组DNA快速提取试剂盒（购自于北京天根生化科技有限公司）说明书提取DNA，简要如下：
1）取植物新鲜组织约100mg，加入液氮充分碾磨；
2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700µL已在65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在 65℃水浴20min；
3）加入700µL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；
4）小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700µL缓冲液GP2，充分混匀；
5）将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30 s，弃掉废液；
6）向吸附柱CB3中加入500µL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7)向吸附柱CB3中 加入600µL 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8)重复操作步骤7；
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
11)DNA经纯度及浓度检测，稀释到50ng/μL，存放于-20℃冰箱中备用。
步骤2，标记引物pF7在不结球白菜基因组中扩增
在20μL反应体系中，50ng/μL DNA模板1μL、10μM标记引物pF7各1μL、2×PrimerStar 10μL、去离子水7μL。
pF7标记引物：
pF7F：5’-CGATGGTACGGTGATGTCGT-3’
pF7R：5’-GGTGTTCCGGACCTTAGACA-3’。
PCR扩增程序为：95℃预变性2min，98℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸30s，72℃后延伸10min，35个循环，4℃保存。
步骤3，琼脂糖凝胶电泳检测
PCR扩增结束后，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，10μL上样，150V电泳20min后，于凝胶成像仪观察并拍照。
电泳结果如图1可知，在泳道1-6、8-29、31-33、39的早抽薹品种均能扩增出517bp的片段，在泳道7、30、34-38的晚抽薹品种则没有517bp的片段。
由以上结果可知，采用标记引物pF7扩增不结球白菜早抽薹的品种或材料，若能够扩增出517bp的片段，则标志着该不结球白菜具有早抽薹性状。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一组不结球白菜早抽薹的分子标记引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatggtacg gtgatgtcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgttccgg accttagaca 20

Claims (3)

1.引物对pF7在鉴定不结球白菜早抽薹品种或材料中的应用，所述引物对pF7的序列为：
pF7F：5’-CGATGGTACGGTGATGTCGT-3’，
pF7R：5’-GGTGTTCCGGACCTTAGACA-3’。
2.一种鉴定不结球白菜早抽薹品种或材料的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，提取待鉴定品种或材料的基因组DNA；
步骤2，以步骤1提取的DNA为模板，利用引物对pF7对其进行PCR扩增，引物对pF7的序列为：
pF7F：5’-CGATGGTACGGTGATGTCGT-3’，
pF7R：5’-GGTGTTCCGGACCTTAGACA-3’；
步骤3，以步骤2的PCR扩增产物进行电泳分离，获得各样品的带型，如果得到517bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为早抽薹。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中，PCR扩增具体为：在20μL反应体系中，50ng/μL DNA模板1μL、10μM pF7引物对pF7F和pF7R各1μL、2× Primer Star 10μL、去离子水7μL；PCR扩增程序为：95℃预变性2min，98℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸30s，72℃后延伸10min，35个循环，4℃保存。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Brassica rapa genome assembly, chromosome: A07.GenBank: LS974623.2.2021,序列. *

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