CN111979352A - 一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是利用mRT‑PCR(多重反转录聚合酶链式反应)技术对侵染半夏的CMV(黄瓜花叶病毒)、SMV(大豆花叶病毒)、DsMV(芋花叶病毒)进行检测。通过提取半夏植株mRNA，反转录得到cDNA，利用设计的特异引物进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，根据照胶仪显示条带鉴定侵染病毒种类。本方法技术成熟、方便快捷、特异性高、准确性好、用价低廉，一次性检测侵染半夏的多种病毒，为半夏病毒病防治及良种选育提供重要技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测领域，具体而言，涉及一种用于鉴定半夏侵染病毒的的引物对组、试剂盒、方法及应用。
背景技术
半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)为天南星科半夏属植物，始载于《神农本草经》，列为下品，其球形块茎经炮制后可入药，产品可分为生半夏、清半夏、姜半夏、法半夏。根据用药历史考证，在558种中药处方中，半夏使用频率为第22位，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效，在中医临床上是治疗湿痰咳嗽的要药，半夏泻心汤对于胃肠功能的恢复可发挥重要的作用，具有临床推广价值。尤其，自仲景始，至当代诸多名家如朱良春、李可等均以生半夏抗肿瘤，现代毒性研究及药理研究均证明其抗肿瘤作用机制确切，可作用于多系统脏器肿瘤；临床应用中取得了较好的临床疗效。并且，半夏的需求量随着中国中医药的发展日益增加，随之而来的是人工种植面积的不断扩大，但由于栽培技术不当，野生种质资源难以供应，长期使用块茎和珠芽进行无性繁殖，导致生产上半夏病毒病危害十分严重，重者可致减产60％以上，并且病毒一旦侵染将终身携带病毒，严重危害品质，导致品种退化。目前，在世界范围内，病毒研究日益精进，虽然并没有研制出广泛用于治疗病毒病的药物，但在源头防治方面，植物病毒病检测技术也正在向着快速、高敏感性、高特异性和高通量并行性及自动化的方向发展，优化无毒半夏种质资源培育技术，加强育种与栽培过程中的病毒检测，是为控制病毒病危害的有效途径。
分子生物学检测法是通过检测病毒核酸(DNA，RNA)来证实病毒的存在，由于是从核酸的水平来检测病毒，灵敏度极高，可检测到皮克(pg)级甚至飞克(fg)级，并且特异性强；检测病毒的范围更广，对各种病毒、类病毒都可以检测，并且可以进行大批量的样本检测。PCR技术将引物、待扩增DNA样品、dNTP、Mg2+和DNA聚合酶加入到PCR缓冲液中，经反复加热变性和退火延伸，最后利用琼脂糖凝胶电泳进行植物病毒检测。PCR用于植物病毒的鉴定与分类，灵敏度高、特异性强、快速简便，特别是当样品病毒含量低，其他方法难以检测出时，其检测效果较好。PCR技术受到引物设计的限制，对于未知基因，随机引物并不一定能够快速、特异、完整地复制出病毒基因，PCR技术在这种情况下检测植物病毒会有局限性。
植物病毒中大多数是RNA病毒，RNA病毒则需先将RNA反转录成cDNA再进行PCR扩增，此方法称为RT-PCR。在此基础上又发展了用于植物病毒检测的多种方法，其中，mRT-PCR为多重RT-PCR反应，即在同一RT-PCR反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段，达到快速、简便的目的。随着分子研究的不断深入，mRT-PCR技术在作物、果树、蔬菜、花卉、中药材等病毒检测上的应用有增无减，无论是在通商口岸还是科研实验室都如火如荼。
在中药材生产中，PCR技术广泛应用于各种药用植物病毒病调查及病原鉴定当中，利用非序列依赖性扩增发现柴胡受到黄瓜花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的复合侵染(寇丽莎，2017，病毒学报)；采用RT-PCR方法结合生物学检测和一代测序技术，研究了人参、西洋参、罗汉果、菊花、白术、太子参、宁夏拘祀、薄荷、曼陀罗和牛芬10种药用植物的病毒病发生情况和病毒侵染情况(董佳莉，2018，北京协和医学院研究生院)，为后续大范围开展药用植物病毒病调查提供了技术支持。
但是，目前我国利用mRT-PCR进行半夏三种病毒检测研究较少，为此，本发明开发设计了新的特异引物及其优化扩增体系，用于我国半夏三种病毒的鉴定。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的引物对组，所述引物对组能够用于单一或多重RT-PCR体系，准确、快速地检测半夏侵染病毒，在病毒病防治、良种选育方面具有广泛的应用前景。
本发明的第二个目的是提供一整套在鉴定鉴别半夏病毒病的体系流程，包括引物对组、RT-PCR体系及反应程序。
本发明的第三个目的是提供一种于半夏病毒检测的试剂盒，所述试剂包括前述引物对组。
本发明的第四个目的在于提供一种利用mRT-PCR检测半夏侵染病毒方法，本发明所述方法能够准确、快速地检测侵染病毒种类。
本发明的第五个目的在于提供上述的引物对组、RT-PCR体系及反应程序、试剂盒在半夏病毒病防治及育种中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的引物对组，所述引物对组包括3对引物对中任一一对或其组合，具体如下表所示：
本发明还涉及一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物对组。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括水、PCR缓冲液、dNTPs mix、DNA聚合酶、Mg2+中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，所述DNA聚合酶选自所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段；更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；特别优选地，所述Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。
本发明所述一种利用SSR分子标记技术鉴别紫苏种质资源亲缘关系的方法，包括如下步骤：
1)半夏植株mRNA的提取；
2)mRNA反转录成cDNA；
3)mRT-PCR病毒引物设计和筛选；
4)利用mRT-PCR引物对半夏cDNA进行PCR扩增；
5)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
6)读取谱带，明确侵染病毒种类。
作为本发明的进一步方案，RNA提取的方法为：在田间采取半夏植株较嫩部位的叶片，用液氮充分研磨后用植物RNA提取试剂盒提取RNA，提取过程需要在超净台无菌条件下进行，保持试样处于低温环境，以免降解破坏。提取完成后，检测仪检测浓度，OD260/OD280在2.0左右说明RNA纯度高，质量好，放置于超低温冰箱(-80℃)保存备用。
作为本发明的进一步方案，RNA反转录为cDNA的方法为：利用反转录试剂盒将提取的RNA样品反转录为cDNA，检测仪检测浓度，OD260/OD280在1.8左右说明DNA纯度高，质量好，稀释至100ng/μL放置于冰箱(-20℃)保存备用。
作为本发明的进一步方案，mRT-PCR引物的设计和筛选的方法为：根据NCBI公布的CMV、SMV、DsMV及其他病毒外壳蛋白(Coat Protein，CP)基因序列，初筛NCBI的设计引物，经预扩增最终选取3对条带清晰、可在同一体系中同步扩增的引物。引物长度为20bp，产物长度为分别为CMV 489bp、SMV 376bp、DsMV 271bp。
作为本发明的进一步方案，所述的利用设计引物对半夏DNA进行PCR扩增方法为:通过调整PCR体系中引物浓度、dNTPs mix浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度，研究退火温度及循环数的影响，得出最佳的多重RT-PCR反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，52.9℃退火30s，72℃延伸70s，31个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。
作为本发明的进一步方案，所述的对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测方法为：扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，80W恒功率电泳15min，将凝胶在成像仪中拍照保存。
作为本发明的进一步方案，所述的读取谱带的方法为：在凝胶影像中，观察出现条带数量及大小，条带清晰、明亮、无拖尾带，产物长度为分别为489bp、376bp、271bp左右，说明样品中含有CMV、SMV、DsMV其中一种或多种病毒。
本发明的有益效果：利用mRT-PCR技术对侵染半夏的CMV、SMV、DsMV进行检测，通过提取半夏植株RNA，反转录得到cDNA，利用设计的特异引物进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，根据照胶仪显示条带鉴定侵染病毒种类。本方法技术成熟、方便快捷、特异性高、准确性好、用价低廉，一次性检测侵染半夏的多种病毒，为半夏病毒病防治及良种选育提供重要技术支持。
附图说明
图1为单重与初体系对比图；
图2为引物浓度优化图；
图3为dNTPs mix浓度优化图；
图4为Taq酶浓度优化图；
图5为Mg2+浓度优化图；
图6为退火温度优化图；
图7为循环数优化图；
图8为延伸时间优化图；
图9为引物浓度再优化图；
图10为灵敏度检测图。
具体实施方式
下面的实施例用来对本发明进行说明，而不是限制本发明。
材料：采集自河北安国地区种植的半夏样品，部位为幼嫩茎叶。
试剂：RNA提取试剂盒为康为世纪OminiPlant RNA Kit(DNase I)(全能型植物RNA提取试剂盒)，反转录试剂盒为康为世纪HiFiScript cDNA Synthesis Kit(cDNA第一链合成试剂盒)。
RNA提取
选取安国地区半夏幼嫩上部叶片，用液氮充分研磨后在超净台用试剂盒提取RNA，检测仪检测浓度，OD260/OD280在2.0左右说明RNA纯度高，质量好，放置于超低温冰箱(-80℃)保存备用。
RNA反转录为cDNA
利用反转录试剂盒将提取的RNA样品反转录为cDNA，检测仪检测浓度，OD260/OD280在1.8左右说明DNA纯度高，质量好，稀释至100ng/μL放置于冰箱(-20℃)保存备用。
mRT-PCR引物的设计和筛选
根据NCBI公布的病毒外壳蛋白基因序列，初筛NCBI的设计引物，经预扩增最终选取3对条带清晰、可在同一体系中同步扩增的引物。引物长度为20bp，产物长度为分别为CMV489bp、SMV 376bp、DsMV 271bp。
利用特异引物对半夏DNA进行PCR扩增方法
多重RT-PCR反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，52.9℃退火30s，72℃延伸70s，31个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。
对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
扩增产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，80W恒功率电泳15min，将凝胶在成像仪中拍照保存。
读取谱带
在凝胶影像中，观察出现条带数量及大小，条带清晰、明亮、无拖尾带，产物长度为分别为489bp、376bp、271bp左右，说明样品中含有CMV、SMV、DsMV其中一种或多种病毒。
灵敏度检测
在最优多重RT-PCR反应体系的基础上，与单重RT-PCR体系进行比较，实验证明在CMV水平上多重体系比单重体系灵敏度提高较多，灵敏度达到10-6，特异性强，操作便捷，极大地缩短了检测时间。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (9)
1.一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的引物对组，所述引物对组选自SEQ ID NO:1-14中的一组或多组。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述的引物组具体为
3.权利要求1或2所述的mRT-PCR引物组在检测半夏病毒中的应用。
4.一种用于mRT-PCR检测半夏病毒的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物对组，所含物质及程序如下：
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52.9℃退火30s，72℃延伸70s，31个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。
5.权利要求4所述的一种用于mRT-PCR检测半夏病毒的试剂盒在鉴定半夏侵染病毒中的应用。
6.一种利用mRT-PCR技术检测半夏侵染病毒种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)半夏植株mRNA的提取；
2)mRNA反转录成cDNA；
3)mRT-PCR病毒引物设计和筛选；
4)利用mRT-PCR引物对半夏cDNA进行PCR扩增；
5)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
6)读取谱带，明确侵染病毒种类。
7.一种分离的mRT-PCR标志物，所述的标志物是由权利要求1或2所述的引物扩增获得。
8.权利要求7所述的标志物在半夏病毒病防治及良种选育中的应用。
9.权利要求1或2所述的引物，权利要求4所述的试剂盒在半夏栽培及繁育中的应用。
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| CN116926240A (zh) * | 2023-09-06 | 2023-10-24 | 南昌师范学院 | 一种RT-qPCR检测黄瓜花叶病毒的方法 |
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| CN1600865A (zh) * | 2003-09-23 | 2005-03-30 | 北京金长河科技发展有限公司 | 一种植物病毒检测基因芯片 |
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