CN1600865A - 一种植物病毒检测基因芯片 - Google Patents

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陈集双
杜志游
郎秋蕾
王冲
陈洁云
刘文洪
谷庆琪
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Abstract

本发明涉及一种植物病毒检测基因芯片，更具体地说涉及一种利用基因芯片检测样品中是否含有植物病毒的方法、用于PCR的新的核酸引物以及用于检测PCR产物的探针。所述检测方法能够同时检测待测样品中可能含有的2～122种植物病毒，例如AlMV、CMV、PVA、PVX、PVY、TMV、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和类病毒PSTVd等。

Description

一种植物病毒检测基因芯片
(一)技术领域
本发明涉及一种植物病毒检测基因芯片，更具体地说涉及一种利用基因芯片检测样品中是否含有植物病毒的方法、用于PCR的新的核酸引物以及用于检测PCR产物的探针。
(二)背景技术
植物病毒是一种普遍存在的病害因素，植物病毒侵染给农业带来严重的经济损失同时也是农业可持续发展的瓶颈因素之一。目前，全球每年由植物病毒造成的农作物直接损失为200多亿美元，其中对中国造成高达几百亿人民币的损失，这还不包括地方特有的经济作物、野生和半野生资源型植物，以及为了控制病毒病所做出的努力和代价，也不包括植物病毒引起作物品质下降造成的间接损失。我国的作物种植业、园艺业、药材生产行业也受到植物病毒的严重影响，例如苜蓿花叶病毒(AlMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、PVA(马铃薯A病毒)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯帚顶病毒(PMTV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯V病毒(PVV)、马铃薯M病毒(PVM)和马铃薯纺锥块茎类病毒(PSTVD)以及香蕉束顶病毒(BBTV)、百合无症病毒(LSV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、柑橘裂皮类病毒(CEVD)、苹果茎沟病毒(ASGV)、桃X植原体(PXP)、PVS(马铃薯S病毒)、百合斑驳病毒(LMoV)、芋花叶病毒(DsMV)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、香石竹环斑病毒(CRSV)、椰子死亡类病毒(CCCVd)、李坏死环斑病毒(PNRSV)、南方菜豆花叶病毒(SBMV)、烟草环斑病毒(TRSV)，造成巨大直接经济损失和行业信誉下降。由于缺少可行的快速检测方法，对植物病毒病害控制束手无策；另外在引进国外种子苗木时，只能引进来自非疫区的，从而影响了优质种苗的进口；同时，由于海关检疫，国家口岸检疫缺少必要的技术保障，长期以来，我国在一类、二类外检病毒对象的关键技术上依赖于国外技术标准和检测材料，限制了我国农产品的出口，制约了我国农业的发展。
目前，对于植物病毒控制还未能找到“特效药”。因植物本身没有免疫系统，在植物病毒控制方面基本上不能采用动物病毒相同的诱导免疫和预防接种保护的方法，对于植物病毒的有效控制只能够依赖于防范于未然的检验检疫方法。因此，建立有效地控制植物病毒的手段是当代农业生产的关键措施，其不仅是我国重要的经济作物例如马铃薯和其它农作物高产优质的重要环节，也是维护国家生物安全和可持续农业生产的必要保障。
迄今为止，病毒的检测技术已经历了传统生物学、免疫化学和核酸分子生物学检测三个阶段。目前用于植物病毒检测的方法主要有生物学方法、血清学方法和分子生物学方法等几类。
1)生物学方法  包括目测法和指示植物鉴别法等。该方法是一种传统的病毒检测方法，该方法工作量大，持续时间长，灵敏度和准确度都较差，难以检测大量样本。
2)血清学方法  包括酶联免疫吸附法(ELISA)等多种方法。该方法是目前应用最广的植物病毒检测方法，它能同时处理大量的样品，有很高的灵敏度和特异性。但是，抗体制备难度大，操作要求极高；尤其是不能同时检测单个样品中的多种病毒。
3)分子生物学方法  包括PCR(RT-PCR)法和核酸杂交检测法等，具有极高的灵敏度。然而，PCR扩增容易出现非特异性扩增条带和假阳性，特异性偏低，可靠性较差。核酸杂交检测特异性强，但膜杂交一次处理样品数量较少，手工杂交需要较长的样品处理时间。目前该方法只在研究条件下应用，难以在生产阶段推广。
可见，各种现有植物病毒检测方法都存在缺陷，很难做到既简便快速，又灵敏准确，并且成本低廉地测定大量样本，更不可能做到对同一种样本中的多种病毒同时进行检测，无法满足实际需要，生产上实质上不能对许多危害性严重的植物病毒进行检测。
国际病毒分类与命名委员会(ICTV)迄今确定了900多种植物病毒，一种植物往往遭受数种和数十种病毒的侵染，面对数量如此庞大的植物病毒，人们不得不探索一些高通量的检测方法。基因芯片具有高通量的特性，正好符合这一需要。
基因芯片技术被誉为是具有划时代意义的“革命性技术”。作为一种检测手段，其具有灵敏度高、特异性强和高通量等特性。基因芯片用于检测已有不少理论和应用成果，但主要集中在人类疾病诊断等方面，将基因芯片用于植物病毒检测还未见报道。
本发明发明人认为在解决大量样品检测能力的基础上保持分子检测方法的高灵敏度和高特异性特征将是植物病毒检测领域的重大突破。经过辛苦的科学研究，最终本发明发明人开创性地将基因芯片用于植物病毒的检测，根据植物病毒的特性作出不同现有技术的独特设计，在世界范围内率先将基因芯片的高通量处理能力和技术特点应用到植物病毒检测，并完成了可以快速、高效、高通量地用于检测植物病毒的基因芯片，有效地解决了常规检测方法不能有效解决的类病毒检测问题，成功地弥补了现有检测方法的缺陷。
(三)发明内容
【要解决的问题】
本发明的目的之一是将基因芯片用于植物病毒检测领域，提供一种能够同时检测多种RNA植物病毒和类病毒的高通量检测基因芯片。
本发明的另一个目的是提供用于本发明的植物病毒检测基因芯片的特异性探针。
本发明的再一个目的是提供用于本发明的检测方法的PCR扩增引物。
本发明的还一个目的是提供利用本发明基因芯片检测待测样品中植物病毒的方法。
【技术方案】
本发明提供了一种基因芯片的用途，其特征在于将基因芯片用于同时检测至少2种植物病毒，优选地检测2～122种植物病毒，最优选地检测7-26种病毒。
本发明的基因芯片优选地可以用于以下122种病毒的检测：苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AlMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato Y virus，PVY)、马铃薯A病毒(potato A virus，PVA)、马铃薯X病毒(Potato X virus，PVX)、马铃薯帚顶病毒(Potato mop-top virus，PMTV)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)、马铃薯V病毒(Potato V virus，PVV)、马铃薯M病毒(Potato M virus，PVM)、马铃薯纺锥块茎类病毒(Potatospindle tuber viroid，PSTVd)、香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortisviroid，CEVd)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)、马铃薯S病毒(Potato A virus，PVS)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LiMoV)、芋花叶病毒(Dasheen masaic virus，DsMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelonmosaic virus，WMV)、香石竹环斑病毒(Camation ring spot virus，CRSV)、椰子死亡类病毒(Coconut cadang-cadang viroid，CCCVd)、李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)、南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)、芹菜黄花叶病毒(Celery yellowmosaic virus，CeYMV)、茼麻黄化病毒(Abutilon mosaic virus，AbYV)、鸭跖草花叶病毒(Commelina mosaic virus，ComMV)、苋叶斑驳病毒(Amaranthus mosaic virus，AmLMV)，豇豆绿脉带病毒(Cowpeagreen vein-banding virus，CGVBV)、三叶草黄花叶病毒(Clover yellowmosaic virus，ClYMV)、豇豆摩洛哥蚜传花叶病毒(Cowoea Moroccanaphid-borne mosaic virus，CMABMV)、冰草花叶病毒(Agropyronmosaic virus，AgMV)、菊芋潜病毒(Artichoke latent virus，ArLV)、豇豆皱缩花叶病毒(Cowpea rugose mosaic virus，CpRMV)、天冬门1号病毒(Asparagus 1 virus，AV-1)、文殊兰花叶病毒(Crinum mosaicvirus，CriMV)、大麦轻型花叶病毒(Barley mild mosaic virus，BaMMV)、瑞香Y病毒(Daphne Y virus，DVY)、大麦花叶病毒(Barleyyellow mosaic virus，BaYMV)、大麦轻型斑驳病毒(Barley  mildmottle virus，BaMMoV)、曼陀罗扭曲花叶病毒(Datura distottionmosaic virus，DDMV)、香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus，BBrMV)、曼陀罗坏死病毒(Datura necrosis virus，DNV)、菜豆普通花叶坏死病毒(Bean common mosaic necrosis virus，BCMNV)、曼陀罗鞋带病毒(Datura shoestring virus，DSTV)、菜豆普通花叶病毒(Beancommon mosaic virus，BCMV)、山蚂蟥花叶病毒(Desmodium mosaicvirus，DesMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus，BtMV)、参薯病毒(Dioscorea alata virus，DAV)、鬼针草花叶病毒(Bidens mosaic virus，BiMV)、薯蓣绿带花叶病毒(Dioscorea green banding mosaic virus，DGBMV)、鬼针草斑驳病毒(Bidens mottle virus，BioMoV)、茄绿花病毒(Eggplant green mosaic virus，EGMV)、豆蔻花叶病毒(Cardamonmosaic virus，CdMV)、香雪兰花叶病毒(freesia mosaic virus，FreMV)、香石竹脉斑驳病毒(Carnation vein mottle virus，CVMV)、花生眼斑病毒(Groundnut eyespot virus，GEV)、胡萝卜细叶病毒(Carrot thinleaf virus，CTLV)、瓜尔豆无症病毒(Guar symptomless virus，GSLV)、木薯褐色线条病毒(Cassava brown streak virus，CBSV)、大黍花叶病毒(Guinea grass mosaic virus，GGMV)、决明黄点病毒(Cassia yellowspot virus，CasYSV)、堆心菊Y病毒(Helenium Y virus，HVY)、芹菜花叶病毒(Celery mosaic virus，CeMV)、天仙子花叶病毒(Henbanemosaic virus，HMV)、鹰嘴豆丛矮病毒(Chickpea bushy dwarf virus，CpBDV)、朱顶红花叶病毒(Hippeastrum mosaic virus，HiMV)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus，ClYVV)、风信子花叶病毒(Hyacinth mosaic virus，HyaMV)、哥伦比亚曼陀罗病毒(ColombianDatura virus，CDV)、印度辣椒斑驳病毒(Indian pepper mottle virus，IPMV)、暗黄鸢尾花叶病毒(Iris fulva mosaic virus，IFMV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)、鸢尾轻型花叶病毒(Iris mild mosaic virus，IMMV)、烟草脉斑驳病毒(Tobaccovein mottling virus，TVMV)、鸢尾重型花叶病毒(Iris severe mosaicvirus，ISMV)、烟草萎蔫病毒(Tobacco wilt virus，TWV)、石茅高梁花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、秘鲁番茄病毒(Tomato Peru virus，ToPV)、肯尼迪豆病毒(Kennedya Y virus，KVY)、紫露草一吊竹梅病毒(Tradescantia-Zebrina virus，TZV)、韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus，LYSV)、栝楼斑驳病毒(Trichosanthesmottle virus，TrMV)、莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)、三叶草花叶病毒(Trifolium mountanum mosaic virus，TmMV)、旱金莲1号病毒(Tropaeolum 1 virus，TV-1)、玉米矮花叶病毒(Maize dwarfmosaic virus，MDMV)、旱金莲2号病毒(Tropaeolum 2 virus，TV-2)、锦葵脉明病毒(Malva vein clwaring virus，MVCV)、晚香玉病毒(tuberose virus，TuV)、万寿菊斑驳病毒(Marigold mottle virus，MaMoV)、郁金香带状碎色病毒(Tulip band-breaking virus，TBBV)、水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)、郁金香碎色病毒(Tulip breaking virus，TBV)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)、郁金香褪绿斑病毒(Tulip chlorotic blotch virus，TCBV)、商路花叶病毒(Pokeweek mosaic virus，PkMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaicvirus，TuMV)、块根落葵花叶病毒(Ullucus mosaic virus，UMV)、石蒜花叶病毒(Vallota mosaic virus，ValMV)、香果兰花叶病毒(Vanilla mosaic virus，VanMV)、报春花花叶病毒(Primula mosaicvirus，PrMV)、沃安齐贾扭曲花叶病毒(Voandzeia distortion mosaicvirus，VDMV)、毛莨斑驳病毒(Ranunculus mottle virus，RanMV)、西瓜花叶1号病毒(Watermelon mosaic 1 virus，WMV-1)、高梁花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)、西瓜花叶2号病毒(Watermelonmosaic 2 virus，WMV-2)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、野马铃薯花叶病毒(Wild potato mosaic virus，WPMV)、补血草Y病毒(Statice Y virus，SVY)、紫藤脉花叶病毒(Wisteria vein mosaic virus，WVMV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、薯蓣花叶病毒(Yam mosaic virus，YMV)、甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potatofeathery mottle virus，SPFMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus，ZYMV)、甘薯G病毒(Sweet potato g virus，SPVG)、树番茄花叶病毒(Tamarillo mosaic virus，TamMV)、发藤葫芦花叶病毒(Telfairia mosaic virus，TeMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)
本发明的基因芯片更优选地可以用于以下26种病毒的检测：苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AlMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、马铃薯Y病毒(Potato Y virus，PVY)、马铃薯A病毒(potato A virus，PVA)、马铃薯X病毒(Potato X virus，PVX)、马铃薯帚顶病毒(Potato mop-top virus，PMTV)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、马铃薯V病毒(Potato V virus，PVV)、马铃薯M病毒(Potato M virus，PVM)和马铃薯纺锥块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)以及香蕉束顶病毒(Bananabunchy top virus，BBTV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)、苹果茎沟病毒(Apple stem groovingvirus，ASGV)、桃潜隐花叶类病毒Peach latent mosaic viroid(PLMVd)、马铃薯S病毒(Potato Avirus，PVS)、百合斑驳病毒(Lilymottle virus，LiMoV)、芋花叶病毒(Dasheen masaic virus，DsMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)、香石竹环斑病毒(Carnationring spot virus，CRSV)、椰子死亡类病毒(Coconut cadang-cadangviroid，CCCVd)、李坏死环斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)、南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)。
本发明的基因芯片包含基质和至少2种植物病毒的特异性探针。优选地，本发明的基因芯片还包含阴性对照。所说的阴性对照是用不含病毒特异性探针的空白点样液在芯片基质上点样制备的。
本发明的基因芯片一般分为1-12个区，每个区分为1-6个亚区。优选地，本发明的基因芯片分为两个区，每个区分为三个亚区。
本发明的基因芯片基质选自玻片、硅片、金属片和膜，优选地为玻片。
本发明通过测序获得的例如包括上述RNA病毒和类病毒等在内的植物病毒的基因组核苷酸序列，尤其是3`端序列，进行保守序列分析，从而对每种病毒设计相应的1对引物和2-5条特异性探针来制备完成本发明的基因芯片，另外本发明还可通过所设计的3’末端扩增引物和通用引物以及相应的探针制备完成本发明的基因芯片。
本发明提供了用于本发明的植物病毒检测基因芯片的特异性探针，这些探针选自根据包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和类病毒PSTVD的组的植物病毒的基因组核苷酸序列进行保守性序列分析而设计的探针；优选地选自根据包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和类病毒PSTVD的组的植物病毒的基因组核苷酸序列进行保守性序列分析而设计的探针。
其中针对AlMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.58或SEQ IDNO.59的核苷酸序列、针对CMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61的核苷酸序列、针对PLRV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63的核苷酸序列、针对PSTVD的特异性探针分别具有SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65的核苷酸序列、针对PVA的特异性探针分别具有SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67的核苷酸序列、针对PVM的特异性探针分别具有SEQ ID NO.68或SEQ ID NO.69的核苷酸序列、针对PVY的特异性探针分别具有SEQ ID NO.70或SEQ ID NO.71的核苷酸序列、针对PXV1的特异性探针分别具有SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73的核苷酸序列、针对PXV2的特异性探针分别具有SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.75的核苷酸序列、针对TMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.76或SEQID NO.77的核苷酸序列、针对BBTV的特异性探针分别具有SEQ IDNO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80的核苷酸序列、针对LSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.81或SEQ ID NO.82的核苷酸序列、针对SqMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84的核苷酸序列、针对CEDV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86的核苷酸序列、针对ASGV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90的核苷酸序列、针对PXP的特异性探针分别具有SEQ ID NO.91、SEQID NO.92、SEQ ID NO.93或SEQ ID NO.94的核苷酸序列、针对PVS的特异性探针分别具有SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96的核苷酸序列、针对LMoV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98的核苷酸序列、针对DsMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100的核苷酸序列、针对ZYMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102的核苷酸序列、针对WMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104的核苷酸序列、针对CRSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108或SEQ ID NO.109的核苷酸序列、针对CCCDV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.110、SEQ IDNO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113的核苷酸序列、针对PNRSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116的核苷酸序列、针对SBMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119的核苷酸序列、针对TRSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123的核苷酸序列。
本发明提供了一种高通量检测待测样品中的植物病毒的方法，该方法包括步骤：
7)取样：取植物材料组培苗或取茎叶组织；
8)样品总RNA抽提：用常规方法抽提样品总RNA；
9)RT-标记PCR：取总RNA作为第一链cDNA合成的模板，按常规RT方法合成第一链cDNA片段，以反转录合成的第一链cDNA为模板进行Cy5标记PCR，反应体系如下：
        ddH2O
        10×PCR buffer
        d(ATG)TP
        DCT
        Cy5-dCTP
        Primer L & R
        模板
        Taq聚合酶
10)杂交：用无水乙醇沉淀标记PCR产物，加杂交液，变性，置于冰上放置一段时间，然后将杂交液滴于权利要求4～12之一基因芯片的点样区进行杂交，盖上盖玻片，转移芯片于杂交舱；
11)芯片扫描与图片处理；
12)数据分析，判断样品中植物病毒的存在。
用于以上方法的PCR扩增引物包括针对AlMV的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、针对CMV的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、针对PLRV的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、针对PSTVD的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对PVA的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对PVM的引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、针对PVY的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、针对PXV1的引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、针对PXV2的引物SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18、针对TMV的引物SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20、针对BBTV的引物SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、针对LSV的引物SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对SqMV的引物SEQID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27、针对CEDV的引物SEQID NO.28和SEQ ID NO.29、针对ASGV的引物SEQ ID NO.30、SEQID NO.31和SEQ ID NO.32、针对PXP的引物SEQ ID NO.33、SEQID NO.34和SEQ ID NO.35、针对PVS的引物SEQ ID NO.36和SEQID NO.37、针对LMoV的引物SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39、针对DsMV的引物SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41、针对ZYMV的引物SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、针对WMV的引物SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45、针对CRSV的引物SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、针对CCCDV的引物SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50、针对PNRSV的引物SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、针对SBMV的引物SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55、针对TRSV的引物SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57。
在本发明的方法中，PCR反应可以采用随机引物和3`末端扩增引物。其中所说的随机引物为Takara Biotechnology或Nonadeoxyribonucleotide mixture。其中所说的PCR反应采用35个循环，72℃延伸反应10min。另外，在所述方法中，优选地用无水乙醇沉淀标记的PCR产物，加杂交液，94℃变性3min。
【有益效果】
本发明的基因芯片具有高度的检测特异性，检出率可高达100％，不出现假阳性和假阴性反应，一次杂交可检测2种以上，最多达122种待检病毒，且不同的检测对象病毒之间不出现相互干扰，能够适应高通量检测的要求。利用该芯片可以在数小时内完成对待检样品中多种病毒的杂交检测，所需要的植物组织极少，一般仅需0.2g组织，利用本发明的基因芯片还能够检测常规方法不能检测的危险性病毒和类病毒。如PSTVd，因为其没有蛋白质，不能用常规ELISA方法进行检测，采用本发明的基因芯片方法能够进行有效检测。另外，基因芯片结果的分析更容易与计算机图像处理和定量分析软件结合，对试验检测结果的输出进行规范化。另外在保证高通量检测的条件下，检测的灵敏度大大高于核酸杂交和常规ELISA方法。
以下是本发明的方法与目前用于植物病毒检测最普遍采用的ELISA法的比较(以检测15种病毒为例进行比较)。
性能指标 本发明方法 ELISA法
一次操作检测的病毒种类 15种 1种
单个病毒检测成本(3个重复) 约5.7元人民币 约19元人民币
检测15种病毒100次耗时 约4天 约20天
检测15种病毒所需样品 0.2g 30g以上
能否检测类病毒 能够 不能
检测灵敏度 后者的100倍以上 较高
对国外抗体和试剂盒的依赖 可以自主生产 一般需要进口
从上表不难看出，本发明的方法较之于ELISA法具有众多的优点，不仅每次操作所检测的病毒种类是前者的15倍，大量病毒检测时的单个病毒检测成本只是后者的30％，检测耗时只是前者的20％，所需样品只有前者的1/150，而且能够检测前者所不能检测的类病毒，提高检测重复性和灵敏度。
(四)附图说明
本说明书包括八幅附图，其中：
附图1是本发明的芯片点样区示意图，其中附图标记1所示为基因芯片点样区的亚区；
附图2是本发明的芯片亚区点样方案图；
附图3图示基因芯片分别检测七种病毒的亚区扫描结果；
附图4图示七种病毒多重标记PCR产物杂交检测结果；
附图5图示健康对照多重标记PCR产物杂交检测结果；
附图6-1图示ELISA灵敏度检测结果；
附图6-2图示NASH灵敏度检测结果；
附图6-3图示基因芯片灵敏度检测结果。
(五)具体实施方式
本发明的基因芯片可以通过下列步骤来制备：首先通过国际上共享数据库公开的和实验室自己测序获得的植物病毒的基因组核苷酸序列，尤其是3′端序列，进行保守序列分析，从而对每个病毒设计1对引物和2-5条探针，其中的植物病毒选自包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和类病毒PSTVD的组；将合成好的探针，按所给浓度，稀释成特定浓度为的点样液；然后，根据点样的数量取一定体积的点样液于384孔板中，用进行点样，各条探针重复点样；点样完毕之后，干燥环境放置一段时间，之后用SDS摇洗，再用双蒸水摇洗，最后室温凉干。制备好的芯片放于玻片盒中于4℃冰箱保存备用。
本发明通过对上述植物RNA病毒或类病毒的基因组核苷酸序列进行保守性序列分析，最终确定针对部分病毒或类病毒的引物和探针及其Tm，见下表：
             各病毒对应的引物序列(5’-3’)
    病毒名称  引物序列(5’-3’)     Seq NO     Tm
    AlMV  GTTCGGGTTTGAGTTGGTCTTCCAAACTTCGTTGAATCGGTATGAG     12     60.360.9
    CMV  TGTGGGTGACAGTCCGTAAAGAGATGTGGGAATGCGTTGGT     34     58.259.0
    PLRV  CCACTCCAACTCCCCAGAAGTACATAGGGACGGCTTGCAT     56     61.9960.49
    PSTVD  GGGAAACCTGGAGCGAACTGCGAGGAAGGACACCCGAAGA     78     61.862.2
    PVA  TTTCTATGAGATCACTGCAACCACTTGACATTTCCGTCCAGTCCAA     910     60.160.9
    PVM  GCACTTCGCAAGAAA(GA)GAGAGACCTTGG(CT)CTGCCAGTCTCTAAC     1112     60.8-61.058.3-62.9
    PVY  AAATACTCG(GA)GCAACTCAATCACACCATCCATCATAACCCAAACTCC     1314     58.8-62.962.2
    PVX1  AACTGGCAAGCACAAGGTTTCACAGTTTGGGCAGCATTCATTTC     1516     64.1663.91
    PVX2  AGCAACCAAGAAAGCAACTTCCGCCTAACTGTGCCATTGATGAG     1718     61.9791.93
    TMV  GCGAGTGGAACTTGCCTGACGGGAACGACCTTGAACTGAAA     1920     63.2961.39
    BBTV  TGAGAAACGAAAGGG(AG)AGCCGGTTCATA(TC)TTCCCGCTTTG     2122     59.4-61.657.4-57.5
    LSV  GCTGATTGGCAAGCTATGGGGATTTCAGCTCCTTGTACCCCAC     2324     60.661.8
    SqMV  TGGTGTAGTTGTGCCAGGTGCTGCTGCTCCTGTTATGCCACTGGGGACACCCATCCTTCTGA     252627     61.560.761.6
    CEVD  TTCTTGAGGTTCCTGTGGTGCCCAGCAGCGAAAGAAGG     2829     59.958.9
    ASGV  TTATTGGGCGTAAAGGGTGTGTTGTTTGCTCCCCACGCTTTCATCGTTTACGGCGTGGACTA     303132     61.361.361.2
    PXP  GCGGCTTGCTGGGTCTTTACACCTGTTTCCTGATGACCTCATGCTGGCAACTAACGACAAG     333435     61.258.658.1
    PVS  ACCAGATCCGACAAGCTCAGGGCCATTTGCTC(GA)GTGTTCG     3637     61.460.1-62.1
    LmoV  TGGGACAGAGCGGTGGAACAGTGTCTCATTTGCCTG(GA)AACG     3839     61.660.8-62.6
    DsMV  GGGCTTGGGTGATGATGGAGCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG     4041     60.960.1
    ZYMV  CCAACGCTGCG(AG)CAAATAATGTGCCGTTCAGTGTCTTCGC     4243     60.6-62.660.1
    WMV  TGATGGATGG(GA)GAAGAGCAAG     44     60.6-62.2
 CAGTATTTTCGGAATTGGTCGA     45     59.6
    CRSV  TAAACCCCACGACGTTCCGTCGATGACGCCACAACACGGGAAGCAGGGTCGGCAAAG     464748     61.461.562.8
    CCCDV  CAAGCGAATCTGGGAAGGAGGGGCTACAAAGGGACAC     4950     5656.3
    PNRSV  AAGACCAC(CT)  TGGACCGTGAGGTCCTCCACCATCCCAATCC     5152     62.4-64.560.9
    SBMV  ATGATGGATGGAGA(GA)GAACAGATTGTGCCTTTCAGTATTTTTCGGAGTTTGTTTTGATTCACATC(CT)CTTGC     535455     58.8-60.861.355.5-60.1
    TRSV  TCAAGT(GA)ACGATGGCTGCTGCCAGACCACCCAAGATTCCTA     5657     60.4-62.459
注：S为正向引物；A为反向引物
表2：各病毒对应的探针序列(5’-3’)
 病毒名称 针  探针序列(5’-3’) eq.NO     Tm
 AlMV   P1P2  TATGCCGTAGCCCT(CT)TGTTTGGACTTCCCT(CT)TG(CT)TGGACTTCGA(CT)GC(GT)C(AT)GCCTGAGGGATCTAA     5859     69.8-69.981.5-86.9
 CMV   P1P2  ACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTATTGTATTCAAAAGACGATGCGCTCGAGACGGA     6061     69.375.6
 PLRV   P1P2  GAGCGATTTATTGCTTACGTTGGCATACCAGGGAGAACGACGACCAAATTTCATATTG     6263     70.369.8
 PSTVD   P1P2  A(AT)AAGGACGGTGGGAGTGCCCAGGAGTAATTCCCGCCGAAACAG     6465     64.8-6768
 PVA   P1P2  G(AG)TCAGAGCCAA(AG)GAGGCGCATAGC(AT)GCGCTGAAGAATTCGAACACTAA     6667     65.5-69.468.9
 PVM   P1P2  GGGAAGGACACATCGGAGAACACTCTGATGGAGA(AG)ATGTCATTGGAGCG     6869     65.566.9-67.0
 PVY   P1P2  TACGACATAGGAGAAACTGA(AG)ATGCCAACTGGGAGTTTGGGTTATGATGGATGG     7071     69.6-70.267.76
 PVX1   P1P2  GCACAAATTCGCTGCATTCGACTTCAACCCAGCTGCCATCATGCCCAA     7273     69.872.2
 PVX2   P1P2  GAGTTCCTGAGTAAGAGAGACATTGGAGATGTCTTTCTCACAGGAGGTGTGGGAGGC     7475     67.669.3
 TMV   P1P2  AATTGCAGAGGAGGTGTGAGCGTGAAAAGGATGGAAAGAGCCGACGAG     7677     67.567.71
 BBTV   P1P2P3  GGTCCCTTCGAGTTTGGTGC(AC)TTTAAATGCCATTT(CT)ATATTCCCGGGCAGTTATGTCTAGGAG(TA)TGAATAAAACGAAGGCGATGAATAGC     787980     69.8-70.870.6-71.967.0-69.1
 LSV   P1P2  TAGGTCTAACCGCAATGA(AG)CGTCTGGGTGTCAAA(AG)GCTGCGAACCGCGTGTTG     8182     69.7-67.875.9-77.5
 SqMV   P1P2  ACAGTGGCATAACAGGAGCAGCAGACATAAGCCTT(AG)GTTCTGCCAGCACCT     8384     67.266.6-70.7
 CEVD   P1P2  GGATCACTGGCGTCCAGCGGAGATCTCCGCTGGACGCCAGTGATC     8586     72.269.1
 ASGV   P1P2P3P4  TGGGTCTTAACTGACGCTGAGGCACGGCTTTCGTGCCTCAGCGTCAGTTAATTTGACTAGAGTTGGATAGAGGCAAGTGGAATACCTTCCACTTGCCTCTATCCAACTCTAGTCAAACA     87888990     72.368.972.171.6
 PXP   P1P2P3P4  AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATAATGGAGGTCATCAGGAAAACAGGTGGTATAACTTCGCAAGAAAATGTCAAGACCTGG     91929394     73.272.970.369.4
 PVS   P1P2  CCGACCCCTGA(AG)ATGCGGAGGAATCATGTTGCTCAATGTTGA(AG)TTGTGCCT     9596     74.2-75.966.1-66.2
 LMoV   P1P2  GCTCTTCGTGCGCTGTACACTGGTGAGCGGGTATCCCCACGCCTCAATCAT     9798     71.574.4
 DsMV   P1P2  GCATCACTTTTCTGACGCAGCAGAGGGCATTATCTGACGCAAGGTGGGTTT     99100     70.467.6
 ZYMV   P1P2  GGTTGTTTGGCCTTGATGGAAATGTTGCATGTATGGTGCCTCTGCATTTCTCAT     101102     68.470.5
 WMV   P1P2  CAAGAGAAGCAATAGCACAAATGAAGGCCCTCAACTTGCTCTTC(CT)CCATCCATCA     103104     70.666.0-69.5
 CRSV   P1P2P3P4P5  GAAACGCATGTATGCAGCAGGAGGCGAGGACGAACCTATTGTGGAGTGAAGTTGAAGTGACGATGTCTGGAGGTTTGTAAGGGATACCTCAGTTCCCGTAGCCGCCAACAAAGGCTGGTGCCTAAACAGCGTCAGAACCT     105106107108109     70.971.672.372.171.8
 CCCDV   P1P2P3P4  GGGAGACTACCCGGTGGATACAACTTATCCACCGGGTAGTCTCCCAAGCGCGAATCTGGGAAGGGAGCGTACTTCCCAGATTCGCTTGA(GC)GTTTCC     110111112113     65.967.568.167.7-68.5
 PNRSV   P1P2P3  TCCCTCAGTTGATGGGTCA(GA)AATTTGACCTTAGGAATTCGGGGAGGCACATTCACCGAGAGGTGACGACGACAGAGG     114115116     67.8-69.069.671.0
 SBMV   P1P2P3  ACACCAAACAGGGCAAGGGA(AG)GCAATATTCAT(CT)TGCGCTATTGCTTCCCTTGCGG(GA)AACATCTCAACCAACTCCGAAAATACTG     117118119     71.7-73.371.4-71.570.5-72.0
 TRSV   P1P2P3P4  ATTTTGGAGGTCCCGTTAAGCATTCTAGGGTCAACCTCCATGTTGTCCATATCTTATACATGGGGCCCGTCATTGATCGTTTTGGCCATTT(CT)ATATTCCCGGGCAGTTATGTCTAG     120121122123     6768.975.867.2-68.5
在制备所需要的PCR标记产物的过程中，针对每一种RNA病毒或类病毒，首先采取3`末端扩增引物进行cDNA第一链的合成，在进行PCR扩增时采用一组随机引物进行PCR扩增，也即用一组随机引物代替样品中所有病毒的5`末端扩增引物进行PCR扩增，所述的引物可以为商业化的分子克隆试剂商提供的PCR扩增随机引物，其通常包括9～12个核苷酸，例如Takara Biotechnology(Dalian)Co.Ltd(宝生物工程(大连)有限公司或Nonadeoxyribonucleotide mixture；pd(N)9九个核苷酸的随机引物商品编号(Takara Code NO.D3802)；也可以是人工合成的随机排列的四种脱氧核苷酸的杂合体。这种PCR扩增不需要针对所有的可能含有的病毒进行添加PCR上游引物，且能够扩增所需要的PCR标记产物。
其中被怀疑感染待测植物病毒的样品一般需要的取样量较小，优选取0.2g；进行PCR扩增反应时一般为35个循环，72℃延伸反应10min。进行芯片扫描时可以将芯片插入GMS 418TM扫描仪中进行扫描，扫描的强度为80％。扫描的结果以Tiff格式保存。利用Arrayscan软件将Tiff格式文件转换成bmp格式文件，最后利用图片处理软件如ACDSee或画图程序将bmp格式文件转换成JPG格式文件。
以下以实施例进一步描述本发明。这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1：芯片的制备
通过国际上共享数据库公开的和实验室自己测序获得的AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和类病毒PSTVD的基因组核苷酸序列，尤其是3′端序列，进行保守序列分析，从而针对每个病毒设计探针2～5条，并合成所述的DNA。将合成好的探针，按所给浓度，稀释成浓度为10μM的点样液40μl。依据亚区点样方案图进行加样排版，点样方案见附图1和2。根据点样的数量取一定体积的点样液于384孔板中，用Cartesian Pixsys 7500点样仪进行点样，各条探针重复点样5次，点间距为500μm。点样完毕之后，干燥环境放置30min，之后用0.2％SDS摇洗5min，再用双蒸水摇洗2次，每次5min，最后室温凉干。制备好的芯片放于玻片盒中于4℃冰箱保存备用。其中每张玻片分两个区，每个区分三个亚区。
实施例2：利用基因芯片检测植物病毒
1.取样：取马铃薯种薯薯块催芽萌发后在温室隔离条件下种植的茎叶组织。
2.样品总RNA抽提：取0.2g样品，用常规方法提其总RNA，作为RT-PCR模板。
3.RT-标记PCR：取5μl总RNA(约50ng/μl)作为第一链cDNA合成的模板，按常规RT方法合成第一链cDNA片段。以反转录合成的第一链cDNA为模板进行Cy5标记PCR，反应体系为：
  ddH2O     34.5μl
  10×PCRbuffer     5.0μl
  d(ATG)TP(10mM)     1.0μl
  dCTP(1mM)     1.0μl
  Cy5-dCTP(1mM)     1.0μl
  Primer L & R(5μM)     3.0μl
  模板     4.0μl
  Taq聚合酶     0.5μl
  总体积     50.0μl
将反应混合物经低速离心混匀，进行PCR扩增，扩增反应为35循环，72℃延伸反应10min。取8μl进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
4.杂交：用无水乙醇沉淀标记PCR产物，加14μl杂交液(含与定位探针互补的靶片段)，94℃变性3min，立即置于冰上，放置5min。将杂交液滴于芯片的点样区，盖上盖玻片，转移芯片于杂交舱。杂交需在暗室中操作。
5.芯片扫描与图片处理：将芯片插入GMS 418TM扫描仪中进行扫描，扫描的强度为80％。扫描的结果以Tiff格式保存。利用Arrayscan软件将Tiff格式文件转换成bmp格式文件，最后利用图片处理软件如ACDSee或画图程序将bmp格式文件转换成JPG格式文件。
6.数据处理：判断是否存在植物病毒。
其中基因芯片检测设置2个制样重复。
实施例3：利用随机引物进行基因芯片检测植物病毒
待测样品的总RNA抽提同实施例2，取5μl总RNA(约50ng/μl)作为第一链cDNA合成的模板，按常规RT方法合成第一链cDNA片段。将cDNA进行乙醇沉淀回收，在PCR反应体系中用含有9个核苷酸的随机引物(Takara Code NO.D3802)进行PCR条件下的Cy5标记，然后进行芯片杂交和检测，反应的条件同实施例2，其中基因芯片检测设置2个制样重复。结果，阳性率为100％。
实施例4：单个病毒杂交检测
本发明所用已知植物病毒和类病毒AlMV(苜蓿花叶病毒)、CMV(黄瓜花叶病毒)、PVY(马铃薯Y病毒)、PVA(马铃薯A病毒)、PVX(马铃薯X病毒)、TMV(马铃薯V病毒)和PSTVD(马铃薯纺锥块茎类病毒)由国家质量检验检疫总局动植物检疫研究所、中国科学院微生物研究所和Dr.Noemi Cerovska(Institute of ExperimentalBotany in Prague，IEB CAS.Na Karlovce la，160 00 Prague 6，CzechRepublic)提供。
从用已知的标准病毒感染的马铃薯组织样品中中抽提RNA样品，经过单一病毒引物进行cDNA合成、PCR扩增标记后进行芯片杂交检测。7种植物RNA病毒在50℃杂交条件下，检测的具体步骤同实
施例2，检测到的亚区杂交结果如附图3所示。
杂交结果表明CMV、PVA二者的两条探针在50℃杂交，其中一条出现阳性杂交信号，PVX、PVY、TMV三者的两条探针在50℃杂交，每个病毒的两条探针均出现阳性杂交，而PSTVd和AlMV二者的四条探针在50℃杂交，分别两条和三条探针出现阳性杂交信号。同时也看出，病毒相互间没有出现交叉杂交，三个亚区具有相当高的重复性。本实验是以健康马铃薯作为阴性对照，七种病毒杂交结果均无杂交信号。
实施例5：7种病毒多重PCR检测
为了进一步检测所制备的芯片对混合感染材料进行病毒检测的效率，将7种病毒同时接种在烟草和马铃薯上，抽提总RNA作为合成cDNA第一链的模板，用这7种病毒的混合下游引物，在SuperScriptII作用下，置于45℃水浴中50min，75℃退火15min。取4μl RT产物做多重标记PCR扩增，反应体系为50μl。七种病毒多重标记PCR产物在50℃与芯片进行杂交，杂交检测结果如附图4、5所示。
多重PCR产物杂交结果表明：通过一次PCR扩增和一次杂交，可以同时对7种病毒进行有效检测。杂交结果同单个病毒检测结果相比，除了PVA之外(两条探针都出现阳性信号)，其它6种病毒杂交检测结果基本相同。这说明了通过对7种病毒的多重PCR条件优化，达到了高通量检测的目的，同时也看出在相同的反应条件下健康对照未出现杂交信号，保证了检测结果的可靠性。
比较实施例1：基因芯片、ELISA和NASH三者检测灵敏度比较
准确称取0.6克接种CMV(1NA分离物)15天的烟叶，在液氮磨成碎片，然后等分成3份，将研磨样品浸于液氮中保存，分别用于ELISA、NASH和芯片检测实验。其中三者实验均选定了101、102、103、104、105、106、107、108这8个稀释梯度用于灵敏度检测。实验另加阴性对照，三者灵敏度检测结果见图6-1、6-2、6-3。
结果表明用ELISA试剂盒按常规的DAS-ELISA检测的方法只可以在104稀释倍数下检测到，阴性对照没有出现阳性反应。
NASH灵敏度检测的结果表明按常规的RNA点杂交方法只可以在104稀释倍数下检测到，与ELISA检测的灵敏度相差不大。且其阴性对照亦无出现杂交信号。
从芯片灵敏度检测实验可以看出，在常规植物叶组织作为检测对象时，可以在108稀释倍数下检测到，阴性对照亦不出现杂交信号，亚区间有相当高的重复性。
比较三者实验结果不难看出，ELISA和NASH二者均只可以在104稀释倍数下检测到待检对象，而本发明的基因芯片则可以在108稀释倍数下检测到待检对象，因此，本发明的芯片法比ELISA和NASH的灵敏度高104倍。
比较实施例2：基因芯片法和ELISA法检测植物病毒的比较
供试材料：脱毒马铃薯种薯组培苗、原原种、原种和生产种，从当地市场上购买的销售马铃薯。
种植方式：薯块萌发后，在温室隔离条件下种植，试管苗直接检测。
病毒观察：通过症状观察，确定感病株，通过芯片检测AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM和PSTVD。
阳性对照：接种侵染已知病毒的马铃薯植株，10种病毒和类病毒分别在2株植株上保存。阳性病毒为：AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM和PSTVD。按照待检样品完全相同的处理方法进行检测。阴性对照：经过种子繁殖、未接种病毒的烟草植株或经反复检测证明不携带病毒的组培苗。
基因芯片检测：步骤同实施例2。
ELISA检测：ELISA试剂盒：购自美国Advanced Diagnostics Int′l，LLC(ADI，LLC)公司。分别检测以下病毒：AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM。参照试剂盒说明进行检测；分别用已知病毒作为阳性对照。ELISA检测设置2个制样重复，每次制样设置3个点样重复，对于不确定的检测材料进行植株继续培养，重复ELISA检测。
对组培苗、原原种、生产种和销售马铃薯分别用基因芯片检测和ELISA方法进行检测的结果如下表所示。
马铃薯繁殖材料用本发明的芯片和ELISA试剂盒检测结果
样品 TMV PVY PSTVd CMV PVX PLRV PVA PVM PMTV AlMV
芯片检测
马铃薯1 + + + + - - - - - -
马铃薯2 + + - + + - - - - -
组培苗1 - - - - - - - - - -
组培苗2 - - - - - - - - - -
原原种1 - - - - - - - - - -
原原种2 - - - - - - - - - -
原原种3 - - - - - - - - - -
原原种4 - - - - - - - - - -
生产种 - - - - + - - - - -
阳性对照 + + + + + + + + + +
ELISA检测
马铃薯1 + + + (+) - - - - - -
马铃薯2 + + - (+) (+) - - - - -
组培苗1 - - - - - - - - - -
组培苗2 - - - - - - - - - -
原原种1 - - - - - - - - - -
原原种2 - - - - - - - - - -
原原种3 - - - - - - - - - -
原原种4 - - - - - - - - - -
生产种 - - - - (+) - - - - -
阳性对照 + + + + + + + + + +
注：马铃薯1和马铃薯2为市场购得马铃薯；原原种1为雾培14：1-11原原种；原原种2为雾培8：1-5原原种；原原种3为雾培9：2-18原原种；原原种4为XS2-16原原种。
由此可见，本发明的植物病毒检测芯片能够有效进行植物材料中病毒的检测，与国外ELISA试剂盒比较，其病毒的检出率为100％，另外，其能够同时检测出ELISA方法不能检测的类病毒病原体，具有高通量检测、有效缩短检测时间和样品需要量的优点。
                            序列表
<110>北京金长河科技发展有限公司
<120>一种植物病毒检测基因芯片
<160>123
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>1
gttcgggttt gagttggtct tc                               22
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>2
caaacttcgt tgaatcggta tgag                             24
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>3
tgtgggtgac agtccgtaaa g                                21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>4
agatgtggga atgcgttggt                                  20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>5
ccactccaac tccccagaag                                  20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>6
tacataggga cggcttgcat                                  20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>7
gggaaacctg gagcgaactg                                  20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>8
cgaggaagga cacccgaaga                                  20
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>9
tttctatgag atcactgcaa ccact                            25
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>10
tgacatttcc gtccagtcca a                                21
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>11
gcacttcgca agaaargaga ga                                22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝c或t
<400>12
ccttggyctg ccagtctcta ac                                22
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>13
aaatactcgr gcaactcaat caca                              24
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>14
ccatccatca taacccaaac tcc                               23
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>15
aactggcaag cacaaggttt ca                                22
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>16
cagtttgggc agcattcatt tc                                    22
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>17
agcaaccaag aaagcaactt cc                                    22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>18
gcctaactgt gccattgatg ag                                    22
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>19
gcgagtggaa cttgcctgac                                       20
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>20
gggaacgacc ttgaactgaa a                                     21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>21
tgagaaacga aagggragcc                                       20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝c或t
<400>22
ggttcatayt tcccgctttg                                       20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>23
gctgattggc aagctatggg                                       20
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>24
gatttcagct ccttgtaccc cac                                   23
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>25
tggtgtagtt gtgccaggtg c                                     21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>26
tgctgctcct gttatgccac t                                     21
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>27
ggggacaccc atccttctga                                       20
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>28
ttcttgaggt tcctgtggtg c                                     21
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>29
ccagcagcga aagaagg                                          17
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>30
ttattgggcg taaagggtgt gt                                    22
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>31
tgtttgctcc ccacgcttt                                        19
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>32
catcgtttac ggcgtggact a                                     21
<210>33
<211>19
<212>NA
<213>人工序列
<220>
<400>33
gcggcttgct gggtcttta                                        19
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>34
cacctgtttc ctgatgacct c                                     21
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>35
atgctggcaa ctaacgacaa g                                     21
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>36
accagatccg acaagctcag g                                     21
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>37
gccatttgct crgtgttcg                                19
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>38
tgggacagag cggtggaac                                19
<210>39
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>39
agtgtctcat ttgcctgraa cg                            22
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>40
gggcttgggt gatgatgga                                19
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>41
gcctttcagt gttctcgctt g                             21
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>42
ccaacgctgc grcaaataat g                             21
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>43
tgccgttcag tgtcttcgc                              19
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>44
tgatggatgg rgaagagcaa g                           21
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>45
tgatggatgg gagaagagca ag                          22
<210>46
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>46
taaaccccac gacgttccg                              19
<210>47
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>47
tcgatgacgc cacaacacg                              19
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>48
ggaagcaggg tcggcaaag                              19
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>49
caagcgaatc tgggaagg                               18
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>50
aggggctaca aagggacac                              19
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝c或t
<400>51
aagaccacyt ggaccgtgag                             20
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>52
gtcctccacc atcccaatcc                             20
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>53
atgatggatg gagargaaca gatt                          24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>54
gtgcctttca gtattttcgg agtt                          24
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝c或t
<400>55
tgttttgatt cacatcyctt gc                            22
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝g或a
<400>56
tcaagtracg atggctgctg                               20
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<400>57
ccagaccacc caagattcct a                             21
<210>58
<211>27
<212>DNA
<213>苜蓿花叶病毒
<220>
<223>y＝c或t
<400>58
tatgccgtag ccctytgttt ggacttc                          27
<210>59
<211>38
<212>DNA
<213>苜蓿花叶病毒
<220>
<222>(1，7，18，21，23)
<223>y＝c或t，k＝g或t，w＝a或t
<400>59
ccttytgytgg acttcgaygc kcwgcctgag ggatctaa             38
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>黄瓜花叶病毒
<400>60
acggagcctc accggtactg gtttat                           26
<210>61
<211>31
<212>DNA
<213>黄瓜花叶病毒
<400>61
tgtattcaaa agacgatgcg ctcgagacgg a                     31
<210>62
<211>29
<212>DNA
<213>马铃薯卷叶病毒
<400>62
gagcgattta ttgcttacgt tggcatacc                        29
<210>63
<211>29
<212>DNA
<213>马铃薯卷叶病毒
<400>63
agggagaacg acgaccaaat ttcatattg                        29
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>马铃薯纺锥块茎类病毒
<220>
<223>w＝a或t
<400>64
awaaggacgg tgggagtgcc                               20
<210>65
<211>24
<212>DNA
<213>马铃薯纺锥块茎类病毒
<400>65
caggagtaat tcccgccgaa acag                          24
<210>66
<211>22
<212>DNA
<213>马铃薯A病毒
<220>
<222>(2，13)
<223>r＝g或a
<400>66
grtcagagcc aargaggcgc at                            22
<210>67
<211>27
<212>DNA
<213>马铃薯A病毒
<220>
<223>w＝t或a
<400>67
agcwgcgctg aagaattcga acactaa                       27
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>马铃薯M病毒
<400>68
gggaaggaca catcggagaa cact                          24
<210>69
<211>25
<212>DNA
<213>马铃薯M病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>69
ctgatggaga ratgtcattg gagcg                           25
<210>70
<211>31
<212>DNA
<213>马铃薯Y病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>70
tacgacatag gagaaactga ratgccaact g                    31
<210>71
<211>23
<212>DNA
<213>马铃薯Y病毒
<400>71
ggagtttggg ttatgatgga tgg                             23
<210>72
<211>25
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>72
gcacaaattc gctgcattcg acttc                           25
<210>73
<211>23
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>73
aacccagctg ccatcatgcc caa                             23
<210>74
<211>32
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>74
gagttcctga gtaagagaga cattggagat gt                   32
<210>75
<211>25
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>75
ctttctcaca ggaggtgtgg gaggc                       25
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>马铃薯V病毒
<400>76
aattgcagag gaggtgtgag cgtg                        24
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>马铃薯V病毒
<400>77
aaaaggatgg aaagagccga cgag                        24
<210>78
<211>28
<212>DNA
<213>香蕉束顶病毒
<220>
<223>m＝c或a
<400>78
ggtcccttcg agtttggtgc mtttaaat                    28
<210>79
<211>32
<212>DNA
<213>香蕉束顶病毒
<220>
<223>y＝c或t
<400>79
gccatttyat attcccggg cagttatgtct ag               32
<210>80
<211>30
<212>DNA
<213>香蕉束顶病毒
<220>
<223>w＝a或t
<400>80
gagwtgaata aaacgaaggc gatgaatagc                  30
<210>81
<211>26
<212>DNA
<213>百合无症病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>81
taggtctaac cgcaatgarc gtctgg                              26
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>百合无症病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>82
gtgtcaaarg ctgcgaaccg cgtgttg                             27
<210>83
<211>25
<212>DNA
<213>南瓜花叶病毒
<400>83
acagtggcat aacaggagca gcaga                               25
<210>84
<211>26
<212>DNA
<213>南瓜花叶病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>84
cataagcctt rgttctgcca gcacct                              26
<210>85
<211>23
<212>DNA
<213>柑橘裂皮类病毒
<400>85
ggatcactgg cgtccagcgg aga                                 23
<210>86
<211>22
<212>DNA
<213>柑橘裂皮类病毒
<400>86
tctccgctgg acgccagtga tc                                  22
<210>87
<211>26
<212>DNA
<213>苹果丛生植原体
<400>87
tgggtcttaa ctgacgctga ggcacg                              26
<210>88
<211>25
<212>DNA
<213>苹果丛生植原体
<400>88
gctttcgtgc ctcagcgtca gttaa                               25
<210>89
<211>35
<212>DNA
<213>苹果丛生植原体
<400>89
tttgactaga gttggataga ggcaagtgga atacc                    35
<210>90
<211>33
<212>DNA
<213>苹果丛生植原体
<400>90
ttccacttgc ctctatccaa ctctagtcaa aca                      33
<210>91
<211>30
<212>DNA
<213>桃X植原体
<400>91
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc                          30
<210>92
<211>30
<212>DNA
<213>桃X植原体
<400>92
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta                          30
<210>93
<211>30
<212>DNA
<213>桃X植原体
<400>93
ataatggagg tcatcaggaa aacaggtggt                          30
<210>94
<211>30
<212>DNA
<213>桃X植原体
<400>94
ataacttcgc aagaaaatgt caagacctgg                          30
<210>95
<211>25
<212>DNA
<213>马铃薯S病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>95
ccgacccctg aratgcggag gaatc                               25
<210>96
<211>27
<212>DNA
<213>马铃薯S病毒
<400>96
atgttgctca atgttgaagt tgtgcct                             27
<210>97
<211>26
<212>DNA
<213>百合斑驳病毒
<400>97
gctcttcgtg cgctgtacac tggtga                              26
<210>98
<211>25
<212>DNA
<213>百合斑驳病毒
<400>98
gcgggtatcc ccacgcctca atcat                               25
<210>99
<211>26
<212>DNA
<213>芋花叶病毒
<400>99
gcatcacttt tctgacgcag cagagg                              26
<210>100
<211>25
<212>DNA
<213>芋花叶病毒
<400>100
gcattatctg acgcaaggtg ggttt                               25
<210>101
<211>26
<212>DNA
<213>小西葫芦黄花叶病毒
<400>101
ggttgtttgg ccttgatgga aatgtt                              26
<210>102
<211>28
<212>DNA
<213>小西葫芦黄花叶病毒
<400>102
gcatgtatgg tgcctctgca tttctcat                            28
<210>103
<211>29
<212>DNA
<213>西瓜花叶病毒
<400>103
caagagaagc aatagcacaa atgaaggcc                           29
<210>104
<211>26
<212>DNA
<213>西瓜花叶病毒
<220>
<223>y＝c或t
<400>104
ctcaacttgc tcttcyccat ccatca                              26
<210>105
<211>25
<212>DNA
<213>香石竹环斑病毒
<400>105
gaaacgcatg tatgcagcag gaggc                               25
<210>106
<211>32
<212>DNA
<213>香石竹环斑病毒
<400>106
gaggacgaac ctattgtgga gtgaagttga ag                       32
<210>107
<211>31
<212>DNA
<213>香石竹环斑病毒
<400>107
tgacgatgtc tggaggtttg taagggatac c                        31
<210>108
<211>25
<212>DNA
<213>香石竹环斑病毒
<400>108
tcagttcccg tagccgccaa caaag                               25
<210>109
<211>27
<212>DNA
<213>香石竹环斑病毒
<400>109
gctggtgcct aaacagcgtc agaacct                             27
<210>110
<211>25
<212>DNA
<213>椰子死亡类病毒
<400>110
gggagactac ccggtggata caact                               25
<210>111
<211>24
<212>DNA
<213>椰子死亡类病毒
<400>111
tatccaccgg gtagtctccc aagc                                24
<210>112
<211>23
<212>DNA
<213>椰子死亡类病毒
<400>112
gcgaatctgg gaagggagcg tac                                 23
<210>113
<211>24
<212>DNA
<213>椰子死亡类病毒
<220>
<223>s＝c或g
<400>113
ttcccagatt cgcttgasgt ttcc                                24
<210>114
<211>27
<212>DNA
<213>李坏死环斑病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>114
tccctcagtt gatgggtcar aatttga                             27
<210>115
<211>25
<212>DNA
<213>李坏死环斑病毒
<400>115
ccttaggaat tcggggaggc acatt                               25
<210>116
<211>25
<212>DNA
<213>李坏死环斑病毒
<400>116
caccgagagg tgacgacgac agagg                               25
<210>117
<211>27
<212>DNA
<213>南方菜豆花叶病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>117
acaccaaaca gggcaaggga rgcaata                             27
<210>118
<211>26
<212>DNA
<213>南方菜豆花叶病毒
<220>
<223>y＝c或t
<400>118
ttcatytgcg ctattgcttc ccttgc                              26
<210>119
<211>31
<212>DNA
<213>南方菜豆花叶病毒
<220>
<223>r＝g或a
<400>119
ggraacatct caaccaactc cgaaaatact g                        31
<210>120
<211>27
<212>DNA
<213>烟草环斑病毒
<400>120
attttggagg tcccgttaag cattcta                             27
<210>121
<211>30
<212>DNA
<213>烟草环斑病毒
<400>121
gggtcaacct ccatgttgtc catatcttat                          30
<210>122
<211>27
<212>DNA
<213>烟草环斑病毒
<400>122
acatggggcc cgtcattgat cgttttg                             27
<210>123
<211>32
<212>DNA
<213>烟草环斑病毒
<220>
<223>y＝c或t
<400>123
gccatttyat attcccgggc agttatgtct ag                       32

Claims (20)

1.一种基因芯片的用途，其特征在于将基因芯片用于同时检测2～122种植物病毒。
2.如权利要求1所述的基因芯片的用途，其特征在于将基因芯片用于同时检测7～26种植物病毒。
3.如权利要求1或2所述的基因芯片的用途，其中所说的植物病毒选自包含RNA植物病毒AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVD、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和类病毒PSTVD的组。
4.一种用于植物病毒检测的基因芯片，该芯片包含基质和2～122种植物病毒的特异性探针。
5.如权利要求4所述的基因芯片，该芯片还包含阴性对照。
6.如权利要求4或5所述的基因芯片，该芯片分1～12个区，每个区分1～6个亚区。
7.如权利要求6所述的基因芯片，该芯片分2个区，每个区分3个亚区。
8.如权利要求4或5所述的基因芯片，其中所说的基质选自玻片、硅片、金属片和膜。
9.如权利要求7所述的基因芯片，该芯片包含玻片和针对7～26种植物病毒的特异性探针。
10.如权利要求4或5所述的基因芯片，其中所说的特异性探针选自根据包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV、ComDV、AbYV、ComMV、AmLMV、CGVBV、ArjMV、CMABMV、ArLV、CpRMV、AV-1、CriMV、BaMMV、DVY、BaYMV、BaMMoV、DDMV、BBrMV、DNV、BCMNV、DSTV、BCMV、DesMV、BtMV、DAV、BiMV、DGBMV、BioMoV、EGMV、CdMV、FreMV、CVMV、GEV、CTLV、GSLV、CBSV、GGMV、CasYSV、HVY、CeMV、HMV、CpBDV、HiMV、ClYVV、HyaMV、CDV、IPMV、IFMV、TVBMV、IMMV、TVMV、ISMV、TWV、JGMV、ToPV、KVY、TZV、LYSV、TrMV、LMV、TmMV、LiMoV、TV-1、MDMV、TV-2、MVCV、TuV、MaMoV、TBBV、NDV、TBV、PPV、TCBV、PkMV、TuMV、UMV、PVV、ValMV、VanMV、PrMV、VDMV、RanMV、WMV-1、SrMV、WMV-2、SMV、WPMV、SVY、WVMV、SCMV、YMV、SPFMV、ZYFV、SPVG、TamMV、TeMV、TEV和类病毒PSTVD的组的植物病毒的基因组核苷酸序列进行保守性序列分析而设计的探针的组。
11.如权利要求10所述的基因芯片，其中所说的特异性探针选自根据包含AlMV、CMV、PVY、PVA、PVX、PMTV、PLRV、TMV、PVM、BBTV、LSV、SqMV、CEVD、ASGV、PXP、PVS、LMoV、DsMV、ZYMV、WMV、CRSV、CCCVd、PNRSV、SBMV、TRSV和类病毒PSTVD的组的植物病毒的基因组核苷酸序列进行保守性序列分析而设计的探针的组。
12.如权利要求11所述的基因芯片，其中针对AlMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.58或SEQ ID NO.59的核苷酸序列、针对CMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61的核苷酸序列、针对PLRV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63的核苷酸序列、针对PSTVD的特异性探针分别具有SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65的核苷酸序列、针对PVA的特异性探针分别具有SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67的核苷酸序列、针对PVM的特异性探针分别具有SEQ ID NO.68或SEQID NO.69的核苷酸序列、针对PVY的特异性探针分别具有SEQID NO.70或SEQ ID NO.71的核苷酸序列、针对PXV1的特异性探针分别具有SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73的核苷酸序列、针对PXV2的特异性探针分别具有SEQ ID NO.74或SEQ ID NO.75的核苷酸序列、针对TMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77的核苷酸序列、针对BBTV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80的核苷酸序列、针对LSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.81或SEQID NO.82的核苷酸序列、针对SqMV的特异性探针分别具有SEQID NO.83或SEQ ID NO.84的核苷酸序列、针对CEDV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86的核苷酸序列、针对ASGV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90的核苷酸序列、针对PXP的特异性探针分别具有SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ IDNO.93或SEQ ID NO.94的核苷酸序列、针对PVS的特异性探针分别具有SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96的核苷酸序列、针对LMoV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98的核苷酸序列、针对DsMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100的核苷酸序列、针对ZYMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102的核苷酸序列、针对WMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104的核苷酸序列、针对CRSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108或SEQID NO.109的核苷酸序列、针对CCCDV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113的核苷酸序列、针对PNRSV的特异性探针分别具有SEQ IDNO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116的核苷酸序列、针对SBMV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119的核苷酸序列、针对TRSV的特异性探针分别具有SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123的核苷酸序列。
13.一种用于权利要求4-12之一的植物病毒检测基因芯片的特异性探针，其包括针对AlMV的特异性探针SEQ ID NO.58或SEQ ID NO.59、针对CMV的特异性探针SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.61、针对PLRV的特异性探针SEQ ID NO.62或SEQ ID NO.63、针对PSTVD的特异性探针SEQ ID NO.64或SEQ ID NO.65、针对PVA的特异性探针SEQ ID NO.66或SEQ ID NO.67、针对PVM的特异性探针SEQ ID NO.68或SEQ ID NO.69、针对PVY的特异性探针SEQ ID NO.70或SEQ ID NO.71、针对PXV1的特异性探针SEQ ID NO.72或SEQ ID NO.73、针对PXV2的特异性探针SEQID NO.74或SEQ ID NO.75、针对TMV的特异性探针SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77、针对BBTV的特异性探针SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79或SEQ ID NO.80、针对LSV的特异性探针SEQ IDNO.81或SEQ ID NO.82、针对SqMV的特异性探针SEQ ID NO.83或SEQ ID NO.84、针对CEDV的特异性探针SEQ ID NO.85或SEQ ID NO.86、针对ASGV的特异性探针SEQ ID NO.87、SEQID NO.88、SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.90、针对PXP的特异性探针SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.92、SEQ ID NO.93或SEQ IDNO.94、针对PVS的特异性探针SEQ ID NO.95或SEQ ID NO.96、针对LMoV的特异性探针SEQ ID NO.97或SEQ ID NO.98、针对DsMV的特异性探针SEQ ID NO.99或SEQ ID NO.100、针对ZYMV的特异性探针SEQ ID NO.101或SEQ ID NO.102、针对WMV的特异性探针SEQ ID NO.103或SEQ ID NO.104、针对CRSV的特异性探针SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ IDNO.107、SEQ ID NO.108或SEQ ID NO.109、针对CCCDV的特异性探针SEQ ID NO.110、SEQ ID NO.111、SEQ ID NO.112或SEQ ID NO.113、针对PNRSV的特异性探针SEQ ID NO.114、SEQ ID NO.115或SEQ ID NO.116、针对SBMV的特异性探针SEQ ID NO.117、SEQ ID NO.118或SEQ ID NO.119、针对TRSV的特异性探针SEQ ID NO.120、SEQ ID NO.121、SEQ ID NO.122或SEQ ID NO.123。
14.一种高通量检测待测样品中的植物病毒的方法，该方法包括步骤：
1)取样：取植物材料组培苗或取茎叶组织；
2)样品总RNA抽提：用常规方法抽提样品总RNA；
3)RT-标记PCR：取总RNA作为第一链cDNA合成的模板，按常规RT方法合成第一链cDNA片段，以反转录合成的第一链cDNA为模板进行Cy5标记PCR，反应体系如下：ddH2O；10×PCRbuffer；d(ATG)TP；DCT；Cy5-dCTP；Primer L &R；模板；Taq聚合酶；
4)杂交：用无水乙醇沉淀标记PCR产物，加杂交液，变性，置于冰上放置一段时间，然后将杂交液滴于权利要求4～12之一基因芯片的点样区进行杂交，盖上盖玻片，转移芯片于杂交舱；
5)芯片扫描与图片处理；
6)数据分析，判断样品中植物病毒的存在。
15.如权利要求14所述的方法，其中PCR反应针对AlMV采用的引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核苷酸序列、针对CMV采用的引物为具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的核苷酸序列、针对PLRV采用的引物为具有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6的核苷酸序列、针对PSTVD采用的引物为具有SEQ ID NO.7或SEQID NO.8的核苷酸序列、针对PVA采用的引物为具有SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的核苷酸序列、针对PVM采用的引物为具有SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12的核苷酸序列、针对PVY采用的引物为具有SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14的核苷酸序列、针对PXV1采用的引物为具有SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16的核苷酸序列、针对PXV2采用的引物为具有SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的核苷酸序列、针对TMV采用的引物为具有SEQID NO.19或SEQ ID NO.20的核苷酸序列、针对BBTV采用的引物为具有SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22的核苷酸序列、针对LSV采用的引物为具有SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24的核苷酸序列、针对SqMV采用的引物为具有SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27的核苷酸序列、针对CEDV采用的引物为具有SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29的核苷酸序列、针对ASGV采用的引物为具有SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32的核苷酸序列、针对PXP采用的引物为具有SEQ ID NO.33、SEQID NO.34或SEQ ID NO.35的核苷酸序列、针对PVS采用的引物为具有SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37的核苷酸序列、针对LMoV采用的引物为具有SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39的核苷酸序列、针对DsMV采用的引物为具有SEQ ID NO.40或SEQID NO.41的核苷酸序列、针对ZYMV采用的引物为具有SEQ IDNO.42或SEQ ID NO.43的核苷酸序列、针对WMV采用的引物为具有SEQ ID NO.44或SEQ ID NO.45的核苷酸序列、针对CRSV采用的引物为具有SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或SEQID NO.48的核苷酸序列、针对CCCDV采用的引物为具有SEQ IDNO.49或SEQ ID NO.50的核苷酸序列、针对PNRSV采用的引物为具有SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52的核苷酸序列、针对SBMV采用的引物为具有SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54或SEQID NO.55的核苷酸序列、针对TRSV采用的引物为具有SEQ IDNO.56或SEQ ID NO.57的核苷酸序列。
16.如权利要求14所述的方法，其中所说的PCR反应采用随机引物或3`末端扩增引物。
17.如权利要求16的检测植物病毒的方法，其中所说的随机引物为Takara Biotechnology或Nonadeoxyribonucleotide mixture。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所说的PCR反应采用35个循环，72℃延伸反应10min。
19.如权利要求14所述的方法，其中用无水乙醇沉淀标记的PCR产物，加杂交液，94℃变性3min。
20.一种PCR扩增引物，其包括针对AlMV的引物SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、针对CMV的引物SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4、针对PLRV的引物SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6、针对PSTVD的引物SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8、针对PVA的引物SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10、针对PVM的引物SEQ ID NO.11或SEQID NO.12、针对PVY的引物SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14、针对PXV1的引物SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16、针对PXV2的引物SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18、针对TMV的引物SEQID NO.19或SEQ ID NO.20、针对BBTV的引物SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、针对LSV的引物SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24、针对SqMV的引物SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ IDNO.27、针对CEDV的引物SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29、针对ASGV的引物SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32、针对PXP的引物SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35、针对PVS的引物SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37、针对LMoV的引物SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39、针对DsMV的引物SEQID NO.40或SEQ ID NO.41、针对ZYMV的引物SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.43、针对WMV的引物SEQ ID NO.44或SEQ IDNO.45、针对CRSV的引物SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47或SEQID NO.48、针对CCCDV的引物SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50、针对PNRSV的引物SEQ ID NO.51或SEQ ID NO.52、针对SBMV的引物SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54或SEQ ID NO.55、针对TRSV的引物SEQ ID NO.56或SEQ ID NO.57。
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