CN1764724A - 大麦脂肪加氧酶－1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法 - Google Patents

大麦脂肪加氧酶－1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法 Download PDF

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Abstract

以通过大麦脂肪加氧酶－1基因第5内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变为其他碱基判别大麦脂肪加氧酶－1缺失大麦为特征的大麦脂肪加氧酶－1缺失大麦的筛选方法，以及使用由通过该筛选方法所得大麦得到的麦芽酒精饮料用原料的麦芽酒精饮料制造方法。

Description

大麦脂肪加氧酶-1基因、大麦的筛选方法、 麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法
技术领域
本发明涉及，大麦脂肪加氧酶-1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法。
背景技术
麦芽所含的酶大麦脂肪加氧酶-1(下称“LOX-1”)在制造麦芽酒精饮料时的下料步骤中，氧化来自麦芽的亚油酸生成9-氢过氧基十八碳二烯酸(Kobayashi，N.et al.，J.Ferment.Bioeng.，76，371-375，1993)。接着，9-氢过氧基十八碳二烯酸通过类似过加氧酶(peroxygenase)的活性被变换成三羟十八碳烯酸(THOD)(Kuroda，H.，et al.，J.Biosci.Bioeng.，93，73-77，2002)。已知THOD使啤酒泡沫稳定性下降，还产生涩味，使口感变差(Kobayashi，N.，J.Am.Soc.Brew.Chem.60：37-41.2002；Kaneda，H.et al.，J.Biosci.Bioeng.，92，221-226.2001)，引起麦芽酒精饮料的品质下降。此外，已知9-氢过氧基十八碳二烯酸还变换成被认为是长时间放置引起麦芽酒精饮料产生纸板气味(カ一ドボ一ド臭)的物质反式-2-壬烯醛(安井，酿造协会志，96：94-99(2001))。
为了改善麦芽酒精饮料的香味持久性，作为抑制反式-2-壬烯醛生成的技术，提出了制造使用LOX-1活性低的麦芽的麦芽酒精饮料的方法(Drost，J.Am.Soc.Brew.Chem.48：124-131(1990))。
此外，Douma等通过对大麦进行诱变剂(药剂)处理诱发突变，制作出LOX-1活性降至对照组的9％的诱发突变系，用其尝试麦芽酒精饮料的制造(国际公开第02/053721号公报)。
但是，即使使用那样的大麦，得到的麦芽酒精饮料的反式-2-壬烯醛浓度的减低仍然不够，香味持久性没有得到充分改善。此外，对于THOD含量的减低和泡沫稳定性的改善并不明显。
发明内容
本发明是鉴于上述已有技术存在的问题所作的，其目的是提供，不通过基因操作而能够用于制造香味持久性和泡沫稳定性得到改善的麦芽酒精饮料的LOX-1突变基因、LOX-1缺失的大麦的筛选方法、由经筛选得到的大麦而来的麦芽酒精饮料用原料和使用所述麦芽酒精饮料用原料的麦芽酒精饮料的制造方法。
本发明人，为了达成上述目的反复认真研究，结果在发现LOX-1活性完全缺失的已有大麦品种的同时，还发现从该大麦品种得到的新的LOX-1突变基因，从而完成了本发明。
即，本发明的LOX-1突变基因的特征在于，LOX-1基因的第五内含子剪切位点(5’-GT-3’)的鸟嘌呤突变成其他碱基。这里，所述碱基以腺嘌呤为佳。
此外，本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法的特征在于，通过LOX-1基因的第五内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦LOX-1缺失大麦。这里，所述碱基以腺嘌呤为佳。
进一步，本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法的特征在于，包括从被检对象大麦提取基因组DNA的基因组DNA提取步骤；从提取的基因组DNA扩增含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断的DNA片断扩增步骤；将所述DNA片断扩增步骤中扩增的含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断用限制性酶酶切，检测指定碱基数的DNA片断，通过剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦LOX-1缺失大麦的DNA片断检测步骤。
这里，所述DNA片断检测步骤中使用的限制性酶以识别碱基序列5’-GTAC-3’的Afa I和/或Rsa I为佳。
根据上述发明，基于LOX-1基因第五内含子剪切位点的鸟嘌呤突变的有无，可以判断是否是具有LOX-1活性缺失性状的大麦品种。
其结果，可以不直接测定LOX-1的活性，而通过基因水平的分析，简单地筛选LOX-1活性缺失的大麦品种。尤其，有时酶活性受植物个体的繁殖阶段、环境等影响难以准确测定，根据这种方法，与酶测定不同，可以不受环境等的影响，筛选LOX-1活性缺失的大麦品种。而且，测定酶活性只有到种子成熟后才能进行，而DNA筛选在繁殖初期就可以进行，所以可以较早地判断是否具有活性缺失性状，而且对连续回交等是有效的。
此外，本发明的麦芽酒精饮料用原料的特征在于，它是由具有本发明的LOX-1突变基因的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。
此外，本发明的麦芽酒精饮料用原料的特征在于，它是由通过本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法筛选出的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。
进一步，本发明的麦芽酒精饮料的制造方法的特征在于，使用本发明的麦芽酒精饮料用原料。
根据上述本发明，原料中不含LOX-1，所以麦芽酒精饮料的制造工艺中9-氢过氧基十八碳二烯酸变得不易从亚油酸生成，因此THOD和反式-2-壬烯醛也变得难以生成，从而可以得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。
本发明还提供序列编号10的第1～1554位碱基所表示的碱基序列构成的核酸。所述碱基序列表示编码LOX-1蛋白的脂肪加氧酶活性缺失的突变LOX-1蛋白的基因编码区域。通过大麦样本中该核酸的有无，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。
本发明还提供序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸。所述碱基序列表示编码LOX-1蛋白的脂肪加氧酶活性缺失的突变LOX-1蛋白的基因的基因组序列。通过检测大麦样本中该核酸的有无，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。
本发明还提供序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸中，含有第3178位碱基的10～60位的连续的碱基序列构成的核酸。第3178位碱基是单碱基多态，正常的LOX-1中为G，突变的LOX-1中为A。通过检测大麦样本中含有多态位点的核酸的存在与否，可以判断该大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。
本发明还提供包括从大麦样本中分离基因组DNA的步骤和检测序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基，将该碱基的存在作为该大麦LOX-1活性存在的指标的步骤的检测大麦中LOX-1活性存在与否的方法。根据所述方法，可以判断作为检测对象的大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。
如果以来自这样筛选出的LOX-1活性缺失的大麦的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物等作为原料制造麦芽酒精饮料，则可以得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。
附图说明
图1是探索试验1中LOX-1活性测定结果的示意图。
图2是证明试验1中LOX-1抑制活性测定结果的示意图。
图3是表示证明试验2中大麦种子的LOX蛋白质Western分析的结果的电泳照片。A表示SDS-PAGE后的Western分析的结果，B表示IEF后的Western分析的结果。
图4是表示证明试验3中大麦种子的RNA的RT-PCR分析结果的电泳照片。
图5是证明试验4中LOX-1基因第5内含子剪切位点的结构的示意图。
图6是表示证明试验5中对于LOX-1突变基因剪切的分析的结果的电泳照片。A是包含第3内含子～第5内含子的扩增片断的电泳照片，B是将与A相同的扩增片断用Stu I消化后的电泳照片。
图7是证明试验7、8中大肠杆菌中诱导表达蛋白质的电泳照片。
图8是证明试验7、8中大肠杆菌中被诱导表达的LOX-1活性的示意图。
图9是表示证明试验9中Kendall×SBOU2杂交的第2代中的DNA多态的电泳照片。
图10是同时表示了证明试验9中Kendall×SBOU2杂交的第2代中的DNA多态和杂交第3代中LOX活性的图。
图11是表示实施例1中一般大麦品种/系用Afa I法分析的结果的电泳照片。
图12是表示实施例2中LOX-1缺失大麦用Afa I法分析的结果的电泳照片。
图13是实施例2中LOX-1缺失大麦的种子的LOX活性测定结果的示意图。A是酶反应时间5分钟的结果的示意图，B是酶反应时间90分钟的结果的示意图。
图14是实施例5中LOX+F4群体和LOX-F4群体的种子的麦芽分析结果的示意图。
图15是实施例5中麦汁中反式-2-壬烯醛浓度和壬烯醛潜在含量的示意图。
实施发明的最佳方式
以下，就本发明优选的实施方式进行详细说明。
首先，就本发明所述的LOX-1突变基因进行说明。
本发明所述的LOX-1突变基因是发明人发现的新基因，其特征在于，与已知的LOX-1基因(序列编号1)相比，第60位碱基G突变为A(序列编号2)。序列编号1的第60～61位为剪切位点(5’-GT-3’)所以由于该碱基的突变导致LOX-1剪切异常，变得无法表达有活性的LOX-1。
序列表的序列编号1中表示了已知的LOX-1基因第5内含子区域的碱基序列，序列编号2中表示了本发明的LOX-1突变基因的对应于LOX-1基因第5内含子区域的碱基序列。
接着，就本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法进行说明。
本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法，其特征在于，通过LOX-1基因第5内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来筛选大麦LOX-1缺失大麦。
利用上述碱基的突变筛选LOX-1缺失大麦的方法，可以使用例如使用在引物序列的3’端或者引物序列内部含有上述突变位点的引物进行DNA的扩增，根据扩增的有无和扩增的效率检测碱基的突变，从而筛选LOX-1缺失大麦的方法；或者根据扩增含有上述突变位点的DNA片断，确定碱基序列，检测碱基的突变，从而筛选LOX-1缺失大麦的方法等。
对于这些碱基突变的检测，只要DNA片断能检出，没有特别限定，但以使用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳为佳。此外，根据扩增的有无和扩增的效率检测DNA突变的情况下，除了上述电泳之外，也可以使用TAQMAN法等定量PCR法。
此外，本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法，优选地，以包括从作为被检对象的大麦提取基因组DNA的基因组DNA提取步骤；从提取的基因组DNA扩增含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断的DNA片断扩增步骤；将所述DNA片断扩增步骤中扩增的含有LOX-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断用限制性酶酶切，检测指定碱基数的DNA片断，通过剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦LOX-1缺失大麦的DNA片断检测步骤为特征。
首先，就本发明所述的基因组DNA提取步骤进行说明。
从被检对象大麦提取基因组DNA的方法没有特别限定，可以通过公知的方法进行，具体地可以通过例如CTAB法(Murray et al.，1980，Nucleic AcidsRes.8：4321-4325)或溴化乙锭法(Varadarajan and Prakash 1991，Plant Mol.Biol.Rep.9：6-12)抽提。这里，用于抽提基因组DNA的组织不光是大麦种子，也可以使用叶、茎、根等。例如，通过使用叶，可以用于回交世代过程中大量的个体筛选。
接着，就本发明所述的DNA片断扩增步骤进行说明。
扩增DNA的片断的方法没有特别限定，可以通过例如PCR法(PolymeraseChain Reaction Method)进行。这里，PCR法中所用的引物，只要是设定于可以扩增含有LOX-1基因第5内含子剪切位点的DNA片断的区域，碱基序列并无特别限定，具体地例如，较好为LOX-1基因中碱基数为10～60位的连续碱基，更好为15～30位连续碱基。此外，一般引物的碱基序列中的GC含量较好为40～60％。更进一步，PCR法中所用的两个引物的引物间Tm值的差以没有或较小为佳。此外，以引物内没有二级结构为佳。
接着，就本发明所述的DNA片断检测步骤进行说明。
本发明所述的LOX-1突变基因，如上所述与已知的LOX-1在碱基序列上有不同，所以如果使用识别或剪切该不同部分的限制性酶剪切扩增产物，得到的DNA片断的大小会有所不同。本发明所述的限制性酶，只要能如此将所述的不同部分识别或剪切的酶，没有特别限定，已知有这样的作用的限制性酶以AfaI和/或Rsa I为佳。
即，本发明的LOX-1突变基因，由于剪切位点的鸟嘌呤突变为其他碱基，存在于已知的LOX-1基因中的限制性酶Afa I和Rsa I的剪切位点(5’-GTAC-3’：第5内含子第60-63位)消失了。其结果，因为将含有该剪切位点的基因扩增产物用限制性酶Afa I和/或Rsa I剪切时的剪切方式与已知的LOX-1基因的情况不同，可以判别是否是LOX-1突变基因。
此外，指定碱基数的DNA片断，只要是由于所述的不同部分的存在，用限制性酶剪切扩增产物得到的DNA片断的大小有不同的DNA片断，其碱基数没有特别限定。
此外，本步骤所述的检测，只要是能够检测用限制性酶剪切的DNA片断的方法，没有特别限定，具体地可以通过例如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
接着，就本发明的麦芽酒精饮料用原料进行说明。
本发明的麦芽酒精饮料用原料，其特征在于，它是由具有本发明的LOX-1突变基因的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物，或者是由通过本发明的LOX-1缺失大麦的筛选方法筛选出的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。
这里，麦芽提取物是指麦芽的提取物，可例举例如麦芽中的糖成分和蛋白质成分的提取物等。大麦分解产物是指将大麦用酶等分解处理后的产物，包括大麦糖化液等。大麦加工产物包括作为麦芽酒精饮料的辅助原料被使用的大麦粉碎产物等。
本发明的麦芽酒精饮料用原料不含LOX-1，所以麦芽酒精饮料的制造工艺中9-氢过氧基十八碳二烯酸变得不易从亚油酸生成，因此有希望也抑制THOD和反式-2-壬烯醛的生成，能有希望得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。
接着，就本发明的麦芽酒精饮料的制造方法进行说明。
本发明的麦芽酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用本发明的麦芽酒精饮料用原料。
首先，就本发明所述的制麦步骤进行说明。
本发明所述的制麦步骤是以使用LOX-1缺失大麦为特征的获得麦芽的步骤，制麦的方法没有特别限定，可以使用公知的方法进行。具体地例如，可以浸麦到浸麦度达40％～45％后，在10～20℃下使其发芽3～6天，烘焙干燥得到麦芽。
接着，就本发明所述下料步骤进行说明。
本发明所述下料步骤是使所述麦芽糖化得到麦汁的步骤。具体地，可以进一步分为以下的第1～第4步骤。
即，第1步骤是，将含有所述麦芽的原料和下料用水混合，通过将得到的混合物加温使麦芽糖化，从所述糖化了的麦芽提取麦汁的下料步骤。
本步骤中所用的麦芽，理想的为给予大麦以水分和空气使其发芽，并进行干燥除去幼根的麦芽。麦芽是麦汁制造必需的酶源，同时作为糖化的原料是主要的淀粉源。此外，为了赋予麦芽酒精饮料特有的香味和色泽，麦汁制造中使用烘焙干燥的已发芽的麦芽。此外，原料除了上述的麦芽外，可以添加本发明所述的LOX-1缺失大麦或一般大麦、玉蜀黍淀粉、玉米粉、米、糖类等辅助原料。
此外，所述麦汁的制造步骤中，可以将用本发明所述的LOX-1缺失大麦或一般大麦配制的麦芽提取物或大麦分解产物、大麦加工产物与下料用水混合，根据需要添加所述辅助原料得到麦汁。
将所述麦芽添加到下料用水中后使其混合。添加所述辅助原料的情况下，可以在此时混合。糖类的情况下，也可以在后述的煮沸之前添加。此外，所述下料用水没有特别限定，使用对于制造的麦芽酒精饮料合适的水即可。糖化基本上用已知的条件进行即可。将这样得到的麦芽糖化液过滤后，添加可以赋予香味、苦味等的啤酒花或香草等煮沸，通过将其冷却得到冷麦汁。
此外，第2步骤是向所述冷麦汁中添加酵母使其发酵，得到麦芽酒精饮料半成品的步骤。
这里，所用的酵母只要是代谢通过所述麦芽的糖化得到的麦汁内的糖分，产生酒精和碳酸气等，进行所谓酒精发酵的酒类酵母都可以，具体地可例举例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)等。
发酵在冷却所述下料步骤中得到的麦汁后，添加所述酵母进行。发酵条件基本上与已知条件相同，例如发酵温度通常在15℃以下，较好为8～10℃，发酵时间较好为8～10天。
进一步，第3步骤是贮藏所述发酵步骤中得到的麦芽酒精饮料半成品的贮酒步骤。
本步骤中，酒精发酵结束了的发酵液移入密闭罐中贮藏。贮藏条件基本上与已知条件相同，例如贮藏温度较好为0～2℃，贮藏时间较好为20～90天。通过贮藏完成发酵的发酵液进行残存提取物的再发酵和老化。
接着，第4步骤是将所述贮酒步骤中得到的麦芽酒精饮料半成品过滤得到麦芽酒精饮料的过滤步骤。
过滤条件基本上与已知条件相同，例如过滤材料可使用硅藻土、PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)、硅胶、纤维素粉末等，温度在0±1℃下进行。
这样得到麦芽酒精饮料。过滤了的麦芽酒精饮料就直接、或进行无菌过滤和加热处理后，被大罐装、桶装、瓶装或罐装向市场销售。
麦芽酒精饮料，用于其制造的麦芽使用比例的多少没有特别限定，只要是以麦芽为原料制造的酒精饮料即可。具体地可例举例如啤酒和汽酒。此外，所谓无酒精啤酒和无酒精汽酒也使用与啤酒等麦芽酒精饮料同样的制法，所以也是麦芽酒精饮料。
根据上述本发明，原料中不含LOX-1，所以麦芽酒精饮料的制造工艺中9-氢过氧基十八碳二烯酸变得不易从亚油酸生成，因此有希望也抑制THOD和反式-2-壬烯醛的生成，能有希望得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。
接着，就本发明的核酸和检测大麦中LOX-1活性存在与否的方法进行说明。
本发明的核酸的特征在于是序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸。序列编号11表示LOX-1活性缺失大麦品种SBOU2具有的突变型LOX-1基因组序列。即，本发明的LOX-1突变基因的特征在于由序列编号11表示。正常的LOX-1基因中，对应于第3178位的碱基是G，而突变型的LOX-1基因中第3178位的碱基突变为A。而且，只要是正常的LOX-1基因，该碱基就是第5内含子的第1位碱基，第3178～3179位碱基序列GT为剪切位点(图5)。但是，在突变型的LOX-1基因中，对应于剪切位点的第3178～3179位碱基序列为AT，所以发生剪切异常，变得无法发生剪切。而且，第3176～3178位碱基序列为TGA，是终止密码子，到这里翻译就停止了。
该突变型LOX-1基因产生的突变型LOX-1蛋白只存在到相当于第5外显子的部分，与正常的LOX-1蛋白相比，较第5外显子缺少C末端的氨基酸残基。分子量相对于正常LOX-1蛋白的95Kd，突变型LOX-1蛋白为57Kd。与正常的LOX-1蛋白中对应于第5内含子旁的外显子区域的结构域是植物LOX的活性中心的认知(Shibata and Axelrod(1995)J.Lipid Mediaters and Cell Signaling12：213-228)相一致，突变型LOX-1蛋白缺失脂肪加氧酶的活性。
因此，如果将具有突变型LOX-1基因的大麦作为原料，制造麦芽酒精饮料，原料中不含LOX-1蛋白，所以麦芽酒精饮料的制造工艺中9-氢过氧基十八碳二烯酸变得不易从亚油酸生成，因此有希望也抑制THOD和反式-2-壬烯醛的生成，得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料。这样，在得到香味持久性和泡沫稳定性提高了的麦芽酒精饮料方面，本发明的序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸是非常有用的。
本发明的核酸还提供，包含序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸中第3178位碱基的10～60位连续的碱基序列构成的核酸。通过使用该核酸作为探针，可以判断大麦具有的LOX-1基因是野生型还是突变型。即，利用由于野生型LOX-1基因第3178位碱基是G而产生的错配，从杂交的不同可以判断是野生型还是突变型。例如，如果使该核酸和LOX-1基因的核酸形成杂交体，通过缓缓升温测定杂交体的解链温度，野生型LOX-1基因和突变型LOX-1基因显示的解链温度不同，所以可以容易地将两者区分。此外，通过对于从业者公知的方法，利用该核酸可以判断LOX-1基因的基因型(野生型/突变型)。从特异性的观点来看，该核酸以由含有第3178位碱基的20～50位连续的碱基序列构成，并且含有第3178～3181位碱基为佳。更进一步，该核酸也可以用荧光物质和放射性同位素等标记。
本发明的检测大麦中LOX-1活性存在与否的方法，其特征在于，包括从大麦样本中分离基因组DNA的步骤和检测序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基，将该碱基的存在作为该大麦LOX-1活性存在的指标的步骤。根据所述方法，可以判断作为检测对象的大麦是否具有LOX-1活性缺失的性状。
大麦样本不局限于大麦种子，也可使用叶、茎、根等。核酸分离可以用公知的方法进行，例如可以使用CTAB法和溴化乙锭法等。
此外，序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基的检测可以通过对于从业者公知的方法进行。例如，根据需要通过PCR法等核酸扩增方法，扩增含有序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基的核酸。对于分离了的核酸或扩增了的核酸判断，通过例如使用如上所述的包含序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸中第3178位碱基的10～60位连续的碱基序列构成的核酸，可以判断第3178位碱基的种类。
然而，利用LOX-1基因的第3178～3181位碱基的差异检测第3178位碱基的方法，更简单，效率更高。第3178～3181位的位点，在野生型LOX-1基因中是限制性酶Afa I/Rsa I的剪切位点，而在突变型LOX-1基因中由于第3178位碱基是A，则不是限制性酶Afa I/Rsa I的剪切位点(图5)。即，如果对分离了的核酸或扩增了的核酸片断用Afa I/Rsa I进行限制性酶处理，野生型LOX-1的核酸被剪切，突变型LOX-1的核酸则不被剪切。如果将进行了限制性酶处理的核酸样本用电泳分析，通过电泳图谱的不同，可以判别LOX-1基因的基因型(野生型/突变型)，判断第3178位碱基的种类。此外，将包含第3178～3181位碱基的10～60位连续的碱基序列构成的核酸作为探针，通过使其与进行了限制性酶处理的核酸杂交等，可以判别LOX-1基因的基因型，判断第3178位碱基的种类。
这样判断第3178位碱基的种类后，如果碱基是G，则作为检测对象的大麦具有LOX-1活性，可以认为不适合作为使香味持久性和泡沫稳定性提高的麦芽酒精饮料的原料。相反，如果碱基是A，则作为检测对象的大麦不具有LOX-1活性，可以认为适合作为使香味持久性和泡沫稳定性提高的麦芽酒精饮料的原料。
此外，本发明的核酸的特征还在于，是由序列编号10的第1～1554位碱基所表示的碱基序列构成的核酸。序列编号10表示LOX-1活性缺失的大麦品种SBOU2中发现的突变型LOX-1的cDNA序列。其中，第1～1554位碱基所表示的碱基序列是编码区。如上所述，该cDNA编码的突变型LOX-1蛋白与正常的LOX-1蛋白相比，较第5外显子缺少C末端的氨基酸残基，其分子量为57Kd，而且脂肪加氧酶的活性缺失。
因此，如果以发现该核酸的大麦作为原料制造麦芽酒精饮料，则如上所述，可以得到香味持久性和泡沫稳定性提高的麦芽酒精饮料。
具体实施方式
以下，通过实施例进一步说明本发明的内容，但本发明并不局限于这些实施例。
探索试验1(根据LOX-1酶活性测定的LOX-1缺失大麦的探索)
通过以下方法进行LOX-1酶活性测定，进行大麦遗传资源中LOX-1缺失大麦的探索。
首先，通过以下方法从大麦种子中提取粗酶液。用锤敲碎1粒成熟的大麦种子，用500μL抽提缓冲液(0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5))，4℃下振荡30分钟进行抽提。将得到的抽提液以15000rpm离心分离10分钟，取上清为粗酶液。
接着，向10μL粗酶液中加入5μL基质液(40mM亚油酸，1.0％(W/V)Tween20溶液)和85μL的抽提缓冲液混合后，24℃下反应5分钟。反应中止通过加入100μL反应中止液(80mM 2，6-二-叔丁基-p-甲酚的甲醇溶液)混合实现。将反应液在-20℃下静置30分钟后，以3000rpm离心分离20分钟，将上清用于接着的显色反应。向20μL得到的上清中加入200μL显色液(4mM 2，6-二-叔丁基-p-甲酚、25mM硫酸、0.25mM硫酸铵铁(II)6水合物、100mM二甲酚橙、90％甲醇水溶液)，静置30分钟后，测定550nm波长的吸光度。作为阴性对照，将粗酶液以100℃热处理5分钟，使LOX-1失活了的粗酶液作同样的反应；作为阳性对照，使用大麦品种Kendall种子的粗酶液。
遗传资源的探索结果，如图1所示，发现SBOU2的种子中没有明显的LOX-1活性。该SBOU2为已有品种，所以不是进行人工诱变得到的系，而是自然突变体。
证明试验1(SBOU2粗酶液中没有LOX-1抑制活性的确认)
接着，对SBOU2粗酶液中LOX-1抑制活性的有无进行考察。
向表现LOX-1活性的粗酶液(阳性对照：PC)中加入SBOU2的粗酶液(10μL、20μL、50μL)，考察LOX-1活性的变化，即使加入SBOU2的粗酶液LOX-1活性也没有变化，确认SBOU2粗酶液中没有LOX-1抑制活性(图2)。由此，认为SBOU2的LOX-1活性缺失的原因不是因为存在LOX活性抑制物质。
证明试验2(SBOU2种子中的LOX-1蛋白表达量的确认)
接着，使用抗LOX-1抗体，考察SBOU2种子中LOX-1蛋白是否表达。
首先，进行抗LOX-1抗体的制作。作为抗原的LOX-1蛋白是通过纯化在大肠杆菌内表达的LOX-1蛋白得到的(Kuroda et.al.(2002)J.Bioscience andBioengineering 93：73-77)。将纯化的蛋白给兔免疫，制作LOX-1抗体。本抗体识别LOX-1和LOX-2。
接着，用以下方法进行Western蛋白质印迹，就SBOU2种子中LOX-1蛋白的表达进行考察。将3μg从SBOU2中用0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.5)抽提的总可溶性蛋白质通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，在PVDF膜(ミリポア公司制)上印迹。将该膜用TTBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.15M氯化钠、0.05％(w/v)Tween20、0.05％(w/v)叠氮化钠)洗涤后，用LOX-1抗体液(1000倍稀释/TTBS)反应30分钟。将膜用TTBS洗涤3次每次5分钟后，用碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG抗体液(Santa Cruz公司制，1000倍稀释TTBS溶液)反应30分钟。将膜用TTBS洗涤2次每次5分钟后，再用AP9.5(10mMTris-HCl(pH9.5)、0.1M氯化钠、5mM氯化镁)洗涤5分钟后，与碱性磷酸酶基质液(1mg/ml硝基四氮唑蓝、0.5mg/ml BCIP、AP9.5溶液)反应显色。结果，对照品种(Kendall)中得到具有约95Kd分子量的强带，而SBOU2系种子中则在约95Kd和约57Kd的分子量区域内检出非常弱的带(图3A)。
此外，将该抽提样本用PhastSystem(Amersham Pharmacia公司制)进行等电电泳(IEF，pI 3-9)后，同样作蛋白质印迹分析。结果，SBOU2中LOX-2的pI位置上检出条带，而LOX-1的pI位置上没有发现明显的条带(图3B)。由此，可以认为用SBOU2种子的提取蛋白质得到的约95Kd的条带是LOX-2蛋白的条带。
由以上结果，确认SBOU2的种子中正常的LOX-1蛋白几乎没有表达。
证明试验3(SBOU2种子的LOX-1RNA分析)
将从SBOU2的开始成熟约第4周的种子和发芽第3天的种子中提取的总RNA作为模板进行RT-PCR。反应使用市场上销售的药盒(ロシユダイアグノステイツク公司制、パ一キンエルマ一公司制)，按照药盒的操作手册进行。引物以已知的序列(DNA数据库(Data Bank)：登录号L35931)为基础，设计为5’-GGAGAGGAGGCCAAGAACAAGATG-3’(序列编号3)和5’-GGTTGCCGATGGCTTAGAT-3’(序列编号4)。PCR先94℃2分钟1次，再以94℃1分钟、60℃2分钟、72℃4分钟重复31个循环后，进行72℃下7分钟的延伸反应。
将扩增了的DNA进行电泳，虽然比对照(品种Kendall)少了一些扩增量，但对于成熟中和发芽中的RNA，检出约2.5Kb的条带的扩增(图4)。这表明LOX-1基因被正常转录。
以上，从SBOU2的种子中，(1)没有发现LOX-1活性；(2)与LOX-1抗体反应的抗原蛋白质仅微量存在；(3)发现约57Kd分子量的蛋白质的存在；(4)发现LOX-1的mRNA等方面，可以认为SBOU2的LOX-1活性缺失的现象是由转录以后的异常引起的。
证明试验4(SBOU2的LOX-1基因内含子区域的结构分析)
为了分析LOX-1基因内含子和外显子区域的结构，分离了含有全部外显子区域的基因组DNA。使用SBOU2的总DNA作为模板。引物为以已知的序列(DNA数据库：登录号U83904、L35931)为基础设计(5’-GGTTGCCGATGGCTTAGAT-3’(序列编号4)、5’-CACGTCGCCGTCCGATCCATC-3’(序列编号5))。PCR以94℃1分钟、65℃2分钟、72℃3分钟的反应重复31个循环后，进行72℃下7分钟的延伸反应。将得到的DNA片断克隆到pCR2.1中(pGLXABAL1)，作为结构分析的模板。结构分析使用ABI公司的测序仪(sequencer)，序列反应使用染料终止子法(dye terminator method)。整个结构记载在序列表的序列编号11。
序列表的序列编号1表示已知的LOX-1基因的碱基序列(WO 02053721)中第5内含子区域的结构。剪切位点为第60-61位碱基序列5’-GT-3’。
另一方面，从分析的结果知道的SBOU2对应区域的碱基序列记载于序列编号2。可以知道SBOU2中剪切位点第60位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤。
此外，由于序列编号2的第60位碱基突变为腺嘌呤，终止密码子重新形成(序列表序列编号2的第58-60位碱基序列5’-TGA-3’)，可以认为在剪切位点5’的上游没有发生变化的情况下LOX-1蛋白的翻译在这里中止(图5)。
已知第5内含子旁的外显子区域是植物LOX的活性中心(Shibata andAxelrod(1995)J.Lipid Mediaters and Cell Signaling 12：213-228)，所以可以认为上述剪切异常对LOX-1酶活性有较大影响。
证明试验5(第5内含子中剪切的分析)
为了确认在第5内含子中确实发生剪切异常，进行了通过RT-PCR的分析。
从发芽中的SBOU2和Kendall中提取总RNA，用市场上销售的药盒(ロシユダイアグノステイツク公司制)，合成cDNA作为模板DNA。在基因组DNA中，使用使扩增片断含有第3内含子(106bp)、第4内含子(132bp)和第5内含子(79bp)而设计的2种引物(5’-CCATCACGCAGGGCATCCTG-3’(序列表序列编号6)、5’-GCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3’(序列表序列编号7))进行PCR。PCR以94℃1分钟、65℃2分钟、72℃3分钟的反应重复31个循环后，进行72℃下7分钟的延伸反应。将扩增了的DNA片断进行琼脂糖凝胶电泳，SBOU2的扩增片断比Kendall的扩增片断要多约80bp碱基(图6A)。对于SBOU2的基因组DNA，扩增出约1.2Kb的片断，上述RT-PCR的结果，可以认为是对于表达的RNA的结果。
接着，为了考察第3内含子(106bp)、第4内含子(132bp)和第5内含子(79bp)中是否有某一个内含子发生剪切异常，将上述扩增片断在位于第4内含子(132bp)和第5内含子之间的外显子区域的限制性酶StuI位点进行消化。结果，含有第5内含子的DNA片断与基因组DNA的扩增片断的移动幅度相同，所以了解到第5内含子的剪切发生异常，没有被剪切，或者剪切位点在3’侧发生错位(图6B)。即，了解到由于图5所示的新产生的终止密码子，SBOU2的LOX-1蛋白的翻译在该密码子处终止了，而导致LOX-1活性缺失。
证明试验6(SBOU2的LOX-1 cDNA的结构分析)
为了了解来自SBOU2的LOX-1的结构，用与上述同样的方法分离cDNA。扩增使用包含BamH I位点和起始密码子的引物(5’-GGATCCATGCTGCTGGGAGGGCTG-3’(序列编号8))及使其含HindII位点和终止密码子的引物(5’-AAGCTTTTAGATGGAGATGCTGTTG-3’(序列编号9))。将扩增了的片断克隆到pT7 Blue T-Vector(Novagen)(pBDC1)后，进行结构分析。结构分析的结果，得到的cDNA的碱基序列记载于序列编号10。了解到本cDNA克隆含有第5内含子整个区域(序列编号10的第1554位到第1632位)。
证明试验7(大肠杆菌的转化和表达诱导)
为了使SBOU2和来自具有野生型LOX-1的品种Steptoe的LOX-1在大肠杆菌中表达，将来自Steptoe的cDNA也与上述同样分离，并克隆(pSDC1)。从pSDC1和pBDC1这两个克隆中分别酶切BamH I-HindIII片断，分别插入在大肠杆菌表达载体pQE80L(Qiagen)的BamHI-HindIII位点得到的片断，作为大肠杆菌表达载体(pSQE1(插入Steptoe的cDNA)、pBQE1(插入SBOU2的cDNA))。将这些表达载体转化入大肠杆菌JMi09中后，按照Qiagen公司的手册进行由IPTG的表达诱导。结果，pSQE1/JM109中诱导表达得到约95Kd的条带，而pBQE1/JM109中诱导表达得到约57Kd的条带(图7)。此外，将这些大肠杆菌用超声波打碎后，抽提粗酶液测定LOX活性。结果，pSQE1/JM109中发现较高的LOX活性，而pBQE1/JM109中没有发现LOX的活性(图8)。这些结果显示，与SBOU2的植物体中LOX-1活性和LOX-1蛋白的分析结果完全一致，大肠杆菌中可以再现SBOU2的LOX-1缺失。
证明试验8(交换插入和表达实验)
接着，将含有pBQE1的第5内含子剪切位点的突变的Pst I-Stu I片断(StuI位点是序列编号10的第1502～1507位碱基，Pst I位点是序列编号10的第2048～2053位碱基)，与野生型pSQE1的Pst I-Stu I片断互相交换插入(pSQE1+BPS，pBQE1+SPS)，如上述同样进行在大肠杆菌中的表达诱导。结果，向pSQE1中交换插入来自含有pBQE1的第5内含子剪切位点的突变的Pst I-Stu I片断的pSQE1+BPS/JM109，与pBQE1/JM109一样，诱导得到约57Kd的蛋白质(图7)，LOX活性缺失(图8)。向pBQE1中交换插入来自pSQE1的Pst I-Stu I片断的pBQE1+SPS/JM109，与pSQE1/JM109一样，诱导得到约95Kd的蛋白质(图7)，LOX活性恢复(图8)。pBQE1的Pst I-Stu I片断的碱基序列与野生型LOX-1基因除了第5内含子剪切位点外完全相同(序列编号10的第1554位的G突变为A)。由以上结果，了解到SBOU2的第5内含子剪切位点突变的有无决定了LOX-1活性的有无。
证明试验9(使用第5内含子突变的大麦交配系的基因定位和筛选)
在已知的LOX-1碱基序列中，含有第5内含子剪切位点的序列(序列表序列编号1的第60-63位：5’-GTAC-3’)能够用识别GTAC序列的限制性酶AfaI(Rsa I)消化。另一方面，利用在SBOU2系中该区域的序列存在突变(序列表序列编号2的第60-63位：5’-ATAC-3’)，变得无法用Afa I和/或Rsa I消化(图5)，进行LOX-1缺失基因的基因定位。从大麦品种Kendall和SBOU2的杂交第2世代(F2)144个个体的叶中提取DNA，使用为了使扩增片断含有该Afa I位点而设计的2种引物(5’-CCATCACGCAGGGCATCCTG-3’(序列表序列编号6)、5’-GCGTTGATGAGCGTCTGCCG-3’(序列表序列编号7))进行PCR。PCR以94℃1分钟、65℃2分钟、72℃3分钟的反应重复31个循环后，进行72℃下7分钟的延伸反应。将扩增了的片断用Afa I剪切，用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分析(以上称为Afa I法)。结果，可以容易地区分SBOU2型、Kendall型和杂合型(图9)。除Afa I法多态调查外，还对LOX-1所在的大麦4H染色体的LOXA基因座旁的DNA标记(JBC970)进行了各系的多态调查(图10)。
接着，用这些F2个体所结的种子考察种子的LOX活性。对于没有发现LOX活性的系进一步进行多颗种子(4～7颗)的活性测定(图10)。
以上的F2世代的Afa I法多态调查和F3种子的LOX活性测定的结果，表明SBOU2的LOX-1缺失性状的分离与上述Afa I法多态的分离完全一致。即，SBOU2的LOX-1缺失基因位于LOXA基因座，通过一系列的遗传学调查被证实。
此外，该结果表明，使用作为利用DNA突变的大麦筛选法的一例的Afa I法，可以在大麦生长发育初期的叶的阶段筛选LOX-1缺失的交配系，而不必等到结出种子。
实施例1(其他大麦品种的Afa I法多态调查)
使用一般的大麦品种/系进行Afa I法多态调查。使用的品种为ミカモゴ一ルデン、ゴ一ルデンメロン、法るな二条、みようぎ二条、さきたま二条、ワ中ドリ二条、めぐりもち、ハルピン二条、りようふう、北育33号、北育35号、Prior、Schooner、Sloop、Lofty Nijo、Franklin、Betzes、Harrington、Manley、B1251、CDC Kendall、CDC Stratus、CDC Copeland、Hanna、Merit、AC Metcalfe、TR145、Chariot、Stirling、Proctor、Koral、Heartland等共计32个品种/系。Afa I法多态调查的结果，受试的这些品种不是SBOU2型，含有第5内含子剪切位点序列的限制性酶Afa I位点(序列表序列编号1的第60-63位：5’-GTAC-3’)被消化(图11)。这表明这些育成系中在Afa I位点(序列表序列编号1的第60-63位：5’-GTAC-3’)没有发现DNA突变，在交配系LOX-1缺失基因的筛选中，该Afa I法可以有效地使用。
实施例2(遗传资源的探索)
对冈山大学保存的世界大麦遗传资源(现有种)进行Afa I法的调查。结果，在新的5个系中，发现了含有第5内含子剪切位点序列的限制性酶Afa I位点(序列表序列编号1的第60-63位：5’-GTAC-3’)没有被消化的系(冈山大学保存的SBOU1、SBOU3、SBOU4、SBOU5和SBOU6)(图12)。
接着，对这些系的种子的LOX-1活性用探索试验1所记载的方法进行测定。对SBOU5和SBOU6反应5分钟进行活性测定(图13A)，对SBOU1、SBOU3和SBOU4为了能更明确活性的有无将反应时间延长到90分钟进行活性测定(图13B)。结果，这所有的系中没有发现明显的活性(图13)。
由此，明确了SBOU2同SBOU1、SBOU3、SBOU4、SBOU5和SBOU6(SBOU2型LOX-1缺失大麦)是LOX-1缺失大麦。这些系都是现有种，不是人工进行诱变的系，所以是LOX-1基因的自然突变体。
由以上结果可见，作为利用DNA突变的大麦筛选法的一例的Afa I法是，不光用于LOX-1缺失大麦的交配后代系的筛选，也能够从大麦遗传资源中有效地进行LOX-1缺失大麦的筛选的技术。
实施例3(试验酿造用大麦的培育)
将SBOU2和大麦品种大正麦交配，在将得到的杂交第1代(F1)自交得到的F2世代中，通过上述探索试验1所记载的LOX-1酶活性测定法和上述证明试验9所记载的上述Afa I法对LOX-1缺失性状进行确认，将LOX-1缺失系、LOX-1保留系作为群体，在下面的种子增殖中受试。
种子增殖在各系(群体)分别进行，在得到F4种子之前使用同样的试验田或温室进行。对于F4种子进行LOX-1酶活性测定，发现用F2个体判别的LOX-1活性的有无能够维持，由该结果知道LOX-1缺失性状被稳定地遗传给后代。
下面的麦芽制造试验和麦芽酒精饮料制造试验中，使用该F4种子受试。
实施例4(试验酿造用麦芽的制造)
生产由上述大正麦×SBOU2杂交得到的没有LOX-1活性的大麦种子得到的LOX-1缺失大麦F4群体(LOX-F4)和由具有LOX-1的大麦种子得到的LOX活性保留大麦F4群体(LOX+F4)，用于制麦。
制麦使用Automatic Micromalting System(Phenix Systems公司制)，以16℃浸麦共82小时(5小时湿/7小时干的循环)，15℃发芽139小时，烘焙干燥29小时(55℃13.5小时、65℃8小时、75℃3.5小时、83℃4小时)的条件进行。
实施例5(麦芽和麦汁的分析)
麦芽的分析按照EBC标准法(European Brewery Convention编，AnalyticaEBC(4th Ed)，1987)进行。结果，了解到使用LOX-F4和LOX+F4的麦芽在麦芽分析值上没有较大的差异，可以毫无问题地用于以比较有无LOX-1活性为目的的麦芽酒精饮料的酿造(图14)。
接着，使用50g麦芽，通过通用(congress)方法(European BreweryConvention编，Analytica EBC(4th Ed)，1987)制作麦汁，分析麦汁中的脂质氧化物。
首先，用以下方法测定麦汁中的反式-2-壬烯醛含量。将8mL麦汁样本加入管形瓶中，加入3g氯化钠，盖上盖。接着将スペルコ制的聚二甲基硅氧烷SPME纤维插入，在40℃下保温15分钟后，用于气相色谱分析。
气相色谱-质谱分析，使用J&W社制的DB-1(30m×0.25mm，膜厚1μm)作为毛细管柱，使用氦气作为载气(1mL/分钟)，加热炉条件为从60℃到225℃(5℃/分钟)，以离子选择模式(セレクトイオンモ一ド，select ion mode)(m/z：70)进行反式-2-壬烯醛的定量。定量中使用以Sigma公司制反式-2-壬烯醛作为标准样品的标准添加法。
结果，使用LOX-F4、LOX+F4制作的麦汁的反式-2-壬烯醛浓度分别为0.36ppb和3.85ppb。所以了解到，如果使用本发明所述麦芽制造麦汁，与采用以往的麦芽的情况相比，可以将反式-2-壬烯醛的生成量控制到1/10以下。
此外，麦汁壬烯醛潜在含量用以下方法测定。首先，根据Drost等的方法(Drost，B.W.，van den Berg，R.，Freijee，F.J.M.，van der Velde，E.G.，and Hollemans，M.，J.Am.Soc.Brew.Chem.，48，124-131，1990)将麦汁煮沸2小时。然后，按照上述的反式-2-壬烯醛的测定方法测定样品中反式-2-壬烯醛的含量，算出麦汁中的壬烯醛潜在含量。
结果，使用LOX-F4、LOX+F4制作的麦汁的壬烯醛潜在含量分别为2.74ppb和11.9ppb。已知壬烯醛潜在含量可以作为预测产品老化的指标(Drost，B.W.，et al.，J.Am.Soc.Brew.Chem.，48，124-131，1990；Ueda et.al.(2001)EBC-proceedings 55：p3 28th Congress)，如果使用由本发明所述大麦制作的麦芽酿造麦芽酒精饮料，可以大大改善麦芽酒精饮料的香味持久性。
此外，将使用LOX-F4制作的麦汁的反式-2-壬烯醛浓度和壬烯醛潜在含量与用市场上销售的麦芽制作的麦汁的这些指标比较，得到图15。由图15所示结果可以知道，本发明所述麦汁显示出了以往的大麦无法达到的分析值。
由以上结果可以知道，如果使用本发明所述大麦，可以制造具有以往产品所没有的品质的麦芽。
更进一步，通过高速液相色谱-质谱分析测定麦汁中THOD的浓度。高速液相色谱的条件如下。流动相的流速为0.3mL/分钟，流动相使用0.5％乙酸(A液)和乙腈(B液)的混合液，以A液∶B液＝35∶65(0分)-A液∶B液＝5∶95(30分)的线性梯度进行。此外，柱使用ウオ一タ一ズ公司制Assymetry(No.106005；C18，3.5μm：2.1×150mm)，柱温为50℃，使用ヒユレツトパツカ一ド公司制1100型高速液相色谱系统，分离5μL麦汁或麦芽酒精饮料样品。质谱分析使用ウオ一タ一ブZQ，以ES负离子化模式(イオン化negative mode)监测质量329。THOD的标准液使用啤酒提取样本(Kobayashi，N.，et al.，J.Biosci.Bioeng.，90，69-73，2000)。
结果，使用LOX-F4、LOX+F4制作的麦汁的THOD浓度分别为6.5ppm和14.7ppm，明显地如果使用本发明所述的麦芽制造麦汁，可以将麦汁THOD浓度控制到1/2以下。
如前所述，THOD在下料步骤中，在麦芽LOX-1和类似麦芽过加氧酶的活性作用下由亚油酸变换生成，认为类似麦芽过加氧酶的活性是THOD生成的限速步骤(Kuroda，H.，et al.，J.Biosci.Bioeng.，93，73-77，2002)，所以并不清楚在减低麦芽LOX-1活性的情况下，能使THOD的生成得到何种程度的抑制。但是，根据本实施例的结果，如果使用由没有LOX-1活性的大麦种子制造的麦芽，麦汁中的THOD含量减少这一点得到了证实。THOD不经过酵母代谢便转移到最终产品中(Kobayashi，N.，et al.，J.Inst.Brew.，106，107-110(2000))，所以明显地，如果使用由本发明所述大麦得到的麦芽，可以实现香味品质和泡沫品质良好的麦芽酒精饮料的制造。
实施例6(麦芽酒精饮料的试验酿造)
1.冷麦汁的制造和分析
对上述实施例4中得到的LOX-F4麦芽和LOX+F4麦芽这两者，采用使用50L规格下料设备的汽酒方法(麦芽使用率24％)进行下料。下料条件如下。
各种麦芽分别取1.5kg用15L下料用水按照50℃，20分钟→65℃，30分钟→75℃，3分钟的流程下料，用滤板设备进行麦汁过滤，最后得到35L过滤麦汁。
将得到的过滤麦汁与5kg液糖(糖分75％)混合，加入13g啤酒花粉末(苦味分析值87.0BU(EBC))，煮沸70分钟，冷却至10℃，通过加水调整提取物，制成提取物含量11.6～11.8％的冷麦汁。
得到的冷麦汁的分析按照EBC标准法(European Brewery Convention编，Analytica EBC(4th Ed)，1987)进行。分析值记载于表1。如表1所记载，对于一般的分析项目LOX-F4和LOX+F4之间没有发现明显的差异。
〔表1〕
  品种   LOX+F4   LOX-F4
  比重   1.0475   1.0467
  提取物(％)   11.78   11.60
  实际未发酵提取物(％)   3.45   3.38
  实际最终发酵度(％)   70.7   70.9
  表观未发酵提取物(％)   1.54   1.52
  表观最终发酵度(％)   86.9   86.9
  pH   5.88   5.93
  色度(°EBC)   2.1   2.1
  BU   31.2   27.3
  总氮(mg/100mL)   24   22
  多酚(mg/L)   44   48
  FAN(mg/L)   46   51
2.麦芽酒精饮料(汽酒)的制造
将上述1中得到的冷麦汁移入经蒸气杀菌的30L规格的圆锥形发酵罐中，按初始浓度3000万个细胞/mL添加酵母，在13℃下进行主发酵。到发酵液的提取物降到2.5％时移入同型的发酵罐中进行贮酒步骤。贮酒步骤最初6天为13℃，其后2周在0℃下进行。
结束贮酒步骤的发酵液用啤酒过滤设备和灌装设备，将麦芽酒精饮料过滤，进行向瓶内的灌装。
3.麦芽酒精饮料的分析
将上述2中得到的麦芽酒精饮料如下进行分析。
首先，按照EBC标准法进行分析，对于除脂质氧化物分析值外的一般分析值，LOX-F4和LOX+F4之间没有发现明显的差异(表2)。
〔表2〕
  品种   LOX+F4   LOX-F4
  比重   1.00562   1.00565
  原麦汁提取物(％)   11.82   11.56
  实际提取物(％)   3.43   3.38
  实际发酵度(％)   71.0   70.7
  表观提取物(％)   1.44   1.45
  表观发酵度(％)   87.8   87.4
  乙醇(vol％)   5.50   5.35
  乙醇(w/w％)   4.33   4.21
  pH   3.51   3.28
  气压(20℃)kg/cm2   2.35   2.55
  色度(°EBC)   1.5   1.7
  总氮(mg/100mL)   16   19
  BU   11.6   9.5
  多酚(mg/L)   45   43
  FAN(mg/L)   10   12
接着通过以下方法对上述2中得到的麦芽酒精饮料的泡沫稳定性进行分析。
泡沫稳定性分析使用NIBEM法。使用Haffmans公司的泡沫稳定性分析器(FOAM STABILITY TESTER)分析泡沫稳定性(表3)，LOX-F4大麦与LOX+F4大麦相比，NIBEM值高出21分，证明有较高的泡沫稳定性。
此外，通过记载于上述实施例5中的方法，测定THOD浓度的结果，LOX-F4与LOX+F4相比减少到一半以下。
由以上结果知道，通过本发明的麦芽酒精饮料制造方法制造的麦芽酒精饮料可以抑制THOD的积聚，改善产品的泡沫稳定性。
〔表3〕
  品种   LOX+F4   LOX-F4
  NIBEM   239   260
  THOD(mg/L)   3.6   1.7
接着，如下进行由13人小组的感官检查，比较上述2中得到的麦芽酒精饮料的香味持久性。
首先，将LOX-F4与LOX+F4的麦芽酒精饮料在37℃下保存1周。接着，将它们在通常的饮用温度下倒入杯中供小组的感官检查，对老化气味、综合老化度(将老化气味和老化味综合的评价)这2个项目用0～4的评分(老化越厉害评分越高)进行评价(表4A、B)。
〔表4A〕
  老化气味   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   3   2
  小组成员2   1   2
  小组成员3   3   2
  小组成员4   2.5   2.5
  小组成员5   2   2
  小组成员6   2.5   2
  小组成员7   2.5   1.5
  小组成员8   2.5   1
  小组成员9   1   0.5
  小组成员10   2.5   2
  小组成员11   2   1.5
  小组成员12   2.5   2
  小组成员13   2   1.5
  平均   2.2   1.7
〔表4B〕
  综合老化度   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   2.5   2
  小组成员2   1   2
  小组成员3   3   2
  小组成员4   3   2.5
  小组成员5   2.5   2
  小组成员6   2.5   2
  小组成员7   2.5   1.5
  小组成员8   2.5   1.5
  小组成员9   1   0.5
  小组成员10   2.5   2
  小组成员11   2   1.5
  小组成员12   2.5   2.5
  小组成员13   2   1.5
  平均   2.3   1.8
结果，对于老化气味，13人中的10人给了LOX-F4较低的评分，LOX-F4与LOX+F4相比表现出较低的评分(平均值)。该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著(表4A)。
此外，对于综合老化度，13人中的11人给了LOX-F4较低的评分，LOX-F4与LOX+F4相比表现出较低的评分(平均值)。该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著(表4B)。
通过以上的感官检查和统计分析知道，LOX-F4与LOX+F4相比，老化气味减低，具有更低的综合老化度。
此外，在37℃保存1周前后测定上述2得到的麦芽酒精饮料的反式-2-壬烯醛浓度的结果，明显地，LOX-F4保存前，反式-2-壬烯醛浓度也比LOX+F4低，保存后可抑制在LOX+F4的约1/3(表5)。
〔表5〕
  反式-2-壬烯醛   LOX+F4   LOX-F4
  保存前   I.02   0.01
  保存后   0.35   0.12
                                  (单位：ppb)
以上，由感官检查的结果和麦芽酒精饮料中反式-2-壬烯醛浓度的分析结果知道，如果通过本发明的麦芽酒精饮料制造方法制造麦芽酒精饮料，可以得到香味持久性被改善的麦芽酒精饮料。
最后，对于上述2中得到的麦芽酒精饮料的浓醇度和透明度通过感官检查和脂质膜传感器进行分析。
首先，进行13人小组的感官检查，比较香味品质。将LOX-F4与LOX+F4的麦芽酒精饮料供感官检查，对浓醇度和透明度这2个项目用0～4的评分(浓醇度越高，或者透明度越好，评分越高)进行评价(表6)。
对于浓醇度，LOX-F4与LOX+F4没有显著差异(5％的显著性水平)(表6A)。
对于透明度，13人中的8人给了LOX-F4较高的评分(表6B)。此外，LOX-F4与LOX+F4相比表现出较高的评分(平均值)，该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著。
由以上结果知道，如果使用LOX-F4制造麦芽酒精饮料，对浓醇度没有影响，而可以改善透明度。
〔表6A〕
  浓醇度   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   2   1
  小组成员2   3   2
  小组成员3   3   2.5
  小组成员4   3.5   3.5
  小组成员5   3   3
  小组成员6   2   2
  小组成员7   2   2
  小组成员8   3   2
  小组成员9   3   2
  小组成员10   2.5   2.5
  小组成员11   3   2
  小组成员12   2   3
  小组成员13   2   3
  平均   2.6   2.3
〔表6B〕
  透明度   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   1   2
  小组成员2   1   3
  小组成员3   1.5   3
  小组成员4   3   3
  小组成员5   1   1
  小组成员6   2   2
  小组成员7   2   3
  小组成员8   1.5   3
  小组成员9   1   2
  小组成员10   1.5   2
  小组成员11   2   3
  小组成员12   3   2
  小组成员13   3   2
  平均   1.8   2.4
更进一步，通过金田等的方法(Kaneda，H.et al.，J.Biosci.Bioeng.，92，221-226，2001)，用脂质膜传感器评价产品的浓醇度和透明度(表7)。
浓醇度通过被脂质膜的吸附性评价，结果LOX-F4与LOX+F4没有统计的显著差异(5％显著性水平)(表7A)。
另一方面，透明度通过脂质膜上的残存性评价(透明度越差表现越高的残存性)，LOX-F4与LOX+F4相比显示出约1/4的残存性，在1％的显著性水平下认为有显著差异(表7B)。
〔表7A〕
  浓醇度   吸附性   标准差
  LOX+F4   189   4
  LOX-F4   187   3
(单位：Hz。在5％显著性水平下没有显著差异)
〔表7B〕
  透明度   残存性   标准差
  LOX+F4   12   3
  LOX-F4   3   3
(单位：Hz。5％显著性水平下具有显著差异)
目前为止，没有见到麦芽LOX-1活性和下料步骤中THOD生成量相关的报道(Kobayashi，N.et al.，(2000).J.Biosci.Bioeng.90：69-73)，所以不清楚通过抑制麦芽LOX-1对THOD生成有何种程度的抑制。此外，抑制的结果最终是否能改善透明度，在已有技术中没有预想到。但是，通过本实施例使用感官检查结果和脂质膜传感器得到的产品的浓醇度和透明度的分析结果首次证实了，如果使用用了本申请的基因的麦芽，可以对产品的浓醇度没有影响，而改善产品的透明度。
实施例7(使用大麦加工产物的麦芽酒精饮料试验酿造)
1.冷麦汁的制造和分析
使用上述实施例3中得到的系的后代LOX-F5和LOX+F5的大麦加工产物作为辅助原料，采用使用50L规格下料设备的汽酒方法(麦芽使用率24％，大麦加工产物使用率76％)进行下料。下料条件如下。
将1.2kg市场上销售的啤酒酿造用麦芽和3.8kg各种大麦加工产物用20L下料用水按照50℃，30分钟→65℃，60分钟→75℃，3分钟的流程下料(因为大麦加工产物使用比例高，下料时和d淀粉酶、β葡聚糖酶等酶制剂一起使用)，用滤板设备进行麦汁过滤，最后得到40L过滤麦汁。
将得到的过滤麦汁中加入53g啤酒花粉末(苦味分析值25.6BU(EBC))，煮沸80分钟，冷却至10℃，通过加水调整提取物，制成提取物含量7.5～7.6％的冷麦汁。
得到的冷麦汁的分析按照EBC标准法进行。分析值记载于表8。如表8所记载，对于一般的分析项目LOX-F5和LOX+F5之间没有发现明显的差异。
〔表8〕
  品种   LOX+F5   LOX-F5
  比重   1.0303   1.0296
  提取物(％)   7.63   7.46
  实际未发酵提取物(％)   2.00   2.06
  实际最终发酵度(％)   73.8   72.4
  表观未发酵提取物(％)   0.67   0.71
  表观最终发酵度(％)   91.2   90.5
  pH   5.69   5.71
  色度(°EBC)   5.7   6.5
  BU   31.7   30.9
  总氮(mg/100mL)   45   47
  多酚(mg/L)   159   137
  FAN(mg/L)   72   72
2.麦芽酒精饮料(汽酒)的制造
将上述1中得到的冷麦汁移入经蒸气杀菌的30L规格的圆锥形发酵罐中，按初始浓度3000万个细胞/mL添加酵母，在15℃下进行主发酵。到发酵液的提取物降到1.3％时移入同型的发酵罐中进行贮酒步骤。贮酒步骤最初5天为13℃，其后2周在0℃下进行。
结束贮酒步骤的发酵液用啤酒过滤设备和灌装设备，将麦芽酒精饮料过滤，进行向瓶内的灌装。
3.麦芽酒精饮料的分析
将上述2中得到的麦芽酒精饮料如下进行分析。
首先，按照EBC标准法进行分析，对于除脂质氧化物分析值外的一般分析值，LOX-F5和LOX+F5之间没有发现明显的差异(表9)。
〔表9〕
  品种   LOX+F5   LOX-F5
  比重   1.00307   1.00338
  原麦汁提取物(％)   7.77   7.60
  实际提取物(％)   2.11   2.14
  实际发酵度(％)   73.7   72.7
  表观提取物(％)   0.79   0.87
  表观发酵度(％)   89.9   88.6
  乙醇(vol％)   3.62   3.49
  乙醇(w/w％)   2.86   2.75
  pH   4.58   4.59
  气压(20℃)kg/cm2   2.29   2.38
  色度(°EBC)   4.0   4.2
  总氮(mg/100mL)   28   27
  BU   16.8   15.3
  多酚(mg/L)   111   91
  FAN(mg/L)   16   16
接着通过以下方法对上述2中得到的麦芽酒精饮料的泡沫稳定性进行分析。
泡沫稳定性分析使用NIBEM法。使用Haffmans公司的泡沫稳定性分析器分析泡沫稳定性(表10)，LOX-F5大麦与LOX+F5大麦相比，NIBEM值高出17分，证明有较高的泡沫稳定性。
此外，通过记载于上述实施例5中的方法，测定麦芽酒精饮料中THOD浓度的结果，LOX-F5与LOX+F5相比减少到一半以下。
由以上结果知道，通过本发明的麦芽酒精饮料制造方法制造的麦芽酒精饮料可以抑制THOD的积聚，改善产品的泡沫稳定性。
〔表10〕
  品种   LOX+F5   LOX-F5
  NIBEM   279   296
  THOD(峰的面积比)   728   237
        ※THOD的值是以内部标准物质的峰的面积为100的相对值
接着，如下进行由13人小组的感官检查，比较上述2中得到的麦芽酒精饮料的香味持久性。感官检查的具体方法与实施例6所记载的方法相同。
结果，对于老化气味，13人中的11人给了LOX-F5较低的评分，LOX-F5与LOX+F5相比表现出较低的评分(平均值)。该差用t检验以5％的置信度显著性水平判断为显著(表11A)。
此外，对于综合老化度，13人中的12人给了LOX-F5较低的评分，LOX-F5与LOX+F5相比表现出较低的评分(平均值)，该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著(表11B)。
〔表11A〕
  老化气味   LOX+F5   LOX-F5
  小组成员1   2   1.5
  小组成员2   3   2
  小组成员3   3   2
  小组成员4   2   1.5
  小组成员5   3   2
  小组成员6   2   1
  小组成员7   2.5   3
  小组成员8   2   1
  小组成员9   2.5   2
  小组成员10   2   1
  小组成员11   3   2
  小组成员12   2.5   1.5
  小组成员13   2   3
  平均   2.4   1.8
〔表11B〕
  综合老化度   LOX+F5   LOX-F5
  小组成员1   2   1.5
  小组成员2   3   1
  小组成员3   3.5   1.5
  小组成员4   2   1.5
  小组成员5   3   2
  小组成员6   2   1
  小组成员7   2.5   3
  小组成员8   2   1
  小组成员9   3   2
  小组成员10   2   1
  小组成员11   3   2
  小组成员12   2.5   1.5
  小组成员13   3   1.5
  平均   2.6   1.6
通过以上的感官检查和统计分析知道，LOX-F5与LOX4F5相比，老化气味减低，具有更低的综合老化度。
此外，由在37℃保存1周前后测定上述2得到的麦芽酒精饮料的反式-2-壬烯醛浓度的结果了解到，LOX-F5保存前的反式-2-壬烯醛浓度与LOX+F5相同，保存后抑制在LOX+F5的约1/2(表12)。
〔表12〕
  反式-2-壬烯醛   LOX+F5   LOX-F5
  保存前   0.06   0.06
  保存后   0.16   0.09
                                  (单位：ppb)
实施例8(麦芽酒精饮料试验酿造)
1.冷麦汁的制造和分析
使用以上述实施例4中同样方法得到的LOX-F4大麦和LOX+F4大麦制作的麦芽这两者，采用使用50L规格下料设备的汽酒方法(麦芽使用率71％)进行下料。下料条件如下。
将5.0kg上述的试验麦芽和总计2.0kg的辅助原料(玉蜀黍淀粉、玉米粉、碎米)用23L下料用水按照50℃，20分钟→65℃，40分钟→75℃，3分钟的流程下料，用滤板设备进行麦汁过滤，最后得到40L过滤麦汁。
向得到的过滤麦汁加入40g啤酒花粉末(苦味分析值44.9BU(EBC))，煮沸90分钟，冷却至10℃，通过加水调整提取物，制成提取物含量10.8～11.1％的冷麦汁。
〔表13〕
  品种   LOX+F4   LOX-F4
  比重   1.0444   1.0433
  提取物(％)   11.05   10.79
  实际未发酵提取物(％)   3.05   3.05
  实际最终发酵度(％)   72.4   71.7
  表观未发酵提取物(％)   1.25   1.31
  表观最终发酵度(％)   88.7   87.9
  pH   5.71   5.68
  色度(°EBC)   6.3   6.5
  BU   38.0   38.2
  总氮(mg/100mL)   77   78
  多酚(mg/L)   150   147
  FAN(mg/L)   153   148
得到的冷麦汁的分析按照EBC标准法进行。分析值记载于表13。如表13所记载，对于一般的分析项目LOX-F4和LOX+F4之间没有发现明显的差异。
2.麦芽酒精饮料(啤酒)的制造
将上述1中得到的冷麦汁移入经蒸气杀菌的30L规格的圆锥形发酵罐中，按初始浓度1500万个细胞/mL添加酵母，在10.5℃下进行主发酵。到发酵液的提取物降到2.5％时移入同型的发酵罐中进行贮酒步骤。贮酒步骤最初8天为8℃，其后2周在0℃下进行。
结束贮酒步骤的发酵液用啤酒过滤设备和灌装设备，将麦芽酒精饮料过滤，进行向瓶内的灌装。
3.麦芽酒精饮料的分析
通过以下方法对上述2中得到的麦芽酒精饮料的泡沫稳定性进行分析。泡沫稳定性采用NIBEM法。使用Haffmans公司的泡沫稳定性分析器(FOAMSTABILITY TESTER)分析泡沫稳定性(表14)，LOX-F4大麦与LOX+F4大麦相比，NIBEM值高出30分，证明有较高的泡沫稳定性。
此外，通过记载于上述实施例5中的方法，测定麦芽酒精饮料中的THOD浓度的结果，LOX-F4与LOX+F4相比减少到一半以下。
由以上结果知道，通过本发明的麦芽酒精饮料制造方法制造的麦芽酒精饮料可以抑制THOD的积聚，改善产品的泡沫稳定性。
〔表14〕
  品种   LOX+F4   LOX-F4
  NIBEM   273   303
  THOD(峰的面积比)   499   221
       ※THOD的值是以内部标准物质的峰的面积为100的相对值
接着，如下进行由13人小组的感官检查，比较上述2中得到的麦芽酒精饮料的香味持久性。感官检查的具体方法与实施例6所记载的方法相同。
结果，对于老化气味，13人中的11人给了LOX-F4较低的评分，LOX-F4与LOX+F4相比表现出较低的评分(平均值)。该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著(表15A)。
此外，对于综合老化度，13人中的12人给了LOX-F4较低的评分，LOX-F4与LOX+F4相比表现出较低的评分(平均值)，该差用t检验以5％的显著性水平判断为显著(表15B)。
通过以上的感官检查和统计分析知道，LOX-F4与LOX+F4相比，老化气味减低，具有更低的综合老化度。
〔表15A〕
  老化气味   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   2.5   2
  小组成员2   3   3.5
  小组成员3   3.5   2
  小组成员4   2.5   2
  小组成员5   1.5   1
  小组成员6   3   1
  小组成员7   2.5   3
  小组成员8   3   2
  小组成员9   2   1.5
  小组成员10   2   1
  小组成员11   3   1.5
  小组成员12   1.5   1
  小组成员13   2   1
  平均   2.5   1.7
〔表15B〕
  综合老化度   LOX+F4   LOX-F4
  小组成员1   3   2
  小组成员2   3   3.5
  小组成员3   3   1.5
  小组成员4   2.5   2
  小组成员5   1.5   1
  小组成员6   3   1
  小组成员7   3   2.5
  小组成员8   3   2
  小组成员9   2   1
  小组成员10   2   1
  小组成员11   3   1
  小组成员12   1.5   1
  小组成员13   2   1
  平均   2.5   1.6
以上，由感官检查的结果和麦芽酒精饮料中反式-2-壬烯醛浓度的分析结果知道，如果通过本发明的麦芽酒精饮料制造方法制造麦芽酒精饮料，可以得到香味持久性被改善的麦芽酒精饮料。
产业上的可应用性
本发明能够提供，不通过基因操作而能够用于制造香味持久性和泡沫稳定性得到改善的麦芽酒精饮料的LOX-1突变基因、LOX-1缺失大麦的筛选方法、由经筛选得到的大麦而来的麦芽酒精饮料用原料和使用所述麦芽酒精饮料用原料的麦芽酒精饮料的制造方法。
                          序列表
<110>札幌啤酒株式会社(SAPPORO BREWERIES LTD.)
<120>大麦脂肪加氧酶-1基因、大麦的筛选方法、麦芽酒精饮料用原料及麦芽酒精饮料的制造方法
<130>FP04-0052
<150>JP 2003-083924
<151>2003-03-25
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>240
<212>DNA
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400>1
ctcgccaagg cctacgtcgc cgtcaatgac tccgggtggc accagctcgt cagccactgg    60
tacgttctcc acggtcgatg tgattcagtc agtcgatgca caacaactga tcgaaatatg    120
attgattgaa acgcgcaggc tgaacactca cgcggtgatg gagccgttcg tgatctcgac    180
gaaccggcac cttagcgtga cgcacccggt gcacaagctg ctgagcccgc actaccgcga    240
<210>2
<211>240
<212>DNA
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400>2
ctcgccaagg cctacgtcgc cgtcaatgac tccgggtggc accagctcgt cagccactga    60
tacgttctcc acggtcgatg tgattcagtc agtcgatgca caacaactga tcgaaatatg    120
attgattgaa acgcgcaggc tgaacactca cgcggtgatg gagccgttcg tgatctcgac    180
gaaccggcac cttagcgtga cgcacccggt gcacaagctg ctgagcccgc actaccgcga    240
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
ggagaggagg ccaagaacaa gatg                                             24
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>4
ggttgccgat ggcttagat                                                   19
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
cacgtcgccg tccgatccat c                                                21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
ccatcacgca gggcatcctg                                                  20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
gcgttgatga gcgtctgccg                                                  20
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含BamHI位点的LOX-1的引物
<400>8
ggatccatgc tgctgggagg gctg                                             24
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>含HindIII位点的LOX-1的引物
<400>9
aagcttttag atggagatgc tgttg                                            25
<210>10
<211>2668
<212>DNA
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400>10
atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag    60
ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc    120
atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc    180
gccgtcgacc aagacaacgg cggtcgcggg aaggtgggcg cggaggcgga gctggagcag    240
tgggtgacga gcctgccgtc gctgacgacg ggggagtcca agttcggcct caccttcgac    300
tgggaggtgg agaagctcgg ggtgccgggc gccatcgtcg tcaacaacta ccacagctcc    360
gagttcctgc ttaaaaccat caccctccac gacgtccccg gccgcagcgg caacctcacc    420
ttcgtcgcca actcatggat ctaccccgcc gccaactacc gatacagccg cgtcttcttc    480
gccaacgaca cgtacctgcc gagccagatg ccggcggcgc tgaagccgta ccgcgacgac    540
gagctccgga acctgcgtgg cgacgaccag cagggcccgt accaggagca cgaccgcatc    600
taccgctacg acgtctacaa cgacctcggc gagggccgcc ccatcctcgg cggcaactcc    660
gaccaccctt acccgcgccg cggccgcacg gagcgcaagc ccaacgccag cgacccgagc    720
ctggagagcc ggctgtcgct gctggagcag atctacgtgc cgcgggacga gaagttcggc    780
cacctcaaga cgtccgactt cctgggctac tccatcaagg ccatcacgca gggcatcctg    840
ccggccgtgc gcacctacgt ggacaccacc cccggcgagt tcgactcctt ccaggacatc    900
atcaacctct atgagggcgg catcaagctg cccaaggtgg ccgccctgga ggagctccgt    960
aagcagttcc cgctccagct catcaaggac ctcctccccg tcggcggcga ctccctgctt    1020
aagctccccg tgccccacat catccaggag aacaagcagg cgtggaggac cgacgaggag    1080
ttcgcacggg aggtgctcgc cggcgtcaac ccggtcatga tcacgcgtct cacggagttc    1140
ccgccaaaaa gtagtctgga ccctagcaag tttggtgacc acaccagcac catcacggcg    1200
gagcacatag agaagaacct cgagggcctc acggtgcagc aggcgctgga aagcaacagg    1260
ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg    1320
cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc ctcttcttcc tgcgcggcga cggcaggctc    1380
acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc atcatccagg gcggccttac cacggccaag    1440
agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc    1500
aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg tggcaccagc tcgtcagcca ctgatacgtt    1560
ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga tgcacaacaa ctgatcgaaa tatgattgat    1620
tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt gatggagccg ttcgtgatct cgacgaaccg    1680
gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa gctgctgagc ccgcactacc gcgacaccat    1740
gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct catcaacgcc ggcggcatct tcgagatgac    1800
ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat gtcggccgtg gtgtacaagg actggaagtt    1860
caccgagcag ggactgccgg acgatctcat caagaggggc atggcggtgg aggacccgtc    1920
gagcccgtac aaggtgcggt tgctggtgtc ggactacccg tacgcggcgg acgggctggc    1980
gatctggcac gccattgagc agtacgtgag cgagtacctg gccatctact acccgaacga    2040
cggcgtgctg cagggcgata cggaggtgca ggcgtggtgg aaggagacgc gcgaggtcgg    2100
gcacggcgac ctcaaggacg ccccatggtg gcccaagatg caaagtgtgc cggagctggc    2160
caaggcgtgc accaccatca tctggatcgg gtcggcgctg catgcggcag tcaacttcgg    2220
gcagtacccc tacgcggggt tcctcccgaa ccggccgacg gtgagccggc gccgcatgcc    2280
ggagcccggc acggaggagt acgcggagct ggagcgcgac ccggagcggg ccttcatcca    2340
caccatcacg agccagatcc agaccatcat cggcgtgtcg ctgctggagg tgctgtcgaa    2400
gcactcctcc gacgagctgt acctcgggca gcgggacacg ccggagtgga cctcggaccc    2460
aaaggccctg gaggtgttca agcggttcag cgaccggctg gtggagatcg agagcaaggt    2520
ggtgggcatg aaccatgacc cggagctcaa gaaccgcaac ggcccggcta agtttcccta  2580
catgctgctc taccccaaca cctccgacca caagggcgcc gctgccgggc ttaccgccaa  2640
gggcatcccc aacagcatct ccatctaa                                     2668
<210>11
<211>4393
<212>DNA
<213>大麦(Hordeum vulgare)
<400>11
cacgtcgccg tccgatccat ctctccaaag ccgagcgcca caccaccggg accggacccg    60
gaccggccta taaattgccc ggaccgagct gcaagcagct cctcacacac actcacgcaa    120
cacacatcca tcttcactga aaagtgaaaa acagtgtgct ggtgccattg gttggagcag    180
tgaaagcgag gagaggaggc caagaacaag atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc    240
acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg    300
ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag    360
ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct    420
ccggccttct cctctgttta caagatatag tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg    480
atggatggat gtgtctggat cggctaaaga agataggata gctagccctg gccggtcgtc    540
tttacctgag catgggcata tgccatcgaa aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc    600
gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac    660
gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa    720
ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca caatcagcag gctataaaca gttgtcatca    780
aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac    840
cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc aagcagggta cgtggcatgt atagttcttg    900
taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg    960
ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga    1020
cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg    1080
gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc    1140
acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg    1200
ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta    1260
ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc    1320
aggacaatag atgatgagct aggagtggtt accacttagc agtacgtaca ttatttattc    1380
cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc    1440
accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga aaataactgt tgcacggatc cacccacatg    1500
attgttttca tgaataaact ttttaaggat gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca    1560
taattattgc ataccaaaac gattaaatta agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca    1620
catatctcga cgtaagatca atgatatagt atttagatat gcaatattta tcttacatct    1680
aaacctttct tcattcctaa atataagaca tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg    1740
aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt cattatgtag tctataataa aatctttaaa    1800
agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa aacataactt tttaatagta atgttgcacg    1860
gctccacact cgcagacgta cctgccgagc cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc    1920
gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac    1980
cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc    2040
aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac    2100
ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag    2160
ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc    2220
atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac accacccccg gcgagttcga ctccttccag    2280
gacatcatca acctctatga gggcggcatc aagctgccca aggtggccgc cctggaggag    2340
ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc    2400
ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac    2460
gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg    2520
gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga    2580
tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa    2640
aagtagtctg gaccctagca agtttggtga ccacaccagc accatcacgg cggagcacat    2700
agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca    2760
actatgattt acctaggagt aattggtagc tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat    2820
ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa    2880
caggctgtac atccttgatc accatgaccg gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa    2940
cctgcccggc aacttcatct acgccacgag gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag    3000
gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc    3060
caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct    3120
cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc cgggtggcac cagctcgtca gccactgata    3180
cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat    3240
tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga    3300
accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca    3360
ccatgaccat caacgcgctg gcgcggcaga cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga    3420
tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga    3480
agttcaccga gcagggactg ccggacgatc tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt    3540
atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg    3600
caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga    3660
ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga    3720
gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc    3780
gtggtggaag gagacgcgcg aggtcgggca cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc    3840
caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc    3900
ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg    3960
gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga    4020
gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg    4080
cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg    4140
ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga    4200
ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa    4260
ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa    4320
gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg catccccaac agcatctcca tctaatttaa    4380
gccatcggca acc                                                       4393

Claims (13)

1.大麦脂肪加氧酶-1突变基因，其特征在于，大麦脂肪加氧酶-1基因的第五内含子剪切位点(5’-GT-3’)的鸟嘌呤突变成其他碱基。
2.如权利要求1所述的大麦脂肪加氧酶-1突变基因，其特征在于，所述其他碱基是腺嘌呤。
3.大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦的筛选方法，其特征在于，通过大麦脂肪加氧酶-1基因的第五内含子剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦。
4.如权利要求3所述的大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦的筛选方法，其特征在于，所述其他碱基是腺嘌呤。
5.如权利要求3或4所述的大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦的筛选方法，其特征在于，包括
从被检对象大麦提取基因组DNA的基因组DNA提取步骤；
从提取的基因组DNA扩增含有大麦脂肪加氧酶-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断的DNA片断扩增步骤；
将所述DNA片断扩增步骤中扩增的含有大麦脂肪加氧酶-1基因第五内含子剪切位点的DNA片断用限制性酶酶切，检测指定碱基数的DNA片断，通过剪切位点的鸟嘌呤是否突变成其他碱基来判别大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦的DNA片断检测步骤。
6.如权利要求5所述的大麦脂肪加氧酶-1缺失大麦的筛选方法，其特征在于，所述DNA片断检测步骤中使用的限制性酶是识别碱基序列5’-GTAC-3’的Afa I和/或Rsa I。
7.麦芽酒精饮料用原料，其特征在于，它是由具有权利要求1或2所述的大麦脂肪加氧酶-1突变基因的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。
8.麦芽酒精饮料用原料，其特征在于，它是由通过权利要求3～6中任一项所述的筛选方法筛选出的大麦得到的种子、麦芽、麦芽提取物、大麦分解产物或大麦加工产物。
9.麦芽酒精饮料的制造方法，其特征在于，使用权利要求7或8所述的麦芽酒精饮料用原料。
10.核酸，其特征在于，由序列编号10的第1～1554位碱基所表示的碱基序列构成。
11.核酸，其特征在于，由序列编号11所表示的碱基序列构成。
12.核酸，其特征在于，由序列编号11所表示的碱基序列构成的核酸中含第3178位碱基的10～60位连续碱基构成。
13.检测大麦中大麦脂肪加氧酶-1活性存在与否的方法，其特征在于，包括从大麦样本中分离基因组DNA的步骤；
和检测序列编号11所表示的碱基序列的第3178位碱基，将该碱基的存在作为该大麦的大麦脂肪加氧酶-1活性存在指标的步骤。
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CN103907989A (zh) * 2012-12-31 2014-07-09 三得利控股株式会社 赋予了味道的收敛感的无酒精啤酒味饮料
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4113795B2 (ja) * 2003-03-25 2008-07-09 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
US7420105B2 (en) 2004-03-11 2008-09-02 Carlsberg A/S Barley for production of flavor-stable beverage
KR100808932B1 (ko) * 2006-08-11 2008-03-07 재단법인서울대학교산학협력재단 대두의 리폭시게나아제 ２에 존재하는 유전적 마커
JP2008109859A (ja) * 2006-10-27 2008-05-15 Asahi Breweries Ltd フィルタ再生装置
JP4178176B2 (ja) * 2007-10-29 2008-11-12 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
MY187926A (en) 2008-12-03 2021-10-29 Heineken Supply Chain Bv Barley and malt-derived beverages with low dms levels
US9587210B2 (en) 2008-12-03 2017-03-07 Carlsberg Breweries A/S Energy saving brewing method
SA109310019B1 (ar) 2008-12-30 2014-09-10 Carlsberg Breweries As شعير له نشاط ليبوأوكسجيناز منخفض
CN101776666B (zh) * 2010-02-04 2012-12-26 四川农业大学 一种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法及应用
CA2801142C (en) 2010-06-03 2019-04-30 Heineken Supply Chain B.V. Energy saving brewing method
AU2016280266B2 (en) 2015-06-19 2020-05-21 Arcadia Biosciences, Inc. Wheat with reduced lipoxygenase activity
JP6901233B2 (ja) * 2015-10-30 2021-07-14 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の呈味改善方法
JP2017123837A (ja) * 2016-01-07 2017-07-20 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の渋味改善剤及びマイルドさ改善剤、並びにビールテイスト飲料の渋味改善方法及びマイルドさ改善方法
JP2017127228A (ja) * 2016-01-19 2017-07-27 サッポロビール株式会社 ノンアルコールビールテイスト飲料の製造方法
JP6876378B2 (ja) * 2016-05-17 2021-05-26 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の香味向上方法
JP7249728B2 (ja) * 2016-05-17 2023-03-31 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料の香味向上方法
JP2017205038A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP2017205036A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP6691826B2 (ja) * 2016-06-01 2020-05-13 サッポロビール株式会社 蒸留酒類
EP3471534A4 (en) 2016-06-17 2019-12-11 Arcadia Biosciences, Inc. PLANTS WITH REDUCED LIPASE-1 ACTIVITY
PT3478813T (pt) 2016-07-01 2020-10-13 Carlsberg Breweries As Bebidas refinadas à base de cereais
JP7046593B2 (ja) * 2017-12-21 2022-04-04 キリンホールディングス株式会社 トランス－２－ノネナール等による酸化臭が低減したビールテイスト飲料
JP7399861B2 (ja) 2017-12-28 2023-12-18 カールスバーグ アグシャセルスガーブ 穀物の抽出物を作製するための方法およびこの抽出物を飲料へと処理するための方法
CN111819275A (zh) 2017-12-28 2020-10-23 嘉士伯有限公司 用于制备谷物提取物的快速方法
BR112020021811B1 (pt) 2018-04-25 2022-10-18 Carlsberg A/S Bebidas e bases de bebida à base de cevada e métodos de produção das mesmas
JP7134748B2 (ja) 2018-06-29 2022-09-12 アサヒビール株式会社 アルコール飲料
JP7281345B2 (ja) * 2019-05-30 2023-05-25 サントリーホールディングス株式会社 ビールテイスト飲料、およびビールテイスト飲料の製造方法
JP7281347B2 (ja) * 2019-05-30 2023-05-25 サントリーホールディングス株式会社 ビールテイスト飲料、およびビールテイスト飲料の製造方法
JP7281344B2 (ja) * 2019-05-30 2023-05-25 サントリーホールディングス株式会社 ビールテイスト飲料、およびビールテイスト飲料の製造方法
JP7281346B2 (ja) * 2019-05-30 2023-05-25 サントリーホールディングス株式会社 ビールテイスト飲料、およびビールテイスト飲料の製造方法
JP7419015B2 (ja) 2019-10-15 2024-01-22 アサヒビール株式会社 発泡性アルコール飲料

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3660699B2 (ja) 1994-09-29 2005-06-15 サッポロビール株式会社 遺伝子診断を用いた大麦又は麦芽の品種識別方法及びそのプライマー
EP0772980B1 (fr) 1995-11-07 2001-06-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Produit amylacé traité par voie enzymatique
WO2002053720A1 (en) 2000-12-29 2002-07-11 Carlsberg Research Laboratory Low-lipoxygenase 1 barley
US6660915B2 (en) * 2000-12-29 2003-12-09 Anna Christina Douma Low lipoxygenase 1 barley
CA2433250C (en) * 2000-12-29 2015-08-11 Carlsberg Research Laboratory Low-lipoxygenase 1 barley
JP4113795B2 (ja) 2003-03-25 2008-07-09 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
US7420105B2 (en) * 2004-03-11 2008-09-02 Carlsberg A/S Barley for production of flavor-stable beverage

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103126030A (zh) * 2011-11-22 2013-06-05 三得利控股株式会社 赋予了味道的收敛感的无酒精啤酒味饮料
TWI501732B (zh) * 2011-11-22 2015-10-01 Suntory Holdings Ltd Beef-flavored beer flavored beverages
CN103126030B (zh) * 2011-11-22 2016-08-17 三得利控股株式会社 赋予了味道的收敛感的无酒精啤酒味饮料
US10993460B2 (en) 2012-12-28 2021-05-04 Suntory Holdings Limited Non-alcohol, beer-taste beverage having Shimari in taste
CN103907989A (zh) * 2012-12-31 2014-07-09 三得利控股株式会社 赋予了味道的收敛感的无酒精啤酒味饮料

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