CN101061219A - 通过灭活或减少具有甜菜醛脱氢酶（badh）活性的功能性蛋白质以产生香味的方法 - Google Patents

通过灭活或减少具有甜菜醛脱氢酶（badh）活性的功能性蛋白质以产生香味的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及增加生物体的香味生成的方法，所述生物体能表达功能性蛋白质，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述方法包括降低或消除该生物体中所述功能性蛋白质的活性。本发明还涉及确定生物体是否能产生香味的方法，以及制备能产生香味之生物体的方法。

Description

通过灭活或减少具有甜菜醛脱氢酶（BADH）活性的功能性蛋白质以产生香味的方法
技术领域
本发明涉及增加生物体中香味产生的方法，鉴定能产生香味的生物体的方法，以及产生香味的生物体。
背景技术
应理解虽然本文引入现有技术出版物作为参考，但并不意味着我们承认：在澳大利亚或任何其它国家，所述出版物构成本领域公知常识的一部分。
香味是很多食物吸引人的特征。例如，与水稻品种，如Basmati 370，KhaoDawk Mali 105，Kyeema，Dumsorhk，Dellmont，Amber和Goolarah水稻品种相关的香味使得这些特殊的水稻品种成为非常受欢迎的有价值的食物来源。香味还与诸如燕麦、大麦、小麦的其它谷类作物品种以及诸如露兜树(Pandanus amaryllifolius)叶的非谷类植物相关。然而，很多植物和其它生物不产生香味，或只能产生很少量的香味。这些不香的生物在遗传上常与香的生物非常密切相关，但缺乏产生足够量的香味以成为合乎需要的产品的能力。
能产生香味的生物种类有限，不能产生香味的很多生物具有其它吸引人的品质，使得它们在食品工业中颇具吸引力。例如，除植物以外的生物，如真菌、酵母和细菌被广泛用于食品工业，用以制备乳酪、面包、酸乳酪、包括啤酒和葡萄酒的发酵饮料以及其它食品。赋予这些食品以香味的能力是所述生物合乎需要的特征。
因此，需要能够赋予无香味的生物以产生香味的能力和/或能够鉴定出能产生香味的生物。然而，导致产生香味的生物学机制仍是未知的。尽管香味与挥发性化合物，如2-乙酰基-1-吡咯啉的产生有关，但导致这些挥发性化合物的产生和减弱的生物学过程仍是未知的。
此外，尚未描述过任何生物中香味产生的分子遗传学，在本发明之前，尚未鉴定出与此性状相关的基因。
现有的与香味产生有关的生物化学和遗传学知识有限，以前不可能操纵无香味的生物使之产生香味，或有效鉴定出产生香味，或至少能产生香味的生物。
因此，需要提供赋予生物产生香味之能力的改良方法，和检测能产生香味之生物的方法。
发明内容
第一方面，本发明提供了增加生物体的香味生成的方法，所述生物体能表达功能性蛋白质，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述方法包括降低或消除该生物体中所述功能性蛋白质的活性。
第二方面，本发明提供了制备产生香味之生物体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供能表达功能性蛋白质的生物体，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列；
(b)降低或消除该生物体中所述功能性蛋白质的活性。
在一个实施方案中，通过抑制功能性蛋白质的活性降低或消除功能性蛋白质的活性。
在另一个实施方案中，通过降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力降低或消除功能性蛋白质的活性。
在一个实施方案中，功能性蛋白质含有氨基酸序列EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S。
在另一个实施方案中，功能性蛋白质含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P。通常，功能性蛋白质含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC，其中X可以是任何氨基酸，n是25至30的整数(即25，26，27，28，29或30)。
功能性蛋白质可含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC和EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S，其中n是25至30的整数(即25，26，27，28，29或30)。
在不同的实施方案中，功能性蛋白质具有的氨基酸序列：
(a)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少35％相同；
(b)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少37％相同；
(c)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少38％相同；
(d)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少39％相同；
(e)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少40％相同；
(f)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少41％相同；
(g)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少44％相同；
(h)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少45％相同；
(i)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少50％相同；
(j)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同；
(k)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少70％相同；
(l)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少75％相同；
(m)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％相同；
(n)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少85％相同；
(o)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少87％相同；
(p)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％相同；
(q)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少95％相同；
(r)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少99％相同。
功能性蛋白质可由任何编码功能性蛋白质的基因编码，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在不同的实施方案中，编码功能性蛋白质的基因的编码序列含有的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO：30的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(b)与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(c)与SEQ ID NO：6的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(d)与SEQ ID NO：8的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(e)与SEQ ID NO：10的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(f)与SEQ ID NO：12的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(g)与SEQ ID NO：14的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(h)与SEQ ID NO：16的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(i)与SEQ ID NO：18的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(j)与SEQ ID NO：20的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(k)与SEQ ID NO：22的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(l)与SEQ ID NO：24的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同。
在不同的实施方案中，编码功能性蛋白质的基因含有的核苷酸序列至少与：
(a)SEQ ID NO：2 65％相同；
(b)SEQ ID NO：2 70％相同；
(c)SEQ ID NO：2 75％相同；
(d)SEQ ID NO：2 80％相同；
(e)SEQ ID NO：2 85％相同；
(f)SEQ ID NO：2 90％相同；
(g)SEQ ID NO：2 95％相同；或
(h)SEQ ID NO：2 99％相同。
生物可以是任何当功能性蛋白质的活性被降低或消除时能产生香味的生物。例如，生物可选自植物、藻类、真菌、酵母和细菌。
在一个实施方案中，生物是植物。植物可以是任何当功能性蛋白质的活性被降低或消除时能产生香味的植物。植物可以是单子叶或双子叶植物。植物可以是谷类作物(cereal crop plant)。适当的谷类作物的例子包括水稻(rice)、燕麦(oat)、大麦(barley)、高粱(sorghum)、玉米(maize)、小麦(wheat)、黑麦(rye)、苋属植物(amaranth)、油菜(rape)和斯卑尔脱小麦(spelt)。植物可以是豆类(legume)。豆类植物的例子包括苜蓿(alfafa)、蚕豆(bean)、金雀花(broom)、角豆(carob)、三叶草(clover)、豇豆(cowpea)、白羽扇豆(lupine)、绿豆(mung bean)、含羞草(mimosa)、豌豆(pea)、花生(peanut)、大豆(soybean)、罗望子(tamarind)和野豌豆(yetch)。植物可以是产生含油种子的植物(oilseed)。产生含油种子的植物的例子包括油菜、canola、大麻(hemp)、亚麻(linseed)、向日葵(sunflower)、红花(safflower)和棉花(cotton)。
在另一个实施方案中，生物是真菌。真菌可以是任何当功能性蛋白质的活性被降低或消除时能产生香味的真菌。适当真菌的例子包括曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)和娄地青霉(Roquefort)属的种。
在另一个实施方案中，生物是酵母。酵母可以是任何当功能性蛋白质的活性被降低或消除时能产生香味的酵母。适当酵母的例子包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrawia lipolytica。
在另一个实施方案中，生物是细菌。细菌可以是任何当功能性蛋白质的活性被降低或消除时能产生香味的细菌。适当细菌的例子包括木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、德氏乳球菌(Lactococcusdelbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和明串珠菌(Leuconostoc)。
可以使用任何本领域已知的用于降低或消除生物体中的蛋白质活性的方法来降低或消除功能性蛋白质的活性。通过抑制功能性蛋白质的活性，或通过降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力可降低或消除功能性蛋白质的活性。
通过将功能性蛋白质的抑制剂导入生物体的细胞中即可抑制功能性蛋白质的活性。抑制剂可以是例如抑制、降解或裂解功能性蛋白质的蛋白质抑制剂，或者，抑制剂可以是功能性蛋白质的化学抑制剂，如吡哆醛5’-磷酸。
可使用任何足以导致功能性蛋白质的表达降低或消除以致于生物体香味产量增加的方法来降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力。
在一个实施方案中，通过将能降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子导入生物体的细胞来降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力。所述核酸分子通常与编码功能性蛋白质的基因的至少一部分互补。核酸分子可以是ssDNA，ssRNA，dsDNA，dsRNA或核酶。所述分子可以是反义分子、共抑制分子(正义抑制)或任何能降低或消除功能性蛋白质表达的其它分子。反义分子可以是例如反义RNA、反义DNA、干扰RNA(dsRNA，iRNA，siRNA，hpRNA或ihpRNA)或核酶。
在另一个实施方案中，通过在一个或多个编码功能性蛋白质的基因中导入能降低或消除功能性蛋白质表达的突变来降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力。突变可以是任何能降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力的突变。突变可以是编码功能性蛋白质的基因中一个或多个碱基对的缺失、插入或取代。
突变可位于编码功能性蛋白质的基因的任何部分，导致功能性蛋白质表达的降低或消除。
在一个实施方案中，突变位于基因的编码序列中。
在另一个实施方案中，突变位于基因的非编码序列中。基因的非编码序列可以是5’非编码序列或3’非编码序列。适当地，5’非编码序列是启动子序列。非编码序列可位于基因的内含子中，或位于内含子或外显子的边界。
可通过任何本领域已知的用于将突变导入基因的方法导入突变，所述方法包括位点特异性重组、同源重组、转座子或反转录转座子诱变、化学诱变、放射诱变等。
使用任何本领域已知的方法可鉴定出编码功能性蛋白质的基因已被突变的生物体。例如，可使用诸如PCR、RT-PCR、TILLING、Southern或Northern杂交等的方法鉴定突变体。
在一个实施方案中，降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力导致生物体中一种或多种选自下列的化合物的产量增加：2-乙酰基-1-吡咯啉，2-(1-乙氧基乙烯基)-1-吡咯啉，2-乙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶以及Widjaja et al.(1996)Comparative Studies on Volatile Components，J.Sci.Food Agric.70：151-161中所述的香味化合物。通常，降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力导致生物体中2-乙酰基-1-吡咯啉的产量增加。
第三方面，本发明提供了确定生物体是否能产生香味的方法，所述方法包括：确定生物体是否能表达功能性蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同。
如果生物体不能表达与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的功能性蛋白质，或者，如果生物体表达与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的功能性蛋白质的水平不足以降低或消除香味的产生，可将该生物体鉴定为能产生香味的生物体。如果生物体能表达与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的功能性蛋白质，表达水平足以降低或消除香味的产生，可将该生物体鉴定为不能产生香味的生物体。
使用任何本领域已知的用于测定生物体表达蛋白质的能力的方法，可测定生物体表达功能性蛋白质的能力，该功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，通过检测功能性蛋白质来测定生物体表达功能性蛋白质的能力，该功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。检测功能性蛋白质的方法包括：免疫学方法，如ELISA和免疫印迹，蛋白质分析法和蛋白质组学，如SDS-PAGE电泳、2D凝胶电泳，质谱分析法，如MALDI-TOF或SELDI-TOF以及针对功能性蛋白质的酶检测法。
在另一个实施方案中，通过用于检测编码功能性蛋白质的基因的mRNA转录物的方法来测定生物体表达功能性蛋白质的能力，该功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。适当的用于检测RNA转录物的方法包括例如Northern印迹分析、点印迹分析、RT-PCR和微阵列分析。
在另一个实施方案中，通过检测编码功能性蛋白质的基因中的突变的方法来测定生物体表达功能性蛋白质的能力，该功能性蛋白质具有与SEQID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述突变导致产生一种蛋白质，该蛋白质不会降低或消除生物体产生香味的能力(“非功能性蛋白质”)，或者导致功能性蛋白质不表达。例如，通过鉴定相同物种的其它个体中编码功能性蛋白质的基因是否含有突变来测定生物体产生功能性蛋白质的能力，该功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述突变如单核苷酸多态性(SNP)、核苷酸插入或缺失、或简单重复序列(SSR)或微卫星序列，所述突变导致非功能性蛋白质的表达，或导致基因不表达蛋白质。适于检测基因多态性的方法包括例如：PCR、RT-PCR、测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、微阵列分析、TILLING、温度梯度凝胶电泳和HPLC。
通常，确定生物体是否能表达功能性蛋白质包括测定生物体的突变fgr基因是否为纯合基因。
第四方面，本发明提供了制备产生香味的生物体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)鉴定一个或多个含有至少一个突变fgr基因的亲代生物体；
(b)在允许生物体交配产生子代的条件下培养一或多种亲代生物体的至少两个个体；
(c)选择一个或多个突变fgr基因为纯合的子代，从而提供产生香味的生物体。
通常，生物体为植物。在一个实施方案中，所述方法包括：
(a)鉴定一个或多个含有至少一个突变fgr基因的亲代植物；
(b)使一个或多个亲代植物中的两个杂交以产生子代植物；
(c)选择一个或多个突变fgr基因为纯合的子代植物，从而提供产生香味的植物。
植物可以是任何当功能性蛋白质的表达被降低或消除时能产生香味的植物。植物可以是单子叶或双子叶植物。植物可以是谷类作物。适当的谷类作物的例子包括水稻、燕麦、大麦、高粱、玉米、小麦、黑麦、苋属植物、油菜和斯卑尔脱小麦。植物可以是豆类。豆类植物的例子包括苜蓿、蚕豆、金雀花、角豆、三叶草、豇豆、白羽扇豆、绿豆、含羞草、豌豆、花生、大豆、罗望子和野豌豆。植物可以是产生含油种子的植物。产生含油种子的植物的例子包括油菜、canola、大麻、亚麻、向日葵和红花。植物可以是竹子(bamboo)。
一或多种亲代生物体的突变fgr基因可以是杂合的。
第五方面，本发明提供了通过第一、第二或第四方面的方法制备的生物体。
第六方面，本发明提供了产生香味的方法，所述方法包括在允许产生香味的条件下培育第五方面的生物体。
第七方面，本发明提供了编码功能性蛋白质的基因用于制备产生香味的生物体的用途，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
第八方面，本发明提供了突变fgr基因用于制备能产生香味的生物体的用途。
第九方面，本发明提供了能降低或消除生物体中的功能性蛋白质表达的核酸分子，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在第九方面的一个实施方案中，核酸分子包括与生物体中编码功能性蛋白质的基因的至少一部分互补的核酸分子。适当地，核酸分子是反义分子、编码反义分子的反义载体、共抑制分子或编码共抑制分子的共抑制载体。适当地，反义分子是寡核苷酸。
第十方面，本发明提供了由第六方面的方法产生的香味分子。
第十一方面，本发明提供了通过降低或消除生物体中功能性蛋白质的活性而产生的2-乙酰基-1-吡咯啉，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
第十二方面，本发明提供了能与生物体的fgr基因或突变fgr基因杂交的核酸分子用于测定生物体是否能表达功能性蛋白质的用途，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
第十三方面，本发明提供了能与生物体的fgr基因或突变fgr基因杂交的核酸分子，使用该分子可测定生物体是否能表达功能性蛋白质，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
第十四方面，本发明提供了能区分生物体的fgr基因和突变fgr基因的核酸分子。
本领域技术人员应理解核酸分子可通过下述方法区分fgr基因和突变fgr基因：
(a)与突变fgr基因而不是fgr基因杂交；
(b)与fgr基因而不是突变fgr基因杂交；
(c)与fgr基因杂交形成杂合体，该杂合体的解链温度高于所述核酸分子与突变fgr基因形成的杂合体的解链温度；或
(d)与突变fgr基因杂交形成杂合体，该杂合体的解链温度高于所述核酸分子与fgr基因形成的杂合体的解链温度。
在第十二至第十四方面的一个实施方案中，核酸分子能与fgr基因而不是突变fgr基因杂交。能与水稻fgr基因而不是水稻突变fgr基因杂交的核酸分子的例子是具有SEQ ID NO：27的核苷酸序列的核酸分子。
在第十二至第十四方面的另一个实施方案中，核酸分子能与生物体的突变fgr基因而不是fgr基因杂交。能与水稻突变fgr基因而不是水稻fgr基因杂交的核酸分子的例子是具有SEQ ID NO：26的核苷酸序列的核酸分子。
本领域技术人员应理解能区分生物体的fgr基因和突变fgr基因的核酸分子可以是探针或引物。探针或引物可以是任何长度，只要它们能区分生物体的突变fgr基因和fgr基因即可。使用本领域已知的方法和本文所述的序列可容易地确定适当的探针或引物。
附图简述
图1显示了水稻fgr基因在水稻基因组染色体8上由标记SSRJ22和SSRJ07所界定的那部分中的位置。
图2显示了BAC克隆在水稻基因组染色体8上的fgr区中的位置。
图3显示了水稻BAC克隆AP004463的基因位置图谱。
图4显示了得自无香味水稻表型的水稻fgr基因的部分核苷酸序列与得自有香味水稻的突变fgr基因之间的序列比对。AP004463是Nipponbare(无香味)的序列，R07和F07是得自Kyeema(有香味)的序列。
图5显示了Nipponbare的水稻fgr基因(SEQ ID NO：2)，图中标明了fgr基因编码(黑体)和非编码(普通字体)部分的核苷酸序列。下划线的是起始密码子。外显子(总共15个)为黑体。
图6显示了(A)由水稻品种Nipponbare的染色体8上的fgr基因编码的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；(B)由水稻品种Kyeema的突变fgr基因编码的蛋白质的氨基酸序列；和(C)由水稻品种Nipponbare的染色体4上的甜菜醛脱氢酶基因(BAD)编码的蛋白质的氨基酸序列。
图7显示了使用Clustal W对无香味水稻品种的fgr基因cDNA的核苷酸序列(rice_fgr_BAD2)(上方)和有香味水稻品种的突变fgr基因cDNA的核苷酸序列(Rice_truncated_BAD2)进行的序列比对。
图8显示了(A)无香味水稻品种Nipponbare的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。
图9显示了(A)无香味小麦的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图10显示了(A)无香味大麦的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图11显示了(A)无香味高粱的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：7)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图12显示了(A)无香味玉蜀黍(Zea mays)的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。
图13显示了(A)无香味Z.tenuifolia的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQID NO：11)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。
图14显示了(A)无香味粟酒裂殖糖酵母的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
图15显示了(A)无香味酿酒酵母的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：15)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。
图16显示了(A)无香味Yarrowia lipolytica的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。
图17显示了(A)无香味木糖葡萄球菌的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。
图18显示了(A)无香味枯草芽孢杆菌的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。
图19显示了(A)无香味大肠杆菌的功能性蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：23)；和(B)编码功能性蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。
图20显示了(A)序列比对结果和(B)评分表，图中显示出小麦、大麦、水稻和Z.tenuifolia的功能性蛋白质的氨基酸序列之间的百分比同一性。(A)和(B)是使用具有缺省参数的Clustal W产生的。
图21显示了使用Clustal W对小麦、大麦、水稻、Z.tenuifolia、高粱和木糖葡萄球菌的功能性蛋白质(BAD2)的氨基酸序列和水稻的甜菜醛脱氢酶蛋白的氨基酸序列进行的序列比对。
图22显示了使用Clustal W对编码小麦、大麦、水稻、Z.tenuifolia、高粱和木糖葡萄球菌的功能性蛋白质的基因的编码区和水稻的BAD1基因的编码区进行的序列比对。
图23显示了使用Clustal W(具有缺省参数)计算出的得自上述生物的功能性蛋白质之间的百分比同一性。在评分的下方列出了每对生物之间的百分比同一性。
图24显示了使用本发明的检测植物是否能产生香味的方法的实施方案产生的引物位置和PCR片段。
图25显示了使用引物SEQ ID NO：25，26，27和28扩增得自无香味水稻品种(Nipponbare)(泳道2)、有香味水稻品种(Kyeema)(泳道3)、杂合水稻品种(Kyeema/Gulfmont)(泳道4)的fgr序列所得的PCR产物，阴性对照(水)(泳道5)和Roche DNA ladder XIV(100bp)标准标记(泳道1和6)的凝胶电泳结果。
图26显示了使用引物SEQ ID NO：25，26，27和28扩增自因香味而分离的未经选择的F2水稻群体的96个个体所得PCR产物的凝胶电泳结果。分子标记(Roche DNA ladder XIV(100bp))被标为S。约580bp的条带对应于用两个外部引物(ESP和EAP)扩增的阳性对照。355bp的条带对应于用内部无香味有义引物(INSP)和外部反义引物(EAP)扩增自无香味等位基因的PCR产物。257bp的条带对应于用内部有香味反义引物(IFAP)和外部有义引物(ESP)扩增自有香味等位基因的PCR产物。
图27显示了酿酒酵母BAD基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。
图28显示了使用Clustal W对小麦BAD1和BAD2的核苷酸序列区域进行的序列比对，所述比对结果可用于设计BAD2 RNAi。BAD1和BAD2之间所示区域的同一性为76.8％。
发明详述
本发明提供了制备和鉴定能产生香味的生物体的方法。
本文所用术语“香味”指的是由一种或多种香味分子所致的芳香气味，所述香味分子是由有香味的水稻品种，如Basmati 370或Kyeema产生的，然而，无香味的水稻品种，如Nipponbare却不能产生所述分子，或者产生所述分子的量太少以致于让人感觉不到。众所周知，其它有香味的生物可产生相同的香味，所述香味与诸如爆米花、玉米粉圆饼、法国长棍面包、火腿、干酪、绿豆、绿茶、葡萄酒的食品和其它有香味的水稻品种有关。
香味可因一种或多种香味分子的产生而散发，所述分子如2-乙酰基-1-吡咯啉，2-(1-乙氧基乙烯基)-1-吡咯啉或2-乙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，或Widjaja et al.(1996)，J.Sci.Food Agric.70：151-161所述的香味分子。通常，香味源自2-乙酰基-1-吡咯啉的产生。本领域技术人员应理解：即使能产生香味的生物体不会在所有条件下都产生香味，或者不是该生物体的所有部分都能产生香味，但该生物体仍会有产生香味的生物学需求。例如，尽管生物体具有产生香味所必需的基因，因此能产生香味，但它可能只在某些条件下才能产生香味，或者只在生物体的特定部分产生香味。条件可以是例如温度、生长培养基和光照、化学药品的异位使用等，本领域技术人员可以容易地确定这些条件。在诸如植物的多细胞生物中，植物的一个或多个部分，如种子、叶、花粉、花、根、茎或果实，或整个生物体都能产生香味。
本领域技术人员应理解：香味可源自生物体的细胞分泌或释放香味分子。本领域技术人员也应懂得：香味可源自香味分子的细胞内积累以及香味分子的分泌或释放。
一方面，本发明提供了由能表达功能性蛋白质的生物体增加香味产生的方法，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述方法包括降低或消除生物体中功能性蛋白质的活性。
本领域技术人员应懂得：生物体中香味产生的增加是相对于功能性蛋白质的活性已被降低或消除的生物体所产生的香味而言的增加。本文所提及的生物体产生香味指的是：生物体的至少一些细胞分泌、释放和/或积累足够量的香味分子，以致于诸如嗅觉和/或味觉的感觉能够检测到香味。本领域技术人员应懂得：生物体香味产生的增加可能是下述的任何一个或多个原因所致：
(a)香味分子的合成增加；
(b)香味分子的积累增加；
(c)生物体的细胞所释放的香味分子增加。
本文所用的“功能性蛋白质”是当在生物体中表达时可降低或消除生物体产生香味之能力的蛋白质。本发明人已发现：降低生物体中功能性蛋白质的活性可增加生物体产生的香味，所述功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。本发明人发现：编码功能性蛋白质的基因中的突变能降低或消除功能性蛋白质的表达，从而降低或消除功能性蛋白质的活性，所述突变导致香味表型，其中，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
本领域技术人员应懂得“％相同”指的是至少两个氨基酸序列比对中排列的相同氨基酸的百分比，或至少两个核苷酸序列比对中排列的相同核苷酸的百分比。例如，可使用下述的任何程序进行序列比对并测定百分比同一性：
(a)使用缺省参数(Word size 3，Blosum 62 matrix，Gap costs：Existence IIExtension 1)的BLAST程序；
(b)GCG软件包(Devereux et al(1984)Nuclei Acid Research，12：387)中使用缺省参数的ALIGN程序；
(c)GCG软件包(Devereux et al(1984)Nuclei Acid Research，12：387)中使用缺口权重＝5.0，长度权重＝0.3的GAP序列比对程序；
(d)使用缺省参数的CLUSTALW(网址为http://www.ebi.ac.uk/clustalW/的欧洲生物信息学研究所列出的缺省参数是：DNA缺口开放罚分＝15.0，DNA缺口延伸罚分＝6.66，DNA矩阵：同一性，蛋白质缺口开放罚分＝10.0，蛋白质缺口延伸罚分＝0.2，蛋白质矩阵＝Gonnet，蛋白质/DNA END缺口＝-1，蛋白质/DNA GAPDIST＝4)。
通常通过使用缺省参数的CLUSTALW测定百分比同一性。
本文所用术语“fgr基因”指的是得自任何生物体的编码功能性蛋白质的基因，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。本领域技术人员应理解不同生物体中fgr基因为人所知的名称可能各不相同，例如BAD2，BADH2，BADH15，BADH1，BAD，BAD1，BBD，BBD1，BBD2，甜菜醛脱氢酶基因，这些基因都落入术语“fgr基因”的范围之内。因此，BAD2基因，BADH2基因，BADH15基因，BADH1基因，BAD基因，BAD1基因，BBD基因，BBD1基因和BBD2基因都是“fgr基因”的例子。本文所用的“突变fgr基因”是fgr基因的不编码功能性蛋白质的突变等位基因。
SEQ ID NO：2提供了水稻品种Nipponbare的fgr基因的核苷酸序列。本领域技术人员应理解因遗传密码子简并性的存在，不同水稻品种之间fgr基因序列有所不同。因此，我们设想水稻品种的fgr基因可与SEQ ID NO：2的核苷酸序列至少65％相同(例如至少70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同。
在一些实施方案中，fgr基因编码区的核苷酸序列：
(a)对水稻品种而言，与SEQ ID NO：30的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(b)对小麦品种而言，与SEQ ID NO：4的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(c)对大麦品种而言，与SEQ ID NO：6的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(d)对高粱品种而言，与SEQ ID NO：8的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(e)对玉蜀黍品种而言，与SEQ ID NO：10的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(f)对Z.tenuifolia品种而言，与SEQ ID NO：12的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(g)对粟酒裂殖糖酵母的菌株而言，与SEQ ID NO：14的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(h)对酿酒酵母的菌株而言，与SEQ ID NO：16的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(i)对Yarrowia lipolytica的菌株而言，与SEQ ID NO：18的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(j)对木糖葡萄球菌的菌株而言，与SEQ ID NO：20的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(k)对枯草芽孢杆菌的菌株而言，与SEQ ID NO：22的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同；
(l)对大肠杆菌的菌株而言，与SEQ ID NO：24的核苷酸序列至少65％相同(例如70％，75％，80％，85％或90％相同)，通常至少95％相同。
本发明人发现：表达功能性蛋白质的生物体要么不能产生香味，要么产生很少量的香味，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。本文所用术语“无香味的”指的是不能产生可测香味，或产生很少量香味的生物体。已发现本文所述的有香味水稻品种的fgr基因携有突变，该突变消除了有香味水稻由fgr基因表达功能性蛋白质的能力。已发现无香味水稻具有至少一个未突变的fgr基因，因此仍能表达功能性蛋白质。本发明人突破了理论的束缚，相信功能性蛋白质参与2-乙酰基-1-吡咯啉的代谢，从而减少或防止生物体积累2-乙酰基-1-吡咯啉。本发明人还发现：在很多不同的生物体中，广泛分布着氨基酸序列与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少30％相同的蛋白质。如本文所述，本发明人已在包括小麦、大麦、水稻、草坪草、高粱和玉蜀黍的多种植物，包括粟酒裂殖糖酵母、酿酒酵母和Yarrowia lipolytica的酵母，包括木糖葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细菌中鉴定出氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的蛋白质。因此，本发明人预期通过降低或消除所述生物体中该蛋白质的活性来增加这些生物体和很多其它不同生物体中香味的产生。
使用本领域已知的标准方法可容易地鉴定出多种生物体中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的蛋白质。例如，通过将SEQ IDNO：1与诸如植物、真菌、酵母和细菌的生物的序列数据库进行比较，可鉴定出氨基酸序列与SEQ ID NO：1的同一性至少为30％的蛋白质。所述数据库包括例如国立生物技术信息中心(NCBI)、Genbank、欧洲分子生物学实验室(EMBL)、日本DNA数据库(DDBJ)、基因组研究所(TIGR)、植物基因组数据库(PlantGDB)等的核苷酸和蛋白质数据库。一般使用基于计算机的序列比较进行比较，使用如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(，参见例如Altschul et al.(1996)Methods in Enzymology 266：260)、GCG程序包(Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research，12：387)、FASTA(Altshul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403)、ClUSTALW(Thompson et al(1994)NucleicAcids Research 22(22)：4673-4680)的算法进行鉴定。图21举例显示了得自无香味的水稻、小麦、大麦、Z.tenuifolia、高粱、木糖葡萄球菌和粟酒裂殖糖酵母的功能性蛋白质的氨基酸序列比对结果，籍此阐明多种多样的生物物种都能表达氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的蛋白质。因此，应懂得携有一个或多个编码功能性蛋白质的基因的上述任何生物体的香味产生都可增加，其中功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
本发明人还发现：在由多种生物表达的、其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的功能性蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1第158位至第480位的区域更加保守。因此，在一个实施方案中，功能性蛋白质包含与SEQ ID NO：1第158位至第480位的氨基酸序列至少45％相同的氨基酸序列。
本发明人已从得自不同生物的、其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的蛋白质中鉴定出下列保守的氨基酸序列：
(a)EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S；
(b)(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P，通常为(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC，其中X可以是任何氨基酸，n是25至30的整数。
因此，在一个实施方案中，功能性蛋白质包含氨基酸序列EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S。在另一个实施方案中，功能性蛋白质包含氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P。在另一个实施方案中，功能性蛋白质包含氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC，其中X可以是任何氨基酸，n是25至30的整数。在另一个实施方案中，功能性蛋白质包含氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC和EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S，其中X可以是任何氨基酸，n是25至30的整数。
生物体可以是任何能表达功能性蛋白质的生物体，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，如果所述功能性蛋白质的表达被降低或消除，所述生物体应该能产生香味。本领域技术人员应懂得：即使能表达功能性蛋白质的生物体不会在所有条件下都产生功能性蛋白质，或者不是该生物体的所有部分都能产生功能性蛋白质，但该生物体仍会有产生功能性蛋白质的生物学需求，其中所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在优选实施方案中，本发明提供了在下述生物体中增加香味产生的方法：
(a)能表达功能性蛋白质的植物，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同(例如至少70％，75％，80％，85％，87％或90％相同)的氨基酸序列；
(b)能表达功能性蛋白质的真菌，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少38％相同(例如至少39％相同)的氨基酸序列；
(c)能表达功能性蛋白质的酵母，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少38％相同(例如至少40％或41％相同)的氨基酸序列；或
(d)能表达功能性蛋白质的细菌，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少35％相同(例如至少37％，44％或45％相同)的氨基酸序列；
所述方法包括降低或消除植物、真菌、酵母或细菌中功能性蛋白质的活性。
适当地，当生物体是：
(1)植物，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少75％相同的氨基酸序列；
(2)酵母，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少38％相同的氨基酸序列；或
(3)细菌，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少37％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，生物是植物。适当的植物包括单子叶或双子叶植物。单子叶植物的例子包括：芦笋(asparagus)、竹子、玉米、大麦、小麦、水稻、高粱、洋葱(onion)、珍珠黍(pearl millet)、黑麦、燕麦、油菜、Zoysiatenuifolia(草坪草)、小果野蕉(Musa acuminata)、露兜树(pandan)。双子叶植物的例子包括：番茄(tomato)、蚕豆、大豆、胡椒(pepper)、莴苣(lettuce)、豌豆、苜蓿、甘蓝(cabbage)、椰菜(broccoli)、花椰菜(cauliflower)、抱子甘蓝(brussel sprouts)、小萝卜(raddish)、胡萝卜(carrot)、甜菜(beet)、茄子(eggplant)、菠菜(spinach)、黄瓜(cucumber)、南瓜(squash)、向日葵。在优选实施方案中，植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱和Zoysia tenuifolia。在多种不同的实施方案中：
(1)当植物是无香味的水稻，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少75％相同(例如至少80％，85％，90％或95％相同)，通常为至少99％相同的氨基酸序列；
(2)当植物是无香味的小麦，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：3至少60％相同(例如至少65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％相同)，通常为至少99％相同的氨基酸序列；
(3)当植物是无香味的大麦，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：5至少70％相同(例如至少70％，75％，80％，85％，90％或95％相同)，通常为至少99％相同的氨基酸序列；
(4)当植物是无香味的高粱，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：7至少60％相同(例如至少65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％相同)，通常为至少99％相同的氨基酸序列；
(5)当植物是无香味的玉米，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：9至少60％相同(例如至少65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％相同)，通常为至少99％相同的氨基酸序列。
得自多种植物的功能性蛋白质的氨基酸序列和编码功能性蛋白质的DNA的例子如下：
  植物   SEQ ID NO   SEQ ID NO.
  水稻小麦大麦高粱玉蜀黍Z.Tenuifolia   SEQ ID NO：2或30SEQ ID NO：4SEQ ID NO：6SEQ ID NO：8SEQ ID NO：10SEQ ID NO：12   SEQ ID NO：1SEQ ID NO：3SEQ ID NO：5SEQ ID NO：7SEQ ID NO：9SEQ ID NO：11
在优选实施方案中，植物是水稻。水稻的种或品种可以是任何表达功能性蛋白质的水稻种或品种，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。适当种的例子包括：Oryza sativa，Oryza australiensis和Oryza rufipogon。无香味的水稻种或品种的例子包括：Nipponbare，Akitamachi，Amaroo 1，Rexmont，Sakha 101，Gulfmont，Rufipogon，Vialone Nano，Koshihikara，Calrose，M202和Shimizi Mochi。
在另一个实施方案中，生物是酵母。适当的酵母包括选自下列的种：酿酒酵母(其定义如Barnett et al.(1990)″Yeasts Characteristics andIdentification″，2nd Edition，Cambridge University Press中所述)、巴扬氏糖酵母(Saccharomyces bayanus)、奇异糖酵母(Sacccharomyces paradoxus)、巴斯德氏糖酵母(Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces servazzii、单孢糖酵母(Saccharomyces unisporus)、Saccharomyces kluyveri、大连糖酵母(Saccharomyces dairiensis)、微小糖酵母(Saccharomyces exiguus)、Saccharomyces catellii，假丝酵母属的种，如产朊假丝酵母(Candida utilis)、Candida paraffinica、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，红酵母属的种，马克斯克鲁维氏酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)，克勒克氏酵母的种，如细尖克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)，毕赤氏酵母属的种，如Pichia angusta、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，汉逊氏酵母属的种，如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)，球拟酵母属的种(Torulopsisspp.)，Zygosaccharomyces rouxii，粟酒裂殖糖酵母，戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)，Yarrowia lipolytica等。
在多个实施方案中：
(1)当酵母细胞是酿酒酵母时，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少35％相同，通常为38％相同的氨基酸序列；
(2)当酵母细胞是粟酒裂殖糖酵母时，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少40％相同，通常为41％相同的氨基酸序列；
(3)当酵母细胞是Yarrowia lipolytica时，功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1至少35％相同，通常为39％相同的氨基酸序列。
得自多种酵母的功能性蛋白质的氨基酸序列和编码功能性蛋白质的DNA的例子如下：
 酵母   SEQ ID NO   SEQ ID NO.
 粟酒裂殖糖酵母酿酒酵母Yarrowia lipolytica   SEQ ID NO：14SEQ ID NO：16SEQ ID NO：18   SEQ ID NO：13SEQ ID NO：15SEQ ID NO：17
在另一个实施方案中，生物是细菌。适当的细菌包括乳杆菌属的种、乳球菌属的种、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、木糖葡萄球菌。在多个实施方案中：
(1)当细菌是木糖葡萄球菌时，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少40％相同，通常为45％相同的氨基酸序列；
(2)当细菌是枯草芽孢杆菌时，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少40％相同，通常为44％相同的氨基酸序列；
(3)当细菌是大肠杆菌时，功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同，通常为37％相同的氨基酸序列。
得自多种细菌的功能性蛋白质的氨基酸序列和编码功能性蛋白质的DNA的例子如下：
  细菌   SEQ ID NO   SEQ ID NO.
  木糖葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌   SEQ ID NO：20SEQ ID NO：22SEQ ID NO：24   SEQ ID NO：19SEQ ID NO：21SEQ ID NO：23
本领域技术人员应理解整个生物体或其一部分可产生香味。例如，对植物而言，它的一部分包括诸如叶、表皮、花粉、种子、果实、根、胚芽、苞叶、果仁、卵细胞、茎或花的部分。
本发明第一方面的方法包括降低或消除功能性蛋白质的活性。本文所用术语“降低或消除功能性蛋白质的活性”指的是降低或消除功能性蛋白质降低或消除生物体产生香味之能力的能力。通过本领域已知的任何用于降低或消除蛋白质活性的方法可降低或消除功能性蛋白质的活性。例如，通过抑制功能性蛋白质的酶解活性，通过降解功能性蛋白质，或通过降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力，可降低或消除功能性蛋白质的活性。
在一个实施方案中，通过抑制功能性蛋白质的酶解活性来降低或消除功能性蛋白质的活性。通过例如在细胞中导入功能性蛋白质的一种或多种酶解抑制剂，或通过在细胞中导入能以阻断或防止功能性蛋白质降低或消除香味的方式与功能性蛋白质相互作用的蛋白质，可抑制功能性蛋白质的酶解活性。功能性蛋白质的抑制剂的例子是吡哆醛5’-磷酸，可使用本领域已知的方法将其导入生物体的细胞中。能以阻断或防止功能性蛋白质降低或消除香味的方式与功能性蛋白质相互作用的蛋白质的例子是能特异性裂解或降解功能性蛋白质的蛋白质。
在另一个实施方案中，可通过降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力来降低或消除功能性蛋白质的活性。本文所用术语“表达”指的是由生物体产生蛋白质。通过本领域已知的任何用于降低或消除蛋白质表达的方法，可降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力。在一些实施方案中，降低或消除了由编码功能性蛋白质的基因转录的RNA的量。在其它实施方案中，降低或消除了由功能性蛋白质的RNA转录物翻译蛋白质的能力。
通过在生物体的细胞中导入降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子，可降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子是反义分子。本文所用术语“反义分子”是含有与特异性DNA或RNA靶序列互补的序列的核酸分子，所述序列能与靶序列杂交，从而降低或消除靶序列的转录或翻译。本领域技术人员应理解：术语“杂交”指的是核酸链通过碱基配对与基本上互补的链退火的过程。反义分子的例子包括：反义核酸，包括单链或双链反义DNA或RNA，共抑制DNA或RNA，干扰RNA(包括RNAi，siRNA，hpRNA，ihpRNA)，核酶。反义分子可以是反义RNA。本文所用的反义RNA指的是这样一种RNA分子，它与靶RNA分子互补或至少部分互补，因而能与其形成双链体，进而可降低或消除靶RNA分子的翻译。反义RNA分子可与靶RNA分子的编码或非编码区互补或部分互补。反义RNA分子可以取能降低或消除功能性蛋白质表达的任何长度。使用反义RNA降低或消除基因表达的方法是已知的，并且描述于例如美国专利5,107,065；Smith et al.，Nature 334：724-726(1988)；Van der Krol et al.，Nature333：866-869(1988)；Rothstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8439-8443(1987)；Bird et al.，Bio/Technology 9：635-639(1991)；Bartley et al.，Biol.Chem.267：5036-5039(1992)；Gray et al.，Plant Mol.Bio.19：69-87(1992)。反义分子可以是干扰RNA(包括RNAi，siRNA，hpRNA和ihpRNA)。本文所用的干扰RNA指的是由dsRNA介导的对基因表达的干扰，其中使用与靶核酸序列互补的双链RNA选择性降低或消除靶基因的表达。产生和使用RNAi的方法是本领域已知的，所述方法描述于例如C.P.Hunter，Current Biology(1999)9：R440-442；Hamilton et al.(1999)Science 286：950-952；Ding，CurrentOpinion in Biotechnology(2000)11：152-156。
反义分子可以是核酶。本文所用术语“核酶”指的是这样一种RNA分子，它含有与靶RNA序列互补的序列，而互补序列与靶序列杂交。产生和使用核酶以降低或消除基因表达的方法是已知的，所述方法描述于例如Kimand Cech，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：8788-8792；Reinhold-Hurekand Shub(1992)nature 357：173-176；美国专利5,254,678；Methods inMolecular Biology(1997)vol.74，Chapter 43“Expressing Ribozymes in Plants”(Turner and Humana Press，Totowa，N.J.Eds.)。
在另一个实施方案中，降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子是共抑制RNA分子。共抑制RNA分子与被抑制的基因的RNA转录物的至少一部分同源。使用共抑制RNA降低或消除基因表达的方法是已知的，所述方法描述于例如美国专利5,231,020；Krol et al.Biotechniques 6：958-976(1988)；Mol et al.，FEBS Lett.268：427-430(1990)；Grierson et al.，Trends in Biotech 9：122-123(1991)；Krol et al(1990)The Plant Cell 2，291-299；Napoli et al.(1990)The Plant Cell 2：279-289；美国专利5,231,020；WO95/34668；Angell andBaulcombe(1997)The EMBO Journal 16，12：3675-3684。
使用本文所述的fgr基因的序列或fgr基因的编码序列(cDNA序列)以及本文提供的方法，可以容易地确定降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子的序列。
通常，降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子是寡核苷酸，适当时为反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是足以降低或消除fgr基因表达的任何长度。适当时，反义寡核苷酸的长度大于10bp。更合适的反义寡核苷酸长度为10至100bp，更合适的长度为12至50bp。反义寡核苷酸可以是上述的任何反义分子。可以使用本领域已知的方法人工合成或通过自动合成仪合成寡核苷酸(参见例如Oligonucleotide Synthesis：Methods and Applications(Methods in Molecular Biology)，Pict Herdewijin(ed.)Humana Press(2004))。反义寡核苷酸一般包括非-磷酸二酯核苷酸间键合，如磷酸烷基酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、alkylphosphonothiates、磷酸烷基酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、acetamidate、羧甲基酯、碳酸酯和磷酸三酯(描述于例如Brown，Meth.Mol.Bio.20，1-8m(1994)；Sonveaux，meth.Mol.Biol.26，1-72(1994)；Uhlmann et al.，Chem Rev.90，543-583(1990))。
降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子可以是载体的一部分。通常，载体是表达载体。本文所用“表达载体”指的是一种核酸构建体，其中降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子与载体可操作地相连，当载体被导入生物体的细胞中时，载体序列指定由表达载体表达核酸分子。通常，核酸分子是反义分子或共抑制分子。适当的用于在生物体中表达核酸分子的载体是已知的，所述载体包括任何适于在该生物体中表达RNA的载体。例如，质粒载体，如衍生自pUC的系列载体(如pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pUC23，pSK-衍生的，pGEM-衍生的，pSP-衍生的，或pBS-衍生的载体)适用于细菌。与根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)一起使用的由Ti和Ri质粒衍生的载体是适用于植物的载体。适当的由Ti和Ri质粒衍生的载体包括下述文献中公开的载体：美国专利4,440,838；Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；Geierson and Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed.(1988)；and Miki and Iyer，Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In PlantMetabolism，2d Ed.D T.Dennis，D H Turpin，D D Lefebrve，D B Layzell(eds)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London.pp.561-579(1997)；Barton and Chilton(1983)Agrobacterium Ti plasmid vectors for plant genetic engineering，Methodsin Enzymology 101：527-539。
预期复制缺损的病毒载体可用于在生物体中表达RNA。所述载体包括例如在植物中起作用的小麦矮小病毒(WDV)穿梭载体，如aspW1-I1和PW1-GUS(参见Ugaki et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：371-377)。
可通过本领域已知的任何方法将降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子导入细胞，所述方法描述于例如Hannon(2002)RNA Interference，Nature418：244-251；Bernstein et al(2002)The rest is silence.RNA 7：1509-1521；Hutvagner et al.RNAi：Nature abhors a double-strand.Curr.Opin.Genetics &Development 12：225-232；Brummelkamp(2002)A system for stable expressionof short interferring RNAs in mammalian cells.Science 296：550-553。将降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子导入生物体细胞的方法包括：转染、转化、电穿孔、根瘤土壤杆菌介导的转化、微粒介导的转化(参见例如Glick andThompson(eds.)，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，BocaRaton，Fla.：CRC Press(1993)；Sambrook et al.(eds.)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Second Edition)，Plainview，N.Y：Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Duan et al.(1996)Nature Biotech.14：494-498)。
在另一个实施方案中，通过突变编码功能性蛋白质的基因(fgr基因)，使得突变的基因不表达功能性蛋白质，从而降低或消除功能性蛋白质的表达。可通过任何能降低或消除功能性蛋白质表达的方法来突变fgr基因。本文描述了编码功能性蛋白质的基因序列，可使用本文提供的方法，用所述基因序列来突变基因。本领域技术人员应懂得：在某些情况下，突变的基因仍能表达蛋白质，但表达出的蛋白质将是无功能的。例如，当突变是导致形成终止密码子的突变时，可产生无功能的截短蛋白质。可通过在基因中插入至少一个额外的碱基对来突变编码功能性蛋白质的基因。插入可产生移码，导致截短的无功能蛋白质的表达，或者导致无蛋白质表达。插入包括翻译和/或转录终止信号。插入可以是单个碱基对或多个碱基对。例如，插入可以是编码选择标记的基因。本文所用的“选择标记”指的是编码生物体中可被选择或筛选的性状或表型的基因或核酸序列。选择标记的例子包括抗生素抗性基因、碳源利用基因、氨基酸产生基因等。用于植物的选择标记是本领域众所周知的，描述于例如Ziemienowizc A.(2001)Plantselectable markers and reporter genes.Acta Physiologiae Plantarum.23(3)：363-374。用于酵母的选择标记是本领域已知的，描述于例如Rothstein(1991)Targeting，disruption，replacement，and allele rescue：integrative DNAtransformation in yeast.Methods in Enzymology，194：281-301；Sherman et al.″Methods in Yeast Genetics″(1981)Cold Spring Harbor Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Guthrie and Fink(1991)“Guide to YeastGenetics and Molecular Biology”，Methods in Enzymology Vol 194，AcademicPress。用于细菌的选择标记描述于例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.(1989)；Molecular Cloning a Laboratory Manual，second edition.(Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.，Moore，D.，Smith，J.，Seidman，J.，and Struhl，K.，eds.(1987)；和Current Protocols in Molecular Biology.(New York：John Wiley andSons)。通过在植物基因中导入插入以突变植物基因的方法描述于例如Krysan et al.OMICS 6：163-174；Greco et al.Plant Physiology 125：1175-1177；Gelvin，Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant.Mol.Biol.51：223-256；Hirochika，Plant Molecular Biology 54(3)：325-334；Henikoff and Comai.Annu.Rev.PlantBiol.54：375-401。通过在酵母基因中导入插入以突变酵母基因的方法是已知的，描述于例如Rothstein(1991)；Johnston，Riles and hegemann(2002)，GeneDisruption，Methods in Enzymology，350：290-315；Sherman et al.″Methods inYeast Genetics″(1981)Cold Spring Harbor Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York；Guthrie and Fink(1991)“Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology”，Methods in Enzymology Vol 194，Academic Press。通过在基因中插入序列以突变细菌基因的方法是已知的，描述于例如Hayes，Annual Review of Genetics 37：3-29。
可使用例如转座子诱变、同源重组或位点特异性重组在基因中进行插入。位点特异性重组的例子是噬菌体P1的cre-lox重组系统(参见Abremski etal.(1983)Cell 32(4)：130l-1311；Sternberg et al.(1981)J.Mol.Biol150(4)487-507；J.Mol.Biol 150(4)：467-487；J.Mol.Biol.150(4)：603-608)，该系统已用于促进植物细胞(参见例如美国专利5,658,772)、动物细胞(美国专利5,801,030)基因组上特定位置的重组。另一例位点特异性重组是酿酒酵母的FLP重组酶系统(参见例如美国专利5,654,182)。除了酵母外，还已阐明植物中FLP重组酶的活性(参见Lyznik et al.1996；Lue et al.2000)。
通过如美国专利6,750,379所述的同源重组导入插入，可破坏编码功能性蛋白质的基因。
通过使用转座子诱变可突变编码功能性蛋白质的基因。使用转座子突变细菌、酵母和植物中的基因的技术是本领域已知的。转座子、反转录转座子和使用转座子和反转录转座子诱变植物中的基因的方法描述于例如：Bennetzen(1996)Trends Microbiol.4：347-353；Voytas(1996)Genetics 142：569-578；Hiroshik et al.(1996)PNAS 93：7783-7788；美国专利6,720,479。转座子和使用转座子诱变酵母基因的方法描述于例如Kumar et al(2002)Insertional mutagenesis：transposon-insertion libraries as mutagens in yeast.Methods in Enzymology 350：219-229。转座子和使用转座子诱变细菌基因的方法描述于例如Kwon et al.(2002)Functional screening of bacterial genomefor virulence genes by transposon footprinting.Methods Enzymol，358：141-52；Burne et al(1994)Methods in Enzymology 235：405-426；de Lorenzo andTimmis(1994)Methods in Enzymology，235：386-405。
通过从编码功能性蛋白质的基因中缺失至少一个碱基对即可突变该基因，所述缺失导致该基因的功能性蛋白质表达被降低或消除。编码功能性蛋白质的基因中的缺失可以是任何长度，位于任何位置，只要缺失能导致该基因的功能性蛋白质表达被降低或消除即可。缺失可在编码序列中进行。缺失可位于5’非编码区，如启动子，这样可防止产生转录物。缺失可位于内含子或内含子/外显子边界。缺失可位于3’编码区。缺失可以是基因的实质性部分或整个基因。
在植物中产生缺失突变的方法描述于Li，Plant Journal 27(3)：235-242；Henikoff and Comai.Annu.Rev.Plant Biol.54：375-401；Rice et al.PlantPhysiol.123：427-438。在酵母中产生缺失突变的方法描述于Kumar andSnyder，Nature Genetics 2(4)：302-312。在细菌中产生缺失突变的方法描述于例如Miller，J.H.，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory，New York(1972)；Miller，J.H.，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Press，New York(1995)；Sambrook et al.，MolecularCloning：H Laboratory Manual 2nd edition，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor(1989)，and Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.eds.，John Wiley and Sons(1995)。
通过取代编码功能性蛋白质的基因中的至少一个碱基对，使得基因不再编码功能性蛋白质，即可突变该基因。取代可发生在基因的编码或非编码部分。取代可导致形成终止密码子(TGA，TAG，TAA)，或导致功能性蛋白质功能丧失的氨基酸取代。取代可位于基因的非编码部分，导致降低或消除RNA转录物的产生。可使用本领域已知的方法将取代导入基因。
可通过本领域已知的其它方法突变编码功能性蛋白质的基因。例如，通过将生物体或其部分暴露于诸如电离辐射、UV辐射、化学诱变剂等的诱变剂即可突变基因。电离辐射的例子包括β、γ或X-射线辐射。化学诱变剂的例子包括乙基甲基磺酸酯、甲基N-亚硝基胍、N-亚硝基-N-乙基脲、N-亚硝基-N-甲基脲、溴化乙锭、双环氧丁烷。生物体或其部分暴露于诱变剂的时间和剂量根据生物体和所用诱变剂的不同而改变，本领域技术人员可容易地确定所述时间和剂量。
使用缺失、插入或改变基因序列的重组DNA技术可突变基因。例如，通过在基因中插入核酸序列，使得该基因不再能表达功能性蛋白质即可突变该基因。核酸序列可以是任何能破坏基因表达的核酸序列。例如，被插入的核酸序列可以是选择标记。将核酸分子插入基因以使基因失活的方法是本领域已知的。例如，在植物基因中插入核酸分子的方法描述于例如Transgenic Plants：Fundamental and Applications，Andrew Hiatt(Ed)(1993)。在酵母基因中插入核酸分子的方法描述于Sherman et al.″Methods in YeastGenetics″(1981)Cold Spring Harbor Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York。在细菌基因中插入核酸分子的方法描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)；Molecular Cloning a Laboratory Manual，secondedition.(Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.，Moore，D.，Smith，J.，Seidman，J.，and Struhl，K.，eds.(1987)；和Current Protocols in Molecular Biology。
可通过本领域已知的任何方法筛选通过上述任何方法产生的突变体或天然突变体。例如，可使用TILLING(Target Induced Local Lesion IN Genomes)鉴定突变体。通常，在TILLING中，扩增待筛选的一种或多种生物体的fgr基因，使其与经扩增的野生型fgr基因退火，检测异源双链体以确定fgr基因是否已被突变。TILLING的方法描述于例如McCallum et al.(2000)NatureBiotechnology 18：455-457。通常在诱变之后进行TILLING。然而，本领域技术人员应理解TILLING也可用于鉴定fgr基因具有天然突变的野生生物体。
本发明还提供了确定生物体是否能产生香味的方法。所述方法能使本领域技术人员鉴定出那些能产生香味的生物体，以及那些不能产生香味的生物体。例如，所述方法能够筛选出能产生香味的突变生物体。
在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：
(a)获得生物体的样品；
(b)由该样品确定生物体是否能表达功能性蛋白质，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
样品可以是生物体的任何样品。然而，本领域技术人员应理解：生物体的某些部分，例如植物的某些部分会比其它部分更适于确定生物体产生香味的能力。例如，在水稻植物中，典型的样品可以是水稻谷粒。本领域技术人员还应懂得所用样品的类型取决于确定生物体是否能表达功能性蛋白质的方法，本领域技术人员可容易地确定样品的类型。
可通过本领域已知的任何用于测定生物体表达蛋白质之能力的方法来测定生物体表达功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，通过检测编码生物体样品功能性蛋白质的基因的mRNA转录物来测定生物体表达功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。通常，RNA转录物是fgr基因的RNA转录物。优选使用本领域已知的方法从生物体的样品中提取RNA，例如，所述方法描述于Ausubel，F.et al.，1989-1999，“Current Protocols in Molecular Biology”(Green Publishing，New York)。在检测编码功能性蛋白质之基因的mRNA转录物时，可使用总RNA，或者，mRNA可分离自总RNA并在分离后被使用。一旦得到RNA或mRNA，可通过本领域已知的多种方法检测mRNA转录物。
例如，可通过RT-PCR检测编码功能性蛋白质之基因的mRNA转录物，其中通过延伸与合成自mRNA转录物的cDNA互补的引物对来扩增mRNA转录物。本文所用术语“引物”指的是通过已知方法(包括例如三酯、亚磷酰胺或磷酸酯化学)，如Engels，et al.，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28：716-734(1989)所述的方法化学合成的短的单链多脱氧核苷酸。然后通过例如聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化引物。选择引物的序列以使引物与靶序列基本上互补，从而能与靶序列杂交。一旦引物与靶序列杂交，可通过使用DNA聚合酶在引物的3’末端添加脱氧核糖核苷酸，或通过使用RNA聚合酶添加核糖核苷酸来延伸引物。本领域技术人员应懂得本文所用“引物对”指的是一对引物，其中一个能与双链核酸分子(如cDNA分子或cDNA:mRNA杂合体)的第一链杂交，另一个能与双链核酸分子的第二链杂交以通过PCR扩增对应于引物对并位于引物对之间的序列(如cDNA分子或cDNA:mRNA杂合体)。本领域技术人员应懂得：cDNA指的是通过使用mRNA为模板合成具有与mRNA序列互补之序列的DNA分子所产生的DNA分子。优选使用逆转录酶合成cDNA链，接着通过聚合酶链反应扩增cDNA序列(RT-PCR)，籍此来检测mRNA转录物。本文所用的逆转录酶是由mRNA模板合成cDNA链的酶。本文所用的“聚合酶链反应”或“PCR”一般是指在体外扩增所需的核苷酸序列的方法，其描述于美国专利4,683,195。一般来说，PCR法包括使用能优先与靶核酸杂交的第一和第二引物重复进行引物延伸合成循环。通常，PCR法中所用的引物会与待扩增核苷酸序列两端的模板内的核苷酸序列互补，但也可使用与待扩增的核苷酸序列互补的引物，Wang，et al.，inPCR Protocols，pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman，et al.，in PCRProtocols，pp.219-227；Triglia，et al.，Nucl.Acids Res.16：8186(1988)。
延伸反应的反应条件，如退火时间和温度以及延伸时间和温度根据延伸反应中所用的引物序列和聚合酶的特性而有所不同。按照Wang，et al.，inPCR Protocols，pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman，et al.，in PCRProtocols，pp.219-227所述，可确定所用的适当的反应条件。
在另一个方法中，使用核酸杂交技术可检测编码功能性蛋白质之基因的mRNA转录物，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。在使用该技术时，提取自生物体样品的RNA或mRNA与探针杂交，所述探针含有与编码功能性蛋白质的基因互补的序列。本文所用术语“探针”指的是这样一种核酸分子，它具有与其靶核酸序列基本上互补的核苷酸序列，因而能在高度严紧的杂交条件下形成可测的杂合探针：靶双链体。“探针：靶双链体”是在两个互补的核酸分子之间形成的双链结构。该结构足够稳定，从而能经受住杂交后的洗涤条件，并能通过放射性同位素、化学发光分子、荧光团或其它荧光标记、可与探针结合的酶，如洋地黄毒苷、萤光素酶、碱性磷酸酶或半抗原被检测到。本文所用的“肽-核酸”(PNA)是含有与肽骨架而不是磷酸二酯骨架相连的配体的化合物。代表性的配体包括通过适当的接头与肽骨架连接的四个主要的天然DNA碱基(即胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤)或其它天然的核碱基(如肌苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或硫尿嘧啶)或人工碱基(如溴胸腺嘧啶、氮腺嘌呤或氮鸟嘌呤等)。PNA能结合互补的ssDNA和RNA链。制备和使用PNA的方法公开于美国专利5,539,082和，例如Basile A，Giuliani A，Pirri G andChiari M，Electrophoresis，2002Mar；23(6)：926-9。
在与探针杂交之前，可将分离自生物体样品的RNA或mRNA，或由mRNA合成的cDNA固定在固体支持物上。固体支持物可以是例如杂交膜，如尼龙或硝酸纤维素膜，载玻片或微芯片。可通过Northern杂交、点印迹杂交或本领域已知的任何其它杂交技术使探针与固定化的RNA，mRNA或cDNA杂交。
或者，可将探针固定在固体支持物，如尼龙或硝酸纤维素膜，载玻片或微芯片上。在此方法中，标记提取自组织样品的RNA，mRNA或cDNA以检测与探针的杂交。
术语“杂交”指的是众所周知的方法，通过此方法，在足够严紧的杂交条件下，核酸仅与基本上互补的序列特异性杂交。如本文所述的某核酸序列与另一个核酸序列“基本上互补”指的是这样一种情况，即85％以上，优选90％，更优选95％，甚至更优选100％的该序列能与另一个序列形成沃森-克里克碱基配对。基本上互补的序列可在序列中含有错配，或者可含有如下所述的末端，如翻译起始位点之间的序列外侧的引物末端，或为了有助于克隆探针或检测探针杂交而添加的末端。在针对特定系统而定义的严紧条件下，基本上互补的序列会杂交。本领域技术人员可定义适当的杂交条件。参见例如Sambrook et al.，DNA Cloning，vols.I，II and III.Nucleic AcidHybridization。然而，一般说来，核酸分子杂交或退火的“严紧条件”如下：
(1)洗涤时使用低离子强度和高温，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，50℃，或
(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，如50％(vol/vol)甲酰胺，其中含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM NaCl，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，42℃。
另一例是在杂交时使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，经超声波处理的鲑精DNA(50μg/mL)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，并于42℃用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。
在洗涤杂交复合物之后，根据众所周知的技术检测杂交复合物。可通过一般用于检测是否存在杂交核酸的几种方法中的任一种来标记能与靶或经标记的RNA，mRNA或cDNA特异性杂交的经标记的核酸探针。一个常用的检测方法是使用经3H，125I，35S，14C或32P等标记的核酸进行放射自显影。对放射性同位素的选择取决于因选定同位素的合成容易度、稳定性和半寿期所致的研究选择。其它标记包括化合物(如生物素和洋地黄毒苷)，它能结合经荧光团、化学发光剂和酶标记的抗配体或抗体。或者，探针可与如荧光团、化学发光剂或酶的标记直接偶联。对标记的选择取决于所需的敏感性、与探针偶联的容易度、稳定性需求和可利用的仪器设备。
探针可以是任何长度，但该长度应足以使探针与编码功能性蛋白质之基因的mRNA转录物或合成自该mRNA转录物的cDNA特异性杂交。优选探针含有至少15个碱基对。更优选探针含有至少50个碱基对。甚至更优选探针含有至少300个碱基对。
可使用本领域已知的方法和本文所述的核苷酸序列测定探针序列。
在RT-PCR或杂交之后，可通过本领域已知的方法检测经标记的核酸。例如，可使用照相胶片、感光成像仪、闪烁计数器检测经放射性标记的分子，使用光检测器检测经荧光标记的分子，通过给酶提供底物并检测反应来检测酶标记。
通过使用特异性针对功能性蛋白质的抗体检测功能性蛋白质或其片段，即可检测功能性蛋白质的表达，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。可通过本领域已知的方法制备抗功能性蛋白质的抗体。首先，必须制备和分离功能性蛋白质。可通过任何本领域已知的用于制备和分离蛋白质的方法来制备功能性蛋白质。例如，可使用重组DNA技术，以允许使用载体和本领域已知技术过表达第一和第二基因的方式克隆由mRNA转录物合成的cDNA分子。可由真核细胞系、植物、酵母、真菌或细菌细胞表达克隆的基因。然后使用众所周知的方法，如用硫酸铵沉淀、PEG沉淀、等电聚焦、凝胶电泳、如离子交换、反相、羟基磷灰石、亲和层析的凝胶过滤层析及其组合纯化基因产物。
一旦分离出基因产物，可使用本领域众所周知的方法(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，1988)针对蛋白质产物制备特异于蛋白质的抗体。然后，在检测功能性蛋白质表达或其表达的缺乏的免疫检测方法中使用抗体。免疫检测方法包括获得可能含有蛋白质的样品，使样品与抗蛋白质的抗体接触，并检测抗体与蛋白质的结合。
通常，将生物样品与抗功能性蛋白质的抗体一起保温足够长的时间，保温条件足以使抗体和蛋白质之间形成免疫复合物。保温抗体和样品的方法包括例如：免疫组化(参见例如Diagnostic immunopathology，2nd Edition，Colvin，R.B.，Bhan，A.K.，McCluskey.Eds，Raven Press，New York，1995)、ELISA平板、点印迹、Western印迹和FACS分析。通常应洗涤复合物以除去未结合的抗体，并检测免疫复合物。
在通过免疫组化或免疫病理学分析检测生物组织切片以及固定细胞中功能性蛋白质的表达时，可使用抗功能性蛋白质的抗体。本发明的范围还包括细胞化学分析，其中这些抗体被(例如荧光素、胶体金、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)直接标记，或通过使用经(本文列举的多种标记)标记的第二抗-物种抗体而被标记以示踪疾病的组织病理学。
可使用ELISA检测法检测功能性蛋白质的表达，其中将特异于功能性蛋白质的抗体固定于固体支持物上，随后，与生物样品保温一段时间，本领域技术人员可容易地确定保温时间。保温后，洗涤免疫复合物以除去未结合的蛋白质，将复合物与经标记的特异于蛋白质的第二抗体一起保温以形成“夹心”免疫复合物。随后，通过检测结合的经标记抗体的存在来检测样品中的功能性蛋白质。然而，本领域技术人员应懂得：可按照多种不同的已知方法进行ELISA测定，这取决于例如待测的样品、所用抗体的类型和所用的检测方法。
对免疫复合物形成的检测是本领域众所周知的，通过使用多种方法可达到此目的。优选用可测的标记，如放射性标记、荧光标记、生物学或酶学标记或本领域已知的其它标记来标记抗体。也可使用第二结合配体，如第二抗体。
通过扩增对应于编码功能性蛋白质之基因的部分基因组，并测序扩增的部分以确定扩增的部分是否含有编码功能性蛋白质的基因，即可测定生物体表达功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。测序经扩增核酸的方法是本领域已知的，描述于例如Sambrook et al.(1989)。
可使用与已知的香味表型相关多态性互补的引物或探针序列检测编码功能性蛋白质之基因中的突变。例如，可使用与有香味水稻品种Kyeema的fgr基因的多态性区域互补的引物或探针序列来测定其它水稻品种或其它生物是否具有这种多态性。在对有香味的生物体的突变fgr基因进行测序后，本领域技术人员可容易地确定能与多态性区域杂交，因而能检测具有多态性的品种的引物对或探针的序列。通过本领域众所周知的方法可检测引物或探针与靶核酸的杂交(或其缺乏)。例如，可如上文所述标记引物或探针。可使用PCR检测引物的杂交(如上文所述)。在一个形式中，可使用实时PCR检测引物与编码功能性蛋白质之基因的杂交。使用实时PCR检测突变的方法描述于例如Germer et al.(2000)Genome Res.10(2)：258-266；Shwartz et al(2004)32(3)：e24；Tapp et al.(2000)Biotechniques 28(4)：732-738。
使用本领域已知的方法和本文描述的核苷酸序列可确定引物序列。
引物序列的长度可以是10bp至50bp(例如10至40bp，10至30bp，12至30bp)，一般长度为12至25bp。在引物延伸反应中可只使用引物，或者，引物可以是PCR所用引物对中的一个引物。PCR方法是本领域已知的，本文也有所描述。可使用本领域已知和本文所述的方法标记引物以用作探针。
本发明还提供了制备能产生香味的生物体的方法。所述方法包括鉴定一或多种亲代生物体，其含有至少一个不能表达功能性蛋白质的突变fgr基因。可使用上文所述的任何方法鉴定亲代生物体。也可以设想将通过第二方面的实施方案产生的、其fgr基因被突变的生物体用作亲代生物体。
一旦鉴定出亲代生物体，可在允许生物体之间交配产生后代的条件下培养至少两个亲代生物体。本文所用术语“交配”指的是任何在亲代生物体之间发生DNA交换的过程。DNA交换的机理包括接合、噬菌体-介导的转导、原生质体融合、性重组等。亲代生物体交配之后，选择突变fgr基因为纯合的后代。
产生香味的生物体可在整个或部分生物体中产生香味，这一点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在一个实施方案中，生物体是植物。当生物体是植物时，方法一般包括：
(a)鉴定第一个亲代植物和第二个亲代植物，其中第一和第二个亲代植物包含至少一个突变fgr基因，其中第一和第二个植物能异花传粉；
(b)用第二个亲代植物的花粉对第一个亲代植物进行传粉，或用第一个亲代植物的花粉对第二个亲代植物进行传粉；
(c)在能产生后代植物的条件下培养经传粉的植物；
(d)选择突变fgr基因为纯合的后代植物。
选择纯合后代的方法包括上文所述的任何用于测定生物体是否能表达功能性蛋白质的方法，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。本领域技术人员应懂得：由于香味表型是隐性表型，优选有香味的生物体是纯合的。
在另一个实施方案中，生物体是酵母。可在允许通过下述方式交配的条件下培养酵母细胞：
(a)集中遗传趋异的酵母细胞群体；
(b)使集中的细胞形成孢子，萌发孢子以产生单倍体细胞；
(c)使单倍体细胞合适的交配型杂交以产生杂合的酵母细胞。
形成孢子、获得单倍体、使单倍体杂交以产生杂合酵母细胞的方法是本领域已知的，描述于例如Chapter 7，“Sporulation and Hybridisation of Yeast”by R.R.Fowell，A.H.Rose and J.S.Harrison，1969，Academic Press；EP 0 511108 B。使用细胞融合技术产生种内或种间杂合体的方法描述于例如(Spencer et al.(1990)in，Yeast Technology，Spencer JFT and Spencer DM(eds.)，Springer Verlag New York)。
本领域技术人员应懂得：一旦获得突变fgr基因为杂合或纯合的生物体，可将杂合或纯合的生物体用于育种计划或交配程序以将产生香味的能力转移至无香味的生物体。
通过本发明的方法鉴定或产生的有香味的生物体可用于制备该生物体适于制备的任何食品。例如，谷类作物可用于产生稻米、面粉和麦芽渣，用于生产诸如面包、啤酒和其它发酵和非发酵饮料的食品。酵母可用于生产例如面包、啤酒和葡萄酒。真菌和细菌可用于生产例如干酪和发酵的乳制品，如酸乳酪。
以下将通过非限制性的实施例阐明本发明。
实施例
实施例1
引言
为了鉴定出编码水稻香味表型之基因的染色体位置，使用简单序列重复(SSR)或微卫星2和单核苷酸多态性(SNP)3标记对分离群体进行作图。水稻基因组序列14的可获得性允许比较香味和无香味基因型的序列。这样就可以将香味基因型中基因和基因组序列靶向重新测序至染色体8的最可能部分。
材料和方法
植物材料
在此研究中，将Yanco Agricultural Institute，NSW Agriculture提供的168个野地生长的F2个体群体用作作图群体，所述个体源自Kyeema(Pelde//Della/Kulu)(高的，茉莉香型，有香味，长-谷粒，澳大利亚栽培品种)和Gulfmont(Lebonnet//CI9881/PI 331581)(早熟，半-矮生，无香味，长-谷粒，美国栽培品种)之间的杂交。
进行遗传作图之后，在已公开的基因组序列的侧翼标记之间的区域鉴定出候选基因，对有香味水稻品种Kyeema中的候选基因重新测序。通过肉眼观察Kyeema的序列与已公开的无香味品种Nipponbare基因组序列的序列比对鉴定出多态性。对12个有香味和67个无香味品种中被认为可能会导致香味的多态性进行基因定型。
遗传作图
根据Berner and Hoff19评价香味。通过品尝去壳的F3种子将F2个体的表型分为有香味的、分离的或无香味的。单独咀嚼至少12个得自各个F2植物的F3种子。如果所有12个F3种子都有香味或无香味，将F2植物分别列为纯合的有香味或无香味植物。得自杂合F2植物的F3种子有望含有有香味的和无香味的种子，因此，如果得自单个F2植物的样品是有香味样品和无香味样品的混合物，那么认为F2植物是杂合的。通过针对单个基因预期比率的X2分析测定所观察到的有香味的∶分离的∶无香味的分离比率。
鉴定之后，通过比较亲代等位基因评价SSR的多态性。对作图群体的F2个体中的多态性SSR进行基因定型。使用MAPMAKER V.3.0估计fgr和多态性SSR之间的遗传距离，并将其测定为重组染色体(cM)的百分比。
生物信息学和计算机程序
控制水稻谷粒香味的主要基因位于RG1和RG28 RFLP标记之间(Lorieux et al.1996)。根据其与RFLP标记R1和RG28的邻近程度选择14个BAC克隆，BAC的序列得自GenBank(http://rgp.dna.affrc.go.jp)。通过使用得自http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool的简单序列重复鉴定工具(SSRIT)鉴定SSR。另外，选择9个已作图的位于RG1和RG28之间的微卫星标记(S.R.McCouch et al，2002)来评价多态性。这些标记的引物序列得自http://www.gramene.org/microsat/ssr.html。使用Primer Premier Version 5.0(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)设计寡核苷酸引物。使用ChromasPro version 1.15 Technelysium Pty Ltd(www.technelysium.com.au/ChromasPro.html)比对序列。BAC AP004463序列得自NCBI站点(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝24460082)。使用检索术语AP004463从Knowledge-based Oryza Molecular biologicalEncyclopedia(KOME)站点(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)获得EST序列，根据它们与微卫星标记SSR-J02和SNP标记RSP04的邻近程度及其预测的功能选择EST序列。
DNA提取、PCR、基因定型和序列分析
使用Qiagen Dneasy96Plant试剂盒(Qiagen GMbH，Germany)提取基因组DNA。用TE缓冲液稀释DNA制品至终浓度约为每μl 10ng。通过ProligoAustralia Pty Ltd合成寡核苷酸引物。使用Perkin Elmer，Gene Amp PCRsystem 9700进行PCR。反应体积为25μl，其中含有20ng提取的基因组DNA，2.5mM MgCl2，200μM总dNTP，1个单位PlatinumTaq DNA聚合酶(GibcoBRL)，1×GibcoPCR缓冲液(减去MgCl2)和各为0.2μM的正向和反向引物。循环条件为94℃，2分钟，接着是94℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟共30个循环，接着于72℃最终延伸7分钟。
通过PCR扩增SSR，在经溴化乙锭(0.5ug/ml-1)染色的2.0％琼脂糖中电泳，或使用Corbett Robotics Gel-Scan 2000TM电泳来分析SSR。使用100bp的梯状分子量标准(Roche)估计PCR片段的大小。
在测序之前，使用剪辑PCR滤器装置(montage PCR filter device，Millipore Corporation)纯化PCR产物。使用BigDye Terminator version 3.1，Applied Biosystems进行序列反应，通过乙醇沉淀纯化完成的反应。在Applied Biosystems 3730Genetic Analyser上分析反应产物。
结果
对分子标记和香味表型的遗传作图表明：标记RM515和SSR-J07侧翼于fgr(图1)。RM515和SSRJ07之间的物理距离是386 591bp。数据表明：与SSRJ07相比，fgr与RM515更近。起初，测序工作集中在包括这两个标记的一个Mbp的区域，但对作图的数据仔细检查后发现：一个BAC(克隆AP004463，图2)最有可能含有该基因。对该BAC中的17个基因进行测序，结果揭示出仅在一个基因中出现显著的序列变异。该区域的其它基因显示出极少的多态性。
根据其在AP004463BAC克隆(图3)中的位置，以及预测产物的指定的推定功能选择17个cDNA(表1)。针对AP004463BAC克隆中对应于产生这些cDNA的基因的区域设计引物，随后，从有香味的水稻栽培品种Kyeema中扩增这些区域并测序。该分析揭示出6个多态性，其中3个位于外显子中，包括位于一个候选基因的外显子内的大的多态性，所述候选基因在KOME中被列为cDNA克隆J023088C02。该大的多态性在25bp的区域内总共含有6个SNP和8个缺失(图4)。为了辅助确证该多态性就是香味表型的原因所在，对12个有着不同香味和67个无香味的水稻品种进行该外显子区域的序列分析。在12个有香味的品种中，在Kyeema中观察到序列多态性，而67个无香味品种显示出与已公开的Nipponbare序列相同的序列。对其它4个有香味品种中得自候选基因的其它3个外显子多态性和1个内含子多态性进行序列分析，这些多态性存在于所有这些品种中。
图5显示了无香味水稻品种Nipponbare的fgr基因的全长DNA序列(SEQ ID NO：2)。
图7显示了得自有香味和无香味表型的cDNA序列的比对。
其它生物体
图8至19显示了水稻(Nipponbare)、小麦、大麦、高粱、玉蜀黍、Z.tenuifolia、粟酒裂殖糖酵母、酿酒酵母、Yarrowia lipolytica、木糖葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的功能性蛋白质编码区的氨基酸和核苷酸序列。图20显示了使用ClustalW对小麦、大麦、水稻和Z.tenuifolia的功能性蛋白质的氨基酸序列进行的序列比对，同时还显示了序列之间配对的同一性百分比(评分值的下方)。图21显示了使用ClustalW对(所示)多种生物体的BADH2蛋白的氨基酸序列进行的序列比对。
图22显示了使用ClustalW对多种生物体的BAD2基因编码区和水稻BAD1的氨基酸序列进行的序列比对。
图23显示了使用ClustalW测定的(所示)多种生物体的fgr基因所编码蛋白质的氨基酸序列的百分比同一性。评分值下方给出了配对的百分比同一性。
表1.与BAC克隆AP004463有关的cDNA以及在Kyeema中发现的多态性
  CDNA名称   在AP004463上的位置   推定的功能(由KOME站点指定)   成果
  J023007E19   31608-42043   发动蛋白-样蛋白6(ADL6)，与发动蛋白-样蛋白6(ADL6)[拟南芥]GI：6651399相同   93％被测序1个缺失1-2个SNP，都位于外显子上(包括Jin’s SNP)
  J013034N11   47127-51166   被表达的蛋白质假拟蛋白AT4g04330[被输入的]-拟南芥   81％被测序在外显子中发现1个SNP
  001-027-C04   83087-84888   膜联蛋白5(ANN5)，与钙-结合蛋白膜联蛋白5[拟南芥]GI：12667520相同   60％被测序
  006-203-B12   83090-84884   膜联蛋白5(ANN5)，与钙-结合蛋白膜联蛋白5[拟南芥]GI：12667520相同   60％被测序
  J033030L06   88552-85143   未定义   76％被测序
  J023141K11   31627-39204   发动蛋白-样蛋白[被输入的]-拟南芥   87％被测序
  006-303-C12   88573-85145   被表达的蛋白质   85％被测序
  002-120-B12   75659-73421   内切核酸酶/外切核酸酶/磷酸酶家族蛋白，类似于肌醇多磷酸5-磷酸酶I(GI：10444261)和II(GI：10444263)   35％被测序
  J023088C02   3212-9364   甜菜-醛脱氢酶，推定的与甜菜-醛脱氢酶，叶绿体前体(BADH)[拟南芥]SWISS-PROT：Q9S795相同；与甜菜-醛脱氢酶[Amaranthushypochondriacus]GI：2388710非常类似甜菜-醛脱氢酶，叶绿体前体(EC 1.2.1.8)(BADH)[go：4028]醛脱氢酶活性[go：8802]甜菜-醛脱氢酶活性[go：19285]甜菜自胆碱出发的生物合成[go：6561]脯氨酸的生物合成   100％被测序6个插入 &1个SNP，皆位于微卫星区域(内含子)在4个有香味的物种中是保守的外显子中大的多态性67个无香味和12个有香味品种的大的多态性区域已被测序，除了未显示出多态性的Goolarah外，结果是相符的。
  J013028P07   91963-92191   未描述   100％被测序
  J013002P24   54060-52936   糖基水解酶家族9蛋白，类似于[Fragaria xananassa]的内-β-1，4-葡聚糖酶GI：4972236
  001-117-A06   25415-29362   被表达的蛋白质，类似于假拟蛋白GI：4455225[拟南芥]   70％被测序内含子中有1个SNP T→A，产生了ATG(可能的起始密码子)
  J033114E08   94343-95371   钙调蛋白-结合蛋白，类似于α葡糖苷酶IIβ亚单位GI：2104691[Mus musculus]   100％被测序
  J013074K16   35679-35774   发动蛋白-样蛋白，推定的(ADL 3)，与发动蛋白-样蛋白6(ADL6)[拟南芥]GI：6651399非常类似   100％被测序
  J013074K14   54306-52936   糖基水解酶家族9蛋白，类似于[Fragaria xananassa]的内-β-1，4-葡聚糖酶GI：4972236   65％被测序
  002-143-E11   94336-95371   钙调蛋白-结合蛋白，类似于α葡糖苷酶IIβ亚单位GI：2104691[Mus musculus]   100％被测序
  001-128-E04   54096-52928   糖基水解酶家族9蛋白，类似于[Fragaria xananassa]的内-β-1，4-葡聚糖酶GI：4972236   77％被测序
  汇总   17,388bp被测序-个区域有5个SNP/加上7个缺失/插入→6-12多态性→每2898-1449bp有一个多态性
讨论
图6显示了由Nipponbare的fgr基因和Kyeema的突变fgr基因编码的蛋白质的推测氨基酸序列。在无香味水稻的基因中发现的肽序列(VTLELGGKSP)和半胱氨酸残基(在BAD1和BAD2中都相距28个氨基酸残基)在醛脱氢酶中是高度保守的15。在可能由有香味品种的基因编码的较短蛋白质中，这些保守的元件被丢失。BAD基因还含有在无香味品种的基因中发现的保守肽EGCRLGSVVS。
Nipponbare的fgr基因编码与甜菜醛脱氢酶(BAD)高度类似的蛋白质。已证实燕麦的BAD对氨基醛和相关化合物有宽泛的底物特异性。水稻的BAD由染色体4上的基因编码。已证实大麦含有两个BAD同工酶，这两种酶可能具有不同的底物特异性17。Nipponbare的fgr基因对应于大麦的BAD2基因。在相同的亚细胞区室产生两个不同的亚单位可能会形成两个亚单位的异二聚体。
尽管尚未确定导致水稻香味的生物化学途径，但已证实L-脯氨酸是水稻香味的前体18。不希望受理论的束缚，本发明人相信fgr基因可编码一种蛋白质，此蛋白质能催化形成或除去2-乙酰基-1-吡咯啉或2-乙酰基-1-吡咯啉的前体。然而，香味是隐性的性状，这表明功能的丧失导致2-乙酰基-1-吡咯啉的积累，而由有香味基因型编码的截短形式的蛋白质是无功能的，它偏向后一假说。
实施例2
对于任何单个的分析者来说，由于其感觉会变得饱和，或者经常因咀嚼硬谷粒导致舌头磨损而造成身体伤害，其区分有香味和无香味样品的能力会随着每个接连不断的分析的进行而降低。
下文描述的是开发PCR测定法以对水稻香味进行基因定型。
植物材料
所有水稻样品由Yanco Agricultural Institute，NSW Agriculture提供。除了168个野地生长的F2个体的群体外，还使用14个有香味品种和74个无香味品种的不同收集物来验证标记，其中所述F2个体源自Kyeema(Pelde//Della/Kulu)(高的，茉莉香型，长-谷粒，澳大利亚栽培品种)和Gulfmont(Lebonnet//CI9881/PI 331581)(早熟，半-矮生，无香味，长-谷粒，美国栽培品种)之间的杂交。
遗传作图
按实施例1所述进行遗传作图。
引物设计
使用Primer Premier Version 5.0(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)设计寡核苷酸引物。对于无香味品种而言，由NCBI站点(www.ncbi.nlm.nih.gov)GenBank登录号-AP004463获得编码功能性蛋白质的基因序列，对于有香味的品种而言，使用fgr基因的序列(图7-水稻截短的BAD2)。
DNA提取、PCR和基因定型
使用Qiagen DNeasy96Plant试剂盒(Qiagen GMbH，Germany)从叶材料中提取基因组DNA，按Bergman et al.(2001)Cereal Chemistry 78：257-260所述从整个种子中提取基因组DNA。通过在50μl 10×PCR缓冲液(Gibco BRL)中将0.1g叶材料煮沸10分钟以进行大致的叶DNA提取。通过ProligoAustralia Pty Ltd合成寡核苷酸引物。使用0.2μl PlatinumTaq DNA聚合酶(Gibco BRL)，1μl基因组DNA 10ngμl-1，2.5μl 10×缓冲液(Gibco BRL)，1μl 50mM MgCl2(Gibco BRL)，1μl dNTP[5mM]，2.5μl各种引物(ESP，IFAP，INSP和EAP，表X)[2μM]，在25μl的总体积中进行PCR。使用PerkinElmer，Gene Amp PCR system 9700进行PCR。循环条件为：首先于94℃变性2分钟，接着94℃5秒，58℃5秒，72℃5秒，共30个循环；最后于72℃最终延伸5分钟。
                      表2
  引物名称  引物序列
  外部有义引物(ESP)  TTGTTTGGAGCTTGCTGATG
  内部有香味的反义引物(IFAP)  CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC
  内部无香味的有义引物(INSP)  CTGGTAAAAGATTATGGCTTCA
  外部反义引物(EAP)  AGTGCTTTACAAAGTCCCGC
通过在经溴化乙锭染色(0.5μg ml-1)的1.0％琼脂糖凝胶中电泳来分析PCR产物。使用100bp的梯状分子量标准(Roche)估计PCR片段的大小。
结果
开发单管等位基因特异性PCR香味测定法
设计并合成4个引物，其中2个与有香味和无香味品种所共有的、位于突变发生区域外部的序列退火，另外2个特异于两个可能的等位基因中的一个(图24)。设计两个外部引物，以用作扩增有香味(577bp)和无香味(585bp)基因型中约580bp的区域的内部阳性对照。单独地，这些外部引物也与内部序列配对，根据DNA样品基因型的不同而产生大小不同的产物。内部引物IFAP和INSP(表2)仅与其特定的基因型退火，它们分别同与其相对应的外部引物对ESP和EAP产生DNA片段。在PCR中使用这4个引物导致3种可能的结果。在所有情况下都会产生约为580bp的阳性对照条带。在第一种情况下，产生了355bp的条带，这表明一个品种或个体是纯合的无香味的。在第二种情况下，产生了257bp的条带，这表明一个品种或个体是纯合的有香味的。在第三种情况下，产生了大小为355bp和257bp的两条带，这表明一个个体是杂合的无香味的。
使用单管ASA PCR香味测定法确定植物基因型
在琼脂糖凝胶上能容易地分离PCR产物。将约580bp的PCR产物用作阳性对照，它存在于每一个样品中。有香味的个体具有大小为257bp的第二个产物，而无香味的个体具有大小为355bp的产物，通过所有3种PCR产物的存在也可区分杂合子(图25)。
该测定法以100％的准确度预测了168个F2后代因香味而分离的表型(46个纯合的有香味的，80个杂合子，42个纯合的无香味的)(图26)。该测定法还可使用通过简单的NaOH提取法(Bergman et al.，2001)从水稻谷粒中提取的DNA，以及使用简单的10分钟煮沸法从叶中提取的DNA来区分有香味和无香味的谷粒。进一步的评价表明：该测定法能够对宽范围的有香味品种，如Basmati 370，Kyeema，Khao Dwak Mali 105和Moosa Tarom起作用。
结果表明：特异性PCR测定法能区分水稻植物个体的基因型状况是纯合的有香味的，纯合的无香味的还是杂合的无香味的。该测定法是简单又有效的方法，该方法使用经简单、便宜和快速的提取方法从水稻中分离的DNA，可在宽范围的水稻品种间和分离的群体内筛选水稻以确定其香味状况。在琼脂糖凝胶上，或者使用更高级的高通量装置可以容易地和便宜地分析PCR产物，从而使该测定法成为非常通用的工具。
以下实施例是本发明实施方案预言性的实施例。
预言实施例1
对玉米进行转座子诱变以因2-乙酰基-1-吡咯啉浓度升高而产生有香味的玉米
根据Robert J.Bensen，Gurmukh S.Johal，Virginia C.Crane，John T.Tossberg，Patrick S.Schnable，Robert B.Meeley，and Steven P.Briggs.(1995)Cloning and Characterization of the Maize Anl Gene.The Plant Cell，Vol.7，75-84的方法，产生和筛选转座子突变品系。
产生含Mu的F1玉米家族群体(20,000-30,000个个体)，随后使用聚合酶链反应(PCR)筛选所述群体，以检测编码BAD2的基因中有Mo插入的等位基因的存在。使用被应用于MWG Biotech TheOnyx液体处理自动仪器的QiagenMagAttractTM 96chemistry从叶材料中分离基因组DNA。
分别使用正向引物5’-ATGGCCTCGCAAGCGAT-3’(SEQ ID NO：31)和反向引物5’-TCCACCTCTTATAATGGCACAGTT-3’(SEQ ID NO：32)与BAD2编码序列的5’末端和BAD2mRNA的3’UTR退火。使用引物5’-CCCTGAGCTCTTCGTC(CT)ATAATGGCAATTATCTC-3’(SEQ ID NO：33)与所有功能性Mu元件共有的末端反向重复的末端部分退火。可通过本领域已知的方法合成引物。用Corbett Rotor-GeneTM进行PCR，通过Sybr-Green检测PCR产物。当用Sybr-Green检测PCR产物时，首先通过琼脂糖凝胶电泳反应的等分试样，接着通过DNA测序来证实结果。PCR的体积为10μl，其中含有10ng提取的基因组DNA，1.5mM 200μM总dNTP，0.5个单位PlatinumTaqDNA聚合酶(Gibco BRL)，1×GibcoPCR缓冲液(减去MgCl2)和各为0.2μM的正向和反向引物。循环条件可以是94℃5分钟，接着94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒共35个循环，最后于72℃延伸7分钟。使用BigDye Terminator循环测序(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Forster City，CA)对PCR产物进行测序，通过Applied Biosystems 3730DNA分析仪(Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Forster City，CA)分析产物。
通过使用正向或反向引物时的PCR产物产生情况鉴定出在BAD2编码基因中含有插入的F1个体，其中所述引物与和Mu-特异性引物配对的BAD2编码基因退火。然后，在温室中种植产生PCR产物的植物的F2种子，对其香味表型进行评分。
通过在氮气中研磨约5g玉米叶材料，接着在室温下，在20ml无水乙醇(99.9％)中保温24小时，可测定玉米叶中2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的浓度[Natta Laohakunjit and Athapol Noomhorm(2004)Flavour and FragranceJournal 19：251-259.Supercritical carbon dioxide extraction of 2-acetyl-1-pyrroline and volatile components from pandan leaves]。将上清液过滤至制剂中以进行GC-MS分析，使用HP 5890 Series II GC/HP 5972质量选择检测仪(MSD)(Hewlett-Packard，California，US.)分析双份提取物，所述检测仪上配备有毛细管柱(Innowax，25m×0.2mm i.d.，0.4μm膜厚度；Agilent Technologies，CA)。注入2μl提取物溶液进行分析。烤箱温度设置为50℃2分钟，然后依靠程序控制以7℃/分钟的速度从50℃升高至170℃，维持在170℃达5分钟。其它操作条件如下：注射器温度，170℃；载气，流速为0.6ml/分钟的氦气；离子源温度，230℃；电子倍增器电压，2600V。以无裂痕的模式注射样品。通过将其质谱数据与得自相同装置的质谱数据匹配，即可试验性地鉴定出化合物。通过使用m/z(质量/电荷)峰面积的测量结果41(50)，43(100)，55(2)，67(0.2)，68(8)，83(11)，111(5)，借助于仪器的数字积分器对提取物中的2AP进行定量测定。通过10至200ng/注射所得的标准校准曲线将峰面积与浓度相关联。为了使错误最小化，可使用外部标准，在定量分析2AP时，将2，4，6-三甲基嘧啶(TMP)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)用作外部标准。
预言实施例2
UV诱变酵母以在酵母中产生水平有所增加的2AP的方法
菌株和培养基
在此实施例中，使用由Fa.Wieninger，Passau，Germany提供的酿酒酵母(面包酵母)分离具有无功能的BAD基因的酵母菌株。于28℃，在YPD培养基(1％酵母提取物，2％聚胨，2％葡萄糖，必要时还含有2％琼脂)上培养酵母。
诱变和突变体分离
将于28℃在液体YPD培养基中培养24小时的细胞铺于YPD培养基平板(每个平板20μl)。以35cm的间距将平板置于UV灯(Toshiba GL15)下照射15秒。照射后，将平板置于28℃保温，24小时后，挑选单个菌落，在含有1ml液体YPD培养基的单个培养瓶中进行继代培养。将培养瓶涡旋几下，再保温2小时，然后各取2μl用于相应的PCR筛选。
PCR、基因定型和序列分析
通过本领域已知的方法合成寡核苷酸引物。使用0.2μL PlatinumTaqDNA聚合酶(Gibco BRL)，2μL酵母培养物(DNA)，2.5μL 10×缓冲液(GibcoBRL)，1μL 50mM MgCl2(Gibco BRL)，1μL dNTP(5mM)，2.5μL各种引物对-(表1)[2mM]，总体积为25μL进行PCR。使用Perkin Elmer，Gene AmpPCR system 9700进行PCR。循环条件为：首先于94℃变性2分钟，接着94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后于72℃最终延伸5分钟。对每个样品进行3次PCR反应，每个反应使用不同的引物对(表1)。
通过在经溴化乙锭染色(0.5μg ml-1)的1.0％琼脂糖凝胶中电泳来分析PCR产物。使用100bp的梯状分子量标准(Roche)估计PCR片段的大小。
使用剪辑PCR滤器装置(Millipore Corporation)纯化PCR产物。使用BigDye Terminator version 3.1(Applied Biosystems)进行序列反应，通过乙醇沉淀纯化完成的反应。在Applied Biosystems 3730 Genetic Analyser上分析反应产物。使用ChromasPro version 1.15(Technelysium Pty Ltd，www.technely-sium.com.au/ChromasPro.html)进行序列比对，将图27中的序列用作标准的野生型序列。
引物和引物设计
使用Primer Premier Version 5.0(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)设计寡核苷酸引物。
下表3列出了可用于对酿酒酵母的完整BAD基因进行测序的引物例子。
表3.PCR和对酿酒酵母BAD基因进行测序所用的引物
  5’有义引物3’   5’反义引物3’
 第1对   GAGAAATGAATAATGTAGGA   TTGTAGACTGGGAAAATC
 第2对   AAGCTACGCTGTAGTATCCA   GTCGTTGTCCTTGTGGG
 第3对   ACCGCCTTGACTGTTGC   CGGGCTCTTATTCTCCACT
通过气相层析分析2AP
根据Munch，P and Schieberle(1998)Quantitative Studies on the Formationof Key Odorants in Thermally Treated Yeast Extracts Using Stable IsotopeDilution Assays.Journal of Agricultural Food Chemistry.46，4695-4701的方法，通过气相层析分离和分析2AP。
预言实施例3
产生具有BAD2 RNAi的转基因小麦的材料和方法
设计RNAi插入物
RNAi插入物可来自小麦BAD2 cDNA的5’末端。该区域与BAD1基因同系物中的相同区域有76.8％的同源性。在此实施例中，设计RNAi插入物，使得转基因植物显示出特殊的BAD2干扰，但无BAD1同系物干扰(图28)。
PCR、基因定型和序列分析
通过本领域已知的方法合成寡核苷酸引物。使用0.2μL PlatinumTaqDNA聚合酶(Gibco BRL)，2μL cDNA，2.5μL 10×缓冲液(Gibco BRL)，1μL50mM MgCl2(Gibco BRL)，1μL dNTP(5mM)，2.5μL各种引物对-(表1)[2mM]，总体积为25μL进行PCR。使用Perkin Elmer，Gene Amp PCR system9700进行PCR。循环条件为：首先于94℃变性2分钟，接着94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后于72℃最终延伸5分钟。对每个样品进行3次PCR反应，每个反应使用不同的引物对。
通过在经溴化乙锭染色(0.5μg ml-1)的1.0％琼脂糖凝胶中电泳来分析PCR产物。使用100bp的梯状分子量标准(Roche)估计PCR片段的大小。
使用剪辑PCR滤器装置(Millipore Corporation)纯化PCR产物。使用BigDye Terminator version 3.1(Applied Biosystems)进行序列反应，通过乙醇沉淀纯化完成的反应。在Applied Biosystems 3730 Genetic Analyser上分析反应产物。使用ChromasPro version 1.15(Technelysium Pty Ltd，www.technely-sium.com.au/ChromasPro.html)进行序列比对，将图28中的序列用作标准的野生型序列。
RNA提取和cDNA合成
使用Qiagen Rneasy提取试剂盒提取RNA，使用Roche cDNA合成试剂盒和锚着的poly T引物合成cDNA。
RNAi转基因植物方法
(以下方法基于Loukoianov et al.‘Regulation of VRN-1 VernalizationGenes in Normal and Transgenic Polyploid Wheat’Plant Physiol..2005；138：2364-2373的工作。)
可在二元载体pMCG161中制备RNAi构建体。该载体含有侧翼于环的盒，此盒被设计用于制备基因的反向重复转录物，所述环应能有效产生双链RNA。转基因的表达由紧接Adh1内含子之前的35S启动子驱动。在有义方向上将BAD2的245bp区段克隆至限制性位点AscI-AvrII之间，在反义方向上将该区段克隆至限制性位点SgfI-SpeI之间。通过Okubara et al.，(2002)Theor.Appl.Genet.106(1)：74-83所述的微粒轰击，用载体/RNAi构建体转化小麦品种“Banks”不成熟的胚。在茎干再生和生根培养基中加入3mg/L bialaphos以选择转化体。
通过使用由侧翼于有义和反义插入的载体序列设计的引物Fvector1和Rvector1(Yan et al.，2004b)对基因组DNA进行PCR，并通过使用35S启动子的探针进行Southern印迹来证实阳性转基因植物。通过使用针对pMCG161载体OCTOPINE SYNTHETASE PolyA区域之转录区的引物OCS-PolyA_F和Ri_AntiS_R(Yan et al，2004b)进行RT-PCR来证实选定T1植物和阳性T2后代中转基因的转录。用引物FBAD2RNAi1(5′CACATCAATGGAGATTTGGAGGGA 3′)(SEQ ID NO：40)和RBAD2RNAi1(5′AAAGCCGCTGCGCTTGTTCC 3′)(SEQ ID NO：41)进行RT-PCR来研究内源性BAD2的转录水平。
检测小麦植物中的2AP
通过在氮气中研磨约5g小麦叶材料，接着在室温下，在20ml无水乙醇(99.9％)中保温24小时，可测定小麦叶中2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的浓度[Natta Laohakunjit and Athapol Noomhorm(2004)Flavour and FragranceJournal 19：251-259.Supercritical carbon dioxide extraction of2-acetyl-1-pyrroline and volatile components from pandan leaves]。
将上清液过滤至制剂中以进行GC-MS分析，使用HP 5890 Series IIGC/HP 5972质量选择检测仪(MSD)(Hewlett-Packard，California，US.)分析双份提取物，所述检测仪上配备有毛细管柱(Innowax，25m×0.2mm i.d.，0.4μm膜厚度；Agilent Technologies，CA)。注入2μl提取物溶液进行分析。烤箱温度设置为50℃2分钟，然后依靠程序控制以7℃/分钟的速度从50℃升高至170℃，维持在170℃达5分钟。其它操作条件如下：注射器温度，170℃；载气，流速为0.6ml/分钟的氦气；离子源温度，230℃；电子倍增器电压，2600V。以无裂痕的模式注射样品。通过将其质谱数据与得自相同装置的质谱数据匹配，即可试验性地鉴定出化合物。通过使用m/z(质量/电荷)峰面积的测量结果41(50)，43(100)，55(2)，67(0.2)，68(8)，83(11)，111(5)，借助于仪器的数字积分器对提取物中的2AP进行定量测定。通过10至200ng/注射所得的标准校准曲线将峰面积与浓度相关联。为了使错误最小化，可使用外部标准，在定量分析2AP时，将2，4，6-三甲基嘧啶(TMP)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)用作外部标准。
预言实施例4
诱变水稻并通过TILING检测以产生因2-乙酰基-1-吡咯啉浓度升高而有香味的水稻的方法
通过乙基甲磺酸酯(EMS)诱变产生M1水稻家族的群体(5000-10,000个个体)。通过将种子浸入20mM EMS溶液达18小时以诱变种子。M1植株可自体受精以产生有5000-10,000个个体的M2群体。使用被应用于MWG BiotechTheOnyx液体处理自动仪器的QiagenMagAttractTM 96chemistry从5个M2个体的叶材料中分离基因组DNA。使用5’FAM标记的引物进行聚合酶链反应(PCR)以扩增BAD2编码基因的外显子：
F1，5′TTGATTGTGGGAAGCC 3′(SEQ ID NO：42)，R1，5′GCATTAACACGGAGGAG 3′(SEQ ID NO：43)
F2，5′TTTTGATGTGCCCTCT 3′(SEQ ID NO：44)，R2，5′ACCAGTTTCATAACTCCC 3′(SEQ ID NO：45)
F3，5′GGTGCTCCTTTGTCATC 3′(SEQ ID NO：46)，R3，5′TCCTAACTGCCTTCCTT 3′(SEQ ID NO：47)
F4，5′TGCCAACTGAGTAAAGAA 3′(SEQ ID NO：48)，R4，5′TGGTCAGGAGCAAGAA 3′(SEQ ID NO：49)
F5，5′TTGCACAGAGCGAATA 3′(SEQ ID NO：50)，R5，5′GACAAGATAAACCTACGG 3′(SEQ ID NO：51)
F6，5′TAGTCGGTGTATGCTCTT 3′(SEQ ID NO：52)，R6，5′AAACAATGCCAACCC 3′(SEQ ID NO：53)
F7，5′CTGGTGCTGTGCTTTC 3′(SEQ ID NO：54)，R7，5′AGTCCATCCCGTCATAC 3′(SEQ ID NO：55)
F8，5′TCCAAGCTGTAATGTAAT 3′(SEQ ID NO：56)，R8，5′TAACCAATGCCGATG 3′(SEQ ID NO：57)
通过本领域已知的方法合成引物。使用Perkin Elmer，Gene Amp PCRsystem 9700进行PCR。PCR体积为10μl，其中含有10ng提取的基因组DNA，1.5mM 200μM总dNTP，0.5个单位PlatinumTaq DNA聚合酶(Gibco BRL)，1×GibcoPCR缓冲液(减去MgCl2)和各为0.2μM的正向和反向引物。循环条件为94℃，5分钟，接着是94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒共35个循环，接着于72℃最终延伸7分钟。
PCR之后，加入20μl CEL I反应混合物(2.4ml水，420μl 10×CEL I缓冲液(100mM MgSO4，100mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH7.5，100mM KCl，0.2％TritonX-100，2μg/mL牛血清白蛋白)，36μl CELI提取物)，然后于45℃将PCR产物保温15分钟[Till，B.J.，Colbert，T.，Tompa，R.，Enns，L.C.，Codomo，C.A.，Johnson，J.E.，Reynolds，S.H.，Henikoff，J.G.，Greene，E.A.，Steine，M.N.，Comai，L.，Henikoff，S.(2003)High-ThroughputTILLING for Functional Genomics.Methods in Molecular Biology，Vol.236：Plant Functional Genomics：Methods and Protocols.p205-220]。通过加入5μL150mM EDTA，pH 8.0以终止反应，将反应产物上样于Applied Biosystems3730DNA分析仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Forster City，CA)。
通过对应于裂解PCR产物的层析谱中峰的出现来鉴定突变体。在鉴定突变体混合物时，通过PCR扩增混合物中个体的基因组DNA，并使用BigDye Terminator循环测序(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Forster City，CA)进行测序，通过Applied Biosystems 3730DNA分析仪(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Forster City，CA)分析产物。
将纯合的M2突变体个体培养至成熟，收集叶材料以测定2AP的浓度。将杂合的M2突变体个体培养至成熟，收集M3种子。使M3种子萌发，通过测序鉴定出纯合的突变体个体。在鉴定纯合的突变体M3个体时，收集叶材料以测定2AP的浓度。
通过在氮气中研磨约5g水稻叶材料，接着在室温下，在20ml无水乙醇(99.9％)中保温24小时，可测定水稻叶中2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)的浓度[Natta Laohakunjit and Athapol Noomhorm(2004)Flavour and FragranceJournal 19：251-259.Supercritical carbon dioxide extraction of2-acetyl-1-pyrroline and volatile components from pandan leaves]。
将上清液过滤至制剂中以进行GC-MS分析，使用HP 5890Series IIGC/HP 5972质量选择检测仪(MSD)(Hewlett-Packard，California，US.)分析双份提取物，所述检测仪上配备有毛细管柱(Innowax，25m×0.2mm i.d.，0.4μm膜厚度；Agilent Technologies，CA)。注入2μl提取物溶液进行分析。烤箱温度设置为50℃2分钟，然后依靠程序控制以7℃/分钟的速度从50℃升高至170℃，维持在170℃达5分钟。其它操作条件如下：注射器温度，170℃；载气，流速为0.6ml/分钟的氦气；离子源温度，230℃；电子倍增器电压，2600V。以无裂痕的模式注射样品。通过将其质谱数据与得自相同装置的质谱数据匹配，即可试验性地鉴定出化合物。通过使用m/z(质量/电荷)峰面积的测量结果41(50)，43(100)，55(2)，67(0.2)，68(8)，83(11)，111(5)，借助于仪器的数字积分器对提取物中的2AP进行定量测定。通过10至200ng/注射所得的标准校准曲线将峰面积与浓度相关联。为了使错误最小化，可使用外部标准，在定量分析2AP时，将2，4，6-三甲基嘧啶(TMP)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)用作外部标准。
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Claims (49)

1.增加生物体的香味生成的方法，所述生物体能表达功能性蛋白质，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列，所述方法包括降低或消除该生物体中所述功能性蛋白质的活性。
2.制备产生香味之生物体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供能表达功能性蛋白质的生物体，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列；
(b)降低或消除该生物体中所述功能性蛋白质的活性。
3.权利要求1或2的方法，其中功能性蛋白质含有氨基酸序列EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中功能性蛋白质含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中功能性蛋白质含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC，其中X是任何氨基酸，n是25至30的整数。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中功能性蛋白质含有氨基酸序列(V或I或L)(S或T或A)LELGGK(S或N)P(X)nC和EG(C或G)RLG(S或P)V(V或I)S，其中n是25至30的整数。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少40％相同的氨基酸序列。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中功能性蛋白质具有与SEQID NO：1的氨基酸序列至少99％相同的氨基酸序列。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中功能性蛋白质是由BAD2，BADH2，BADH15，BADH1，BAD，BAD1，BBD，BBD1或BBD2基因编码的蛋白质。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中生物选自植物、真菌、酵母和细菌。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中生物是植物。
15.权利要求14的方法，其中植物选自谷类作物植物、豆类植物和能产生含油种子的植物。
16.权利要求1至13中任一项的方法，其中生物是真菌。
17.权利要求16的方法，其中真菌选自曲霉、青霉和娄地青霉属的种。
18.权利要求1至13中任一项的方法，其中生物是酵母。
19.权利要求18的方法，其中酵母选自酿酒酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrawia lipolytica。
20.权利要求1至13中任一项的方法，其中生物是细菌。
21.权利要求20的方法，其中细菌选自木糖葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、德氏乳球菌、乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌和明串珠菌属的种。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中降低或消除功能性蛋白质的活性，是通过抑制功能性蛋白质的活性来实现。
23.权利要求1至21中任一项的方法，其中降低或消除功能性蛋白质的活性，是通过降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力来实现。
24.权利要求23的方法，其中降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力，是通过将能降低或消除功能性蛋白质表达的核酸分子导入生物体的细胞来实现。
25.权利要求24的方法，其中核酸分子选自ssDNA，ssRNA，dsDNA，dsRNA和核酶。
26.权利要求25的方法，其中核酸分子是反义分子或共抑制分子。
27.权利要求26的方法，其中反义分子选自反义RNA、反义DNA、干扰RNA(dsRNA，iRNA，siRNA，hpRNA或ihpRNA)和核酶。
28.权利要求23的方法，其中降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力，是通过在一个或多个编码功能性蛋白质的基因中导入能降低或消除功能性蛋白质的表达的突变来实现。
29.权利要求28的方法，其中突变选自插入、缺失和取代。
30.权利要求28或29的方法，其中突变位于基因的编码序列中。
31.权利要求28或29的方法，其中突变位于基因的非编码序列中。
32.权利要求1至31中任一项的方法，其中降低或消除生物体表达功能性蛋白质的能力导致生物体中一种或多种选自2-乙酰基-1-吡咯啉，2-(1-乙氧基乙烯基)-1-吡咯啉和2-乙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶的化合物的产量增加。
33.确定生物体是否能产生香味的方法，所述方法包括：确定生物体是否能表达功能性蛋白质，该蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
34.制备产生香味的生物体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)鉴定含有至少一个突变fgr基因的一或多种亲代生物体；
(b)在允许生物体交配产生子代的条件下培养所述一或多种亲代生物体的至少两个个体；
(c)选择突变fgr基因为纯合的一个或多个子代，从而提供产生香味的生物体。
35.权利要求34的方法，其中生物体是植物。
36.制备产生香味的植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)鉴定含有至少一个突变fgr基因的一或多种亲代植物；
(b)使至少一种亲代植物中的两个杂交以产生子代植物；
(c)选择突变fgr基因为纯合的一个或多个子代植物，从而提供产生香味的植物。
37.权利要求36的方法，其中一或多种亲代生物体的突变fgr基因是杂合的。
38.通过权利要求2至32或34至37中任一项的方法制备的生物体。
39.产生香味的方法，包括在允许产生香味的条件下培育权利要求38的生物体。
40.编码功能性蛋白质的基因用于制备产生香味的生物体的用途，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
41.突变的fgr基因用于制备能产生香味的生物体的用途。
42.能降低或消除生物体中的功能性蛋白质表达的核酸分子，所述功能性蛋白质具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
43.由权利要求39的方法产生的香味分子。
44.权利要求43的香味分子，其为2-乙酰基-1-吡咯啉。
45.能与生物体的fgr基因或突变fgr基因杂交的核酸分子用于测定生物体是否能表达功能性蛋白质的用途，所述功能性蛋白质具有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
46.能与生物体的fgr基因或突变fgr基因杂交的核酸分子，使用该分子可测定生物体是否能表达功能性蛋白质，所述功能性蛋白质具有与SEQID NO：1的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列。
47.能区分生物体的fgr基因和突变fgr基因的核酸分子。
48.权利要求47的核酸分子，其中该核酸分子能与fgr基因而不是突变fgr基因杂交。
49.权利要求47的核酸分子，其中该核酸分子能与生物体的突变fgr基因而不是fgr基因杂交。
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