CN106520920A - 用于检测基因编辑水稻植株‑e7的核酸序列及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测基因编辑水稻植株‑E7的核酸序列及其检测方法，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列。本发明首次创制出新的BADH2基因的等位形式，由此获得的水稻植株‑E7及其产生的稻米具有明显的香味，实现了人工培育不含转基因成分的香味水稻，目的性强，基因组损伤小，能够规避转基因可能带来的风险，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含水稻植株‑E7的DNA分子。

Description

用于检测基因编辑水稻植株-E7的核酸序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种基因组修饰系统及其用途，特别涉及一种用于检测基因编辑水稻植株-E7的核酸序列及其检测方法。

背景技术

水稻是世界上最重要且广泛种植的农作物之一，改造水稻基因组对于农业发展具有重要意义。香米是一种特殊类型稻米，其在市场上具有很高的经济价值，这已为泰国的茉莉香型水稻所证实。目前香味已成为一项评价稻米品质的重要指标。已有研究表明，水稻香味基因位于第8染色体上，并且由一对隐性基因控制，2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-AP)是决定米饭香味最重要的化学成分。Louis等和Bradbury等研究最先发现，水稻香味是由于编码甜菜醛脱氢酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase，BADH)的Badh2基因序列编码区8bp的缺失和3bp突变导致BADH2原有功能丧失，从而使甜菜醛脱氢酶的作用底物2-AP的代谢途径中断，香味物质不断积累。自Lorieux等发现一个与2-AP相关的单隐性基因fgr控制香气性状后，一系列香味基因鉴定相关标记被开发，包括RFLP标记、SSR标记及RAPD标记等，但这些定位标记与基因的距离偏大易出现假阳性，使其利用也受到了一定限制。

现阶段，香米育种主要依靠传统的常规育种，通过多轮的杂交及回交将香稻种质资源中的BADH2突变基因导入骨干的水稻栽培品种中。但利用现有的香稻种质进行育种存在较大困难，传统香稻种质资源的农艺性状往往不尽如人意，如抗倒性、抗虫性及抗病性较差，且产量不高。当利用这些种质通过传统育种向待改良品种引入香味性状的同时，由于连锁累赘等原因，常常会带来不良的负面性状，导致无法获得可用于实际生产的香米品种，或所育出的品种产量极低。因此，实际生产中需要开发具有香米性状，且综合农艺性状良好的香稻种质作为香米育种种质资源或直接作为亲本生产杂交种。

TALENs(转录激活子样效应因子核酸酶)是近几年出现的基因定点修饰新技术，在动物、植物和人类等领域都有广泛的研究和应用。转录激活子样效应因子(TranscriptionActivator-Like Protein Effector，TALE)是黄单胞菌属病原菌分泌到宿主植物细胞中的一种毒性蛋白，可以识别植物DNA，驱动基因表达。TALENs就是利用TALE的DNA结合结构域和Fok I的DNA切割结构域人工合成的核酸酶。两个TALEN单体按照一定方式结合在DNA双链上，形成有切割活性的二聚体将DNA切断，产生DNA双链断裂(DSB)，细胞启动修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变，通过同源重组(HR)方式修复可以实现精确的基因定点插入或基因替换。

因此，通过TALENs技术可以直接将优质稻米(非香米)中BADH2基因定点突变或敲除，不仅可以满足实际生产中创制优质香米的需求，还可以大大缩短育种周期。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测基因编辑水稻植株-E7的核酸序列及其检测方法，水稻植株-E7及其产生的稻米具有明显的香味，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定水稻植株-E7的DNA分子。

为实现上述目的，本发明提供了一种具有以下核酸序列的核酸分子，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQID NO:28第2877-5847或其互补序列。

优选地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28或其互补序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，包括：

使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；

进行核酸扩增反应；

检测扩增产物的存在；

所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

进一步地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

优选地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

进一步地，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:28或其互补序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，包括：

使待检测样品与探针接触，所述探针包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQID NO:2或其互补序列；

使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和

检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。

进一步地，所述探针包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ IDNO:28第2877-5847位或其互补序列。

优选地，所述探针包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

可选地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。

为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包含至少一个DNA分子，所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

进一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

更进一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

为实现上述目的，本发明还提供了一种培育香味水稻植物的方法，包括：

种植至少一粒水稻植物种子，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列；

使所述植物种子长成植株。

进一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

优选地，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

进一步地，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:28或其互补序列。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

如本申请，包括权利要求中使用的，除非上下文中清楚地另有说明，否则单数和单数形式的术语，例如“一”、“一个”和“该”，包括复数指代物。因此，例如“植物”、“该植物”或“一个植物”也指示多个植物。并且根据上下文，使用术语“植物”还可指示该植物在遗传上相似或相同的后代。类似地，术语“核酸”可以指核酸分子的许多拷贝。类似地，术语“探针”可以指代相同或相似的探针分子。

数字范围包括限定该范围的数字，并明确地包括所限定的范围内的每个整数和非整数分数。除非另外指出，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本领域普通技术人员普遍理解的相同的含义。

本发明中，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，根据上下文含义，可指代DNA或RNA。其中DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、合成DNA(例如人工合成)和含核酸类似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三维结构。核酸可为双链或单链(既有义链或反义单链)。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物、以及核酸类似物。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述转录激活子样效应因子核酸酶的调节序列。

所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。

本发明中，术语“分离的”涉及核酸时还包括任何非天然产生的序列，因为所述非天然产生的序列未在天然情况下发现且其在天然产生的基因组中没有紧邻序列。

本发明中，术语“TALENs”是指转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like(TAL)effector nucleases)，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶。它借助于转录激活子样效应因子(Transcription Activator-Like Protein Effector，TALE)，一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。理论上讲，TAL效应因子可被设计识别和结合目的DNA序列。TAL效应因子N端一般有转运信号(translocationsignal)，TAL效应因子C端有核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和转录激活结构域(activation domain，AD)，而中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。把TAL效应因子中的转录激活结构域(AD)替换成核酸内切酶的切割结构域就生成了TALENs，所述切割结构域通常来自于无序列特异性的FokI核酸内切酶。TALENs可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。

本发明中，术语“基因组修饰”被用作生物体的基因组或染色体或染色体外DNA或细胞器DNA中产生的作为基因靶向或基因功能修饰的结果的任何修饰。

本发明中，“修饰”是指利用任何基因技术导致靶序列永久或临时改变包括但不限于缺失、插入、突变、置换、切口、甲基化、乙酰化、连接、重组、螺旋解旋、化学修饰、标记、活化、失活和靶序列中一个或多个核苷酸的抑制。

本发明中，“突变体”是指发生突变的个体，其具有与野生型不同的序列，可能会导致至少部分功能丢失例如，在启动子或增强子区域中序列的变化将至少部分地影响生物体中编码序列的表达。术语“突变”是指可由诸如缺失、添加、取代或重排引起的核酸序列中序列的任何变化。突变还可影响该序列参与的一个或多个步骤。例如，DNA序列中的变化可导致有活性的、有部分活性的或无活性的改变的mRNA和/或蛋白的合成。

本发明中，术语“核酸酶”意在包括外切核酸酶和内切核酸酶。

本发明中，术语“内切核酸酶”指能催化DNA或RNA分子内(优选DNA分子)核酸之间水解(切割)的任何野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性示例包括II型限制性内切酶例如Fok I、Hha I、Hind III、Not I、BbvC I、EcoR I、Bg II和Alw I。

在本发明中，“定位结构域”可任选地添加为蛋白部分的部分，定位结构域可将蛋白部分或编程的蛋白部分或组装的复合物定位至活细胞中特定细胞或亚细胞定位。定位结构域可通过将蛋白部分的氨基酸序列融合到掺入包括以下结构域的氨基酸来构建：核定位信号(NLS)；线粒体前导序列(MLS)；叶绿体前导序列；和/或被设计以将蛋白运输或引导或定位至含有核酸的细胞器、细胞区室或细胞的任何细分部分的任何序列。在一些实施方案中，生物体是真核生物，且定位结构域包括允许蛋白进入细胞核和基因组DNA内的核定位结构域(NLS)。所述NLS的序列可包括带正电荷序列的任何功能NLS。在另一些实施方案中，定位结构域可包括使蛋白部分或编程的核蛋白进入细胞器的前导序列，使细胞器DNA被修饰成为可能。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自水稻植株-E7基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自水稻植株-E7或种子还是来源于水稻植株-E7的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于水稻植株-E7的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互补序列，或者上述序列的任一片段。SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定水稻植物是否由含有本发明水稻植株-E7通过有性杂交方式产生，或采集自田地的水稻样品是否包含水稻植株-E7，或水稻提取物，例如稻米是否包含水稻植株-E7，从水稻植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于水稻植株-E7的DNA的存在是诊断性的扩增子。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述水稻植株-E7也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

本发明中，“标记物”指可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段是可检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，在ELISA中常用的)、生物素、地高辛、或半抗原和可使其是可检测的其他实体。标记物可被掺入核酸和蛋白的任何位置处。

本发明中，“试剂盒”可包括本发明描述的基因组修饰系统与以下的任一种或全部：测定试剂、缓冲液、探针和/或引物、和无菌盐水或另一种药学上可接受的乳剂和悬液基底。此外，试剂盒可包括含有用于实践本发明描述的方法的用法说明(例如，操作方案)的说明性材料。

本发明中，将外源DNA导入植物，如将编码所述基因组修饰系统的核苷酸序列或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

本发明提供了一种基因组修饰系统及其用途，具有以下优点：

1、本发明提供的基因组修饰系统，可用于植物定向分子育种，通过本方法获得的初代改良植株，经过遗传分离可获得具有改良效果但不携带转基因成分的子代植株，从而在获得香味性状的同时消除外源DNA片段插入带来的植物基因组稳定性风险。

2、本发明提供的基因组修饰系统可在定点修饰作物内源基因的基础上定向进行作物分子改良，经过靶向修饰后的基因可在后代中稳定遗传，克服了超表达、RNAi等技术容易产生的基因丢失、沉默等缺陷。

3、本发明所述基因组修饰系统培育的香味水稻，实现了人工培育不含转基因成分的香味水稻，目的性强，基因组损伤小，能够规避转基因可能带来的风险。

4、本发明所述基因组修饰系统缩短了植物育种时间，加快育种进程，节省成本，高效精准。

5、本发明首次创制出新的BADH2基因的等位形式，即在第7外显子发生1bp的插入，丰富了香味基因资源。

6、本发明首次创制出香型华占水稻材料-水稻植株-E7，除具有香味外，在植株形态、生育期等其他性状方面与野生型华占水稻材料无明显差异，因此其可以用作香稻育种种质资源；由于本发明水稻植株-E7的BADH2基因处于杂合状态时，其产生的稻米也具有明显的香味，所以水稻植株-E7的纯合材料可直接作为恢复系应用于实际生产，以获得杂交种，进而获得具有香味的稻米。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明基因组修饰系统及其用途的重组表达载体DBN-E7-L构建流程图；

图2为本发明基因组修饰系统及其用途的重组表达载体DBN-E7-R结构示意图；

图3为本发明基因组修饰系统及其用途的重组表达载体pDBN-BADH2E7结构示意图；

图4为本发明基因组修饰系统及其用途的香味物质2-AP的气相色谱-质谱图；

图5为本发明基因组修饰系统及其用途的在营养生长期的植株整体形态图；

图6为本发明基因组修饰系统及其用途的在成熟期的植株整体形态图；

图7为本发明基因组修饰系统及其用途的在成熟期的植株株高对比图；

图8为本发明基因组修饰系统及其用途的在成熟期的植株分蘖数对比图；

图9为本发明基因组修饰系统及其用途的对外源T-DNA区的66个片段进行残留检测的扩增区域示意图；

图10为本发明基因组修饰系统及其用途的对外源T-DNA区的66个片段中1个片段进行残留检测的扩增结果图；

图11为本发明基因组修饰系统及其用途的采用21对引物中3对引物对外源T-DNA区进行残留检测的扩增结果图；

图12为本发明基因组修饰系统及其用途的对8个潜在脱靶位点中1个潜在脱靶位点进行脱靶效应鉴定的测序结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明基因组修饰系统及其用途的技术方案。

第一实施例、水稻材料华占的BADH2基因序列的获得

1、DNA的提取

DNA提取按照常规采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法：取2g幼嫩的水稻品种华占(华占水稻材料由北京金色农华种业有限公司提供)植株的叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.5ml于温度65℃预热的CTAB缓冲液(20g/LCTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、20mMEDTA(乙二胺四乙酸)，用NaOH调pH至8.0)，充分混匀后，于温度65℃抽提90min；先后加入0.5倍体积苯酚和0.5倍体积氯仿，颠倒混匀；12000rpm(每分钟转数)转速下离心10min；吸取上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻柔晃动离心管，于温度4℃静置30min；12000rpm转速下再离心10min；收集DNA到管底；弃上清液，用1ml质量浓度为70％的乙醇，洗涤沉淀；12000rpm转速下离心5min；真空抽干或在超净台吹干；DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)中，保存在温度-20℃条件下。

将上述提取的DNA稀释10倍后作为PCR扩增模板。

2、扩增水稻材料华占的BADH2基因

从NCBI上获取中花11号水稻材料的BADH2基因序列，如序列表SEQ ID NO:3所示。

根据中花11号水稻材料的BADH2基因序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)，设计引物

引物1-F：ACCTATCGCTTTCCACCTC，如序列表中SEQ ID NO:4所示；

引物1-R：CTCTCCGCTTGAACCCAT，如序列表中SEQ ID NO:5所示；

引物2-F：CCAAATCGATCGATATGGTCTAG，如序列表中SEQ ID NO:6所示；

引物2-R：CTATTTAGTACCATGCTTGGGTCAT，如序列表中SEQ ID NO:7所示；

引物3-F：GATGCTTTGAGTACTTTGCAGATC，如序列表中SEQ ID NO:8所示；

引物3-R：ATTGAGAGGAATATCATTTCCATTG，如序列表中SEQ ID NO:9所示；

引物4-F：CTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGT，如序列表中SEQ ID NO:10所示；

引物4-R：AACATCATAGAGACATGGACACA，如序列表中SEQ ID NO:11所示；

引物5-F：TCTCTTTGGTTGCTTTTGGAC，如序列表中SEQ ID NO:12所示；

引物5-R：CAGCACCAGCCAGACCATAACT，如序列表中SEQ ID NO:13所示；

引物6-F：TGGCCAACGATACTCAGTGAGTT，如序列表中SEQ ID NO:14所示；

引物6-R：AATCAAACATCGATATGCACAA，如序列表中SEQ ID NO:15所示。

以华占水稻材料的BADH2基因序列为模板，按照下述条件进行PCR扩增：

上述反应缓冲液为：200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，15mM MgCl₂。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸5min。

使用PCR清洁试剂盒(Axygen)对上述PCR产物进行纯化，具体方法参考其产品说明书；直接进行测序验证，并将各PCR产物序列使用ContigExpress Project软件进行拼接，以获得完整的拼接后的序列信息；确认水稻材料华占的BADH2基因序列如序列表中SEQ IDNO:16所示。

本发明以水稻材料华占的BADH2基因第七外显子(E7)的序列为转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)的靶序列，如序列表中SEQ ID NO:16的第2844位至第2909位所示。

第二实施例、TALEN的设计及获得

1、TALEN靶序列的筛选

靶序列E7靶向水稻材料华占BADH2基因的第七外显子，序列如下:5’-gtTGCATTTACTGGGAGTTatgaaactggtaaaaagattaTGGCTTCAGCTGCTCCTatggt taag-3’(序列表中SEQ ID NO:16的第2844位至第2909位)；其中左右两侧大写字母为TALEN模块识别序列(分别命名为L-E7和R-E7)，中间的小写字母为间隔序列。

2、TALEN编码基因的设计与合成

将以靶序列E7中的L-E7为模块识别序列的TALEN命名为E7-L，所述核酸酶E7-L的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示，所述核酸酶E7-L的编码基因序列如序列表SEQ IDNO:17所示，其中，序列表中SEQ ID NO:17的第1-465位编码TAL效应因子N端，第469-2214位编码L-E7的识别蛋白，第2215-2856位编码TAL效应因子C端，第2857-3459位编码内切核酸酶Fok I；

将以靶序列E7中的R-E7为模块识别序列的TALEN命名为E7-R，所述核酸酶E7-R的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示，所述核酸酶E7-R的编码基因序列如序列表SEQ IDNO:20所示，其中，序列表中SEQ ID NO:20的第1-465位编码TAL效应因子N端，第469-2214位编码R-E7的识别蛋白，第2215-2856位编码TAL效应因子C端，第2857-3459位编码内切核酸酶Fok I；

序列表中SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20所示的多核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

第三实施例、TALEN重组表达载体的构建及其转化农杆菌

1、构建TALEN重组表达载体pDBN-BADH2E7

用限制性内切酶BsaI和BsmBI分别酶切所述E7-L多核苷酸序列片段和表达载体DBNBC-01(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的E7-L核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的BsmBI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN-E7-L，其构建流程如图1所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；pr35S：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子(SEQ ID NO:21)；E7-L：E7-L核苷酸序列(SEQ ID NO:17)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:22)；LB：左边界)。

用限制性内切酶BsaI分别酶切所述E7-R多核苷酸序列片段和表达载体DBNBC-01(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，将切下的E7-R核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的BsaI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN-E7-R，其载体结构如图2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；pr35S：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子(SEQ ID NO:21)；E7-R：E7-R核苷酸序列(SEQ IDNO:20)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:22)；LB：左边界)。

用限制性内切酶SpeI、AscI和BamHI酶切基础载体pG(载体骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA机构可以提供))，回收Backbone-Hpt片段；用限制性内切酶SpeI和SfiI酶切重组表达载体DBN-E7-L，回收E7-L cassette片段；和用限制性内切酶SfiI和AscI酶切重组表达载体DBN-E7-R，回收E7-R cassette片段；用T4连接酶连接上述Backbone-Hpt片段、E7-Lcassette片段和E7-Rcassette片段三个回收的片段，构建成重组表达载体pDBN-BADH2E7，其载体结构如图3所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；pr35S：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子(SEQ ID NO:21)；E7-L：E7-L核苷酸序列(SEQ ID NO:17)；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:22)；E7-R：E7-R核苷酸序列(SEQ ID NO:20)；Hpt：潮霉素磷酸转移酶基因(SEQ ID NO:23)；t35S：花椰菜花叶病毒(CaMV35S)终止子(SEQ ID NO:24)；LB：左边界)。然后将连接产物用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞(Transgen，Beijing，China；CAT：CD501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl连接产物，42℃水浴30秒；37℃培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)，然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37℃条件下生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、质量浓度为1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸钾、5M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用质量浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNA酶(Rnase，20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经SpeI、AscI和BamHI酶切鉴定后，挑选阳性克隆，进行测序验证，获得正确的重组表达载体pDBN-BADH2E7。

2、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体pDBN-BADH2E7用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其转化条件为：100μl农杆菌LBA4404、3μl质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10min，37℃温水浴10min；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2h，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶进行酶切验证，结果表明重组表达载体pDBN-BADH2E7结构完全正确。

第四实施例、获得转化的水稻植株

对于农杆菌介导的水稻转化，简要地，把水稻品种华占种子接种在诱导培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，从水稻成熟胚诱导出愈伤组织(步骤1：愈伤诱导步骤)，之后，优选愈伤组织，用农杆菌悬浮液接触愈伤组织，其中农杆菌能够将所述基因组修饰系统传递至愈伤组织上的至少一个细胞(步骤2：侵染步骤)。在此步骤中，愈伤组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD₆₆₀＝0.1，侵染培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、pH5.2))中以启动接种。愈伤组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤3：共培养步骤)。优选地，愈伤组织在侵染步骤后在液体培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，有一个“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素150-250mg/L)，不添加植物转化体的选择剂(步骤4：恢复步骤)。优选地，愈伤组织在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的愈伤组织在含选择剂(潮霉素)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤5：选择步骤)。优选地，愈伤组织在有选择剂的筛选固体培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素50mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤6：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(N6分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述N6分化培养基(N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、麦芽糖30g/L、肌醇100mg/L、脯氨酸300mg/L、谷氨酸200mg/L、潮霉素10mg/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8)上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养。在温室中，每天于28℃下培养，获得转化的T₀水稻植株。

第五实施例、检测BADH2基因的突变结果

1、DNA的提取

按照第一实施例1中所述DNA提取的方法提取上述转化的T₀水稻植株叶片的DNA，并将所述提取的DNA稀释10倍后作为PCR扩增模板。

2、检测BADH2基因的突变结果

按照上述第一实施例2中的扩增方法和条件，设计引物扩增包含靶序列E7在内的区段：

引物7-F：CTGATGTGTGTAAAGAGGTTGG，如序列表中SEQ ID NO:25所示；

引物7-R：TTTCCACCAAGTTCCAGTG，如序列表中SEQ ID NO:26所示。

通过测序分析，获得靶序列E7发生突变的T₀水稻植株-E7，突变后的靶序列E7如序列表中SEQ ID NO:27所示，其突变形式为在靶序列E7内插入了一个碱基A。故突变后的BADH2基因序列如序列表中SEQ ID NO:28所示，其CDS序列如序列表中SEQ ID NO:29所示。

3、获得突变的T₂水稻植株-E7的种子

在温室(28℃左右)培养所述T₀水稻植株-E7至结实，收获突变的T₁水稻植株-E7的种子。

在温室(28℃左右)种植所述T₁水稻植株-E7的种子，获得突变的T₁水稻植株-E7，剪取所述T₁水稻植株-E7的幼苗叶片(出苗后第7-10天)，按照上述提取DNA的方法，使用引物7-F和引物7-R扩增包含靶序列E7在内的区段，测序分析后，将所述T₁水稻植株-E7区分为未发生突变的T₁水稻植株、纯合的T₁水稻植株-E7和杂合的T₁水稻植株-E7三种类型，待其成熟后收获上述未发生突变的T₁水稻植株的种子、纯合的T₁水稻植株-E7的种子和杂合的T₁水稻植株-E7的种子。

第六实施例、突变材料的香味鉴定

1、突变的水稻植株叶片的香味鉴定

分别称取所述未发生突变的T₁水稻植株、所述纯合的T₁水稻植株-E7、所述杂合的T₁水稻植株-E7、无香味的华占水稻植株的幼苗叶片(三叶期)各2g，剪碎后放入50ml离心管中，加入10ml浓度为1.7％(m/v)的KOH溶液，加盖密封后于温度30℃下放置10min，打开盖子，立即逐一闻其气味，依据香味浓烈分类。本实验采用五人分别评定的方法进行，且被鉴定材料的名称采用随机编码的方式进行标注，如1、2、3、4以此类推。

上述实验结果表明：五个人对上述材料的判断结果完全一致，即纯合的T₁水稻植株-E7有香味，杂合的T₁水稻植株-E7、未发生突变的T₁水稻植株和无香味的华占水稻植株均没有香味。

2、突变的水稻植株种子的香味鉴定-气味

分别取所述未发生突变的T₁水稻植株的种子、所述纯合的T₁水稻植株-E7的种子、所述杂合的T₁水稻植株-E7的种子、无香味的华占水稻植株的种子各1000粒，籽粒脱壳，分别放入小碗内，加入少许水，分别放入四个蒸锅的蒸屉上，盖上锅盖并将蒸锅分别放置在四个独立密闭的屋子里直接进行蒸煮。约40min后，首先闻屋子里是否有香味，然后掀开蒸锅的盖子，闻是否有香味，最后取出蒸煮好的籽粒，再闻是否有香味。逐一闻其气味，依据香味浓烈分类。本实验采用五人分别评定的方法进行，且被鉴定材料的名称采用随机编码的方式进行标注，如1、2、3、4以此类推。

上述实验结果表明：五个人对上述材料的判断结果完全一致，即纯合的T₁水稻植株-E7的种子有香味，未发生突变的T₁水稻植株的种子和无香味的华占水稻植株的种子没有香味；由于杂合的T₁水稻植株-E7自交产生的种子中有25％的种子为具有香味的纯合基因型种子，故杂合的T₁水稻植株-E7的种子也有香味。

3、突变的水稻植株种子的香味鉴定-气相色谱-质谱法

通过GC-MS(气相色谱/质谱联用仪)进行2-AP含量的测定，具体方法为：分别称取0.5g所述纯合的T₁水稻植株-E7的种子和所述杂合的T₁水稻植株-E7的种子，脱壳后分别放入2ml离心管中，使用高速振荡器充分磨成粉末，将粉末转移到5ml钳口瓶中，加入2ml提取液(无水乙醇:二氯甲烷＝1:1(体积比)，并且含0.5mg/L的2,4,6-三甲基吡啶作为内参)。钳口瓶密封好后，于温度80℃下处理3小时，然后冷却至室温，13800rpm转速下离心5分钟，取上清液至样品瓶，使用GC-MS仪器(GC7890A-5975C MS；Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)进行2-AP含量的测定。DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，J&W)的初始温度为50℃，保持2分钟，而后以5℃/分钟的速度升温至120℃，然后再以15℃/分钟的速度升温至280℃，并保持3分钟。GC-MS仪器处于电子冲击模式，电离电压为70eV，离子源温为230℃。同时以华占水稻植株的种子和日本晴水稻植株的种子(由中国农业大学赠送)作为阴性对照，以稻花香水稻植株的种子(市场上购买)作为阳性对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

如图4所示，上述实验结果表明：野生型华占水稻植株的种子和野生型日本晴水稻植株的种子中未检测到香味物质2-AP的存在；所述纯合的T₁水稻植株-E7的种子和所述杂合的T₁水稻植株-E7的种子均具有一定量的2-AP，且纯合的T₁水稻植株-E7的种子的2-AP含量与稻花香水稻植株的种子相当。

第七实施例、分析突变的水稻植株

1、植株整体形态的鉴定

针对植株整体形态对所述未发生突变的T₁水稻植株、所述纯合的T₁水稻植株-E7和华占水稻植株分别在营养生长期和成熟期进行总体的表型观察和评估，并在成熟期进行株高和分蘖数调查。

如图5-8所示，除香味性状外，在营养生长期和成熟期，在所述未发生突变的T₁水稻植株、所述纯合的T₁水稻植株-E7和华占水稻植株之间没有观察到其它形态不同，具体包括植株长势、株型、株高和分蘖数。且所述纯合的T₁水稻植株-E7的叶片有香味，所述未发生突变的的T₁水稻植株和华占水稻植株的叶片均没有香味。

2、突变的水稻植株的外源T-DNA残留检测

按照第五实施例中1的方法提取所述纯合的T₁水稻植株-E7的叶片DNA，设计引物8-F(如序列表中SEQ ID NO:30所示)分别与引物8-R-1(如序列表中SEQ ID NO:31所示)、引物8-R-2(如序列表中SEQ ID NO:32所示)组配成两对引物，按照第一实施例的扩增方法和条件，进行外源T-DNA区目标片段扩增检测(扩增区域覆盖外源T-DNA区域的10％)，并获得多株残留检测为阴性(即外源T-DNA区目标片段无残留)的所述纯合的T₁水稻植株-E7。

引物8-F：CTCCGTGACCGAGTTCAAGT，如序列表中SEQ ID NO:30所示；

引物8-R-1：GACCGGGTCACGCTGCAC，如序列表中SEQ ID NO:31所示；

引物8-R-2：TGCTTTGAAGACGTGGTTGGAA，如序列表中SEQ ID NO:32所示。

利用上述获得的多株残留检测为阴性的所述纯合的T₁水稻植株-E7的叶片DNA，按照上述方法设计引物9-74(如序列表中SEQ ID NO:33-164所示)，按照第一实施例的扩增方法和条件，对外源T-DNA区的66个片段进行扩增检测，同时以野生华占水稻植株作为阴性对照，以含有外源T-DNA区的华占水稻植株作为阳性对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复。如图9所示，扩增区域覆盖外源T-DNA区域的96％。获得5株残留检测均为阴性(即外源T-DNA区66个片段无残留)的所述纯合的T₁水稻植株-E7，如图10(+：含有外源T-DNA区的华占水稻植株；-：表示野生华占水稻植株；1、2、3、4、5表示所得到的5株残留检测均为阴性的所述纯合的T₁水稻植株-E7)所示，图10仅展示了其中1个片段的扩增结果，其它65个片段的扩增结果与其一致。

依据国家转基因检测方法，采用21对国家转基因检测部门所用的引物(引物75-95，如序列表中SEQ ID NO:165-206所示)，对上述获得的5株所述纯合的T₁水稻植株-E7进行外源T-DNA区的21个片段进行扩增检测，同时以野生华占水稻植株作为阴性对照，以含有含有待检测元件的转化事件DNA样品作为阳性对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复。如图11(+：含有含有待检测元件的转化事件DNA样品；-：表示野生华占水稻植株；1、2、3、4、5表示所得到的5株无外源T-DNA残留的新的所述纯合的T₁水稻植株-E7)所示，最终获得了5株无外源T-DNA残留的新的所述纯合的T₁水稻植株-E7(BADH2基因的突变体)；图11仅展示了其中3对引物的扩增结果，其它18对引物的扩增结果与上述3对引物一致。

3、突变的水稻植株的脱靶效应鉴定

将本发明所使用的TALEN模块识别序列L-E7(TGCATTTACTGGGAGTT)和R-E7(AGGAGCAGCTGAAGCCA)在康奈尔大学网站(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talef-off-paired)上进行分析，得到8个潜在的脱靶位点，具体信息如表1所示。利用上述获得的5株无外源T-DNA残留的新的所述纯合的T₁水稻植株-E7的叶片DNA，分别设计引物，扩增上述8个潜在的脱靶位点区域，同时以华占水稻植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复。测序后，将5株无外源T-DNA残留的新的所述纯合的T₁水稻植株-E7的序列与华占水稻植株的序列进行比对。

表1、8个潜在的脱靶位点的具体信息表

如图12(1、2、3、4、5表示所得到的5株无外源T-DNA残留的新的所述纯合的T₁水稻植株-E7)所示，上述8个潜在脱靶位点均未发生突变，即没有发生脱靶效应，图12仅展示了其中1个潜在脱靶位点的测序结果，其它7个潜在脱靶位点的测序结果与其一致。

综上所述，本发明基因组修饰系统可用于植物定向分子育种，经过遗传分离可获得具有改良效果但不携带转基因成分的子代植株，且可在后代中稳定遗传，同时缩短了植物育种时间，加快育种进程，节省成本，高效精准；本发明首次创制出新的BADH2基因的等位形式，由此获得的香味水稻，实现了人工培育不含转基因成分的香味水稻，目的性强，基因组损伤小，能够规避转基因可能带来的风险，且香型华占水稻材料-水稻植株-E7，除具有香味外，在植株形态、生育期等其他性状方面与野生型华占水稻材料无明显差异，在实际生产中具有广阔的应用前景。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.一种具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847或其互补序列。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

4.根据权利要求2或3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28或其互补序列。

5.一种检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，包括：

使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；

进行核酸扩增反应；和

检测扩增产物的存在；

所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

6.根据权利要求5所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

7.根据权利要求5所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

8.根据权利要求6或7所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物包含SEQ ID NO:28或其互补序列。

9.一种检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，包括：

使待检测样品与探针接触，所述探针包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ IDNO:2或其互补序列；

使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和

检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。

10.根据权利要求9所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

11.根据权利要求10所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

12.根据权利要求9-11任一项所述的检测样品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。

13.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包含至少一个DNA分子，所述DNA分子包含SEQ IDNO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。

14.根据权利要求13所述DNA检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

15.根据权利要求14所述DNA检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

16.一种培育香味水稻植物的方法，其特征在于，包括：

种植至少一粒水稻植物种子，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列；

使所述植物种子长成植株。

17.根据权利要求16所述的培育香味水稻植物的方法，其特征在于，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互补序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互补序列。

18.根据权利要求16所述的培育香味水稻植物的方法，其特征在于，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:27或其互补序列。

19.根据权利要求17或18所述的培育香味水稻植物的方法，其特征在于，所述水稻植物种子的基因组中包含SEQ ID NO:28或其互补序列。