CN109536490A

CN109536490A - 转基因抗虫耐除草剂玉米cm8101外源插入片段旁侧序列及其应用

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Publication number: CN109536490A
Application number: CN201811332359.3A
Authority: CN
Inventors: 李新海; 翁建峰; 雷开荣; 杨小艳; 谢树章; 张德贵; 鲁鑫; 张爽; 李明顺; 郝转芳; 雍洪军; 韩洁楠
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: CN109536490B

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明提供的转基因玉米CM8101经Southern blot鉴定有一个插入位点，这个插入位点的外源插入片段的5’端和3’端旁侧序列如SEQ ID No.1、2所示。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物对，分别如SEQ ID No.3‑4和SEQ ID No.5‑6所示的核苷酸序列。本发明的转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对转基因玉米CM8101包括亲本、杂种F1和后代，及其植株、组织、种子及其制品的检测。

Description

转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列以及用于检测该转基因玉米的特异性引物对，本发明还涉及利用该引物对进行转基因玉米CM8101亲本或杂交后代及其制品检测的方法和试剂盒。

背景技术

玉米是重要的粮食、饲料及工业原料作物，在国家粮食安全和国民经济发展中占有重要地位。近年来，我国玉米种植面积保持在5亿多亩，主要分布于全国20多个省、市、自治区。由于耕作制度、自然气候等变化，亚洲玉米螟已经严重影响到玉米的单产、总产和品质，成为我国玉米生产的重要害虫。田间杂草与作物竞争水、肥、光能及生长空间，直接影响农作物产量与质量。另外，随着农村劳动力往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化成为趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。虫害与草害是影响玉米生产的重要因素，培育抗虫耐除草剂玉米是解决该难题的关键技术途径，能够有效地防治玉米螟等鳞翅目害虫及杂草的危害，挽回产量损失，减少农药使用量，具有巨大的经济，环境和社会效益。

Bt基因Cry1Ab是目前应用较为广泛的针对鳞翅目害虫如玉米螟，棉铃虫的抗虫基因(http://cera-gmc.org/GMCropDatabase)。在转基因玉米方面，Cry1Ab基因的商业化应用最为广泛。孟山都公司MON80100、MON802、MON810；先正达公司的BT11、BT176以及杜邦先锋公司MON809等转化体及其衍生品种均实现了商业化推广。转Cry1Ab玉米的商业化推广已近20年，其安全性已有定论，即通过安全评价、获得安全证书的转基因生物及其产品是安全的。

中国农业科学院作物科学研究所提出的人工改造合成的Bt抗虫基因Cry1Ab-Ma，已获得国家发明专利授权(ZL 201010574708.X)，bar基因是迄今为止应用较多的一个抗除草剂基因。采用35S组成型启动子融合小麦叶绿体A/B结合蛋白的非翻译前导链序列(L-Cab)和水稻actin1内含子启动经过密码子优化后Cry1Ab-Ma基因表达，由小麦HSP17蛋白的末端非翻译区作为终止子；采用2×P35S组成型启动子融合TEV增强子启动bar基因的表达，由大豆Tvsp作为终止子，构建包含bar基因的植物表达载体。利用农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫耐除草剂的转基因玉米事件CM8101，在抗虫和耐除草剂方面具有良好的特性，今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米CM8101进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因玉米CM8101进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因玉米CM8101的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因玉米CM8101外源插入片段旁侧序列及其应用。

本发明另一目的在于提供一种转基因玉米CM8101的PCR检测方法和试剂盒。

本发明的抗虫转基因玉米事件CM8101按如下方式获得：

采用35S组成型启动子融合小麦叶绿体A/B结合蛋白的非翻译前导链序列(L-Cab)和水稻actin1内含子启动经过密码子优化后Cry1Ab-Ma基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中第228bp-1015bp为Southern blot探针部分)表达，由小麦HSP17蛋白的末端非翻译区作为终止子；采用2×P35S组成型启动子融合TEV增强子启动bar基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中第1-548bp为Southern blot探针部分)的表达，由大豆Tvsp作为终止子，构建包含bar基因的植物表达载体。利用农杆菌介导法，将外源基因及其他基因元件导入受体玉米材料HiII中，并通过回交转育的方法将该转化事件转移至玉米自交系郑58遗传背景。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米CM8101。经Southern blot杂交实验及转基因后代基因分离鉴定实验，鉴定所得该转基因阳性植株CM8101为一个拷贝。对转基因玉米进行温室及田间接亚洲玉米螟，表明获得的转基因玉米CM8101具有很好的玉米螟抗性。

本发明提供了抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段；和/或外源插入片段的3’端旁侧序列，具有SEQ ID NO.2所示的序列或其特异性片段。

本发明提供了用于检测抗虫耐除草剂转基因玉米事件CM8101的DNA片段，其包含至少部分上述的5’或3’旁侧序列和至少部分外源插入片段，且旁侧序列部分与外源插入片段部分顺序相连，所述外源插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。

在本发明的一个实施例中，提供的用于检测抗虫耐除草剂转基因玉米事件CM8101的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了SEQ ID NO.1或2所示的旁侧序列或满足上述限定的DNA片段在检测转基因玉米CM8101中的应用。

本发明进一步提供了用于扩增上述DNA片段的特异性引物对。

优选地，所示的特异性引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4或SEQ ID NO.5-6所示。

本发明提供了用于检测抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4或SEQ ID NO.5-6所示。

含有SEQ ID NO.3-4或SEQ ID NO.5-6所示核苷酸序列的引物对的试剂盒属于本发明的保护范围，该试剂盒用于检测转基因玉米CM8101。

进一步地，本发明提供了一种检测抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101的方法，以样品总DNA为模板，利用本发明上述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。

上述检测转基因玉米件CM8101的方法中，20μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μL，2mmol/L dNTP 2μL，25mM硫酸镁0.8μL，KOD Plus 0.4μL，玉米总DNA模板1.0μL，10μmol/L上游引物0.6μL，10μmol/L下游引物0.6μL，ddH₂O12.6μL；

PCR反应条件为：94℃5min；94℃15s，58℃30s，68℃1min，共35个循环；68℃7min。

判断结果的标准为：当采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为828bp，则待测样品含有CM8101来源的成分；

若采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为649bp，则待测样品含有CM8101来源的成分。

本发明提供了上述特异性引物对或含有该引物对的试剂盒在检测转基因玉米CM8101亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。

本发明通过TAIL-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件CM8101的5’和3’端旁侧序列，根据这两个旁侧序列的序列信息，设计两对特异性PCR引物并建立针对转基因玉米CM8101及其制品的检测方法。本发明提供的旁侧序列和特异性引物对适用于对转基因玉米CM8101(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

附图说明

图1是目的基因Cry1Ab-Ma特异性探针在T-DNA序列中位置及限制性酶切位点示意图。

图2是转基因玉米CM8101(T₅)的Cry1Ab-Ma探针Southern杂交分析结果。M：Marker(λ-DNA)；泳道1：SacⅠ酶切转基因玉米CM8101；泳道2：SacⅠ酶切阴性对照郑58；泳道3：NdeⅠ酶切转基因玉米CM8101；泳道4：NdeⅠ酶切阴性对照郑58；泳道5：阳性质粒对照。

图3是bar特异性探针在T-DNA序列中位置及限制性酶切位点。

图4是转基因玉米CM8101(T5)bar探针Southern杂交分析结果，M：Marker(λ-DNA)；泳道1：Hind III酶切转基因玉米CM8101；泳道2：Hind III酶切阴性对照郑58；泳道3：SacⅠ酶切转基因玉米CM8101；泳道4：SacⅠ酶切阴性对照郑58；泳道5:NdeⅠ酶切转基因玉米CM8101；泳道6：NdeⅠ酶切阴性对照郑58；泳道7：阳性质粒对照。

图5是转基因玉米CM8101的外源片段插入位点5’端特异性PCR检测结果，M:BM2000+Marker；1:质粒；2:水；3:阴性对照郑58；4:-6:商业化抗虫转基因玉米；7:T8世代的转基因玉米CM8101；8:T9世代的转基因玉米CM8101。

图6是转基因玉米CM8101的外源片段插入位点3’端特异性PCR检测结果，M:BM2000+Marker；1:质粒；2:水；3:阴性对照郑58；4-6:商业化抗虫转基因玉米；7:T8世代的转基因玉米CM8101；8:T9世代的转基因玉米CM8101。

图7是转基因玉米CM8101的5’端特异性PCR的灵敏度检测结果，M:BM2000+Marker；1:50％；2:10％；3:5％；4:1％；5:0.5％；6:0.1％；7：0.05％；8：0.01％；9：0；10：水。

图8是转基因玉米CM8101 3’端特异性PCR的灵敏度检测结果，M:BM2000+Marker；1:50％；2:10％；3:5％；4:1％；5:0.5％；6:0.1％；7：0.05％；8：0.01％；9：0；10：水。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1目的基因在抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101基因组中的整合情况

1、Southern印迹杂交检测技术

(1)琼脂糖电泳：取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切10～20μg；酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳；电泳结束后，转膜。

(2)印迹转移：切胶并作标记(左下角切除)，以便于定位，然后将凝胶置于一容器中，用0.25M HCl脱嘌呤10min；将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置30min使之变性，不间断地轻轻摇动；将滤纸，尼龙膜剪成与胶同样大小，尼龙膜浸入转移buffer中平衡30min；逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折；虹吸转移24h。

(3)固定DNA：取下尼龙膜浸入2×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒；将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤2-4h。

(4)预杂交：用长镊子将膜放入干净的杂交管中，正面朝向管内，加入适量的双蒸水，使膜湿润，用玻璃棒擀出膜与管壁间的气泡；将预杂交液事先在65℃预热，然后将10mL预杂交液加入杂交管中，拧紧管口，检测无泄露，固定在杂交炉中；65℃预杂交2h以上。

(5)标记探针：从带有目的基因的质粒中扩增出所需要标记的探针序列，扩增后用0.8％的琼脂糖凝胶分离，切胶回收所需要标记的探针序列；将回收得到的探针序列纯化浓缩至16μL(含有1μg DNA)，加入到无菌的离心管中；将上述溶液在100℃沸水中水浴10min，然后立即冰浴，冷却10min，使DNA变性；加入4μL充分混匀的高效DNA地高辛标记和检测试剂盒Ⅱ中的Dig-High Prime，混匀，短暂离心。37℃保温20h；65℃水浴10min，终止反应。

(6)杂交：取出杂交管，吸出7mL杂交液加入20μL变性探针，排除气泡后封口；将杂交管放入杂交炉中杂交12h以上。

(7)按下列条件洗膜：2×SSC,0.1％SDS 50mL室温5min/2次；1×SSC,0.1％SDS50mL 42℃15min/2次；0.5×SSC,0.1％SDS 50mL 56℃ 15min/2次；洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与尼龙膜之间不能有气泡，保鲜膜勿叠加。

(8)染色方法：用CSPD染色，放入暗箱曝光15分钟。

2、Cry1Ab-Ma基因插入拷贝数分析

材料采用转基因玉米CM8101(T₅)和对照材料郑58，利用Southern杂交的方法确定外源基因的拷贝数。分别选择三种单一内切酶对基因组DNA进行消化酶切，选定的酶再T-DNA区只有一个酶切位点，并且不位于相应探针的结合序列内(或者有多个酶切位点，但均不位于探针结合序列一侧)，因此基因组中每个插入位点将显示为一条特异的条带，酶切后进行Southern杂交，分别选取目的基因的一部分作为探针。每个Southern杂交包括阳性对照和阴性对照样品，非转基因野生型玉米DNA中加入经酶切、一个拷贝当量的对照质粒，用作阳性对照；非转基因野生型对照DNA，用作阴性对照。

目的基因Cry1Ab-Ma特异性探针Sac I、Nde I内切酶限制性酶切位点如图1所示，探针大小为788bp，含Southern blot探针的Cry1Ab-Ma目的基因见SEQ ID NO.10。用特异性探针及两种酶切的转基因玉米CM8101的T₅代玉米基因组DNA及对照进行Southern杂交，结果分别获得不同大小的单一条带(图2)。理论上Sac I酶切杂交获得条带大小应大于5.2kb，实际获得大小约为6.2kb，符合预期；Nde I酶切杂交获得条带大小应大于5.0kb,实际获得大小约为5.7kb，符合预期(表1)。结果证明Cry1Ab-Ma基因已经整合到玉米基因组中，在转基因玉米CM8101中，目的基因Cry1Ab-Ma表达框以单拷贝的形式插入受体玉米基因组，载体上目的基因表达盒框架完整。

表1预期及实际杂交条带的大小

3、bar基因的Southern杂交与分析

bar基因特异性探针及Hind III、Sac I、Nde I内切酶限制性酶切位点如图3所示，探针大小为578bp，含Southern blot探针的bar基因见SEQ ID NO.11。用特异性探针及三种酶切的转基因玉米CM8101的T₃至T₅代玉米基因组DNA及对照进行Southern杂交，结果分别获得不同大小的单一条带(图4)。理论上Hind III酶切杂交获得条带大小应大于2.2kb,实际获得大小约为2.6kb，符合预期；Sac I酶切杂交获得条带大小应大于5.2kb，实际获得大小约为6.2kb，符合预期；Nde I酶切杂交获得条带大小应大于5.0kb，实际获得条带大小约为5.7kb，符合预期(表2)。结果证明bar基因已经整合到玉米基因组中，在转基因玉米CM8101中，bar基因表达框以单拷贝的形式插入受体玉米基因组，载体上基因表达盒框架完整。

表2预期及实际杂交的条带大小

实施例2外源插入序列分析及特异性PCR检测方法的建立

通过优化的Tail-PCR法获得插入片段的旁侧基因组序列及靠近5’端和3’端插入玉米基因组的序列，根据旁侧序列确定了转化体特异性PCR检测方法。

1、Tail-PCR捕获侧翼序列

根据刘耀光等报道的hiTAIL-PCR方法，hiTAIL-PCR的特异性引物根据载体5’端和3′端序列设计嵌套式特异性引物，其核苷酸序列和扩增片段长度见表3，在hiTAIL-PCR中使用的任意简并引物AD1-n(n为1至4)和AC-1、AD6见表4。

表3特异性引物

表4任意简并引物AD1-n、AC1和AD6

各步PCR反应体系如表5所示：

表5预扩增PCR反应体系

hiTAIL-PCR包括3轮PCR反应，见表6。

表6 Tail-PCR反应条件

用1％的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，通过比较各级反应产物的电泳分离图谱，切下次级或三级反应的特异性条带，用通用DNA回收试剂盒纯化回收，并克隆到pEASY-T1Cloning Vector上，挑选阳性克隆进行测序。将所得到的侧翼序列与载体序列比对，初步分析是否为所需的片段，然后将所得到的侧翼序列与NCBI数据库比对，分析是否为玉米基因组的序列。

2、定性引物序列

根据CM8101转化体5’和3’端插入及侧翼玉米基因组DNA序列设计特异性PCR检测引物。引物序列见表7，该引物扩增目标片段长度分别为828bp和649bp。

表7 CM8101特异性检测引物序列

反应体系和扩增条件

表8 PCR反应体系

CM8101特异性PCR扩增反应体系见表8。

CM8101扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；68℃延伸5min。

3、检测引物的特异性测试

利用设计的特异性PCR检测引物，以转基因玉米CM8101、其它商业化抗虫转基因玉米、阴性对照DNA以及空白对照为模板，进行一次扩增(图5和图6)，3次重复PCR结果一致，结果表明该引物能特异性检测转基因玉米CM8101。另外两项平行实验得到了相同的结果。

4、检测灵敏度的实证数据

为了确定本定性方法的检测灵敏度，制备了一系列转基因玉米CM8101含量的玉米，三项平行实验组均包括50％，10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0的粉末样品，提取DNA，用转基因玉米CM8101的特异性PCR检测方法进行PCR扩增，每项平行实验组3次重复。

扩增体系中DNA模板量为50ng，用特异性引物8101-5’nF/R的检测结果表明，在50％-1％范围内均能够获得828bp的特异性目的片段(图7)，3次重复结果一致，表明该方法检测灵敏度为大于1％。另外两项平行实验组得到了相同的结果。

扩增体系种DNA模板量为50ng，用特异性引物8101-3’nF/R的检测结果表明，在50％-10％范围内均能够获得649bp的特异性目的片段(图8)，3次重复结果一致表明该方法检测灵敏度为大于10％。另外两项平行实验组得到了相同的结果。

实施例3不同时期不同组织目的蛋白的定量检测

1、ELISA定量检测技术

每个材料不同时期、不同组织样本，每个组织取3株。取0.1g，并简单剪成4-8段。放入液氮速冻，并每个材料装到一个封口袋中，集体放入-80里保存。采用美国Agdia公司生产的Cry1Ab/Ac试剂盒，分析方法根据具体的试剂盒说明书进行操作，分析结果以表达的基因蛋白占样品组织重ng蛋白/g重及可溶性蛋白占每克重mg蛋白/g重表示。取田间生长的不同时期、不同组织样本，每个组织取3株进行检测。

称取0.1克经液氮研磨后组织样本，加入1mL样品提取液，混匀后取出10uL按照ELISA试剂盒说明书进行操作，Bt蛋白的量通过Thermo MK3酶标仪分析。植物总蛋白采用北京康为世纪公司生产的植物总蛋白提取试剂盒提取，总蛋白定量采用索莱伯公司生产的蛋白定量试剂盒，利用Thermo MK3酶标仪定量。根为播种后60天(V8)时期支柱根，茎为灌浆期第10节茎、叶片为V8时期顶端片叶、雄穗为抽雄期的未展开的幼嫩雄穗、花粉为散粉期花粉、苞叶为雌穗吐丝期苞叶，雌穗穗尖为吐丝期的雌穗穗尖、花丝为吐丝期花丝、种子为成熟后水分含量低于15％的种子。对照为非转基因材料，用已知数量的标准Bt蛋白作为对照，然后按照同样的条件进行试验。

1.1 Bt蛋白的ELISA试剂盒进行检测、鉴定

准备样品及正对照：液氮研磨待测样品，称量0.1克磨好的样品加入1mL样品提取缓冲液，同时用2mL样品提取缓冲液稀释试剂盒自带的正对照，充分混匀后低速离心30秒，准备加样。

用酶联缓冲液按照100：1的比例稀释抗体，将稀释的抗体加入到酶标板中，每孔加入100μL。分别将不同的样品各取10μL加入到相应的样品孔中，同时取0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、100μL正对照加入相应的样品孔中，用洗板缓冲液PBST将各样品孔补至200μL，室温潮湿环境下孵育1小时或4℃过夜。

洗板：用1×PBST洗板6-7次，每次加洗板缓冲液200μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体。

显色：每孔加入100μL TMB显色缓冲液，室温潮湿环境下孵育20分钟。

检测：通过Thermo MK3酶标仪在650nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线进行目标蛋白定量。

1.2 PAT蛋白的ELISA试剂盒进行检测、鉴定

孵育：在ELISA板中每孔加入50μL PAT/Bar-酶联反应液，分别将不同的样品各取10μL加入到相应的样品孔中，同时取0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、100μL正对照加入相应的样品孔中，用洗板/抽提缓冲液将各样品孔补至200μL，离心混匀后室温潮湿环境下孵育2小时。

洗板：用洗板缓冲液洗板3次，每次加洗板缓冲液300μL，加满一板后倒掉，洗完后将酶联板倒置，充分去除内部残留液体。

酶联孵育：加入100μL过氧化物酶，充分混匀后室温潮湿环境下孵育0.5小时。

显色：每孔加入100μL终止缓冲液后充分混匀，30分钟内测定结果。

检测：通过Thermo MK3酶标仪在450nm波长下分析不同样品的吸光值，利用正对照绘制标准曲线进行目标蛋白定量。

1.3植物总蛋白提取与测定

植物总蛋白采用北京康为世纪公司生产的植物总蛋白提取试剂盒提取，总蛋白定量采用索莱伯公司生产的蛋白定量试剂盒，利用Thermo MK3酶标仪定量。分析结果以表达的基因蛋白占样品组织重ug蛋白/鲜重及可溶性蛋白占每克重mg蛋白/g鲜重表示。

2、CM8101转基因玉米Cry1Ab-Ma蛋白及PAT蛋白测定

Cry1Ab-Ma蛋白测定结果表明，转基因玉米CM8101在所测植物组织中均能检测到Cry1Ab-Ma蛋白，叶片中含量最高，花粉中含量最低。按Cry1Ab-Ma蛋白μg/g鲜重计算，Cry1Ab-Ma蛋白在叶片，根，茎中的含量随着植株的发育呈下降趋势，苗期时表达量最高。T₅代转基因品系在苗期、心叶期、拔节期、吐丝期、乳熟期和完熟期中，均为叶片表达量最高，分别为31.00，38.02，27.04，20.16和17.74。在根中，苗期、心叶期、拔节期、吐丝期表达量较为接近，心叶期最高，为21.52；乳熟期和完熟期表达量相对较低，分别为为7.77和1.01；在雄穗中，检测吐丝期的表达量为18.01；在花粉中，检测吐丝期的表达量为1.28；在花丝中，检测吐丝期的表达量为10.08；雌穗穗尖中，检测吐丝期的表达量为16.81；在苞叶中，检测吐丝期的表达量为9.19；在茎秆中，乳熟期的表达量最高，为13.50；在籽粒中，乳熟期的表达量最高，为2.64。非转基因对照郑58的值或低于定量极限，或低于检测极限。

PAT蛋白测定结果表明，转基因玉米CM8101在所测植物组织中均能检测到PAT蛋白，叶片中含量最高，花粉中含量最低。按PAT蛋白μg/g鲜重计算，PAT蛋白在叶片，根，茎中的含量随着植株的发育呈下降趋势，苗期时表达量最高。在苗期、心叶期、拔节期、吐丝期、乳熟期和完熟期中，均为叶片表达量最高，分别为2.76，2.34，2.05，3.92和1.4，完熟期叶片的表达量为0.005。在根中，苗期、心叶期、拔节期、吐丝期表达量较为接近，心叶期最高，为1.15；乳熟期和完熟期表达量相对较低，分别为为0.07和0.005；在雄穗中，检测吐丝期的表达量为1.04；在花粉中，检测吐丝期的表达量为0.01；在花丝中，检测吐丝期的表达量为0.08；雌穗穗尖中，检测吐丝期的表达量为0.42；在苞叶中，检测吐丝期的表达量为0.47；在茎秆中，乳熟期的表达量最高，为0.35；在籽粒中，乳熟期和完熟期表达量一致，为0.01。非转基因对照郑58的值或低于定量极限，或低于检测极限。

实施例4抗虫和耐除草剂目标性状的功能效率

1、转基因玉米对亚洲玉米螟抗性的室内生测

转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米转基因玉米CM8101对应的非转基因玉米品种郑58，供试玉米均由转Cry1Ab-Ma基因抗虫玉米研发单位中国农业科学院作物科学研究所提供。试验所用亚洲玉米螟为吉林省农业科学院农业生物技术研究所转基因植物环境安全研究课题组室内饲养种群。

心叶：于心叶期(V6)分别采集转基因玉米及对应非转基因玉米品种的心叶。将心叶剪成约2-3小段，放入培养皿，5次重复，每重复测试10头幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16L：8D的人工气候箱内饲养，根据被取食消耗情况随时添加相同来源的新组织。

雄穗：待玉米生长至吐丝期，分别采集转基因玉米及其对应非转基因玉米品种包有雄穗但雄穗未展开的玉米，剥开玉米叶，轻取幼嫩雄穗，将适量鲜嫩雄穗放入培养皿中，5次重复，每重复测试10头初孵幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16h：8h(L:D)的人工气候箱内培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。

花丝：待玉米生长至吐丝期，分别采集转基因玉米及对应非转基因玉米品种玉米的雌穗，剥开苞叶，轻取鲜花丝，将适量花丝放入培养皿中，5次重复，每重复测试10头幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16h：8h(L：D)的人工气候箱内培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。

苞叶：待玉米生长到吐丝期，分别采集转基因玉米及对应非转基因玉米品种玉米的苞叶，并剪成小段，取适量放入培养皿中，5次重复，每重复测试10头幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16h：8h(L：D)的人工气候箱内培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。

雌穗穗尖：待玉米生长到吐丝期，分别采集转基因玉米及对应非转基因玉米品种玉米的雌穗穗尖，将适量雌穗穗尖放入培养皿中，5次重复，每重复测试10头幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16h：8h(L：D)的人工气候箱内培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。

茎秆：待玉米生长到乳熟期，分别采集转基因玉米及其对应非转基因玉米品种的茎秆(雌穗着生节茎秆)，将茎秆剪成约1-2CM的小段，将适量茎秆小段放入培养皿中，每皿接入亚洲玉米螟初孵幼虫10头，试验重复5次。饲养条件和调查方法同心叶部分。

籽粒：在玉米乳熟期，从田间采回新鲜雌穗，剥去苞叶，取整个籽粒，取适量放入培养皿内，5次重复，每重复测试10头初孵幼虫。置于温度28℃，RH80％，光照周期16h：8h(L：D)的人工气候箱内培养。隔天更换相同来源的新鲜组织，并记录存活幼虫数。

从饲喂第1天、第3天、第5天和第7天，分别对玉米螟幼虫存活率进行调查。根据各处理幼虫的存活数量，计算不同处理的亚洲玉米螟幼虫存活率。采用DPS数据处理系统新复极差法对数据进行统计分析和差异显著性分析。对转基因玉米CM8101与非转基因玉米品种郑58的亚洲玉米螟抗性室内生测结果显示：5％显著水平范围内，取食转基因材料心叶、雄穗、花丝、苞叶、雌穗穗尖、茎秆、籽粒的亚洲玉米螟初孵幼虫7天的存活率均低于取食非基因对照玉米品种郑58对应部位的亚洲玉米螟幼虫7天的存活率，并存在显著性差异。且T₃、T₄、T₅代CM8101抗虫玉米之间无显著性差异。结果表明，转基因玉米CM8101的心叶、雄穗、花丝、苞叶、雌穗穗尖、茎秆、籽粒部位均对亚洲玉米螟具有较强的毒性，且抗虫效率稳定遗传。

2、转基因玉米对亚洲玉米螟抗性的田间生测

对转基因抗虫玉米CM 8101开展抗玉米螟性鉴定研究，综合评价其对亚洲玉米螟的抗性水平，转基因玉米CM8101与非转基因玉米品种郑58，由转Cry1Ab-Ma和bar基因抗虫耐除草剂玉米研发单位中国农业科学院作物科学研究所提供。试验地点为“农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(长春)”环境安全研究试验圃场。试验圃场总面积10公顷，主要用于开展转基因玉米、大豆的环境安全研究试验，圃场东面为玉米农田，南面为大豆试验地，西面为种子加工基地和种子库，北面为居民区。圃场周边有2.5高的围墙，周围300米范围内无其它玉米种植。试验圃场有专人负责监管。

随机区组设计，每个品种三次重复，小区面积为30m²(5m×6m)，行距60cm，株距25cm，常规栽培管理，全生育期不喷施杀虫剂。不同害虫接虫试验小区之间有2m的间隔，避免害虫在不同小区之间的扩散。常规播种方式，播种后按当地常规耕作管理模式进行管理。玉米植株发育至展6叶期(V6)、吐丝期人工接虫。分别在心叶期(小喇叭口期，玉米植株发育至展6期(V6)和吐丝期人工接虫，各接虫两次。每小区人工接虫50株。

心叶期接虫：将产在蜡纸上的玉米螟卵块依卵粒密集程度剪成每块约30粒-40粒的小片。当卵发育至黑头卵阶段，在每株玉米心叶中接载有即将孵化黑头卵的蜡纸片2块，约60粒卵。心叶期接虫调查，每份鉴定材料随机选取15株/行-20株/行，根据玉米螟幼虫取食心叶后所形成的叶片虫孔直径大小和数量划分食叶级别，食叶级别划分依据采用NY/T1248.5-2006的9级分级标准，逐株按表1中的描述记载玉米螟食叶级别。接虫后14天逐株调查食叶级别。叶片危害级别调查结果显示，CM8101对靶标害虫玉米螟有很好的控制作用，5％显著水平范围内，CM8101叶片危害级别显著低于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种，且达到显著差异水平。结果表明，转基因玉米CM8101对亚洲玉米螟抗性优于其对应的非转基因玉米品种和当地普通栽培玉米品种。

吐丝期接虫：将产在蜡纸上的玉米螟卵块依卵粒密集程度剪成每块约30-40粒的小片。当卵发育至黑头卵阶段，在每株玉米花丝丛外接载有即将孵化黑头卵的蜡纸片2块，约60粒卵。在收获前逐株剖杆调查驻茎情况，记录活虫数、隧道长度和驻孔数。按照玉米穗期玉米螟为害程度分级标准、穗期玉米对玉米螟抗性的评价标准，对照郑58的危害级别为7级，抗性级别划分为感；转基因玉米CM8101为害级别为1级，抗性级别为高抗和驻孔数均低于野生型对照。

3、转基因玉米对除草剂抗性的田间测定

对转基因玉米CM8101开展除草剂抗性研究，综合评价其对除草剂的抗性水平。试验地点位于农业部转基因植物环境安全监督验测试中心(济南)试验基地，该基地位于历城区，地势平坦，土质为黄土，肥力中等，上茬作物为玉米。

采用随机区组设计，3次重复，共24个小区，小区面积4m×6m，每小区之间设1m间隔。处理如下：非转基因玉米郑58不喷施除草剂，非转基因玉米郑58喷施中剂量除草剂，非转基因玉米郑58喷施中剂量2倍量除草剂，转基因玉米CM8101不喷施除草剂，转基因玉米CM8101喷施中剂量除草剂，转基因玉米CM8101喷施中剂量2倍量除草剂，转基因玉米CM8101喷施中剂量4倍量除草剂，转基因玉米CM8101喷施中剂量6倍量除草剂。

按常规播种时间、播种方式和播种量于7月10日进行播种，于7月30日喷施相应剂量除草剂。按常规栽培方式进行管理。参考“农业部953号公告-11.1.2007转基因植物及其产品环境安全检测耐除草剂玉米第一部分：除草剂耐受性”用药后1周、2周、4周调查成苗率，植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)，药害症状分级按“B/T17980.42-2000农药田间药效试验准则(一)除草剂防治玉米地杂草”。

用药后1周、2周、4周的调查结果表明，转基因玉米CM8101喷施目标除草剂草铵膦中剂量、2倍中剂量、4倍中剂量、6倍中剂量后，成苗率均达100％，株高与未喷施除草剂处理差异不显著，受害率显著低于喷施草铵膦中剂量、2倍中剂量处理的对照玉米郑58。因此，转基因玉米CM8101对草铵膦有显著耐受性，转基因玉米CM8101能够耐受6倍田间推荐浓度的草铵膦。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所重庆市农业科学院

<120> 转基因抗虫耐除草剂玉米CM8101外源插入片段旁侧序列及其应用

<130> KHP181117476.6

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 646

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctgaagtct tgtactcatc aagcatggtc cttgccatgt ccaatagagt tctattcttc 60

ctcttccact acaccatttt gttgaggtgt gtagggagaa gagaactcat gcttgattcc 120

ctcctccttc aaggaagcct tcgatttgag agttcttgaa ctccatcccc gttgtcgctt 180

ctaattttct tgatccttaa gccgaactca ttttgagccc gtctcaagaa tccctttaag 240

gtttcttggg tttgagattt ttcctgtaaa aagaataccc aagttaagcg agaataatca 300

tccacaataa ctagacagta cttactcccg ccgatgctta tgtaggctat tgggccgaat 360

agatccatgt gcaggagctc cagtggcctg tcggtcgtca ttatgctctt atgcggatga 420

tgagagccaa cttgctttcc tgcttggcat gcgctacaaa tcctatcttt ctcaaaatga 480

acatttgtta gtcctaaaat gtgttctccc tttagaagct tatgaagatt cttcatccca 540

acatgagcta gtcggcggtg ccagagtcaa cccatgttag tcttagcaat taagcaagtg 600

tcgagttcag ctctatcaaa atctaccaag tatagctgac ccttct 646

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgagttttt aaccaagaaa tggtctccac cagaaatcca agaatgtgat ctatggcaag 60

gaaacatatg tggggtgagg ttttgaccaa gaaatggtct ccaccagaaa tccaagaatg 120

tgatctatgg caaggaaaca tatgtggggt gaggtgtatg agcctctggt cgacgatcaa 180

tggccacaca acccccattt tgccgaaaat agccatgaat gaccattttc aataataccg 240

aaggctaaca cgtacgagtt tttaaccaag aaatggtttc caccaaaaat ccaagaatgt 300

aatctatggc aaggaaacat atgtggggtg aggtgtatga gcctctagtt gatgataaat 360

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttgttgag gtgtgtaggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggggtgtgg aaatagtgat 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtttctttcc ccagtgtttt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatggtcatt catggctatt t 21

<210> 7

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttttgttgag gtgtgtaggg agaagagaac tcatgcttga ttccctcctc cttcaaggaa 60

gccttcgatt tgagagttct tgaactccat ccccgttgtc gcttctaatt ttcttgatcc 120

ttaagccgaa ctcattttga gcccgtctca agaatccctt taaggtttct tgggtttgag 180

atttttcctg taaaaagaat acccaagtta agcgagaata atcatccaca ataactagac 240

agtacttact cccgccgatg cttatgtagg ctattgggcc gaatagatcc atgtgcagga 300

gctccagtgg cctgtcggtc gtcattatgc tcttatgcgg atgatgagag ccaacttgct 360

ttcctgcttg gcatgcgcta caaatcctat ctttctcaaa atgaacattt gttagtccta 420

aaatgtgttc tccctttaga agcttatgaa gattcttcat cccaacatga gctagtcggc 480

ggtgccagag tcaacccatg ttagtcttag caattaagca agtgtcgagt tcagctctat 540

caaaatctac caagtatagc tgacccttct aacacattgc ggacgttttt aatgtactga 600

attaacgccg aattgctcta gcattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 660

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 720

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 780

aagctaattc gcttcaagac gtgctcaaat cactatttcc acacccct 828

<210> 8

<211> 649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttctttcc ccagtgtttt ctgtacttgt gtaatcggct aatcgccaac agattcggcg 60

atgaataaat gagaaataaa ttgttctgat tttgagtgca aaaaaaaagg aattagatct 120

gtgtgtgttt tttggatccc cggggcggcc gcgttaacaa gcttgagctc aggatttagc 180

agcattccgg gtaccgagct cgaattcgta atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 240

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 300

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 360

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 420

ttacgagttt ttaaccaaga aatggtctcc accagaaatc caagaatgtg atctatggca 480

aggaaacata tgtggggtga ggttttgacc aagaaatggt ctccaccaga aatccaagaa 540

tgtgatctat ggcaaggaaa catatgtggg gtgaggtgta tgagcctctg gtcgacgatc 600

aatggccaca caacccccat tttgccgaaa atagccatga atgaccatt 649

<210> 9

<211> 5466

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacacattgc ggacgttttt aatgtactga attaacgccg aattgctcta gcattcgcca 60

ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag 120

ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag 180

tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagctaattc gcttcaagac gtgctcaaat 240

cactatttcc acacccctat atttctattg cactcccttt taactgtttt ttattacaaa 300

aatgccctgg aaaatgcact ccctttttgt gtttgttttt ttgtgaaacg atgttgtcag 360

gtaatttatt tgtcagtcta ctatggtggc ccattatatt aatagcaact gtcggtccaa 420

tagacgacgt cgattttctg catttgttta accacgtgga ttttatgaca ttttatatta 480

gttaatttgt aaaacctacc caattaaaga cctcatatgt tctaaagact aatacttaat 540

gataacaatt ttcttttagt gaagaaaggg ataattagta aatatggaac aagggcagaa 600

gatttattaa agccgcggta agagacaaca agtaggtacg tggagtgtct taggtgactt 660

acccacataa cataaagtga cattaacaaa catagctaat gctcctattt gaatagtgca 720

tatcagcata ccttattaca tatagatagg agcaaactct agctagattg ttgagcagat 780

ctcggtgacg ggcaggaccg gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa 840

acccacgtca tgccagttcc cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc 900

atatccgagc gcctcgtgca tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac 960

cacgctcttg aagccctgtg cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc 1020

cagtcccgtc cgctggtggc ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta 1080

ggcgttgcgt gccttccagg ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc 1140

ggcgacgagc cagggatagc gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg 1200

ttcctgcggc tcggtacgga agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt 1260

gcagaccgcc ggcatgtccg cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg 1320

gctcatggta gatcccccgt tcgtaaatgg tgaaaatttt cagaaaattg cttttgcttt 1380

aaaagaaatg atttaaattg ctgcaataga agtagaatgc ttgattgctt gagattcgtt 1440

tgttttgtat atgttgtgtt gagaattaat tctcgaggtc ctctccaaat gaaatgaact 1500

tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc 1560

agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 1620

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggtag aggcatcttg 1680

aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac 1740

tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat 1800

taccctttgt tgaaaagtct caattgccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 1860

tttggagtag acaagtgtgt cgtgctccac catgtttatc acatcaatcc acttgctttg 1920

aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 1980

tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc 2040

atttgtagga gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc 2100

aatggaatcc gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca attgcccttt 2160

ggtcttctga gactgtatct ttgatatttt tggagtagac aagtgtgtcg tgctccacca 2220

tgttgacctg caggcatgca agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccccg 2280

atcctacctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 2340

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 2400

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 2460

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 2520

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acacgctgac 2580

aagctgactc tagcagatcc tctagaacca tcttccacac actcaagcca cactattgga 2640

gaacacacag ggacaacaca ccataagatc caagggaggc ctccgccgcc gccggtaacc 2700

accccgcccc tctcctcttt ctttctccgt ttttttttcc gtctcggtct cgatctttgg 2760

ccttggtagt ttgggtgggc gagaggcggc ttcgtgcgcg cccagatcgg tgcgcgggag 2820

gggcgggatc tcgcggctgg ggctctcgcc ggcgtggatc cggcccggat ctcgcgggga 2880

atggggctct cggatgtaga tctgcgatcc gccgttgttg ggggagatga tggggggttt 2940

aaaatttccg ccgtgctaaa caagatcagg aagaggggaa aagggcacta tggtttatat 3000

ttttatatat ttctgctgct tcgtcaggct tagatgtgct agatctttct ttcttctttt 3060

tgtgggtaga atttgaatcc ctcagcattg ttcatcggta gtttttcttt tcatgatttg 3120

tgacaaatgc agcctcgtgc ggagcttttt tgtaggtaga agcccgggat ggacaacaac 3180

ccgaacatca acgagtgcat cccctacaac tgcctctcga acccggaggt cgaggtcctc 3240

ggaggcgagc ggatcgagac ggggtatacg ccgatcgata tctcgctctc gctcacgcag 3300

ttcctcctgt ccgaattcgt cccgggcgcg ggtttcgtcc ttgggctcgt cgacatcatc 3360

tgggggatct tcgggccgtc ccagtgggac gcgttcctcg tccagatcga gcaactcatc 3420

aaccagcgga tcgaggaatt cgcgcggaat caagcgatca gccggctcga ggggctctcc 3480

aacttgtacc agatctacgc ggaatccttc cgggaatggg aggcggaccc gacgaatccg 3540

gcgttgaggg aagagatgag gatccagttc aacgacatga actccgcgct cacgacggcg 3600

atcccgctct tcgcggtcca gaactatcag gtcccgctac tctcggtcta tgtccaggcg 3660

gcgaacctcc atttgtcggt cctccgggac gtgtcggtct tcggtcagcg ctgggggttc 3720

gacgcggcga cgatcaactc gcggtacaat gacctcacgc gcctcatcgg gaactacacg 3780

gatcacgcgg tccggtggta caacacgggg ctcgagcggg tgtggggccc ggactccagg 3840

gactggatcc gctacaacca attccgtcgg gagcttacgt tgacggtcct cgatatcgtc 3900

agcttgttcc ctaactacga ttcgaggacg tatccgatcc ggacggtctc gcagctcacg 3960

agggagattt acacgaaccc ggtcctcgag aacttcgatg ggtccttccg ggggtccgcg 4020

caggggatcg aggggtcgat ccgctccccg cacctcatgg atatcctcaa ctcgatcacg 4080

atctacacgg acgcgcaccg gggggagtac tattggtccg ggcaccagat catggcgtcg 4140

ccggtgggct tctcgggccc ggagttcacg ttcccgctgt acgggacgat ggggaacgcg 4200

gccccgcagc agcggatcgt cgcgcagctc gggcagggcg tgtaccgcac gctcagcagc 4260

acgctctacc gccgcccgtt caacatcggg atcaacaacc aacagctctc ggtcctcgat 4320

gggacggagt tcgcgtacgg gacgagcagc aacctcccgt cggcggtcta ccggaagtca 4380

gggacggtcg actcgctcga tgagatcccg ccgcagaaca ataacgtccc gccgcggcag 4440

gggttctcgc accggctctc gcacgtctcg atgttccggt cggggttctc gaactcgtcg 4500

gtctcgatca tccgcgcgcc gatgttctcg tggatccacc ggtcggcgga attcaacaac 4560

atcattccgt cgtcgcagat cacgcagatc ccgctcacga agtcgacgaa cctcgggtcg 4620

gggacgtcgg tcgtcaaggg gccggggttc acgggtgggg acatcctccg gcggacgagc 4680

ccggggcaga tctcgacatt gcgggtcaac atcacggcgc cgctctccca gcgctaccgg 4740

gtgcgaatcc ggtacgcgtc gacgacgaac ctccagttcc acacgtcgat cgacggtcgg 4800

ccgatcaacc agggaaactt ctcggcgacg atgtcctcgg ggtcgaacct ccagtcgggt 4860

tcgttccgga cggtaggctt cacgacgccg ttcaacttct ccaacggctc gtcggtcttc 4920

acgctctcgg cgcacgtctt caactccggg aacgaggtct acatcgacag gatcgagttc 4980

gtcccggcgg aggtcacgtt cgaggcggag tactagcccg ggtgatgaga catctctgta 5040

ttgtgtttct ttccccagtg ttttctgtac ttgtgtaatc ggctaatcgc caacagattc 5100

ggcgatgaat aaatgagaaa taaattgttc tgattttgag tgcaaaaaaa aaggaattag 5160

atctgtgtgt gttttttgga tccccggggc ggccgcgtta acaagcttga gctcaggatt 5220

tagcagcatt ccgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg 5280

aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 5340

ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 5400

ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 5460

cggttt 5466

<210> 10

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggacaaca acccgaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctctc gaacccggag 60

gtcgaggtcc tcggaggcga gcggatcgag acggggtata cgccgatcga tatctcgctc 120

tcgctcacgc agttcctcct gtccgaattc gtcccgggcg cgggtttcgt ccttgggctc 180

gtcgacatca tctgggggat cttcgggccg tcccagtggg acgcgttcct cgtccagatc 240

gagcaactca tcaaccagcg gatcgaggaa ttcgcgcgga atcaagcgat cagccggctc 300

gaggggctct ccaacttgta ccagatctac gcggaatcct tccgggaatg ggaggcggac 360

ccgacgaatc cggcgttgag ggaagagatg aggatccagt tcaacgacat gaactccgcg 420

ctcacgacgg cgatcccgct cttcgcggtc cagaactatc aggtcccgct actctcggtc 480

tatgtccagg cggcgaacct ccatttgtcg gtcctccggg acgtgtcggt cttcggtcag 540

cgctgggggt tcgacgcggc gacgatcaac tcgcggtaca atgacctcac gcgcctcatc 600

gggaactaca cggatcacgc ggtccggtgg tacaacacgg ggctcgagcg ggtgtggggc 660

ccggactcca gggactggat ccgctacaac caattccgtc gggagcttac gttgacggtc 720

ctcgatatcg tcagcttgtt ccctaactac gattcgagga cgtatccgat ccggacggtc 780

tcgcagctca cgagggagat ttacacgaac ccggtcctcg agaacttcga tgggtccttc 840

cgggggtccg cgcaggggat cgaggggtcg atccgctccc cgcacctcat ggatatcctc 900

aactcgatca cgatctacac ggacgcgcac cggggggagt actattggtc cgggcaccag 960

atcatggcgt cgccggtggg cttctcgggc ccggagttca cgttcccgct gtacgggacg 1020

atggggaacg cggccccgca gcagcggatc gtcgcgcagc tcgggcaggg cgtgtaccgc 1080

acgctcagca gcacgctcta ccgccgcccg ttcaacatcg ggatcaacaa ccaacagctc 1140

tcggtcctcg atgggacgga gttcgcgtac gggacgagca gcaacctccc gtcggcggtc 1200

taccggaagt cagggacggt cgactcgctc gatgagatcc cgccgcagaa caataacgtc 1260

ccgccgcggc aggggttctc gcaccggctc tcgcacgtct cgatgttccg gtcggggttc 1320

tcgaactcgt cggtctcgat catccgcgcg ccgatgttct cgtggatcca ccggtcggcg 1380

gaattcaaca acatcattcc gtcgtcgcag atcacgcaga tcccgctcac gaagtcgacg 1440

aacctcgggt cggggacgtc ggtcgtcaag gggccggggt tcacgggtgg ggacatcctc 1500

cggcggacga gcccggggca gatctcgaca ttgcgggtca acatcacggc gccgctctcc 1560

cagcgctacc gggtgcgaat ccggtacgcg tcgacgacga acctccagtt ccacacgtcg 1620

atcgacggtc ggccgatcaa ccagggaaac ttctcggcga cgatgtcctc ggggtcgaac 1680

ctccagtcgg gttcgttccg gacggtaggc ttcacgacgc cgttcaactt ctccaacggc 1740

tcgtcggtct tcacgctctc ggcgcacgtc ttcaactccg ggaacgaggt ctacatcgac 1800

aggatcgagt tcgtcccggc ggaggtcacg ttcgaggcgg agtactag 1848

<210> 11

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagatct gctcaacaat ctag 564

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggggtgtgg aaatagtgat ttgagcacgt c 31

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgatggact ccagtccaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggc 43

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgcagcaca tccccctttc gccagct 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcaggattt agcagcattc cgggtac 27

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgag 28

Claims

1.抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段；和/或外源插入片段的3’端旁侧序列，具有SEQ ID NO.2所示的序列或其特异性片段。

2.用于检测抗虫耐除草剂转基因玉米事件CM8101的DNA片段，其特征在于，其包含至少部分权利要求1所述的旁侧序列和至少部分外源插入片段，且旁侧序列部分与外源插入片段部分顺序相连，所述外源插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示。

4.权利要求1所述的旁侧序列或权利要求2-3任一所述的DNA片段在检测转基因玉米CM8101中的应用。

5.用于扩增权利要求2-3任一所述的DNA片段的特异性引物对。

6.用于检测抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3-4或SEQ ID NO.5-6所示。

7.用于检测转基因玉米CM8101的试剂盒，其他特征在于，含有权利要求5或6所述的特异性引物对。

8.一种检测抗虫耐除草剂转基因玉米CM8101的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书5或6所述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，当采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的特异性引物对对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为828bp，则待测样品含有CM8101来源的成分；

10.权利要求5或6所述的特异性引物对或权利要求7所述的试剂盒在检测转基因玉米CM8101亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。