CN110951727A - 转基因玉米bfl4-2外源插入片段旁侧序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4‑2外源插入片段旁侧序列及其应用。所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明提供了用于检测3’端旁侧序列的引物对。本发明的转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4‑2外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于玉米BFL4‑2包括亲本、杂交种以及后代相关材料，包括植株、组织、种子及相关制品的检测。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用。
背景技术
玉米是我国第一大粮食作物，也是重要的饲料及工业原料，在国家粮食安全和国民经济发展中占有非常重要地位。然而在玉米生长发育过程中，常遭受病害、虫害、草害的影响。玉米螟俗称钻心虫，是造成玉米常年减产的重要生物灾害之一，每年造成玉米产量的重大损失。其危害造成的伤口又是玉米穗腐病病原菌入侵的途径，害虫本身常携带病原菌，从而诱发和加重玉米穗腐病的发生。农民常大量使用高毒化学农药进行防治，导致玉米农药残留严重，且农药中毒事件也频频发生，严重危害人民健康。田间杂草与作物争夺养分、水分和光源，严重影响作物的生长发育，造成严重减产，一般年份造成10-30%的减产，严重可达50%以上，随着人工成本的增加，依靠人工除草大大增加生产成本。
转基因技术为玉米的遗传改良提供了一条新的分子育种途径。利用转基因技术培育的抗虫、抗除草剂转基因作物是农业害虫控制和杂草防除的有效手段，可有效减少农民对化学杀虫剂的依赖，降低人工成本，提高玉米产量和品质，对于保护生态环境和生物多样性具有重要意义。Bt基因Cry1Ab、Cry1F主要应用于针对鳞翅目害虫玉米螟和棉铃虫的抗虫基因。孟山都公司的MON810、杜邦公司的TC1507、先正达公司的Bt11、Bt176、先锋公司的DP4114等均已实现了商业化种植推广。草甘膦（Glyphosate）是一种内吸性、广谱性、施用于叶面的有机膦类除草剂，1971年由孟山都公司成功开发，是全球销售最好的除草剂，具有高效、低毒、易降解等特点。其可以竞争性抑制植物和细菌的莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性。孟山都公司的NK603、MON87427将具有抗草甘膦除草剂能力的cp4epsps基因转入农作物中，使这些作物具有抗草甘膦能力，并得到了大规模的商业化应用。
国际农业生物技术应用服务组织发布的2018年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势表明，2018年转基因作物继续保持高应用率，全球种植面积达到1.917亿公顷。具有复合抗虫性状的转基因作物种植面积占全球种植面积的42%。在美国，复合性状的转基因玉米的种植面积占玉米总种植面积的76%。复合性状转基因作物具有成本低、效率高、管理方便、投入较少等优点，将会得到农民的更多的应用和青睐。
转基因作物抗虫的关键是获得具有抗虫性能的优良杀虫蛋白，目前比较常用的是BT杀虫蛋白，比如Cry1Ab、Cry1F、Cry2Bb等。单独使用一种杀虫蛋白容易引起害虫的抗性产生和发展。培育含多个抗虫蛋白的转基因作物可以更有效地延缓害虫抗性的发生，种植具有复合性状的转基因作物已成为趋势。我国还没有商业化种植的转基因玉米，转基因玉米研发处于环境安全评价的不同阶段，培育的转基因玉米具有抗虫耐除草剂复合性状特性，未来通过转基因安全评价获得安全生产证书后，可应用于商业种植，有效的减少玉米螟发生、提高除草效率，降低人工成本和农药使用，提高玉米生产效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因抗虫耐除草剂玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用。
一种转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
所述外源插入片段包括Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因。
所述转基因玉米BFL4-2外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BFL4-2中的应用。
用于扩增所述的DNA片段的特异性引物对。
用于检测转基因玉米BFL4-2的特异性引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3-4所示。
用于检测转基因玉米BFL4-2的试剂盒，含有所述的特异性引物对。
所述的特异性引物对在检测转基因玉米BFL4-2亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。
一种检测转基因玉米BFL4-2的方法，以样品总DNA为模板，利用所述的特异性引物对进行PCR反应，若扩增产物条带大小为296 bp，则待测样品含有BFL4-2来源的成分。
本发明的有益效果：本发明根据玉米的密码子使用频率对抗虫基因Cry1Ab、Cry1F和抗草甘膦基因cp4epsps基因密码子进行优化，使其在玉米中能够高效表达和翻译，将Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因串联表达，转入玉米，获得具有抗虫、耐除草剂复合抗性的转基因玉米。利用全基因组测序和旁侧序列测序对外源片段插入位置进行了分析，对Cry1Ab、 Cry1F、cp4epsps基因表达量和蛋白表达量进行了分析，同时对转基因玉米的抗虫和除草剂性能进行了评价。本发明提供了抗虫耐除草剂转基因玉米BFL4-2插入位点的外源插入片段的旁侧序列，包括外源插入片段的3’端旁侧序列和5’端旁侧序列。特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，旁侧序列与外源基因组的整合片段，可以通过设计引物，包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段，进行PCR扩增，检测特异性PCR条带。在外源插入片段设计上游特异性引物，在3’旁侧序列设计下游特异引物，扩增特异性片段。也可以根据在5’端旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段。
附图说明
图1为pL4质粒的图谱。
图2 为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2的3代材料中的PCR检测；
图中，阴性对照为郑58，阳性对照为转基因T1代植株，Marker为100 bp分子量标准。
图3 为BFL4-2材料特异性PCR检测；
图中，1：BFL4-2玉米株系；2：阳性对照（转基因T1代植株）；3：阴性对照（非转基因郑58对照）；M：100 bp分子量标准。
图4 为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2材料5叶期和成熟期表达量；
图中，A为Cry1Ab、Cry1F、cp4epsps基因在BFL4-2材料5叶期表达量；B为Cry1Ab、Cry1F、 cp4epsps基因在BFL4-2材料成熟期表达量。
图5 为BFL4-2材料抗除草剂和抗虫性能评价；
图中，A为喷施草甘膦1周后转基因BFL4-2材料与非转基因对照材料生长情况；B和C为田间接虫后非转基因植株和BFL4-2在叶片B和果穗C上的表型；白色箭头所指为虫孔位置；对照为非转基因玉米材料郑58。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1转基因材料的获得
根据玉米的密码子使用频率对cp4epsps、cry1Ab和cry1F基因进行密码子优化，将优化的cp4epsps、cry1Ab和cry1F基因构建到植物表达载体，载体骨架来自pCAMBIA1300载体序列，构建好的载体名称为pL4，载体大小17804 bp，载体图谱见附图1，其中RB到LB之间的包含cry1Ab、cp4epsps和cry1F三个表达框（表1-表3）。利用农杆菌介导的转化方法，将外源基因及其它基因元件导入受体玉米材料HiII中，并通过回交转育的方法，将转化事件与玉米自交系郑58进行回交，获得含有外源基因的郑58遗传背景的抗虫耐除草剂玉米BFL4-2。经转基因后代分离鉴定实验和全基因组测序，BFL4-2为一个拷贝插入。对BFL4-2进行田间接种亚洲玉米螟和耐除草剂实验，结果表明获得的转基因玉米BFL4-2具有很好的抗玉米螟耐草甘膦性能。
表1 Cry1Ab表达框
| 名称 | 大小 | 功能 |
| E35S | 613 bp | 花椰菜花叶病毒35S启动子（双CaMV35S）, 含有重复增强子区域。 |
| Act2 intron | 591 bp | 水稻肌动蛋白基因Act2第一内含子，稳定Cry1Ab表达。 |
| <i>Cry1Ab</i> | 2451 bp | 来源于苏云金芽孢杆菌<i>cry1Ab</i>基因，表达Cry1Ab蛋白质，抗鳞翅目昆虫。 |
| Tnos | 224 kb | 来源于农杆菌胭脂氨酸合成酶的3’端非转录区，终止转录，引导信息RNA聚腺苷酸化。 |
表2 CP4EPSPS表达框
| 名称 | 大小 | 功能 |
| OsAct2 | 1405 bp | 水稻肌动蛋白基因5’ 端区域，含有启动子、转录起始点及第一内含子。 |
| CTP2 | 228 bp | 来源于拟南芥EPSPS 叶绿体转移信号肽DNA序列,引导CP4EPSPS蛋白质进入芳香族氨基酸合成场所叶绿体中。 |
| <i>cp4epsp</i>s | 1368 bp | 来源于农杆菌CP4 菌株，编码合成CP4EPSPS的DNA序列，抗草甘膦。 |
| Thsp17 | 211 bp | 来源于小麦的热激蛋白Hsp17的3’端非转录区，终止转录，引导信息RNA聚腺苷酸化。 |
表3 Cry1F表达框
| 名称 | 大小 | 功能 |
| Ubi | 1994 bp | 玉米泛素蛋白基因5’ 端区域，含有启动子、转录起始点及第一内含子。 |
| <i>Cry1F</i> | 1971 bp | 来源于苏云金芽孢杆菌<i>cry1F</i>基因，表达cry1F蛋白质，抗鳞翅目昆虫。 |
| T35S | 185 bp | 来源于花椰菜花叶病毒35S的3’端非转录区，终止转录，引导信息RNA聚腺苷酸化。 |
实施例2 BFL4-2转化材料中外源基因遗传稳定性检测
采用全式金公司的“植物基因组DNA提取试剂盒”提取BFL4-2不同世代（BC4F1、BC5F1和BC6F1）阳性植物基因组DNA，分别对Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因进行特异扩增。引物序列如表4。
表4 BFL4-2转化材料中外源基因检测引物信息
PCR（聚合酶链式反应）反应体系如下：
2xTSINGKE Master Mix 10 µl
Forward primer (10 µM) 0.4 µl
Reverse primer (10 µM) 0.4 µl
ddH2O 8.2 µl
DNA模板 1 µl
PCR反应程序如下：
94℃ 3 min
94℃ 30 s
58℃ 30 s 35 cycle
72℃ 30 s
72℃ 10 min
反应结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果见图2。3代检测（BC4F1,BC5F1和BC6F1）都能检测到目的基因，说明插入序列是以整合形式存在，且能够稳定遗传。PCR检测后代分离比复合单拷贝插入片段的孟德尔遗传规律，为单拷贝插入。
实施例3 BFL4-2的旁侧序列分析及特异性PCR检测
利用全基因组重测序方法和PCR技术检测了外源目的基因在玉米基因组中的整合情况。获得测序结果结合生物信息学方法进行分析，发现插入序列整合在玉米染色体上。BFL4-2的外源基因插入在玉米基因组Chr5：65838248—65839864之间。
通过高通量重测序方法和PCR结合测序方法确定了目标基因在基因组中的整合位置，经PCR测序BFL4-2事件的旁侧序列如下，其左旁侧序列如SEQ ID NO：1所示，其右旁侧序列如SEQ ID NO：2所示。3’端特异性PCR检测的引物对由SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子组成，扩增的序列如SEQ ID NO：5所示。
采用全式金公司的“植物基因组DNA提取试剂盒”提取BFL4-2基因组DNA，对插入片段3’端序列进行特异性PCR扩增。扩增引物序列为：
BFL4-2T: 5’-GCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’； （SEQ ID NO：3）
T35LBfw1: 5’-CTATCCACCGCTGAGGCAGA-3’； （SEQ ID NO：4）
理论扩增大小为296 bp（SEQ ID NO：5）。
PCR（聚合酶链式反应）反应体系如下：
2xTSINGKE Master Mix 10 µl
Forward primer (10 µM) 0.4 µl
Reverse primer (10 µM) 0.4 µl
ddH2O 8.2 µl
DNA模板 1 µl
PCR反应程序如下：
94℃ 3 min
94℃ 30 s
58℃ 30 s 35 cycles
72℃ 30 s
72℃ 10min
反应结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果见图3。
实施例4 BFL4-2外源基因qRT-PCR检测
提取玉米BFL4-2植株5片叶的幼苗的根、茎、叶，以及成熟期的成熟植株的根、茎、叶以及种子中的RNA。RNA的提取参照试剂盒SV Total RNA Isolation System (Promega, USA)方法进行、反转录参照试剂盒A3500-Reverse Transcription System (Promega, USA)方法进行。外源基因qRT-PCR检测用引物见表5。采用SYBR Premix ExTaqTM (Code DRR041A,TAKARA)荧光定量试剂盒，PCR仪为Applied Biosystems (http://www.AppliedBiosystems.com) Prism 7500 analyzer。BFL4-2植株Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps在5叶期和成熟期的表达量见图4。
表5 BFL4-2转化材料中外源基因qRT-PCR引物信息
实施例5 BFL4-2目标蛋白测定方法及其在不同组织的表达量检测
采用酶联免疫分析（ELISA）方法对BFL4-2玉米和非转基因对照玉米地上部整株和籽粒样本中的Cry1Ab、Cry1F、CP4EPSPS蛋白的表达水平进行分析检测。分析方法按照EnviroLogix公司试剂盒说明书进行。
（1） Cry1Ab标准曲线的制作
将购买的Cry1Ab蛋白纯品分别稀释成0.4 ng/µL、0.2 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL、0.025 ng/µL、0.0125 ng/µL、0.00625 ng/µL、0.00 ng/µL（空白对照）。操作步骤如下：
分别取50 µL加入酶标板进行反应，三次重复；室温下孵育30分钟；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加50 µL Cry1Ab-enzyme抗体；室温下孵育1小时；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加100 µL底物，室温下孵育30分钟；加100µL反应终止液；利用酶标仪进行OD450光吸收测定。
（2） Cry1F标准曲线的制作
将Cry1F蛋白分别稀释成0.4 ng/µL、0.2 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL、0.025 ng/µL、0.0125 ng/µL、0.00625 ng/µL、0.00 ng/µL（空白对照）。操作步骤如下：
分别取50µL加入酶标板进行反应，三次重复；室温下孵育30分钟；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加50 µL Cry3Bb-enzyme抗体；室温下孵育1小时；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加100µL底物，室温下孵育30分钟；加100µL反应终止液；利用酶标仪进行OD450光吸收测定。
（3）CP4EPSPS标准曲线的制作
将CP4EPSPS蛋白分别稀释成0.4 ng/µL、0.2 ng/µL、0.1 ng/µL、0.05 ng/µL、0.025ng/µL、0.0125ng/µL、0.00625ng/µL、0.00 ng/µL（空白对照）。操作步骤如下：
分别取50 µL加入酶标板进行反应，三次重复；室温下孵育30分钟；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加50 µL Cry3Bb-enzyme抗体；室温下孵育1小时；移去上清，用washbuffer洗3-4次；加100µL底物，室温下孵育30分钟；加100µL反应终止液；利用酶标仪进行OD450光吸收测定。
（4）目的蛋白含量的测定
分别在玉米生长的五叶期、开花期、成熟期取材，包括根、茎、叶、花穗、种子等组织。
取植物材料50 mg，用液氮研磨成粉末，加300 µL蛋白提取buffer，溶解蛋白，12,000 rpm离心，取上清200 µL，-80度保存；进一步稀释100倍备用。阳性对照：玉米籽粒干粉分别含有Cry1Ab 30 µg/g；Cry1F 30 µg/g；CP4EPSPS 40 µg/g。阴性对照为非转基因自交系郑58。
ELISA操作步骤如下：
分别取稀释好的样品50 µL加入酶标板进行反应，三次重复；室温下孵育30分钟；移去上清，用wash buffer洗3-4次；分别加50 µL Cry1Ab-enzyme抗体、Cry1F-enzyme抗体或CP4EPSPS-enzyme抗体；室温下孵育1小时；移去上清，用wash buffer洗3-4次；加100 µL底物，室温下孵育30分钟；加100 µL反应终止液；利用酶标仪进行OD450光吸收测定；根据测定获得的OD450值和标准曲线分别计算Cry1Ab、Cry1F、CP4EPSPS蛋白浓度和含量。计算公式如下：
稀释后的Cry1Ab的浓度(ng/µL)=OD450/6.106
50 mg鲜重样品中Cry1Ab含量为=(OD450/6.106) × 50 × 2 × 300
稀释后的Cry1F的浓度(ng/µL)=OD450/4.1916
50 mg鲜重样品中Cry1F含量为=(OD450/4.1916) × 50 × 2 × 300
稀释后的CP4EPSPS的浓度(ng/µL)=OD450/4.8836
50 mg鲜重样品中CP4EPSPS含量为=(OD450/4.8836) × 50 × 2 × 300
采用同样的方法，对转基因植株中的目标蛋白进行测定，BFL4-2在5叶期、开花期和成熟期转基因材料中Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白含量见表6-表8。
表6 BFL4-2转基因材料5叶期Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白含量
注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。
表7 BFL4-2转基因材料开花期Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白含量
注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。
表8 BFL4-2转基因材料成熟期Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白含量
注：数值为平均值±表示标准差。阴性对照减去背景值后未检出，以“－”表示。
实施例6 BFL4-2田间抗草甘膦试验
试验材料：将转基因材料及未转基因的野生型对照材料按照每个材料种6行（3次重复），行长4米，行距为60 cm，株距30 cm。
试验方法：在幼苗3-4叶期和大喇叭口期对PCR阳性的转基因植株，采用不同浓度的草甘膦(41%乳液)进行喷施，使用浓度分别为一般的正常使用浓度（3mL/L）的5倍，对照喷施清水，分别在一周和两周后调查植株死亡率。
试验结果：BFL4-2对草甘膦抗性达到正常大田使用浓度的5倍以上，为高抗草甘膦转基因玉米。
实施例7 BFL4-2田间玉米螟抗性试验
试验材料：BFL4-2及非转基因对照郑58。转基因材料及未转基因的野生型对照材料按照每个材料种6行，行长4米，行间距为60 cm，株间距30 cm，小区间隔2米。
试验方法：幼苗大喇叭口期在每个小区中每株接种刚刚孵化出的玉米螟20-30头，每个小区接种50~60株，生长3周后统计虫害，包括受害叶片上的虫孔大小、数量及分布等。国际玉米螟协作组制定的9级抗虫分级标准为：1~3 级：虫孔针刺状（1 级：稀少、分散；2级：中等数量；3 级：大量）。4~6 级：虫孔火柴头大小（4 级：稀少、分散；5 级：中等数量；6级：大量）。7~9 级：虫孔大于火柴头（7 级：稀少分散；8 级：中等数量；9 级：大量）。抗性级别分类：1~2.9 级（高抗），3~4.9 级（抗虫），5~6.9 级（感虫），7~9级（高感）。
试验结果：结果表明所有的转基因植株叶片仅有针孔大小的危害，数量少，而绝大部分（>98%）的非转基因对照植株叶片出现大于火柴头的虫孔，数量多，受害严重（图5），抗性鉴定结果说明BFL4-2对玉米螟的抗性为高抗。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 转基因玉米BFL4-2外源插入片段旁侧序列及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 553
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
<400> 1
aaaacacttg ttgagacata acaagagttg ttccaagaga aattgatcaa agatttcaaa 60
aactccccct tttttccata attaatcctt ctccccacaa gagactaact tttgataata 120
agaggcaaac aagagtattt tgacaaacaa aaactctaac tctacttttt caaaatttct 180
caagtggtag ctgatccatt tcttgctttg gccttatttt ctcccccttt ggcatcaagc 240
accaaaacgg gatcaatttt ggccctttaa ccccattgcc tcaccaaaat cttcaactaa 300
gagtaaaaag gcaataagag tacaaagatg aacatggaaa aagttactct ttcatcggag 360
tgcagtggaa gtcttgcatg gtccaagtcc accttttccc tttcaaacct cctttgagac 420
ttaattaagc aaactcaaac acacagttag tctcaaaggg tcaagttgta gcacatctcc 480
ccctaaattt gtgcatcact tgcaaatgga cttgtaaggt ccagggagtg cttgtacaac 540
ttgagcacca taa 553
<210> 2
<211> 739
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays L.)
<400> 2
caaagtcccg gagggtttgc ctcatccaaa gtagttgcgc gcaacactgt cctgcggcaa 60
cgtactctgc ctcagcggtg gatagggcaa cagaagtttg tttcttagaa ctccatgaca 120
ccagggacct tcctaagaac tggcacgtcc ccgatgtact cttcctatcg accttacatc 180
tagcatagtc ggagtctgaa tatccaatca agtcaaaggt agaccccttt ggataccaga 240
tcctgaagca aggcgtagcg actaaatatc taagaattcg cttcactgcc actaagtgac 300
attcccttgg atcggattga aatctagcac acatgcatac actaagcata atatccagtc 360
tactagcaca taaataaagt aaagacccta tcatagaccg atatgccttt tgatcaacgg 420
acttacctcc tttgttgagg tcggtgtgtc cgtcggttcc cattggagtc tttgcgggct 480
tggcgtcctt catcccaaac cgcttgatca agtcttgcgt gtacttcgtt tgggagatga 540
aggtcccgtc cttgagttgc ttcacttgga acccaaggaa gtagttcaac tcgcccatca 600
tcgacatttc gaatttctgc gtcatcaccc tgctaaactc ttcacaagac ttttggttag 660
tggagccaaa tattatgtca tcgacataaa tttggcacac aaacagatca ccatcgcagg 720
tcttagtgaa aagagttgg 739
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctcatgtgt tgagcatata a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctatccaccg ctgaggcaga 20
<210> 5
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct 60
atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtac taaaatccag atcccccgaa 120
ttaattcggc gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa 180
gcgtcaattt gtttacacca caatatagct tcaaagtccc ggagggtttg cctcatccaa 240
agtagttgcg cgcaacactg tcctgcggca acgtactctg cctcagcggt ggatag 296
Claims (7)
1.一种转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，其特征在于，所述旁侧序列的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述转基因玉米BFL4-2外源插入旁侧序列，其特征在于，所述外源插入片段包括Cry1Ab、Cry1F和cp4epsps基因。
3.权利要求1或2所述转基因玉米BFL4-2外源插入序列及其旁侧序列在检测转基因玉米BFL4-2中的应用。
4.用于检测转基因玉米BFL4-2的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3-4所示。
5.用于检测转基因玉米BFL4-2的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的特异性引物对。
6.权利要求4所述的特异性引物对在检测转基因玉米BFL4-2亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。
7.一种检测转基因玉米BFL4-2的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求书4所述的特异性引物对进行PCR反应，若扩增产物条带大小为296 bp，则待测样品含有BFL4-2来源的成分。
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| JINCHAO GUO等: "A multiplex degenerate PCR analytical approach targeting to eight genes for screening GMOs", 《FOOD CHEMISTRY》 * |
| 刘小丹等: "转基因玉米育种研究进展", 《玉米科学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113980990A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-01-28 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种转基因抗虫耐除草剂玉米及其培育方法 |
| CN113980990B (zh) * | 2021-11-26 | 2022-07-26 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种转基因抗虫耐除草剂玉米及其培育方法 |
| WO2023093847A1 (zh) * | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种转基因抗虫耐除草剂玉米及其培育方法 |
| WO2023093848A1 (zh) * | 2021-11-26 | 2023-06-01 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种转基因抗虫耐除草剂玉米及其培育方法 |
| CN114410822A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-04-29 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 转基因玉米bfl4-2转化体特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法 |
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