CN106498030A - 转基因大豆zuts‑33的制备方法、检测及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大豆转化事件ZUTS‑33，所述转化事件ZUTS‑33中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的5'端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO:1所示，所述外源插入序列的3'端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还同时公开了相应的用于鉴定转基因大豆ZUTS‑33的检测方法、检测生物样品中事件ZUTS‑33或其子代的方法、检测事件ZUTS‑33中外源插入DNA分子的方法、检测来源于ZUTS‑33事件的植物材料的方法等内容。

Description

转基因大豆ZUTS-33的制备方法、检测及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术及育种领域。具体的说，本发明涉及转基因大豆及其应用，更具体地，本发明涉及抗草甘膦转基因大豆制备方法、检测技术与应用。
背景技术
大豆是我国重要的蛋白和油料作物，在农业生产中具有不可或缺的地位。利用基因工程手段将与抗除草剂有关的基因转入大豆，育成高抗除草剂大豆品种，可节约大豆生产中人工除草的成本，降低草害，提高大豆的产量。
草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，是全球应用最广的除草剂之一。草甘膦主要通过抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶，EPSPS)的活性而阻断芳香族氨基酸的合成，最终导致受试植物死亡。近年来包括美国和中国在内的国家，草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积的推广有直接的关系。我国目前年产草甘膦约3万吨，实际生产能力超过4.5万吨，已成为继美国之后世界第二大生产和出口国。在转基因抗草甘膦作物方面的研究取得了一些成果，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道，这与我国作为世界草甘膦生产和出口第二大国的地位是极不相称的。特别是入关以后，这种来自外部的冲击对我国植物抗草甘膦基因工程研究和草甘膦生产所造成的不利影响将越来越严重。
EPSP合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是生物体内芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键性酶；草甘磷是通过抑制EPSP合成酶的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是某些细菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以将细菌EPSPS基因的表达在植物体内，可以使植物免受除草剂的伤害。
抗除草剂转基因大豆的培育，不仅有科学理论意义，而且有巨大的应用价值。将抗除草剂草甘膦的g10-epsps基因转入大豆，通过草甘膦直接筛选得到草甘膦抗性明显提高的株系，这个技术的应用将为培育无标记基因的高效抗草甘膦的转基因农作物开辟一条更直接更有效的道路。浙江大学通过农杆菌介导法将从耐辐射球菌中筛选获得的抗除草剂基因g10-epsps(CN 102321640 B)整合到栽培大豆品种“华春3号”中，获得了32个抗除草性得到提高的转基因大豆新株系。通过实验研究和中间试验，已明确了以上株系的遗传、分子特征及目的基因表达特性，生物学试验已证实了基因的整合与表达。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种涉及抗草甘膦转基因大豆制备方法、检测技术与应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆转化事件ZUTS-33，所述转化事件ZUTS-33中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的5'端与内源基因组DNA 构成的连接序列如SEQ ID NO:1所示，所述外源插入序列的3'端与内源基因组DNA 构成的连接序列如SEQ ID NO:2所示。
作为本发明的大豆转化事件ZUTS-33的改进：所述转化事件ZUTS-33的基因组中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还同时提供了用于鉴定转基因大豆ZUTS-33的检测方法，包括以下步骤：
a)设计特异性识别鉴定5’端T-DNA插入的序列或其互补序列的第一对引物序列SEQ ID NO:4(鉴定5’端基因组上序列的引物)和SEQ ID NO:5(鉴定T-DNA插入序列的引物)；
b)设计特异性识别鉴定3’端T-DNA插入的序列或其互补序列的第二对引物序列SEQ ID NO:6(鉴定5’端基因组上序列的引物)；和SEQ ID NO:7(鉴定T-DNA插入序列的引物)。
本发明还同时提供了一种检测生物样品中事件ZUTS-33或其子代的方法，包括以下步骤：
(a)从所述生物样品提取DNA样品；
(b)提供DNA引物对，
(c)提供DNA扩增反应条件；
(d)进行DNA扩增反应，获得DNA扩增子；
(e)检测所述DNA扩增产物，其中所述的DNA扩增子SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，在所述DNA扩增反应中的检出表明事ZUTS-33的存在。
本发明还同时提供了检测事件ZUTS-33中外源插入DNA分子的方法，所述方法包括将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件(即，满足杂交温度在52℃的条件)下，可以特异性检出ZUTS-33转化事件的DNA，表明ZUTS-33事件的存在，所述多核苷酸探针如SEQ ID NO:10所示的序列。
本发明还同时提供了检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，为以下任意一种方法：
方法一、该方法包括如下步骤：
(a)获得用于分析的样品；
(b)制备样品的蛋白质提取物；
(c)提供抗体，该抗体被设计成结合如权利要求1所述植物中包含的g10-epsps蛋白质；
(d)温育所述抗体和蛋白样品，
(e)检测该抗体是否已经结合；
已经结合的抗体的存在表明该样品来源于ZUTS-33事件；
方法二，该方法包括如下步骤：
(a)获得用于分析的样品；
(b)制备样品的蛋白质提取物；
(c)提供检测试纸条，该检测条被设计成检测存在于样品中的g10-epsps蛋白质的存在；
(d)温育检测条和样品；
(e)检测g10-epsps蛋白质是否存在；
g10-epsps蛋白质的存在表明该样品来源于ZUTS-33事件。
本发明还同时提供了用于大豆转化的重组质粒载体，将权利要求1所述的核苷酸序列和至少一个控制表达的多核苷酸功能性地连接；表达载体为pSOY19。
本发明还同时提供了一种构建抗草甘膦转基因大豆的方法，通过将外源DNA序列插入受体华春3号大豆基因组第19号染色体的第2854906..2855152区间，得到转基因大豆；
所述外源DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还同时提供了用检测大豆转化事件的引物：
第一对引物为：如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所述；
第二对引物为：如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所述。
本发明还同时提供了用检测大豆转化事件的核苷酸探针和抗体：
所述核苷酸探针如SEQ ID NO:10所示；
所述抗体可以特异性识别ZUTS-33转化事件中外源基因g10-epsps的基因表达，g10-epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
即，g10-epsps基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列为：G10-EPSPSP含1332个碱基(如SEQ ID NO:11所示)，编码444个氨基酸，序列如下：
EKGSDALPATFDVIVHPARELRGELRAQPSKNYTTRYLLAAALAEGETRVVGVATSEDAEAMLRCLRDWGAGVELVGDDAVIRGFGARPQAGVTLNPGNAAAVARLLMGVAALTSGTTFVTDYPDSLGKRPQGDLLEALERLGAWVSSNDGRLPISVSGPVRGGTVEVSAERSSQYASALMFLGPLLPDGLELRLTGDIKSHAPLRQTLDTLSDFGVRATASDDLRRISIPGGQKYRPGRVLVPGDYPGSAAILTAAALLPGEVRLSNLREHDLQGEKEAVNVLREMGADIVREGDTLTVRGGRPLHAVTRDGDSFTDAVQALTAAAAFAEGDTTWENVATLRLKECDRISDTRAELERLGLRARETADSLSVTGSAHLAGGITADGHGDHRMIMLLTLLGLRADAPLRITGAHHIRKSYPQFFAHLEALGARFEYAEATAYRS。
具体而言：
本发明还同时提供了上述转化事件在育种中的应用；和包含事件ZUTS-33的植物，以及上述植物产生的种子。
本发明还同时提供了一种大豆品种，该大豆品种在其第19号染色体短臂上的2854906—2855152区间的物理位置上，含有一个g10-epsps基因。
本发明涉及具抗草甘膦能力转基因大豆培育技术、位于转基因序列侧翼的大豆基组DNA的转基因大豆植物。更具体地，本发明涉及构建抗草甘膦转基因大豆的方法，即通过将外源DNA序列插入受体华春3号大豆基因组第19号染色体的第2854906..2855152区间，得到的转基因大豆。本发明的检测方法可以鉴定插入的T-DNA和植物基因组DNA结合区域并进一步鉴定转基因大豆及其后代的细胞、组织、器官等。本发明涉及一种构建体、一种大豆细胞、组织和器官，一种转化事件ZUTS-33，一种用检测大豆转化事件的引物，一种用检测大豆转化事件的核苷酸探针，一种用检测大豆转化事件的抗体，一种用于大豆转化事件的检测试纸条,一种用于大豆转化事件的检测试剂盒。
本发明的构建体包括：
第一表达盒，包含用在植物中表达的适合启动子是来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动和适合的聚腺苷酸化信号，该启动子可操作地连接编码g10-epsps的基因；
第二个盒子包含g10-epsps的基因,g10-epsps是装载在双元载体pSOY19上的，基因编码区5’端含有一个来源于拟南芥的叶绿体蛋白前导序列，使目的基因表达产物运往叶绿体组织。
该载体的T-DNA区域只含有g10-epsps基因的表达框。特别指出，g10-epsps表达时同时可以用做选择性标记的基因，因此插入序列中没有抗生素标记基因或报告基因的存在。
具体而言，为表达载体pSOY19。
利用该构建体，能够有效地将g10-epsps的基因引入大豆品种华春3号的植株中，从而得到携带外源基因的大豆植株。由此，可以有效地用于大豆杂交，得到的杂交种也为非转基因。
由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到大豆的细胞、组织或器官中，以使得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，在本发明的第二方面，本发明提出了一种大豆细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该大豆细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
本发明提出了一种制备大豆种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到大豆植株中；以及将所述大豆植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。
本发明还提出了一种特异的侧翼序列，所述"侧翼序列"又称为"旁侧序列"。5’端旁侧序列如SEQ ID NO:1所示，3’端旁侧序列如SEQ ID NO:2所示。在本发明中，所述侧翼序列可用于开发生物样品中的事件ZUTS-33的特异性鉴定方法。在一些实施方案中，还公开了ZUTS-33的左边界和右边界的侧翼区域序列，这些侧翼序列可用于设计特定的引物和探针。
本发明提供了检测来源于ZUTS-33转基因事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；从样品提取DNA；提供设计用于结合多核苷酸的引物对，该多核苷酸包含SEQ ID NO:4，5和SEQ ID NO:6，7的核苷酸序列；扩增位于引物结合位点之间的区域；并且检测扩增产物的存在。因为可以得到SEQ ID NO：8，9的插入核苷酸序列。所以可以利用分子生物学领域技术人员熟知的参数，设计该检测方法中使用的本发明提供的引物对。基本的原理，本领域技术人员已知的技术，是聚合酶链式反应(PCR)。利用琼脂糖凝胶电泳大小分离后，通过用涣化乙绽染色和用UV光激发可以观察来自于该PCR反应的扩增产物。
本发明的另一个方面提供了检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品：提供探针，该探针被设计成当多核苷酸是单链时结合所述多核苷酸的互补序列，该多核苷酸来自SEQ ID NO:10；杂交所述探针和样品；并且检测该探针是否已经杂交。在进一步实施方式中，所述探针核苷酸来自SEQ ID NO:10。例如，探针可以是PCR产物或限制消化片段。在进一步实施方式中，可以用荧光、放射性、酶性或其它适合的标记标记这里所述的探针，以能够检测到杂交。在本发明进一步实施方式中，提供了在严格条件下杂交探针和样品，并且检测探针是否已经杂交的方法。严格杂交条件是本领域技术人员所熟知的，并且包括，例如在约65℃，在含有6x SSC,0.01％SDS和0.25％脱脂奶粉的溶液中杂交，接着在相同的温度，在含有O.2x SSC和0.1％SDS的溶液中洗涤。基于杂交原理，用于检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的适合技术包括但不限于Southern印迹，Northern印迹和原位杂交。这些技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标的探针。做为可替代的方案，通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。
在本发明的进一步方面，提供了检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；制备样品总蛋白；提供设计的抗体，该抗体可结合植物中所包含的g10-epsps蛋白质；温育所述的抗体和样品；检测是否该抗体已经结合。在本发明的一个实施方式中，所述g10-epsps蛋白质包含SEQ IDNO:11序列。基于所述抗体结合，检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的适合方法包括，但不限于Western印迹，酶联免疫吸附测定法(EL1SA)分析。本领域技术人员熟悉这些免疫学技术。典型的步骤包括:温育样品和结合g10-epsps蛋白质的抗体，冲洗以移除未结合的抗体，和检测是否抗体已经结合。许多这种检测方法是基于酶促反应的，例如可以用酶诸如辣根过氧化物酶标记抗体，并且在应用适合的底物后，检测颜色改变。适合的抗体可以是单克隆和相应的配对抗体。
在本发明的另一方面，提供了检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，该方法包括获得用于分析的样品；制备样品的蛋白质提取物；提供设计用来检测样品中g10-epsps蛋白质的存在的检测条；温育检测条和样品；和检测g10-epsps蛋白质是否存在。用于ZUTS-33的可替代的基于抗体的检测方法利用检测试纸条(dipsticks)。典型的步骤包括温育检测试纸条和样品，并且观察检测试纸条上存在或不存在有色条带。有色条带表明样品中蛋白质的存在。这种测量棒(dipsticks)或检测试纸条。
本发明是公布的一个转基因事件，主要保护转基因事件中的旁侧序列。检测技术利用最新发明的g10-epsps检测试纸条与ELISA定量检测试剂盒(例如为2016101095633的《检测转基因蛋白g10-epsps的胶体金速测试纸及其使用法》和2016101109176的《转基因蛋白g10-epsps的定量检测方法及所用试剂盒》)；其他均为现有技术。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为pSOY19表达载体的示意图。
图2为转基因后代的EPSPS引物的PCR检测结果图；
Ctr+：质粒阳性对照，Ctr-：非转基因的阴性对照，ZUTS-33：转基因的阳性植株。
图3为ZUTS-33转基因大豆叶片中g10-epsps蛋白表达分析图；
Lane 1：Ctr+大肠杆菌表达的g10-epsps蛋白；Lane 2-3：ZUTS-33转基因大豆不同株系的叶片中g10-epsps蛋白；Lane 4：Ctr-受体华春3号大豆叶片总蛋白。
图4为不同世代ZUTS-33转基因大豆叶片中g10-epsps蛋白表达分析图；
Lane 1：Ctr+大肠杆菌表达的g10-epsps蛋白；Lane 2(T1)：ZUTS-33转基因大豆的T1代叶片中g10-epsps蛋白；Lane 3(T2)：ZUTS-33转基因大豆的T2代叶片中g10-epsps蛋白；Lane 4(T3)：ZUTS-33转基因大豆的T3代叶片中g10-epsps蛋白；Lane 5(T4)：ZUTS-33转基因大豆的T4代叶片中g10-epsps蛋白；Lane 6：Ctr-野生型受体华春3号大豆叶片总蛋白。
图5为大豆各组织中的g10-epsps蛋白表达分析图；
Lane 1：Ctr+大肠杆菌表达的g10-epsps蛋白；Lane 2：ZUTS-33转基因大豆的根中g10-epsps蛋白；Lane 3：ZUTS-33转基因大豆的茎中g10-epsps蛋白；Lane 4：ZUTS-33转基因大豆的叶片中g10-epsps蛋白；Lane 5：ZUTS-33转基因大豆的籽粒中g10-epsps蛋白；Lane 6：Ctr-野生型受体华春3号大豆叶片总蛋白。
图6为T-DNA插入位置及侧翼序列物理位置图；
ZUTS-33转化事件中，T-DNA括入在大豆第19号染色体短臂近着丝粒处，物理位置为Chr19:2854906..2855152，T-DNA整合导致整合位点处基因组序列缺失245个碱基，缺失序列如SEQ ID NO:12所示，该缺失序列未破坏大豆内源基因编码区。
图7为Southern杂交检测插入基因的拷贝数；
A. T-DNA区域的序列结构及Southern杂交预期结果。所列的质粒和探针位置可知，当pSOY19质粒中T-DNA序列进入大豆基因组后，转基因植物基因组DNA经HindⅢ和XbaⅠ酶切，用G10探针检测时，应出现大于3kb的条带，条带具体大小与插入位点旁邻基因组序列中相应的酶切位点的位置有关；每一次插入都会在Southern杂交结果中出现一个杂交带，也就是说，杂交条带的数目代表了插入片段的拷贝数。
B. Southern杂交结果。ZUTS-33用HindⅢ和XbaⅠ酶切后分别得到了4.9kb和4.7kb左右的条带(7B)，两个株系中目的基因都是单拷贝插入(图7B)
图8为g10-epsps检测试纸条结果；
A.试纸条图例说明，阳性检测结果在C和T的位置上有红色条带；阴性检测结果C的位置上有红色条带，T位置上无红色条带；无效的检测试纸条在C和T的位置上均无红色条带；
B. 1号试纸条为孟山都CP4转基因大豆叶片蛋白提取液检测结果，T位置上无红色条带，结果为g10-epsps阴性；2号试纸条为受体材料华春3号大豆叶片蛋白提取液检测结果，T位置上无红色条带，结果为g10-epsps阴性；3-5号试纸条为ZUTS-33转基因大豆叶片蛋白提取液检测结果，检测结果为g10-epsps阳性。
具体实施方式
下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
所涉及的参考文献如下
Liu,Y.G.Mitsukawa,N.Oosumi,T.and Whittier,R.F.(1995).Efficientisolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions bythermal asymmetric interlaced PCR.Plant J 8,457-463(Liu,Y.G.Mitsukawa,N.Oosumi,T.and Whittier,R.F.(1995).利用巢式聚合酶链式反应方法高效提取并鉴定拟南芥外源插入片段，Plant J 8,457-463)。
Song,Z.Y.,Tian,J.L.,Fu,W.Z.,Li,L.,Lu,L.H.,Zhou,L.,Shan,Z.H.,Tang,G.X.,and Shou,H.X.(2013).Screening Chinese soybean genotypes forAgrobacterium-mediated genetic transformation suitability J Zhejiang Univ SciB 14,289-298(Song,Z.Y.,Tian,J.L.,Fu,W.Z.,Li,L.,Lu,L.H.,Zhou,L.,Shan,Z.H.,Tang,G.X.,and Shou,H.X.(2013).农杆菌介导的转基因大豆品种的筛选，J ZhejiangUniv Sci B 14,289-298)。
实施例1、载体构建
目的基因与载体构建的图谱：
本试验转基因大豆是通过农杆菌携带如图1所示的双元质粒pSOY19转化而成的。该载体从T-DNA区域从右边界(T-Border-RB)(序列如SEQ ID NO:1所述)到左边界(T-Border-LB)(序列如SEQ ID NO:2所述)区域全长6284bp，该区域中除多克隆位点外主要由4个部分组成：
1)、能在植物中产生组成型表达的花椰菜花叶病毒35蛋白的启动子CaMV35Spromoter)；
2)、来自拟南芥的信号肽Ch-L,该信号肽可引导其同一表达框编码的蛋白质转运至叶绿体内，Ch-L编码的叶绿体引导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所述，Ch-L编码的叶绿体引导肽的推导的氨基酸序列为：MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTA。
3)、来自Deinococcus radiodurans R1的g10-epsps耐草甘膦基因(序列如SEQ IDNO:3所述)，该基因序列与Ch-L位于同一读码框；
4)CaMV35S蛋白的终止子。LB和RB是T-DNA的边界。载体中各种元件的名称、大小和功能等信息列于表1。质粒图中标注了后续Southern杂交所用的限制性内切酶HindIII和XbaI的作用位点。通过装配下述DNA元件，构建如图1所示的被称为pSOY19的表达载体。
表1、pSOY19载体中各种元件的信息表
g10-epsps是装载在双元载体pSOY19上的，该载体的T-DNA区域只含有g10-epsps基因的表达框，目的基因由来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子驱动，基因编码区5’端含有一个来源于拟南芥的叶绿体蛋白前导序列，使目的基因表达产物运往叶绿体组织。特别指出，插入序列中没有抗生素标记基因或报告基因的存在。
实施例2、大豆转化
转基因方法：
大豆转基因采用农杆菌介导转化法(Song et al.,2013)，该方法是农杆菌将双元质粒T-DNA左右边界之间的区段整合到植物细胞中。转化中的受体细胞是萌动种子子叶节间未分化的腋芽，将实施例1中构建好的带有g10-epsps的双元载体pSOY19转入农杆菌，农杆菌侵染后植物组织与农杆菌经过4天的共侵染，再将已侵染后的组织置于含有草甘膦和抗生素的丛生芽诱导培养基上进行筛选培养，共四周。培养基中的草甘膦和抗生素分别用于阻止非转化细胞和农杆菌的生长。
经四周丛生芽诱导后，含有大量丛生芽的大豆子叶节部位被转入芽诱导培养基中，培养基中含有草甘膦和抗生素，转基因的幼芽由于具备对草甘膦的抗性，能在含草甘膦的培养基中伸长，伸长后的幼苗转入生根培养基进行生根培养后，生根后幼苗移入土壤中。移入土壤的幼苗在成活后，通过PCR、RT-PCR、Western杂交及草甘膦抗性检测，筛选获得转基因植株基因组中含有目的基因的表达盒，而且目的基因表达正常。ZUTS-33转基因大豆是通过以上转基因程序获得的。
实施例3、转基因学的鉴定和筛选
1、大豆叶片DNA提取和PCR鉴定
1.1SDS法提取DNA
1)、取0.05g磨碎的叶片或种子，加700μl SDS提取液和3μl 10mg/ml的蛋白酶K(叶片材料无需加蛋白酶K)，混匀，60℃水浴40min-1h(叶片材料待呈现褐色后取出)，每隔10min颠倒混匀一次。
2)、加等体积的酚/氯仿(1：1)轻轻颠倒混匀10min，静置30min以上，10000g离心10min，取上清液。
3)、加等体积的酚/氯仿(1：1)混匀，静置10min。10000g离心10min，取上清，加2倍体积的无水乙醇，沉淀，静置10min以上。10,000g离心1min，倒掉上清，用70％或75％的乙醇洗涤沉淀两次。风干，加400μl灭菌蒸馏水溶解。加4μl 10mg/ml RNA酶，37℃水浴1h。
4)、加等体积氯仿/异戊醇(24：1)，摇匀10min，静置。10 000g离心10min，取上清，加2倍体积的无水乙醇，沉淀。10 000g离心1min，倒掉上清，用70％或75％的乙醇洗沉淀两次。风干DNA，加50μl无菌蒸馏水溶解，-20℃保存。
5)、紫外分光光度计Spectrophotometer ND-1000检测DNA浓度，每次上样量为1.5μl。琼脂糖电泳检测DNA浓度：配制0.8％琼脂糖电泳液，加适量EB。电泳条件U＝120V，I＝140mA。
经检测，所得DNA浓度为：1μg/μl。
1.2目的基因的PCR检测
1)通过多聚酶链式反应(PCR)检测目的基因是否已经整合到大豆基因组中。目的基因的引物序列如表2所示。PCR反应体系为：基因组DNA 2μl，2.5mM的dNTP 0.8μl，10xPCRloading buffer 2μl，10μM primer1和10μM primer2各0.2μl，Taq酶0.3μl，ddH2O 14.5μl，总体积为20μl。PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；32个循环以后72℃，10min。PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳20分钟，用凝胶成像系统观察结果并拍照。采用g10-epsps基因内部引物扩增，目的条带为1133bp，如图2中所示。转基因阳性株系均能扩增出目的条带，ZUTS-33为本发明公布的研究材料。
表2.目的基因PCR检测引物序列信息
1.3大豆叶片蛋白的提取、ELISA和Western检测
在各转基因株系PCR阳性植株中取叶片样本提取总蛋白进行Western检测。具体方法如下：
大豆V3期叶片样品在液氮中研磨至粉末状后移至离心管中，加入预冷的蛋白提取液(0.1M醋酸钾，20mM CaCl2，2mM EDTA，0.1mM苯甲基磺酰氟，20％甘油，pH 5.4)，混合均匀，12000g，4℃，离心15min，取上清。用10％SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上。将膜置于TBSTM(0.01M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-20，5％脱脂奶粉)中，室温孵育1h；在TBSTM中按1/500加入兔抗g10-epsps蛋白的抗体，孵育1h；用TBST(0.01M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；在TBSTM中按1/10000加入山羊抗兔二抗，孵育1h；用TBST洗膜3次，每次5min。显色的方法有二种，包括辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
HRP-ECL发光法：将发光液按1：1比例稀释混合至1ml。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于1ml发光液的液滴上，黑暗放置5min左右后滤纸贴角吸干，置于化学发光扫描仪内自动曝光扫描成像。
结果如图3所示，根据图3，我们得知：ZUTS-33转基因大豆叶片总蛋白中检测到与预期g10-epsps蛋白大小相符的目标蛋白条带。正对照Ctr+大肠杆菌中表达的g10-epsps；负对照Ctr-受体大豆华春3号大豆叶片总蛋白材料。
双抗体间接酶联免疫反应(ELISA)可用于有效地检测g10-epsps蛋白质含量，用大肠杆菌中表达后纯化的g10-epsps蛋白质作为标准参照蛋白，建立标准曲线，然后通过外推法得到测试样品中的g10-epsps含量。方法简述如下：
从待检样本(根，茎，叶片，籽粒)中提取蛋白，得蛋白提取液；用g10-epsps定量检测试剂盒对蛋白提取液进行检测，检测过程包括加样、孵育、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止和读数；通过用g10-epsps蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的g10-epsps蛋白浓度。
表3、转基因大豆株系ZUTS-33叶，茎，根，籽粒EPSPS表达量
转基因材料编号 叶(μg/g) 茎(μg/g) 根(μg/g) 籽粒(μg/g)
I-L2-1 77.94 43.65 30.49 420.88
I-L2-2 58.01 68.21 65.98 309.11
I-L2-3 25.06 25.48 25.02 218.22
II-L2-1 82.22 28.35 25.02 703.43
II-L2-2 50.50 29.28 48.05 467.35
II-L2-3 69.87 55.65 51.99 1019.15
III-L2-1 75.99 26.50 28.03 403.83
III-L2-2 53.42 27.47 33.64 611.68
III-L2-3 70.75 29.56 10.14 313.19
平均值 63.62 39.01 35.37 496.32
标准差 19.52 15.65 16.97 247.62
根据上述表3，我们得知：ZUTS-33转基因大豆在根，茎，叶籽粒中均能检测到g10-epsps蛋白的表达。
实施例4、转基因株系目的基因的遗传稳定性
本次中间试验中对ZUTS33转基因事件目的基因g10-epsps的遗传分离情况进行了分析。田间种植的三个转基因事件、三个除草剂剂量处理和三个重复的植株均表现出稳定的除草剂抗性。对各小区植株进行取样，PCR鉴定的方法分析了目的基因是否存丰，结果发现，各转基因植株的目的基因存在与否与其对草甘膦的抗性重合，三个转基因事件在田间种植的植株在g10-epsps基因插入位点表现为纯合。
转基因株系目的基因的表达：
为了检测目标蛋白g10-epsps在各转基因世代中的稳定性，试验中对转基因株系ZUTS-33不同世代的植株叶片提取蛋白后进行Western杂交分析。由图4可见，转基因株系ZUTS-33不同世代植株叶片中均能检测到很高含量的g10-epsps蛋白，目的基因表达在各世代间稳定。
为了检测目标蛋白g10-epsps在转基因植株不同部位的表达，试验对转基因株系ZUTS-33T3代植株根、茎、叶和种子样品提取蛋白后进行Western杂交分析。由图5可见，转基因株系ZUTS-33植株根、茎和叶片中均能检测到很高含量的g10-epsps蛋白。
实施例5、转化事件的侧翼序列分析
以实施例3中所得到的转基因大豆ZUTS-33纯合植株的基因组DNA为模板，pSOY19载体作为阳性对照，大豆转化受体华春3号作为阴性对照，利用TAIL-PCR扩增T-DNA旁侧序列，获得转化事件ZUTS-33的T-DNA旁侧序列，并分析验证T-DNA的整合方式。利用普通PCR验证推测的T-DNA整合方式，并分析外源基因是否插入大豆内源基因内部。
通过热不对称PCR扩增获得了插入序列右边界旁的侧翼序列。TAIL-PCR的所用的引物见表4。
表4、TAIL-PCR引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’)
RB0b CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT
RB1b ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATC
RB2b GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT
AD2 NGTCGASWGANAWGAA
将提取的大豆基因组DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于1μg/μL DNA浓度来计算纯化的DNA浓度。DNA溶液OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间。4℃保存一周内使用。
根据刘耀光等人设计的改进过的热不对称交错PCR法(THERMALASYMMETRICINTERLACED PCR TAIL-PCR)(Liu et al.,1995；)，在外源括入的T-DNA上设计3条嵌套的特异引物(SPECIALPRIMER,RB0b,RB1b,RB2b)，将RB0b与随机简并引物(LONG ARBITRARYDEGENERATE PRIMER，LAD)组合，而RB1b和RB2b分别与锚走引物AD2组合，以基因组DNA为模板，根据引物长短和特异性差异设计不对称的温度循环，进行TAIL-PCR。其中，反应流程如表5所示。根据不同的引物设定PCR扩增条件，并将PCR产物跑琼脂糖凝胶检测。
表5、TAIL PCR的条件如下：
将获得的旁侧序列进行测序分析，并与数据库https://phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html，发布时间2010，Glycine max Wm82.a2.v1(Soybean)中大豆基因组序列进行比对，发现在ZUTS-33转化事件中，T-DNA括入在大豆第19号染色体短臂近着丝粒处，物理位置为Chr19:2855152..2854906，未插入大豆内源基因编码区，上游基因Glyma.19G024400的物理位置为Chr19:2831599..2837777，距上游基因的起始密码23554bp。下游基因Glyma.19G024500的物理位置为Chr19:2893626..2895846，距下游基因的终止密码子40940bp。T-DNA整合导致整合位点处基因组序列缺失245个碱基，缺失序列如SEQ ID NO:12所示，该缺失序列未破坏大豆内源基因编码区(图6)。
利用序列如前SEQ ID NO:4和5所描述的插入位点5‘端两对引物及利用序列如前SEQ ID NO:6和7所描述插入位点3’端的两对引物进行PCR进一步确认插入基因组内的旁侧序列，PCR扩增结果，5‘端插入序列的旁侧序列如序列如前SEQ ID NO:8所示，3‘端插入的旁侧序列如前SEQ ID NO:9所示。通过分析转化事件中外源T-DNA片段的测序结果，验证了T-DNA插入大豆基因组的旁侧序列。
实施例6、转化事件中外源基因整合稳定性分析
为了验证上述转化事件中外源基因括入物的拷贝数和完整性，本发明采用Southern blot印记分析的方法对上述转化事件进行分析。
根据载体中的T-DNA序列设计探针，其中用于检测转化事件ZUTS-33中目的基因(包含g10-epsps)的探针序列如SEQ ID NO:10所示.
以转基因大豆株系ZUTS-33的T2、T3和T4代植株，和转化受体材料华春3号为实验材料，通过以下的实验流程进行Southern blot印记分析。
1、DNA提取
按中华人民共和国农业行业标准NY/T674操作，提取大豆基因组DNA。将DNA适当稀释，测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，以一个OD260值相当于50mg/ml DNA浓度来计算纯化的DNA浓度。DNA溶液。D260/0D280的比值在1.7～2.0之间。依据测得的浓度将DNA溶液稀释到100ng/μL，4℃保存一周内使用。分别用HindⅢ和XbaⅠ充分酶切消化转化体ZUTS-33T2、T3和T4代植株基因组DNA 30μg。
2、地高辛标记探针(随机引物法)
1ug模板DNA，用无菌ddH2O稀释到16ul；沸水浴煮10min，立即放入冰中；混匀DIG-High Prime，取4ulDIG-High Prime到上述20ul变性DNA中，混匀，稍加离心；
37℃反应过夜(约20小时)；加入2ulO.2M EDTA(Ph8.0)或65 0C 10min终止反应。
3、检测探针效率
将对照探针和标记好的探针进行一系列稀释后，直接点在膜上，通过标准检测未确定目的探针的标记效率。
4、电泳和转膜
(1)制备1％琼脂糖凝胶，恒压45V电泳过夜；
(2)指示剂距加样孔6-8cm左右时停止电泳。切掉加样孔及多余的胶，切掉左下角作标记；
(3)将凝胶浸入200ml，0.25M HCl中进行脱口票岭处理约5-10min；
(4)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，浸入变性液中，2X 15min；
(5)将凝胶取出，在去离子水中漂洗一下，然后浸入中和液中，2X 15min；
(6)将凝胶取出在去离子水中漂洗一下后，进行毛细转移；
(7)DNA的毛细转移：大培养皿中盛20X SSC→上架玻璃板→玻璃板上铺厚滤纸→赶气泡→将凝胶加样孔朝下放在滤纸桥上→周围用Parafilm膜盖住→胶上放等大的尼龙膜→赶气泡→膜上放四层与膜等大的滤纸→赶气泡→上放10cm厚的纸巾→放玻璃板→上压500g重物；
(8)毛细转移24h，取出膜在2XSSC中洗一下，夹于滤纸中，夹于滤纸中，254nmUV，紫外交联30min。5、杂交
(1)预杂交:将膜浸入预热到杂交温度的(52℃)DIG Easy Hyb中，10ml/100cm2，在杂交箱中52℃，60rpm，预杂交1h；
(2)将DNA探针(约25ng/ml DIG Easy Hyb)在100℃变性10min后，立即放到冰上，冷却10min；
(3)将变性的DNA探针加到预热的(52℃)DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2膜)，轻柔泪匀，避免泡沫；
(4)倒掉预杂交液，将杂交液倒入杂交瓶中，52℃，60rpm，杂交12-16小时；
(5)杂交结束，回收杂交液，-20℃可保存1年，再用时68℃加热10min重新变性探针。
6、洗膜
1)低严谨性(高盐，低温):充足的2X SSC+O.l％SDS，室温60rpm洗涤2X 15min；
2)高严谨性(低盐，高温):0.5XSSC+0.1％SDS(预热到洗涤温度)，60rpm洗涤2X15min。注:如果探针>150bp且G/C％较高，应当在68 0C洗膜；短于100bp时，洗涤温度同杂交温度。
7、检测
应用化学发光检测法，所有操作都在室温进行。
1)杂交结束并洗膜后，在Washing buffer中短暂冲洗膜约1-5min；
2)在80ml Blocking solution中封闭30min(轻摇)；
3)在20ml Antibody solution中反应40min；
4)转移膜入新容器，用Washing buffer洗两次，每次15min；
5)在20ml Detection buffer中平衡2-5min的将膜DNA面朝上小心放入杂交袋中，吸取1ml CSPD ready-to-use(Kit瓶5)均匀应用到膜上，立即将杂交袋的上层盖在膜上，使底物均匀布满膜表面，并且避免气泡产生，室温反应5min；
6)挤出多余液体，将杂交袋的边缘封住(防止膜干燥)；的将膜放在3rC，10min，以强化发光反应:的曝光X胶片15-25min，观察结果。
结论如下：
ZUTS-33的基因组DNA分别用HindⅢ和XbaⅠ充分酶切后，根据目的基因设计探针进行Southern blot结果显示该株系T2、T3和T4代植株的单株HindⅢ的酶切结果中均有4.9kb的信号条带(表6、图7)，XbaⅠ的酶切结果中均有4.7kb的信号条带(表6,图7)实际观察片段与转化体上预期片段大小(即4.9kb与4.7kb)相符(表明均为1个拷贝。代际间条带大小相同，拷贝数一致，表明转化体ZUTS-33的目的基因在T2、T3和T4代之间稳定遗传。
转化体ZUTS-33的T2、T3和T4代植株中外源基因整合稳定性的Southern blot分析结果以转化受体华春3号DNA作为阴性对照，将质粒DNA加入到华春3号基因组DNA中作为阳性对照，探针在此杂交条件下能够与靶标序列顺利结合。
综上所述，根据转化体ZUTS-33上T-DNA序列、括入位点旁侧序列、探针位置及酶切位点，可以预测杂交片段大小。将实际观察与预测相比较，从而证实外源基因的拷贝数。
表6、拷贝数检测
结果显示：ZUTS-33用HindⅢ和XbaⅠ酶切后分别得到了4.9kb和4.7kb左右的条带(图7B)，目的基因是单拷贝插入(图7B)。
实施例7、通过ELISA方法检测转化事件中g10-epsps蛋白的表达分析
分别提取转基因大豆株系T4代三叶期根、茎、叶、六叶期，九叶期叶片，生育期的成熟籽粒时期种子的总蛋白，研究目标基因g10-epsps的蛋白在不同生长阶段不同组织中的蛋白表达水平。目标基因g10-epsps的蛋白的氨基酸序列如前SEQ ID No.11所示。
1、标准品配制
用1mL稀释液溶解EPSPS标准品冻干粉，此溶液浓度为2ppb(2ug/mL)；
取2ppb EPSPS标准品300μL，加入TBA缓冲液(0.1M Tris,0.1M Na2B4O7·10H2O,0.01M MgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH 7.8，300μL，此溶液浓度为1ppb；取1ppb EPSPS标准品300μL，加入TBA缓冲液(0.1M Tris,0.1M Na2B4O7·10H2O,0.01M MgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH 7.8，300μL，此溶液浓度为0.5ppb；取0.5ppb EPSPS标准品300μL，加入TBA缓冲液(0.1M Tris,0.1M Na2B4O7·10H2O,0.01M MgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH 7.8，300μL，此溶液浓度为0.25ppb；取0.25ppb EPSPS标准品300μL，加入TBA缓冲液(0.1M Tris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01M MgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH 7.8，300μL，此溶液浓度为0.125ppb。
2、样品蛋白制备
(1)叶片前处理方法：取5-10mm2的叶片样本，放入1.5mL离心管中捣碎，加入250μL的TBA缓冲液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μL上清用于分析。种子前处理方法：取0.1g碾碎后的种子样本，放入1.5mL离心管中，加入1ml TBA缓冲液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取100μL上清用于分析。
(2)加标准品或未知浓度样品：将100μL的TBA缓冲液(空白对照)/标准品/未知浓度样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。
(3)洗板：将孔内液体甩干，用250μL洗涤液/孔，充分洗涤3次，每次间隔1min，用吸水纸拍干。
(4)加酶标抗体：加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复步骤(3)所述的洗板。
(5)显色：加入显色剂100μL/孔，置于25℃避光环境中反应15min。
(6)终止与测定：加入100μL终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值(优选用双波长450/630nm进行检测，在5min内读完数据)
3、定量分析
(1)标准品吸光度值的计算，标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)减去样品提取液(本底)的吸光度值。
(2)标准曲线的绘制与计算
以标准品吸光度值为纵坐标，以EPSPS标准品浓度(ppb)的为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
4、转化事件中各个发育时期不同器官的g10-epsps蛋白量ELISA结果
表7ZUTS-33转基因大豆叶，茎，根，籽粒EPSPS表达量
根据上述表7，我们得知：ZUTS-33在营养生长的三叶期，六叶期，九叶期及生育期的大豆籽粒中均检测到g10-epsps的表达。
实施例8、通过检测试纸条进行g10-epsps检测
1、将约2cm2的一片叶片组织放置在含有提取TBA缓冲液(0.1M Tris,0.1MNa2B4O7·10H2O,0.01M MgCl2,0.05％(v/v)Tween-20pH 7.8的试管中。通过用塑料搅拌器切割和浸解组织，从组织提取蛋白质。叶片组织包括孟山都CP4转基因大豆叶片作为阴性对照，受体大豆华春3号叶片作为阴性对照，ZUTS-33转基因大豆叶片为待测材料。
大豆种子的检测方法：取粉碎好的大豆样本1g，转移到做好标记的容器中，加5mLPBS溶解，盖好容器的盖子，用力上下振荡20～30s，确保样品与提取缓冲液充分混匀。静置等待固体物质沉淀分层，将上清稀释不同倍数加入样品杯，待测。
2测量棒检测
检测条被放置在试管中，并且温育5-10分钟以产生结果。检测条包含和对照抗体结合的第一条带，和抗g10-epsps抗体结合的第二条带。温育后，检测条结果视窗中双红色线表明存在g10-epsps。下边的线表明g10-epsps蛋白质的存在，而上边的线是对照，表明该检测方法正确地工作。检测结果如图8。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.大豆转化事件ZUTS-33，其特征是：所述转化事件ZUTS-33中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的5'端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO:1所示，所述外源插入序列的3'端与内源基因组DNA构成的连接序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的大豆转化事件ZUTS-33，其特征是：所述转化事件ZUTS-33的基因组中含有一个外源插入序列，所述外源插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.用于鉴定转基因大豆ZUTS-33的检测方法，其特征是包括以下步骤：
a)设计特异性识别鉴定5’端T-DNA插入的序列或其互补序列的第一对引物序列SEQ IDNO:4(鉴定5’端基因组上序列的引物)和SEQ ID NO:5(鉴定T-DNA插入序列的引物)；
b)设计特异性识别鉴定3’端T-DNA插入的序列或其互补序列的第二对引物序列SEQ IDNO:6(鉴定5’端基因组上序列的引物)；和SEQ ID NO:7(鉴定T-DNA插入序列的引物)。
4.检测生物样品中事件ZUTS-33或其子代的方法，其特征是包括以下步骤：
(a)从所述生物样品提取DNA样品；
(b)提供DNA引物对，
(c)提供DNA扩增反应条件；
(d)进行DNA扩增反应，获得DNA扩增子；
(e)检测所述DNA扩增产物，其中所述的DNA扩增子SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，在所述DNA扩增反应中的检出表明事ZUTS-33的存在。
5.检测事件ZUTS-33中外源插入DNA分子的方法，其特征在于：所述方法包括将包含DNA的样品与多核苷酸探针接触，所述多核苷酸探针在严谨杂交条件下，可以特异性检出ZUTS-33转化事件的DNA，表明ZUTS-33事件的存在，所述多核苷酸探针如SEQ ID NO:10所示的序列。
6.检测来源于ZUTS-33事件的植物材料的方法，其特征是为以下任意一种方法：
方法一、该方法包括如下步骤：
(a)获得用于分析的样品；
(b)制备样品的蛋白质提取物；
(c)提供抗体，该抗体被设计成结合如权利要求1所述植物中包含的g10-epsps蛋白质；
(d)温育所述抗体和蛋白样品，
(e)检测该抗体是否已经结合；
已经结合的抗体的存在表明该样品来源于ZUTS-33事件；
方法二，该方法包括如下步骤：
(a)获得用于分析的样品；
(b)制备样品的蛋白质提取物；
(c)提供检测试纸条，该检测条被设计成检测存在于样品中的g10-epsps蛋白质的存在；
(d)温育检测条和样品；
(e)检测g10-epsps蛋白质是否存在；
g10-epsps蛋白质的存在表明该样品来源于ZUTS-33事件。
7.用于大豆转化的重组质粒载体，其特征是：将权利要求1所述的核苷酸序列和至少一个控制表达的多核苷酸功能性地连接；表达载体为pSOY19。
8.构建抗草甘膦转基因大豆的方法，其特征是：通过将外源DNA序列插入受体华春3号大豆基因组第19号染色体的第2854906..2855152区间，得到转基因大豆；
所述外源DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
9.用检测大豆转化事件的引物，其特征是：
第一对引物为：如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所述；
第二对引物为：如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所述。
10.用检测大豆转化事件的核苷酸探针和抗体，其特征是：
所述核苷酸探针如SEQ ID NO:10所示；
所述抗体可以特异性识别ZUTS-33转化事件中外源基因g10-epsps的基因表达，g10-epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
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